JP2022551987A

JP2022551987A - 肝疾患を治療するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2022551987A
Application number: JP2022522789A
Authority: JP
Inventors: グティエレス，アレハンドロソト; ベル，アーロン; ナヴァッロ，ニコラスフラウンホーファー; レペ，ジョージグズマン; ハイナー，サラ; ケー．ミハロプロス，ジョージ; オストローシュカ，アリーナ; フォックス，イラ; ナオエテファレング，エドガー; 一樹武石
Original assignee: ユニバーシティオブピッツバーグ－オブザコモンウェルスシステムオブハイヤーエデュケイション
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-12-14
Also published as: US20220362405A1; EP4045094A1; AU2020367770A1; BR112022007252A2; WO2021076566A1; IL292221A; ZA202205289B; MX2022004625A; CN115209923A; CA3154460A1; KR20220101631A; CL2022000967A1; EP4045094A4

Abstract

転写因子であるＨＮＦ４αの対象における肝細胞の核への輸送または保持を増加させることによって、対象における肝疾患を治療するための組成物および方法が開示されている。いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００およびＰＯＭ１２１Ｃならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をアップレギュレートすること、ならびに／あるいは１つまたは複数の転写因子ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４およびＰＥＲＫならびにその機能的断片の発現または機能をダウンレギュレートすることを含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／９１５，７６５号の優先権を主張する。
連邦政府により後援された研究または開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＤＫ０９９２５７の下で、政府支援を受けて行われた。政府は本発明においてある一定の権利を有する。
本開示は、例えば、肝疾患および／または肝障害を治療するためのＨＮＦ４αの発現または活性のモジュレーションに関する。

進行性肝硬変の結果として起こる終末期肝不全（ＴＬＦ）は、２０１５年には死因の第１２位であることが報告されており、世界の人口１０万人あたりの死者は１５．８人であると推定されている（Tsochatzis EA et al., 2014）。米国では、２０１５年の慢性肝疾患および肝硬変に結び付けられる死亡登録者数は４０，３２６人であり、人口１０万人あたりの死者は１２．５人、年々増加率は３．８％であった（Murphy SL et al., 2017；Goldman L, et al., 2016）。影響を最も受ける年齢層は４５歳～６４歳で、人口１０万人あたりの死者は２６．４人であり、慢性肝疾患および肝硬変は、がん、心臓病、および不慮の事故に次いで、この年齢層における第４位の主要死因としてランク付けされている（Murphy SL et al., 2017）。ＴＬＦの唯一の決定的な治療法は同所性肝移植であり、肝移植を必要とする患者の数と利用可能な臓器が不十分な数であることを考えると、本質的にＴＬＦは治療不可能な疾患となる（Lopez PM et al., 2006）。

慢性肝疾患には、肝炎ウイルスによる慢性感染、アルコール媒介性肝硬変、および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む、様々な原因があり（Archambeaud I et al., 2015；Donato F et al,. 2006；Gelatti U et al., 2005；Kuper H et al., 2000）、それぞれ肝細胞不全を引き起こす可能性がある（Guzman-Lepe J et al., 2018；Hernaez R et al., 2017；Lee YA et al., 2015；Pessayre D et al., 1978）。ヒトにおける肝細胞機能の低下および最終的には肝不全の原因を担う機序は余り解明されていない。

慢性肝疾患、肝硬変、および最近のＴＬＦの主要な原因は、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスによる感染、アルコール媒介性ラエンネック肝硬変、および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）／メタボリック症候群に関係している（Archambeaud et al., 2015；Donato F et al., 2006；Gelatti et al., 2005；Kuper et al., 2000）。これらの病因因子は、血管系の変化を伴う正常な小葉の構造を破壊する線維症を引き起こす（Goldman L, et al., 2016）。これらの病理学的変化は、肝細胞不全および肝細胞がその正常な機能を果たすことができないことに関連していたが（Guzman-Lepe J et al., 2018；Hernaez R et al., 2007；Lee Ya et al., 2015；Pessayre D et al., 1978）、肝細胞機能の低下および最終的な肝不全の原因を担う機序は、ヒトにおいて不明である。慢性肝損傷は、酸化ストレス（Cichoz-Lach H et al., 2014；Simoes ICM et al., 2018）および小胞体ストレス（Malhi H et al., 2011；Zhang XQ et al., 2014）を発生させ、これらが細胞死を誘導し（Cichoz-Lach H et al., 2014；Malhi H et al., 2011；Zhang XQ et al., 2014；Wang K et al., 2014；Seki E et al., 2015）、最終的に肝細胞の増殖能力を低下させる（Zhang BH et al., 1999；Michalopoulos GK et al., 2015；Dubuquoy L et al., 2015）。

末期肝硬変のラット由来の肝細胞では、肝臓に豊富な転写因子が安定的にダウンレギュレートされていること（Nishikawa T et al., 2014；Guzman-Lepe J et al., 2019）、また、それらのうちの１つである肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）の強制的な再発現が機能障害性肝細胞を再プログラムして、培養とｉｎｖｉｖｏの両方において機能を回復させること（Nishikawa T et al., 2014）が判明している。進行性肝疾患の患者の大規模なコホートについての研究では、罹患した肝臓のＨＮＦ４α ｍＲＮＡ発現のレベルが肝機能障害の程度と相関していること（チャイルド・ピュー分類）、またＨＮＦ４α発現が核に局在していなかったことが明らかにされている（Guzman-Lepe J et al., 2019）。肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）の強制的な再発現は、新たな肝細胞または幹細胞を増殖させることなく、培養およびｉｎｖｉｖｏの両方において、機能障害性肝細胞を再プログラムして、終末期の肝硬変の肝臓から再び機能させることができる（Nishikawa T et al., 2014）。ＨＮＦ４αの核内局在およびｍＲＮＡ発現の有意な減少を含む、ＬＥＴＦのダウンレギュレーションは、ＴＬＦのあるヒト肝臓の大規模コホートにおける肝機能障害の程度と関係している（Guzman-Lepe J et al., 2018）。

ＨＮＦ４αは、成体肝臓における肝臓器官形成と肝細胞機能に重要な役割を果たす転写因子である（Nishikawa T et al., 2014；Babeu JP et al., 2014）。主なＨＮＦ４αの作用は、脂質、グルコース、生体異物、および薬物の代謝に関与する特異的な標的遺伝子の制御であった（Nishikawa T et al., 2014；Babeu JP et al., 2014）。ヒトでは単一遺伝子がＨＮＦ４αをコードしており（Kritis AA et al., 1999）、これは２つの異なるプロモーターによって制御されている。これらのプロモーターは、２つのアイソフォームクラス、Ｐ１およびＰ２を生成する（Babeu JP et al., 2014）。Ｐ１アイソフォームは、主として成体肝臓で発現されるが、Ｐ２アイソフォームは胚発生中の肝臓で、およびがんなどの病的状況下での肝臓で検出されている（Babeu JP et al., 2014；Walesky C et al., 2015；Tanaka T et al., 2006）。ＨＮＦ４αの発現および機能は、複数のレベルで制御されている（Chellappa K et al., 2012；Guo H et al., 2014；Hong YH et al., 2003；Lu H et al., 2016、Song Y et al., 2015；Soutoglou E et al., 2000；Sun K et al., 2007；Xu Z et al., 2007；Yokoyama A et al., 2011；Zhou W et al., 2012）。

したがって、ＨＮＦ４αの発現をモジュレートし、ならびに／あるいは肝疾患および／または肝障害を治療するための組成物および方法が必要とされている。本明細書に開示されている組成物および方法は、これらのニーズおよび他のニーズに対処する。

本明細書に開示されている組成物および方法は、肝疾患治療におけるある特定の未だ対処されていないニーズに対処する。いくつかの態様では、本明細書では、肝疾患および／または肝障害を治療するための医薬のための組成物およびその使用であって、組成物が、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００および／またはＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量または機能を増加させるか、あるいはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する、組成物およびその使用が開示されている。いくつかの実施形態では、組成物はベクターであり、ベクターは、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、および／またはＰＯＭ１２１Ｃのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４α（例えば、ＨＮＦ４αアイソフォーム２）をコードする核酸を含むベクターである。本明細書に開示されている組成物および方法は、肝細胞のＨＮＦ４αの量の驚くべき増加（例えば、肝細胞のＨＮＦ４αの総量の増加、および／または肝細胞の核のＨＮＦ４αの量の増加）をもたらし、肝疾患（例えば、末期肝疾患）の効果的な治療がもたらされる。

いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象に組成物を投与することを含み、組成物が、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量または機能を増加させる、方法が開示されている。

いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療するための医薬を調製するための組成物の使用であって、対象に組成物を投与することを含み、組成物が、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量または機能を増加させる、使用が開示されている。

いくつかの実施形態では、組成物はベクターであり、ベクターは、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＰＲＯＸ１および／またはＳＲＥＢＰ１をコードする１つまたは複数の核酸を含む。１つまたは複数の核酸は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。

いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象に組成物を投与することを含み、組成物が、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する、方法が開示されている。

いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療するための医薬を調製するための組成物の使用であって、対象に組成物を投与することを含む、組成物が、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量または機能を減少させる、使用が開示されている。

いくつかの実施形態では、組成物の投与は、対象における肝細胞の核のＨＮＦ４αの量を増加させる。いくつかの実施形態では、組成物の投与は、肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させない。いくつかの実施形態では、組成物の投与は、肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させる。

いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、対象にＨＮＦ４αをコードする核酸を含むベクターを投与することをさらに含む。一例では、核酸は、ＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする。

いくつかの態様では、本明細書では、ベクターを含む組成物であって、ベクターが、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をコードする１つまたは複数の核酸を含む、組成物が開示されている。

いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象にＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする核酸を含むベクターを投与することを含む方法が開示されている。

いくつかの態様では、本明細書では、肝疾患を治療するための医薬を調製するためのベクターの使用であって、ベクターが、ＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする核酸を含む、使用が開示されている。

図１Ａ～１Ｃは、正常肝臓および硬変した肝臓からの肝細胞におけるＨＮＦ４αの局在を示す。図１Ａは、ＮＡＳＨ非代償性肝臓および正常ヒト肝細胞からの単離したヒト肝細胞のＨＮＦ４α免疫蛍光法の代表的な写真を示す。機能的に非代償性の肝臓から単離した肝細胞（ＮＡＳＨおよびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変）（ｎ＝６）および正常肝臓対照から単離した肝細胞（ｎ＝２）におけるベータアクチンに対して、ＨＮＦ４αのウェスタンブロット分析および定量化を正規化した。図１Ａは、総ＨＮＦ４α；正常ヒト肝細胞対非代償性ヒト肝細胞、Ｐ＝０．１６６を示す。図１Ｂは、細胞質のＨＮＦ４α；正常ヒト肝細胞対非代償性ヒト肝細胞、Ｐ＝０．０２３を示す。図１Ｃは、核のＨＮＦ４α；正常ヒト肝細胞対非代償性ヒト肝細胞、Ｐ＝０．０２３）を示す。Ａ～Ｃのグラフは、平均±ＳＤとしてプロットされる。統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）。ひし形は、チャイルド・ピュー「Ｂ」を示し、四角は、チャイルド・ピュー「Ｃ」を示す。図２Ａ～２Ｃは、ＨＮＦ４α翻訳後修飾剤のタンパク質の発現およびスピアマンの順位相関試験を示す。図２Ａおよび２Ｂは、非代償性ＮＡＳＨの肝細胞（ｎ＝４）およびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変の肝細胞（ｎ＝２）および正常な対照肝細胞（ｎ＝２）における、ＥＧＦＲ（Ｐ＝０．９０４）、ｃＭＥＴ（Ｐ＝０．０２３）、総ＡＭＰＫα（Ｐ＞０．９９９）、ｐ－ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）（Ｐ＝０．５４７）、総ＡＫＴ（Ｐ＝０．０４７）、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（Ｐ＝０．５４７）、ｐ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（Ｐ＝０．０２４）、ｐ－ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）／ＡＭＰＫαの比率（Ｐ＝０．５４７６）、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）／ＡＫＴの比率（Ｐ＝０．１６６７）およびｐ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率（Ｐ＝０．０２３８）のウェスタンブロット分析（２Ａ）および定量化（２Ｂ）を示す。図２Ａ～２Ｃは、ＨＮＦ４α翻訳後修飾剤のタンパク質の発現およびスピアマンの順位相関試験を示す。図２Ａおよび２Ｂは、非代償性ＮＡＳＨの肝細胞（ｎ＝４）およびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変の肝細胞（ｎ＝２）および正常な対照肝細胞（ｎ＝２）における、ＥＧＦＲ（Ｐ＝０．９０４）、ｃＭＥＴ（Ｐ＝０．０２３）、総ＡＭＰＫα（Ｐ＞０．９９９）、ｐ－ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）（Ｐ＝０．５４７）、総ＡＫＴ（Ｐ＝０．０４７）、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（Ｐ＝０．５４７）、ｐ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（Ｐ＝０．０２４）、ｐ－ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）／ＡＭＰＫαの比率（Ｐ＝０．５４７６）、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）／ＡＫＴの比率（Ｐ＝０．１６６７）およびｐ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率（Ｐ＝０．０２３８）のウェスタンブロット分析（２Ａ）および定量化（２Ｂ）を示す。図２Ｂにおいて、中黒の四角は、チャイルド・ピュー「Ｂ」を指し、中黒のひし形は、チャイルド・ピュー「Ｃ」を指す。図２Ａ～２Ｃは、ＨＮＦ４α翻訳後修飾剤のタンパク質の発現およびスピアマンの順位相関試験を示す。図２Ｃは、スピアマンの順位相関試験が示されており、核のＨＮＦ４αが、ｃＭＥＴ（ｒ＝０．７１；Ｐ＝０．０３７）、総ＡＫＴ（ｒ＝０．７１；Ｐ＝０．０３７）、ホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（ｒ＝０．８２；Ｐ＝０．０１１）、およびホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率（ｒ＝０．７３；Ｐ＝０．０３１）と有意に相関することを実証している。細胞質のＨＮＦ４αは、ｃＭＥＴ（ｒ＝－０．８０；Ｐ＝０．０１４）、総ＡＫＴ（ｒ＝－０．７３；Ｐ＝０．０３１）、ホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（ｒ＝－０．７７；Ｐ＝０．０２１、およびホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率（ｒ＝－０．７２；Ｐ＝０．０３７）との有意な相関を示した。図２Ｂの棒グラフは、平均±ＳＤとしてプロットされる。統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）。図３Ａ～３Ｄは、翻訳後修飾剤およびＨＮＦ４α細胞局在性の関係を示す。図３Ａは、パス解析が、ＨＮＦ４α局在と、ｃＭＥＴ（０．５６；Ｐ＝０．００４）、ホスホＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率（０．０５；Ｐ＝０．００６）および総ＨＮＦ４αレベル（０．６０；Ｐ＝０．０４２）との有意な直接的な関係を解明したことを示す。パス解析により、ｃＭＥＴと総ＨＮＦ４αとの間の負の有意な関係（－０．３７；Ｐ＝０．０２４）が明らかになった。図３Ｂは、線形回帰分析が、核のＨＮＦ４α発現と、肝機能障害の程度（チャイルド・ピュースコア）との有意な関係を示した（Ｒ^２＝０．８０、Ｐ＝０．００７）ことを描写する。図３Ａ～３Ｄは、翻訳後修飾剤およびＨＮＦ４α細胞局在性の関係を示す。図３Ｃは、主成分分析（ＰＣＡ）が、ＨＮＦ４α発現と相関するタンパク質プロファイルが正常ヒト肝細胞（ｎ＝２）の特徴を肯定的に説明する一方で、細胞質のＨＮＦ４α、活性カスパーゼ３、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）／総ＡＫＴの比率およびｐ－ＡＭＰＫ（Ｓｅｒ１７２）／ＡＭＰＫは、ＮＡＳＨ（ｎ＝４）の肝臓およびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変の肝臓（ｎ＝２）からの非代償性ヒト肝細胞の特徴を示したことを図示する。図３Ａ～３Ｄは、翻訳後修飾剤およびＨＮＦ４α細胞局在性の関係を示す。図３Ｄのグラフは、正常ヒト肝細胞と比べた、非代償性ヒト肝細胞（チャイルド・ピュー分類ＢおよびＣ）における、総ＨＮＦ４α、核内ＨＮＦ４α、または細胞質ＨＮＦ４α（上の列における３つのグラフ）、ｃＭＥＴ、ｐ－ＡＭＰＫ（Ｓｅｒ１７２）／ＡＭＰＫ、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）／総ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）／総ＡＫＴおよびホスホＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率、ｐ－Ｈ３（Ｓｅｒ１０）および活性カスパーゼ（２列目および下の列におけるグラフ）のＰＣＡ分析に使用されたタンパク質発現の変化倍率を示す。グラフは平均±ＳＤとしてプロットされる。統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）。図４Ａ～４Ｃは、核のＨＮＦ４αのアセチル化が、ＮＡＳＨの外植した肝臓およびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変の外植した肝臓からのヒト非代償性肝細胞において変更されることを示す。図４Ａおよび４Ｂは、非代償性ＮＡＳＨ（ｎ＝４）の外植した肝臓からのヒト肝細胞の核画分およびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変（ｎ＝４）の外植した肝臓からのヒト肝細胞の核画分におけるＨＮＦ４α（Ｌｙｓ１０６）のアセチル化形態のウェスタンブロットおよび定量化を示す（Ｐ＝０．０２４）。図４Ｃにおける線形回帰分析は、ＨＮＦ４α（Ｌｙｓ１０６）のアセチル化形態の低減と肝機能障害との有意な相関（Ｒ^２＝０．７１、Ｐ＝０．００４）を示す。棒グラフは、平均±ＳＤとしてプロットされる。統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）。図５は、ＨＮＦ４α－翻訳後修飾（ＰＴＭ）のインシリコ分析を示す。図５は、ＨＮＦ４α－ＰＴＭの一覧を提供する。図６Ａ～６Ｂは、活性化されたＡＫＴ経路と、ＮＡＳＨの外植した肝臓およびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変の外植した肝臓からのヒト非代償性肝細胞におけるＨＮＦ４α翻訳後修飾剤およびｐ－ＥＧＦＲ発現との関係を示す。図６Ａは、ホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／ＡＫＴに関するスピアマンの相関を示す。図６Ｂは、ホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）／ＡＫＴに関するスピアマンの相関を示す。図７Ａ～７Ｃは、免疫組織化学による、新たに単離した正常ヒト肝細胞のものと比較した、ｍＲＮＡレベル（図７Ａ）およびタンパク質レベル（図７Ｂ）での、アルコール性肝炎を有する患者の外植された肝臓から単離したヒト肝細胞における肝臓に豊富な転写因子であるＨＮＦ４αの発現レベルを示し、アルコール性肝炎の肝細胞の約４０％のみが、核において弱い強度でＨＮＦ４αを発現し、それらの細胞の約１０％が、ＨＮＦ４αの細胞質内の発現を有していたことを実証する。図７Ｃに関して、新たに単離したヒトアルコール肝炎肝細胞を、ＨＮＦ４αをコードするレンチウイルス（ＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＳ９７０Ｓ－１；ＣＤ５１１Ｂ－１中のＨＮＦ４α）で処理した。この図は、７２時間後、ＨＮＦ４α発現は、核でＨＮＦ４αを発現する肝細胞のパーセントを変化させなかったことを示す。しかしながら、ＨＮＦ４α発現強度は、既存の細胞で劇的に増加した。全体的にみると、このデータは、核へのＨＮＦ４α輸送が、アルコール性肝炎を有するヒトにおいて肝細胞が機能を回復するのに重要な役割を果たす可能性があることを示す。図８Ａ～８Ｆは、初代ヒト肝細胞におけるＭＴＦ１発現を示す。図８Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＭＴＦ１（ＭＡ５－２６７３８１：１０００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図８Ａ～８Ｆは、初代ヒト肝細胞におけるＭＴＦ１発現を示す。図８Ｂおよび８Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＨＮＦ４α（図８Ｂおよび８Ｃ）およびＭＴＦ１（図８Ｄおよび８Ｅ）の相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。ＨＮＦ４αおよびＭＴＦ１の発現は、子供Ｂ肝細胞と比較して、子供Ｃ肝細胞においてより低い。図８Ｂおよび８Ｄ、^＊ｐ＜０．００３、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝２５。図８ＣＲ^２＝０．０１９、ｐ＝０．０６、ｎ＝１９。図８ＥＲ^２＝０．０１５、ｐ＝０．１、ｎ＝１９。図８Ａ～８Ｆは、初代ヒト肝細胞におけるＭＴＦ１発現を示す。図８Ｆは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＭＴＦ１のタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す。ＨＮＦ４αのタンパク質発現は、ＭＴＦ１のタンパク質発現と相関する（Ｒ^２＝０．２８、ｐ＝０．００７、ｎ＝２５）。図９Ａ～９Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＮＲ０Ｂ２発現を示す。図９Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＮＲ０Ｂ２（ＡｂｃｌｏｎａｌＡ１８３６１：５００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図９Ａ～９Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＮＲ０Ｂ２発現を示す。図９Ｂおよび９Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＮＲ０Ｂ２の相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。図９Ｂ ^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝２５。図９ＣＲ^２＝０．１９、ｐ＝０．０６、ｎ＝１９。ＮＲ０Ｂ２の発現は、子供Ｃ、子供Ｂおよび対照肝細胞で異なる。図９Ａ～９Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＮＲ０Ｂ２発現を示す。図９Ｄは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＮＲ０Ｂ２のタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す（Ｒ^２＝０．１２、ｐ＝０．１、ｎ＝２５）。図１０Ａ～１０Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＮＲ５Ａ２発現を示す。図１０Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＮＲ５Ａ２（ＮｏｖｕｓＮＢＰ２－２７１９６１：５００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図１０Ａ～１０Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＮＲ５Ａ２発現を示す。図１０Ｂおよび１０Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＮＲ５Ａ２の相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。図１０Ｂ ^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２５。図１０ＣＲ^２＝０．１７、ｐ＝０．０７、ｎ＝１９。ＮＲ５Ａ２の発現は、子供Ｂおよび子供Ｃならびに対照肝細胞の間で異なる。図１０Ａ～１０Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＮＲ５Ａ２発現を示す。図１０Ｄは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＮＲ０Ｂ２のタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。ＮＲ５Ａ２のタンパク質発現は、ＨＮＦ４αの発現と相関する。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す（Ｒ^２＝０．１７、ｐ＜０．０５、ｎ＝２５）。図１１Ａ～１１Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＰｒｏｘ１発現を示す。図１１Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＰＲＯＸ１（Ｒ＆ＤＡＦ２７２７１：５００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図１１Ａ～１１Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＰｒｏｘ１発現を示す。図１１Ｂおよび１１Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＰＲＯＸ１の相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。図１１Ｂ ^＊ｐ＜０．０２、ｎ＝２５。図１１ＣＲ^２＝０．０２、ｐ＝０．６、ｎ＝１９。ＰＲＯＸ１の発現は、子供Ｃおよび対照肝細胞で異なる。図１１Ａ～１１Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＰｒｏｘ１発現を示す。図１１Ｄは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＰＲＯＸ１のタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す（Ｒ^２＝０．０２、ｐ＝０．４６、ｎ＝２５）。図１２Ａ～１２Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＰＯＭ１２１Ｃ発現を示す。図１２Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＰＯＭ１２１Ｃ（ＰＡ５－８５１６１１：５００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図１２Ａ～１２Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＰＯＭ１２１Ｃ発現を示す。図１２Ｂおよび１２Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＰＯＭ１２１Ｃの相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。図１２Ｂｎ＝２５。図１２ＣＲ^２＝０．０８、ｐ＝０．２４、ｎ＝２５。図１２Ａ～１２Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＰＯＭ１２１Ｃ発現を示す。図１２Ｄは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＰＯＭ１２１Ｃのタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す（Ｒ^２＝０．０６、ｐ＝０．２３、ｎ＝２５）。図１３Ａ～１３Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＳＲＥＢＰ１発現を示す。図１３Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＳＲＥＢＰ１（Ａｂｃａｍａｂ２８４８１１：５００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図１３Ａ～１３Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＳＲＥＢＰ１発現を示す。図１３Ｂおよび１３Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＳＲＥＢＰ１の相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。図１３Ｂｎ＝２５。図１３ＣＲ^２＝０．０２、ｐ＝０．５４、ｎ＝１９。図１３Ａ～１３Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＳＲＥＢＰ１発現を示す。図１３Ｄは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＳＲＥＢＰ１のタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す（Ｒ^２＝０．０１、ｐ＝０．８６、ｎ＝２５）。図１４Ａ～１４Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＥＰ３００発現を示す。図１４Ａは、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導性肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞を、ウェスタンブロットによって、ＥＰ３００（ＮｏｖｕｓＮＢ１００－６１６１：５００）およびＨＮＦ４α（ａｂ４１８９８１：１０００）の発現について分析したことを示す。図１４Ａ～１４Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＥＰ３００発現を示す。図１４Ｂおよび１４Ｃは、対照肝細胞、子供Ｂ肝細胞および子供Ｃ肝細胞間のＥＰ３００の相対強度を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定によって比較したことを示す。図１４Ｂｎ＝２５。図１４ＣＲ^２＝０．３２、ｐ＝０．０１、ｎ＝１９。図１４Ａ～１４Ｄは、初代ヒト肝細胞におけるＥＰ３００発現を示す。図１４Ｄは、チャイルド・ピュースコア、ＨＮＦ４αおよびＥＰ３００のタンパク質発現を用いた相関研究を、単純線形回帰を使用して実行したことを示す。黒丸は対照を指し、薄灰色の丸は子供Ｂを指し、濃い灰色の丸は子供Ｃを指す（Ｒ^２＝０．０１、ｐ＝０．６９、ｎ＝２５）。図１５ＡおよびＢは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＥＰ３００、ＭＴＦ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ５Ａ２、ＰＯＭ１２１Ｃ、ＰＲＯＸ１またはＳＲＥＢＰ１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトを実行し、細胞内ＨＮＦ４αの局在を免疫蛍光法で分析した（ａｂ４１８９８１：５００）ことを示す。ＤＡＰＩおよびＨＮＦ４α陽性の核（図１５Ａ）および細胞質におけるＨＮＦ４α陽性の細胞（図１５Ｂ）の総数を計数した。統計的分析を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定を使用して実行した。ＥＰ３００、ＭＴＦ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ５Ａ２、ＰＯＭ１２１Ｃ、ＰＲＯＸ１およびＳＲＥＢＰ１のノックアウトは、は、ＨＮＦ４αの核内局在の低減およびＨＮＦ４αの細胞質内局在の増加を示した。^＊ｐ＜０．０５。図１６は、肝移植を受けたＮＡＳＨを有する患者から単離した初代ヒト肝細胞を、ＡＡＶ－ＨＮＦ４αおよびＡＡＶ－ＭＴＦ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ５Ａ２、ＰＯＭ１２１Ｃ、ＰＲＯＸ１、ＳＲＥＢＰ１またはＧＦＰで、１０^５のＭＯＩで形質導入したことを示す。ＨＮＦ４α陽性の核のパーセンテージを計数した。統計的分析を、ブラウン・フォーサイスの一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のためのウェルチのＡＮＯＶＡ検定を使用して実行した。ＨＮＦ４α、ＭＴＦ１、ＮＲ０Ｂ２、ＰＯＭ１２１Ｃ、ＰＲＯＸ１およびＳＲＥＢＰ１での共形質導入は、ＧＦＰＨＮＦ４α共形質導入群と比較して、陽性核の数における増加をもたらす（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＜０．０００５、^＊＊ｐ＜０．００１、^＊ｐ＜０．０５）。

本明細書では、対象における肝細胞の核への転写因子ＨＮＦ４αの発現および／または輸送または保持を増加させることによって、対象における肝疾患を治療するための組成物および方法が開示されている。いくつかの実施形態では、この方法は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をアップレギュレートすること、ならびに／あるいは１つまたは複数の転写因子ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫ、ならびにその機能的断片の発現または機能をダウンレギュレートすることを含む。これらの転写因子がＨＮＦ４αの発現および／または局在をモジュレートし、したがって、肝疾患の治療に使用することができることは驚くべき発見である。

いくつかの実施形態では、この方法は、ベクターを投与することを含み、ベクターは、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃｅＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）を含む。いくつかの態様では、この方法は、ＨＮＦ４α（例えば、ＨＮＦ４αアイソフォーム２）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃｅＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含むベクターを投与することを含む。他の実施形態またはさらなる実施形態では、この方法は、組成物を投与することを含み、組成物は、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する。他の実施形態では、この方法は、Ｌｙｓ１０６でのＨＮＦ４αのアセチル化を増加させること、ｃＭＥＴの発現を増加させること、および／またはＴｈｒ３０８でのリン酸化を介したＡＫＴの活性化を増加させること含む。本明細書に開示されている方法は、肝細胞の核のＨＮＦ４αの量を驚くほど増加させることを示している。ＨＮＦ４αのそのような操作は、肝疾患を有する患者における肝細胞の機能を改善する。

本出願を通して使用されている用語は、当業者にとって通常で典型的な意味で解釈されるものとする。しかし、出願人は、次の用語に以下のような特定の定義を付与することを望む。

用語
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形の言及を含む。例えば、「細胞」という用語には、それらの混合物を含む、複数の細胞が含まれる。

例えば量、パーセンテージなどの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」という用語は、測定可能な値から±２０％、±１０％、±５％、または±１％の変動を包含することを意味する。

対象への「投与」または「投与する」には、対象に薬剤を導入するまたは送達する任意の経路が含まれる。投与は、静脈内、腹腔内などを含む、任意の適切な経路によって実施することができる。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。

本明細書で使用される場合の「含む（comprising）」という用語およびその変化形には、「含む（including）」という用語およびその変化形と同義的に使用され、オープンで非限定的な用語である。本明細書では、様々な実施形態を説明するために「含む（comprising）」および「含む（including）」という用語を使用してきたが、「から本質的になる（consisting essentially of）」および「からなる（consisting of）」という用語を「含む（comprising）」および「含む（including）」の代わりに使用し、より具体的な実施形態を提供することができ、開示もされている。

「組成物」とは、有益な生物学的効果を有する任意の薬剤を指す。有益な生物学的効果には、治療効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態の治療と、予防効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態（例えば、肝疾患）の予防の両方が含まれる。この用語はまた、限定するものではないが、ベクター、ポリヌクレオチド、細胞、塩、エステル、アミド、プロエージェント（proagent）、活性代謝物、異性体、断片、類似体などを含む、本明細書で詳しく言及されている有益な薬剤の薬学的に許容される薬理学的に活性のある誘導体も包含する。次に、「組成物」という用語が使用される場合、または特定の組成物が詳しく特定される場合、その用語には、組成物それ自体、ならびに薬学的に許容される薬理学的に活性のあるベクター、ポリヌクレオチド、塩、エステル、アミド、プロエージェント、コンジュゲート、活性代謝物、異性体、断片、類似体などが含まれるものと理解されたい。いくつかの態様では、本明細書に開示されている組成物はベクターを含み、ベクターは、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されている組成物は、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する核酸を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されている組成物はベクターを含み、ベクターは、ＨＮＦαをコードする核酸を含む。

「有効量」は、限定するものではないが、病状または障害（例えば、肝疾患）の症状または徴候を改善、逆転、軽減、予防、または診断することができる量を包含する。別段の指示がない限り、明示的にまたは文脈によって、「有効量」は状態を改善するのに十分な最小量に限定されない。疾患または障害の重症度、ならびに疾患または障害を予防、治療、または軽減する治療の能力は、何ら限定を意味することなく、バイオマーカーによって、または臨床パラメーターによって測定することができる。「ベクターの有効量」または「組成物の有効量」という用語は、肝疾患の軽減または肝機能の回復をいくらか引き起こすのに十分なベクターまたは組成物の量を指す。

「断片」は、他の配列に結合しているか否かにかかわらず、断片の活性が非修飾ペプチドまたはタンパク質と比較して有意に変化しないか、または損なわれない限り、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含むことができる。これらの修飾は、例えば、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去または付加すること、その生体の寿命延長（bio-longevity）を高めること、その分泌特性を変更することなど、いくつかの追加の特性を提供することができる。いずれの場合にも、断片は、標的遺伝子の転写を調節するなどの生物活性特性を有することが必要である。

「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、コード配列もしくは制御配列、またはその断片を指す。遺伝子は、コード配列および制御配列の任意の組合せ、またはその断片を含んでいてもよい。したがって、本明細書で言及される場合の「遺伝子」は、天然遺伝子の全部または一部であり得る。本明細書で言及される場合のポリヌクレオチド配列は、「遺伝子」という用語と交換可能に使用され得るか、または任意のコード配列、非コード配列もしくは制御配列、その断片、およびそれらの組合せを含み得る。「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、例えば、コード配列の上流の制御配列（例えば、リボソーム結合部位）を含む。

本明細書で使用される場合の「肝疾患」は、一般に、肝臓に影響を及ぼす疾患、障害、および状態を指し、例えば、肝細胞における脂肪の単純な蓄積（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、アルコール関連肝疾患（限定するものではないが、脂肪性肝、アルコール性肝炎、アルコール関連肝硬変を含む）、大滴性脂肪変性（macrovesicular steatosis）、門脈周囲および小葉の炎症（脂肪性肝炎）、肝硬変、線維症、肝虚血、肝細胞がんを含む肝がん、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、特発性肝疾患、末期肝疾患、ならびに肝不全を包含する広範囲の重症度を有し得る。「肝硬変」は、本明細書では、肝臓組織の線維性肥厚および／または再生結節を特徴とする肝臓の慢性疾患として定義される。「肝硬変」の程度または重症度は、チャイルド・ピュースコア（Child-Pugh score）によって指定することができ、その分類では、５種の臨床項目である総ビリルビン、血清アルブミン、プロトロンビン時間延長、腹水、および肝性脳症のレベルが、各臨床項目の様々なレベルに対応して１点、２点、および３点の値の点数方式を使用して点数化され、各項目の最も重度には３点の値が割り当てられる。５種のすべての項目の合計点数を加算することにより、チャイルド・ピュースコアおよび分類（Child-Pugh score and classification）に到達する。５～６点はチャイルド・ピューのクラスＡに指定し、７～９点はチャイルド・ピューのクラスＢに指定し、１０～１５点はチャイルド・ピューのクラスＣに指定する。一般に、チャイルド・ピューのクラスＡは最も低い重症度の肝疾患を示し、チャイルド・ピューのクラスＣは最も高い重症度の肝疾患を示す。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、チャイルド・ピューのクラスＢ肝疾患またはチャイルド・ピューのクラスＣ肝疾患を有する対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、チャイルド・ピューのクラスＡ肝疾患を有する対象を治療するために使用することができる。様々な態様では、この方法は、対象のチャイルド・ピュースコアを改善する。いくつかの実施形態では、肝疾患はアルコール性肝炎である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、虚血性ドナー肝臓をｅｘｖｉｖｏ灌流で治療するために使用することができる。本発明は、肝切除前または肝切除後を含む、がん治療前またはがん治療後の肝がんを治療するために使用することができる。

本明細書で使用される場合の「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）から構成されるポリマーを意味する。本明細書で使用される場合の「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。本明細書で使用される場合の「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。

「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーから構成される一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを指す。

「ポリペプチド」という用語は、Ｄ－アミノ酸もしくはＬ－アミノ酸の一本鎖、またはペプチド結合によって結合されているＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸との混合物から構成される化合物を指す。

「プロモーター」または「制御エレメント」という用語は、転写の開始から上流または下流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始するための他のタンパク質の認識および結合に関与する領域または配列決定因子を指す。プロモーターは細菌起源である必要はなく、例えば、ウイルスまたは他の生物に由来するプロモーターが本明細書に記載の組成物、システム、または方法において使用され得る。

「薬学的に許容される担体」（「担体」と呼ばれることもある）は、一般に安全で無毒な医薬組成物または治療用組成物を調製するのに有用な担体または賦形剤を意味し、動物用および／またはヒト用の医薬または治療上の使用に許容される担体を含む。「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、限定するものではないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水もしくは水／油エマルジョン）および／または様々なタイプの湿潤剤を含み得る。

本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定化剤、または医薬製剤において使用するための当技術分野で周知の他の材料を包含する。組成物で使用するための担体の選択は、その組成物の意図した投与経路によって決まる。これらの材料を含む薬学的に許容される担体および製剤の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, ed. University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005に記載されている。生理学的に許容される担体の例には、生理食塩水、グリセロール、ＤＭＳＯ、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの緩衝液、および他の有機酸を含む緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／あるいは非イオン界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ；ＦｌｏｒｈａｍＰａｒｋ，ＮＪ）が含まれる。所望の治療処置をするためのそのような用量の投与を提供するために、本明細書に開示されている組成物は、有利には、担体または希釈剤を含む組成物全体の重量に基づいて、１つまたは複数の対象化合物の総量を約０．１重量％～９９重量％で含むことができる。

「対象」という用語は、本明細書では、限定するものではないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む、哺乳動物などの動物を含むように定義される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で使用される「転写因子」という用語は、ＤＮＡをＲＮＡに転写するプロセスに関与するタンパク質を指す。典型的には、転写因子は、特定の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー領域に結合するドメインを有する。転写因子はまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはいくつかの他の転写因子と相互作用するドメインを有し、そのような相互作用により、結果的にＤＮＡから転写されるＲＮＡの量を調節することができる。転写因子は細胞質に存在し、活性化の際に核に移動することができる。

本明細書で使用される場合の「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、「治療」という用語、およびそれらの文法的な変化形は、障害もしくは状態の１つもしくは複数の付随症状の強さを部分的もしくは完全に遅延、緩和、軽減もしくは低減すること、および／または障害もしくは状態の１つもしくは複数の原因を緩和、軽減、または阻害することを含む。本発明による治療は、予防的、防止的（prophylactically）、軽減的または治療的に施すことができる。治療は、発症前（例えば、肝疾患の明らかな兆候の前）、初期発症中（例えば、肝疾患の最初の徴候および症状の際）、肝疾患の発症が樹立された後、または終末期肝不全の段階で対象に施される。防止的施術は、肝疾患の症状が現れる数日前から数年前にわたり行われ得る。

いくつかの場合では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、「治療」という用語、およびそれらの文法的な変化形は、対象の治療前と比較して、または一般集団もしくは研究集団におけるそのような症状の発生率と比較して、対象における肝疾患を軽減すること、肝機能を回復させること、および／または肝細胞の核のＨＮＦαの量を増加させることを含む。

本明細書で使用される場合の「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。あるいは、ベクターはまた、前述の核酸配列を含むビヒクルであってもよい。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター（単離された、弱毒化された、組換えの、ウイルス粒子としてカプセル化されたもの、など）、リポソーム、エキソソーム、細胞外小胞、微粒子および／またはナノ粒子であり得る。ベクターは、二本鎖または一本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは二本鎖および／または一本鎖のヌクレオチドを含むハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列をパッケージングすることを担うウイルスパッケージング配列である核酸配列を含むウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターはエキソソームである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、ベクターは、天然のおよび／または操作されたキャプシドを有するウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、制御配列に作動可能に連結された核酸配列を含むウイルス粒子を含み、その核酸配列は、１つまたは複数のＡＡＶウイルス粒子ポリペプチドまたはその断片を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸またはポリペプチドを含むナノ粒子である。様々な実施形態では、ベクターは脂質ベースのナノ粒子である。

組成物
上記のように、本明細書では、転写因子であるＨＮＦ４αの、対象における肝細胞の核への発現および／または輸送および／または保持を増加させることによって、肝疾患を治療する方法が開示されている。いくつかの実施形態では、この方法は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をアップレギュレートすること、ならびに／あるいはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をダウンレギュレートすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞（例えば、肝細胞）の内側で、好ましくは細胞の核の内側で、任意選択で、内因性ＨＮＦαの発現を増加させることによって、または外因性ＨＮＦαを導入することによって、ＨＮＦ４αの発現または機能をアップレギュレートすることをさらに含む。本明細書では、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃのアップレギュレーションならびに／あるいはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫのダウンレギュレーションが肝細胞の核のＨＮＦ４αのレベルを増加させ、肝機能の回復および肝疾患の軽減をもたらすことが記載されている。他の実施形態では、この方法は、Ｌｙｓ１０６でのＨＮＦ４αのアセチル化を増加させること、ｃＭＥＴの発現を増加させること、および／またはＴｈｒ３０８でのリン酸化を介したＡＫＴの活性化を増加させることを含む。これらの方法は、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４９２０９号明細書に記載されている方法と組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態では、この方法は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子とともに、ＨＮＦ４αの発現または機能をアップレギュレートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４αおよびＰＲＯＸ１の発現または機能をアップレギュレートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＮＦ４αおよびＳＲＥＢＰ１の発現または機能をアップレギュレートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＮＦ４α、ＰＲＯＸ１、およびＳＲＥＢＰ１の発現または機能をアップレギュレートすることをさらに含む。

したがって、本明細書には、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能を増加させ、ならびに／あるいはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能を減少させる組成物が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子とともに、ＨＮＦ４αの発現または機能をアップレギュレートする。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４αおよびＰＲＯＸ１の発現または機能をアップレギュレートする。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４αおよびＳＲＥＢＰ１の発現または機能をアップレギュレートする。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４α、ＰＲＯＸ１、およびＳＲＥＢＰ１の発現または機能をアップレギュレートする。

本明細書では、ベクターを含む組成物であって、ベクターが、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、および／またはＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をコードする核酸を含む、組成物が開示されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＰＲＯＸ１またはその機能的断片をコードする核酸を含む。他の実施形態では、ベクターは、ＮＲ５Ａ２またはその機能的断片をコードする核酸を含む。他の実施形態では、ベクターは、ＮＲ０Ｂ２またはその機能的断片をコードする核酸を含む。他の実施形態では、ベクターは、ＭＴＦ１またはその機能的断片をコードする核酸を含む。他の実施形態では、ベクターは、ＳＲＥＢＰ１またはその機能的断片をコードする核酸を含む。他の実施形態では、ベクターは、ＥＰ３００またはその機能的断片をコードする核酸を含む。他の実施形態では、ベクターは、ＰＯＭ１２１Ｃまたはその機能的断片をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＰＲＯＸ１およびＳＲＥＢＰ１をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４α、ＰＲＯＸ１、およびＳＲＥＢＰ１をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４αおよびＰＲＯＸ１をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４αおよびＳＲＥＢＰ１をコードする核酸を含む。

ＨＮＦ４αは肝臓の他に、腎臓、小腸、結腸、および膵臓においても高度に発現しており、そこでまた重要な役割を担っている。ＨＮＦ４α遺伝子の多型変異は、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、クローン病、および炎症性腸症候群を含む、広範囲の疾患に関連している。選択的スプライシングと組み合わせたＰ１またはＰ２プロモーターからの転写は、１２種の異なる転写産物を生成することができる。相対的なアイソフォーム発現は組織依存的である。１２種のアイソフォームは、転写の活性化および抑制をそれぞれ担っている、Ｎ末端およびＣ末端でのみ異なっている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ko et al., Cell Rep. 2019 Mar 5; 26(10):2549-2557.e3を参照）。各アイソフォームが組織依存的に遺伝子の特定のサブセットを制御する別個の機能を果たしていることは、次第に認識されてきている。例えば、報告によれば、ＨＮＦ４αアイソフォーム２は肝臓に豊富に存在し、腫瘍抑制因子として作用し、その喪失は本出願に記載されているように肝細胞がんまたは肝不全に関連しているが、ＨＮＦ４αアイソフォーム８は結腸で高度に発現され、増殖促進遺伝子の発現を調節する。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、ＨＮＦ４αアイソフォーム２ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αアイソフォーム２ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、もしくは約９８％同一の配列またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、その核酸は、配列番号３１と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％同一であるか、またはその断片である。いくつかの態様では、ＨＮＦ４αアイソフォーム２ポリペプチドはプロモーター１（Ｐ１）駆動され、言い換えれば、その発現はＨＮＦ４αのＰ１プロモーターによって駆動される。これは、本明細書ではＨＮＦ４αアイソフォーム２（Ｐ１）と呼ばれる。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αアイソフォーム２ポリヌクレオチドまたは核酸は、Ｐ１プロモーターに作動可能に連結されている。

ベクターは、発現可能な遺伝子の複製を調節する制御核酸配列を含む核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸に作動可能に連結されたプロモーター（例えば、転写因子をコードするポリヌクレオチド）を含むベクターは、人為的操作による結果として（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)またはCurrent Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載されている方法によって）、第２の核酸（例えば、転写因子をコードするポリヌクレオチド）に対して異種であるプロモーターを含むことができる。本明細書に記載されているいずれかの態様のベクターは、上記の転写因子のうちの１つまたは複数に作動可能に連結され得る、プロモーター、エンハンサー、抗生物質耐性遺伝子、および／または開始点をさらに含むことができることを本明細書において理解されたい。

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。本明細書に開示されている場合の「ウイルスベクター」は、ビヒクルに関して、ウイルス、ウイルス様粒子、ビリオン、ウイルス粒子、またはシュードタイプウイルスにおける核酸配列のパッケージングを指示する核酸配列を含む任意のウイルス、ウイルス様粒子、ビリオン、ウイルス粒子、またはシュードタイプウイルスを意味する。いくつかの実施形態では、ウイルス、ウイルス様粒子、ビリオン、ウイルス粒子、またはシュードタイプウイルスは、ベクター（例えば、核酸ベクター）を宿主細胞内に、および／または宿主細胞間で移送することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス、ウイルス様粒子、ビリオン、ウイルス粒子、またはシュードタイプウイルスは、ベクター（例えば、核酸ベクター）を、対象の肝臓の肝細胞などの標的細胞内に、および／または標的細胞間で移送することができる。重要なことには、いくつかの実施形態では、ウイルス、ウイルス様粒子、ビリオン、ウイルス粒子、またはシュードタイプウイルスは、標的細胞（例えば、肝細胞）の核に輸送することができる。「ウイルスベクター」という用語はまた、あらゆる目的のために参照により本書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００５７８３９号明細書中により完全に記載されているそれらの形態を指すことを意味する。適切なウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスおよびレトロウイルス、パルボウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。

複製欠損アデノウイルスの構築は開示されている（Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987)；Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986)；Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986)；Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987) ；Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)）。これらのウイルスをベクターとして使用する利点は、最初に感染した細胞内では複製はできるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することはできないため、他の細胞種に広がる可能性のある範囲が制限されることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質部および他の多くの組織部位に直接ｉｎｖｉｖｏ送達した後に、高効率の遺伝子導入が達成されることが示されている（Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993)；Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993)；Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993)；Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993)；La Salle, Science 259:988-990 (1993)；Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992)；Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993)；Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994)；Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993)；Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)；Zabner, Cell 75:207-216 (1993)；Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993)；およびRagot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)）。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合することによって遺伝子導入を達成し、その後、ウイルスは、野生型または複製欠損型アデノウイルスと同様に、受容体介在性エンドサイトーシスによって内在化される（Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970)；Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973)；Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985)；Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984)；Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984)；Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991)；Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)）。

別の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものである。この欠損型パルボウイルスは、多くの細胞種に感染でき、ヒトには非病原性である。ＡＡＶ型ベクターは約４～５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは１９番染色体に安定的に挿入することが知られている。ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）またはその修飾は、感染性と部位特異的組込みを付与するが、細胞毒性はなく、プロモーターは細胞特異的発現を指示する。ＡＡＶベクターに関連する資料としての米国特許第６，２６１，８３４号明細書は、参照により本明細書に組み込まれる。肝細胞にｉｎｖｉｖｏで形質導入するためにＡＡＶベクターを使用する方法は、当技術分野では公知である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，９８１，０４８号明細書を参照されたい。

ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターは、カチオン性両親媒性物質、例えば、カチオン性脂質、ポリＬ－リジン（ＰＬＬ）、およびジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＬＡＥ－デキストラン）などと複合体を形成することができ、標的細胞へのウイルス感染の効率が向上する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、１９９７年１１月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４９６号を参照されたい）。ＡＡＶベクター、例えば、その開示が本明細書に組み込まれる、Zhong et al., J. Genet Syndr Gene Therapy 2012 Jan. 10; S1. pii: 008、米国特許第５，１３９，９４１号明細書、同第５，２５２，４７９号明細書および同第５，７５３，５００号明細書、ならびにＰＣＴ出願公開の国際公開第９７／０９４４１号パンフレットに開示されているようなＡＡＶベクターはまた、これらのベクターが宿主染色体に組み込まれて、ベクターを繰り返し投与する必要性が最小限となるため、有用である。遺伝子治療におけるウイルスベクターの概説については、McConnell et al., 2004, Hum Gene Ther. 15(11):1022-33；Mccarty et al., 2004, Annu Rev Genet. 38:819-45；Mah et al., 2002, Clin. Pharmacokinet. 41(12):901-11；Scott et al., 2002, Neuromuscul. Disord. 12(Suppl 1):S23-9を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ベクターはナノ粒子である。本明細書で使用されるナノ粒子は、核酸を送達するのに有用な任意のナノ粒子であり得る。本明細書で使用される場合の「ナノ粒子」という用語は、十分な数のナノ粒子が適用部位または治療部位への送達後に実質的に無傷のままであるように、そのような使用の環境による化学的および／または物理的破壊と生体適合性があって、十分に耐性があり、そのサイズがナノメートル範囲である、粒子または構造物を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質様ナノ粒子を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１８７５３１号パンフレット、国際公開第２０１７／１７６９７４号パンフレット、国際公開第２０１９／０２７９９９号パンフレット、またはLi, B et al., An Orthogonal array optimization of lipid-like nanoparticles for mRNA delivery in vivo. Nano Lett. 2015, 15, 8099-8107を参照されたい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質二重層またはリポソームを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子である。

いくつかの実施形態では、開示したナノ粒子は、生物学的実体、例えば、標的細胞上の特定の膜成分または細胞表面受容体（例えば、肝細胞への送達を促進する受容体もしくは肝細胞上の受容体）に効率的に結合され得るか、さもなければそれと会合し得る。例えば、開示したナノ粒子は、正常な肝細胞または罹患した肝細胞で発現される受容体（例えば、肝アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）もしくは低密度リポタンパク質（ＬＤＬＲ）受容体）に結合するリガンドを含むように操作することができる。

いくつかの態様では、本明細書に開示されているナノ粒子は、肝細胞への核酸の送達を促進する補足成分を含み得る。ナノ粒子は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５Ａ２－ＳＣ８、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および／または１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５Ａ２－ＳＣ８、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））をさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の５Ａ２－ＳＣ８、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））のモル比は、約１５／１５／３０／３である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））のモル比は、約５０／１０／３８．５／１．５である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））のモル比は、約３５／１６／４６．５／２．５である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているナノ粒子は、５Ａ２－ＳＣ８、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール－メトキシ（ポリ（エチレングリコール））、および１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。ナノ粒子は、約０．１％～約３０％ｍｏｌ／ｍｏｌのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。例えば、ナノ粒子中に存在するＤＯＴＡＰの量は、そのナノ粒子の約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約０．７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約０．８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約０．９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約３．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約４．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約５．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約６．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約７．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約８．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約９．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１０．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１１．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１２．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１３．５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、約３０％ｍｏｌ／ｍｏｌであり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子中に存在するＤＯＴＡＰの量は、そのナノ粒子の約２０％ｍｏｌ／ｍｏｌである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている肝臓特異的送達のためのナノ粒子および方法は、当技術分野において、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Cheng et al., Nat Nanotechnol. 2020 Apr; 15(4):313-320. Epub 2020 Apr 6；Trepotec et al., Mol Ther. 2019 Apr 10; 27(4):794-802. Epub 2018 Dec 22；Truong, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2019 Oct 15; 116(42):21150-21159. Epub 2019 Sep 9で記載されているものである。

さらなる実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、ポリ（アミド－アミン）、ポリ－ベータアミノ－エステル（ＰＢＡＥ）、および／またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはポリアクリジンＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、外側のＰＥＧシェルとナノ粒子ベースのコアを含む。

脂質ベースのナノ粒子は、治療用ペイロードを肝臓に正常に送達する。例えば、Witzigmann et al., Adv Drug Deliv Rev. 2020 Jul, doi: 10.1016/j.addr.2020.06.026を参照されたい。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から調製することができる。しかし、リン脂質が、薬物担体として脂質ベースのナノ粒子を生成するのに最も一般的に使用される。本発明において使用するための脂質粒子は、リポソーム形成脂質およびリン脂質、ならびに膜活性ステロール（例えば、コレステロール）を含むように調製することができる。リポソームは、リポソーム形成脂質ではない他の脂質およびリン脂質を含むことができる。

リン脂質は、例えば、レシチン（例えば、卵レシチンまたは大豆レシチン）；ホスファチジルコリン（例えば、卵ホスファチジルコリン）；水素化ホスファチジルコリン；リゾホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン；ジステアロイルホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールホスフェート、ホスファチジルイノシトールビスホスフェートおよびホスファチジルイノシトールトリホスフェート）；スフィンゴミエリン；カルジオリピン；ホスファチジン酸；プラズマローゲン；またはそれらの混合物から選択することができる。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表している。使用され得る他の脂質の例には、糖脂質（例えば、グリセロ糖脂質、例えば、ガラクト脂質およびスルホ脂質、スフィンゴ糖脂質、例えば、セレブロシド、グルコセレブロシドおよびガラクトセレブロシド、ならびにグリコシルホスファチジルイノシトール）；リン脂質（例えば、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミンおよびセラミドホスホリルグリセロール）；またはそれらの混合物が含まれる。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表している。負または正に帯電した脂質ナノ粒子は、例えば、アニオン性またはカチオン性のリン脂質または脂質を使用することによって得ることができる。そのようなアニオン性／カチオン性のリン脂質または脂質は、典型的には、ステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、その脂質は全体的に正味の負電荷／正電荷を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているナノ粒子は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の生体適合性および／または生分解性ポリマーを含む。例えば、考えられるナノ粒子は、生分解性ポリマーおよびポリエチレングリコールを含む１つまたは複数のブロックコポリマーを約１０～約９９重量パーセントと、生分解性ホモポリマーを約０～約５０重量パーセントを含み得る。ポリマーには、例えば、生体安定性ポリマーおよび生分解性ポリマーの両方が含まれ、例えば、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）などのポリアルキレンオキシド、ポリ無水物、ポリ（エステル無水物）、ポリヒドロキシ酸、例えばポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）およびそれらのコポリマー、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）およびそれらのコポリマー、ポリカプロラクトンおよびそれらのコポリマー、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１ｎｍ～約１０００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、例えば、約１０００ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約２９０ｎｍ、約２８０ｎｍ、約２７０ｎｍ、約２６０ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２４０ｎｍ、約２３０ｎｍ、約２２０ｎｍ、約２１０ｎｍ、約２００ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１００ｎｍ、約９０ｎｍ、約８０ｎｍ、約７０ｎｍ、約６０ｎｍ、約５０ｎｍ、約４０ｎｍ、約３０ｎｍ、約２０ｎｍ、または約１０ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、例えば、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約８００ｎｍ、約２０ｎｍ～約７００ｎｍ、約３０ｎｍ～約６００ｎｍ、約３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４０ｎｍ～約４００ｎｍ、約４０ｎｍ～約３００ｎｍ、約４０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１１０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１２０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１２０ｎｍ、１００ｎｍ～約１４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１１０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約１１０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１９５ｎｍ、約１１０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約１２０ｎｍ～約１８５ｎｍ、約１３０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約１４０ｎｍ～約１７５ｎｍ、１５０ｎｍ～１７５ｎｍ、または約１５０ｎｍ～約１７０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１５０ｎｍ～約１７５ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１３５ｎｍ～約１７５ｎｍの直径を有する。粒子は任意の形状を有し得るが、一般的には球状である。

いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるベクターはエキソソームである。本明細書で使用される場合の「微小胞」および「エキソソーム」という用語は、約１０ｎｍ～約５０００ｎｍ、より典型的には３０ｎｍ～１０００ｎｍ、最も典型的には約５０ｎｍ～７５０ｎｍの直径（または粒子が球状ではない場合には最大の寸法）を有する膜状粒子を指し、ここで、エキソソームの膜の少なくとも一部は、細胞から直接得られるものである。最も一般的には、エキソソームは、ドナー細胞の５％以下の大きさ（平均直径）を有する。したがって、特に考えられるエキソソームには、細胞から排出されるものが含まれる。エキソソームを作製する方法は、当技術分野では公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０１７７７２７号明細書を参照されたい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するためのエキソソームおよびその使用は、当技術分野で公知である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，５７７，６３０号明細書を参照されたい。

本明細書にはまた、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）を介して、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能を増加させる組成物も含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、この組成物は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃの１つまたは複数を活性化するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。

「ＨＮＦ４α」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＨＮＦ４Ａ遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：５０２４、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：３１７２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０１０７６、ＯＭＩＭ：６００２８１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４１２３５。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αポリペプチドは、配列番号１の配列（ＨＮＦ４αアイソフォーム２）、または配列番号１と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号１の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号１のＨＮＦ４αポリペプチドは、成熟ＨＮＦ４αの未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号１のＨＮＦ４αポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αポリペプチドは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４９２０９号明細書に記載されているものである。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αポリヌクレオチドは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４の配列、または配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＰＲＯＸ１（プロスペロ関連ホメオボックス１）は、通常、肝臓器官形成中のマウスの内胚葉細胞で胚８．５日目（Ｅ８．５）に初めて発現される。成人の肝臓では、ＰＲＯＸ１の役割は、肝細胞のエネルギー代謝を制御することであり得る。さらに重要なことには、Ｐｒｏｘ１は、そのホメオドメインを特定のＤＮＡエレメントに直接結合することによって、遺伝子転写の活性化因子として機能し得ることが報告されている。「ＰＲＯＸ１」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＰＲＯＸ１遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＰＲＯＸ１ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：９４５９、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：５６２９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１７７０７、ＯＭＩＭ：６０１５４６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９２７８６。いくつかの実施形態では、ＰＲＯＸ１ポリペプチドは、配列番号２の配列、または配列番号２と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号２の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号２のＰＲＯＸ１ポリペプチドは、成熟ＰＲＯＸ１の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号２のＰＲＯＸ１ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＲＯＸ１ポリヌクレオチドは、配列番号１３の配列、または配列番号１３と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号１３の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＮＲ５Ａ２（核内受容体５Ａ２；肝臓受容体ホモログ－１；ＬＲＨ－１）は、その標的遺伝子のプロモーターおよび制御領域内の特定の応答エレメントに単量体として結合する核内受容体である。ＮＲ５Ａ２はまた、胆汁酸生成酵素、脂肪酸代謝、およびミトコンドリア機能をコードする遺伝子を正に制御することができる。「ＮＲ５Ａ２」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＮＲ５Ａ２遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＮＲ５Ａ２ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：７９８４、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２４９４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１６８３３、ＯＭＩＭ：６０４４５３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ００４８２。いくつかの実施形態では、ＮＲ５Ａ２ポリペプチドは、配列番号３の配列、または配列番号３と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号３の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号３のＮＲ５Ａ２ポリペプチドは、成熟ＮＲ５Ａ２の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号３のＮＲ５Ａ２ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＮＲ５Ａ２ポリヌクレオチドは、配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１６の配列、または配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１６と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１６の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＮＲ０Ｂ２（核内受容体スモールヘテロダイマーパートナー；ＳＨＰ）は、通常、正常な肝細胞で高度に発現されており、胆汁酸、グルコース、脂質代謝の重要な転写制御因子として作用する。ＮＲ０Ｂ２のＳＵＭＯ化は、核輸送と、胆汁酸のホメオスタシスの維持および肝毒性からの保護に重要な胆汁酸生合成のフィードバック阻害におけるＳＨＰの遺伝子抑制機能に必要となり得る（Kim DH et al., 2016）。「ＮＲ０Ｂ２」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＮＲ０Ｂ２遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＮＲ０Ｂ２ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：７９６１、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８４３１、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３１９１０、ＯＭＩＭ：６０４６３０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５４６６。いくつかの実施形態では、ＮＲ０Ｂ２ポリペプチドは、配列番号４の配列、または配列番号４と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号４の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号４のＮＲ０Ｂ２ポリペプチドは、成熟ＮＲ０Ｂ２の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号４のＮＲ０Ｂ２ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＮＲ０Ｂ２ポリヌクレオチドは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号１７の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＭＴＦ１（金属応答性転写因子１）は、メタロチオネイン遺伝子の基礎転写および重金属誘導転写の両方を媒介でき、細胞ストレス応答および金属恒常性に関与する他の遺伝子を制御することもできる。ＭＴＦ１はまた、他の金属応答性遺伝子、例えば、亜鉛トランスポーター１の転写制御にも関与し得る。ＭＴＦ１は、肝細胞において亜鉛のレベルを制御することができる。「ＭＴＦ１」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＭＴＦ１遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＭＴＦ１ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：７４２８、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：４５２０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８７８６、ＯＭＩＭ：６００１７２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４８７２。いくつかの実施形態では、ＭＴＦ１ポリペプチドは、配列番号５の配列、または配列番号５と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号５の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号５のＭＴＦ１ポリペプチドは、成熟ＭＴＦ１の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号５のＭＴＦ１ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＭＴＦ１ポリヌクレオチドは、配列番号１８の配列、または配列番号１８と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号１８の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＳＲＥＢＰ１（ステロール制御因子エレメント結合タンパク質１）は、コレステロール、脂肪酸、およびトリグリセリドの生合成に関与する転写因子である。ＳＲＥＢＰ１は、ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の発現および活性を制御することができ、またその逆も可能である（Shi Q et al., 2016；Porstmann T et al., 2008）。「ＳＲＥＢＦ１」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＳＲＥＢＦ１遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＳＲＥＢＦ１ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：１１２８９、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：６７２０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００７２３１０、ＯＭＩＭ：１８４７５６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３６９５６。いくつかの実施形態では、ＳＲＥＢＦ１ポリペプチドは、配列番号６の配列、または配列番号６と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号６の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号６のＭＴＦ１ポリペプチドは、成熟ＳＲＥＢＦ１の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号６のＳＲＥＢＦ１ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＳＲＥＢＰ１ポリヌクレオチドは、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１の配列、または配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＥＰ３００（ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）ＥＰ３００は、Ｃ／ＥＢＰタンパク質と複合体を形成し、脂肪肝の発症時のトリグリセリド合成、グルコース代謝、および肝臓において高度に発現されるいくつかの転写因子、例えばＦｏｘｏ１およびファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の制御に関与する遺伝子のプロモーターを活性化することができる。「ＥＰ３００」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＥＰ３００遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＥＰ３００ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：３３７３、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２０３３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１００３９３、ＯＭＩＭ：６０２７００、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０９４７２。いくつかの実施形態では、ＥＰ３００ポリペプチドは、配列番号７の配列、または配列番号７と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号７の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号７のＥＰ３００ポリペプチドは、成熟ＥＰ３００の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号７のＥＰ３００ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＥＰ３００ポリヌクレオチドは、配列番号２２もしくは配列番号２３の配列、または配列番号２２もしくは配列番号２３と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号２２もしくは配列番号２３の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＰＯＭ１２１Ｃ（核膜孔膜タンパク質ＰＯＭ１２１）は、核膜孔の生合成に関与すると考えられている、孔膜タンパク質と呼ばれるタンパク質群のメンバーである膜タンパク質である。「ＰＯＭ１２１Ｃ」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＰＯＭ１２１Ｃ遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＰＯＭ１２１Ｃポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：３４００５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：１００１０１２６７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２７２３９１、ＯＭＩＭ：６１５７５４、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ８ＣＧ３４。いくつかの実施形態では、ＰＯＭ１２１Ｃポリペプチドは、配列番号８の配列、または配列番号８と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号８の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号８のＰＯＭ１２１Ｃポリペプチドは、成熟ＰＯＭ１２１Ｃの未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号８のＰＯＭ１２１Ｃポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＯＭ１２１Ｃポリヌクレオチドは、配列番号２４の配列、または配列番号２４と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号２４の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

本明細書ではまた、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する組成物も開示されている。したがって、本明細書には、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫポリヌクレオチドと相関および／または作用する、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲＲＮＡ、例えばｃｒｉｓｇＲＮＡもしくはｔｒａｃｒ／ｍａｔｅＲＮＡを含む組成物が含まれる。タンパク質の機能を低下または抑制するためにｓａＲＮＡを使用する方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０４８６３２号パンフレットを参照されたい。したがって、本明細書には、ｓａＲＮＡを使用してＨＮＦ４αの発現を増加させて、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する方法が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０の量を減少させるか、またはその機能を抑制する核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＴＦ６の量を減少させるか、またはその機能を抑制する核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＴＦ４の量を減少させるか、またはその機能を抑制する核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＥＲＫの量を減少させるか、またはその機能を抑制する核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む。

ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０（ヒートショックタンパク質４０）は、遺伝子発現および翻訳開始、フォールディングおよびアンフォールディング、ならびにタンパク質の移行および分解に不可欠な役割を果たし得る分子シャペロンタンパク質である。ＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０の活性は、いくつかの翻訳後修飾により制御される。多くの場合、ＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０はリン酸化タンパク質であり（例えば、ＤｎａＪＡ１、ＤｎａＪＢ４、ＤｎａＪＣ１、ＤｎａＪＣ２９）、その発現および機能は、それぞれ、アセチル化（例えば、ＤｎａＪＡ１、ＤｎａＪＢ２、ＤｎａＪＢ１２、ＤｎａＪＣ５、ＤｎａＪＣ８、ＤｎａＪＣ１３）、グリコシル化（ＤｎａＪＢ１１、ＤｎａＪＣ１０、ＤｎａＪＣ１６）、パルミトイル化（ＤｎａＪＣ５、ＤｎａＪＣ５Ｂ、ＤｎａＪＣ５Ｇ）、メチル化（ＤｎａＪＡ１～４）、プレニル化（ＤｎａＪＡ１、ＤｎａＪＡ２、ＤｎａＪＡ４）、および分子内ジスルフィド結合（ＤｎａＪＢ１１、ＤｎａＪＣ３、ＤｎａＪＣ１０）の形成によって、さらに同時翻訳修飾および翻訳後修飾され得る。「ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＤＮＡＪＢ１遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡＪＢ１ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：５２７０、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：３３３７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３２００２、ＯＭＩＭ：６０４５７２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５６８５。いくつかの実施形態では、ＤＮＡＪＢ１ポリペプチドは、配列番号９の配列、または配列番号９と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号９の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号９のＤＮＡＪＢ１ポリペプチドは、成熟ＤＮＡＪＢ１の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号９のＤＮＡＪＢ１ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡＪＢ１ポリヌクレオチドは、配列番号２５もしくは配列番号２６の配列、または配列番号２５もしくは配列番号２６と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号２５もしくは配列番号２６の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＡＴＦ６は、小胞体ストレス応答（折りたたみ不全タンパク質応答(unfolded protein response)、ＵＰＲ）のセンサーであり、転写発現を制御するように機能する。いくつかの場合では、小胞体ストレスの際に、ＡＴＦ６は小胞体（ＥＲ）からゴルジ体へと輸送され、そこでタンパク質分解により切断されて、タンパク質のフォールディングおよび輸送に関わる遺伝子の転写因子であるＮ末端ＡＴＦ６セグメントを遊離することが明らかになっている。「ＡＴＦ６」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＡＴＦ６遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ６ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：７９１、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２２９２６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１８２１７、ＯＭＩＭ：６０５５３７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１８８５０。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ６ポリペプチドは、配列番号１０の配列、または配列番号１０と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号１０の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号１０のＡＴＦ６ポリペプチドは、成熟ＡＴＦ６の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号１０のＡＴＦ６ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ６ポリヌクレオチドは、配列番号２７の配列、または配列番号２７と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号２７の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＡＴＦ４は、アミノ酸代謝および酸化ストレス耐性に関わる遺伝子の転写発現を増強する役割を果たし得るＵＰＲ標的遺伝子の転写活性化因子である（Fusakio ME et al., 2016）。「ＡＴＦ４」は、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＡＴＦ４遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ４ポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：７８６、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：４６８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２８２７２、ＯＭＩＭ：６０４０６４、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１８８４８。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ４ポリペプチドは、配列番号１１の配列、または配列番号１１と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号１１の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号１１のＡＴＦ４ポリペプチドは、成熟ＡＴＦ４の未熟型または前処理型を表していてもよく、したがって、本明細書には、配列番号１１のＡＴＦ４ポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ４ポリヌクレオチドは、配列番号２８の配列、または配列番号２８と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号２８の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

ＰＥＲＫ（プロテインキナーゼＲＮＡ様小胞体キナーゼ）は、典型的には、ＰＥＲＫから離れたシャペロンの動員により活性化されて、サイトゾルキナーゼドメインのオリゴマー化および活性化をもたらす１型膜貫通タンパク質である。ＰＥＲＫおよびＡＴＦ４の下流でアポトーシス促進性シグナル伝達を媒介する重要なタンパク質はＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）相同タンパク質（ＣＨＯＰ）であり、これは肝疾患の進行に関与している（Malhi H et al., 2011）。「ＰＥＲＫ」はまた、「ＥＩＦ２ＡＫ３」としても知られており、本明細書では、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーの自己リガンド受容体であり、ヒトにおいて、ＥＩＦ２ＡＫ３遺伝子によってコードされているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＰＥＲＫポリペプチドは、次のような１つまたは複数の公的に利用可能なデータベースにおいて同定されるものである：ＮＣ：３２５５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：９４５１、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１７２０７１、ＯＭＩＭ：６０４０３２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＺＪ５。いくつかの実施形態では、ＰＥＲＫポリペプチドは、配列番号１２の配列、または配列番号１２と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号１２の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号１２のＰＥＲＫポリペプチドは、成熟ＰＥＲＫの未熟型または前処理型を表していてもよく、本明細書には、配列番号１２のＰＥＲＫポリペプチドの成熟部分または処理部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＲＫまたはＥＩＦ２ＡＫ３ポリヌクレオチドは、配列番号２９もしくは配列番号３０の配列、または配列番号２９もしくは配列番号３０と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号２９もしくは配列番号３０の一部を含むポリヌクレオチドを含む。

任意の先行する態様の組成物は、ＨＮＦ４αアゴニストをさらに含んでいてもよく、ＨＮＦ４αアゴニストは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４９２０９号明細書中に、より完全に記載されているそれらの組成物を指すことを意味する。

いくつかの実施形態では、任意の先行する態様の組成物および／またはベクターは、生物学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。いくつかの実施形態では、生物学的に許容される担体は、組成物および／またはベクターを宿主細胞内および／または宿主細胞間に導入することができる。いくつかの実施形態では、生物学的に許容される担体は、組成物および／またはベクターを、対象の肝臓の肝細胞などの標的細胞内および／または標的細胞間に導入することができる。重要なことには、いくつかの実施形態では、組成物および／またはベクターは、生物学的に許容される担体と一緒に、機能性高分子、例えばＤＮＡおよびＲＮＡを標的細胞（例えば、肝細胞）の核に輸送することができる。

治療の方法
本明細書では、転写因子であるＨＮＦ４αの対象における肝細胞の核への発現および／または輸送および／または保持を増加させることによって肝疾患を治療する方法が提供されている。いくつかの実施形態では、この方法は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をアップレギュレートすること、ならびに／あるいはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をダウンレギュレートすることを含む。いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象にベクターを投与することを含み、ベクターが、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、および／またはＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をコードする核酸を含む、方法が開示されている。いくつの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象にＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の発現または機能をダウンレギュレートする組成物を投与することを含む方法が開示されている。いくつかの態様では、この組成物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒ／ｍａｔｅＲＮＡを含む。他の実施形態では、この方法は、Ｌｙｓ１０６でのＨＮＦ４αのアセチル化を増加させること、ｃＭＥＴの発現を増加させること、および／またはＴｈｒ３０８でのリン酸化を介したＡＫＴの活性化を増加させることを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象にベクターを投与することを含み、ベクターが、ＰＲＯＸ１をコードする核酸を含む、方法が開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、対象にベクターを投与することを含み、ベクターが、ＳＲＥＢＰ１をコードする核酸を含む、方法が開示されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＨＮＦ４α、ＰＲＯＸ１、およびＳＲＥＢＰ１をコードする１つまたは複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＮＦ４αをコードする核酸を含むベクターを投与することをさらに含む。

上述のように、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃはすべて、例えば、ＨＮＦ４αのアセチル化、細胞代謝経路、または核膜孔複合体の形成を含めた、直接的または間接的な機序を介して、ＨＮＦ４α核輸送を制御する転写因子および／または制御因子である。ＨＮＦ４αに対するこのような作用は、肝疾患を有する患者の肝細胞機能を回復させることができる。

したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のベクターの投与は、対象における肝細胞の核のＨＮＦ４αの量を増加させる。いくつかの実施形態では、ベクター（複数可）の投与は、肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させない。いくつかの実施形態では、ベクター（複数可）の投与は、肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させる。いくつかの実施形態では、任意の先行する態様のベクターは、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、ＨＮＦ４αアイソフォーム２ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４αアイソフォーム２ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、もしくは約９８％同一の配列またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３１と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％同一であるか、またはその断片である。

したがって、いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療する方法であって、ＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする核酸を含むベクターを対象に投与することを含む方法が開示されている。また本明細書では、それを必要とする対象における肝疾患を治療するための医薬を調製するための組成物の使用であって、対象に組成物を投与することを含み、組成物が、ＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする核酸を含む、使用も含まれる。

この方法で使用されるベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス粒子（単離されたもの、弱毒化されたもの、組換え体など）、エキソソーム、細胞外小胞および／またはナノ粒子を含む、本明細書に記載のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、ベクターは、天然のおよび／または操作されたキャプシドを有するウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはエキソソームである。いくつかの実施形態では、ベクターはナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ（例えば、閉鎖型ＤＮＡ（closed-ended DNA、ｃｅＤＮＡ）またはＲＮＡである。ｃｅＤＮＡおよびｃｅＤＮＡを作製および使用する方法は、当技術分野において公知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公報の国際公開第２０１９／１６９２３３号パンフレットおよび国際公開第２０１７／１５２１４９号パンフレットを参照されたい。方法、材料、送達ナノ粒子、ならびに量および処方などに関するそれらの製造および使用を含む、ナノ粒子、その成分、およびそのような成分の送達に関する一般的な情報に関しては、すべてが本発明の実施に有用であり、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429, 1987、米国特許出願公開第２０１１／０２７４７０６号明細書および国際公開第２０１８／１７０４０５号パンフレットに言及されている。

上述のように、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫは、すべて小胞体（ＥＲ）ストレスの転写調節因子である。ＥＲは、タンパク質の適切なフォールディング、修飾、および輸送にとって重要な真核細胞の膜性オルガネラの一種である。タンパク質をフォールディングするＥＲの能力が飽和した場合に発生するＥＲストレスは、細胞死および炎症などの反応を引き起こし得る。これらの転写制御因子は、ＥＲストレスに関連する経路を介して、ＨＮＦ４α核輸送を制御する。本明細書では、これらの転写制御因子の１つまたは複数の量を減少させるか、またはその機能を抑制することが、肝疾患を有する患者における肝細胞の機能を回復させ得ることが示されている。したがって、いくつかの実施形態では、組成物の投与は、対象における肝細胞の核のＨＮＦ４αの量を増加させる。いくつかの実施形態では、組成物の投与は、肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させない。いくつかの実施形態では、組成物の投与は、肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、これらの遺伝子のノックダウンによって、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、および／またはＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させる。ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、および／またはＰＥＲＫのノックダウンは、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、および／またはＰＥＲＫをコードするｍＲＮＡ、あるいはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、および／またはＰＥＲＫ活性に必要な酵素をコードするｍＲＮＡなどの、関連ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡ分子により認識され、ＲＮＡ干渉により媒介されることによってもたらされ得る。例えば、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をコードする分子は、トランスフェクションまたは形質導入などの方法を介して、適切なベクター、例えば、レンチウイルス、レトロウイルスベクター、またはナノ粒子によって肝細胞または肝細胞前駆体に導入され得る。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、および／またはＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をノックアウトするためのいずれか１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ複合体成分は、本明細書に開示されているウイルス粒子、ビリオンまたはウイルスベクターとともに、またはその中に入れて投与することができる。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒ／ｍａｔｅＲＮＡは、１つまたは複数のリプログラミング因子とともにパッケージ化することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子、ビリオン、またはウイルスベクターによってカプセル化されたｓｇＲＮＡ分子は、１つまたは複数のリプログラミング因子とともにパッケージ化され得る。方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ、ならびに量および処方などに関するそれらの製造および使用を含む、ＣＲＩＳＰＲＣａｓシステム、その成分、およびそのような成分の送達に関する一般的な情報に関しては、すべてが本発明の実施に有用であり、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００５７８３９号明細書に言及されている。

上述のように、本明細書で使用される場合の「肝疾患」は、一般に、肝臓に影響を及ぼす疾患、障害、および状態を指し、例えば、肝細胞の脂肪の単純蓄積（脂肪症）、大滴性脂肪変性、門脈周囲および小葉の炎症（脂肪性肝炎）、肝硬変、繊維症、肝虚血、肝細胞がんを含む肝がん、初期病期の肝疾患、末期の肝疾患、および肝不全を包含する広範囲の重症度を有し得る。したがって、脂肪症、大滴性脂肪変性、脂肪性肝炎、肝硬変、線維症、肝がん、肝細胞がん、末期肝疾患、慢性肝疾患、および肝不全はそれぞれ「肝疾患」の定義に含まれる。「肝硬変」の程度または重症度は、チャイルド・ピュースコアによって指定することができ、その分類では、５種の臨床項目である総ビリルビン、血清アルブミン、プロトロンビン時間延長、腹水、および肝性脳症のレベルが、各臨床項目の様々なレベルに対応して１点、２点、および３点の値の点数方式を使用して点数化され、各項目の最も厳しいレベルには３点の値が割り当てられる。５種のすべての項目の合計点数を加算することにより、チャイルド・ピュースコアおよび分類に到達する。５～６点はチャイルド・ピューのクラスＡに指定し、７～９点はチャイルド・ピューのクラスＢに指定し、１０～１５点はチャイルド・ピューのクラスＣに指定する。一般に、チャイルド・ピューのクラスＡは最も低い重症度の肝疾患を示し、チャイルド・ピューのクラスＣは最も高い重症度の肝疾患を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、チャイルド・ピューのクラスＢ肝疾患またはチャイルド・ピューのクラスＢＣ肝疾患を有する対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、チャイルド・ピューのクラスＡ肝疾患を有する対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、肝疾患はアルコール性肝炎である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、虚血性ドナー肝臓をｅｘｖｉｖｏ灌流で治療するために使用することができる。本発明は、肝切除前または肝切除後を含む、がん治療前またはがん治療後の肝がんを治療するために使用することができる。初期病期の肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、限定するものではないが脂肪性肝、アルコール性肝炎、およびアルコール関連肝硬変を含めたアルコール関連肝疾患であり得ると理解されたく、また本明細書では企図されているものとする。本明細書に開示されている末期肝疾患は、例えば、ウイルス性、アルコール性、非アルコール性、および特発性（cryptogenic）を含む、当技術分野において公知のすべての原因に起因し得ることも理解されたい。

したがって、本明細書に開示されている方法は、任意の先行する態様の肝疾患を有する対象における肝機能を改善するために使用され得る。そのような肝機能の改善は、例えば、血清アルブミンの増加、血清アンモニアレベルの低下、総ビリルビンの減少、脳症スコアの上昇、および／またはプロトロンビン時間延長の減少によって示すことができる。したがって、本明細書に開示されている方法は、血清アルブミンレベルを増加させ、血清アンモニアレベルを低下させ、総ビリルビンレベルを低下させ、脳症スコアを上昇させ、および／またはプロトロンビン時間延長を減少させるために使用され得る。

肝疾患は、炎症、線維症、肝硬変、末期肝疾患、および肝がんを含む、複数のステージで進行し得る。肝炎ウイルスによる慢性感染、アルコール媒介性肝硬変、および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む慢性肝疾患には様々な原因があることが知られているはずである。肝疾患の時期は予測できないことが多いため、肝疾患を治療、予防、軽減、および／または抑制する開示された方法は、炎症、線維症、肝硬変、末期肝疾患、および／または肝がんの発症前または発症後に使用でき、さらには肝炎ウイルス感染、アルコール媒介性肝硬変、および／または非アルコール性脂肪性肝炎の前または最中であっても使用でき、肝疾患のいずれかのステージの治療、予防、抑制、および／または緩和のために使用できることを理解されたい。開示された方法は、炎症、線維症、肝硬変、末期肝疾患、および／または肝がんの発症前であればいつでも実施することができる。一態様では、開示された方法は、炎症、線維症、肝硬変、末期肝疾患、および／または肝がんの発症の６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１年前；１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１か月前；３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３日前；６０、４８、３６、３０、２４、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２時間前に使用することができるか；あるいは、炎症、線維症、肝硬変、末期肝疾患、および／または肝がんの発症の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１０５、１２０分後；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０時間後；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、６０、９０日、またはそれ以上の後；４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月、またはそれ以上の後；６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１年後に使用することができる。

肝切除は、肝疾患（例えば、肝硬変、末期肝疾患、および／または肝がん）を有する対象の肝臓の全部または一部の外科的除去である。開示された方法は、肝切除前または切除後のいつでも対象に実施することができる。一態様では、開示された方法は、肝切除の手術の５、４、３、２、または１年前；１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１か月前；３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３日前；６０、４８、３６、３０、２４、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３または２時間前に使用することができるか；あるいは、肝切除の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１０５、１２０分後；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０時間後；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、６０、９０日、またはそれ以上の後；４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月またはそれ以上の後；６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１年後に使用することができる。

本明細書に記載のベクターまたは組成物は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（transcutaneous）、経皮吸収（transdermal）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、膣内を含む任意の経路によって、吸入により、または埋め込みリザーバーを介して、対象に投与することができる。「非経口」という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入の技術が含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターまたは組成物の投与は静脈内投与である。

本開示の別の態様は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、および／またはＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量または機能を増加させる上記の組成物と、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する組成物の両方を投与することに関する。いくつかの実施形態では、両方の組成物は同時に投与される。他の実施形態では、一方の組成物が他方の組成物の前に投与される。いくつかの実施形態では、任意の先行する態様の方法は、ＨＮＦ４αの発現または機能をアップレギュレートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、任意の先行する態様の方法は、ＨＮＦ４αアゴニストをさらに投与することを含み、この用語は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４９２０９号明細書中でより完全に記載されている組成物を指す。

任意の先行する態様のベクターまたは組成物の投与頻度には、限定するものではないが、少なくとも毎年１回、２年毎に１回、３年毎に１回、４年毎に１回、５年毎に１回、６年毎に１回、７年毎に１回、８年毎に１回、９年毎に１回、１０年毎に１回、少なくとも２か月毎に１回、３か月毎に１回、４か月毎に１回、５か月毎に１回、６か月毎に１回、７か月毎に１回、８か月毎に１回、９か月毎に１回、１０か月毎に１回、１１か月毎に１回、少なくとも毎月１回、３週間毎に１回、２週間毎に１回、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、または毎日が含まれる。投与はまた継続的であってもよく、化合物のレベルを任意の所望する指定した範囲内に維持するように調整することができる。任意の先行する態様のベクターおよび／または組成物を使用して肝疾患を治療するために本明細書で使用される「投与」または「投与する」という用語には、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００５７８３９号明細書中でより完全に記載されている投与のそれらの形態が含まれる。

以下の実施例は、開示された主題に従って組成物、方法、および結果を例示するために以下に記載される。これらの実施例は、本明細書で開示される主題のすべての態様を含むことを意図するのでなく、代表的な方法および結果を例示することを意図する。これらの実施例は、当業者に明白な本発明の均等物およびバリエーションを排除することは意図しない。

[実施例１]
方法および材料。
ヒト試料および肝細胞単離。非特定化された正常ヒト肝臓組織および／または細胞を、書面によるインフォームドコンセントを得た後に、ＬｉｖｅｒＴｉｓｓｕｅＣｅｌｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を介して、ＮＩＨ契約番号ＨＳＮ２７６２０１２０００１７Ｃにより資金援助されたピッツバーグ大学のＨｕｍａｎＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗＣｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコールによって得た。成体ヒト肝臓組織および／または細胞も、ピッツバーグ大学のＨｕｍａｎＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄ（識別子の除去は免除される；ＩＲＢ番号：ＰＲＯ１２０９０４６６）によって承認されたプロトコールによって、ＵＰＭＣの小児病院のＩｒａＪＦｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得た（表１）。肝細胞を、以前に記載された通りの３工程のコラゲナーゼ消化技術を使用して単離した（Gramignoli R et al., 2012）。単離後に、以前に記載された通りにトリパンブルー排除を使用して細胞生存率を評価し、生存率＞８０％の細胞のみの調製物を分析に使用した。

インシリコのＨＮＦ４α翻訳後修飾（ＰＴＭ）分析。ＨＮＦ４α細胞局在性をモジュレートするＰＴＭを同定するために、データベースおよび刊行物でのコンピューター検索を介してインシリコ分析を実行した（図５）。プロセスを、３つの相、すなわち同定、スクリーニング、および選択に分けた。最初に、５１種のＰＴＭを同定した。次に、スクリーニング相中、２つの除外基準の適用によって２３種のＰＴＭを選択した（図５）。選択相で、評価することが可能なＨＮＦ４α局在に関して最も信頼性のあるＰＴＭとして、２つのリン酸化および１つのアセチル化修飾を同定した。

ガスクロマトグラフィー－質量分析を使用した安定同位体分析。１００万個のヒト肝細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地Ｆ１２を用いて、１３－Ｃ６標識グルコースおよびグルタミン同位体トレーサーの存在下で、９６時間培養した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）。培地を除去し、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次に、細胞を、１μＬのノルバリンを含有する４００μＬのメタノールおよび４００μＬの水でクエンチし、掻き取り、８００μＬの氷冷したクロロホルムで洗浄し、４℃で３０分ボルテックス混合し、７，３００ｒｐｍで、４℃１０分遠心分離した。上の水性相を代謝物分析のために収集した。代謝物抽出物を、１４，０００ｇで１０分遠心分離して、極性相、タンパク質中間相、およびクロロホルム相を分離した。極性代謝物を含有する水／メタノール相を新しいマイクロ遠沈管に移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥させ、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）分析まで－８０℃で貯蔵した。次いで、３０μＬのメトキシアミン塩酸塩（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を乾燥させた試料に添加し、間欠的にボルテックス混合しながら３０℃で２時間インキュベートした。合計４５μＬのＭＢＴＳＴＦＡ＋１％のｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシランを試料に添加し、５５℃で１時間インキュベートした。誘導体化された試料を、ガラスインサートを用いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアルに移し、ＧＣ－ＭＳオートサンプラーに添加した。ＧＣ－ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ５９７７Ｂ質量分析計に接続された３０ｍのＨＰ－５ＭＳＵＩキャピラリーカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ７８９０ＧＣ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）を使用して実行した。極性代謝物のために、以下のＧＣオーブンのための加熱サイクルを使用した：１００℃で３分、それに続いて５℃／分の一定割合で３００℃に昇温し、３００℃で４８分の総ランタイムを保持する。スキャンモードでデータを獲得した。代謝物の相対的な存在量を、各代謝物断片につきすべての標識された可能性があるイオンの統合したシグナルから計算した。モデルでの分析の前に、同位体置換体の質量分布を、ＩｓｏＣｏｒｒｅｃｔｏＲを使用して天然の存在量に合わせて補正した。代謝物レベルを内部標準であるノルバリンのシグナルに正規化した。濃縮の分数計算は、基質から中間代謝物への１３Ｃの寄与率の分数を表す。これは以下のように計算される：

式中、ＮＣは、１３Ｃとして標識可能な炭素の数であり、ｘｉは、（Ｍ＋ｉ）番目の同位体置換体の分数である。

免疫組織化学およびＨＮＦ４αの定量化。パラフィン包埋肝臓組織のパラフィンをキシレンを用いて除き、エタノールで水分を除いた。クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中で沸騰させることによって抗原の脱マスキングを実行した。次いでスライドを３％過酸化水素中でインキュベートし、正常動物血清でブロッキングし、その後、４℃で一晩そのまま一次抗体と共にインキュベートした。表２に、使用された一次抗体を列挙する。次いで組織切片を一次抗体の動物種に対応するビオチン化二次抗体（ＢＡ－１０００；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共にインキュベートし、３，３’－ジアミノベンジジン（ＳＫ－４１０５；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に曝露して、ペルオキシダーゼ活性を可視化した。対比染色を、Ｒｉｃｈａｒｄ－ＡｌｌａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅシリーズのヘマトキシリン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて実行した。定量化のために、核および細胞質のＨＮＦ４αの免疫反応性を、独立して、２人の肝臓病理医によって、３つの強拡大視野で試料１つ当たり計数された１，０００個の肝細胞を用いて格付けした。これらの分析に、正常な肝臓（ｎ＝２）、チャイルド・ピューＢ（ｎ＝４）、およびチャイルド・ピューＣ（ｎ＝２）が組み入れられた。チャイルド・ピューＢおよびＣは、硬変したヒト肝臓として群分けされ、結果は、計数された細胞の総数に対するパーセンテージとして表される。

タンパク質抽出およびウェスタンブロッティング。タンパク質発現分析を実行するために、単離した肝細胞を、２つの画分に分け、一方の画分を、これまでに記載された標準的手順に従って総タンパク質抽出に使用し（Bell AW et al., 2006）、他方の画分を核タンパク質単離に使用した。核タンパク質単離のために、患者１人当たり１×１０^７から５×１０^７個の間の単離した肝細胞を洗浄し、４０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．６）、１４ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、および１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ中に回収し、次いで遠心分離した（５分、１００ｇ）。細胞ペレットを、２ｍＬの低張性緩衝液［プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨ_２ＰＯ_４、１．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ_２、１ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのスペルミジン、および１ｍｏｌ／ＬのＮａＦ］に懸濁した。氷上で１０分インキュベートした後、ダウンス型ホモジナイザー中で試料をホモジナイズし、次いで遠心分離した（５分、８００ｇ）。細胞溶解物を、トリパンブルー染色を用いてモニターした。上清を、細胞質内抽出物として保存した。核ペレットを同じ緩衝液で追加で２回洗浄した。

核タンパク質を、５０～１００μＬの高張性緩衝液［プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む、３０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２５％グリセロール、４５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ_２、１ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ、および０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ］に、４℃で４５分、連続的にかき混ぜながら抽出した。抽出物を３０，０００ｇで遠心分離し、上清を収集し、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有すること以外は同じ溶液に対して２時間透析した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって決定した。

ウェスタンブロット分析を標準的手順に従って実行した（Natarajan A et al., 2007）。各タンパク質バンドの強度を、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈのＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。上記に示した表２に、一次抗体およびその希釈率を列挙する。

ＲＮＡシーケンシングおよび分析。全ゲノム鎖特異的なＲＮＡ配列(RNA-seq)を使用して、単離したヒト初代肝細胞からのＲＮＡ発現レベルをプロファイリングした。ＲＮＡ配列ライブラリーを、すでに述べられた通りに（Hainer SJ et al., Genes Dev.2015）、さらに文献で述べられた通りに（Kumar R et al., 2012）調製した。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌを使用して腸細胞から抽出し、続いて製造元の指示に従ってカラムで精製した（ＺｙｍｏＲＮＡクリーンおよびコンセントレーターカラム）。全ＲＮＡから、ｒＲＮＡを、これまでに記載された通りに、プールしたアンチセンスオリゴハイブリダイゼーションおよびＲＮアーゼＨ消化を介した枯渇を使用して枯渇させた（Morlan JD et al., 2012；Adiconis X et al., 2013）。ＺｙｍｏＲＮＡクリーンおよびコンセントレーターカラム上で精製した後、第１の鎖のｃＤＮＡを合成した。その後、第２の鎖のｃＤＮＡを合成し、精製し、断片化した。ＲＮＡ配列ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術を使用して調製した。簡単に言えば、末端修復、Ａ－テーリング、およびバーコード化したアダプターのライゲーション、それに続いてＰＣＲ増幅およびサイズ選択である。ライブラリーの完全性を、各ライブラリーからの約１０断片の、ｑｕＢｉｔ定量化、断片分析器の粒度分布評価、およびサンガーシーケンシングによって確認した。ライブラリーを、ペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを使用してシーケンシングした。

ペアエンドリードを、ＱＩＡＧＥＮのＣＬＣＧｅｎｏｍｉｃｓｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用してｈｇ３８にアライメントし、ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎ）として評価した。データをソーティングするために、Ｋ平均法クラスタリングをＣｌｕｓｔｅｒ３．０（De Hoon MJ et al., 2004）を使用して実行し、ＪａｖａＴｒｅｅＶｉｅｗ（Saldanha AJ, 2004）を使用してヒートマップを作成した。ミスマッチ（Murphy SL et al., 2015）、インサーションコスト（insertion cost）（Goldman L et al., 2016）、およびデリーションコスト（deletion cost）（Goldman L et al., 2016）のデフォルト設定を使用した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（ＩＰＡ）を使用して、差次的に発現される遺伝子を同定し、下流の作用を予測し、標的（ＱＩＡＧＥＮＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ）を同定した。ＩＰＡ内の調節作用分析を使用して、上流調節因子と生物学的機能との関係を同定した。分析においてデフォルト設定を使用した（すなわち、上流調節因子を遺伝子、ＲＮＡ、およびタンパク質に限定した）。ＲＮＡ配列データは、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓで入手可能である（受託番号ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１３４４２２）。

正常ヒト肝細胞におけるＡＫＴ阻害。正常ヒト肝細胞（細胞１００万個／ウェル）を、コラーゲンでコーティングされたウェル上で培養した。細胞を、増殖因子または血清の非存在下で６時間培養した。次いで細胞を、ＡＫＴ阻害剤である５μＭのＭＫ－２２０６（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で２４時間処理した。総タンパク質、細胞質タンパク質および核タンパク質を、上述したようにウェスタンブロッティングのために抽出した。

統計的分析。データを、平均±ＳＤとして表した。２つの統計群のウェスタンブロットからの結果を、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定によって評価し、３つの統計群の結果を、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定によって評価した。群間の比較を、ダンの多重比較試験によって実行した。分析したタンパク質間の関連を、スピアマンの順位相関試験を使用して評価した。線形回帰を使用して、タンパク質発現と、チャイルド・ピュースコアおよびＭＥＬＤスコアとして測定された臨床ステータスとの関係を説明した。統計を、Ｐｒｉｓｍ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して実行した。Ｐ＜０．０５の場合、差を有意とみなした。

ウェスタンブロットによって分析したタンパク質間の直接の依存性を同定するために、パス解析（構造的な方程式モデル）を使用した。パス解析モデルは、従属変数と複数の独立変数との間で観察された相関の間での可能性のある原因となる関連を説明するという目的を有する。パスモデルを試験し、調査フレームワークならびに回帰重みおよびモデルフィッティングの結果に基づいて、パスを追加および除去することによって改変した。結果は、研究システムに対する変数の直接および間接的な作用を示す線図としてプロットされる。変数間の相関の程度および直線的な関係は、Ｐ＜０．０５および重要性のレベルを示す任意の係数（数字が大きいほど、より大きい関係を表す）によって決定される。パス解析を、ＩｎｆｏＳｔａｔバージョン２０１３（ＧｒｕｐｏＩｎｆｏＳｔａｔ、ＦＣＡ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄＮａｃｉｏｎａｌｄｅＣｏｒｄｏｂａ、Ｃｏｒｄｏｂａ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）を使用して実行した。

教師なし多変量主成分分析（ＰＣＡ）をウェスタンブロットデータに適用して、試料の臨床状態を区別するタンパク質の群を解明した。分散のほとんどを説明する主成分（ＰＣ）の散乱プロットを描画した。ＰＣＡ分析に、統計ソフトウェアＪＭＰバージョン１４（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用した。

[実施例２]
ＨＮＦ４αの核内局在は、末期肝不全を有するヒト肝臓で減少するが、細胞質内局在は増加する
ＨＮＦ４αは転写因子として機能し、核内局在は活性に必要である（Babeu JP et al., 2014；Chellappa K et al., 2012；Guo H, 2014；Hong YH et al., 2003；Lu H et al., 2016, Song Y et al., 2015；Soutoglou E et al., 2000；Sun K et al., 2007；Yokoyama A et al., 2011；Zhou W et al., 2012；Bell AW et al., 2006；Kritis AA et al., 1996；Tanaka T et al., 2006；Walesky C et al., 2015）。それゆえに、罹患した肝臓検体からの肝細胞での免疫組織化学およびウェスタンブロットを実行して、ＨＮＦ４αの局在を決定し、発現と肝臓の非代償性との相関を示した。終末期肝不全を有する肝臓からの肝細胞の約７８％が、ＨＮＦ４αの細胞質内のみの発現または細胞質内発現および弱い核内発現を示したが、それに対して正常ヒト肝臓は、肝細胞の７５％がＨＮＦ４αの強い核内局在を示した。単離した肝細胞からの総ＨＮＦ４αタンパク質発現は、ウェスタンブロットによって評価したところ、末期肝臓と正常な対照との間にいかなる統計学的差異も示さなかった（Ｐ＝０．１６６；図１Ａ）。この結果は驚くことではなかった。その理由は、機能的な非代償性の程度に基づいて、変性疾患を有する患者および対照からの肝臓中でのＨＮＦ４α発現における差を見極める能力は、患者の大きいコホートの研究を必要とするからである（Guzman-Lepe J et al., 2018）。しかしながら、この研究において、ＨＮＦ４αのに基づき統計学的に有意な差が観察された。ＨＮＦ４αは、正常な対照から単離した肝細胞と比較して、機能的に非代償性の肝臓から単離した肝細胞の細胞質で高いレベルで検出され（Ｐ＝０．０２３；図１Ｂ）、核で低いレベルで検出された（Ｐ＝０．０２３；図１Ｃ）。

ＨＮＦ４αの機能および安定性が多数の翻訳後修飾剤によってレギュレートされるため（Chellappa K et al., 2012；Guo H, 2014；Hong YH et al., 2003；Lu H et al., 2016 、 Song Y et al., 2015；Soutoglou E et al., 2000；Sun K et al., 2007；Yokoyama A et al., 2011；Zhou W et al., 2012）、さらに、その核内局在がその活性にとって重要であるため、インシリコ分析を実行して、どの修飾剤がＨＮＦ４α局在をレギュレートするかを評価した。ＡＭＰＫαの活性化がＨＮＦ４αの転写を制御することが見出された（Hong YH et al., 2003）。加えて、ＨＮＦ４αのアセチル化は、ＡＫＴ経路によって媒介でき、これが分子を安定化させ、その核内での保持に好ましい（Soutoglou E et al., 2000）（図５）。

[実施例３]
ＨＮＦ４αは進行性肝疾患におけるヒト肝細胞の機能の主要な調節因子である。
次に、正常な対照からのヒト肝細胞（ｎ＝４）と、肝硬変および終末期肝不全を有する患者から回収したもの（ｎ＝４）（チャイルド・ピューＣ）との間の遺伝子発現の差を比較するための評価を実行して、研究をＮＡＳＨおよびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変を有する患者に限定した。ＲＮＡ配列データの階層的クラスタリングから、肝硬変および肝機能障害に関連する３つの主要な動的パターン、Ｋ平均法クラスタリングのヒートマップでの計算値（対照に対するｌｏｇ_２ＦＣ；Ｋ＝３）が解明された。対照ヒト肝細胞と比べて終末期肝不全を有する患者からの肝細胞において中程度から高度にアップレギュレートされた遺伝子の代表例として、クラスターＩ（３４７８種の遺伝子）およびＩＩＩ（１６６９種の遺伝子）が示された。これらのクラスターにおけるほとんどの遺伝子が自食作用およびアポトーシスのシグナル伝達に関連していた（データは示されない）。

しかしながら、クラスターＩＩは、末期肝細胞において有意にダウンレギュレートされた１６６９種の遺伝子からなり、セリン－スレオニンプロテインキナーゼ（ＡＫＴ１）、シトクロムＰ４５０（シトクロムＰ４５０［ＣＹＰ］ｃ８、ＣＹＰ２ｃ９、ＣＹＰ２ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４）、および肝細胞核内因子（ＨＮＦ４α、フォークヘッドボックスａ１［ＦＯＸａ１］）をコードする遺伝子を含んでいた。このクラスターに提示される上の経路は、ファルネソイドＸ受容体／レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）および肝臓Ｘ受容体／ＲＸＲ活性化、ミトコンドリア機能障害、酸化的リン酸化、およびＲＸＲ機能の阻害を含んでいた。これらのダウンレギュレートされた遺伝子におけるパスウェイ解析は、ＨＮＦ４αが中心的な上流調節因子であったことを示し、ヒートマップは、ＮＡＳＨおよびアルコール媒介性ラエンネック肝硬変を有する患者からの肝細胞の遺伝子発現プロファイルにおける多くの類似性を確認した（データは示されない）。これらの結果は、終末期不全を有する硬変した肝臓から回収されたラット肝細胞の遺伝子発現プロファイルとほぼ同一であった（Liu L et al., 2012）。

[実施例４]
ｃＭＥＴおよびＡＫＴリン酸化は末期肝不全を有する患者からのヒト肝細胞においてＨＮＦ４αの核内局在と相関する
ＥＧＦＲおよびｃＭＥＴは、ＨＮＦ４αの重要なモジュレーターとしてインシリコおよびＲＮＡ配列分析で同定されたＡＭＰＫおよびＡＫＴ経路をレギュレートすることが示されるため（Komposch K et al., 2015；Paranjpe S et al., 2016；Tsagianni A et al, 2018）、肝臓検体におけるこれらの分子のための抗体ベースのアッセイを実行した。非代償性肝臓検体におけるｃＭＥＴ発現は、免疫組織化学とウェスタンブロットの両方によって測定したところ、単離した対照ヒト肝細胞と比較して著しく低減した（Ｐ＝０．０２３；図２Ａおよび２Ｂ）。正常な肝臓検体と罹患した肝臓検体との間で、ＥＧＦＲ発現における有意差はなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。しかしながら、ＥＧＦＲの活性型であるホスホ－ＥＧＦＲ（Ｙ１０８６）は、正常ヒト肝細胞と比較して、非代償性疾患を有する患者からの罹患した肝臓由来の肝細胞で高度に発現された（図６Ａおよび６Ｂ）。加えて、細胞死および肝細胞複製の連続的なサイクルは、肝硬変の顕著な特徴であるので（Tsochatzis EA et al., 2014）、この観察が終末期肝不全を有する患者からの肝細胞において確認されて、免疫組織化学およびウェスタンブロットを使用して、末期肝細胞において、［ホスホ－Ｈ３（Ｓｅｒ１０）］および細胞死（活性カスパーゼ３）の再現性あるマーカー発現が実証された。

機能的に非代償性の肝臓からの肝細胞において、ｃＭＥＴはＡＭＰＫαおよびＡＫＴを制御することができ、ｃＭＥＴは有意にダウンレギュレートされることから、ＡＭＰＫαおよびＡＫＴに関する活性化プロセスを分析した。総ＡＭＰＫα、活性化ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）およびその比率は、非代償性の機能を有する肝細胞と正常ヒト肝細胞とで統計学的に異なっていなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。しかしながら、総ＡＫＴ、活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）、およびその比率は、非代償性肝機能を有する患者からの肝臓検体および単離された肝細胞において有意に減少した（図２Ａおよび２Ｂ）。別のＡＫＴリン酸化部位（Ｓｅｒ４７３）は、正常な対照または非代償性検体からの単離された肝臓検体または肝細胞において不変であった（図２ＡおよびＢ）。

ＨＮＦ４α、その核内局在、および翻訳後修飾間の関係をさらに分析するために、スピアマンの順位相関試験を実行した。ｃＭＥＴ発現は、総ＨＮＦ４α（ｒ＝０．７６；Ｐ＝０．０２１；図２Ｃ）および核のＨＮＦ４α（ｒ＝０．７１；Ｐ＝０．０３７；図２Ｃ）と正の統計学的に有意な相関を示した。活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）も、総ＨＮＦ４α（ｒ＝０．７３；Ｐ＝０．０３１；図２Ｃ）および核のＨＮＦ４α（ｒ＝０．８２；Ｐ＝０．０１１；図２Ｃ）と正の統計学的に有意な相関を示し、それに対して細胞質のＨＮＦ４αは、ｃＭＥＴ（ｒ＝－０．８０；Ｐ＝０．０１４；図２Ｃ）および活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（ｒ＝－０．７７；Ｐ＝０．０２１；図２Ｃ）と負の相関を示した。加えて、ホスホ－ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率は、ｃＭＥＴ（ｒ＝０．８０；Ｐ＝０．０１４；図６Ａ）および総ＡＫＴ（ｒ＝０．７１；Ｐ＝０．０３７；図６Ａ）と正に相関した。したがって、低減したｃＭＥＴは、ＡＫＴ経路の低減した活性化、核における低減したＨＮＦ４α、および細胞質におけるＨＮＦ４αのより高い発現に関連していた。

[実施例５]
ＨＮＦ４αの核内局在はｃＭＥＴ／ＡＫＴ軸の影響を受け、肝機能障害の程度と相関する
図３Ａでわかるように、パスウェイ解析は、ｃＭＥＴ発現と核のＨＮＦ４α発現との間の有意な因果関係（０．５６；Ｐ＝０．００４）および核のＨＮＦ４αのレベルと活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率との間の直接的な関係（０．０５；Ｐ＝０．００６）を明らかにした。モデリングもまた、総ＨＮＦ４α発現レベルが核内局在に寄与することを実証した（０．６０；Ｐ＝０．０４２）。しかしながら、ｃＭＥＴ発現は総ＨＮＦ４α発現と負の関連を示したことから（－０．３７；Ｐ＝０．０２４）（図３Ａ）、ｃＭＥＴ発現が、総ＨＮＦ４α発現に直接影響しないが、その核内局在にだけ影響することが示される。核内発現のレベルが肝機能障害の程度（チャイルド・ピュースコア）と相関するかどうかを評価するために、線形回帰分析を実行したところ、核のＨＮＦ４α発現レベルがチャイルド・ピュースコアと有意な逆の関係を有することを示した（Ｒ^２＝０．８０；Ｐ＝０．００７）（図３Ｂ）。まとめると、これらのタンパク質の発現のパスウェイおよび線形回帰統計分析は、ＨＮＦ４α局在が、肝疾患進行に関連すること、およびｃＭＥＴ発現およびＡＫＴリン酸化が、肝細胞ＨＮＦ４αの核内局在および機能を維持することにおいて中心的な役割を果たすことを示す。

次に、主成分分析（ＰＣＡ）を実行して、ＨＮＦ４α翻訳後修飾剤関連の分子を評価し、分子のパターンが末期肝細胞における肝機能（チャイルド・ピュースコア）と相関するかどうかを描画した（図３Ｃおよび３Ｄ）。図３Ｃで示されるように、ＰＣ１（６９．９％）およびＰＣ２（３０．１％）は、研究される単離された肝細胞において、肝機能のレベル（チャイルド・ピュースコア）における変動の１００％を識別する。正常ヒト肝細胞を特徴付けたベクトルは、ｃＭＥＴおよび活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）／総ＡＫＴの比率、総ＨＮＦ４α、および核のＨＮＦ４αであったが、それに対して不全のヒト肝細胞を特徴付けた負の特徴は、細胞質のＨＮＦ４αおよび活性カスパーゼ３発現であった（図３Ｃおよび３Ｄ）。まとめると、この統計的分析は、終末期肝不全を有するヒト肝細胞の分子プロファイリングを確証し、ｃＭＥＴ、活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）、ならびに総および核のＨＮＦ４αの発現の間の原因となる関係を確立する。

[実施例６]
核内でのＨＮＦ４αの保持は、末期肝不全を有する患者において減少したアセチル化を介して低減される。
ＡＫＴの標的の１つは、ＣＲＥＢ結合タンパク質の活性化である（Dekker FJ et al., 2009）。ＣＲＥＢ結合タンパク質は、ヌクレオソームヒストンにおける固有のアセチル化活性を有し、これは、転写因子のヌクレオソームＤＮＡへの接近を増加し、したがって核中での転写因子の転写および保持を活性化することが周知である。したがって、この軸は、ＨＮＦ４αの核内保持に関連する可能性がある（Soutoglou E et al., 2000）。ゲノム全体的なトランスクリプトーム分析およびインシリコ分析により、ｃＭＥＴ／ＡＫＴキナーゼ軸経路は、ＣＲＥＢ結合タンパク質の活性化を介してＨＮＦ４αの局在および安定性を制御できることが示されたことから（Kumar R et al., 2012）、アセチル化ＨＮＦ４αの核発現を測定し（図４Ａ～４Ｃ）、核中のＨＮＦ４αアセチル化が、正常な対照と比較して、終末期肝不全を有する患者からの肝細胞において有意に低減されることを見出した（Ｐ＝０．０２４；図４Ａ）。さらにＨＮＦ４αのアセチル化が肝機能障害の程度（チャイルド・ピュースコア）に関連することを確認するために、線形回帰分析を実行して、アセチル化ＨＮＦ４αにおける減少は、肝機能障害と直接かつ有意に相関することを示した（Ｒ^２＝０．７１；Ｐ＝０．００４；図４Ｃ）。原理の証明として、ＨＮＦ４αの核内局在における活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）の役割を確証するために、ＡＫＴシグナル伝達を阻害することによって、新たに単離した正常ヒト肝細胞で予備実験を実行した。新たに単離した正常ヒト肝細胞を、有力なアロステリック汎ＡＫＴ阻害剤であるＭＫ－２２０６で処理した。ＡＫＴ阻害処理の２４時間後、未処理対照と比較して、活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）の８０％、核のＨＮＦ４αの２５％、およびアセチル化された核のＨＮＦ４αの発現の１４％が低減した。

[実施例７]
核内でのＨＮＦ４αの保持は複数のシグナル伝達分子によってレギュレートされ、末期肝不全と有意な負の関連を示す。
ＨＮＦ４αは、肝機能のマスター調節因子である（Babeu JP et al., 2014；Chellappa K et al., 2012；Guo H et al., 2014；Lu H et al., 2016 、 Song Y et al., 2015；Soutoglou E et al., 2000；Sun K et al., 2007；Xu Z et al., 2007；Zhou W et al., 2012；Bell AW et al., 2006）。ＨＮＦ４α発現における変更は、肝疾患を、複数の病因、例えばがん、Ｂ型およびＣ型肝炎、アルコール媒介性肝硬変、およびＮＡＳＨと関連付けられている（Babeu JP et al., 2014；Chellappa K et al., 2012；Guo H et al., 2014；Lu H et al., 2016 、 Song Y et al., 2015；Soutoglou E et al., 2000；Sun K et al., 2007；Xu Z et al., 2007；Zhou W et al., 2012；Bell AW et al., 2006）。ＴＬＦを有する動物モデルにおいて、ＨＮＦ４α発現における強い低減が同定され、遺伝子治療を使用してＨＮＦ４αの生産を回復させることによって、肝臓細胞をリブートして正常に機能させる（Nishikawa T et al., 2014）。この観察がヒトに適用されるかどうかを評価するために、非代償性肝機能を有する患者の大きいコホートの肝臓における肝臓に豊富な転写因子の発現に対する研究を行った（Guzman-Lepe J et al., 2018）。ＨＮＦ４αのｍＲＮＡレベルがダウンレギュレートされ、チャイルド・ピュー分類に基づく肝機能障害の程度と相関することが見出された。これらの研究におけるＨＮＦ４αの核内局在は一貫性がなかった（Guzman-Lepe J et al., 2018）。

ヒト肝細胞を、ＮＡＳＨによって引き起こされる肝硬変および末期（チャイルド・ピューＢ、Ｃ）肝不全ならびにアルコール媒介性ラエンネック肝硬変を有する患者の外植された肝臓から単離した。これらの単離された肝細胞において、正常な対照肝細胞で見られるものと比較して、細胞質に局在されたＨＮＦ４αは増加し、核におけるＨＮＦ４αは減少した。加えて、ヒトの不全な硬変した肝細胞における細胞質または核へのＨＮＦ４αの局在は、肝細胞の機能障害の程度と相関していた。これらのデータは、ＨＮＦ４αの核輸送または保持をレギュレートする経路は、終末期肝不全の治療のための標的であり得ることを示す。

ＡＭＰＫおよびＡＫＴキナーゼは、ＨＮＦ４αの局在をレギュレートできる主要な構成要素である（Hong YH et al., 2003；Song Y et al., 2015；Soutoglou E et al., 2000）。ＡＭＰＫは、エネルギーホメオスタシスを維持すること、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）生産経路を促進すること、およびＡＴＰ消費を低減することにおいて中心的な役割を果たし（Woods A et al., 2017）、一方でＡＫＴ活性化は、細胞の増殖、生存、および成長を促進する（Manning BD et al., 2017；Morales-Ruiz M et al., 2017）。ＡＫＴ活性化は、スレオニン３０８および／またはセリン４７３でのリン酸化によって媒介される（Praveen P et al., 2016；Inoue J et al., 2017）。末期ヒト肝細胞において活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）レベルが有意に減少したことから、活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）とＨＮＦ４α局在化との間の有意な相関を示すことが本明細書で開示される。これらの発見は、Ｔｈｒ３０８におけるＡＫＴリン酸化が、肝疾患の終末期における肝細胞の不全において重要な役割を果たす可能性があることを示す。

ｃＭＥＴおよびＥＧＦＲについての分析を行った。これら２つの中心的な受容体は、ＡＫＴおよびＡＭＰＫの上流調節因子であり、肝臓の機能および再生に関連する（Natarajan A et al., 2007；Komposch K et al., 2015；Paranjpe S et al., 2016；Tsagianni A et al., 2018；Alam A et al., 2017）。マウスにおけるｃＭＥＴおよびＥＧＦＲの破壊の組合せは、肝臓のホメオスタシスを変更し、終末期肝不全をもたらす（Tsagianni A et al., 2018）。ヒトの不全の硬変した肝細胞において、低減したｃＭＥＴの発現、およびＨＮＦ４α局在と直接相関する減少した発現がみられた。対照的に、ヒトの不全の硬変した肝細胞または対照ヒト肝細胞のいずれにおいても総ＥＧＦＲ発現の差はなかった。したがって、ヒト肝臓において、ｃＭＥＴは、ＡＫＴの経路活性化ならびにＨＮＦ４αの局在および機能をレギュレートするのに重要な役割を果たし得る。さらに、異なる統計分析（スピアマンの順位相関試験、パスウェイ解析、線形回帰分析および主成分分析）を使用することは、ヒトの不全の硬変したおよび正常な肝細胞で分析された翻訳後修飾剤の間の関連の確立を可能にする。これらの統計分析は、ｃＭＥＴおよび活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）が核のＨＮＦ４αの発現レベルと直接関連することを明らかにした。ｃＭＥＴタンパク質発現と総ＨＮＦ４αとの間に見出された負の関連は、ｃＭＥＴ発現が総ＨＮＦ４α発現に直接影響しないが、その核内局在にだけ影響することを示す。

ＨＮＦ４αのアセチル化は、ヒトの不全の硬変した肝細胞における活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）の低い発現レベルと、ヌクレオソームのＤＮＡに結合する転写因子を増加させる固有のアセチル化活性を有する分子であるＣＲＥＢ結合タンパク質へのＡＫＴの直接的な作用とに基づいて、硬変した不全の肝細胞において影響を受け得る。実際に、核のＨＮＦ４αのアセチル化は、印象的なことに、硬変した肝臓からのヒト肝細胞で低減し、そのレベルは肝機能障害の程度と関連していた。これらの観察は、スレオニン３０８におけるＡＫＴリン酸化は、ＣＲＥＢ結合タンパク質を制御することによって、アセチル化を介してＨＮＦ４αの核内保持を媒介することを示す（Soutoglou E et al., 2000）。

まとめると、細胞質におけるＨＮＦ４αの局在は、肝疾患の進行期の間に核内でのＨＮＦ４αを維持する分子経路の変更から生じる。ｃＭＥＴおよび活性化ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）は、ダウンレギュレートされ、ＨＮＦ４αのアセチル化および核内保持に影響を与える。これらのデータは、ＨＮＦ４αの核への局在を介した慢性肝疾患における肝細胞機能の回復を示す。

[実施例８]
転写因子のレンチウイルス（ＬＶ）構築物での初代ヒト肝細胞の形質導入。
転写因子ＬＶでの初代ヒト肝細胞の形質導入。肝細胞は、肝細胞の脱分化を防止するために二重のコラーゲン（厚い層）系で培養される。それに続き、コラーゲンサンドイッチプロトコールが使用される。以下を調製する：ＷＡＲＭ：ｄＰＢＳ、ＨＭＭ（基礎＋ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）、ＨＣＭ（ＨＢＭ基礎＋ＨＣＭＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）；氷上：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＬＶ^＊、転写因子（ＴＦ）ＬＶ^＊、ＭａｘＥｎｈａｎｃｅｒ、ＴｒａｎｓＤｕｘ；その他：１．５ｍＬのチューブ、５０ｍＬのチューブ、チップ、ピペット。

１．ウェル当たり５ｅ５個の肝細胞を厚い層のコラーゲン上にプレーティングし、細胞をそのまま４時間付着させる。

２．温ｄＰＢＳでウェルを２回洗浄して、死細胞を除去し、培地を５００ｕＬのＨＭＭ（ＦＢＳなし）で交換する。

３．５つのチューブを調製し、以下の通りラベルする：ａ．ＧＦＰＬＶ－２；ｂ．ＧＦＰＬＶ－１０；ｃ．ＴＦＬＶ－０；ｄ．ＴＦＬＶ－２；ｅ．ＴＦＬＶ－１０。

４．ＨＭＭ／ＭａｘＥｎｈａｎｃｅｒ／ＴｒａｎｓＤｕｘ（ＨＭＴ）溶液を、５０ｍＬのチューブ：１２．３２３ｍＬのＨＭＭ＋３．１００ｍＬのＭａｘＥｎｈａｎｃｅｒ＋７７．５ｕＬのＴｒａｎｓＤｕｘで調製する。

５．ＬＶ溶液を、予めラベルしたチューブ：ａ．ＧＦＰＬＶ－２：６１８．３ｕＬのＨＭＭ＋１．７ｕＬのＧＦＰＬＶ；ｂ．ＧＦＰＬＶ－１０：６１１．６ｕＬのＨＭＭ＋８．４ｕＬのＧＦＰＬＶ；ｃ．ＴＦＬＶ－０：６２０ｕＬのＨＭＭのみ；ｄ．ＴＦＬＶ－２：６１８．６ｕＬのＨＭＭ＋１．４４ｕＬのＴＦ４ＬＶ；ｅ．ＴＦＬＶ－１０：６１２．８２ｕＬのＨＭＭ＋７．１８ｕＬのＴＦ４ＬＶで調製する。

６．ウェル中のＨＭＭ培地を５００μＬのＨＭＴ溶液で交換する。

７．１００ｕＬの各ＬＶ溶液をウェルに分配する。プレートを回転させて混合する。

８．次の日、温ｄＰＢＳでウェルを２回洗浄して、死細胞と残存するＬＶ溶液を除去する。

９．細胞に厚いコラーゲンを重ね、コラーゲンをそのまま２時間ゲル化させる。

１０．５００ｕＬのＨＣＭをウェルに添加し、新鮮なＨＣＭで毎日交換する。

１１．形質導入後７２および９６時間で試料を得る（７２時間におけるプロトコールを参照）。

１２．９６時間で試料を得るために、温めたｄＰＢＳで細胞を洗浄し、培地を５００ｕＬのＨＣＭ（ＦＢＳなし）で交換する。

注釈：^＊水浴中、３７℃で、ＬＶを迅速に融解させる。フードに移し、回転、倒置、または穏やかなボルテックス混合によって混合し、氷上で維持する。使用しないＬＶはアリコートにし、－８０℃で再凍結する。再凍結ごとにウイルス活性の１０～２０％が失われる。

転写因子（ＴＦ）ＬＶ構築物。
ＴＦＬＶ構築物は、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、ＰＯＭ１２１ＣもしくはＨＮＦ４αをコードするポリヌクレオチド、またはＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４もしくはＰＥＲＫに対応するＲＮＡｉをコードするポリヌクレオチド含有するレンチウイルスベクター（ＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＳ９７０Ｓ－１）である。

ＥＬＩＳＡのために馴化培地を収集する（７２および９６時間）。各群につき２つのウェルから１２００ｕＬの馴化培地を収集し、１．５ｍＬのチューブに移す。収集した培地を温めたＨＭＭで交換する。馴化培地を、２０，０００×ｇで２分遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、－２０℃で貯蔵する。

ＧＦＰ発現および明視野の写真を撮り、トランスフェクション効率を決定する（７２および９６時間）。浮遊する細胞を温めたｄＰＢＳで洗浄する。温めたＨＣＭで交換する。ＧＦＰ発現にはフィルター２（グリーン励起）および明視野にはフィルター６を使用して写真を撮る。

ＲＮＡ抽出のためのＱｉａｚｏｌ中に細胞溶解産物を収集する（７２および９６時間）。温ｄＰＢＳで細胞を２回洗浄する。６００ｕＬのＱｉａｚｏｌでウェルをコーティングし、１分インキュベートする。Ｐ１０００を使用してプレートから細胞を掻き取り、１．５ｍＬのチューブに移す。ＲＮＡ単離まで－２０℃で貯蔵する。

ＩＦのためにウェルを固定する（７２時間）。温ｄＰＢＳで細胞を２回洗浄する。７５０ｕＬの４％ＰＦＡ溶液でウェルをコーティングし、４０分インキュベートする。ウェルを、１ｍＬのｄＰＢＳで３回、洗浄ごとに１０分洗浄する。１ｍＬのｄＰＢＳを添加する。ＨＮＦ４Ａについて染色するまで４℃で貯蔵する。

ウェスタンブロットのために細胞溶解産物を収集する（７２および９６時間）。以下を含有する氷冷した溶解溶液を調製する：

細胞を温ｄＰＢＳで２回洗浄する。２００ｕＬの氷冷した溶解溶液でウェルをコーティングし、ウォークイン型の冷蔵庫中で揺らしながら３０分インキュベートする。ラバーポリスマンを使用して細胞を剥がし、沈殿物および固形物を含む溶解産物を収集し、予めラベルしたチューブに移す。２０，０００×ｇで、４℃１０分回転させる。上清をきれいな予めラベルした１．５ｍＬのチューブに移す。－８０℃の冷凍庫で溶解産物を貯蔵する。

ＴＦ免疫蛍光共染色（厚いコラーゲンサンドイッチ層を有する１２ウェルプレートの場合）。試料を、細胞の剥離を防止するために穏やかに吸引する。試料をそのまま乾燥させない。^＊最大速度で５分遠沈させる。^＊二次抗体は、実験に応じて他の好適な抗体で置き換えることができる。

固定（細胞がすでに固定されている場合、ブロッキングおよび透過化工程に移行する）。試料を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で４０分固定する。試料を氷冷ＰＢＳで３回、各洗浄につき１０分洗浄する。染色に進むか、または染色まで４℃で貯蔵する（最大２週）。

ブロッキングおよび透過化。試料を、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄する。試料を、１ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ）で３回、各洗浄につき１０分洗浄する。試料を、１ｍＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１０％正常ロバ血清、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）と共に２時間インキュベートすることによってブロッキングおよび透過化する。

抗体のインキュベーション：マウス抗ＴＦストック１°Ａｂをボルテックス混合および遠沈する^＊。１：５００のマウス抗ＴＦ１°Ａｂ希釈物をブロッキング緩衝液中で調製する。６００ｕＬの希釈した１°Ａｂで試料をコーティングし、加湿したチャンバー中で、室温で６時間または４℃で一晩インキュベートする。１°Ａｂ溶液を吸引し、細胞を洗浄緩衝液で３回、各洗浄につき１０分洗浄する。ロバ抗マウスＩｇＧ－ＡＦ５９４（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡ２１２０３）をボルテックス混合および遠沈する^＊。１：２５０の希釈した２°Ａｂをブロッキング緩衝液中で調製する。６００μＬの希釈した２°Ａｂで試料をコーティングし、加湿したチャンバー中で、室温で２時間インキュベートする。２°Ａｂ溶液を吸引し、細胞を洗浄緩衝液で３回、各洗浄につき１０分洗浄する。

対比染色およびマウント：試料をＰＢＳで３回洗浄する。細胞を、暗所で、ＰＢＳ中の１ｍＬの１ｕｇ／ｍｌヘキスト３３３４２中で、２分インキュベートする。試料をＰＢＳで３回洗浄する。試料は、暗所で、４℃で貯蔵してもよい。ＲＥＤチャネルを使用してＴＦを試験する。

[実施例９]
転写因子（ＴＦ）ｍＲＮＡ（５０、１００、５００ｎｇ）での初代ヒト肝細胞のトランスフェクション
初代ヒト肝細胞のトランスフェクション。以下：温めておくもの：ＤＰＢＳ、ＨＭＭ（ＨＭＭ基礎培地＋ＨＭＭＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ→ＲＴ；氷上：リポフェクトアミンメッセンジャーＭａｘ→ＲＴ、ｍＲＮＡ→ＲＴ；その他：１．５ｍＬのチューブ、５０ｍＬのチューブ、チップ、ピペットを調製する。

１．細胞を温ＤＰＢＳで洗浄し、培地を５００ｕＬのＨＭＭ（ＦＢＳなし）で交換する。

２．以下のようにラベルした２セットのチューブを調製する：ａ．ＧＦＰ－５０。ｂ．ＧＦＰ－１００。ｃ．ＧＦＰ－５００。ｄ．ＴＦ－０。ｅ．ＴＦ－５０。ｆ．ＴＦ－１００。ｇ．ＴＦ－５００。ＴＦは、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、ＰＯＭ１２１ＣおよびＨＮＦ４αから選択される。

３．第２の希釈したｍＲＮＡを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで調製する：ａ．ＤｉｌＧＦＰ：３２．５ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭ＋３．６１ｕＬのＧＦＰｍＲＮＡ。ｂ．ＤｉｌＨＮＦ：４０．３ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭ＋４．４７ｕＬのＴＦｍＲＮＡ。

４．第１のセットの予めラベルしたチューブ中に、ｍＲＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭミックスを調製する：ａ．ＧＦＰ－５０：３１２．２ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋２．８ｕＬのＤｉｌＧＦＰ。ｂ．ＧＦＰ－１００：３０９．４ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋５．６ｕＬのＤｉｌＧＦＰ。ｃ．ＧＦＰ－５００：２８７．３ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋２７．７ｕＬのＤｉｌＧＦＰ。ｄ．ＨＮＦ－０：３１５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ。ｅ．ＴＦ－５０：３１１．５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋３．５ｕＬのＤｉｌＴＦ。ｆ．ＴＦ－１００：３０８．１ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋６．９ｕＬのＤｉｌＴＦ。ｇ．ＴＦ－５００：２８０．７ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋３４．３ｕＬのＤｉｌＴＦ。

５．希釈したＬｉｐｏミックスを調製する：ａ．２，２２０．７５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋１４１．７５ｕＬのＬｉｐｏ。

６．希釈したＬｉｐｏミックスを２～３秒ボルテックス混合し、第２のセットの予めラベルしたチューブに３１０ｕＬを分配する。室温で１０分インキュベートする。

７．３１０ｕＬの各ｍＲＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭミックスを、希釈したＬｉｐｏミックスを含有するチューブに移す。室温で５分インキュベートする。

８．１００ｕＬの各ミックスを各ウェルに分配する。

９．インキュベートし、翌朝、温ｄＰＢＳで洗浄し、５００ｕＬのＨＭＭ（ＦＢＳなし）で交換する。

１０．トランスフェクションの２４^＊および４８^＊時間後（肝細胞をプレーティングするときに応じて決まる）に試料を得る。

ＥＬＩＳＡのために馴化培地を収集する（２４および４８時間）。各群につき２つのウェルから１２００ｕＬの馴化培地を収集し、１．５ｍＬのチューブに移す。収集した培地を温ＨＭＭで交換する。馴化培地を、２０，０００×ｇで２分遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、－２０℃で貯蔵する。

ＧＦＰ発現および明視野の写真を撮り、トランスフェクション効率を決定する（２４および４８時間）。浮遊する細胞を温ｄＰＢＳで洗浄する。温ＨＭＭで交換する。ＧＦＰ発現にはフィルター２（グリーン励起）および明視野にはフィルター６を使用して写真を撮る。

ＲＮＡ抽出のためにＱｉａｚｏｌ中に細胞溶解産物を収集する（２４および４８時間）。細胞を温ｄＰＢＳで２回洗浄する。６００ｕＬのＱｉａｚｏｌでウェルをコーティングし、１分インキュベートする。Ｐ１０００を使用してプレートから細胞を掻き取り、１．５ｍＬのチューブに移す。ＲＮＡ単離まで－２０℃で貯蔵する。

ＩＦのためにウェルを固定する（２４時間）。細胞を温めたｄＰＢＳで２回洗浄する。７５０ｕＬの４％ＰＦＡ溶液でウェルをコーティングし、２０分インキュベートする。ウェルを、１ｍＬのｄＰＢＳで３回、洗浄ごとに５分洗浄する。１ｍＬのｄＰＢＳを添加する。ＴＦについて染色するまで４℃で貯蔵する。

ウェスタンブロットのために細胞溶解産物を収集する（２４および４８時間）。以下を含有する氷冷した溶解溶液を調製する：

細胞を温ｄＰＢＳで２回洗浄する。２００ｕＬの氷冷した溶解溶液でウェルをコーティングし、ウォークイン型の冷蔵庫中で揺らしながら３０分インキュベートする。ラバーポリスマンを使用して細胞を剥がし、沈殿物および固形物を含む溶解産物を収集し、予めラベルしたチューブに移す。２０，０００×ｇで、４℃で１０分回転させる。上清をきれいな予めラベルした１．５ｍＬのチューブに移す。－８０℃の冷凍庫で溶解産物を貯蔵する。

免疫蛍光共染色（染色、固定、ブロッキングおよび透過化、抗体のインキュベーション、ならびに対比染色およびマウント）は、実施例９で上述した通りである。

[実施例１０]
転写因子および調節因子ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００およびＰＯＭ１２１Ｃは、終末期肝不全を有する硬変した肝細胞におけるＨＮＦ４αの核内発現を改善する。
肝臓に豊富な転写因子は、末期肝硬変を有するラットからの肝細胞において安定的にダウンレギュレートされること、およびそれらの１つの肝細胞核内因子４アルファ（ＨＮＦ４α）を、培養物およびインビボの両方において強制的に再発現させることにより、機能障害性肝細胞が再プログラミングされ、機能が回復することが見出された。進行性肝疾患を有する患者の大コホートで、罹患した肝臓におけるＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現のレベルは、肝機能障害の程度（チャイルド・ピュー分類）と相関していたこと、およびラット研究での場合のように、その発現は核内には局在していなかったことが示された。進行性肝硬変を有する患者の肝臓において、ＨＮＦ４αのＲＮＡ発現レベルは、肝機能の低下に従って減少し、タンパク質発現は細胞質で見出される。これらの発見は、変性性の肝疾患を有する患者における損なわれた肝機能を説明することができる。さらに、ＲＮＡ配列分析は、核タンパク質の移行に関与するＨＮＦ４αおよび他の転写因子／調節因子関連の経路は、終末期不全を有する患者からの硬変した肝細胞でダウンレギュレートされ、その場合、ＨＮＦ４αの核内レベルは有意に低減し、ＨＮＦ４αの細胞質内の発現は増加することが見出されたことを明らかにした。加えて、小胞体（ＥＲ）ストレスの４つの主要な転写調節因子が有意にアップレギュレートされたことが見出された。この研究は、翻訳後修飾に関わるＨＮＦ４αおよび経路の操作は、終末期肝不全を有する患者において肝細胞機能を回復させることができることを示す。

ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００およびＰＯＭ１２１Ｃのタンパク質発現は、末期肝不全を有する患者における肝機能障害の程度と相関する。ＨＮＦ４αは、適切に機能するために核で発現されなければならない；それゆえに、ＨＮＦ４αの核内局在に関与するシグナル伝達経路を、非代償性の機能を有する外植したヒト肝臓から単離した肝細胞で分析した。ＲＮＡ配列分析で、転写因子および調節因子ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００およびＰＯＭ１２１ＣがＨＮＦ４αの重要なモジュレーターとして同定されたことから、これらの分子に対して、抗体ベースのアッセイを、ＮＡＳＨまたはアルコール誘導肝硬変のために肝移植を受けた患者の肝臓から単離した初代ヒト肝細胞（チャイルド・ピュー「Ｂ」および「Ｃ」）または正常な対照肝細胞で実行した。ＨＮＦ４α発現は、ウェスタンブロットによって測定した場合（図８Ａ）、単離された対照ヒト肝細胞と比較して、非代償性肝臓検体で著しく低減した。肝不全が進行するに伴いＭＴＦ１発現においても有意差があった。さらに、単純線形回帰を使用したところ、チャイルド・ピューでスコア付けしたヒト肝細胞は、ＨＮＦ４αおよびＭＴＦ１のタンパク質発現と相関していたことから、ＨＮＦ４αおよびＭＴＦ１の両方が、肝不全の程度と有意に相関することが見出された（ｐ＝０．００７）（図８Ｂ～８Ｆ）。加えて、ＮＲ０Ｂ２のタンパク質発現（図９Ａ～Ｄ）、ＮＲ５Ａ２のタンパク質発現（図１０Ａ～Ｄ）、ＰＲＯＸ１のタンパク質発現（図１１Ａ～Ｄ）が、チャイルド・ピューＣの肝細胞においてより有意に低く、それらの発現は、肝細胞の機能障害の程度に相関していたことが見出された。

ＨＮＦ４αの核内発現および局在に対するこれらの同定された転写因子および調節因子の役割をさらに理解するために、ヒト肝細胞細胞株を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して遺伝子編集して、ＰＲＯＸ１またはＮＲ５Ａ２またはＮＲ０Ｂ２またはＭＴＦ１またはＳＲＥＢＰ１またはＥＰ３００およびＰＯＭ１２１Ｃのいずれかの発現をノックアウト（ＫＯ）した（図１５Ａ～Ｂ）。ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００またはＰＯＭ１２１ＣのＫＯによって、ＨＮＦ４αの核内発現の有意な低減が起こったことが見出された（図１５Ａ）。ＰＲＯＸ１またはＳＲＥＢＰ１がＫＯされた場合、ＨＮＦ４αの特に高い非核発現が観察された。終末期肝不全を有するヒト肝細胞での以前の研究において、細胞質におけるＨＮＦ４αの発現が同様に同定された。さらに、ＨＮＦ４αの誘導された核内発現に対する、ＨＮＦ４α単独の効果、またはＰＲＯＸ１もしくはＮＲ５Ａ２もしくはＮＲ０Ｂ２もしくはＭＴＦ１もしくはＳＲＥＢＰ１もしくはＰＯＭ１２１Ｃのいずれかと組み合わせたＨＮＦ４αの効果を試験するために、肝移植を受けたＮＡＳＨによる終末期肝不全を有する患者の外植された肝臓から単離したヒト肝細胞への処理を実行した（図１６）。いずれかのＨＮＦ４α－ＡＡＶ単独での処理の９６時間後に、ＨＮＦ４αの核内発現において、対照と比較して約１倍の増加が見出された（ＧＦＰ－ＡＡＶ）。しかしながら、ＨＮＦ４α－ＡＡＶ処理をＰＲＯＸ１－ＡＡＶまたはＮＲ５Ａ２－ＡＡＶまたはＮＲ０Ｂ２－ＡＡＶまたはＭＴＦ１－ＡＡＶまたはＳＲＥＢＰ１－ＡＡＶまたはＰＯＭ１２１Ｃ－ＡＡＶのいずれかと組み合わせた場合、すべての組合せが、特に組合せがＨＮＦ４αに加えてＰＲＯＸ１またはＳＲＥＢＰ１を含む場合、ＨＮＦ４αの核内発現を有意に誘導した（図１６）。

したがって、本研究は、転写因子および調節因子ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００およびＰＯＭ１２１Ｃは、終末期肝不全を有する硬変した肝細胞においてＨＮＦ４αの核内発現を改善することを実証する。さらに、この結果は、ＨＮＦ４αを１つまたは１つより多くの転写因子および調節因子（ＰＲＯＸ１またはＮＲ５Ａ２またはＮＲ０Ｂ２またはＭＴＦ１またはＳＲＥＢＰ１またはＥＰ３００およびＰＯＭ１２１Ｃ）と共に含むすべての組合せが、ＨＮＦ４αの核内発現およびその再プログラミング能力を強化して、終末期肝不全を治療することを示す。

参考文献:

Claims

それを必要とする対象において肝疾患を治療する方法であって、前記対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量または機能を増加させる、方法。
前記組成物がベクターであり、前記ベクターが、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
前記組成物がベクターであり、前記ベクターが、ＰＲＯＸ１および／またはＳＲＥＢＰ１をコードする１つまたは複数の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸が、ＤＮＡまたはｍＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物の前記投与が、前記対象における肝細胞の核のＨＮＦ４αの量を増加させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物の前記投与が、前記肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物の前記投与が、前記肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記対象にＨＮＦ４αをコードする核酸を含むベクターを投与することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸が、ＨＮＦ４αアイソフォーム２（Ｐ１）をコードする、請求項８または９に記載の方法。
ＨＮＦ４αをコードする前記核酸が、配列番号１を含む、請求項８または９に記載の方法。
前記肝疾患が、肝線維症、肝硬変、肝がん、または末期肝疾患である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記肝疾患が肝硬変である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
それを必要とする対象において肝疾患を治療する方法であって、前記対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、ＤＮＡＪＢ１／ＨＳＰ４０、ＡＴＦ６、ＡＴＦ４、およびＰＥＲＫからなる群から選択される１つまたは複数の転写因子の量を減少させるか、またはその機能を抑制する、方法。
前記組成物が核酸である、請求項１５に記載の方法。
前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
前記核酸の前記投与が、前記対象における肝細胞の核のＨＮＦ４αの量を増加させる、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物の前記投与が、前記肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させない、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物の前記投与が、前記肝細胞のＨＮＦ４αの総量を増加させる、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、ＨＮＦ４αをコードする核酸をさらに含む、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
前記対象にＨＮＦ４αをコードする核酸を含むベクターを投与することをさらに含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸が、ＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする、請求項２１または２２に記載の方法。
ＨＮＦ４αをコードする前記核酸が、配列番号１を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
前記肝疾患が、肝線維症、肝硬変、肝がん、または末期肝疾患を含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の方法。
ベクターを含む組成物であって、前記ベクターが、ＰＲＯＸ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ０Ｂ２、ＭＴＦ１、ＳＲＥＢＰ１、ＥＰ３００、およびＰＯＭ１２１Ｃ、ならびにその機能的断片からなる群から選択される１つまたは複数の転写因子をコードする１つまたは複数の核酸を含む、組成物。
ＨＮＦ４αをコードする核酸を含む別のベクターをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
ＨＮＦ４αをコードする前記核酸が、配列番号１を含む、請求項２８に記載の組成物。
それを必要とする対象において肝疾患を治療する方法であって、前記対象にＨＮＦ４αアイソフォーム２をコードする核酸を含むベクターを投与することを含む方法。
前記核酸が、配列番号１を含む、請求項３０に記載の方法。
前記肝疾患が、肝線維症、肝硬変、肝がん、または末期肝疾患である、請求項３０または３１に記載の方法。
前記肝疾患が肝硬変である、請求項３２に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。