KR20220101631A - 간 질환 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

대상체에서 간세포의 핵으로 전사 인자인 HNF4α의 수송 또는 보유를 증가시켜 대상체에서 간 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자 및 그의 기능적 단편의 발현 또는 기능을 상향 조절하고/하거나 하나 이상의 전사 인자 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK 및 그의 기능적 단편의 발현 또는 기능을 하향 조절하는 것을 포함한다.

Description

간 질환 치료를 위한 조성물 및 방법.
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 10월 16일자 출원된 미국 가출원 번호 62/915,765의 우선권을 주장하며, 전체로서 본원에 참조로 도입된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 대한 진술
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 부여한 승인 번호 DK099257에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
본 개시는 예를 들어 간 질환 및/또는 간 장애를 치료하기 위한 HNF4α 발현 또는 활성의 조절과 관련이 있다.
진행성 간경변(advanced liver cirrhosis)으로 인한 말기 간기능 부전(TLF)은 2015년 전 세계적으로 인구 100,000명당 15.8명이 사망하는 12번째 주요 사망 원인으로 나타났다 (Tsochatzis EA et al., 2014). 미국에서 2015년 만성 간 질환과 간경변으로 인한 사망 등록 건수는 40,326명이었고 사망률은 인구 100,000명당 12.5명으로 연간 3.8% 증가했다 (Murphy SL et al., 2017; Goldman L, et al., 2016). 가장 영향을 받는 연령대는 45세에서 64세 사이이며, 사망률은 인구 100,000명당 26.4명으로, 만성 간 질환 및 간경변이 이 연령대에서 암, 심장 질환, 및 의도치않은 부상에 이어 네 번째 주요 사망 원인이다 (Murphy SL et al., 2017). TLF에 대한 유일한 결정적인 치료법은 간 이식이 필요한 환자의 수와 사용 가능한 장기의 불충분한 수를 고려할 때 TLF를 근본적으로 치료할 수 없는 질병으로 만드는 치환 간 이식(orthotopic liver transplantation)이다 (Lopez PM et al., 2006).
간염 바이러스에 의한 만성 감염, 알코올-매개 간경변, 및 비-알코올성 지방간염(NASH)을 포함하여 만성 간 질환의 원인은 다양하며 (Archambeaud I et al., 2015; Donato F et al,. 2006; Gelatti U et al., 2005; Kuper H et al., 2000), 각각은 간세포 부전을 일으킬 수 있다 (Guzman-Lepe J et al., 2018; Hernaez R et al., 2017; Lee YA et al., 2015; Pessayre D et al., 1978). 인간의 간세포 기능의 악화와 궁극적으로 간 부전의 원인이 되는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다.
만성 간질환, 간경변, 및 최근 TLF의 주요 원인은 B형 및 C형 간염 바이러스에 의한 감염, 알코올 매개 Laennec's 간경변, 비알코올성 지방간염(NASH)/대사 증후군과 관련이 있다 (Archambeaud et al., 2015; Donato F et al., 2006; Gelatti et al., 2005; Kuper et al., 2000). 이러한 병인(etiologic agent)은 혈관 구조의 변경으로 정상적인 소엽 구조(lobular architecture)를 방해하는 섬유증을 유발한다 (Goldman L, et al., 2016). 이러한 병리학적 변화는 간세포 부전 및 간세포가 정상적인 기능을 수행하지 못하는 것과 관련이 있으나 (Guzman-Lepe J et al., 2018; Hernaez R et al., 2007; Lee Ya et al., 2015; Pessayre D et al., 1978), 간세포 기능의 악화와 궁극적으로 간 부전에 대한 메커니즘은 인간에게 알려져 있지 않다. 만성 간 손상은 세포 사멸을 유도하는 (Cichoz-Lach H et al., 2014; Malhi H et al., 2011; Zhang XQ et al., 2014; Wang K et al., 2014; Seki E et al., 2015) 산화 스트레스 (Cichoz-Lach H et al., 2014; Simoes ICM et al., 2018) 및 소포체 스트레스 (Malhi H et al., 2011; Zhang XQ et al., 2014)를 생성하며, 궁극적으로 간세포의 증식 능력을 감소시킨다 (Zhang BH et al., 1999; Michalopoulos GK et al., 2015; Dubuquoy L et al., 2015).
말기 간경변이 있는 쥐의 간세포에서 간-강화 전사 인자는 안정적으로 하향조절되고 (Nishikawa T et al., 2014; Guzman-Lepe J et al., 2019), 그 중 하나인 간세포 핵 인자 4 알파 (hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF4α)의 강제 재발현은 기능 장애 간세포를 재프로그래밍하여 배양 및 생체 내 모두에서 기능을 회복하는 것으로 확인되었다 (Nishikawa T et al., 2014). 진행성 간 질환 환자의 대규모 코호트 연구는, 병든 간에서 HNF4α mRNA 발현 수준이 간 기능 장애의 정도 (Childs-Pug 분류)와 상관관계가 있으며, HNF4α 발현이 핵에 국한되지 않음을 보여준다 (Guzman-Lepe J et al., 2019). 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α)의 강제 재발현은 새로운 간세포 또는 줄기 세포의 확장 없이도 말기 간경변 간에서 기능 장애 간세포를 재프로그래밍하여 배양 및 생체 내에서 다시 기능하도록 할 수 있다 (Nishikawa T et al., 2014). HNF4α 핵 국소화 및 mRNA 발현의 상당한 감소를 포함한 LETF의 하향 조절은 TLF가 있는 인간 간의 대규모 코호트에서 간 기능 장애 정도와 관련이 있다 (Guzman-Lepe J et al., 2018).
HNF4α는 성인 간에서 간 기관 형성 및 간세포 기능에 중요한 역할을 하는 전사 인자이다 (Nishikawa T et al., 2014; Babeu JP et al., 2014). 주요 HNF4α 작용은 지질, 포도당, 생체이물(xenobiotic), 및 약물 대사와 관련된 특정 표적 유전자의 조절이다 (Nishikawa T et al., 2014; Babeu JP et al., 2014). 단일 유전자는 인간에서 HNF4α를 암호화하며 (Kritis AA et al., 1999), 이는 두 개의 다른 프로모터에 의해 조절된다. 이러한 프로모터는 P1 및 P2의 두 가지 이소형 부류를 생성한다 (Babeu JP et al., 2014). P1 이소형은 주로 성인 간에서 발현되는 반면, P2 이소형은 배아 발달 및 암과 같은 병리학적 조건 하에서 간에서 검출되었다 (Babeu JP et al., 2014; Walesky C et al., 2015; Tanaka T et al., 2006). HNF4α의 발현과 기능은 여러 수준에서 조절된다 (Chellappa K et al., 2012; Guo H et al., 2014; Hong YH et al., 2003; Lu H et al., 2016, Song Y et al., 2015; Soutoglou E et al., 2000; Sun K et al., 2007; Xu Z et al., 2007; Yokoyama A et al., 2011; Zhou W et al., 2012).
따라서, HNF4α 발현을 조절하고/하거나 간 질환 및/또는 간 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 필요하다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 이러한 요구 및 기타 요구를 다룬다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 간 질환 치료에서 충족되지 않은 특정 요구를 다룬다. 일부 측면에서, 간 질환 및/또는 간 장애의 치료용 약제를 위한 조성물 및 이의 용도가 본원에 개시되며, 여기서 상기 조성물은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및/또는 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양 또는 기능을 증가시키거나 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 벡터이고, 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및/또는 POM121C 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 HNF4α (예를 들어, HNF4α 이소형 2)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 간세포에서 HNF4α의 양의 놀라운 증가를 초래하여 (예를 들어, 간세포에서 HNF4α 총량의 증가, 및/또는 간세포의 핵에서 HNF4α의 양의 증가), 간 질환의 효과적인 치료를 초래한다 (예를 들어, 말기 간 질환).
일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 개시하며, 여기서 상기 조성물은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 양 또는 기능을 증가시킨다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환 치료용 약제의 제조를 위한 조성물의 용도를 개시하며, 여기서 상기 조성물은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 양 또는 기능을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 벡터이고, 여기서 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 PROX1 및/또는 SREBP1를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 상기 하나 이상의 핵산은 DNA 또는 mRNA일 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 개시하며, 여기서 상기 조성물은 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환 치료용 약제의 제조를 위한 조성물의 용도를 개시하며, 여기서 상기 조성물은 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 양 또는 기능을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 투여는 대상체의 간세포 핵에서 HNF4α의 양을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 투여는 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 투여는 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α을 암호화하는 핵산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 HNF4α를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 더 포함한다. 일 예시에서, 상기 핵산은 HNF4α 이소형 2를 암호화한다.
일부 측면에서, 본 발명은 벡터를 포함하는 조성물을 개시하며, 여기서 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자, 및 이의 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 HNF4α 이소형 2를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 개시한다.
일부 측면에서, 본 발명은 간 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 벡터의 용도를 개시하며, 여기서 상기 벡터는 HNF4α 이소형 2를 암호화하는 핵산을 포함한다.
도 1A-1C는 정상 및 간경변 간의 간세포에서 HNF4α 위치를 나타낸다. 도 1A는 NASH 비대상 간에서 분리된 간세포 및 정상 인간 간세포의 HNF4α 면역형광의 대표 사진을 나타낸다. 기능적으로 비대상된 간 (NASH 및 알코올-매개 Laennec's 간경변)(n=6)에서 분리된 간세포 및 정상 간 대조군(n=2)에서 분리된 간세포에서 베타-액틴으로 정규화된 HNF4α의 웨스턴 블롯 분석 및 정량화. 도 1A는 총 HNF4α를 나타낸다; 정상 인간 간세포 vs 비대상 인간 간세포, P = 0.166. 도 1B는 세포질 HNF4α를 나타낸다; 정상 인간 간세포 vs 비대상 인간 간세포, P = 0.023. 도 1C는 핵 HNF4α를 나타낸다; 정상 인간 간세포 vs 비대상 인간 간세포, P = 0.023). A에서 C까지의 그래프는 평균±SD로 표시된다. 통계적 유의미(P < 0.05). 다이아몬드는 Child-Pugh "B"를 나타내고 사각형은 Child-Pugh "C"를 나타낸다.
도 2A-2C는 HNF4α 번역 후 변형자의 단백질 발현 및 스피어만 순위 상관 테스트를 보여준다. 도 2A 및 2B는 비대상 NASH(n=4) 및 알코올 매개 Laennec's 간경변 간세포(n=2) 및 정상 대조군 간세포(n=2)에서 EGFR(P=0.904), cMET(P=0.023), 총 AMPKα(P > 0.999), p-AMPKα(Thr172)(P=0.547), 총 AKT(P=0.047), p-AKT(Ser473)(P=0.547), p-AKT(Thr308)(P=0.024), p-AMPKα(Thr172)/AMPKα 비율(P=0.5476), p- AKT(Ser473)/AKT 비율(P=0.1667) 및 p-AKT(Thr308)/총 AKT 비율(P=0.0238)의 웨스턴 블롯 분석(2A) 및 정량화(2B)를 보여준다. 도 2B에서 채워진 사각형은 Child-Pugh "B"를 나타내고 채워진 다이아몬드는 Child-Pugh "C"를 나타낸다. 도 2C는 스피어만 순위 상관 테스트가 표시되고 핵 HNF4α가 cMET (r=0.71; P=0.037), 총 AKT (r=0.71; P=0.037), 포스포-AKT(Thr308) (r=0.82; P=0.011), 및 포스포-AKT(Thr308)/총 AKT 비율 (r=0.73; P=0.031)과 유의한 상관관계가 있음을 보여준다. 세포질 HNF4α는 cMET (r=-0.80; P=0.014), 총 AKT (r=-0.73; P=0.031), 포스포-AKT(Thr308) (r=-0.77; P=0.021, 및 포스포-AKT(Thr308)/총 AKT 비율 (r=- 0.72; P=0.037)과 유의한 상관관계를 나타낸다. 도 2B의 막대 그래프는 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의미(P < 0.05).
도 3A-3D는 번역 후 변형자와 HNF4α 세포 국소화의 관계를 보여준다. 도 3A는 경로 분석이 cMET(0.56; P=0.004), 포스포AKT(Thr308)/총 AKT 비율(0.05; P=0.006) 및 총 HNF4α 수준(0.60; P=0.042)과 HNF4α 국소화 사이에 유의한 직접적 관계가 있음을 보여준다. 경로 분석은 cMET과 총 HNF4α(-0.37; P=0.024) 사이에 음의 유의한 관계가 있음을 보여준다. 도 3B는 선형 회귀 분석이 핵 HNF4α 발현과 간 기능 장애의 정도(Child-Pugh 점수)의 유의한 관계를 보여줌(R2=0.80, P=0.007)을 도시한다. 도 3C는 주성분 분석(PCA)이 HNF4α 발현과 상관관계가 있는 단백질 프로파일을 보여주며 정상 인간 간세포(n=2)의 특성을 명확히 설명하는 반면, 세포질 HNF4α, 활성 카스파제 3, p-AKT(Ser473)/총 AKT 비율 및 p-AMPK(Ser172)/AMPK는 NASH(n=4) 및 알코올 매개 Laennec's 간경변 간(n=2)의 비대상된 인간 간세포의 특성을 설명한다. 도 3D의 그래프는 정상 인간 간세포와 비교하여 비대상 인간 간세포(차일드-퍼 분류 B 및 C)에서 전체, 핵 또는 세포질 HNF4α(상단 행의 세 그래프), cMET, p-AMPK(Ser172)/AMPK, p-AKT(Ser473)/총 AKT 및 포스포AKT(Thr308)/총 AKT 비율, p-H3(Ser10) 및 활성화된 카스파제 (두 번째 및 맨 아래 행의 그래프)의 PCA 분석에 사용된 단백질 발현 배수 변화를 보여준다. 그래프는 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의미(P < 0.05).
도 4A-4C는 핵 HNF4α의 아세틸화가 NASH 및 알코올 매개 Laennec's 간경변 외식 간(explanted liver)의 인간 비대상 간세포에서 변화됨을 나타낸다. 도 4A 및 4B는 비대상 NASH(n=4) 및 알코올 매개 Laennec's 간경변(n=4) 외식간(P=0.024)에서 인간 간세포의 핵 분획에서 HNF4α(Lys106)의 아세틸화된 형태의 웨스턴 블롯 및 정량화를 보여준다. 도 4C의 선형 회귀 분석은 감소된 아세틸화 형태의 HNF4α(Lys106)와 간 기능 장애(R2=0.71, P=0.004)의 유의한 상관 관계를 보여준다. 막대 그래프는 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의미(P < 0.05).
도 5는 HNF4α 번역 후 변형(PTM)의 인 실리코 분석을 보여준다. 도 5는 HNF4α-PTM의 목록을 제공한다.
도 6A-6B는 활성화된 AKT 경로와 HNF4α 번역 후 변형자와 NASH 및 알코올 매개 Laennec's 간경변 외식간에서 인간 비대상 간세포의 p-EGFR 발현과의 관계를 보여준다. 도 6A는 포스포-AKT(Thr308)/AKT에 대한 스피어만 상관관계를 보여준다. 도 6B는 포스포-AKT(Ser473)/AKT에 대한 스피어만 상관관계를 보여준다.
도 7A-7C는 갓 분리된 정상 인간 간세포와 비교하여 mRNA 수준(도 7A)에서, 및 알코올 간염 간세포의 약 40%만이 약한 강도로 핵에서 HNF4α를 발현하고 세포의 약 10%가 HNF4α 세포질 발현을 갖는다는 것을 면역조직화학에 의해 입증하여 단백질 수준(도 7B)에서 알코올성 간염 환자의 외식된 간에서 분리한 인간 간세포에서 간-강화 전사 인자 HNF4α의 발현 수준을 보여준다. 도 7C의 경우, 갓 분리된 인간 알코올 간염 간세포를 HNF4α를 암호화하는 렌티바이러스(Systems Bioscience, Cat#CS970S-1; CD511B-1의 HNF4α)로 처리했다. 이 도면은 72시간 후에, HNF4α 발현이 핵에서 HNF4α를 발현하는 간세포의 백분율을 변경하지 않았음을 보여준다. 그러나 HNF4α 발현 강도는 기존 세포에서 급격히 증가하였다. 전체적으로 이 데이터는 핵으로의 HNF4α 수송이 알코올성 간염에 걸린 인간에서 간세포가 기능을 회복하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다.
도 8A-8F는 1차 인간 간세포에서 MTF1 발현을 보여준다. 도 8A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 MTF1(MA5-26738 1:1000) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여준다. 도 8B 및 8C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 HNF4α(도 8B 및 8C) 및 MTF1(도 8D 및 8E)의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. HNF4α 및 MTF1의 발현은 차일드 B 간세포에 비해 차일드 C 간세포에서 더 낮았다. 도 8B 및 8D, *p<0.003, **p<0.01, ***p<0.0001, n=25. 도 8C R2=0.019, p=0.06, n=19. 도 8E R2=0.015, p=0.1, n=19. 도 8F는 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 MTF1과의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 어두운 회색 원은 차일드 C를 나타낸다. HNF4α의 단백질 발현은 MTF1의 단백질 발현과 상관관계가 있다(R2=0.28, p=0.007, n=25).
도 9A-9D는 1차 인간 간세포에서 NR0B2 발현을 보여준다. 도 9A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 NR0B2(Abclonal A1836 1:500) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여준다. 도 9B 및 9C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 NR0B2의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. 도 9B *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n=25. 도 9C R2=0.19, p=0.06, n=19. NR0B2의 발현은 차일드 C, 차일드 B 및 대조군 간세포에서 다르다. 도 9D 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 NR0B2와의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 짙은 회색 원은 차일드 C를 나타낸다(R2=0.12, p=0.1, n=25).
도 10A-10D는 1차 인간 간세포에서 NR5A2 발현을 보여준다. 도 10A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 NR5A2(Novus NBP2-27196 1:500) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여준다. 도 10B 및 10C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 NR5A2의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. 도 10B *p<0.05, n=25. 도 10C R2=0.17, p=0.07, n=19. NR5A2의 발현은 차일드 B, 차일드 C 및 대조군 간세포에서 다르다. 도 10B는 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 NR0B2와의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. NR5A2의 단백질 발현은 HNF4α의 발현과 상관관계가 있다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 짙은 회색 원은 차일드 C를 나타낸다(R2=0.17, p<0.05, n=25).
도 11A-11D는 1차 인간 간세포에서 Prox1 발현을 보여준다. 도 11A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 PROX1(R&D AF2727 1:500) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여준다. 도 11B 및 11C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 PROX1의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. 도 11B *p<0.02, n=25. 도 11C R2=0.02, p=0.6, n=19. PROX1의 발현은 차일드 C 및 대조군 간세포에서 다르다. 도 11D는 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 PROX1과의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 짙은 회색 원은 차일드 C를 나타낸다(R2=0.02, p=0.46, n=25).
도 12A-12D는 1차 인간 간세포에서 POM121C 발현을 보여준다. 도 12A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 POM121C(PA5-85161 1:500) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여준다. 도 12B 및 12C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 POM121C의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. 도 12B n=25. 도 12C R2=0.08, p=0.24, n=25. 도 12D는 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 POM121C와의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 짙은 회색 원은 차일드 C를 나타낸다(R2=0.06, p=0.23, n=25).
도 13A-13D는 1차 인간 간세포에서 SREBP1 발현을 보여준다. 도 13A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 SREBP1(Abcam ab28481 1:500) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여준다. 도 13B 및 13C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 SREBP1의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. 도 13B n=25. 도 13C R2=0.02, p=0.54, n=19. 도 13D는 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 SREBP1과의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 짙은 회색 원은 차일드 C를 나타낸다(R2=0.01, p=0.86, n=25).
도 14A-14D는 1차 인간 간세포에서 EP300 발현을 보여준다. 도 14A는 NASH 또는 알코올 유발 간경변증으로 간 이식을 받은 환자의 간에서 분리된 1차 인간 간세포가 웨스턴 블롯에 의해 EP300(Novus NB100-616 1:500) 및 HNF4α(ab41898 1:1000)의 발현에 대해 분석되었음을 보여줍니다. 도 14B 및 14C는 대조군 간세포, 차일드 B 간세포 및 차일드 C 간세포 중 EP300의 상대 강도가 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)에 의해 비교되었음을 보여준다. 도 14B n=25. 도 14C R2=0.32, p=0.01, n=19. 도 14D는 차일드-퍼 점수, HNF4α의 단백질 발현 및 EP300과의 상관 관계 연구가 단순 선형 회귀를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 검은색 원은 대조군, 밝은 회색 원은 차일드 B, 짙은 회색 원은 차일드 C를 나타낸다(R2=0.01, p=0.69, n=25).
도 15A 및 B는 HepG2 세포에서 EP300, MTF1, NR0B2, NR5A2, POM121C, PROX1 또는 SREBP1의 CRISPR/Cas9 녹아웃이 수행되었고 세포 HNF4α 위치가 면역형광에서 분석되었음을 보여준다(ab41898 1:500). DAPI 및 HNF4α에서 양성인 핵의 총 수(도 15A) 및 세포질에서 HNF4α에 대해 양성인 세포(도 15B)를 카운팅하였다. 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행했다. EP300, MTF1, NR0B2, NR5A2, POM121C, PROX1 및 SREBP1의 녹아웃은 HNF4α의 핵 위치 감소와 HNF4α의 세포질 위치 증가를 보여주었다. *p<0.05.
도 16은 간 이식을 겪은 NASH 환자로부터 분리된 1차 인간 간세포가 105의 MOI를 갖는 AAV-MTF1, NR0B2, NR5A2, POM121C, PROX1, SREBP1 또는 GFP 및 AAV-HNF4α로 형질도입되었음을 나타낸다. HNF4α에 대해 양성인 핵의 백분율을 계산했다. 다중 비교를 위해 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트와 함께 일원 분산 분석(One-Way ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행했다. HNF4α, MTF1, NR0B2, POM121C, PROX1 및 SREBP1과의 동시 형질도입은 GFPHNF4α 동시 형질도입 그룹에 비해 증가된 양성 핵의 수를 갖는다 (****p<0.0001, ***p<0.0005, **p<0.001, *p<0.05).
본원은 대상체에서 간세포의 핵으로 전사 인자인 HNF4α의 발현 및/또는 수송 또는 보유를 증가시켜 대상체에서 간 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자 및 그의 기능적 단편의 발현 또는 기능을 상향 조절하고/하거나 하나 이상의 전사 인자 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK 및 그의 기능적 단편의 발현 또는 기능을 하향 조절하는 것을 포함한다. 이러한 전사 인자가 HNF4α의 발현 및/또는 국소화를 조절하여 간 질환 치료에 사용될 수 있다는 것은 놀라운 발견이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자, 및 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 (예를 들어, DNA, ceDNA, 또는 mRNA)을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 HNF4α(예를 들어, HNF4α 이소형 2)를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA, ceDNA 또는 mRNA)을 포함하는 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 또는 추가 구현예에서, 상기 방법은 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 조성물은 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자, 및 그의 기능적 단편의 양을 감소시키거나 기능을 억제한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 Lys106에서 HNF4α의 아세틸화를 증가시키는 단계, cMET의 발현을 증가시키는 단계, 및/또는 Thr308에서 인산화를 통해 AKT의 활성화를 증가시키는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 방법은 간세포의 핵에서 HNF4α의 양을 놀랍게도 증가시키는 것으로 나타났다. HNF4α의 이러한 조작은 간 질환 환자의 간세포 기능을 향상시킨다.
본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어는 당업자에게 통상적이고 일반적인 의미로 해석되어야 한다. 그러나 출원인은 다음과 같은 용어에 아래 제공된 특정 정의가 부여되기를 바란다.
용어
명세서 및 청구범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수의 인용을 포함한다. 예를 들어, 용어 "a cell"은 이의 혼합물을 포함하는 복수의 cells을 포함한다.
양, 백분율 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 본원에서 사용된 용어 "약"은 측정 가능한 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, 또는 ±1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
대상체에 대한 "투여" 또는 "투여하는"은 대상체에게 제제를 도입하거나 전달하는 모든 경로를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있으며, 정맥내, 복강내 등을 포함한다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 및 그의 변형은 용어 "포함하는(including)" 및 그의 변형과 동의어로 사용되며 개방적, 비제한적인 용어이다. 용어 "포함하는(comprising)" 및 "포함하는(including)"이 다양한 구현예를 설명하기 위해 본원에서 사용되었지만, 용어 "~로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "~로 구성되는(consisting of)"는 "포함하는(comprising)" 및 "포함하는(including)" 대신에 보다 구체적인 구현예를 제공하기 위해 사용될 수 있고 또한 개시되어 있다.
"조성물"은 유익한 생물학적 효과가 있는 임의의 제제를 의미한다. 유익한 생물학적 효과는 치료적 효과 (예: 장애 또는 기타 바람직하지 않은 생리학적 상태의 치료)와 예방 효과 (예: 장애 또는 기타 바람직하지 않은 생리학적 상태 (예: 간 질환)의 예방)를 모두 포함한다. 상기 용어는 또한 본원에 구체적으로 언급된 유익한 제제의 약학적으로 허용가능한, 약리학적 활성 유도체를 포함하며, 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 세포, 염, 에스테르, 아마이드, 촉진제(proagent), 활성 대사물, 이성질체, 단편, 유사체 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. "조성물"이라는 용어가 사용되는 경우, 또는 특정 조성물이 구체적으로 확인되는 경우, 그 용어는 조성물 그 자체뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 약리학적 활성 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 염, 에스테르, 아마이드, 촉진제, 접합체, 활성 대사물, 이성질체, 단편, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물은 벡터를 포함하며, 여기서 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자, 및 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물은 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자, 및 이의 기능적 단편의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물은 벡터를 포함하며, 여기서 상기 벡터는 HNFα를 암호화하는 핵산을 포함한다.
"유효량"은 의학적 상태 EH는 장애 (예: 간 질환)의 증상 또는 징후를 개선, 전환, 완화, 예방 또는 진단할 수 있는 양을 제한 없이 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 명시적으로 또는 문맥에 따라 "유효량"은 상태를 개선하기에 충분한 최소량으로 제한되지 않는다. 질병 또는 장애의 중증도, 및 질병 또는 장애를 예방, 치료 또는 완화하는 치료 능력은 제한 없이 바이오마커 또는 임상 파라미터에 의해 측정될 수 있다. 용어 "벡터의 유효량" 또는 "조성물의 유효량"은 간 질환의 일부 완화 또는 간 기능의 회복을 야기하기에 충분한 벡터 또는 조성물의 양을 지칭한다.
"단편"은 다른 서열에 부착되었는지 여부에 관계없이, 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 기타 선택된 변형을 포함할 수 있다 (단, 단편의 활성이 비변형된 펩타이드 또는 단백질과 비교하여 크게 변경되거나 손상되지 않는다). 이러한 변형은 이황화 결합이 가능한 아미노산의 제거 또는 추가, 생체 수명(bio-longevity) 증가, 분비 특성 변경 등과 같은 일부 추가 속성을 제공할 수 있다. 어떠한 경우든 단편은 표적 유전자의 전사를 조절하는 것과 같은 생리활성 특성을 가져야 한다.
용어 "유전자" 또는 "유전자 서열"은 암호화 서열 또는 제어 서열, 또는 이의 단편을 지칭한다. 유전자는 암호화 서열과 조절 서열, 또는 이의 단편의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 언급되는 "유전자"는 천연 유전자의 전부 또는 일부일 수 있다. 본원에서 언급된 폴리뉴클레오타이드 서열은 용어 "유전자"와 상호교환적으로 사용될 수 있거나, 임의의 암호화 서열, 비-암호화 서열 또는 조절 서열, 이의 단편, 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "유전자" 또는 "유전자 서열"은, 예를 들어 암호화 서열의 상류에 있는 제어 서열(예를 들어, 리보솜 결합 부위)을 포함한다.
본원에 사용된 "간 질환"은 일반적으로 간에 영향을 미치는 질환, 장애 및 상태를 나타내며, 예를 들어 간세포에 지방의 단순 축적(지방증), 비알코올성 지방간염(NASH), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 알코올 간 질환(ALD), 알코올-관련 간 질환(지방간, 알코올성 간염, 알코올-관련 간경변을 포함하나 이에 제한되지 않음), 거대수포성 지방증, 문맥주위 및 소엽 염증(지방간염), 간경변, 섬유증, 간 허혈, 간세포 암종을 포함한 간암, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 특발성 간 질환, 말기 간 질환 및 간부전을 포함하는 광범위한 중증도를 가질 수 있다. "간경변"은 간 조직 및/또는 재생 결절의 섬유성 비후를 특징으로 하는 간의 만성 질환으로 본원에서 정의된다. "간경변"의 정도 또는 중증도는 차일드-퍼 점수(Child-Pugh score)에 의해 지정될 수 있으며, 여기서 5가지 임상 측정값인 총 빌리루빈(bilirubin) 수준, 혈청 알부민, 프로트롬빈 시간 연장, 복수(ascite) 및 간성 뇌병증이 1점, 2점, 및 3점 값의 점수 시스템을 사용하여 각 임상 측정값의 다양한 수준에 대해 채점되며 3점 값은 각 측정의 가장 심각한 수준에 할당된다. 차일드-퍼 점수 및 분류에 도달하기 위해 5개 측정값 모두에 대한 총점이 추가된다. 5-6점은 차일드-퍼 분류 A, 7-9점은 차일드-퍼 분류 B, 10-15점은 차일드-퍼 분류 C이다. 일반적으로 차일드-퍼 분류 A는 가장 덜 심각한 간 질환을 나타내며, 차일드-퍼 분류 C는 가장 심각한 간 질환을 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 차일드-퍼 분류 B 또는 차일드-퍼 분류 C 간 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 차일드-퍼 분류 A 간 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 다양한 측면에서, 상기 방법은 대상체의 차일드-퍼 점수를 개선한다. 일부 구현예에서, 상기 간 질환은 알코올성 간염이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 생체외 관류를 위해 허혈성 공여자 간을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 간 절제 전 또는 후를 포함하는 암 치료 전 또는 후에 간암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오타이드로 구성된 중합체 (예: 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA))를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "리보핵산" 및 "RNA"는 리보뉴클레오타이드로 구성된 중합체를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "데옥시리보핵산" 및 "DNA"는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 중합체를 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 DNA(예: ceDNA 또는 cDNA)이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 mRNA이다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단량체로 구성된 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드"는 D- 또는 L-아미노산의 단일 사슬 또는 펩타이드 결합으로 연결된 D- 및 L-아미노산의 혼합물로 구성된 화합물을 지칭한다.
용어 "프로모터" 또는 "조절 요소"는 전사의 시작으로부터 상류 또는 하류에 위치하고 전사를 개시하기 위한 RNA 폴리머레이스 및 기타 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 영역 또는 서열 결정자를 지칭한다. 프로모터는 박테리아 기원일 필요는 없으며, 예를 들어 바이러스 또는 다른 유기체로부터 유래된 프로모터는 본원에 기재된 조성물, 시스템 또는 방법에서 사용될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 담체"(때때로 "담체"라고도 함)는 일반적으로 안전하고 무독성인 약학적 또는 치료적 조성물을 제조하는 데 유용한 담체 또는 부형제를 의미하며, 수의학적 및/또는 또는 인간의 약학적 또는 치료적 용도에 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼(예: 오일/물 또는 물/오일 에멀젼) 및/또는 다양한 유형의 습윤제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 안정화제, 또는 약학적 제형에 사용하기 위해 당업계에 널리 공지된 기타 물질을 포함한다. 조성물에 사용하기 위한 담체의 선택은 조성물의 의도된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 이러한 물질을 함유하는 약학적으로 허용가능한 담체 및 제형의 제조는 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, ed. University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005에 기재되어 있다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예로는 식염수, 글리세롤, DMSO, 완충액 (예: 인산염 완충액, 시트르산염 완충액, 및 기타 유기산을 포함하는 완충액); 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 TWEENTM(ICI, Inc.; Bridgewater, New Jersey), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICSTM(BASF; Florham Park, NJ)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 원하는 치료적 치료를 위한 이러한 투여량의 투여를 제공하기 위해, 본원에 개시된 조성물은 유리하게는 담체 또는 희석제를 포함하는 총 조성물의 중량을 기준으로 하나 이상의 대상 화합물의 총 중량의 약 0.1% 내지 99%를 포함할 수 있다.
용어 "대상체"는 영장류(예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 쥐, 마우스 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 동물을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 용어 "전사 인자"는 DNA를 RNA로 전사하는 과정에 관여하는 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 전사 인자는 특정 유전자의 프로모터 또는 인핸서 영역에 결합하는 영역(domain)을 보유한다. 전사 인자는 또한 RNA 중합효소 및/또는 일부 다른 전사 인자와 상호작용하는 영역을 가질 수 있으며, 이러한 상호작용은 결과적으로 DNA에서 전사된 RNA의 양을 조절한다. 전사 인자는 세포질에 존재하고 활성화 시 핵으로 이동할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형은 장애 또는 상태의 하나 이상의 수반되는 증상의 강도를 부분적으로 또는 완전히 지연, 경감, 완화 또는 감소시키는 것 및/또는 장애 또는 상태의 하나 이상의 원인을 경감, 완화 또는 방해하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 예방적으로, 완화적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다. 치료는 발병 전(예: 간 질환의 명백한 징후 전), 조기 발병 동안(예: 간 질환의 초기 징후 및 증상 시), 간 질환의 확립 후, 또는 말기 간부전의 단계에 대상체에게 투여될 수 있다. 예방적 투여는 간 질환의 증상이 나타나기 이전 몇 일에서 몇 년 동안 발생할 수 있다.
일부 예에서, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형은 대상체의 치료 전과 비교하거나 또는 일반 또는 연구 집단에서 이러한 증상의 발생률과 비교하여 간 질환 완화, 간 기능 회복 및/또는 대상체의 간세포 핵에서 HNFα 양의 증가를 포함한다.
본원에 사용된 "벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 분리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 벡터는 자가-복제, 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터일 수 있다. 또는, 벡터는 또한 전술한 핵산 서열을 포함하는 비히클일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스 벡터(분리, 약독화, 재조합, 바이러스 입자로 캡슐화 등), 리포솜, 엑소좀, 세포외 소포, 마이크로입자 및/또는 나노입자일 수 있다. 벡터는 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA, RNA, 또는 이중-가닥 및/또는 단일-가닥 뉴클레오타이드를 포함하는 하이브리드 DNA/RNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 하나 또는 복수의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 또는 복수의 핵산 서열을 패키징하는 역할을 하는 바이러스 패키징 서열인 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 상기 플라스미드이다. 일부 구현예에서 상기 벡터는 엑소좀이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 입자이다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 천연 및/또는 조작된 캡시드를 갖는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 바이러스 입자를 포함하고, 여기서 상기 핵산 서열은 하나 또는 복수의 AAV 바이러스 입자 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자이다. 다양한 구현예에서, 상기 벡터는 지질계 나노입자이다.
조성물
상기 언급된 바와 같이, 본원에서는 대상체에서 간세포의 핵으로 전사 인자인 HNF4α의 발현 및/또는 수송 및/또는 보유를 증가시켜 간 질환을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 상향 조절하고/하거나 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 하향 조절하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 선택적으로 내인성 HNFα의 발현을 증가시키거나 외인성 HNFα를 도입하여 세포 (예를 들어, 간 세포) 내부, 바람직하게는 세포의 핵 내부에 HNF4α의 발현 또는 기능을 상향 조절하는 단계를 더 포함한다. PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C의 상향 조절 및/또는 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK의 하향 조절이 간세포의 핵에서 HNF4α의 수준을 증가시켜 간 기능의 회복 및 간 질환 완화를 유도한다는 것이 본원에 설명되어 있다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 Lys106에서 HNF4α의 아세틸화를 증가시키는 단계, cMET의 발현을 증가시키는 단계, 및/또는 Thr308에서 인산화를 통해 AKT의 활성화를 증가시키는 단계를 포함한다. 이들 방법은 전체로서 참조로 도입되는 미국 특허 출원 공개 2014/0249209에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자와 함께 HNF4α의 발현 또는 기능을 상향 조절하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 HNF4α 및 PROX1의 발현 또는 기능을 상향 조절하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 HNF4α 및 SREBP1의 발현 또는 기능을 상향 조절하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 HNF4α, PROX1 및 SREBP1의 발현 또는 기능을 상향 조절하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 증가시키고/시키거나 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 감소시키는 조성물이 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자와 함께 HNF4α의 발현 또는 기능을 상향 조절한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 HNF4α 및 PROX1의 발현 또는 기능을 상향 조절한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 HNF4α 및 SREBP1의 발현 또는 기능을 상향조절한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 HNF4α, PROX1 및 SREBP1의 발현 또는 기능을 상향조절한다.
벡터를 포함하는 조성물이 본원에 개시되며, 여기서 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및/또는 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자, 및 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 PROX1 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 NR5A2 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 NR0B2 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 MTF1 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 SREBP1 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 EP300 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 POM121C 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 PROX1 및 SREBP1을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α, PROX1, 및 SREBP1을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α 및 PROX1을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α 및 SREBP1을 암호화하는 핵산을 포함한다.
HNF4α는 간 외에도 신장, 소장, 결장 및 췌장에서도 많이 발현되며, 중요한 역할을 한다. HNF4α 유전자의 다형성 돌연변이는 성숙기발병당뇨병 (MODY), 크론병 및 염증성 장 증후군을 포함하는 광범위한 질병과 관련이 있다. 대체 스플라이싱과 결합된 P1 또는 P2 프로모터의 전사는 12개의 다른 전사체를 생성할 수 있다. 상대적인 이소형 발현은 조직에 따라 다르다. 12개의 이소형은 각각 전사 활성화 및 억제를 담당하는 N 및 C 말단에서만 상이하다 (Ko et al., Cell Rep. 2019 Mar 5;26(10):2549-2557.e3 참조, 전체로서 본원에 참조로 도입됨). 각 이소형이 조직- 의존적 방식으로 유전자의 특정 하위 집합을 조절하는 별개의 기능을 수행한다는 것이 점점 인식되고 있다. 예를 들어, HNF4α 이소형 2는 보고된 바에 따르면 간에서 풍부하고 본 출원에 기재된 바와 같이 손실이 간암(hepatocarcinoma) 또는 간부전과 관련된 종양 억제인자로 작용하는 반면, HNF4α 이소형 8은 결장에서 고도로 발현되고 성장-촉진 유전자의 발현을 조절한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 HNF4α 이소형 2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, HNF4α 이소형 2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 상동성인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 서열번호 31 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 상동성이 있다. 일부 측면에서, HNF4α 이소형 2 폴리펩타이드는 프로모터 1(P1)에 의해 구동되거나, 다시 말해서 이의 발현은 HNF4α의 P1 프로모터에 의해 구동된다. 이는 본원에서 HNF4α 이소형 2(P1)로 지정된다. 따라서, 일부 구현예에서, HNF4α 이소형 2 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 P1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
벡터는 발현 가능한 유전자의 복제를 제어하는 조절 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터(예를 들어, 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 벡터는 인간 조작(예: Sambrook et al., Molecular Cloning―A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)에 기재된 방법에 의한) 의 결과로서 제2 핵산(예를 들어, 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)과 이종인 프로모터를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 측면의 벡터는 프로모터, 인핸서, 항생제 내성 유전자 및/또는 원점을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 상기 언급된 전사 인자 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 본원에 개시된 "바이러스 벡터"는 비히클과 관련하여, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 비리온, 바이러스 입자. 또는 유사형 바이러스(pseudotyped virus) 내 핵산 서열의 패키징을 지시하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 바이러스, 바이러스-유사 입자, 비리온, 바이러스 입자, 또는 유사형 바이러스를 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스, 바이러스-유사 입자, 비리온, 바이러스 입자 또는 유사형 바이러스는 벡터(예: 핵산 벡터)를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 간에 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스, 바이러스-유사 입자, 비리온, 바이러스 입자, 또는 유사형 바이러스는 벡터(예: 핵산 벡터)를 대상체의 간 내 간세포와 같은 표적 세포 내로 및/또는 표적 세포 간에 전달할 수 있다. 중요하게는, 일부 구현예에서, 상기 바이러스, 바이러스-유사 입자, 비리온, 바이러스 입자 또는 유사형 바이러스는 표적 세포(예를 들어, 간세포)의 핵 내로 수송될 수 있다. 용어 "바이러스 벡터"는 또한 모든 목적을 위해 본원에 참조로 도입된 미국 특허 출원 공개 U.S. 2018/0057839에 보다 완전하게 기술된 형태를 지칭하는 것을 의미한다. 적합한 바이러스 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 헤르페스바이러스, 배큘로바이러스 및 레트로바이러스, 파보바이러스, 및 렌티바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 아데노연관바이러스 벡터이다.
복제-결함 아데노바이러스(replication-defective adenoviruse)의 구성이 (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993))에 기재되어 있다. 이러한 바이러스를 벡터로 사용하는 이점은 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없기 때문에 다른 세포 유형으로 퍼질 수 있는 범위가 제한된다는 것이다. 재조합 아데노바이러스는 기도 상피, 간세포, 혈관 내피, CNS 실질(parenchyma) 및 다수의 기타 조직 부위로 직접 생체내 전달된 후 고효율 유전자 전달을 달성하는 것으로 나타났다 (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 특정 세포 표면 수용체에 결합하여 유전자 도입(transduction)을 달성하고, 그 후 바이러스는 야생형 또는 복제-결함 아데노바이러스와 동일한 방식으로 수용체-매개 내포작용(endocytosis)에 의해 내재화된다 (Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).
다른 유형의 바이러스 벡터는 아데노연관바이러스(AAV)를 기반으로 한다. 이 결손(defective) 파보바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있으며 인간에게는 비병원성이다. AAV 유형 벡터는 약 4 내지 5kb를 수송할 수 있고 야생형 AAV는 19번 염색체에 안정적으로 삽입되는 것으로 알려져 있다. AAV 역 말단 반복부(ITR) 또는 이의 변형은 감염성 및 부위 특이적 도입을 부여하지만, 세포 독성은 부여하지 않으며, 프로모터는 세포 특이적 발현을 지시한다. 미국 특허 번호 6,261,834는 AAV 벡터와 관련된 물질에 대해 참조로 본원에 도입된다. 생체내에서 간 세포를 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전체로서 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 9,981,048 참조.
바이러스 벡터, 특히 아데노바이러스 벡터는 양이온성 지질, 폴리L-리신(PLL) 및 디에틸아미노에틸덱스트란(DELAE-덱스트란)과 같은 양이온성 양친매성 물질과 복합될 수 있으며, 이는 표적 세포의 바이러스 감염 효율을 증가시킨다 (예: Nov. 20, 1997 출원된 PCT/US97/21496 참조, 본원에 참조로 도입됨). 예를 들어 본원에 도입된 Zhong et al., J. Genet Syndr Gene Therapy 2012 Jan. 10; S1. pii: 008, U.S. Pat. Nos. 5,139,941, 5,252,479 및 5,753,500 및 PCT 공보 WO 97/09441에 개시된 AAV 벡터는, 또한 이러한 벡터가 벡터의 반복 투여에 대한 최소한의 필요로 숙주 염색체에 도입되기 때문에 유용하다. 유전자 요법에서 바이러스 벡터에 대한 리뷰는 McConnell et al., 2004, Hum Gene Ther. 15(11):1022-33; Mccarty et al., 2004, Annu Rev Genet. 38:819-45; Mah et al., 2002, Clin. Pharmacokinet. 41(12):901-11; Scott et al., 2002, Neuromuscul. Disord. 12(Suppl 1):S23-9를 참고할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 나노입자이다. 본원에서 사용되는 나노입자는 핵산의 전달에 유용한 임의의 나노입자일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "나노입자"는 생체적합성이 있고 그러한 사용 환경에 의한 화학적 및/또는 물리적 파괴에 충분히 내성이 있어 충분한 수의 나노입자가 적용 또는 치료 부위에 전달된 후 실질적으로 손상되지 않은 상태로 유지되고, 크기가 나노미터 범위에 있는 입자 또는 구조를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 지질-유사 나노입자를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 도입된 WO WO/2016/187531A1, WO/2017/176974, WO/2019/027999, 또는 Li, B et al., An Orthogonal array optimization of lipid-like nanoparticles for mRNA delivery in vivo. Nano Lett. 2015, 15, 8099-8107를 참조할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 지질 이중층 또는 리포솜을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 mRNA 지질 나노입자이다.
일부 구현예에서, 개시된 나노입자는 생물학적 개체, 예를 들어 표적 세포 상의 특정 막 성분 또는 세포 표면 수용체(예: 간 세포로의 전달을 촉진하는 수용체 또는 간 세포 상의 수용체)에 효율적으로 결합하거나 회합될 수 있다. 예를 들어, 개시된 나노입자는 정상 또는 병든 간 세포 상에서 발현되는 수용체 (예: 간 아시알로당단백질 수용체(ASGPR) 또는 저밀도 지단백질(LDLR) 수용체) 에 결합하는 리간드를 포함하도록 조작될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 나노입자는 간 세포 내로 핵산의 전달을 촉진하는 보충 성분을 포함할 수 있다. 상기 나노입자는 양이온성 지질, 보조 지질, 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 5A2-SC8, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 및/또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜)), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 5A2-SC8, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜))을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자 5A2-SC8, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜))의 몰비(molar ratio)는 약 15/15/30/3이다.
일부 구현예에서, 상기 나노입자는 DLin-MC3-DMA, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜))을 포함한다. 일부 구현예에서, DLin-MC3-DMA, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜))의 몰비는 약 50/10/38.5/1.5이다.
일부 구현예에서, 상기 나노입자는 C12-200, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜))을 포함한다. 일부 구현예에서, C12-200, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜))의 몰비는 약 35/16/46.5/2.5이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 상기 나노입자는 5A2-SC8, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-rac-글리세롤-메톡시(폴리(에틸렌 글리콜)), 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함한다. 상기 나노입자는 DOTAP을 약 0.1% 내지 약 30% 몰/몰(mol/mol)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노입자에 존재하는 DOTAP의 양은 나노입자의 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6% 몰/몰, 약 0.7% 몰/몰, 약 0.8% 몰/몰, 약 0.9% 몰/몰, 약 1% 몰/몰, 약 2% 몰/몰, 약 2.5% 몰/몰, 약 3% 몰/몰, 약 3.5% 몰/몰, 약 4% 몰/몰, 약 4.5% 몰/몰, 약 5% 몰/몰, 약 5.5% 몰/몰, 약 6% 몰/몰, 약 6.5% 몰/몰, 약 7% 몰/몰, 약 7.5% 몰/몰, 약 8% 몰/몰, 약 8.5% 몰/몰, 약 9% 몰/몰, 약 9.5% 몰/몰, 약 10% 몰/몰, 약 10.5% 몰/몰, 약 11% 몰/몰, 약 11.5% 몰/몰, 약 12% 몰/몰, 약 12.5% 몰/몰, 약 13% 몰/몰, 약 13.5% 몰/몰, 약 14% 몰/몰, 약 15% 몰/몰, 약 16% 몰/몰, 약 17% 몰/몰, 약 18% 몰/몰, 약 19% 몰/몰, 약 20% 몰/몰, 약 22% 몰/몰, 약 24% 몰/몰, 약 26% 몰/몰, 약 28% 몰/몰, 약 30% 몰/몰 일 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자에 존재하는 DOTAP의 양은 나노입자의 약 20% 몰/몰 이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 나노입자 및 간-특이적 전달 방법은 당업계, 예를 들어 Cheng et al., Nat Nanotechnol. 2020 Apr;15(4):313-320. Epub 2020 Apr 6; Trepotec et al., Mol Ther. 2019 Apr 10;27(4):794-802. Epub 2018 Dec 22; Truong, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2019 Oct 15;116(42):21150-21159. Epub 2019 Sep 9;에 기재되어 있으며, 전체로서 본원에 참조로 도입된다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 폴리(아미도-아민), 폴리-베타 아미노-에스터 (PBAEs), 및/또는 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 폴리아크리딘 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 외부 PEG 쉘 및 나노입자-기반 코어를 포함한다.
지질-기반 나노 입자는 간으로 치료용 페이로드를 성공적으로 전달한다. 예를 들어, Witzigmann et al., Adv Drug Deliv Rev. 2020 Jul, doi: 10.1016/j.addr.2020.06.026 참고. 리포솜은 여러 유형의 지질로부터 만들어질 수 있지만, 인지질은 약물 운반체로 지질-기반 나노 입자를 생성하는 데 가장 일반적으로 사용된다. 본 발명에서 사용하기 위한 지질 입자는 리포솜-형성 지질 및 인지질, 및 막 활성 스테롤(예: 콜레스테롤)을 포함하도록 제조될 수 있다. 리포솜은 리포솜 형성 지질이 아닌 다른 지질 및 인지질을 포함할 수 있다.
인지질은 예를 들어 레시틴(예: 계란 또는 대두 레시틴); 포스파티딜콜린(예: 계란 포스파티딜콜린); 수소화된 포스포티딜콜린; 리소포스파티딜 콜린; 디팔미토일포스파티딜콜린; 디스테아로일 포스파티딜콜린; 디미리스토일 포스파티딜콜린; 디라우로일포스파티딜콜린; 글리세로인지질(예: 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트 및 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트); 스핑고미엘린; 카디오리핀; 포스파티드산; 플라스마로겐; 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 각 경우는 본 발명의 각각의 구현예를 나타낸다. 사용될 수 있는 다른 지질의 예는 당지질(예를 들어, 글리세로당지질(예: 갈락토리피드 및 설포리피드), 글리코스핑고리피드(예: 세레브로사이드, 글루코세레브로사이드 및 갈락토세레브로사이드), 및 글리코실포스파티딜이노시톨); 포스포스핑고리피드(예: 세라마이드 포스포릴콜린, 세라마이드 포스포릴에탄올아민, 및 세라마이드 포스포릴글리세롤 등); 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 각 경우는 본 발명의 각각의 구현예를 나타낸다. 음전하 또는 양전하를 띤 지질 나노입자는 예를 들어 음이온성 또는 양이온성 인지질 또는 지질을 사용하여 얻을 수 있다. 이러한 음이온성/양이온성 인지질 또는 지질은 일반적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 모이어티를 가지며, 여기서 지질은 전체 알짜 음전하/양전하를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 나노입자는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체를 포함한다. 예를 들어, 고려되는 나노입자는 생분해성 중합체 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 하나 이상의 블록 공중합체를 약 10 내지 약 99 중량%로 포함할 수 있으며, 생분해성 단독중합체를 약 0 내지 약 50 중량%로 포함할 수 있다. 중합체는 예를 들어 미세결정질 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리알킬렌 옥사이드, 예를 들어 폴리에틸렌 옥사이드(PEG)), 폴리무수물, 폴리(에스테르 무수물), 폴리하이드록시산, 예를 들어 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리-3-하이드록시부티레이트(PHB) 및 이들의 공중합체, 폴리-4-하이드록시부티레이트(P4HB) 및 이들의 공중합체, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체, 및 이들의 조합과 같은 생안정성 및 생분해성 중합체 모두를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 나노입자는 약 1 nm 내지 약 1000 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 예를 들어 약 1000 nm, 약 950 nm, 약 900 nm, 약 850 nm, 약 800 nm, 약 750 nm, 약 700 nm, 약 650 nm, 약 600 nm, 약 550 nm, 약 500 nm, 약 450 nm, 약 400 nm, 약 350 nm, 약 300 nm, 약 290 nm, 약 280 nm, 약 270 nm, 약 260 nm, 약 250 nm, 약 240 nm, 약 230 nm, 약 220 nm, 약 210 nm, 약 200 nm, 약 190 nm, 약 180 nm, 약 170 nm, 약 160 nm, 약 150 nm, 약 140 nm, 약 130 nm, 약 120 nm, 약 110 nm, 약 100 nm, 약 90 nm, 약 80 nm, 약 70 nm, 약 60 nm, 약 50 nm, 약 40 nm, 약 30 nm, 약 20 nm, 또는 약 10 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 예를 들어 약 20 nm 내지 약 1000 nm, 약 20 nm 내지 약 800 nm, 약 20 nm 내지 약 700 nm, 약 30 nm 내지 약 600 nm, 약 30 nm 내지 약 500 nm, 약 40 nm 내지 약 400 nm, 약 40 nm 내지 약 300 nm, 약 40 nm 내지 약 250 nm, 약 50 nm 내지 약 250 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 150 nm, 약 70 nm 내지 약 150 nm, 약 80 nm 내지 약 150 nm, 약 90 nm 내지 약 150 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 110 nm 내지 약 150 nm, 약 120 nm 내지 약 150 nm, 약 90 nm 내지 약 140 nm, 약 90 nm 내지 약 130 nm, 약 90 nm 내지 약 120 nm, from 100 nm 내지 약 140 nm, 약 100 nm 내지 약 130 nm, 약 100 nm 내지 약 120 nm, 약 100 nm 내지 약 110 nm, 약 110 nm 내지 약 120 nm, 약 110 nm 내지 약 130 nm, 약 110 nm 내지 약 140 nm, 약 90 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 195 nm, 약 110 nm 내지 약 190 nm, 약 120 nm 내지 약 185 nm, 약 130 nm 내지 약 180 nm, 약 140 nm 내지 약 175 nm, from 150 nm 내지 175nm, 또는 약 150 nm 내지 약 170 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 약 100 nm 내지 약 250 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 약 150 nm 내지 약 175 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 나노입자는 약 135 nm 내지 약 175 nm의 직경을 갖는다. 상기 입자는 임의의 모양을 가질 수 있으나, 일반적으로 구형이다.
일부 구현예에서, 본원에 사용된 벡터는 엑소좀이다. 본원에 사용된 용어 "미세소포(microvesicle)" 및 "엑소좀"은 약 10 nm 내지 약 5000 nm, 보다 일반적으로 30 nm 내지 1000 nm의, 및 가장 일반적으로 약 50 nm 내지 750 nm의 직경을 갖는 막형 입자를 지칭하고 (또는 입자가 회전 타원체(spheroid)가 아닌 경우 최대 치수), 여기서 엑소좀 막의 적어도 일부는 세포로부터 직접 수득된다. 가장 일반적으로 엑소좀은 도너 세포 크기의 최대 5%인 크기(평균 직경)를 갖는다. 따라서, 특히 고려되는 엑소좀은 세포로부터 배출된 엑소좀을 포함한다. 엑소좀의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전체로서 본원에 참조로 도입된 미국 공개 번호 2018/0177727을 참조할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 전달하기 위한 엑소좀 및 이의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 10,577,630을 참조할 수 있다.
또한 RNA 활성화(RNAa)를 통해 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 증가시키는 조성물이 본원에 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 조성물은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C 중 하나 이상을 활성화하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함한다.
본원에서 "HNF4α"는 인간에서 HNF4A 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, HNF4α 폴리펩타이드는 HGNC: 5024, Entrez Gene: 3172, Ensembl: ENSG00000101076, OMIM: 600281, UniProtKB: P41235와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, HNF4α 폴리펩타이드는 서열번호 1의 서열(HNF4α 이소형 2), 또는 서열번호 1과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 1의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 1의 HNF4α 폴리펩타이드는 성숙한 HNF4α의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 1의 HNF4α 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 HNF4α 폴리펩타이드는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 US 2014/0249209에 기재된 것이다. 일부 구현예에서, 상기 HNF4α 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 또는 서열번호 34의 서열, 또는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 또는 서열번호 34의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 또는 서열번호 34의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
PROX1(Prospero-related homeobox 1)은 보통 간 기관 형성 동안 생쥐의 내배엽 세포에서 배아 8.5일(E8.5)에 처음 발현된다. 성인 간에서, PROX1의 역할은 간세포의 에너지 대사를 제어할 수 있다. 더 중요하게는 Prox1이 특정 DNA 요소에 대한 호메오도메인의 직접 결합에 의해 유전자 전사의 활성제로 기능할 수 있다고 보고되었다. 본원에서 "PROX1"은 인간에서 PROX1 유전자에 의해 암호되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, PROX1 폴리펩타이드는 HGNC: 9459, Entrez Gene: 5629, Ensembl: ENSG00000117707, OMIM: 601546, UniProtKB: Q92786와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, PROX1 폴리펩타이드는 서열번호 2의 서열, 또는 서열번호 2와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 2의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 2의 PROX1 폴리펩타이드는 성숙한 PROX1의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 2의 PROX1 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 PROX1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13의 서열, 또는 서열번호 13의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 13의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
NR5A2(Nuclear receptor 5A2; Liver receptor homologue-1; LRH-1)는 표적 유전자의 프로모터 및 조절 영역 내의 특정 반응 요소에 단량체로 결합하는 핵 수용체이다. NR5A2는 또한 담즙산 생산 효소, 지방산 대사 및 미토콘드리아 기능을 암호화하는 유전자를 양성 조절할 수 있다. 본원에서 "NR5A2"는 인간에서 NR5A2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, NR5A2 폴리펩타이드는 HGNC: 7984, Entrez Gene: 2494, Ensembl: ENSG00000116833, OMIM: 604453, UniProtKB: O00482와 같은 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, NR5A2 폴리펩타이드는 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 3의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 3의 NR5A2 폴리펩타이드는 성숙한 NR5A2의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 3의 NR5A2 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 NR5A2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14, 서열번호 15, 또는 서열번호 16의 서열, 또는 서열번호 14, 서열번호 15, 또는 서열번호 16의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 14, 서열번호 15, 또는 서열번호 16의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
NR0B2(Nuclear receptor small heterodimer partner; SHP)는 보통 정상 간세포에서 높게 발현되며 담즙산, 포도당 및 지질 대사에 대한 중요한 전사 조절자 역할을 한다. NR0B2의 수모일화(SUMOylation)는 핵 수송 및 담즙산 항상성을 유지하고 간 독성으로부터 보호하는 데 중요한 담즙산 생합성의 피드백 억제에서 SHP의 유전자 억제 기능에 필요할 수 있다. (Kim DH et al., 2016). 본원에서 "NR0B2"는 인간에서 NR0B2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, NR0B2 폴리펩타이드는 HGNC: 7961, Entrez Gene: 8431, Ensembl: ENSG00000131910, OMIM: 604630, UniProtKB: Q15466과 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, NR0B2 폴리펩타이드는 서열번호 4의 서열, 또는 서열번호 4와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 4의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 번호 4의 NR0B2 폴리펩타이드는 성숙한 NR0B2의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 4의 NR0B2 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 NR0B2 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17의 서열, 또는 서열번호 17의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 17의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
MTF1(Metal-responsive transcription factor 1)은 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자의 기초 및 중금속 유도 전사를 매개할 수 있으며 또한 세포 스트레스 반응 및 금속 항상성에 관련된 다른 유전자를 조절할 수 있다. MTF1은 또한 아연 수송체 1과 같은 다른 금속 반응성 유전자의 전사 조절에 관여할 수 있다. MTF1은 간세포의 아연 수준을 조절할 수 있다. 본원에서 "MTF1"은 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 지칭하며, 인간에서 MTF1 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, MTF1 폴리펩타이드는 HGNC: 7428, Entrez Gene: 4520, Ensembl: ENSG00000188786, OMIM: 600172, UniProtKB: Q14872와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, MTF1 폴리펩타이드는 서열번호 5의 서열, 또는 서열번호 5와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 5의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 5의 MTF1 폴리펩타이드는 성숙한 MTF1의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 5의 MTF1 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 MTF1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 18의 서열, 또는 서열번호 18의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 18의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
SREBP1(Sterol regulator element binding proteins 1)은 콜레스테롤, 지방산 및 트리글리세리드의 생합성에 관여하는 전사 인자이다. SREBP1은 AKT/PI3K 신호전달 경로의 발현과 활성을 제어할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지이다 (Shi Q et al., 2016; Porstmann T et al., 2008). 본원에서 "SREBF1"은 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 지칭하며, 인간에서 SREBF1 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, SREBF1 폴리펩타이드는 HGNC: 11289, Entrez Gene: 6720, Ensembl: ENSG00000072310, OMIM: 184756, UniProtKB: P36956과 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, SREBF1 폴리펩타이드는 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 6의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 6의 SREBF1 폴리펩타이드는 성숙한 SREBF1의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 6의 SREBF1 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 SREBP1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 21의 서열, 또는 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 21의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 21의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
EP300(The histone acetyltransferase p300) 은 C/EBP 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 간 지방증 발달, 포도당 대사 및 간에서 높게 발현되는 Foxo1 및 파네소이드 X 수용체(farnesoid X receptor, FXR)와 같은 여러 전사 인자의 조절 동안 트리글리세리드 합성에 관여하는 유전자의 프로모터를 활성화할 수 있다. 본원에서 "EP300"은 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 나타내며, 인간에서 EP300 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, EP300 폴리펩타이드는 HGNC: 3373, Entrez Gene: 2033, Ensembl: ENSG00000100393, OMIM: 602700, UniProtKB: Q09472와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, EP300 폴리펩타이드는 서열번호 7의 서열, 또는 서열번호 7과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 7의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 7의 EP300 폴리펩타이드는 성숙한 EP300의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 7의 EP300 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 EP300 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 22 또는 서열번호 23의 서열, 또는 서열번호 22 또는 서열번호 23의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 22 또는 서열번호 23의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
POM121C(Nuclear envelope pore membrane protein POM 121)는 핵공 생합성에 관여하는 것으로 여겨지는 공극막 단백질이라고 하는 단백질 그룹의 구성원인 막 단백질이다. 본원에서 "POM121C"는 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 나타내며, 인간에서 POM121C 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, POM121C 폴리펩타이드는 HGNC: 34005, Entrez Gene: 100101267, Ensembl: ENSG00000272391, OMIM: 615754, UniProtKB: A8CG34와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, POM121C 폴리펩타이드는 서열번호 8의 서열, 또는 서열번호 8과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 8의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 8의 POM121C 폴리펩타이드는 성숙한 POM121C의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 8의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 POM121C 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 24의 서열, 또는 서열번호 24의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 24의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
또한 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 조성물이 본원에 개시된다. 따라서, DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK 폴리뉴클레오타이드에 상관되고/되거나 이에 작용하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)와 같은 작은 활성화 RNA(saRNA), 또는 crisgRNA 또는 tracr/mate RNA와 같은 CRISPR RNA를 포함하는 조성물이 본원에 포함된다. 단백질의 기능을 감소 또는 억제하기 위해 saRNA를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전체로서 본원에 참조로 도입된 국제 공개 번호 WO2019/048632를 참고할 수 있다. 따라서, DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제하기 위해 saRNA를 사용하여 HNF4α의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 DNAJB1/HSP40의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 ATF6의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 ATF4의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 PERK의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 HNF4α를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
DNAJB1/HSP40(Heat shock protein 40)은 유전자 발현 및 번역 개시, 접힘 및 비-접힘, 및 단백질의 전위 및 분해에 필수적인 역할을 할 수 있는 분자 샤페론 단백질이다. DNAJ/HSP40의 활성은 여러 번역 후 변형에 의해 조절된다. 많은 경우에, DNAJ/HSP40은 인단백질(예: DnaJA1, DnaJB4, DnaJC1, DnaJC29)이며, 그 발현과 기능은 각각 아세틸화(예: DnaJA1, DnaJB2, DnaJB12, DnaJC5, DnaJC8, DnaJC13), 당화(DnaJB11, DnaJC10, DnaJC16), 팔미토일화(DnaJC5, DnaJC5B, DnaJC5G), 메틸화(DnaJA1-4), 프레닐화(DnaJA1, DnaJA2, DnaJA4), 및 분자내 이황화 결합(DnaJB11, DnaJC3, DnaJC10)에 의해 번역 동시 및 번역 후 추가로 조절될 수 있다. 본원에서 "DNAJB1/HSP40"은 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 지칭하며, 인간에서 DNAJB1 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, DNAJB1 폴리펩타이드는 HGNC: 5270, Entrez Gene: 3337, Ensembl: ENSG00000132002, OMIM: 604572, UniProtKB: P25685와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, DNAJB1 폴리펩타이드는 서열번호 9의 서열, 또는 서열번호 9와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 9의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 9의 DNAJB1 폴리펩타이드는 성숙한 DNAJB1의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 9의 DNAJB1 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 DNAJB1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 25 또는 서열번호 26의 서열, 또는 서열번호 25 또는 서열번호 26의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 25 또는 서열번호 26의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
ATF6은 비-접힘 단백질 반응(UPR)의 센서일 수 있고 전사 발현을 조절하는 기능을 할 수 있다. 어떤 경우에는 ER 스트레스 시 ATF6이 ER에서 골지로 이동하여 단백질 분해로 절단되어 단백질의 접힘 및 이동에 관여하는 유전자의 전사 인자인 N-말단 ATF6 조각을 방출하는 것으로 나타났다. 본원에서 "ATF6"은 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 나타내며, 인간에서 ATF6 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, ATF6 폴리펩타이드는 HGNC: 791, Entrez Gene: 22926, Ensembl: ENSG00000118217, OMIM: 605537, UniProtKB: P18850와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, ATF6 폴리펩타이드는 서열번호 10의 서열, 또는 서열번호 10과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 10의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 10의 ATF6 폴리펩타이드는 성숙한 ATF6의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 10의 ATF6 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 ATF6 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 27의 서열, 또는 서열번호 27의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 27의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
ATF4는 UPR 표적 유전자의 전사 활성제로, 아미노산 대사 및 산화 스트레스에 대한 내성에 관여하는 유전자의 전사 발현을 향상시키는 역할을 할 수 있다. (Fusakio ME et al., 2016) 본원에서 "ATF4"는 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 나타내며, 인간에서 ATF4 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, ATF4 폴리펩타이드는 HGNC: 786, Entrez Gene: 468, Ensembl: ENSG00000128272, OMIM: 604064, UniProtKB: P18848과 같은 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, ATF4 폴리펩타이드는 서열번호 11의 서열, 또는 서열번호 11과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 11의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 11의 ATF4 폴리펩타이드는 성숙한 ATF4의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 11의 ATF4 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 ATF4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 28의 서열, 또는 서열번호 28의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 28의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
PERK(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase)는 PERK에서 떨어진 샤페론 모집(recruitment)을 통해 일반적으로 활성화되어 세포질 키나아제 도메인의 올리고머화 및 활성화를 유도하는 유형 1 막횡단 단백질이다. PERK 및 ATF4의 하류에서 세포자멸사 신호 전달을 매개하는 중요한 단백질은 간 질환의 진행과 관련된 CCAAT 인핸서-결합 단백질(C/EBP) 상동 단백질(CHOP)이다. (Malhi H et al., 2011) "EIF2AK3"으로도 알려진 "PERK"는 본원에서 신호전달 림프구 활성화 분자 패밀리의 자가-리간드 수용체인 폴리펩타이드를 지칭하며, 인간에서 EIF2AK3 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, PERK 폴리펩타이드는 NC: 3255, Entrez Gene: 9451, Ensembl: ENSG00000172071, OMIM: 604032, UniProtKB: Q9NZJ5와 같이 하나 이상의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스에서 확인된 것이다. 일부 구현예에서, PERK 폴리펩타이드는 서열번호 12의 서열, 또는 서열번호 12와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열, 또는 서열번호 12의 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 12의 PERK 폴리펩타이드는 성숙한 PERK의 미성숙 또는 전처리된 형태를 나타낼 수 있고, 이에 따라 본원에 포함되는 것은 서열번호 12의 PERK 폴리펩타이드의 성숙 또는 가공된 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 PERK 또는 EIF2AK3 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 30의 서열, 또는 서열번호 29 또는 서열번호 30의 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 29 또는 서열번호 30의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
임의의 전술한 측면의 조성물은 HNF4α 작용제를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 HNF4α 작용제는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 출원 공개 US2014/0249209에 보다 완전히 기재된 조성물을 지칭하는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 임의의 전술한 측면의 조성물 및/또는 벡터는 생물학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물학적으로 허용되는 담체는 조성물 및/또는 벡터를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 간에 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 생물학적으로 허용되는 담체는 대상체의 간에 있는 간세포와 같은 표적 세포 내로 및/또는 표적 세포 사이에서 조성물 및/또는 벡터를 전달할 수 있다. 중요하게도, 일부 구현예에서, 생물학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물 및/또는 벡터는 DNA 및 RNA와 같은 기능적 거대분자를 표적 세포(예를 들어, 간세포)의 핵으로 수송할 수 있다.
치료 방법
본원에서는 대상체에서 간세포의 핵으로 전사 인자인 HNF4α의 발현 및/또는 수송 및/또는 보유를 증가시켜 간 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 상향 조절하고/하거나 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 하향 조절하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본원은 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이 개시하며, 여기서 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및/또는 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자 및 그의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 본원은 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 기능을 하향 조절하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이 개시한다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 siRNA, miRNA, sgRNA 또는 tracr/mate RNA를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 Lys106에서 HNF4α의 아세틸화를 증가시키는 단계, cMET의 발현을 증가시키는 단계, 및/또는 Thr308에서 인산화를 통해 AKT의 활성화를 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 PROX1을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, SREBP1을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 HNF4α, PROX1, 및 SREBP1을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 HNF4α를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
앞서 언급한 바와 같이, PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C는 모두 예를 들어 HNF4α의 아세틸화, 세포 대사 경로, 또는 핵공 복합체의 형성을 포함하는 직접 EH는 간접 메커니즘을 통해 HNF4α 핵 수송을 조절하는 전사 인자 및/또는 조절자이다. HNF4α에 대한 이러한 효과는 간 질환이 있는 환자의 간 세포 기능을 회복시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 벡터 또는 벡터들의 투여는 대상체의 간세포의 핵에서 HNF4α의 양을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 벡터(들)의 투여는 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 벡터(들)의 투여는 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 임의의 선행하는 측면의 벡터는 HNF4α를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 HNF4α 이소형 2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, HNF4α 이소형 2 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98%의 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 31 또는 그의 단편과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 98%의 상동성을 갖는다.
따라서, 일부 측면에서, 본원은 HNF4α 이소형 2를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법을 개시한다. 또한 본원은 HNF4α 이소형 2를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 조성물의 용도를 포함한다.
상기 방법에 사용된 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 바이로스 입자(분리, 약독화, 재조합 등), 엑소좀, 세포외 소포 및/또는 나노입자를 포함하는 본원에 기재된 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 입자이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 천연 및/또는 조작된 캡시드를 갖는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 엑소솜이다. 일부 구현예에서 상기 벡터는 나노입자이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 mRNA 지질 나노입자이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 DNA(예를 들어, 폐쇄형 DNA(ceDNA)) 또는 RNA이다. ceDNA 및 ceDNA의 제조 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전체로서 본원에 참조로 도입된 국제 공개 번호 WO2019/169233 및 WO2017152149를 참조할 수 있다. 방법, 재료, 나노 입자의 전달 및 이의 제조 및 사용을 포함하는(양 및 제형 포함) 나노 입자, 이의 구성요소 및 이러한 구성요소의 전달과 관련하여, 모두 본 발명의 실시에 유용하며, Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429, 1987, U.S. 특허 출원 공개 2011/0274706, 및 WO2018/170405는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 도입된다.
일부 측면에서, 본원에 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함하는 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 조성물은 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제한다.
앞서 언급한 바와 같이, DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK는 모두 소포체(ER) 스트레스의 전사 조절자이다. ER은 단백질의 적절한 접힘, 변형 및 수송에 중요한 진핵 세포의 일종의 막성 소기관이다. 단백질을 접는 ER의 능력이 포화될 때 발생하는 ER 스트레스는 세포 사멸 및/또는 염증과 같은 반응으로 이어질 수 있다. 이러한 전사 조절자는 ER 스트레스와 관련된 경로를 통해 HNF4α 핵 수송을 조절한다. 이러한 전사 조절제 중 하나 이상의 양의 감소 또는 기능의 억제가 간 질환이 있는 환자에서 간 세포 기능을 회복시킬 수 있음이 본원에서 제시된다. 따라서, 일부 구현예에서, 조성물의 투여는 대상체의 간세포의 핵에서 HNF4α의 양을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 조성물의 투여는 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물의 투여는 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 조성물은 HNF4α를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 이들 유전자의 녹다운에 의해 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및/또는 PERK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시킨다. DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및/또는 PERK의 녹다운은 상보적 RNA 분자에 의한 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및/또는 PERK를 암호화하는 mRNA 또는 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및/또는 PERK의 활성에 필요한 효소와 같은 관련 mRNA의 인식에 의해 야기될 수 있으며, RNA 간섭에 의해 매개될 수 있다. 예를 들어, 간섭 RNA(RNAi)를 암호화하는 분자는 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)과 같은 방법을 통해 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 또는 나노입자와 같은 적합한 벡터에 의해 간세포 또는 간세포 전구체에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및/또는 PERK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자를 녹아웃시키기 위한 임의의 하나 또는 복수의 CRISPR 복합체 성분은 본원에 개시된 바이러스 입자, 비리온(virion), 또는 바이러스 벡터와 함께 또는 그 안에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA 또는 tracr/mate RNA는 하나 이상의 재프로그래밍 인자와 함께 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자, 비리온 또는 바이러스 벡터에 의해 캡슐화된 sgRNA 분자는 하나 이상의 재프로그래밍 인자와 함께 패키징될 수 있다. CRISPRCas 시스템에 관한 일반 정보, 그의 구성 요소 및 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAV를 포함하는 이러한 구성 요소의 전달 및 양 및 제형을 포함하여 이의 제조 및 사용과 관련하여, 본 발명의 실시에 유용한 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 도입된 미국 공개 2018/0057839를 참조한다.
상기 언급한 바와 같이, 본원에서 사용된 "간 질환"은 일반적으로 간에 영향을 미치는 질환, 장애 및 상태를 지칭하며, 예를 들어 간세포에 단순 지방 축적(지방증), 거대낭포성 지방증, 문맥주위 및 소엽 염증(지방간염), 간경변, 섬유증, 간 허혈, 간세포 암종을 포함하는 간암, 초기 질환 단계의 간 질환, 말기 간 질환, 및 간 부전을 포함하는 광범위한 중증도를 가질 수 있다. 따라서, 지방증, 거대낭포성 지방증, 지방간염, 간경변, 섬유증, 간암, 간세포 암종, 말기 간 질환, 만성 간 질환, 및 간 부전은 각각 "간 질환"의 정의에 포함된다. "간 경변"의 정도 또는 중증도는 차일드-퍼 점수에 의해 지정될 수 있으며, 여기서 5가지 임상 측정값인 총 빌리루빈(bilirubin) 수준, 혈청 알부민, 프로트롬빈 시간 연장, 복수(ascite) 및 간성 뇌병증이 1점, 2점, 및 3점 값의 점수 시스템을 사용하여 각 임상 측정값의 다양한 수준에 대해 채점되며 3점 값은 각 측정의 가장 심각한 수준에 할당된다. 차일드-퍼 점수 및 분류에 도달하기 위해 5개 측정값 모두에 대한 총점이 추가된다. 5-6점은 차일드-퍼 분류 A, 7-9점은 차일드-퍼 분류 B, 10-15점은 차일드-퍼 분류 C이다. 일반적으로 차일드-퍼 분류 A는 가장 덜 심각한 간 질환을 나타내며, 차일드-퍼 분류 C는 가장 심각한 간 질환을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 차일드-퍼 분류 B 또는 차일드-퍼 분류 C 간 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 차일드-퍼 분류 A 간 질환을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 간 질환은 알코올성 간염이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 생체외 관류를 갖는 허혈성 공여자 간을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 간 절제 전 또는 후를 포함하는 암 치료 전 또는 후에 간암을 치료하는데 사용될 수 있다. 초기 질환 단계의 간 질환은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 알코올-관련 간 질환(지방간, 알코올성 간염 및 알코올-관련 간경변을 포함하나 이에 제한되지 않음)일 수 있음을 이해하고 본원에서 고려한다. 본원에 개시된 말기 간 질환은 예를 들어 바이러스성, 알코올성, 비-알코올성 및 잠복성을 포함하여 당업계에 공지된 모든 원인에 기인할 수 있음을 또한 이해해야 한다.
따라서, 본원에 개시된 방법은 임의의 상기 측면의 간 질환을 갖는 대상체에서 간 기능을 개선하는데 사용될 수 있다. 이러한 간 기능의 개선은 예를 들어 혈청 알부민의 증가, 혈청 암모니아 수준의 감소, 총 빌리루빈의 감소, 뇌병증 점수의 증가 및/또는 프로트롬빈 시간 연장의 감소로 나타날 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 혈청 알부민 수준을 증가시키고, 혈청 암모니아 수준을 감소시키고, 총 빌리루빈 수준을 감소시키고, 뇌병증 점수를 증가시키고 및/또는 프로트롬빈 시간 연장을 감소시키는데 사용될 수 있다.
간 질환은 염증, 섬유증, 간경변, 말기 간 질환, 및 간암을 포함하는 여러 단계로 진행될 수 있다. 간염 바이러스에 의한 만성 감염, 알코올-매개 간경변, 및/또는 비알코올성 지방간염(NASH)을 포함하여 만성 간 질환의 다양한 원인이 있음을 알아야 한다. 간 질환의 시기를 예측할 수 없는 경우가 많기 때문에, 간 질환을 치료, 예방, 감소 및/또는 억제하는 개시된 방법은 염증, 섬유증, 간경변, 말기 간 질환, 및/또는 간암의 발병 전 또는 후에, 심지어 간염 바이러스 감염, 알코올 매개 간경변, 및/또는 비알코올성 지방간염의 전 또는 도중에 간 질환의 임의의 단계를 치료, 예방, 억제 및/또는 완화하기 위해 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 개시된 방법은 염증, 섬유증, 간경변, 말기 간 질환 및/또는 간암이 발병하기 전에 언제든지 수행할 수 있다. 한 측면에서, 개시된 방법은 염증, 섬유증, 간경변, 말기 간 질환, 및/또는 간암의 발병 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년; 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개월; 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일; 60, 48, 36, 30, 24, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2시간 전; 또는 염증, 섬유증, 간경변, 말기 간 질환, 및/또는 간암의 발병 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105, 120분; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60시간; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 45, 60, 90일 또는 그 이상; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 이상; 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1년 후에 사용될 수 있다.
간 절제는 간 질환(예: 간경변, 말기 간 질환, 및/또는 간암)이 있는 대상체의 간 전체 또는 일부를 외과적으로 제거하는 것이다. 개시된 방법은 간 절제 전 또는 후에 언제든지 대상체에게 수행될 수 있다. 한 측면에서, 개시된 방법은 간 절제 수술 5, 4, 3, 2, 또는 1년; 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개월; 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일; 60, 48, 36, 30, 24, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2시간 전; 또는 간 절제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105, 120분; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60시간; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 45, 60, 90일 또는 그 이상; 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 이상; 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1년 후에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 벡터 또는 조성물은 경구, 국소, 정맥내, 피하, 경피, 경피, 근육내, 관절내, 비경구, 동맥내, 피내, 뇌실내, 두개내, 복강내, 병변내, 비강내, 직장, 질, 흡입 또는 이식된 저장소를 통하는 것을 포함하는 임의의 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 또는 조성물의 투여는 정맥내이다.
본 개시의 또 다른 측면은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및/또는 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사 인자, 및 이의 기능적 단편의 양 또는 기능을 증가시키는 상기 기재된 조성물 및 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 및 PERK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제하는 조성물 모두를 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 두 조성물은 동시에 투여된다. 다른 구현예에서, 하나의 조성물은 다른 것보다 먼저 투여된다. 일부 구현예에서, 임의의 전술한 측면의 방법은 HNF4α의 발현 또는 기능을 상향조절하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 임의의 전술한 측면의 방법은 HNF4α 작용제를 추가로 투여하는 것을 포함하며, 용어 작용제는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 US2014/0249209에 보다 완전히 기재된 조성물을 지칭한다.
벡터 또는 임의의 전술한 측면의 조성물에 대한 투여 빈도는 적어도 1년에 1회, 2년에 1회, 3년에 1회, 4년에 1회, 5년에 1회, 6년에 1회, 7년에 1회, 8년에 1회, 9년에 1회, 10년에 1회, 적어도 2개월에 1회, 3개월에 1회, 4개월에 1회, 5개월에 1회, 6개월에 1회, 7개월에 1회, 8개월에 1회, 9개월에 1회, 10개월에 1회, 11개월에 1회, 적어도 1개월에 1회, 3주에 1회, 2주에 1회, 1주에 1회, 1주에 2회, 1주에 3회, 1주에 4회, 1주에 5회, 1주에 6회, 또는 매일을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 또한 연속적일 수 있고 임의의 원하는 특정 범위 내에서 화합물의 수준을 유지하도록 조정될 수 있다. 임의의 전술한 측면의 벡터 및/또는 조성물을 사용하여 간 질환을 치료하기 위해 본원에 사용된 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 도입된 미국 특허 출원 공개 2018/0057839에 보다 완전히 기재된 투여 형태를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 개시된 주제에 따른 조성물, 방법 및 결과를 예시하기 위해 아래에 제시된다. 이들 예는 본원에 개시된 주제의 모든 측면을 포함하는 것으로 의도되지 않고, 오히려 대표적인 방법 및 결과를 예시하기 위한 것이다. 이들 실시예는 당업자에게 자명한 본 발명의 균등물 및 변형을 배제하도록 의도되지 않는다.
실시예 1: 방법 및 재료
인간 샘플 및 간세포 분리. 비식별화된 정상 인간 간 조직 및/또는 세포는 NIH 계약 번호 HSN276201200017C 하에 지원된 피츠버그 대학의 인간 연구 검토 위원회(Human Research Review Committee)에서 승인한 프로토콜에 의해 서면 동의를 얻은 후 간 조직 세포 분배 시스템(Liver Tissue Cell Distribution System)(Pittsburgh, PA)을 통해 얻었다. 성인 인간 간 조직 및/또는 세포는 또한 피츠버그 대학의 인간 연구 검토 위원회 및 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)(식별자가 제거된 면제; IRB#: PRO12090466)에서 승인한 프로토콜에 따라 UPMC 아동 병원의 Ira J Fox 연구소에서 얻었다 (표 1). 간세포는 이전에 설명한 대로 3단계 콜라게나제 소화 기술을 사용하여 분리되었다(Gramignoli R et al., 2012). 트리판 블루 배제를 사용하여 이전에 설명한 대로 분리 후 세포 생존율을 평가했으며 생존율이 >80%인 세포 제제만 분석에 사용했다.
Figure pct00001
인 실리코 HNF4α 번역 후 변형(PTM) 분석. HNF4α 세포 국소화를 조절하는 PTM을 식별하기 위해 데이터베이스 및 간행물에서 컴퓨터 검색을 통해 인 실리코 분석을 수행했다(도 5). 프로세스는 식별(identification), 선별(screening) 및 선택(selection)의 세 단계로 나뉜다. 처음에는 51개의 PTM이 식별되었다. 다음으로 선별 단계에서 두 가지 제거 기준을 적용하여 23개의 PTM을 선택했다(도 5). 2개의 인산화 및 1개의 아세틸화 변형이 평가할 수 있는 HNF4α 국소화와 관련된 가장 그럴듯한 PTM으로 선택 단계에서 확인되었다.
기체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용한 안정 동위원소 분석. 100만개의 인간 간세포를 13-C6-표지 글루코스 및 글루타민 동위원소 추적자의 존재 하에 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) F12에서 96시간 동안 배양하였다(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). 배지를 제거하고 세포를 얼음처럼 차가운 인산완충생리식염수로 세척하였다. 다음으로, 세포를 400μL 메탄올 및 1 μL 노르발린을 함유하는 400μL 물에 켄칭하고, 긁어내고, 800μL 얼음처럼 차가운 클로로포름으로 세척하고, 4℃에서 30분간 볼텍싱하고, 4℃에서 7,300 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 대사 산물(metabolite) 분석을 위해 상부 수상(aqueous phase)을 수집했다. 대사 산물 추출물을 14,000g에서 10분간 원심분리하여 극성상, 단백질 간상, 클로로포름상을 분리하였다. 물/메탄올 상을 포함하는 극성 대사 산물을 새로운 미세원심분리 튜브로 옮기고 SpeedVac에서 건조시키고 기체 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS) 분석까지 -80℃에서 보관하였다. 그런 다음, 30 μL의 메톡시아민 하이드로클로라이드(Thermo Scientific)를 건조된 샘플에 첨가하고 간헐적으로 볼텍싱하면서 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플에 총 45μL의 MMBTSTFA + 1% 털트-부틸디메틸클로로실란을 첨가하고 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 유도체화된 샘플을 유리 삽입물이 있는 가스 크로마토그래피(GC) 바이알로 옮기고 GC-MS 자동샘플러에 추가했다. GC-MS 분석은 Agilent 5977B 질량 분석기에 연결된 30-m HP-5MSUI 모세관 컬럼이 장착된 Agilent 7890 GC(Santa Clara, CA)를 사용하여 수행되었다. 극성 대사 산물의 경우 GC 오븐에 대해 다음 가열 사이클이 사용되었다: 3분 동안 100℃, 이어서 300℃까지 5℃/분의 램프 및 48분의 총 실행 시간 동안 300℃에서 유지하였다. 스캔 모드에서 데이터를 수집했다. 대사 산물의 상대적 풍부함은 각 대사 산물 단편에 대한 잠재적으로 표지된 모든 이온의 통합 신호로부터 계산되었다. 질량 동위원소 분포는 모델로 분석하기 전에 IsoCorrectoR을 사용하여 본래 풍부도에 대해 수정되었다. 대사 산물 수준은 내부 표준 노르발린의 신호로 정규화되었다. 부분 농축 계산은 기질에서 중간 대사 산물에 대한 13C의 부분 기여도를 나타낸다. 이는 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00002
여기서 NC는 13C로 표지할 수 있는 탄소의 수이고, xi는 (M + i)번째 동위 원소의 비율이다.
면역조직화학 및 HNF4α 정량화. 파라핀이 포매된 간 조직을 자일렌으로 탈파라핀화하고 에탄올로 탈수하였다. 항원 언마스킹(unmasking)은 pH 6.0의 시트르산 완충액에서 끓임으로써 수행되었다. 그런 다음 슬라이드를 3% 과산화수소에서 인큐베이션하고 정상 동물 혈청으로 차단한 다음, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 사용된 1차 항체는 표 2에 나열되어 있다. 그런 다음 조직 섹션을 1차 항체의 동물 종에 해당하는 비오틴화된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고(BA-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-디아미노벤지딘에 노출시켜서(SK-4105; Vector Laboratories) 퍼옥시다제 활성을 시각화했다. 대조염색은 Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin(Thermo Scientific, Waltham, MA)으로 수행되었다. 정량화를 위해 2명의 간 병리학자가 핵 및 세포질 HNF4α의 면역 반응성을 독립적으로 등급을 매겼으며, 샘플당 3개의 고-전력 필드에서 1,000개의 간세포를 계산했다. 정상 간(n = 2), 차일드-퍼 B(n = 4) 및 차일드-퍼 C(n = 2)가 이러한 분석에 포함되었다. 차일드-퍼 B 및 C는 간경변 인간 간으로 그룹화되고 결과는 계산된 총 세포 수에 대한 백분율로 표시된다.
항체/표적 종 면역조직화학
희석배율		 웨스턴 블롯
희석배율		 회사/카탈로그 번호
HNF4α 생쥐 1:200 1:1000 Abcam/Ab41898
아세틸-HNF4α(Lys106) 토끼 - 1:500 Cusabio/CSB-PA727840
cMET 토끼 1:200 1:1000 Cell Signaling/8198T
총 AKT 토끼 - 1:1000 Cell Signaling/ 4691S
포스포-AKT(Ser473) 토끼 1:50 1:1000 Cell Signaling/4060S
포스포-AKT(Thr308) 토끼 1:100 1:1000 Cell Signaling/9275S
총 AMPKα 토끼 - 1:1000 Cell Signaling/5831S
포스포-AMPKα(Thr172) 토끼 1:100 1:1000 Cell Signaling/2535S
총 EGFR 토끼 - 1:1000 Cell Signaling/ 4267S
포스포-EGFR(Y1086) 토끼 - 1:1000 Cell Signaling/2220S
포스포-H3(Ser10) 토끼 1:200 1:1000 Cell Signaling/9701S
카스파제 3 활성 토끼 1:100 1:500 Abcam/Ab32042
HDAC1 토끼 - 1:100 Cell Signaling/2062
히스톤 H3 생쥐 - 1:100 Santa Cruz/SC517576
B-액틴 토끼 - 1:2000 Cell Signaling/4970S
단백질 추출 및 웨스턴 블로팅. 단백질 발현 분석을 수행하기 위해, 분리된 간세포를 두 부분으로 나누었다; 한 분획은 이전에 설명한 표준 절차(Bell AW et al., 2006)에 따라 총 단백질 추출에 사용되었고, 다른 분획은 핵 단백질 분리에 사용되었다. 핵 단백질 분리를 위해, 환자당 1 x 107 에서 5 x 107 사이의 분리된 간세포를 세척하고 40mmol/L Tris(pH 7.6), 14mmol/L NaCl 및 1mmol/L EDTA에서 수거한 다음 원심분리(5분, 100g)하였다. 세포 펠렛을 2mL의 저장성 완충액[10mmol/L HEPES (pH 7.9), 10mmol/L NaH2PO4, 1.5mmol/L MgCl2, 1mmol/L DTT, 0.5mmol/L 스퍼미딘, 및 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 포함하는 1mol/L NaF (Sigma, St. Louis, MO)]에 현탁시켰다. 얼음 위에서 10분간 인큐베이션한 후, 샘플을 Dounce 균질화기에서 균질화한 다음 원심분리했다(5분, 800g). 트리판 블루 염색으로 세포 용해를 모니터링했다. 상층액은 세포질 추출물로 저장되었다. 핵 펠렛을 동일한 완충액에서 추가로 2회 세척하였다.
핵 단백질은 연속 교반과 함께 4℃에서 45분 동안 고장성 완충액[30mmol/L HEPES (pH 7.9), 25% 글리세롤, 450mmol/L NaCl, 12mmol/L MgCl2, 1mmol/L DTT, 및 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 포함하는 0.1mmol/L EDTA (Sigma, St. Louis, MO)] 50-100μL에서 추출되었다. 추출물을 30,000g에서 원심분리하고, 상층액을 수집하고 150mmol/L NaCl을 함유하지만 동일한 용액에 대해 2시간 동안 투석하였다. 단백질 농도는 Bicinchoninic Acid assay(Sigma, St. Louis, MO)에 의해 결정되었다.
표준 절차에 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행했다(Natarajan A et al., 2007). 각 단백질 밴드의 강도는 National Institutes of Health Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 1차 항체 및 그 희석액은 상기 표 2에 나와 있다.
RNA 시퀀싱 및 분석. 전체 게놈 가닥 특이적 RNA-seq를 사용하여 인간 분리된 1차 간세포로부터 RNA 발현 수준을 프로파일링했다. RNA-Seq 라이브러리는 이전(Hainer SJ et al., Genes Dev. 2015) 및 문헌(Kumar R et al., 2012)에 설명된 대로 준비되었다. TRIzol을 사용하여 장 세포에서 RNA를 추출한 후 제조업체의 지침에 따라 컬럼 정제(Zymo RNA clean and concentrator column)를 수행했다. 총 RNA는 풀링된 안티센스 올리고 혼성화를 사용하여 rRNA를 고갈시켰고, 이전에 설명한 대로 RNaseH 소화를 통해 고갈되었다 (Morlan JD et al., 2012; Adiconis X et al., 2013). Zymo RNA clean and concentrator column을 통한 정제 후, 첫 번째 가닥 cDNA가 합성되었다. 이어서, 두 번째 가닥 cDNA를 합성, 정제 및 단편화하였다. Illumina 기술을 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 준비했다. 간단히 말해서, 말단 수선, A-테일링(A-tailing) 및 바코드 어댑터 결찰 후 PCR 증폭 및 크기 선택을 수행했다. 라이브러리의 완전성은 quBit 정량화, 단편 분석기 크기 분포 평가 및 각 라이브러리에서 ~10개 단편의 생어(Sanger) 시퀀싱으로 확인되었다. 라이브러리는 페어드엔드(paired-end) Illumina 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱되었다.
페어드 엔드 리드(Paired-end read)는 QIAGEN의 CLC Genomics 워크벤치를 사용하여 hg38에 정렬되었고 TPM(transcript per million)으로 평가되었다. 데이터를 정렬하기 위해, Cluster 3.0(De Hoon MJ et al., 2004)을 사용하여 K-평균 클러스터링을 수행하고 Java TreeView(Saldanha AJ, 2004)를 사용하여 히트맵을 생성했다. 미스매치(Murphy SL et al., 2015)에 대한 기본 설정으로 삽입 비용(Goldman L et al., 2016)과 결실 비용(Goldman L et al., 2016)이 사용되었다. IPA (Ingenuity Pathway Analysis)는 차등적으로 발현된 유전자를 식별하고, 다운스트림 효과를 예측하고, 표적을 식별하는 데 사용되었다(QIAGEN Bioinformatics; www.qiagen.com/ingenuity). IPA 내의 조절 효과 분석은 상류 조절자와 생물학적 기능 간의 관계를 식별하는 데 사용되었다. 기본 설정이 분석에 사용되었다(즉, 상류 조절자는 유전자, RNA 및 단백질로 제한됨). RNA-seq 데이터는 Gene Expression Omnibus(등록 번호 www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE134422)에서 사용할 수 있다.
정상 인간 간세포에서 AKT 억제. 정상 인간 간세포(1백만 세포/웰)를 콜라겐 코팅된 웰에서 배양하였다. 세포를 성장 인자 또는 혈청 없이 6시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 AKT 억제제인 5μM의 MK-2206(Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan)으로 24시간 동안 처리하였다. 총, 세포질 및 핵 단백질은 앞에서 설명한 대로 웨스턴 블로팅을 위해 추출되었다.
통계 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. 2개의 통계 그룹에 대한 웨스턴 블롯 결과는 Mann-Whitney 비모수 검정에 의해 평가되었고 3개의 통계 그룹에 대해서는 Kruskal Wallis 비모수 검정에 의해 평가되었다. 그룹 간의 비교는 Dunn 다중 비교 테스트에 의해 수행되었다. 분석된 단백질 간의 연관성은 스피어만 순위 상관계수 테스트를 사용하여 평가되었다. 차일드-퍼 점수와 MELD 점수로 측정된 임상 상태와 단백질 발현 사이의 관계를 설명하기 위해 선형 회귀가 사용되었다. 통계는 Prism 4.0(GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA)을 사용하여 수행되었다. 차이는 P < 0.05일 때 유의한 것으로 간주되었다.
웨스턴 블롯으로 분석한 단백질 간의 직접적인 의존성을 확인하기 위해, 경로분석(구조방정식모델)을 이용하였다. 경로 분석 모델은 종속 변수와 다중 독립 변수 간의 관찰된 상관관계 사이의 가능한 인과 관계를 설명하는 것을 목표로 한다. 경로 모델은 연구 프레임워크와 회귀 가중치 및 모델 적합도 결과를 기반으로 경로를 추가 및 제거하여 테스트 및 수정되었다. 결과는 연구 시스템에 대한 변수의 직접 및 간접 효과를 보여주는 다이어그램으로 표시되었다. 변수 간의 상관관계와 선형 관계는 P < 0.05와 중요도를 나타내는 임의의 계수(숫자가 클수록 큰 관계를 나타냄)에 의해 결정된다. 경로 분석은 InfoStat 버전 2013(Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Cordoba, Cordoba, Argentina)을 사용하여 수행되었다.
샘플의 임상 상태를 구별하는 단백질 그룹을 밝히기 위해 자율(Unsupervised) 다변량 주성분 분석(PCA)이 웨스턴 블롯 데이터에 적용되었다. 대부분의 분산을 설명하는 주성분(PC)의 산점도(Scatter plot)가 그려졌다. PCA 분석에는 통계 소프트웨어 JMP 버전 14(SAS Institute, Cary, NC, USA)가 사용되었다.
실시예 2. 말기 간부전이 있는 인간 간에서 HNF4α 핵 국소화는 감소하지만 세포질 국소화는 증가된다.
HNF4α는 전사 인자로 기능하며 활성을 위해서는 핵 국소화가 필요하다 (Babeu JP et al., 2014; Chellappa K et al., 2012; Guo H, 2014; Hong YH et al., 2003; Lu H et al., 2016, Song Y et al., 2015; Soutoglou E et al., 2000; Sun K et al., 2007; Yokoyama A et al., 2011; Zhou W et al., 2012; Bell AW et al., 2006; Kritis AA et al., 1996; Tanaka T et al., 2006; Walesky C et al., 2015). 따라서, HNF4α의 위치를 결정하고 발현을 간 대상부전(decompensation)과 연관시키기 위해 병든 간 표본의 간세포에 대한 면역 조직 화학(immunohistochemistry) 및 웨스턴 블롯을 수행했다. 말기 간부전이 있는 간의 간세포의 약 78%는 HNF4α의 세포질 발현 또는 세포질 및 약한 핵 발현을 모두 나타내는 반면, 정상 인간 간은 75%의 간세포가 HNF4α의 강한 핵 국소화를 나타냈다. 웨스턴 블롯에 의해 평가된 분리된 간세포로부터의 총 HNF4α 단백질 발현은 말기 간과 정상 대조군 사이에 통계적 차이를 나타내지 않았다(P = 0.166; 도 1A). 퇴행성 질환이 있는 환자와 기능적 대상부전 정도에 따른 대조군의 간에서 HNF4α 발현의 차이를 식별하는 능력은 대규모 환자 코호트에 대한 연구가 필요했기 때문에 이 결과는 놀라운 일이 아니다(Guzman-Lepe J et al., 2018). 그러나 본 연구에서는, HNF4α 위치에 따라 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. HNF4α는 정상 대조군에서 분리된 간세포와 비교할 때, 기능적으로 보상되지 않은 간에서 분리된 간세포의 세포질에서 높은 수준(P = 0.023; 도 1B) 및 핵에서 낮은 수준(P = 0.023; 도 1C)으로 검출되었다.
HNF4α의 기능과 안정성은 많은 번역-후 변형자에 의해 조절되기 때문에(Chellappa K et al., 2012; Guo H, 2014; Hong YH et al., 2003; Lu H et al., 2016, Song Y et al., 2015; Soutoglou E et al., 2000; Sun K et al., 2007; Yokoyama A et al., 2011; Zhou W et al., 2012), 그리고 핵 국소화가 활성에 중요하기 때문에, HNF4α 국소화를 조절하는 변형자를 평가하기 위한 인 실리코 분석을 수행했다. AMPKα 활성화가 HNF4α 전사를 조절하는 것으로 밝혀졌다(Hong YH et al., 2003). 또한, AKT 경로에 의해 매개될 수 있는 HNF4α의 아세틸화는 분자를 안정화시켜 핵에서의 유지를 촉진한다(Soutoglou E et al., 2000)(도 5).
실시예 3: HNF4α는 진행성 간 질환에서 인간 간세포 기능의 주요 조절자이다.
다음 평가는 정상 대조군(n=4)의 인간 간세포와 간경변 및 말기 간부전 환자로부터 회복된 간세포(n=4)(차일드-퍼 C) 간의 유전자 발현 차이를 비교하기 위해 수행되었으며, 연구를 NASH 및 알코올 매개 Laennec's 간경변 환자로 제한했다. RNA-seq 데이터의 계층적 클러스터링은 K-평균 클러스터링의 히트맵에서 계산된 간경변 및 간 기능 장애와 관련된 세 가지 주요 동적 패턴을 나타냈다(대조군에 대한 log2 FC; K=3). 클러스터 I(3478개 유전자) 및 III(1669개 유전자)는 대조군 인간 간세포에 비해 말기 간부전 환자의 간세포에서 중간 내지 고도로 상향 조절된 유전자를 나타낸다. 이 클러스터의 대부분의 유전자는 자가포식(authphagy) 및 세포자살 신호 전달과 관련이 있다(데이터는 표시되지 않음).
그러나 클러스터 II는, 말기 간세포에서 유의하게 하향 조절된 1669개의 유전자로 구성되었으며, 세린-트레오닌 단백질 키나아제(AKT1), 사이토크롬 P450(cytochrome P450 [CYP]c8, CYP2c9, CYP2e1, CYP3A4) 및 간세포 핵 인자(HNF4α, forkhead box a1[FOXa1])을 암호화하는 유전자를 포함했다. 이 클러스터에 표시된 상위 경로에는 파르네소이드 X 수용체/레티노이드 X 수용체(RXR) 및 간 X 수용체/RXR 활성화, 미토콘드리아 기능 장애, 산화적 인산화 및 RXR 기능 억제가 포함된다. 이러한 하향 조절된 유전자에 대한 경로 분석은 HNF4α가 중심 상류 조절자임을 보여주었으며, 히트맵은 NASH 및 알코올 매개 Laennec's 간경변 환자의 간세포의 유전자 발현 프로필에서 많은 유사성을 확인했다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 결과는 말기 부전이 있는 간경변성 간에서 회수된 쥐 간세포의 유전자 발현 프로필과 거의 동일했다(Liu L et al., 2012).
실시예 4: cMET 및 AKT 인산화는 말기 간부전 환자의 인간 간세포에서 HNF4α 핵 국소화와 상관관계가 있다.
EGFR 및 cMET은 인 실리코 및 RNAseq 분석에서 확인된 AMPK 및 AKT 경로(Komposch K et al., 2015; Paranjpe S et al., 2016; Tsagianni A et al., 2018)를 조절하는 것으로 나타났기 때문에, 간 표본에서 이러한 분자에 대한 HNF4α 항체-기반 분석의 중요한 조절자로 수행되었다. 비대상 간 표본에서 cMET 발현은 면역조직화학 및 웨스턴 블롯(P = 0.023; 도 2A 및 2B) 모두에 의해 측정될 때 분리된 대조군 인간 간세포와 비교할 때 현저히 감소되었다. 정상 및 병든 간 표본 간에 EGFR 발현에는 유의한 차이가 없었다(도 2A 및 2B). 그러나 EGFR의 활성 형태인 포스포-EGFR(Y1086)은 정상 인간 간세포와 비교할 때 비대상 질환 환자의 병든 간에서 유래한 간세포에서 높게 발현되었다(도 6A 및 6B). 또한, 세포 사멸과 간세포 복제의 연속적인 주기가 간경변의 특징이므로(Tsochatzis EA et al., 2014), 환자의 간세포에서 이러한 관찰은 면역조직화학 및 웨스턴 블롯을 사용하여 말기 간세포에서 복제 [포스포-H3(Ser10)] 및 세포 사멸(활성 카스파제 3) 마커의 발현을 입증하는 말기 간부전으로 확증되었다.
cMET는 AMPKα 및 AKT를 제어할 수 있고 cMET는 기능적으로 비대상된 간의 간세포에서 유의하게 하향조절되므로, AMPKα 및 AKT의 활성화 과정을 분석했다. 총 AMPKα, 활성화된 AMPKα(Thr172) 및 그 기능 비대상 간세포와 정상 인간 간세포 간에 통계적으로 차이가 없었다(도 2A 및 2B). 그러나, 총 AKT, 활성화된 AKT(Thr308) 및 그 비율은 간 표본 및 간 기능 비대상 환자의 분리된 간세포에서 유의하게 감소했다(도 2A 및 2B). 또 다른 AKT 인산화 부위(Ser473)는 간 표본이나 정상 대조군 또는 비대상 표본에서 분리된 간세포에서 변하지 않았다(도 2A 및 B).
HNF4α의 핵 국소화와 번역 후 변형 간의 관계를 추가로 분석하기 위해 스피어만 순위 상관 테스트를 수행했다. cMET 발현은 총 HNF4α(r = 0.76; P = 0.021; 도 2C) 및 핵 HNF4α(r = 0.71; P = 0.037; 도 2C)와 통계적으로 양의 유의한 상관관계를 보였다. 활성화된 AKT(Thr308)는 또한 총 HNF4α(r = 0.73; P = 0.031; 도 2C) 및 핵 HNF4α(r = 0.82; P = 0.011; 도 2C)와 통계적으로 양의 유의한 상관관계를 보인 반면, 세포질 HNF4α는 cMET(r = -0.80; P = 0.014; 도 2C) 및 활성화된 AKT(Thr308)(r = -0.77; P = 0.021; 도 2C)와 음의 상관관계를 보였다. 또한, 포스포-AKT(Thr308)/총 AKT의 비율은 cMET(r = 0.80; P = 0.014; 도 6A) 및 총 AKT(r = 0.71; P = 0.037; 도 6A)와 양의 상관관계가 있다. 따라서, 감소된 cMET은 AKT 경로의 감소된 활성화, 핵에서 감소된 HNF4α 및 세포질에서 HNF4α의 더 많은 발현과 관련이 있었다.
실시예 5: HNF4α의 핵 국소화는 cMET/AKT 축에 의해 영향을 받고 간 기능 장애의 정도와 상관관계가 있다.
도 3A에서 볼 수 있듯이, 경로 분석은 cMET 발현과 핵 HNF4α 발현(0.56; P = 0.004) 사이의 유의한 인과 관계와 핵 HNF4α 수준과 활성화된 AKT(Thr308)/총 AKT 비율(0.05; P = 0.006) 사이의 직접적인 관계를 보였다. 모델링은 또한 총 HNF4α 발현 수준이 핵 국소화에 기여한다는 것을 보여주었다(0.60; P = 0.042). 그러나, cMET 발현은 총 HNF4α 발현(-0.37; P = 0.024)(도 3A)과 음의 관계를 가져서, cMET 발현이 총 HNF4α 발현에 직접적인 영향을 미치지 않고 핵 국소화에만 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 핵 발현 수준이 간 기능 장애의 정도(차일드-퍼 점수)와 상관관계가 있는지 여부를 평가하기 위해, 선형 회귀 분석을 수행했는데, 핵 HNF4α 발현 수준이 차일드-퍼 점수(R2 = 0.80; P = 0.007)(도 3B)와 유의한 역 관계가 있음을 보여주었다. 함께, 이러한 경로 및 단백질 발현의 선형 회귀 통계 분석은 HNF4α 국소화가 간 질환 진행과 연관되고, cMET 발현 및 AKT 인산화가 간세포 HNF4α 핵 국소화 및 기능을 유지하는 데 중심적 역할을 한다는 것을 보여준다.
다음으로, 주성분 분석(PCA)을 수행하여 HNF4α 번역 후 변형자 관련 분자를 평가하고, 분자 패턴이 말기 간세포에서 간 기능과 상관관계가 있는지(차일드-퍼 점수) 묘사했다(도 3C 및 3D). 도 3C에 도시된 바와 같이, PC1(69.9%) 및 PC2(30.1%)는 연구된 분리된 간세포에서 간 기능 수준(차일드-퍼 점수)의 가변성을 100% 구별한다. 정상 인간 간세포를 특징으로 하는 벡터는 cMET 및 활성화된 AKT(Thr308)/총 AKT 비율, 총 HNF4α 및 핵 HNF4α인 반면, 인간 간세포 부전을 특징으로 하는 음성 특성은 세포질 HNF4α 및 활성 카스파제 3 발현이다(도 3C 및 3D). 이와 함께, 이 통계 분석은 말기 간부전이 있는 인간 간세포의 분자 프로파일링을 확증하고 cMET, 활성화된 AKT(Thr308), 및 전체 및 핵 HNF4α의 발현 사이의 인과 관계를 확립한다.
실시예 6: 아세틸화 감소를 통해 말기 간부전 환자에서 핵에서의 HNF4α 보유가 감소한다.
AKT의 표적 중 하나는 CREB 결합 단백질의 활성화이다(Dekker FJ et al., 2009). CREB 결합 단백질은 뉴클레오솜 DNA에 대한 전사 인자의 접근을 증가시켜 핵 내 전사 인자의 전사 및 보유를 활성화시키는 뉴클레오솜 히스톤에 대한 고유 아세틸화 활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 이 축은 HNF4α 핵 보유와 관련될 수 있다(Soutoglou E et al., 2000). 게놈 전체 전사체 분석 및 인 실리코 분석에서 cMET/AKT 키나아제 축 경로가 CREB 결합 단백질의 활성화를 통해 HNF4α의 국소화 및 안정성을 제어할 수 있음을 나타내므로(Kumar R et al., 2012), 아세틸화된 HNF4α의 핵 발현을 측정했고(도 4A-4C), 정상 대조군과 비교할 때 말기 간부전 환자의 간세포에서 핵의 HNF4α 아세틸화가 유의하게 감소되었음을 발견했다(P = 0.024; 도 4A). 그리고 HNF4α의 아세틸화가 간 기능 장애의 정도(차일드-퍼 점수)와 관련이 있음을 확인하기 위해, 선형 회귀 분석을 수행했으며, 아세틸화된 HNF4α의 감소가 간 기능 장애와 직접적으로 유의한 상관관계가 있음을 보였다(R2 = 0.71; P = 0.004; 도 4C). 원리의 증명으로, HNF4α 핵 국소화에서 활성화된 AKT(Thr308)의 역할을 확증하기 위해 AKT 신호 전달을 억제하여 갓 분리된 정상 인간 간세포에서 예비 실험을 수행했다. 갓 분리된 정상 인간 간세포를 강력한 알로스테릭 범-AKT 억제제(allosteric pan-AKT inhibitor)인 MK-2206으로 처리했다. AKT 억제 처리 24시간 후, 비처리 대조군과 비교하여 활성화된 AKT(Thr308)의 80%, 핵 HNF4α의 25% 및 아세틸화된 핵 HNF4α 발현의 14%가 감소되었다.
실시예 7: 핵에서 HNF4α의 보유는 여러 신호 분자에 의해 조절되며, 이는 말기 간부전과 유의하게 음의 연관성을 나타낸다.
HNF4α는 간 기능의 마스터 조절자이다(Babeu JP et al., 2014; Chellappa K et al., 2012; Guo H et al., 2014; Lu H et al., 2016, Song Y et al., 2015; Soutoglou E et al., 2000; Sun K et al., 2007; Xu Z et al., 2007; Zhou W et al., 2012; Bell AW et al., 2006). HNF4α 발현의 변화는 암, B형 및 C형 간염, 알코올 매개 간경변, NASH와 같은 여러 병인을 가진 간 질환과 관련이 있다(Babeu JP et al., 2014; Chellappa K et al., 2012; Guo H et al., 2014; Lu H et al., 2016, Song Y et al., 2015; Soutoglou E et al., 2000; Sun K et al., 2007; Xu Z et al., 2007; Zhou W et al., 2012; Bell AW et al., 2006). TLF가 있는 동물 모델에서 HNF4α 발현의 강력한 감소가 확인되었으며, 유전자 요법을 사용하여 HNF4α 생산을 복원함으로써 간 세포를 정상 기능으로 재부팅한다(Nishikawa T et al., 2014). 이러한 관찰이 인간에게 적용되는지 여부를 평가하기 위해, 간 기능이 비대상된 대규모 환자 코호트의 간에서 간-강화 전사 인자 발현에 대한 연구가 수행되었다(Guzman-Lepe J et al., 2018). HNF4α mRNA 수준이 하향 조절되고 차일드-퍼 분류에 기초한 간 기능 장애의 정도와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구에서 HNF4α의 핵 국소화는 균일하지 않았다(Guzman-Lepe J et al., 2018).
인간 간세포는 NASH 및 알코올 매개 Laennec's 간경변으로 인한 간경변 및 말기(차일드-퍼 B, C) 간부전 환자의 외식된 간에서 분리되었다. 이러한 분리된 간세포에서 대조군 정상 간세포에서 볼 수 있는 것과 비교하여 세포질에 위치한 HNF4α의 증가와 핵의 HNF4α의 감소가 있었다. 또한, 인간 부전 간경변성 간세포에서 세포질 또는 핵으로의 HNF4α의 국소화는 간세포 기능 장애의 정도와 상관관계가 있었다. 이러한 데이터는 HNF4α 핵 수송 또는 보유를 조절하는 경로가 말기 간부전 치료의 표적이 될 수 있음을 나타낸다.
AMPK 및 AKT 키나아제는 HNF4α 국소화를 조절할 수 있는 주요 구성요소ㅇ이(Hong YH et al., 2003; Song Y et al., 2015; Soutoglou E et al., 2000). AMPK는 에너지 항상성을 유지하고, ATP(아데노신 삼인산) 생산 경로를 촉진하며, ATP 소비를 줄이는 데 중심 역할을 하는 반면(Woods A et al., 2017), AKT 활성화는 세포 증식, 생존 및 성장을 촉진한다(Manning BD et al., 2017, Morales-Ruiz M et al., 2017). AKT 활성화는 트레오닌 308 및/또는 세린 473에서의 인산화에 의해 매개된다(Praveen P et al., 2016; Inoue J et al., 2017). 본원에 개시된 것은 활성화된 AKT(Thr308) 수준이 말기 인간 간세포에서 유의하게 감소되었기 때문에 활성화된 AKT(Thr308)와 HNF4α 국소화 사이의 유의한 상관관계를 보여준다. 이러한 발견은 Thr308에서의 AKT 인산화가 간 질환의 말기 단계에서 간세포 부전에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
분석은 AKT와 AMPK의 상류 조절자이며 간 기능 및 재생과 관련된 두 가지 중심 수용체인 cMET 및 EGFR에 대해 수행되었다(Natarajan A et al., 2007; Komposch K et al., 2015; Paranjpe S et al., 2016; Tsagianni A et al., 2018; Alam A et al., 2017). 생쥐(mouse)에서 cMET와 EGFR의 결합된 파괴(disruption)는 간 항상성을 변경하고 말기 간부전으로 이어진다(Tsagianni A et al., 2018). 인간 부전 간경변 간세포에서, cMET의 발현 감소가 있었고 발현 감소는 HNF4α 국소화와 직접적으로 상관관계가 있었다. 대조적으로, 인간 부전 간경변 간세포 또는 대조군 인간 간세포에서 총 EGFR 발현에는 차이가 없었다. 따라서, 인간 간에서 cMET는 AKT 경로 활성화와 HNF4α 국소화 및 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 다양한 통계 분석(스피어만 순위 상관 테스트, 경로 분석, 선형 회귀 분석 및 주성분 분석)을 사용하여 인간 부전 간경변 및 정상 간세포에서 분석된 번역 후 변형자 간의 연관성을 설정할 수 있다. 이러한 통계적 분석은 cMET과 활성화된 AKT(Thr308)가 핵 HNF4α의 발현 수준과 직접적인 관련이 있음을 보여주었다. cMET 단백질 발현과 총 HNF4α 사이에서 발견된 음의 연관성은 cMET 발현이 총 HNF4α 발현에 직접적인 영향을 미치지 않고 핵 국소화에만 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
HNF4α의 아세틸화는 인간 부전 간경변 간세포에서 활성화된 AKT(Thr308)의 낮은 발현 수준과, 뉴클레오솜 DNA에 대한 전사 인자 결합을 증가시키는 고유 아세틸화 활성을 갖는 분자인 CREB 결합 단백질에 대한 AKT의 직접적인 효과에 기초하여, 간경변 부전 간세포에서 영향을 받을 수 있다. 실제로, 핵 HNF4α 아세틸화는 간경변성 간의 인간 간세포에서 현저하게 감소되었으며 그 수준은 간 기능 장애의 정도와 관련이 있었다. 이러한 관찰은 트레오닌 308에서의 AKT 인산화가 CREB 결합 단백질을 조절함으로써 아세틸화를 통해 HNF4α 핵 보유를 매개한다는 것을 나타낸다(Soutoglou E et al., 2000).
요약하면, 세포질에서 HNF4α의 국소화는 간 질환의 진행 단계 동안 핵에서 HNF4α를 유지하는 분자 경로의 변경으로 인해 발생한다. cMET 및 활성화된 AKT(Thr308)는 하향 조절되고 HNF4α의 아세틸화 및 핵 보유에 영향을 미친다. 이러한 데이터는 HNF4α를 핵에 국소화하는 것을 통해 만성 간 질환에서 간세포 기능의 회복을 보여준다.
실시예 8: 전사 인자 렌티바이러스(LV) 구축물(construct)을 사용한 1차 인간 간세포의 형질도입.
전사 인자 LV를 사용한 1차 인간 간세포의 형질도입. 간세포는 이중 콜라겐(두꺼운 층) 시스템에서 배양되어 간세포의 역분화를 방지한다. 콜라겐 샌드위치 프로토콜은 이후에 사용된다. 다음을 준비한다:
WARM: dPBS, HMM(기본+SingleQuots), HCM(HBM 기본 + HCM SingleQuots); ON ICE: 녹색 형광 단백질(GFP) LV*, 전사 인자(TF) LV*, Max Enhancer, TransDux; 기타: 1.5mL 튜브, 50mL 튜브, 팁, 피펫.
1. 두꺼운 층의 콜라겐에 웰당 5e5 간세포를 플레이팅하고 4시간 동안 세포를 부착시킨다.
2. 따뜻한 dPBS 2X로 웰을 세척하여 죽은 세포를 제거하고 배지를 500uL HMM(FBS 없음)으로 교체한다.
3. 5개의 튜브를 준비하고 다음과 같이 라벨을 붙인다: a. GFPLV-2; b. GFPLV-10; c. TFLV-0; d. TFLV-2; e. TFLV-10.
4. 50mL 튜브에 HMM/Max Enhancer/TransDux(HMT) 용액을 준비한다: 12.323mL HMM + 3.100mL Max Enhancer + 77.5uL TransDux.
5. 미리 라벨이 붙은 튜브에 LV 용액을 준비한다: a. GFPLV-2: 618.3uL HMM + 1.7uL GFP LV; b. GFPLV-10: 611.6uL HMM + 8.4uL GFP LV; c. TFLV-0: 620uL HMM; d. TFLV-2: 618.6uL HMM + 1.44uL TF4 LV; e. TFLV-10: 612.82uL HMM + 7.18uL TF4 LV.
6. 웰의 HMM 배지를 500μL HMT 용액으로 교체한다.
7. 각 LV 용액 100uL를 웰에 분배한다. 혼합할 접시를 흔들어준다.
8. 다음날 따뜻한 dPBS 2X로 웰을 세척하여 죽은 세포와 남아 있는 LV 용액을 제거한다.
9. 두꺼운 콜라겐으로 세포를 덮고 콜라겐이 겔화되도록 2시간 동안 둔다.
10. 500uL HCM을 웰에 추가하고 매일 신선한 HCM으로 교체한다.
11. 형질도입 후 72시간 및 96시간에 샘플을 얻는다(72시간 프로토콜 참조).
12. 96시간에 얻은 샘플의 경우 따뜻한 dPBS로 세포를 세척하고 배지를 500uL HCM(FBS 없음)으로 교체한다.
참고: *37℃의 수조에서 LV를 빠르게 해동한다. 후드로 옮겨 회전, 반전 또는 부드럽게 볼텍싱하여 혼합하고 얼음 위에 보관한다. 사용하지 않은 LV는 분취하여 -80℃에서 재냉동할 수 있으며 각 재냉동 시 바이러스 활성이 10-20% 손실된다.
전사 인자(TF) LV 구축물.
TF LV 구축물은 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, POM121C 또는 HNF4α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4 또는 PERK에 해당하는 RNAi를 함유하는 렌티바이러스 벡터(Systems Bioscience, Cat#CS970S-1)이다.
ELISA(72 및 96시간)에 대해 조정 배지(conditioned medium) 수집. 각 그룹에 대해 2개의 웰에서 1200uL의 조정 배지를 수집하고 1.5mL 튜브로 옮긴다. 수집된 배지를 따뜻한 HMM으로 교체한다. 조정 배지를 2분 동안 20,000xg에서 원심분리 한다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 -20℃에서 보관한다.
GFP 발현 및 브라이트필드(Brightfield)의 사진을 찍어 형질감염 효율을 결정한다(72 및 96시간). 따뜻한 dPBS로 부유(floating) 세포를 세척한다. 따뜻한 HCM으로 교체한다. GFP 발현에는 필터 2(녹색 여기(excitation))를 사용하고 브라이트필드에는 필터 6을 사용하여 사진을 찍는다.
RNA 추출을 위해 Qiazol에서 세포 용해물을 수집한다(72 및 96시간). 따뜻한 dPBS 2X로 세포를 세척한다. 600uL Qiazol로 웰을 코팅하고 1분 동안 인큐베이션한다. P1000을 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내고 1.5mL 튜브로 옮긴다. RNA가 분리될 때까지 -20℃에서 보관한다.
IF로 대한 웰을 고정한다(72시간). 따뜻한 dPBS 2X로 세포를 세척한다. 750uL 4% PFA 용액으로 웰을 코팅하고 40분 동안 인큐베이션한다. 1mL dPBS 3X로, 세척당 10분간 웰을 세척한다. dPBS 1mL를 추가한다. HNF4A가 염색될 때까지 4C에서 보관한다.
웨스턴 블롯에 대한 세포 용해물을 수집한다(72 및 96시간). 다음을 함유하는 얼음처럼 차가운 용해 용액을 준비한다:
1mL 2mL 3mL
a. NP40 세포 용해 완충액 - 90% 900uL 1800uL 2700uL
b. Complete (1 tab/1.5mL) - 6% 60uL 120uL 180uL
c. Halt protease inhibitor - 2% 20uL 40uL 60uL
d. 0.1M PMSF in ethanol - 2% 20uL 40uL 60uL
따뜻한 dPBS 2X로 세포를 세척한다. 200uL의 얼음처럼 차가운 용해 용액으로 웰을 코팅하고 워크인 냉장고에서 흔들면서 30분 동안 인큐베이션한다. 고무 청소기(rubber policeman)를 사용하여 세포를 분리하고 침전물 및 고체를 포함하는 용해물을 미리 라벨이 붙은 튜브에 수집하고 옮긴다. 4℃에서 10분 동안 20,000xg에서 회전시킨다. 상층액을 미리 라벨이 붙은 깨끗한 1.5mL 튜브에 옮긴다. -80℃ 냉동고에 용해물을 보관한다.
TF 면역형광 공동 염색(두꺼운 콜라겐 샌드위치 층이 있는 12-웰 플레이트용). 세포의 분리를 방지하기 위해 부드럽게 샘플을 흡인한다. 샘플을 건조시키지 않는다. * 최대 속도에서 5분 동안 회전을 줄인다. * 2차 항체는 실험에 따라 적절한 다른 항체로 대체될 수 있다.
고정(세포가 이미 고정된 경우 차단 및 투과 단계로 이동). 실온에서 40분 동안 PBS pH 7.4에서 4% 파라포름알데히드로 샘플을 고정한다. 샘플을 얼음처럼 차가운 PBS로 각 세척당 10분간 3X 세척한다. 염색을 진행하거나 염색이 될 때까지 4℃에서 보관한다(최대 2주).
차단 및 투과. 샘플을 1mL PBS로 2X 세척한다. 샘플을 1mL 세척 완충액(PBS, 0.1% BSA 및 0.1% Tween)으로 각 세척당 10분간 3X 세척한다. 1mL 차단 완충액(PBS, 10% 정상 당나귀 혈청, 1% BSA, 0.1% Tween 및 0.1% Triton X-100)에서 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하여 차단하고 투과시킵니다.
항체 인큐베이션: *마우스 항-TF stock 1°Ab를 볼텍싱 및 스핀다운. 차단 완충액에서 1:500 마우스 항-TF 1°Ab 희석을 준비한다. 600uL의 희석된 1°Ab로 샘플을 코팅하고 가습 챔버에서 실온에서 6시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 1°Ab 용액을 흡인하고 세척 완충액으로 세포를 각 세척당 10분간 3X 세척한다. *당나귀 항-마우스IgG-AF594(Invitrogen A21203)를 볼텍싱 및 스핀다운한다. 차단 완충액에 1:250으로 희석된 2°Ab를 준비한다. 600μL의 희석된 2°Ab로 샘플을 코팅하고 실온에서 2시간 동안 가습 챔버에서 인큐베이션한다. 2°Ab 용액을 흡인하고 세척 완충액으로 세포를 각 세척당 10분간 3X 세척한다.
카운터염색 및 마운팅: PBS 3X로 샘플을 세척한다. 암실의 PBS에서 1ug/ml Hoechst 33342의 1 mL에서 2분 동안 세포를 인큐베이션한다. PBS로 샘플을 3X 세척한다. 샘플은 4℃의 암실에서 보관될 수 있다. RED 채널을 사용하여 TF를 테스트한다.
실시예 9: 전사 인자(TF) mRNA(50, 100, 500ng)를 사용한 1차 인간 간세포의 형질감염.
1차 인간 간세포의 형질감염. 다음을 준비한다:
WARM: DPBS, HMM(HMM 기본 배지 + HMM SingleQuots), Opti-MEM → RT; ON ICE: Lipofectamine Messenger Max → RT, mRNA → RT; 기타: 1.5mL 튜브, 50mL 튜브, 팁, 피펫.
1. 따뜻한 DPBS로 세포를 세척하고 배지를 500uL HMM(FBS 없음)으로 교체한다.
2. 다음과 같이 라벨이 붙은 두 세트의 튜브를 준비한다: a. GFP-50. b. GFP-100. c. GFP-500. d. TF-0. e. TF-50. f. TF-100. g. TF-500. TF는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, POM121C 및 HNF4α에서 선택된다.
3. Opti-MEM에서 두 번 희석된 mRNA를 준비한다: a. DilGFP: 32.5uL OptiMEM + 3.61uL GFP mRNA. b. DilHNF: 40.3uL OptiMEM + 4.47uL TF mRNA.
4. 미리 라벨이 붙은 튜브의 첫 번째 세트에서 mRNA-OptiMEM 혼합물을 준비한다: a. GFP-50: 312.2uL Opti-MEM + 2.8uL DilGFP. b. GFP-100: 309.4uL Opti-MEM + 5.6uL DilGFP. c. GFP-500: 287.3uL Opti-MEM + 27.7uL DilGFP. d. HNF-0: 315uL Opti-MEM. e. TF-50: 311.5uL Opti-MEM + 3.5uL DilTF. f. TF-100: 308.1uL Opti-MEM + 6.9uL DilTF. g. TF-500: 280.7uL Opti-MEM + 34.3uL DilTF.
5. 희석된 Lipo 혼합물을 준비한다: a. 2,220.75uL Opti-MEM + 141.75uL Lipo.
6. 2-3초 동안 희석된 Lipo 혼합물을 볼텍싱하고 미리 라벨이 붙은 두 번째 세트의 튜브에 310uL를 분배한다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
7. 각 mRNA-OptiMEM 혼합물의 310uL를 희석된 Lipo 혼합물이 함유된 튜브에 옮긴다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
8. 각 웰에 각 혼합물 100uL를 분배한다.
9. 인큐베이션하고 다음날 아침, 따뜻한 dPBS로 세척하고 500uL HMM(FBS 없음)으로 교체한다.
10. 형질감염 후 24* 및 48*시간에 샘플을 얻는다(언제 간세포가 플레이팅 되는지에 따라 다름).
ELISA(24 및 48시간)에 대해 조정 배지(conditioned medium) 수집. 각 그룹에 대해 2개의 웰에서 1200uL의 조정 배지를 수집하고 1.5mL 튜브로 옮긴다. 수집된 배지를 따뜻한 HMM으로 교체한다. 조정 배지를 2분 동안 20,000xg에서 원심분리 한다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 -20℃에서 보관한다.
GFP 발현 및 브라이트필드(Brightfield)의 사진을 찍어 형질감염 효율을 결정한다(24 및 48시간). 따뜻한 dPBS로 부유 세포를 세척한다. 따뜻한 HMM으로 교체한다. GFP 발현에는 필터 2(녹색 여기)를 사용하고 브라이트필드에는 필터 6을 사용하여 사진을 찍는다.
RNA 추출을 위해 Qiazol에서 세포 용해물을 수집한다(24 및 48시간). 따뜻한 dPBS 2X로 세포를 세척한다. 600uL Qiazol로 웰을 코팅하고 1분 동안 인큐베이션한다. P1000을 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내고 1.5mL 튜브로 옮긴다. RNA가 분리될 때까지 -20℃에서 보관한다.
IF로 웰을 고정한다(24시간). 따뜻한 dPBS 2X로 세포를 세척한다. 750uL 4% PFA 용액으로 웰을 코팅하고 20분 동안 인큐베이션한다. 1mL dPBS 3X로, 세척당 5분간 웰을 세척한다. dPBS 1mL를 추가한다. TF가 염색될 때까지 4C에서 보관한다.
웨스턴 블롯에 대한 세포 용해물을 수집한다(24 및 48시간). 다음을 함유하는 얼음처럼 차가운 용해 용액을 준비한다:
1mL 2mL 3mL
a. NP40 세포 용해 완충액 - 90% 900uL 1800uL 2700uL
b. Complete (1 tab/1.5mL) - 6% 60uL 120uL 180uL
c. Halt protease inhibitor - 2% 20uL 40uL 60uL
d. 0.1M PMSF in ethanol - 2% 20uL 40uL 60uL
따뜻한 dPBS 2X로 세포를 세척한다. 200uL의 얼음처럼 차가운 용해 용액으로 웰을 코팅하고 워크인 냉장고에서 흔들면서 30분 동안 인큐베이션한다. 고무 청소기(rubber policeman)를 사용하여 세포를 분리하고 침전물 및 고체를 포함하는 용해물을 미리 라벨이 붙은 튜브에 수집하고 옮긴다. 4℃에서 10분 동안 20,000xg에서 회전시킨다. 상층액을 미리 라벨이 붙은 깨끗한 1.5mL 튜브에 옮긴다. -80℃냉동고에 용해물을 보관한다.
면역형광 동시 염색(염색, 고정, 차단 및 투과, 항체 인큐베이션, 카운터염색 및 마운팅)은 상기 실시예 9에서 언급된 바와 동일하다.
실시예 10. 전사 인자 및 조절자 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C는 말기 간부전이 있는 간경변성 간세포의 HNF4α 핵 발현을 개선한다.
간-강화 전사 인자는 말기 간경변이 있는 쥐의 간세포에서 안정적으로 하향 조절되며, 그 중 하나인 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α)의 강제 재발현이 기능을 회복하기 위해 기능 장애 간세포를 배양과 생체내 모두에서 재프로그래밍하는 것으로 밝혀졌다. 진행성 간 질환 환자의 대규모 코호트에서 병든 간에서 HNF4α mRNA 발현 수준이 간 기능 장애의 정도(차일드-퍼 분류)와 상관관계가 있으며 그 발현이 쥐 연구의 경우처럼 핵에 국한되지 않는 것으로 나타났다. 진행성 간경변 환자의 간에서는, 간 기능이 저하됨에 따라 HNF4α RNA 발현량이 감소하고, 세포질에서 단백질 발현이 발견된다. 이러한 발견은 퇴행성 간 질환 환자의 간 기능 손상을 설명할 수 있다. 더욱이, RNA-seq 분석은 HNF4α 및 핵 단백질 전위에 관여하는 기타 전사 인자/조절자-관련 경로가 말기 부전 환자의 간경변 세포에서 하향 조절되는 것으로 나타났으며, 여기서 HNF4α의 핵 수준은 유의하게 감소되었으며, HNF4α의 세포질 발현이 증가된 것으로 밝혀졌다. 또한, 소포체(ER) 스트레스의 4가지 주요 전사 조절자가 유의하게 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 이 연구는 HNF4α 및 번역 후 변형과 관련된 경로의 조작이 말기 간부전 환자에서 간세포 기능을 회복시킬 수 있음을 나타낸다.
PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C의 단백질 발현은 말기 간부전 환자의 간 기능 장애 정도와 상관관계가 있다. HNF4α가 제대로 기능하려면 핵에서 발현되어야 한다; 따라서 HNF4α의 핵 국소화와 관련된 신호 전달 경로는 기능이 비대상된 외식된 인간 간에서 분리된 간세포에서 분석되었다. 전사 인자 및 조절자 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C가 RNA-seq 분석에서 HNF4α의 중요한 조절자로 확인되었기 때문에, NASH 또는 알코올 유발 간경변(차일드 퍼 "B" 및 "C")을 위해 간 이식을 겪은 환자의 간으로부터 분리한 1차 인간 간세포 또는 대조군 정상 간세포에서 이러한 분자에 대한 항체 기반 분석이 수행되었다. HNF4α 발현은 분리된 대조군 인간 간세포와 비교하면 웨스턴 블롯(도 8A)으로 측정할 때 비대상 간 표본에서 현저히 감소했다. 간부전이 진행됨에 따라 MTF1 발현에도 유의한 차이가 있었다. 또한, 단순 선형 회귀를 사용하여 차일드-퍼로 채점된 인간 간세포는 HNF4α 및 MTF1의 단백질 발현과 상관관계가 있었으며, HNF4α 및 MTF1 모두 간부전 정도와 유의하게 상관관계가 있음을 발견했다(p=0.007)(도 8B-8F). 또한, NR0B2(도 9A-D), NR5A2(도 10A-D), PROX1(도 11A-D)의 단백질 발현은 차일드 퍼 C 간세포에서 유의하게 낮았으며 이들의 발현은 간세포 기능 장애의 정도와 상관관계가 있었다.
HNF4α 핵 발현 및 위치에 대한 이러한 확인된 전사 인자 및 조절자의 역할을 더 이해하기 위해, 인간 간세포주를 CRISPR/Cas9를 사용하여 유전자 편집하여 PROX1 또는 NR5A2 또는 NR0B2 또는 MTF1 또는 SREBP1 또는 EP300 및 POM121C의 발현을 녹아웃(KO)시켰다(도 15A-B). PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 또는 POM121C의 KO에 의해 HNF4α 핵 발현이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(도 15A). 특히 HNF4α의 높은 비-핵 발현은 PROX1 또는 SREBP1이 KO일 때 관찰되었다. 세포질에서 HNF4α의 발현은 말기 간부전이 있는 인간 간세포에 대한 이전 연구에서 유사하게 확인되었다. 또한 HNF4α 단독 또는 PROX1 또는 NR5A2 또는 NR0B2 또는 MTF1 또는 SREBP1 또는 POM121C와 조합하여 HNF4α의 핵 발현을 유도하는 효과를 테스트하기 위해, 간 이식을 겪는 NASH로 인한 말기 간부전 환자의 외식된 간에서 분리된 인간 간세포에서 치료를 수행했다(도 16). HNF4α-AAV 단독으로 처리한 지 96시간 후에 대조군(GFP-AAV)과 비교하여 HNF4α의 핵 발현이 약 1배 증가됨을 발견했다. 그러나 HNF4α-AAV 치료가 PROX1-AAV 또는 NR5A2-AAV 또는 NR0B2-AAV 또는 MTF1-AAV 또는 SREBP1-AAV 또는 POM121C-AAV와 조합되었을 때, 모든 조합은 HNF4α의 유의한 핵 발현을 유도했으며(도 16), 특히 조합이 HNF4α + PROX1 또는 SREBP1과 관련된 경우 유의한 핵 발현을 유도했다.
따라서, 이 연구는 전사 인자 및 조절자 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300 및 POM121C가 말기 간부전이 있는 간경변 간세포에서 HNF4α의 핵 발현을 개선함을 입증한다. 더욱이, 이 결과는 HNF4α와 하나 이상의 전사 인자 및 조절자(PROX1 또는 NR5A2 또는 NR0B2 또는 MTF1 또는 SREBP1 또는 EP300 및 POM121C)를 포함하는 모든 조합이 HNF4α의 핵 발현 및 말기 간 부전을 치료하는 HNF4α의 재프로그래밍 능력을 향상시킨다는 것을 보여준다.
참고문헌:
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Homo sapiens <400> 33 agatcttccc agaggacggt ttgaaaggaa ggcagagagg gcactgggag gaggcagtgg 60 gagggcggag ggcgggggcc ttcggggtgg gcgcccaggg tagggcaggt ggccgcggcg 120 tggaggcagg gagaatgcga ctctccaaaa ccctcgtcga catggacatg gccgactaca 180 gtgctgcact ggacccagcc tacaccaccc tggaatttga gaatgtgcag gtgttgacga 240 tgggcaatga ttttgttgcc gctgcgtctc gccagattga ggcatcccct ccgacatcac 300 tggagcatat ctggaggggt ggacagttct ccacagggag acacgtcccc atcagaaggc 360 accaacctca acgcgcccaa cagcctgggt gtcagcgccc tgtgtgccat ctgcggggac 420 cgggccacgg gcaaacacta cggtgcctcg agctgtgacg gctgcaaggg cttcttccgg 480 aggagcgtgc ggaagaacca catgtactcc tgcagattta gccggcagtg cgtggtggac 540 aaagacaaga ggaaccagtg ccgctactgc aggctcaaga aatgcttccg ggctggcatg 600 aagaaggaag ccgtccagaa tgagcgggac cggatcagca ctcgaaggtc aagctatgag 660 gacagcagcc tgccctccat caatgcgctc ctgcaggcgg aggtcctgtc ccgacagatc 720 acctcccccg tctccgggat caacggcgac attcgggcga agaagattgc cagcatcgca 780 gatgtgtgtg agtccatgaa ggagcagctg ctggttctcg ttgagtgggc caagtacatc 840 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ctccccccag ccccctaaga gagcacctgg tgatcacgtg gtcacggcaa aggaagacgt 1740 gatgccagga ccagtcccag agcaggaatg ggaaggatga agggcccgag aacatggcct 1800 aagggccaca tcccactgcc acccttgacg ccctgctctg gataacaaga ctttgacttg 1860 gggagacctc tactgccttg gacaactttt ctcatgttga agccactgcc ttcaccttca 1920 ccttcatcca tgtccaaccc ccgacttcat cccaaaggac agccgcctgg agatgacttg 1980 aggccttact taaacccagc tcccttcttc cctagcctgg tgcttctcct ctcctagccc 2040 ctgtcatggt gtccagacag agccctgtga ggctgggtcc aattgtggca cttggggcac 2100 cttgctcctc cttctgctgc tgcccccacc tctgctgcct ccctctgctg tcaccttgct 2160 cagccatccc gtcttctcca acaccacctc tccagaggcc aaggaggcct tggaaacgat 2220 tcccccagtc attctgggaa catgttgtaa gcactgactg ggaccaggca ccaggcaggg 2280 tctagaaggc tgtggtgagg gaagacgcct ttctcctcca acccaacctc atcctccttc 2340 ttcagggact tgggtgggta cttgggtgag gatccctgaa ggccttcaac ccgagaaaac 2400 aaacccaggt tggcgactgc aacaggaact tggagtggag aggaaaagca tcagaaagag 2460 gcagaccatc caccaggcct ttgagaaagg gtagaattct ggctggtaga gcaggtgaga 2520 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attaaggaga attcatgact cttgacagct tttctctctt cactccccaa gtcaagggga 3420 ggggtggcag gggtctgttt cctggaagtc aggctcatct ggcctgttgg catgggggtg 3480 ggacagtgtg cacagtgtgg gggcagggga gggctaagca ggcctgggtt tgagggctgc 3540 tccggagacc gtcactccag gtgcattctg gaagcattag accccaggat ggagcgacca 3600 gcatgtcatc catgtggaat cttggtggct ttgaggacat tctggaaaat gccactgacc 3660 agtgtgaaca aaagggatgt gttatggggc tggaggtgtg attaggtagg agggaaactg 3720 ttggaccgac tcctgccccc tgctcaacac tgacccctct gagtggttgg aggcagtgcc 3780 ccagtgccca gaaatcccac cattagtgat tgttttttat gagaaagagg cgtggagaag 3840 tattggggca atgtgtcagg gaggaatcac cacatcccta cggcagtccc agccaagccc 3900 ccaatcccag cggagactgt gccctgctca gagctcccaa gccttccccc accacctcac 3960 tcaagtgccc ctgaaatccc tgccagacgg ctcagcctgg tctgcggtaa ggcagggagg 4020 ctggaaccat ttctgggcat tgtggtcatt cccactgtgt tcctccacct cctccctcca 4080 gcgttgctca gacctctgtc ttgggagaaa ggttgagata agaatgtccc atggagtgcc 4140 gtgggcaaca gtggcccttc atgggaacaa tctgttggag cagggggtca gttctctgct 4200 gggaatctac ccctttctgg aggagaaacc cattccacct taataacttt attgtaatgt 4260 gagaaacaca aaacaaagtt tacttttttg actctaagct gacatgatat tagaaaatct 4320 ctcgctctct tttttttttt tttttttttt tttggctact tgagttgtgg tcctaaaaca 4380 taaaatctga tggacaaaca gagggttgct ggggggacaa gcgtgggcac aatttcccca 4440 ccaagacacc ctgatcttca ggcgggtctc aggagcttct aaaaatccgc atggctctcc 4500 tgagagtgga cagaggagag gagagggtca gaaatgaacg ctcttctatt tcttgtcatt 4560 accaagccaa ttacttttgc caaatttttc tgtgatctgc cctgattaag atgaattgtg 4620 aaatttacat caagcaatta tcaaagcggg ctgggtccca tcagaacgac ccacatcttt 4680 ctgtgggtgt gaatgtcatt aggtcttgcg ctgacccctg agcccccatc actgccgcct 4740 gatggggcaa agaaacaaaa aacatttctt actcttctgt gttttaacaa aagtttataa 4800 aacaaaataa atggcgcata tgttttctaa gtccttggat aagtatcttt tctttcaggt 4860 atcagaaata agactgaatc ttctggttct acttgggggt taaaaaattt tttttaaagg 4920 aagaatgaga atagttttat agttctttgt gatgtgcaga atgtttttgt gtccattata 4980 atttttcagt cttcacatca agaggtaagc agttagacat gattactccc actttccaga 5040 tgaggagact gaggcttggg ggaagtgact tctcttggaa ggcagaggtg gacatctaac 5100 cctggtctct tgattccaag tacttagtat atcgagagag tgaaagttga tcccccttct 5160 tgaagagggg agtgatgagg ggagagtgca atggcaagat ctggaagaat ggcaagaggg 5220 tccaagggtc tgtcatcctc caccaaggtt caagacagaa ccttttgctg ggtcacctca 5280 atctgccagc aatggaagat gagtagctgt ggggacattt cataaaagca agtggttttt 5340 ttgttttgtt ttgttttgtt ttttgttttt ttttctagaa caaggctgtg cacagtggct 5400 cacctctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggcggga ggatcacttg agctcaggag 5460 ttcgagacca gccagagcaa tataaggaga ccccatctct acaaaaaatt taaaaattag 5520 ccaggtatag tggtgtgtgc ctatagtacc agctactctg aaggctgagg tgggaagatt 5580 gcttcagccc aggagttcga ggatgcagtg agctatgaat gcaacactgc actacagcct 5640 ggatgaaaga acaagactct gtctcaaaac ataaataata agtaaaaaga ataaaagcaa 5700 gagatgcact tgagaatctc cagccagatc tgtagccact gggcttctct ccaaggctaa 5760 actattacag gagggtggcc ttgtgtctcg gtcaccacag accacagcgt tccattcact 5820 cggggttgtg ctggagctgg cttgtgagaa ctgactgtta gcttctcttc ccaactccat 5880 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cacctgctgc tcggagccac 960 caagagatcc atggtgttca aggacgtgct gctcctaggc aatgactaca ttgtccctcg 1020 gcactgcccg gagctggcgg agatgagccg ggtgtccata cgcatccttg acgagctggt 1080 gctgcccttc caggagctgc agatcgatga caatgagtat gcctacctca aagccatcat 1140 cttctttgac ccagatgcca aggggctgag cgatccaggg aagatcaagc ggctgcgttc 1200 ccaggtgcag gtgagcttgg aggactacat caacgaccgc cagtatgact cgcgtggccg 1260 ctttggagag ctgctgctgc tgctgcccac cttgcagagc atcacctggc agatgatcga 1320 gcagatccag ttcatcaagc tcttcggcat ggccaagatt gacaacctgt tgcaggagat 1380 gctgctggga gggtccccca gcgatgcacc ccatgcccac caccccctgc accctcacct 1440 gatgcaggaa catatgggaa ccaacgtcat cgttgccaac acaatgccca ctcacctcag 1500 caacggacag atgtccaccc ctgagacccc acagccctca ccgccaggtg gctcagggtc 1560 tgagccctat aagctcctgc cgggagccgt cgccacaatc gtcaagcccc tctctgccat 1620 cccccagccg accatcacca agcaggaagt tatctagcaa gccgctgggg cttgggggct 1680 ccactggctc cccccagccc cctaagagag cacctggtga tcacgtggtc acggcaaagg 1740 aagacgtgat gccaggacca gtcccagagc aggaatggga aggatgaagg gcccgagaac 1800 atggcctaag ggccacatcc cactgccacc cttgacgccc tgctctggat aacaagactt 1860 tgacttgggg agacctctac tgccttggac aacttttctc atgttgaagc cactgccttc 1920 accttcacct tcatccatgt ccaacccccg acttcatccc aaaggacagc cgcctggaga 1980 tgacttgagg ccttacttaa acccagctcc cttcttccct agcctggtgc ttctcctctc 2040 ctagcccctg tcatggtgtc cagacagagc cctgtgaggc tgggtccaat tgtggcactt 2100 ggggcacctt gctcctcctt ctgctgctgc ccccacctct gctgcctccc tctgctgtca 2160 ccttgctcag ccatcccgtc ttctccaaca ccacctctcc agaggccaag gaggccttgg 2220 aaacgattcc cccagtcatt ctgggaacat gttgtaagca ctgactggga ccaggcacca 2280 ggcagggtct agaaggctgt ggtgagggaa gacgcctttc tcctccaacc caacctcatc 2340 ctccttcttc agggacttgg gtgggtactt gggtgaggat ccctgaaggc cttcaacccg 2400 agaaaacaaa cccaggttgg cgactgcaac aggaacttgg agtggagagg aaaagcatca 2460 gaaagaggca gaccatccac caggcctttg agaaagggta gaattctggc tggtagagca 2520 ggtgagatgg gacattccaa agaacagcct gagccaaggc ctagtggtag taagaatcta 2580 gcaagaattg aggaagaatg gtgtgggaga gggatgatga 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ctcatctggc ctgttggcat 3480 gggggtggga cagtgtgcac agtgtggggg caggggaggg ctaagcaggc ctgggtttga 3540 gggctgctcc ggagaccgtc actccaggtg cattctggaa gcattagacc ccaggatgga 3600 gcgaccagca tgtcatccat gtggaatctt ggtggctttg aggacattct ggaaaatgcc 3660 actgaccagt gtgaacaaaa gggatgtgtt atggggctgg aggtgtgatt aggtaggagg 3720 gaaactgttg gaccgactcc tgccccctgc tcaacactga cccctctgag tggttggagg 3780 cagtgcccca gtgcccagaa atcccaccat tagtgattgt tttttatgag aaagaggcgt 3840 ggagaagtat tggggcaatg tgtcagggag gaatcaccac atccctacgg cagtcccagc 3900 caagccccca atcccagcgg agactgtgcc ctgctcagag ctcccaagcc ttcccccacc 3960 acctcactca agtgcccctg aaatccctgc cagacggctc agcctggtct gcggtaaggc 4020 agggaggctg gaaccatttc tgggcattgt ggtcattccc actgtgttcc tccacctcct 4080 ccctccagcg ttgctcagac ctctgtcttg ggagaaaggt tgagataaga atgtcccatg 4140 gagtgccgtg ggcaacagtg gcccttcatg ggaacaatct gttggagcag ggggtcagtt 4200 ctctgctggg aatctacccc tttctggagg agaaacccat tccaccttaa taactttatt 4260 gtaatgtgag aaacacaaaa caaagtttac ttttttgact 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gagagagtga aagttgatcc 5160 cccttcttga agaggggagt gatgagggga gagtgcaatg gcaagatctg gaagaatggc 5220 aagagggtcc aagggtctgt catcctccac caaggttcaa gacagaacct tttgctgggt 5280 cacctcaatc tgccagcaat ggaagatgag tagctgtggg gacatttcat aaaagcaagt 5340 ggtttttttg ttttgttttg ttttgttttt tgtttttttt tctagaacaa ggctgtgcac 5400 agtggctcac ctctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcgggagga tcacttgagc 5460 tcaggagttc gagaccagcc agagcaatat aaggagaccc catctctaca aaaaatttaa 5520 aaattagcca ggtatagtgg tgtgtgccta tagtaccagc tactctgaag gctgaggtgg 5580 gaagattgct tcagcccagg agttcgagga tgcagtgagc tatgaatgca acactgcact 5640 acagcctgga tgaaagaaca agactctgtc tcaaaacata aataataagt aaaaagaata 5700 aaagcaagag atgcacttga gaatctccag ccagatctgt agccactggg cttctctcca 5760 aggctaaact attacaggag ggtggccttg tgtctcggtc accacagacc acagcgttcc 5820 attcactcgg ggttgtgctg gagctggctt gtgagaactg actgttagct tctcttccca 5880 actccatgtt tgccagtgcc acactgatag cttgaaattg gttattgccg gagtgtttac 5940 accacaagga ctagcaaact ctacaaatcc gggcttttgt tcctggagag cccgttgtta 6000 acattcacca gcacaccaca gcattcggca atggctggac catgggatgc ctacatatgg 6060 ggacatcctc cttggggatg agggtagagc agggcgatcc tttcacctct tccttaaggg 6120 aggggacaaa agttctggtc tgggaagcac acgttttgct gatcagcgta accttgggca 6180 ggtcactcca ccactccgag cctcatctgt aaagtgggaa tgatatctcc ctccagggca 6240 gatgtcagga ttcaatggaa tgagatcaca gtaactgtga gagctcccgt tacatgagga 6300 gtacaagtga actcttcatg cgcccctttt tagcgagaag ttaaccatta aactctccag 6360 gcttcagagc acccattcgc tgtctacctg atccctaggg ccgctcccgc cttcccctgt 6420 gccttccctc cactagtcag caccaggaaa tgttttcgat aacgttgcaa cggaggcctt 6480 gttcatgctg ccgccatcgg ggacaagcgc gggggggggg gggtggaggc cagaggagac 6540 tatttcagtc ctaaattgtg cttaataaac ccatatcaaa accataaa 6588

Claims (34)

  1. PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양 또는 기능을 증가시키는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 벡터이고, 상기 벡터는 PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 벡터이고, 상기 벡터는 PROX1 및/또는 SREBP1을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산은 DNA 또는 RNA인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 대상체의 간세포의 핵에서 HNF4α의 양을 증가시키는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키지 않는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 HNF4α을 암호화하는 핵산을 더 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, HNF4α를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 핵산은 HNF4α 이소형 2 (P1)을 암호화하는 것인, 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 HNF4α를 암호화하는 핵산은 서열번호 1을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 질환은 간 섬유증, 간경변, 간암 또는 말기 간 질환인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 질환은 간경변인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  15. DNAJB1/HSP40, ATF6, ATF4, 및 PERK으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자의 양을 감소시키거나 기능을 억제시키는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 핵산인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 대상체의 간세포의 핵에서 HNF4α의 양을 증가시키는 것인, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키지 않는 것인, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 간세포에서 HNF4α의 총량을 증가시키는 것인, 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 HNF4α를 암호화하는 핵산을 더 포함하는 것인, 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HNF4α를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 핵산은 HNF4α 이소형 2를 암호화하는 것인, 방법.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 HNF4α를 암호화하는 핵산은 서열번호 1을 포함하는 것인, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 질환은 간 섬유증, 간경변, 간암 또는 말기 간 질환을 포함하는 것인, 방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  27. PROX1, NR5A2, NR0B2, MTF1, SREBP1, EP300, 및 POM121C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자, 및 그의 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, HNF4α를 암호화하는 핵산을 포함하는 또 다른 벡터를 더 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 HNF4α를 암호화하는 핵산은 서열번호 1을 포함하는 것인, 조성물.
  30. HNF4α 이소형 2를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 질환을 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 1을 포함하는 것인, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 간 질환은 간 섬유증, 간경변, 간암 또는 말기 간 질환인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 간 질환은 간경변인, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
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