KR20220124208A

KR20220124208A - 프로그램된 세포 사멸 수용체1 항체 제제 및 그 용도

Info

Publication number: KR20220124208A
Application number: KR1020227026697A
Authority: KR
Inventors: 위안 팡; 둥메이 한
Original assignee: 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크.
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2022-09-13
Also published as: CN110787292B; CA3162976A1; ZA202207051B; US20230048612A1; WO2021139642A1; EP4088740A1; BR112022012768A2; EP4088740A4; JP2023510229A; CN110787292A; AU2021205538A1

Abstract

본 발명은 항PD-1단일 클론 항체, 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 단백질 보호제, 계면활성제 및 등장성 조절제를 포함하는 항PD-1단일 클론 항체를 포함하는 약물 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 주사용 액체 제제 또는 동결 건조 제제 제조에서의 상기 약물 제제의 응용에 관한 것이다.

Description

프로그램된 세포 사멸 수용체1 항체 제제 및 그 용도

본 출원은 2020년 1월 6일에 제출된 발명 명칭이 "프로그램된 세포 사멸 수용체1 항체 제제 및 그 용도"인 제202010008058.6호 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 상기 출원의 전부 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다.

본 발명은 생물 기술 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 프로그램된 세포 사멸 수용체1(PD-1) 항체 제제 및 그 용도에 관한 것이다.

프로그램된 세포 사멸 수용체1(programmed death 1, PD-1)은 CD279로도 지칭되는 중요한 면역 억제 분자로서, 면역글로불린 슈퍼패밀리의 CD28 패밀리의 구성원에 속하고, 분자량이 50 ~ 55 kD인 I형 막관통 단백질이다. PD-1은 T세포, B세포, 자연 살해 세포, 단핵구 및 골수 세포의 표면에서 지속적으로 발현된다. PD-1에는 PD-L1 및 PD-L2 두 가지 알려진 리간드가 있다. 현재, 연구에 따르면, PD-1은 이의 리간드 PD-L1과 결합되어, 억제 신호를 전달하고, 림프절에서 CD8+T 세포의 증식을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, PD-1은 Bcl-2 유전자 조절에 의해 림프절에서 항원 특이적 T 세포의 축적을 제어할 수도 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PD-1과 PD-L1의 결합을 차단하면, T 림프구 억제 신호의 생성을 효과적으로 방지할 수 있어, 자가 조직에 대한 면역계의 말초 면역 내성을 타파하고, T림프구의 활성화 및 증식, 및 사이토카인의 발현을 촉진한다. 따라서, 독성 부작용이 더 적고, 임상 효능이 더 우수한 암 면역 치료용 신규의 항PD-1단일 클론 항체 연구 개발이 현재 연구 이슈로 떠오르고 있으며, 또한 환자에게 더욱 많은 약물 선택 기회를 제공할 것이다.

단백질(단일 클론 항체 등) 약물 제제는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 주사를 포함하는 비경구 투여와 같은 투여 방식에 적합하다. 이의 액상 제제는 사용이 용이하지만 안정성이 떨어지고, 저장 조건에 대한 요구가 높으며, 일반적으로 저온 조건에서 보관하여야 한다. 또한, 액체 제제에서 단백질은 쉽게 응집체 또는 입자를 형성하여, 단일 클론 항체 제제의 안정성도 저하시킨다. 일반적인 약물 제제에서, 포함된 단백질, 특히 단일 클론 항체류 약물은 특히 비냉장 조건과 같은 저장 기간 동안 우수한 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 안정성을 유지하기 어려우므로, 이러한 유형의 약물에 대한 안정적인 완충액 체계에 대한 연구가 요구된다. 단백질(단일 클론 항체) 약물에 첨가되는 안정제로 계면활성제, 당 및 폴리올, 염류, 아미노산/아미노산염 및 일부 거대분자 화합물을 포함하는 것으로 보도되었다. 그러나, 항체류 약물의 구조적 성질이 상이하고 중합이 용이하여, 현재 제약 산업의 요구에 부합되는 안정적인 단백질 제제가 부족한 실정이다.

본 발명의 목적 중 하나는 항PD-1단일 클론 항체를 포함하는 약물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명은 스크리닝 및 배합 최적화 연구를 통해, 먼저 항PD-1단일 클론 항체 약물 제제의 바람직한 완충계로서 시트르산-시트르산나트륨(Citric acid-sodium citrate) 완충액을 사용하기로 결정한다. 구체적으로, 상기 약물 제제는 항PD-1단일 클론 항체, 완충액, 안정제 및 계면활성제, 및 선택적으로 등장성 조절제를 포함한다.

스크리닝된 완충액 체계를 기반으로, 단일 인자 시험을 설계하여 단백질 농도, pH값, 안정제의 종류 및 함량, 계면활성제의 종류 및 함량, 등장성 조절제 첨가 여부가 단백질 안정성에 미치는 영향을 고찰하였다. 이로써, 스크리닝을 최적화 하여 바람직한 기타 제제 성분을 얻는다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 항PD-1단일 클론 항체, 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 단백질 보호제 및 계면활성제를 포함한다.

상기 약물 제제에서 항PD-1단일 클론 항체의 함량은 바람직하게는 5-50 mg/mL이고, 보다 바람직하게는 8-30 mg/mL이며, 더욱 바람직하게는 10.0 mg/mL이다. 상기 항PD-1단일 클론 항체는 선택적으로 SEQ ID NO. 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO. 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항PD-1단일 클론 항체는 h1G4항체이고, SEQ ID NO. 10으로 표시되는 중쇄 및 SEQ ID NO. 9로 표시되는 경쇄를 포함한다.

하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체를 함유하고, 여기서, 상기 항PD-1단일 클론 항체는 h1G4항체이며, SEQ ID NO. 10으로 표시되는 중쇄 및 SEQ ID NO. 9로 표시되는 경쇄를 포함한다.

상기 제제의 완충액 체계에서, 상기 시트르산-시트르산나트륨의 농도는 바람직하게는 10-50 mM이고, 보다 바람직하게는 15-30 mM이며, 더욱 바람직하게는 20 mM이다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 시트르산-시트르산나트륨 완충액의 함량은 10-30 mM이다.

하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액을 함유한다.

상기 약물 제제의 pH값은 바람직하게는 pH 5.0-6.5이다. 예를 들어, pH값은 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5일 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 약물 제제의 pH값은 pH 5.5이다.

본 발명의 제제는 또한 제품의 안정성을 제공하기 위해 단백질 보호제를 첨가하고, 당업계의 통상적인 단백질 보호제로부터 선택되며, 상기 단백질 보호제는 단백질 약물의 안정성을 보호할 수 있고, 단백질 약물의 기능이 조건 변화로부터 영향을 받지 않도록 보호한다(예를 들어, 동결, 동결 건조 또는 기타 제조 조건의 변화). 단백질 보호제는 바람직하게는 당류, 단백질, 아미노산, 중합체, 염, 아민, 계면활성제 등을 포함한다. 보다 바람직하게, 단백질 보호제는 자당, 만니톨 또는 글리신 중 한가지 또는 여러 가지를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 단백질 보호제는 자당, 글리신 및 만니톨 중 한가지 또는 여러 가지로부터 선택된다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 단백질 보호제는 만니톨, 자당 또는 글리신이다.

상기 단백질 보호제의 함량은 바람직하게는 질량/부피 백분율(g/L) 0.5-5%이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 단백질 보호제의 함량은 질량/부피 백분율 1-5%이고, 여기서 질량/부피비는 g/L이다.

바람직한 실시형태에 있어서, 단백질 보호제는 자당, 글리신 및 만니톨 중 한가지 또는 여러 가지로부터 선택되고, 그 향량은 0.5-5%이며, 여기서 질량/부피비는 g/L이다.

하나의 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 질량/부피 백분율이 1-3%인 자당을 함유한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 질량/부피 백분율이 1%인 글리신을 함유한다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 질량/부피 백분율이 3%인 만니톨을 함유한다. 상술한 바와 같은 질량/부피비는 g/L이다. 본 발명의 제제는 당업계의 통상적인 계면활성 작용제로부터 선택되는 계면활성제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 비이온성 계면활성제이다. 본문에서의 계면활성제의 예로 바람직하게, 폴리소르베이트(Polysorbate)(예를 들어, 폴리소르베이트20 및 폴리소르베이트80); 폴록사머(Poloxamer)(예를 들어, 폴록사머188); 트리톤(Triton); 도데실황산나트륨(SDS); 라우릴황산나트륨(Sodium Lauryl Sulfate); 옥틸글리코시드나트륨(Sodium octyl glycoside); 라우릴-설포베타인(Lauryl-sulfobetaine), 미리스틸-설포베타인(myristyl-sulfobetaine), 리놀-설포베타인(linoleyl-sulfobetaine), 또는 스테아로일-설포베타인(stearoyl-sulfobetaine); 라우릴-사르코신(lauryl-sarcosine), 미리스틸-사르코신(myristyl-sarcosine), 리놀-사르코신(linol-sarcosin), 또는 스테아로일-사르코신(stearoyl-sarcosine); 리놀-베타인(Linol-betaine), 미리스틸-베타인(myristyl-betaine), 또는 세틸-베타인(cetyl-betaine); 라우로아미노프로필-베타인(Lauroaminopropyl-betaine), 코코아미노프프로필-베타인(Cocoaminopropyl-betaine), 리놀레아미노프로필-베타인(Linoleaminopropyl-betaine), 미리스토아미노프로필-베타인(Myristoaminopropyl-betaine), 팔미토일아미노프로필-베타인(Palmitoylaminopropyl-betaine), 또는 이소스테아르아미노프로필-베타인(Isostearaminopropyl-betaine)(예를 들어, 라우로아미노프로필-베타인); 미리스토아미노프로필-디메틸아민(Myristoaminopropyl-dimethylamine), 팔미토일아미노프로필-디메틸아민(Palmitoylaminopropyl-dimethylamine), 또는 이소스테아르아미노프로필-디메틸아민(Isostearaminopropyl-dimethylamine); 소듐메틸코코일타우레이트(sodium methyl cocoyl taurate) 또는 디소듐메틸타우레이트(Disodium methyl taurate); 및 MONAQUATTM계열(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 및 에틸렌 글리콜(Ethylene Glycol) 및 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol) 공중합체(예를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68등)를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 보다 바람직하게, 계면활성제는 폴리소르베이트80이다.

상기 계면활성제의 함량은 부피비가 0.01％-0.05％인 것이 바람직하다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 계면활성제의 함량은 부피비가 0.02％이다.

하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80을 함유한다.

하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 항PD-1단일 클론 항체, 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 단백질 보호제 및 계면활성제를 포함하고, 여기서,

상기 시트르산-시트르산나트륨 완충액의 함량은 10-30 mM이며;

상기 단백질 보호제는 자당, 글리신 및 만니톨 중 한가지 또는 여러 가지로부터 선택되고, 함량은 질량/부피 백분율 0.5-5%이며, 여기서, 질량/부피 백분율은 g/L이고;

상기 계면활성제는 폴리소르베이트80이며, 함량은 부피비가 0.01%-0.05%이고;

상기 항PD-1단일 클론 항체는 SEQ ID NO. 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO. 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는다.

본 발명의 제제는 필요에 따라 등장성 조절제를 함유하거나 함유하지 않으며, 여기서, 상기 등장성 조절제는 당업계의 통상적인 등장성 조절제이다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 등장성 조절제는 염화나트륨이다. 하나의 실시형태에 있어서, 등장성 조절제의 함량은 질량/부피 백분율 0.1-0.5%이고, 여기서 질량/부피비는 g/L이다.

하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 함유하고, 여기서 질량/부피비는 g/L이다.

본 발명은 40℃에서 최대 4주 동안 각 성분의 제제에 대해 고온 가속 시험을 수행하여, 각 제제 배합의 안정성 데이터를 검출하고 평가하였으며, 검출 항목에는, 외관, 농도, 탁도(A350), pH값, 삼투압, 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC) 등 테스트가 포함된다. 테스트 결과에 결합하여, 최적의 제제 배합을 분석하여 얻는다.

하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체, 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 질량/부피 백분율이 3%인 만니톨, 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80, 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 포함하고, pH 5.5이며, 여기서, 질량/부피비는 g/L이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체, 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 질량/부피 백분율이 1-3%인 자당, 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80, 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 포함하고, pH 5.5이며, 여기서 질량/부피비는 g/L이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체, 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 질량/부피 백분율이 1%인 글리신, 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80, 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 포함하고, pH 5.5이며, 여기서 질량/부피비는 g/L이다.

상기 약물 제제의 제형은 당업계의 통상적인 제형일 수 있고, 바람직하게는 주사용 액체 제제 또는 동결 건조 제제 등을 포함한다. 상기 주사용 액체 제제는 바람직하게는 피하 주사 제제, 정맥 주사 제제, 복강 투여 제제, 근육 주사 제제, 정맥/피하 주사 제제 또는 유리체내 주사 제제 등을 포함한다. 상기 주사용 액체 제제는 바람직하게 수침 주사 제제, 사전 충전된 바늘 주사 제제 등을 포함하고, 바람직하게는 수침 주사 제제이며, 상기 수침 주사 제제는 정맥내 주사에 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 주사용 액체 제제 또는 동결 건조 제제 제조에서의 상기 약물 제제의 응용에 관한 것이다.

달리 설명되지 않는 한, 본문에 사용된 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는다. 특정 용어 또는 문구는 특별히 정의되지 않는 한 확실하지 않거나 명확하지 않는 것으로 간주되어서는 아니되고, 당업자가 일반적으로 이해하는 의미에 따라 해석되어야 한다. 본문에서 상품명이 나타나는 경우, 이에 대응되는 상품 또는 그 활성성분을 지칭하기 위한 것이다. 본문에 인용된 각각의 문건(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조 업체의 설명서, 지침 등)은 상기 문장이거나 하기 문장에서 그 전체가 참조로 인용된다. 본문에서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 출원으로부터 우선권을 주장할 수 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본문에 제공된 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예컨대, "예를 들어")의 사용은 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

달리 설명되지 않는 한, 본문에 기재된 농도, 농도 범위 또는 함량과 같은 임의의 수치는 어떠한 경우에도 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치는 일반적으로 상기 수치의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본문에 사용된 바와 같이, 상기 문장 또는 하기 문장에서 명시되지 않는 한, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위 범위, 해당 범위 내의 정수 및 수치의 분수를 포함하는 해당 범위 내의 모든 개별 수치를 명시적으로 포함한다.

"포함"이라는 표현 또는 이와 동의적인 유사 표현 "포괄", "함유" 및 "갖는다" 등은 개방형이고, 별도로 예를 들지 않은 요소, 단계 또는 성분을 배제하지 않는다. "...으로 이루어지다" 또는 "...으로 구성되다"라는 표현은 지정되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "기본적으로...으로 이루어지다"라는 표현은 범위가 지정된 요소, 단계 또는 성분과, 보호하고자 하는 주제의 기본적 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 선택적으로 존재하는 요소, 단계 또는 성분으로 제한되는 것을 의미한다. "포함”이라는 표현은 "기본적으로...으로 이루어지다" 및 "...으로 이루어지다"라는 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 서술되는 사건 또는 상황이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있음을 의미하며, 이러한 서술은 사건 또는 상황이 발생한 것과, 사건 또는 상황이 발생하지 않은 것 모두를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 선택적으로 등장성 조절제를 포함하는 것은 등장성 조절제를 포함하거나 포함하지 않는 상황을 모두 포함한다.

용어 "약물 제제"는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여되는 약품을 지칭하고, 고체 또는 액체 등 형태(즉, "제형")일 수 있으며, 예를 들어, 액체 제제(예를 들어, 주사용 액체 제제), 분말제 및 동결건조제 등이다.

본 발명의 약물 제제는 고온 가속 테스트를 거쳤고, 주요 검출 지표는 현저한 변화가 없으며; 40℃의 조건 하에서 4주 동안 가속 처리한 후 검출 결과에 따르면, 각 주요 검출 지표는 모두 현저한 변화가 없고, 비교적 안정적이며, 모든 검출 결과는 모두 본 제품의 현재 품질 표준 요구에 부합되었고, 양호한 안정성을 나타냈다.

도 1은 h1G4항체 제제 완충계 스크리닝 연구에 대한 가속 안정성 시험(40℃) SEC 단편 함량(%)의 주상도이다.
도 2는 h1G4항체 제제 완충계 스크리닝 연구에 대한 가속 안정성 시험(40℃) 탁도 주상도이다.

본 발명은 실시예에 의해 하기에서 더욱 상세하게 설명될 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

시약의 출처: 본 발명의 실험 부분에 관련된 시약은 모두 시판되는 제품이다.

실시예 1. 시료 테스트 방법

1.1. 삼투압 검출

피펫으로 20 μl의 시료와 2부의 290 mOsmol/kg의 삼투압 표준품을 흡입하고, Advanced 2020형 삼투압 기기를 사용하여 시료 및 표준품의 삼투압 값을 측정하였다.

1.2. SEC-HPLC

Agilent 1260 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여, TOSOH TSK G3000(300*7.8 mm) 크로마토그래피 컬럼으로 시료를 분석하였고, 컬럼의 온도는 실온이며, 유속은 0.5 mL/분이고, 검출 파장은 280 nm이다. 이동상 조성은 100 mM의 PB, 0.5%의 NaCl, pH 6.8이고, 시료를 제공하여 이동상으로 1.0 mg/mL 정도로 희석하며, 시료를 50 μL 주입하고, 정지 시간은 30 분이다.

1.3. CEX-HPLC

Agilent 1260고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여, Thermo ProPac WCX-10 크로마토그래피 컬럼(4 Х 250 mm)으로 시료를 분석하였고, 컬럼의 온도는 35℃이며, 유속은 1.0 mL/분이고, 검출 파장은 280 nm이며, 이동상의 용출 기울기는 표 1에 표시된 바와 같다. 이동상A의 조성은 CX-1 Gradient buffer A, pH 5.6이고, 이동상B의 조성은 CX-1 Gradient buffer B, pH 10.2이며, 시료를 제공하여 이동상A로 1.0 mg/mL 정도로 희석하고, 시료를 20μL 주입하였다.

표 1. 이동상 용출 기울기

1.4. DSC

시차주사 열량측정법으로 시료의 Tm onset, Tm1 및 Tm2 값을 테스트하였다. 시료 스캔 전 플라세보(placebo)로 1.0 mg/ml까지 희석하여야 한다.

실시예 2. 항체의 제조

PD-1항체h1G4는 특허 출원 WO 2018052818에 개시된 h1G4로부터 유래되었고, 그 제조 방법은 WO 2018052818을 완전히 인용하였다. PD-1항체h1G4의 아미노산 서열은 아래와 같다.

표 2. h1G4의 CDR서열

h1G4항체 경쇄(LC) SEQ ID NO: 9

h1G4항체 중쇄(HC) SEQ ID NO: 10

실시예 3. 완충계 스크리닝 연구

본 연구에서는 두 그룹의 서로 상이한 제제 완충계를 대체 처방(이하 각각 B1 ~ B6으로 지칭함)으로 선택하였고, 목표 약물 h1G4항체 농도는 10.0 mg/mL이다. 여기서, B1 ~ B3은 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충계이고, pH값은 각각 5.0, 5.5 및 6.0이며; B4 ~ B6은 20 mmol/L의 히스티딘-히스티딘 염산(histidine-histidine hydrochloric acid) 완충계이고, pH값은 각각 5.0, 5.5 및 6.0이며; 상기 완충계는 모두 3%의 만니톨, 0.02%의 폴리소르베이트80 및 0.3%의 염화나트륨을 보조재료로 함유하고, 여기서, 보조재료의 농도 백분율은 질량/부피비(w/v, g/L)를 지칭한다. h1G4항체 제제 완충계 스크리닝 연구에 대한 대체 처방 정보는 표 3과 같다.

표 3. h1G4항체 제제 대체 완충계 조성

항체 원액을 적정량 취하여 한외 여과에 의해 액체를 바꾸고, 보조재료를 넣어, 농도를 조절하여 표 3과 같은 처방으로 제조하였다. 생물학적 안전 캐비닛(cabinet)에서 0.22 μm의 일회용 멸균 필터를 사용하여 시료를 여과하고, 무균 조건 하에서 2 mL의 바이알(vial)에 나누어 담으며, 13 mm의 고무 마개를 넣어, 13 mm의 알루미늄 플라스틱 복합 캡을 롤링하였다. 나누어 담은 시료를 40℃ 및 2 ~ 8℃의 항온 약용 보관함에 2주 동안 바로 놓고, 0주째, 1주째, 2주째에 각각 샘플링하여, 검출 분석하며, 테스트 항목은 표 4에 나타내었다.

표 4. h1G4항체 완충계 스크리닝 연구 고찰 조건

연구 결과

고온 가속 시험 결과

0주에 20 mmol/L의 pH 5.0의 시트르산계(C50)에서 입자가 나타나는 것을 제외하고, 다른 완충계 외관은 모두 무색의 미세 유광(opalescence) 액체이며, 현저한 가시적 이물질이 없으며, 농도는 9 ~ 11 mg/mL 범위 내에 있고, 삼투압 몰농도는 300 ~ 340 mOsmol/kg이다. SEC 주요 피크의 함량은 99.0%를 초과하고, 응집체의 함량은 0.6 ~ 0.7%이다. CEX주요 피크의 함량은 47.0 ~ 48.6%이고, 산성 피크 함량은 11.0 ~ 14.3%이며, 염기성 피크의 함량은 38.6 ~ 40.9%이고, R-CE-SDS 순도는 94.1 ~ 96.9%이다. 기본적인 물리화학적 검출 결과 0주에서 각 완충계 품질이 양호하고, 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(표 5 참조).

40℃의 가속 조건 하에서 2주 동안 놓은 후, 모든 시트르산-시트르산나트륨 완충계 단백질 농도는 현저한 변화가 없고, 모두 9 ~ 11 mg/mL 범위 내에 있지만, 히스티딘-히스티딘 염산 완충계에서는 농도가 현저하게 상승하였으며, C50, C60 및 H55 완충계에서 단백질 침전이 발생하였고, 히스티딘-히스티딘 염산염(histidine-histidine hydrochloride) 완충계의 탁도(A350: NanoDrop 2000C를 사용하고, 2.5 μL의 시료를 추가하여, 350 nm 파장 하에서의 시료의 흡광도 값을 측정하였다. 3회 중복 측정하여 그 평균 값을 최종 결과로 한다.) 수치가 현저하게 증가하였으므로(도 1 및 도 2 참조), 완충계 우열 순위는 C55 > C60 > C50, H60 > H55 > H50이다. 40 ± 2℃의 조건 하에서 2주 동안 놓고, CE-SDS 측정에 의해 중쇄 함량이 5.4 ~ 23.7% 감소된 것을 발견하였으며, 순도 순서는 C55, H55, H50 > H60 > C50 > C60이다.

40℃의 가속 조건 하에서 2주 동안 놓고, 시트르산-시트르산나트륨 완충계에서 SEC 주요 피크의 함량은 0.1 ~ 2.5% 감소하였으며, 응집체 함량은 0.1 ~ 0.4% 증가하였고, 단편 함량은 0 ~ 2.1% 증가하였다. 그러나, 모든 히스티딘-히스티딘 염산염 완충계 모두에서 현저한 분해 반응이 발생하였으므로, 시트르산-시트르산나트륨 완충계가 히스티딘-히스티딘 염산염 완충계보다 우수하고, 최적의 pH는 5.5이다.

표 5. h1G4항체 완충계 스크리닝 연구 가속 안정성 시험(40℃) 데이터 요약표

유의: N/A는 적용하지 않은 것을 나타낸다.

실시예 4. 보조재료 스크리닝 연구

이번 라운드에서 총 6개의 대체 처방(이하 각각 F1 ~ F6이라고 지칭함)을 연구하였고, 목표 단백질 h1G4항체 농도는 10.0 mg/mL이다. 완충계는 모두 20 mmol/L의 pH 5.5의 시트르산-시트르산나트륨 용액이다. 염화나트륨을 함유하지 않은 처방 F3을 제외하고, 다른 처방은 0.3%의 염화나트륨, 0.02%의 폴리소르베이트80을 함유하고, 여기서, 처방 F1, F2 및 F4에서 만니톨의 함량은 각각 1%, 3% 및 5%이며, 단일 인자로 만니톨 함량이 단백질 안정성에 미치는 영향을 고찰하였다. 처방 F2(0.3%의 NaCl) 및 F3(0%의 NaCl)을 비교하여, 염화나트륨이 단백질의 안정성을 증가시키는데 도움이 되는 지를 고찰하였다. F2, F5 및 F6 처방은 각각 등장성 3%의 만니톨, 3%의 자당 및 1%의 글리신을 함유하고, h1G4항체 제제 장기적 안정성에 도움이 되는 보조재료 체계를 스크리닝하였다. h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 대체 처방 정보는 표 6과 같다.

표 6. h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 대체 처방 조성

원액 적정량을 취하여 한외 여과에 의해 액체를 바꾸고, 보조재료를 넣어, 농도를 조절하여 표 6과 같은 처방으로 제조하였다. 생물학적 안전 캐비닛에서 0.22 μm의 일회용 멸균 필터를 사용하여 시료를 여과하고, 무균 조건 하에서 2 mL의 바이알(vial)에 나누어 담으며, 13 mm의 고무 마개를 넣어, 13 mm의 알루미늄 플라스틱 복합 캡을 롤링하였다. 나누어 담은 시료를 40℃ 및 2 ~ 8℃ 의 항온 약용 보관함에 8주 동안 바로 놓았다. 0주째, 1주째, 2주째, 4주째, 6주째, 8주째에 각각 샘플링하여 검출하였다.

h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 단일 인자 시험은 6개의 처방을 설계하고, 40℃ 가속 안정성 시험 결과 및 보조재료에 따라 우열 배열(표 7 참조)하며, 염화나트륨을 함유하지 않은 처방(F3) 및 5%의 만니톨이 함유된 처방(F4) 안정성이 약간 바람직하지 않았고, 1%의 만니톨(F1), 3%의 만니톨(F2)을 함유한 처방은 3%의 자당을 함유한 처방(F5)과 현저한 차이가 없었다.

표 7. h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 고온 가속 시험 (40℃) 데이터 요약표

유의: N/A는 적용하지 않은 것을 나타낸다. *는 F4 처방이 40 ± 2℃에서 2주 동안 방치된 후 유광 정도가 다른 처방보다 약간 심각한 것을 나타낸다.

실시예 5. 안정제의 스크리닝

이번 라운드 연구는 단일 인자 시험에 의해 제제 처방을 스크리닝하였고, 총 9개의 대체 처방(이하 각각 F7 ~ F15라고 지칭함)을 설계하였으며, 목표 약물 h1G4항체 농도는 10.0 mg/mL이다. 여기서, 처방 F7 ~ F14의 완충계는 모두 20 mmol/L 의 pH 5.5인 시트르산-시트르산나트륨이고, F15는 20 mmol/L의 시트르산나트륨-인산수소이나트륨(sodium citrate-disodium hydrogen phosphate)이며, 제제 보조재료 스크리닝 연구 대체 처방 정보는 표 8과 같다.

표 8. h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 대체 처방 조성

원액을 적정량 취하여 한외 여과에 의해 액체를 바꾸고, 보조재료를 넣어, 농도를 조절하여 표 8과 같은 처방으로 제조하였다. 생물학적 안전 캐비닛에서 0.22 μm의 일회용 멸균 필터를 사용하여 시료를 여과하고, 무균 조건 하에서 2 mL의 바이알(vial)에 나누어 담으며, 13 mm의 고무 마개를 넣어, 13 mm의 알루미늄 플라스틱 복합 캡을 롤링하였다. 나누어 담은 시료를 40℃의 항온 셰이커(shaker)에 넣고 4주 동안 200 rpm으로 셰이킹하였다. 0주째, 1주째, 2주째, 4주째에 각각 샘플링하고, 검출 분석하였다(표 9 참조).

표 9. h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 고찰 조건

연구 결과

0주에 모든 처방에서 모두 무색 투명한 액체가 관찰되었고, 뚜렷한 가시적 이물질이 없었으며, 농도는 9 ~ 11 mg/mL 범위 내에 있고, 삼투압은 185 ~ 540 mOsmol/kg이며, 탁도(A350)는 0.006 ~ 0.009이다. SEC 주요 피크 함량은 98.0 ~ 98.2%이고, 응집체 함량은 1.7 ~ 1.9%이다. CEX 주요 피크 함량은 35.4 ~ 39.1%이고, 산성 피크 함량은 31.6 ~ 33.8%이며, 염기성 피크 함량은 27.5 ~ 30.8%(표 10 참조)이다. 기본 이화학적 검출 결과는 0주에서 각 처방 품질이 양호하고, 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.

40℃에서 최대 4주 동안의 가속 처리 후, 시트르산나트륨-인산수소이나트륨 완충계가 h1G4항체의 안정적인 보존에 적합하지 않음을 알 수 있다.

표 10. h1G4항체 제제 보조재료 스크리닝 연구 셰이킹 안정성 시험(40℃, 200 rpm) 데이터 요약표

유의: N/A는 적용하지 않은 것을 나타낸다.

결과에 따르면, 본 발명의 h1G4 제제 완제품이 40℃ 조건 하에서 최대 4주 동안 보관되는 경우, 외관, 가시적 이물질, 단백질 함량, SEC, CEX, pH, 삼투압에 모두 현저한 변화 경향이 없는 것으로 나타났고, 모두 본 제품의 현행 품질 표준 초안의 요구에 부합되어, 상기 제제의 안정성이 우수함을 나타낸다.

본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있고, 이러한 등가적 형태도 본 출원의 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 범위에 속한다는 것을 이해해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI HENLIUS BIOTECH, INC. <120> PROGRAMMED CELL DEATH RECEPTOR 1 ANTIBODY FORMULATION AND USE THEREOF <141> <160> 10 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <223> h1G4 LCDR1 <400> 1 Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(7) <223> h1G4 LCDR2 <400> 2 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> h1G4 LCDR3 <400> 3 Gln Gln His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> h1G4 HCDR1 <400> 4 Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) <223> h1G4 HCDR2 <400> 5 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> VSYYYGIDF <400> 6 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe 1 5 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(116) <223> h1G4 VH <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <223> h1G4 VL <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(214) <223> h1G4 ?? 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<400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440

Claims

항PD-1단일 클론 항체, 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 단백질 보호제, 계면활성제를 포함하고;
상기 시트르산-시트르산나트륨 완충액의 함량은 10-30 mM이며;
상기 단백질 보호제의 함량은 질량/부피 백분율 0.5-5%이고, 자당, 글리신 및 만니톨 중 한가지 또는 여러 가지로부터 선택되며, 질량/부피비는 g/L이고;
상기 계면활성제는 폴리소르베이트80이며, 상기 계면활성제의 함량은 부피비 0.01%-0.05%이고;
상기 항PD-1단일 클론 항체는 SEQ ID NO. 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO. 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 항PD-1단일 클론 항체의 약물 제제.
제1항에 있어서,
상기 약물 제제는 등장성 조절제 염화나트륨을 더 포함하고, 함량은 질량/부피 백분율 0.1-0.5%이며, 질량/부피비는 g/L인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 약물 제제의 pH값은 5.0-6.5인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질 보호제는 만니톨 또는 자당이고, 상기 단백질 보호제의 함량은 질량/부피 백분율 1-5%이며, 질량/부피비는 g/L인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항PD-1단일 클론 항체의 단백질 농도는 5-50 mg/ml인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항PD-1단일 클론 항체는 h1G4항체이고, SEQ ID NO. 10로 표시되는 중쇄와 SEQ ID NO. 9로 표시되는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체, 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 질량/부피 백분율이 3%인 만니톨, 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80, 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 포함하고, pH 5.5이며, 질량/부피비는 g/L인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체, 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 질량/부피 백분율이 1-3%인 자당, 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80, 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 포함하고, pH 5.5이며, 질량/부피비는 g/L인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물 제제는 10 mg/ml의 항PD-1단일 클론 항체, 20 mmol/L의 시트르산-시트르산나트륨 완충액, 질량/부피 백분율이 1%인 글리신, 부피 백분율이 0.02%인 폴리소르베이트80, 질량/부피 백분율이 0.3%인 염화나트륨을 포함하고, pH 5.5이며, 질량/부피비는 g/L인 것을 특징으로 하는 약물 제제.
주사용 액체 제제 또는 동결 건조 제제 제조에서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 약물 제제의 응용.