KR100566859B1 - Ｒｎａ-단백질 융합물을 이용한 단백질의 선별 - Google Patents

Abstract

본원에 개시된 것은 RNA-단백질 융합물을 이용한 단백질 분자의 선별 방법 및 시약이다.

RNA-단백질 융합물, 펩타이드 억셉터, 분리, DNA 사본, 단백질 분자, 선별

Description

ＲＮＡ-단백질 융합물을 이용한 단백질의 선별{SELECTION OF PROTEINS USING RNA-PROTEIN FUSIONS}

본 발명은 단백질 선별 방법(protein selection method)에 관계한다.

본 발명은 F32 GM17776-01 및 F32 GM17776-02 기금하에 정부의 후원에 의해 성안되었으므로, 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.

현재 RNA 및 DNA 분자들의 분리에 이용되고 있는 방법들은 이들의 기능에 기초하는 것이다. 예를 들어, 엘링턴 및 쇼스탁의 실험(Nature 346:818 (1990); 및 Nature 355:850 (1992)) 및 투에르크 및 골드의 실험(Science 249:505 (1990); 및 J. Mol. Biol 222:739 (1991))은 목적으로 하는 특성을 갖는 매우 드문 (즉, 1/10¹³ 미만) 핵산 분자들이 선별과 증폭을 반복함으로써 복잡한 분자들의 풀(pool)로부터 분리될 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 방법들은 종래의 유전자 선별 방법에 비해 (ⅰ) 아주 큰 후보 풀(candidate pool)(>10¹⁵)을 스크리닝할 수 있고, (ⅱ) 숙주 생존능력 및 생체내(in vivo) 조건에 관계 없고, 그리고 (ⅲ) 생체내 유전자 스크리닝이 존재하지 않는 경우에 조차도 선별을 행할 수 있다는 이점을 제공한다. 생체외(in vitro) 선별은 매우 특이적인 단백질 결합 기능(예컨대, Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J.Mol. Biol 222:739 (1991); Oliphant et al., Mol. Cell Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et al., Science 250:1104 (1990); Pollock and Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen and Bach, Nuc. Acids Res. 18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529 (1991); Stormo and Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5699 (1991); 및 Bock et al., Nature 355:564 (1992) 참조), 소분자 결합 기능(Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990); Ellington and Szostak, Nature 355:850 (1992)), 및 촉매 기능(Green et al., Nature 347:406 (1990)); Robertson and Joyce, Nature 344:467 (1990); Beaudry and Joyce, Science 257:635 (1992); Bartel and Szostak, Science 261:1411 (1993); Lorsch and Szostak, Nature 371:31-36 (1994); Cuenoud and Szostak, Nature 375:611-614 (1995); Chapman and Szostak, Chemistry and Biology 2:325-333 (1995); 및 Lohse and Szostak, Nature 381:442-444 (1996))을 갖는 신규한 RNA 및 DNA 서열들을 규명하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 유사한 단백질의 선별 및 증폭을 위한 스킴들이 많이 소개된 바 있다.

[발명의 요약]

본 발명의 목적은 생체외 선별(in vitro selection) 및 생체외 진화(in vitro evolution)의 원리가 단백질에 적용될 수 있게 하는 것이다. 본 발명에 의하면 일부분 또는 전체가 랜덤한 아미노산 서열로 되어 있는 큰 풀(pool)로부터 목적으로 하는 특성을 갖는 단백질을 쉽게 선별해 낼 수 있다. 또한, 본 발명은 단백질 분자에 mRNA 코드화 서열을 공유결합시킴으로써 단백질 서열 정보의 회수와 증폭의 문제를 해결한다.

일반적으로, 본 발명의 방법은 그 자신의 mRNA의 3' 말단에 공유결합되어 있는 단백질, 즉, RNA-단백질 융합물을 만들어내는 생체외 또는 인 시츄 전사/해독 프로토콜(in situ transcription/translation protocol)로 구성된다. 이것은 그 자신의 3' 말단에 펩타이드 억셉터(acceptor)가 부착되어 있는 mRNA의 합성 및 생체외 또는 인 시츄 해독에 의해 달성된다. 하나의 바람직한 펩타이드 억셉터는 성장하는 펩타이드 사슬의 C-말단에 부착하여 해독을 종결시키는 뉴클레오시드 아날로그인 퓨로마이신이다. 하나의 바람직한 설계에서는, 메세지의 말단과 리보좀을 개방 해독틀의 말단에서 일시 정지시키도록 설계된 펩타이드 억셉터의 사이에 DNA 서열이 포함되어, 펩타이드 억셉터(예컨대, 퓨로마이신)가 펩타이드-tRNA 연결의 가수분해 이전에 성장 초기의 펩타이드 사슬을 받아 들일 여분의 시간을 제공한다.

원하는 경우, 단백질 서열 정보는 역전사 및 증폭(예컨대, PCR에 의한 증폭은 물론 3SR 또는 TSA와 같은 RNA-기반 증폭 기술을 포함하는 기타의 여러 가지 증폭기술)에 의해 회수될 수 있기 때문에, 결과되는 RNA-단백질 융합물은 반복적으로 여러 라운드 선별 및 증폭될 수 있다. 이어서 증폭된 핵산은 전사, 변형, 및 생체외 또는 인 시츄 해독되어 다음 라운드의 선별을 위해 RNA-단백질 융합물을 생산할 수 있다. 여러 라운드의 선별 및 증폭을 수행할 수 있는 능력은 예컨대, 10¹⁵ 멤버 풀중의 하나의 목적 분자와 같이 매우 희귀한 분자의 농후화(enrichment) 및 분리를 가능하게 한다. 이로 인해 임의의 표적을 특이적으로 인식하거나 또는 목적으로 하는 화학반응을 촉매하는 신규하거나 개량된 단백질의 분리도 가능해진다.

따라서, 본 발명의 첫번째 양상에 있어서, 본 발명은 목적으로 하는 단백질의 선별 방법을 특징으로 하는데, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열(candidate protein coding sequence)에 작동가능하도록 연결되어 있는(operably linked) 해독 개시 서열(translation initiation sequence)과 개시 코돈(start codon)을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들(candidate RNA molecules)의 집단을 제공하는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물(candidate RNA-protein fusions)의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 선별하여 목적으로 하는 단백질을 선별해내는 단계.

관련 양상에 있어서, 본 발명은 목적으로 하는 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 선별 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억 셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계; (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 선별하는 단계; 및 (d) 융합물의 RNA 부분으로부터 목적 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 생성하는 단계.

다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 아래의 단계들을 포함하는, 기준이 되는 단백질(reference protein)에 비해 변화된 기능을 수행하는 단백질의 선별방법을 특징으로 한다: (a) DNA 주형의 집단으로부터 후보 RNA 분자들의 집단을 만드는 단계로서, 여기서 상기 후보 DNA 주형들은 각자 기준이 되는 단백질 코드화 서열과는 상이한 후보 단백질 코드화 서열을 갖고, 상기 RNA 분자들은 각각 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 만드는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 변화된 기능을 갖는 RNA-단백질 융합물을 선별하여, 변화된 기능을 갖는 단백질을 선별해내는 단계.

또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 아래의 단계들을 포함하는, 기준 단백질에 비해 변화된 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 선별 방법을 특징으로 한다: (a) 후보 DNA 주형의 집단으로부터 후보 RNA 분자들의 집단을 만드는 단계로서, 여기서 상기 후보 DNA 주형들은 각자 기준 단백질 코드화 서열과는 상이한 후보 단백질 코드화 서열을 갖고, 상기 RNA 분자들은 각각 후보 단백질 코드화 서 열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 만드는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계; (c) 변화된 기능을 갖는 RNA-단백질 융합물을 선별하는 단계; 및 (d) 융합물의 RNA 부분으로부터 변화된 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 생성하는 단계.

또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 목적으로 하는 RNA 분자를 선별하는 방법을 특징으로 한다: (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 선별하여 목적으로 하는 RNA를 선별해내는 단계.

본 발명 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 펩타이드 억셉터는 퓨로마이신이고; 후보 RNA 분자들 각각은 일시 정지 서열(pause sequence)을 추가로 포함하거나 상기 RNA의 3' 말단에 공유결합되어 있는 DNA 또는 DNA 유사 서열(analog sequence)을 추가로 포함한다; 후보 RNA 분자들의 집단은 적어도 10⁹, 바람직하게 적어도 10¹⁰, 더욱 바람직하게, 적어도 10¹¹, 10¹² 또는 10¹³, 그리고 가장 바람직하게 적어도 10¹⁴개의 상이한 RNA 분자들을 포함한다; 생체외 해독 반응은 진핵세포 또는 그의 일부분으로부터 제조된 세포 용해물(lysate)에서 행해진다(예를 들어, 망상적혈구 용해물 또는 밀 유아 용해물(wheat germ lysate)에서 수행된다); 생체외 해독 반응은 원핵세포(예컨대, 이. 콜라이) 또는 그의 일부분으로부터 제조된 추출물에서 행해진다; 선별 단계는 목적 단백질을 고정된 바인딩 파트너(immobilized binding partner)에 결합시키는 단계를 포함하고, 선별 단계는 목적 단백질의 기능적 활성을 검사하는 분석 단계를 포함한다; DNA 분자들은 증폭되고; 상기 방법은 상기 선별방법의 단계들을 반복하는 과정을 포함한다; 상기 방법은 DNA 분자로부터 RNA 분자를 전사시키는 단계 및 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 과정을 추가로 포함한다; 생체외 해독 단계 다음에, 상기 방법은 50-100 mM Mg²⁺의 존재하에서 수행되는 인큐베이션 단계를 추가로 포함하며; RNA-단백질 융합물은 펩타이드 억셉터에 가까이 위치된 유연성(flexibility)을 향상시키는 핵산 또는 핵산 유사 서열(nucleic acid analog sequence)을 추가로 포함한다.

다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 상술한 방법들 가운데 임의의 방법에 의해 선별된 RNA-단백질 융합물; 아미노산 서열에 아미드 결합(amide bond)을 통해 공유결합되어 있는 리보핵산으로서, 상기 아미노산 서열이 상기 리보핵산 서열에 의해 코드화되는 리보핵산; 및 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고, 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터(예를 들어, 퓨로마이신)에 작동가능하도록 연결되어 있는 리보핵산을 특징으로 한다.

두 번째 양상에 있어서, 본 발명은 서열 풀(sequence pool)의 농후화(enrichment)를 통한 목적 단백질 또는 목적 RNA의 선별방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계; (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계; 및 (c) RNA-단백질 융합물의 집단을, 바인딩 파트너-RNA-단백질 융합물 복합체와 결합되지 않은 집단의 멤버들을 실질적으로 구별할 수 있는 조건하에서, RNA-단백질 융합물의 RNA 부분 또는 단백질 부분중 어느 하나에 대해 특이적인 바인딩 파트너(binding partner)와 접촉시키는 단계; (d) 복합체로부터 결합된 RNA-단백질 융합물을 떼어내는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 수득된 RNA-단백질 융합물의 집단을, 바인딩 파트너-RNA-단백질 융합물 복합체와 결합되지 않은 집단의 멤버들을 실질적으로 구별할 수 있는 조건하에서, 목적 RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너와 접촉시켜, 목적으로 하는 RNA 및 목적 단백질을 선별해내는 단계.

바람직한 구현예에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 과정을 추가로 포함한다. 또한, 이러한 반복 단계에서는, 목적 RNA-단백질 융합물의 선택적인 농후화를 위해 임의의 순서로 동일 또는 상이한 바인딩 파트너가 이용 될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에 있어서, 단계 (d)는 목적 융합물의 단백질 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너(예컨대, 단클론 항체)의 이용을 포함한다. 이 단계는 바람직하게 융합물의 RNA 부분을 역전사하여 목적 단백질을 코드화하는 DNA를 생성하는 과정을 수행한다. 이러한 농후화 기술은 목적 단백질을 선별하는데 이용되거나 기준 단백질에 비해 변화된 기능을 갖는 단백질을 선별하는데 이용될 수 있다.

농후화 방법의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 펩타이드 억셉터는 퓨로마이신이고; 후보 RNA 분자들 각각은 일시 정지 서열(pause sequence)를 추가로 포함하거나 상기 RNA의 3' 말단에 공유결합되어 있는 DNA 또는 DNA 유사 서열(analog sequence)을 추가로 포함한다; 후보 RNA 분자들의 집단은 적어도 10⁹, 바람직하게 적어도 10¹⁰, 더욱 바람직하게, 적어도 10¹¹, 10¹² 또는 10¹³, 그리고 가장 바람직하게 적어도 10¹⁴개의 상이한 RNA 분자들을 포함한다; 생체외 해독 반응은 진핵세포 또는 그의 일부분으로부터 제조된 세포 용해물(lysate)에서 행해진다(예를 들어, 망상적혈구 용해물 또는 밀 유아 용해물(wheat germ lysate)에서 수행된다); 생체외 해독 반응은 원핵세포(예컨대, 이. 콜라이) 또는 이들의 일부로부터 제조된 추출물에서 행해진다; DNA 분자들은 증폭되고; 바인딩 파트너들중 적어도 하나는 고체 지지체(solid support)에 고정되며; 생체외 해독 단계 다음에, 상기 방법은 50-100 mM Mg²⁺의 존재하에서 수행되는 인큐베이션 단계를 추가로 포함하며; RNA-단백 질 융합물은 펩타이드 억셉터에 가까이 위치된 유연성(flexibility)을 향상시키는 핵산 또는 핵산 유사 서열을 추가로 포함한다.

관련 양상에 있어서, 본 발명은 본원에 설명된 선별방법들중 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 특징으로 한다.

세 번째 최종 양상에 있어서, 본 발명은 RNA-단백질 융합물과 혼성화되는 고정된 단일-가닥 핵산의 어레이를 포함하는 마이크로칩(microchip)을 특징으로 한다. 바람직하게, RNA-단백질 융합물의 단백질 성분은 RNA에 의해 코드화된다.

본원에서 이용될 때, "집단(population)"이라는 용어는 하나 이상의 분자(예컨대, 하나 이상의 DNA, RNA, 또는 RNA-단백질 융합 분자)를 의미한다. 본 발명의 방법은 바람직한 경우, 많은 수의 후보 분자들을 가지고 시작하는 분별을 용이하게 하기 때문에, 본 발명에 따른 "집단"은 바람직하게, 10⁹ 이상, 더욱 바람직하게, 10¹¹, 10¹² 또는 10¹³ 이상 그리고 가장 바람직하게 10¹⁴개 이상의 분자들을 의미한다.

본 발명에서 "선별(selecting)"이란 하나의 분자를 집단내의 다른 분자들로부터 구별해내는 것을 의미한다. 본원에서 이용될 때, "선별" 단계는 선별 단계의 완료시 목적으로 하는 분자가 집단내의 목적으로 하지 않는 분자에 비해 적어도 2배, 바람직하게 30배, 더욱 바람직하게 100배, 가장 바람직하게 1000배 농후화되도록 한다. 본원에서, 선별 단계는 임의의 횟수 만큼 반복실시될 수 있고 상이한 유형의 선별 단계들이 주어진 방법에 함께 이용될 수 있다.

"단백질"이란 두개 이상의 천연 또는 변형된 아미노산들(naturally occurring or modified amino acids)이 하나 이상의 펩타이드 결합에 의해 연결된 것을 의미한다. 본원에서 "단백질" 및 "펩타이드"는 호환적으로 사용된다.

"RNA"란 두개 이상의 공유결합된, 천연 또는 변형된 리보뉴클레오티드(naturally occurring or modified ribonucleotides)를 의미한다. 이러한 용어에 포함되는 변형된 RNA의 일례는 포스포로티오에이트 RNA(phosphorothioate RNA)이다.

"해독 개시 서열(translation initiation sequence)"은 기능적인 리보좀 진입 부위(fuctional ribosome entry site)를 제공할 수 있는 임의의 서열을 의미한다. 세균 시스템에서, 이러한 영역은 때로 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence)이라고도 한다.

"개시 코돈"은 단백질 코드화 서열의 시작을 신호하는 3 염기들을 의미한다. 일반적으로, 이러한 염기들은 AUG(또는 ATG)이지만; 이러한 방법으로 이용될 수 있는 임의의 다른 3 염기 트리플렛들로 대체될 수 있다.

펩타이드 억셉터에 "공유결합된"이란 표현은 펩타이드 억셉터가 직접적으로 공유결합에 의해 또는 다른 공유결합된 서열(예컨대, 일시 정지 부위에 상당하는 DNA)을 통해 간접적으로 "단백질 코드화 서열"에 결합되어 있는 것을 의미한다.

"펩타이드 억셉터(peptide acceptor)"란 리보좀 펩티딜 트랜스페라제 기능(ribosomal peptidyl transferase function)의 촉매 활성에 의해 성장하는 단백질 사슬(growing protein chain)의 C-말단에 부가될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 전형적으로, 이러한 분자들은 (ⅰ) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드-유사 부분(예컨대, 아데노신 또는 아데노신 아날로그(N-6 아미노 위치에서 디-메틸화된 것이 허용가능하다)), (ⅱ) 아미노산 또는 아미노산 유사 부분(예컨대, 20 D- 또는 L-아미노산들 또는 이들의 임의의 아미노산 아날로그(예컨대, Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991에 의해 기술된 O-메틸 티로신 또는 임의의 아날로그), 및 (ⅲ) 둘 사이의 결합(예컨대, 3' 위치 또는 덜 바람직하지만, 2' 위치에서의 에스테르, 아미드, 또는 케톤 결합)을 보유하며; 바람직하게, 이러한 결합은 천연 리보뉴클레오티드 형태의 고리의 퍼커(pucker)를 해하지 않는다. 펩타이드 억셉터는 친핵체(nucleophile)를 포함할 수 있는데, 이들은 제한 없이, 아미노기, 수산기, 또는 설프히드릴기일 수 있다. 또한, 펩타이드 억셉터는 뉴클레오티드 미메틱(mimetics), 아미노산 미메틱, 또는 결합된 뉴클레오티드-아미노산 구조의 미메틱일 수 있다.

단백질 코드화 서열의 3' 말단에 펩타이드 억셉터가 위치된다는 것은 펩타이드 억셉터 분자가 단백질 코드화 서열의 최종 코돈 다음에 위치된다는 것을 의미한다. 이러한 용어는, 제한 없이, 정확하게 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 위치된 펩타이드 억셉터 분자는 물론 최종 코돈으로부터 중간에 끼어 있는 코드화 또는 비코드화 서열(예컨대, 일시 정지 서열에 해당하는 서열)에 의해 떨어져 있는 억셉터 분자도 포함한다. 이러한 용어는 코드화 또는 비코드화 서열들이 펩타이드 억셉터 분자 다음에 존재하는(즉, 3' 쪽에 위치) 구조체들도 포함한다. 더욱이, 이러한 용어는, 제한 없이, 단백질 코드화 서열에 공유결합되어 있는(직접 또는 중간에 끼어 있는 핵산 서열에 의해 간접적으로) 펩타이드 억셉터 분자는 물론 몇몇 비공유결합 수단, 예컨대, 단백질 코드화 서열의 3'에 또는 그 근방에 결합하여 그 자체가 펩타이드 억셉터 분자에 결합되는 제 2의 핵산 서열을 이용한 혼성화에 의해 단백질 코드화 서열에 연결되어 있는 것도 포함한다.

"변화된 기능(altered function)"이란 분자의 기능상의 질적 또는 양적인 변화를 의미한다.

"일시 정지 서열(pause sequence)"은 리보좀의 해독 속도를 느리게 하거나 멈추게 만드는 핵산 서열을 의미한다.

본원에서 이용될 때, "바인딩 파트너(binding partner)"란 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물의 일부분에 대해서 특이적인, 공유결합적 또는 비공유결합적 친화성을 갖는 임의의 분자를 의미한다. 바인딩 파트너의 예들은, 제한 없이, 항원/항체 쌍, 단백질/억제제 쌍, 수용체/리간드 쌍(예컨대, 호르몬 수용체/펩타이드 호르몬 쌍과 같은 세포 표면 수용체/리간드 쌍), 효소/기질 쌍(예컨대, 키나제/기질 쌍), 렉틴/탄수화물 쌍, 올리고머 또는 헤테로올리고머 단백질 집합체, DNA 결합 단백질/DNA 결합 부위 쌍, RNA/단백질 쌍, 및 핵산 듀플렉스, 헤테로듀플렉스 또는 리게이션된 가닥들의 멤버들은 물론 RNA-단백질 융합물의 임의의 부분과 하나 이상의 공유 또는 비공유결합(예컨대, 이황화 결합)을 형성할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 바인딩 파트너들은, 제한 없이, 도 2에 도시된 "선별 모티브(selection motifs)"들중 임의의 것을 포함한다.

"고체 지지체(solid support)"란, 제한 없이, 친화성 복합체(affinity complex)가 직접 또는 간접적으로(예컨대, 다른 항체 또는 다른 단백질 A와 같은 다른 바인딩 파트너 매개체를 통해서) 결합되거나 그 안에 친화성 복합체가 함입(embedding)될 수 있는(예컨대, 수용체 또는 채널을 통해서) 컬럼(또는 컬럼 재료), 비드, 시험관, 마이크로타이터 디쉬, 고체 입자(예컨대, 아가로스 또는 세파로스), 마이크로칩(예컨대, 실리콘, 실리콘-유리, 또는 금 칩), 또는 막(예컨대, 리포좀 또는 소포(visicle)의 막)을 의미한다.

본 발명은 많은 중요한 이점들을 제공한다. 먼저, 단백질의 분별 및 증폭을 위한 이러한 유형의 스킴의 첫 번째 예는 목적으로 하는 분리된 단백질에 상당하는 뉴클레오티드 서열의 회수(단지 핵산만이 복제될 수 있기 때문에)에 의해 야기되는 문제점을 극복하게 해 준다. 특히, 일부 또는 전부가 랜덤한 풀로부터 단백질들을 분리해내는 많은 선행 기술상의 방법들은 생체내 단계(in vivo step)를 통해서 이와 같은 것을 행하여 왔다. 이러한 종류의 방법들은 단클론 항체 기술(Milstein, Sci. Amer 243:66 (1980); 및 Schultz et al., J, Chem. Engng. News 68:26 (1990)); 파아지 디스플레이(Smith, Science 228:1315 (1985); Parmley and Smith, Gene 73:305 (1988); 및 McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)); 펩타이드-lac 리프레서(repressor) 융합(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 (1992)); 및 전통적인 유전자 분리 기술을 포함한다. 본 발명과 다르게, 이들 방법들은 모두 단백질과 핵산 사이의 토폴로지컬 링크(topological link)에 의존하여 단백질 정보를 보유하고 있으며 해독가능한 핵산 형태로 회수될 수 있다.

또한, 본 발명은, 여전히 리보좀 및 그의 mRNA와 복합체를 이루고 있는 성장 초기의(nascent) 단백질 사슬의 일부 특성에 대해 선별이 이루어지는 정지 해독 방법(stalled translation method)[Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol. 222:739 (1991); Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1844-1848 (1982); Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026(1994); Mattheakis et al., Meth. Enzymol. 267:195 (1996); 및 Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997)]을 능가하는 이점을 제공한다. 정지 해독 방법과 달리, 본 발명은 매우 깨지기 쉬워서 기술적으로 적용가능한 선별 타입을 제한하는 mRNA:리보좀:성장 초기 사슬의 3원 복합체의 완전성(integrity)의 유지에 의존하지 않는다.

본 발명의 방법은 브레너 및 러너(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992))에 의해 제안된, DNA-펩타이드 융합물을 만들고 유전 정보를 한 라운드의 선별 다음에 회수하는 브렌치 합성 방법(branched synthesis approach)을 능가하는 이점을 제공한다. 브렌치 합성 방법과 달리, 본 발명 방법은 융합물의 DNA 부분으로부터 펩타이드를 재생(브렌치 합성 방법에서는 개개의 라운드의 화학 합성에 의해 이루어지는)할 필요가 없다. 따라서, 본 발명 방법에 의하면 후보 분자들의 집단을 이용해서 선별 과정을 여러 라운드 반복할 수 있다. 또한, 일반적으로 꽤 짧은 서열의 선별에만 이용가능한 브렌치 합성 방법과 달리, 본 발명 방법은 상당히 긴 단백질 분자들의 선별에도 이용할 수 있다.

또 다른 이점으로, 본 발명의 선별 및 부위 지정 진화 기술(directed evolution)은 매우 크고 복잡한 후보 서열들의 도서관을 이용할 수 있다. 이와 반대로, 생체내 단계에 의존하는 기존의 선별 방법들은 전형적으로 어느 정도 제한된 복잡성을 갖는 비교적 작은 도서관에만 이용할 수 있어 사용가능한 범위가 제한된다. 본 발명의 이러한 이점은 예를 들어, 길이가 단지 10 아미노산 정도인 하나의 펩타이드에 대해 10¹³개의 가능한 서열이 존재하는 것을 고려할 때 기능적인 단백질 서열(functional protein sequence)을 선별할 때 특히 중요하다. lac 리프레서 융합 방법, 및 파아지 디스플레이 방법과 같은 전통적인 유전자 기술에 있어서, 최대한의 복잡성은 일반적으로 10¹³ 멤버들 미만의 범위이다. 큰 도서관 크기는 서열 공간(sequence space)이 주어진 개시 서열 주위로 심도 있게 조사될 수 있다는 점에서 부위지정 진화(directed evolution applications)에 대해서도 이점을 제공한다.

본 발명의 기술은 선별단계가 상황에 따라 달라지지 않는다는 점에서 종래 기술과 구별된다. 다른 많은 선별 스킴에서는, 예컨대, 발현된 단백질이 존재하는 상황과 같은 상황이 생성된 도서관의 특성에 크게 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 발현된 단백질은 특정 시스템에서는 잘 발현되지 않거나 적절하게 디스플레이(예컨대, 파아지 입자의 표면에) 되지 않을 수 있다. 그렇지 않으면, 단백질의 발현은 선별 사이클의 하나 이상의 중요한 단계, 예컨대, 파아지의 생존능력, 감염력 또는 lac 리프레서 결합을 방해할 수 있다. 이러한 문제점들은 기능적인 분자가 손실되게 하거나 적용가능한 선별 과정의 특성을 제한할 수 있다.

끝으로, 본 발명 방법은 시험될 수 있는 단백질의 레퍼터리에 대한 대조표준을 제공하기 때문에 유익하다. 특정한 기술(예컨대, 항체 선별)에서, 출발 풀(starting pool)의 특성에 대한 대조표준은 거의 없거나 존재하지 않는다. 또 다른 기술(예컨대, lac 융합 및 파아지 디스플레이)에서, 후보 풀은 융합 단백질의 컨텍스트내에서 발현되어야 한다. 이와 대조적으로, RNA-단백질 융합 구조체들은 스크리닝에 이용가능한 후보 풀들의 특성에 대한 대조표준을 제공한다. 또한, 후보 풀의 크기는 생체외 해독 반응의 크기에 의해서만 제한되는 RNA 또는 DNA 풀(∼10¹⁵ 멤버들) 만큼 커질 가능성이 있다. 후보 풀의 메이크업은 실험 설계에 전적으로 의존하고; 랜덤 영역은 분리하여 또는 목적으로 하는 융합 단백질의 컨텍스트내에서 스크리닝될 수 있고, 전부 그런 것은 아니지만 대부분 서열들은 RNA-단백질 융합물들의 후보 풀내에서 발현될 수 있다.

본 발명의 다른 이점 및 특징들은 이하의 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

먼저 도면에 관하여 설명한다.

도 1a-1c는 RNA-단백질 융합물의 생산 단계들을 도시한 개략도이다. 도 1a는 융합물의 RNA 부분을 생산하기 위한 샘플 DNA 구조체를 도시한 것이다. 도 1b 는 RNA/퓨로마이신 컨쥬게이트의 생성을 도시한 것이다. 그리고 도 1c는 RNA-단백질 융합물의 생성을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 선별 프로토콜의 개략도이다.

도 3은 3' 퓨로마이신을 포함하는 최소 해독 주형(minimal translation templates)에 대한 합성 프로토콜의 개략도이다. 단계 (A)는 퓨로마이신의 반응성 작용기(5-OH 및 NH₂)에 보호기(protecting group)를 붙이는 과정을 도시한 것이고; 변형될 때, 이들 기들은 포스포아미디트-기초 올리고뉴클레오티드 합성(phosphoramidite based oligonucleotide systhesis)에 이용하기 위해 적절하게 보호된다. 보호된 퓨로마이신은 그의 3'-OH를 통해서 DNA를 부착하는 표준 기술을 이용하여 아미노헥실 조절 공극 유리(CPG; controlled pore glass)에 부착된다. 단계 (B)에서는, 43개의 뉴크레오티드들을 포함하는, 최소 해독 주형("43-P"라 한다)을 표준 RNA 및 DNA 화학(밀리포어, 베드포드, MA)을 이용하여 합성하고, NH₄OH 및 TBAF를 이용하여 탈보호하여 겔 정제한다. 상기 주형은 5' 말단에 13 염기의 RNA를 포함하고 그 다음에 그의 5'-OH 말단에 3' 퓨로마이신이 부착된 29 염기의 DNA가 이어진다. RNA 서열은 (ⅰ) 16S rRNA의 5 염기와 상보적인 샤인 달가르노 공통서열(Stomo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine and Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974); 및 Steitz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)), (ⅱ) 5 염기 스페이서, 및 (ⅲ) 단일의 AUG 개시 코돈을 포함한다. DNA 서열은 dA₂₇dCdCP이었고, 여 기서 "P"는 퓨로마이신을 뜻한다.

도 4는 보호 CPG-링크된(protected CPG-linked) 퓨로마이신의 바람직한 제조방법을 설명한 개략도이다.

도 5는 본 발명의 주형내에 메치오닌이 혼입되는 가능한 모드를 개략적으로도시한 것이다. 반응 (A)에 도시된 바와 같이, 주형과 리보좀이 결합되어 70S 개시 복합체(initiation complex)를 형성한다. Fmet tRNA는 P 부위에 결합하여 주형과 염기쌍을 형성한다. 주형의 3' 말단에 있는 퓨로마이신은 분자내 방식(intramolecular fashion)으로 A 부위로 들어가 펩티딜 트렌스페라제 센터를 통해 N-포밀 메치오닌에 아미드 결합되어 tRNA를 탈아실화한다. 반응물을 페놀/클로로포름 추출해보면 공유결합되어 있는 메치오닌을 포함하는 주형이 수득된다. 반응(B)는 바람직하지 않은 주형과 퓨로마이신 포함 올리고뉴클레오티드 사이의 분자간 반응을 도시한 것이다. 앞서 설명한 것과 마찬가지로, 최소 주형은 P 부위에 fmet tRNA가 결합되어 있는 70S 리보좀의 생성을 자극한다. 이 다음에는 제 2의 주형이 트랜스로 들어가 공유결합된 메치오닌을 제공한다.

도 6a-6h는 ³⁵S 메치오닌(³⁵S met)이 해독 주형내에 편입된 것을 보여주는 사진이다. 도 6a는 반응의 마그네슘(Mg²⁺) 의존성을 보여준다. 도 6b는 생성물의 염기 안정성(base stability)을 입증한다; 이 도면에 도시된 이동성의 변화는 43-P("Met 주형"이라고도 한다)의 5' RNA 서열을 상실하여 30-P-로 불리우는 DNA-퓨로마이신 부분을 생성한 것에 기인한다. 염기 처리후의 표지(label)의 보유는 ³⁵S 메치오닌과 주형의 3' 퓨로마이신 사이의 펩타이드 결합의 형성과 일치한다. 도 6c는 펩티딜 트랜스페라제 억제제의 존재하에서 생성물의 생성이 억제되는 것을 보여준다. 도 6d는 주형 코드화 서열에 대한 ³⁵S 메치오닌 편입의 의존성을 보여준다. 도 6e는 ³⁵S 메치오닌 편입의 DNA 주형 길이 의존성을 보여준다. 도 6f는 주형 43-P 및 25-P를 이용한 시스 대 트랜스 생성물(cis versus trans product) 생성을 설명한다. 도 6g는 43-P 및 13-P를 이용한 시스 대 트랜스 생성물 형성을 설명한다. 도 6h는 망상적혈구 용해물 시스템내에서의 43-P 및 30-P를 이용한 시스 대 트랜스 생성물 형성을 설명한다.

도 7a-7c는 펩타이드 융합물 생성 및 선별을 시험하기 위한 구조체의 개략도이다. 도 7a는 LP77("리게이션된-생성물(ligated-product)" "77" 뉴클레오티드 길이)("짧은 myc 주형"이라고도 한다)(서열 1)을 도시한 것이다. 이 서열은 5' 개시 코돈 및 3' 링커에 측접하는 c-myc 단클론 항체 에피톱 택 EQKLISEEDL(서열 2)를 포함한다(Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610-3616 (1985)). 5' 부위는 43-P와 동일한 세균 샤인 달가르노 서열을 포함한다. 코드화 서열은 세균 시스템에서 가장 잘 발현하도록 최적화되었다. 특히, 43-P 및 LP77의 5'UTRs은 16S rRNA의 5 염기와 상보적인 샤인 달가르노 공통서열(Steitz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975))을 포함하고 리보좀 단백질 서열과 마찬가지로 간격을 두고 떨어져 있다(Stomo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982)). 도 7b는 LP154(연결 생성물, 154 뉴클레오티드 길이)("긴 myc 주형"이라고도 한다)(서열 3)를 도시한 것이다. 이 서열은 c-myc 항체의 분리에 이용되는 펩타이드의 생성을 위한 코드를 포함한다. 5' 말단은 TMV 상류 서열("TE"라 한다)의 트룬케이션된 버젼을 포함한다. 이러한 5'UTR은 두 개의 ACAAAUUAC 반복부위를 포함하는 TMV 5'UTR로부터 유래된 22 뉴클레오티드 서열을 포함한다(Gallie et al., Nulc. Acids Res. 16:883 (1988)). 도 7c는 펩타이드 선별에 이용되는 예시적 서열(examplary sequence)인 풀 #1(서열 4)를 도시한 것이다. 본래의 myc 펩타이드의 맨 끝에 있는 7 아미노산은 주형의 PCR 증폭을 위해 요구되는 3' 불변 부위로 기능하도록 주형에 포함되었다. 이 서열은 항체 결합 에피톱의 일부분이 아닌 것으로 알려져 있다.

도 8은 주형 43-P, LP77, 및 LP154, 그리고 망상적혈구("Retic") 및 밀 유아("Wheat") 해독 시스템을 이용한 RNA-단백질 융합물의 합성을 보여주는 사진이다. 도면의 왼쪽 반은 세 가지 주형의 각각에 ³⁵S 메치오닌이 편입된 것을 도시한 것이다. 도면의 오른쪽 반은 RNA 부호화 영역을 제거하기 위해 세 가지 주형 각각을 RNase 처리한 후 그 결과로 수득한 생성물을 나타낸 것이다; 도시된 것은 ³⁵S 메치오닌-표지된 DNA-단백질 융합물이다. 각각의 DNA 부분은 올리고 30-P와 동일하였다. 따라서, 이동거리상의 차이는 코드화 서열의 길이에 비례하는데, 이는 각 경우에 길이가 다른 단백질의 존재와 일치한다.

도 9는 LP154로부터 합성되고 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분석된 RNA-단백질 융합물의 프로테아제 민감성을 보여주는 사진이다. 레인 1은 ³²P-표지된 30-P를 포함한다. 레인 2-4, 5-7 및 8-10은 각각 처리하지 않은, RNase 처리한, 또는 RNase와 프로테인아제 K 처리한 망상적혈구 용해 반응물로부터 회수된 ³⁵S -표지된 해독 주형들을 포함한다.

도 10은 생체외 해독된 33 아미노산 myc-에피톱 단백질을 이용한 면역침강반응의 결과를 보여주는 사진이다. 레인 1 및 레인 2는 각각 myc-에피톱 단백질 및 β-글로빈 주형의 해독 생성물을 나타낸다. 레인 3-5는 각각 myc 단클론 항체 및 PBS, DB, PBSTDS 세정 버퍼를 이용한 면역침강반응의 결과이다. 레인 6-8은 β-글로빈 해독 생성물을 이용한 것을 제외하고는 동일한 면역침강반응의 결과이다.

도 11은 생체외 해독 반응으로부터의 RNA-단백질 융합물의 면역침강반응을 보여주는 사진이다. 반응에 이용된 주형의 피코몰(picomoles)을 표기하였다. 레인 1-4는 RNA124(융합 LP154의 RNA 부분)이고 레인 5-7은 RNA-단백질 융합 LP154이다. c-myc 단클론 항체와 G 세파로스를 이용한 면역침강 이후에, 샘플들을 RNase A 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리하고나서 융합을 육안으로 확인하기 위해 변성 요소 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하였다. 주형을 포함하지 않거나 긴 myc 주형(RNA124)의 RNA 부분만을 포함하는 샘플에 해당하는, 레인 1-4에서는, 융합이 관찰되지 않았다. 레인 5-7에서는, 융합물에 해당하는 밴드가 선명하게 나타났다. ³²P-표지된 30-P의 위치를 나타내었고, 투입된 주형의 양도 도면의 상단에 나타내었다.

도 12는 생체외 해독 반응으로부터 수득된 융합물의 정량 결과를 도시한 그 래프도이다. 도 11의 레인 5-7에 도시된 융합 밴드 및 30-P 밴드(도시하지는 않았지만 dT₂₅에 대해 같은 방식으로 분리된)의 강도는 포스포이메이져 플레이트(phosporimager plate)상에서 정량하여 입력된 LP154 농도에 대한 함수로 플로팅하였다. 회수된 변형 30-P(왼쪽 y축)는 입력 주형(x 축)에 선형으로 비례한 반면에, 링커-펩타이드 융합물(오른쪽 y축)은 일정하였다. 이러한 분석 결과로부터, 해독 반응 샘플당 ∼10¹² 융합물들이 생성되었음을 산출하였다.

도 13은 티오프로필 세파로스 및 dT₂₅ 아가로스 및 이들 기질들의 본 발명의 RNA-단백질 융합물과 상호작용하는 능력을 도시한 개략도이다.

도 14는 본 발명의 융합물의 순차적인 분리 결과를 보여주는 사진이다. 레인 1은 ³²P-표지된 30-P를 포함한다. 레인 2 및 3은 해독반응물로부터 분리되고 RNase 처리된 LP154에 대한 것이다. 레인 2에서, LP154는 티오프로필 세파로스에 이어 dT₂₅ 아가로스에 의해 순차적으로 분리되었다. 레인 3은 dT₂₅ 아가로스만을 이용한 분리결과이다. 이러한 결과들은 생성물이 myc 에피톱 코드화 서열의 끝에서 두 번째 시스테인과 마찬가지로 유리된 티올을 포함하였다는 것을 가리킨다.

도 15a 및 15b는 β-글로빈 주형을 이용한 융합물의 생성을 SDS-트리신-PAGE(폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의해 분석한 결과 사진이다. 도 15a는 주형이 없는 경우(레인 1), syn-β-글로빈 주형(레인 2-4) 또는 LP-β-글로빈 주형(레인 5-7)중 어느 하나의 ³⁵S의 편입을 나타낸 것이다. 도 15b(레인들은 도 15a에서와 같이 표지되었다)는 올리고뉴클레오티드 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된 ³⁵S-표지된 재료들을 나타낸다. 30-P 테일(tail)이 없는 상태에서는(레인 2-4) 어떠한 재료도 분리되지 않았다.

도 16a 내지 16c는 생체외 선별에 의한, 풀 dsDNA에 대한 myc dsDNA의 농후화를 설명한 다이어그램 및 사진이다. 도 16a는 선별 프로토콜의 개략도이다. myc 및 풀 주형의 4 가지 혼합물을 생체외 해독시키고 dT₂₅ 아가로스상에서 분리한 후 TP 세파로스에서 분리하여 변형되지 않은 주형으로부터 주형 융합물을 정제하였다. 이어서 mRNA-펩타이드 융합물을 주형내에 존재하는 제 2 또는 제 3의 구조체가 존재하는 것을 막기 위해 역전사시켰다. 친화성 선별(affinity selection) 이전(도 16b) 및 이후(도 16c)에 각 혼합물의 분취량들을 취하여, 표지된 프라이머의 존재하에서 PCR 증폭시키고 myc DNA 만을 절단하는 제한효소를 가지고 절단하였다. 입력된 주형 혼합물들은 순수한 myc(레인 1), 또는 1:20, 1:200, 또는 1:2000 myc:풀(레인 2-4)이었다. 선별되지 않은 물질은 myc 주형의 선호 해독(preferential translation) 및 역전사로 인해서 입력 비율(input ratio)로부터 벗어났다. 선별 단계중의 myc 주형의 농후화는 선별 이전 및 이후의 풀:myc 비율의 변화로 측정하였다.

도 17은 myc RNA 주형들의 해독을 나타낸 사진이다. 다음의 링커들이 이용되었다: 레인 1-4, dA₂₇dCdCP; 레인 5-8, dA₂₇rCrCP; 및 레인 9-12, dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP. 각 레인에서, RNA 주형의 농도는 600nM이었고, ³⁵S-Met이 표지를 위해 이용되었다. 반응조건은 다음과 같았다: 레인 1, 5, 9, 30℃에서 1시간; 레인 2, 6, 및 10, 30℃에서 2시간; 레인 3, 7, 및 11, 30℃에서 1시간, -20℃에서 16시간; 및 레인 4, 8 및 12, 50 mM Mg²⁺ 존재하에서 30℃에서 1시간, -20℃에서 16시간. 이 도면에서 "A"는 유리된 펩타이드를 의미하고, "B"는 mRNA-펩타이드 융합물을 의미한다.

도 18은 ³²P-표지된 myc RNA 주형의 해독을 설명한 사진이다. 이용된 링커는 dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP이었다. 해독은 30℃에서 90분간 수행되었고 인큐베이션은 Mg²⁺ 존재하지 않는 상태에서 -20℃에서 2일간 행하였다. mRNA 주형의 농도는 400nM(레인 3), 200nM(레인 4), 100nM(레인 5), 및 100nM(레인 6)이었다. 레인 1은 ³⁵S-Met에 의해 표지된 mRNA-펩타이드 융합물이고, 레인 2는 ³²P-표지된 mRNA를 나타낸 것이다. 레인 6에서, 반응은 0.5 mM 캡 아날로그(cap analog)가 존재하는 상태에서 이루어졌다.

도 19는 Ambion(레인 1), Novagen(레인 2), 및 Amersham(레인 3)으로부터 입수한 용해물을 이용한 myc RNA 주형의 해독을 도시한 사진이다. 이용된 링커는 dA₂₇dCdCP이었다. RNA 주형의 농도는 600nM이었고, ³⁵S-Met이 표지를 위해 이용되었다. 해독은 30℃에서 1시간 동안 수행되었고 인큐베이션은 50 mM Mg²⁺이 존재하는 상태하 -20℃에서 밤새 행하였다.

본원에 설명된 것은 단백질들이 그들 자신의 전령 RNA에 공유결합되어 있는 융합물을 이용하여 목적으로 하는 기능을 갖는 단백질을 선별해내는 방법이다. 이러한 RNA-단백질 융합물들은 그들의 3' 말단에 부착된 펩타이드 억셉터를 포함하는 mRNA 풀들의 생체외 또는 인 시츄 해독에 의해 합성된다(도 1b). 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서는, 메시지의 개방 해독틀을 모두 읽은 후, 리보좀은 설계된 일시정지 부위에 도달할 때 일시정지하고 억셉터 부분은 리보좀의 A 부위를 점령한 상태에서 P-부위에 있는 펩티딜-tRNA로부터 성장 초기의 펩타이드 사슬을 받아들여 RNA-단백질 융합물을 생성한다(도 1c). 단백질과 RNA 사이의 공유결합(mRNA의 3' 말단과 그것을 코드화한 단백질의 C-말단 사이의 아미드 결합 형태의)은 단백질에 있는 유전 정보가 RNA의 역전사에 의한 선별이후에 회수되고 증폭(예컨대, PCR에 의해)될 수 있게 한다. 일단 융합물이 만들어지면, 선별 및 농후화는 mRNA-단백질 융합물의 특성에 기초하여 행해지거나 그렇지 않으면 단일가닥 RNA의 선별과정에 대한 영향을 피하기 위해 아직 단백질에 부착되어 있는 상태에서 mRNA 주형을 이용하여 역전사가 행해질 수 있다. mRNA-단백질 구조체가 이용될 때, 선별된 융합물은 어느 부분(단백질, RNA, 또는 둘 다)이 목적으로 하는 기능을 제공하는지 확인하기 위해 시험될 수 있다.

본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 퓨로마이신(티로실 아데노신과 닮았다)은 신장하는 펩타이드를 그의 mRNA에 붙이는 억셉터로 기능한다. 퓨로마이신은 펩타이드 신장을 종결시킴으로써 작용하는 항생제의 일종이다. 아미노아실-tRNA의 미메틱으로서, 그것은 A 부위에 결합하고 신장하는 펩타이드 사슬을 받아들여 리보좀을 떼어냄으로써(Kd=10^-4 M) 단백질 합성의 보편적인 억제제로 작용한다(Traut and Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964); Smith et al., J. Mol. Biol. 13:617 (1965)). 퓨로마이신의 가장 매혹적인 이점들 가운데 하나는 그것이 신장하는 펩타이드 사슬과 안정한 아미드 결합(amide bond)을 형성하여, 불안정한 에스테르 결합을 형성하는 다른 이용가능한 억셉터 보다 안정한 융합물을 형성한다는 사실이다. 특히, 펩티딜-퓨로마이신 분자는 펩타이드와 퓨로마이신의 O-메틸 티로신 부분 사이의 안정한 아미드 결합을 포함한다. 이어서 O-메틸 티로신은 안정한 아미드 결합에 의해 퓨로마이신의 변형된 아데노신 부분의 3'-아미노기에 결합된다.

억셉터로 이용가능한 다른 것은 mRNA의 3'말단에 있는 tRNA-유사 구조들은 물론 퓨로마이신과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 기타 다른 화합물들을 포함한다. 이러한 화합물들은, 제한 없이, 아데닌 또는 아미노산 뉴클레오티드, 페닐알라닐-아데노신(A-Phe), 티로실 아데노신(A-Tyr) 및 알라닐 아데노신(A-Ala)과 같은 아데닌-유사 화합물은 물론 페닐알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신, 알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신, 및 티로실 3' 데옥시3' 아미노 아데노신과 같은 아미 드-결합 구조에 결합된 아미노산을 갖는 임의의 화합물을 포함한다; 이들 임의의 화합물들에서, 천연 L-아미노산들 또는 그들의 아날로그들중 임의의 것이 이용될 수 있다. 또한, 결합된 tRNA-유사 3' 구조-퓨로마이신 컨쥬게이트도 본 발명에서 이용될 수 있다.

도 2에는 본 발명에 따른 바람직한 선별 스킴을 도시하였다. 이러한 선별 스킴에 포함된 단계들은 일반적으로 다음과 같이 수행된다.

단계 1: DNA 주형의 준비. 본 발명의 RNA-단백질 융합물을 생성하기 위한 단계로서, 융합물의 RNA 부분이 합성된다. 이것은 직접적인 화학 RNA 합성에 의해 행하거나 또는 보다 보편적으로는 적당한 이중가닥 DNA 주형을 전사하여 행한다.

이러한 DNA 주형들은 표준 기술(재조합 DNA 기술, 화학합성, 또는 양자를 포함)에 의해 제조될 수 있다. 원칙적으로, 공지의, 랜덤, 랜덤화된 또는 돌연변이유발된 서열을 포함하는 하나 이상의 주형을 만들 수 있게 하는 어떠한 방법이라도 본 발명의 목적을 위해 이용될 수 있다. 하나의 구체적인 접근방법에서, 올리고뉴클레오티드(예컨대, 랜덤 염기들 포함)가 합성되고 전사되기 전에 증폭(예컨대, PCR에 의해)된다. 화합합성도 랜덤 카세트를 생산하는데 이용될 수 있다. 여기서 랜덤 카세트는 공지의 단백질 코드화 서열의 중간에 삽입된다(예를 들어, Ausubel et al.,Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons and greene Publishing Company, 1994, 8장 참조). 이러한 후자의 접근방법은 목적으로 하는 단백질의 특정 부위 부근에 높은 밀도의 돌연변이를 유발한다.

DNA 주형 서열의 전체적인 랜덤화에 대한 대안은 부분적인 랜덤화로, 이러한 방법으로 합성된 풀은 일반적으로 "도핑된 풀(doped pool)"이라 한다. RNA 서열에서 이루어지는, 이러한 기술의 한 가지 예는 예를 들어 이클랜드 등(Nucl. Acids Reseatch 23:3231 (1995))에 의해 기술되었다. 부분 랜덤화는 염기 첨가 반응 혼합물이 과량의 한 가지 염기와 소량의 나머지 염기들을 포함하도록 합성 반응물을 바이어스시키고; 염기 농도를 주의 깊게 조절함으로써 화학적으로 행할 수 있는데, 이러한 접근방법에 의해 목적으로 하는 돌연변이 빈도를 수득할 수 있다. 부분 랜덤화된 풀(partially randomized pools)들은 예컨대, 보드리 및 조이이(Science 257:635 (1992)) 및 바텔 및 쇼스탁(Science 261:1411 (1993))에 의해 기술된 에러-프론 PCR 기술(error prone PCR techniques)을 이용해서도 만들 수 있다.

공지의 DNA 서열부터 시작해서 돌연변이유발된 DNA 풀에 이르기까지 DNA 구조체를 만드는데는 수많은 방법들이 이용될 수 있다. 이러한 기술들의 예들은 오스벨 등의 (상술한 문헌 8장) 및 샘브룩 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, chapter 15, Cold Spring Harbor Press, New York, 2nd ed. (1989)에 설명되어 있다. 랜덤 서열들은 스테머(Nature 370:389 (1994)) 등에 의해 설명된 "셔플링(shuffling)" 기술에 의해서도 만들 수 있다.

본 발명의 선별 스킴을 최적화하기 위해서는, 주형의 3' 및 5' 말단에 있는 서열 및 구조체들은 변형되어야 한다. 바람직하게, 이러한 과정은 두 개의 서로 다른 선별과정에 의해 행해지는데, 각각은 랜덤 도메인을 주형 단부의 적당한 말단 내에 삽입한 후 선별하는 과정을 포함한다. 이들 선별들은 (ⅰ) 만들어지는 융합물의 양을 최대화(따라서 도서관의 복잡도를 최대화)하거나 또는 (ⅱ) 최적화된 해독 서열을 제공하는 기능을 수행한다. 더욱이, 상기 방법은 돌연변이유발 PCR과 함께 코드화 및 비코드화 영역 모두에서 해독 주형의 최적화를 위해 보편적으로 이용할 수 있다.

단계 2: RNA의 생성. 상술한 바와 같이, RNA-단백질 융합물의 RNA 부분은 올리고뉴클레오티드 합성의 표준 기술을 이용하여 화학 합성될 수 있다. 그렇지 않으면, 특히, 긴 RNA 서열이 이용되는 경우에, RNA 부분은 DNA 주형의 생체외 전사(in vitro transcription)에 의해 생성된다. 바람직한 접근방법에 있어서, T7 폴리메라제가 RNA 가닥을 효소적으로 생성하는데 이용된다. 이러한 용도의 다른 바람직한 RNA 폴리메라제는, 제한 없이, SP6, T3 및 이. 콜라이 RNA 폴리메라제(예를 들어, 오스벨 등의 상기 문헌 3장에 기술된)를 포함한다. 또한, 합성된 RNA는 전체 또는 일부가 변형된 RNA(modified RNA)일 수 있다. 하나의 구체적인 예로, 포스포로티오에이트 RNA가 변형된 리보핵산 및 표준 기술을 이용하여 생성될 수 있다(예컨대, T7전사에 의해). 이러한 변형된 RNA는 뉴클레아제에 대해 안정한(nuclease stable) 이점을 제공한다.

단계 3: 주형에 대한 퓨로마이신의 연결. 다음으로, 퓨로마이신(또는 임의의 다른 펩타이드 억셉터)이 주형 서열에 공유결합된다. 이 단계는 T7 RNA 리가제를 이용하여 퓨로마이신을 직접 RNA 서열에 부착하거나 또는 바람직하게 퓨로마이신을 T7 RNA 리가제 또는 다른 두 가지 뉴클레오티드 서열들을 서로 결합시킬 수 있는 임의의 다른 효소를 이용하여 DNA "스플린트(splint)"에 의해 부착함으로써 이루어질 수 있다(도 1b 참조)(또, 예를 들어, 오스벨 등의 상술한 문헌 3장 섹션 14 및 15 참조). tRNA 합성효소(synthetase)들도 퓨로마이신-유사 화합물들을 RNA에 부착하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 페닐알라닐 tRNA 합성효소들은 페닐알라닌을 3' 아미노기를 포함하는 페닐알라닐-tRNA 분자에 결합시켜 퓨로마이신-유사 3' 말단을 갖는 RNA 분자를 생성한다(Fraser and Rich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2671 (1973)). 이용가능한 다른 펩타이드 억셉터의 예들은, 제한 없이, 아데닌 또는 페닐알라닐-아데노신(A-Phe), 티로실 아데노신(A-Tyr) 및 알라닐 아데노신(A-Ala)과 같은 아데닌-유사 화합물은 물론 페닐알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신, 알라닐 3' 데옥시 3' 아미노 아데노신, 및 티로실 3' 데옥시3' 아미노 아데노신과 같은 아미드-결합 구조체에 결합된 아미노산을 갖는 임의의 화합물을 포함한다; 이들 임의의 화합물들에서, 천연 L-아미노산들 또는 그들의 아날로그들중 임의의 것이 이용될 수 있다. 다수의 펩타이드 억셉터들이, 예를 들어, 크레이브스키 및 커크하노바(Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23:1 (1979))에 기술되어 있다.

단계 4: RNA-단백질 융합물의 생성 및 회수. RNA-단백질 융합물을 생성하기 위해서는, 임의의 생체외 또는 인 시츄 해독 시스템이 이용될 수 있다. 후술하는 바와 같이, 진핵세포 시스템이 바람직하고 특히 바람직한 두 가지 시스템은 밀 유아(wheat germ)와 망상적혈구 용해물 시스템(reticulocyte lysate system)이다. 그러나 원칙적으로, 융합물의 RNA 부분을 파괴하지 않고 RNA-단백질 융합물의 생성을 가능하게 하는 어떠한 해독 시스템이라도 본 발명에서 이용할 수 있다. 또한, 임의의 이러한 시스템에서의 RNA 파괴를 줄이기 위해, 파괴-블로킹 안티센스 올리고뉴클레오티드들이 해독 반응 혼합물에 포함될 수 있다; 이러한 올리고뉴클레오티드들은 파괴를 시작하게 하는 분자의 RNA 부분내에 있는 서열들과 특이적으로 혼성화하거나 이들 서열들을 커버한다(예컨대, Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997) 참조).

위에서 설명한 바와 같이, 임의의 수의 진핵세포 해독 시스템이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 이들은, 제한 없이, 효모, 복수(ascites), 종양세포(Leibowitz et al., Meth. Enzymol. 194:536 (1991)) 및 제노퍼스 난모세포 난자(xenopus oocyte eggs)로부터의 용해물들을 포함한다. 세균 시스템으로부터의 유용한 생체외 해독 시스템은, 제한 없이, 쥬베이(Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973)) 및 엘만(Meth. Enzymol. 202:301 (1991)) 등에 의해 기술된 것들을 포함한다.

또한, 해독 반응은 인 시츄(in situ)에서 행해질 수 있다. 하나의 구체적인 예에서, 해독은 표준기술을 이용하여 mRNA를 제노퍼스 난자에 주사함으로써 이루어질 수 있다.

일단 생성되면, RNA-단백질 융합물은 단백질 또는 RNA의 표준 정제 방법에 따라 해독 반응 혼합물로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 단백질 정제 기술이 이용된다. 후술하는 바와 같이, 예를 들어, 융합물의 정제는 dT₂₅ 아가로스 또는 티오프로필 세파로스와 같은 적절한 크로마토그래피 시약을 이용함으로써 쉽게 행할 수 있다. 그러나, 정제는 예컨대, 오스벨(상술한 문헌, 4장)에 의해 기술된 정제기술과 같은 융합물의 RNA 부분에 기초한 정제과정을 함께 포함하거나 선택적으로 이러한 정제과정만으로 이루어질 수 있다.

단계 5: 목적 RNA-단백질 융합물의 선별. 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물의 선별은 후보 융합물들의 집단으로부터 목적으로 하는 융합물을 선택적으로 구별해내거나 분리하는데 이용가능한 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 분리 기술의 예들은, 제한 없이, 예컨대, 컬럼, 비드, 막, 또는 기타의 고체 지지체에 직접 또는 간접으로 고정되어 있는 바인딩 파트너에 대한 선택적 결합(selective binding), 및 융합물의 단백질 부분에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역침강법을 포함한다. 이들 기술들 중 첫 번째는 결합할 수 있는 임의의 타입의 분자들로 구성될 수 있는 고정된 선택 모티브(immobilized selection motif)를 이용한다. 이용가능한 선택 모티브들의 목록은 도 2에 제시되어 있다. 선별은 후보 분자와 반응할 수 있는 친화성 라벨에 부착된 기질 분자들(예컨대, 기질-바이오틴)의 이용에 기초하거나 융합 분자와의 임의의 다른 유형의 상호작용에 기초하여 이루어질 수도 있다. 또한 단백질들은 RNA 효소들의 분리에 대한 바텔 및 쇼스탁(상술한 문헌)에 의해 기술된 것과 유사한 방식으로 단백질들의 촉매 작용에 기초해서 분리될 수도 있다; 이러한 특수한 기술에 의하면, 목적으로 하는 분자들은 표적분자들을 자기 자신에게 결합시킬 수 있는 능력에 기초하여 선별되고, 이어서 기능적인 분자들은 그러한 표적의 존재에 기초해서 분리된다. 이것과 동일한 접근방법 또는 임의의 다른 기능적인 선별방법을 이용하는 신규하거나 개량된 촉매 단백질의 분리를 위한 선별 스킴은 본 발명에 의해 가능해진다.

또한, 본원에서 기술될 때, 목적 RNA-단백질 융합물(또는 그의 DNA 사본)의 선별은 후보 물질들의 풀내의 그러한 융합물의 농도를 농후화함으로써 더 용이하게 이루어질 수 있다. 이러한 최적의 농후화(enrichment)를 수행하기 위해서는, 후보 RNA-단백질 융합물들의 집단을 샘플내의 바인딩 파트너-융합물 복합체와 결합되지 않은 멤버들을 확실하게 분리시킬 수 있는 조건하에서, 융합물의 RNA 부분 또는 단백질 부분중 어느 하나에 대해 특이적인 바인딩 파트너(예컨대, 위에서 언급한 바인딩 파트너들중 하나)와 접촉시킨다. 이 단계는 반복해서 행해질 수 있고, 이 기술은 바람직하게 적어도 2회의 순차적인 농후화 단계를 포함하는데, 1회에서는 융합물이 RNA 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너를 이용하여 선별되고 2회에서 융합물은 단백질 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너를 이용하여 선별된다. 또한, 융합물의 동일한 부분(예켠대, 단백질 부분)을 표적으로 하는 농후화 단계를 반복실시하는 경우에는 서로 다른 바인딩 파트너를 이용하는 것이 바람직하다. 본원에 개시된 하나의 구체적인 예에 있어서, 분자들의 집단은 일차로 융합물의 RNA 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너를 이용하여 선별되고나서, 두 번째 단계에서 둘 다 융합물의 단백질 부분에 대해 특이적인, 두 가지 서로 다른 종류의 바인딩 파트너를 이용하여 선별되어 목적으로 하는 융합물에 대해 농후화된다. 다시 한 번 설명하면, 이러한 복합체들은 제한 없이, 컬럼 친화성 크로마토그래피, 원심분리, 또는 면역침강법을 포함하는 임의의 표준 분리 기술에 의해 샘플 성분들 로부터 분리될 수 있다.

더욱이, 농후화(또는 선별된) 복합체로부터의 RNA-단백질 융합물의 용출은 여러 가지 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 분리하기 위해서 변성(denaturating) 또는 비-특이적 화학 용출 단계(non-specific chemical elution step)를 거칠 수 있다. 이러한 단계는 복합체 성분들 사이 및/또는 복합체 성분들과 고체 지지체 사이의 비-공유결합을 절단함으로써 비교적 비-특이적인 방법으로 복합체 성분들을 서로 분리시키거나 결합된 고체 지지체로부터 복합체 성분을 용이하게 유리시킨다. 본원에 설명된 바와 같이, 하나의 변성 또는 비-특이적 화학 용출 시약은 4% HOAc/H₂O이다. 다른 변성 또는 비-특이적 화학 용출 시약의 예로는 구아니딘, 요소, 고염(high salt), 세제, 또는 일반적으로 비-공유 어덕트들이 제거될 수 있는 임의의 다른 수단들을 포함한다. 대안으로, 화학약품을 융합물의 분자의 특이적인 해리(specific release)를 유발하도록 이용하는 특이적 화학약품 용출 방법(specific chemical elution approach)을 이용할 수도 있다. 하나의 구체적인 예에서, 목적 융합 단백질의 링커 암이 하나 이상의 이황화 결합을 포함하고 있다면, 결합된 융합 엡타머(aptamers)는 예컨대, 이황화 결합을 환원시켜 결합된 표적을 유리시키는 DTT의 첨가에 의해 용출될 수 있다.

대안으로, 용출은 특이적으로 분열시키는 친화성 복합체(specifically disrupting affinity complex)에 의해 이루어질 수 있다; 이 기술은 복합체의 하나의 멤버를 과량으로 첨가함으로써 복합체 성분들을 선택적으로 유리시킨다. 예를 들어, ATP-결합 선별에서, 용출은 과량의 ATP를 인큐베이션 혼합물에 첨가함으로써 행해진다. 최종적으로, 효소 용출(enzymatic elution) 단계를 행할 수 있다. 이러한 접근방법에 의하면, 결합된 분자 자체 또는 외부로부터 첨가된 프로테아제(또는 기타의 적당한 가수분해 효소)는 표적 또는 효소를 절단하여 유리시킨다. 하나의 구체적인 예에서, 프로테아제 표적 부위는 복합체 성분내에 포함되고 결합된 분자들은 프로테아제의 첨가에 의해 용출될 수 있다. 대신에, 촉매 선별에서, 용출은 자기 자신을 고체 지지체로부터 유리(예컨대, 절단)시킬 수 있는 분리 분자(isolating molecules)들에 대한 선별 단계로 이용될 수 있다.

단계 6: 역전사를 이용한 RNA 서열들의 DNA 사본의 생성. 원하는 경우, 선별된 RNA-단백질 융합물의 DNA 사본(copy)을 표준 기술(예컨대, Superscript 리버스 트랜스크립타제)을 이용함으로써 그러한 RNA 서열을 역전사하여 쉽게 수득할 수 있다. 이러한 단계는 선별 또는 농후화 단계 이전에(예컨대, 도 16에 도시한 바와 같이) 또는 그 단계 다음에 행할 수 있다. 그 대신에, 역전사 과정은 생체외 또는 인 시츄 해독 혼합물로부터 융합물을 분리해내기 전에 행해질 수 있다.

그 다음으로, DNA 주형은 부분 또는 전체 길이 이중가닥 서열로 증폭된다. 바람직하게, 이 단계에서, 적당한 올리고뉴클레오티드 및 PCR 증폭을 이용하여 전체 길이 DNA 주형들이 생성된다.

이들 단계들 및 이러한 단계들을 수행하는데 필요한 시약 및 기술들을 구체적인 예를 들어 상세히 설명한다. 이러한 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 기술되는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

RNA-단백질 융합물에 대한 주형의 생성

도 1a와 2에서 보듯이, 본 발명의 선별 스킴(selection scheme)은 바람직하게는 많은 설계 요소(design element)를 포함하는 이중가닥 DNA 주형을 이용한다. 이러한 요소들의 첫 번째는 mRNA 합성을 위해 바람직한 RNA 폴리메라제와 결합하는데 사용되는 프로모터(promoter)이다. 도 1a에서 나타나고 본란에서 설명되었듯이, 선형 이중가닥 DNA로부터 합성을 이끌 수 있는 어떠한 프로모터도 사용될 수 있지만, T7 프로모터가 바람직하다.

도 1a에 보여진 주형의 두 번째 요소는 5' 비해독 영역(또는 5'UTR)이라고 불리워지고 해독 개시 부위의 RNA 상류부(upstream)에 해당한다. 도 1a에서는 담배 모자이크 바이러스 5' 비해독 영역의 결실 돌연변이이고, 특히 TMV 해독 개시의 염기 5'에 해당하는 바람직한 5'UTR("TE"라 불림)가 나타나 있다; 이러한 UTR의 서열은 다음과 같다:rGrGrG rArCrA rArUrU rArUrU rUrArCrArArU rUrArC rA(첫 번째 3 G는 증대 전사에 삽입되었다)(서열 5). 다른 적당한 5'UTR이 활용될 수 있다(예를 들자면, Kozak의 Microbiol. Rev. 47:1(1983) 참조).

도 1a에서 보여지는 세 번째 요소는 해독 개시 부위이다. 일반적으로, 이것 은 AUG 코돈이다. 그러나, AUG가 아닌 코돈이 자연-발생(naturally occurring) 코드화 서열에서 이용되는 예가 있고, 이러한 코돈들은 또한 본 발명의 선별 스킴에서 이용될 수 있다.

도 1a에서의 네 번째 요소는 단백질의 개방 해독틀(open reading frame, ORF)인데, 이것은 단백질 서열을 코드화한다. 이러한 개방 해독틀은 어떠한 자연-발생, 랜덤, 랜덤화된(randomized), 돌연변이유발화된(mutagenized), 또는 완전합성(totally synthetic) 단백질 서열을 코드화할 수 있다.

도 1a에서 보여지는 다섯 번째 요소는 3' 불변 영역이다. 본 서열은 풀(pool) 서열의 PCR 증폭과 퓨로마이신(puromycin)함유 올리고뉴클레오티드의 mRNA로의 리게이션(ligation)을 촉진한다. 이 영역은 일시 정지 부위, 즉 리보좀이 일시 정지하게 하여 억셉터 부분(예를 들면, 퓨로마이신)이 성장 초기의 펩타이드 사슬을 펩티딜-tRNA로부터 수용할 수 있는 부가적인 시간을 허여해 주는 서열을 포함할 수 있다; 이러한 일시 정시 부위는 하기에서 보다 상세히 논의된다.

본 발명의 방법을 발전시키기 위해, 초기에 매우 단순화된, 1-2 코돈을 함유하는 mRNA 주형을 사용하여 RNA-단백질 융합물을 생성하였다. 이러한 접근이 2가지 이유에서 이루어졌는데, 첫째로 이러한 크기의 주형은 화학적 합성에 의해 쉽게 제조될 수 있고, 둘째로 작은 개방 해독틀은 결합의 효율, 말단의 이질성(end heterogeneity), 주형 의존성, 및 해독의 정확성을 포함하는 본 반응의 중요한 특징들을 가능하게 하기 때문이다.

구조체의 설계(Design of Construct). 테스트 RNA-단백질 융합물을 만드는데 사용되는 기초 구조체가 사용되었다. 이 분자는, (i) 리보좀 단백질 L1으로부터 SD 서열의 3 염기 결실을 함유하고 16SrRNA(예를 들면, rGrGrA rGrGrA rCrGeA rA)의 5 염기에 상보성인, 해독 개시를 위한 샤인-달가르노(Shine Dalgarno, SD) 서열을 함유하는 mRNA(서열 6)(Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996(1982); Shine and Dalgano, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346(1974); 및 Stecitz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738(1975)), (ⅱ) AUG 개시 코돈, (ⅲ) 일시 정시 부위로서 작용하는 DNA 링커(예를 들면, 5'-(dA)₂₇), (ⅳ) dCdC-3', 및 (ⅴ) 3'퓨로마이신(P)으로 구성되어 있다. 폴리 dA 서열은 A부위에서 tRNA를 불충분하게 주형화하는 것으로 알려졌기 때문에(Morgan et al., J, Mol. Biol. 26:477-497(1967); Ricker and Kaji, Nucleic Acid Research 19:6573-6578(1991)) 선택되어졌고, 좋은 일시 정지 부위로서 작용되도록 설계되었다. 올리고 dA 링커(linker)의 길이는 해독 부위와 리보좀의 펩티딜 디코드화(decoding) 부위의 ∼60-70Å 거리를 확장하기 위해 결정되었다. dCdCP는 tRNA의 CCA 말단을 모방하므로, 퓨로마이신을 리보좀의 A부위에 결합하는 것을 촉진하기 위해 설계되었다.

최소 주형 43-P의 화학적 합성. 구조체 43-P(도 3에 나타남) 구조체를 합성하기 위해서, 첫째로 퓨로마이신이 표준적인 포스포아미디트 올리고뉴클레오티드(phosphoramidite oligonucleotide) 합성 화학에서와 같은 방식으로 고체 지지체에 부착된다. 이 올리고에 대한 합성 프로토콜(protocol)이 도 3에서 개략적으로 묘사되어 있으며 하기에서 더욱 상세히 설명되어 있다. 퓨로마이신을 조절된 공극 유리(controlled pore glass, CPG) 고체 지지체에 부착시키기 위해서, Applied Biosystems User Bolletin #49 for DNA synthesizer model 380(1988)에서 설명된 바와 같이 아미노기가 트리플루오로아세틸기로써 보호(protect)된다. 그 다음, 5'OH의 보호가 표준적인 DMT-CI 접근법(Gait, Oligonucleotide Synthesis a practical approach, The Practical Approach Series(IRL Press, Oxford, 1984))을 사용하여 수행되어 지고, 3' OH가 디옥시뉴클리오시드의 부착에 사용되었던 것(도 3과 Gait, 상술한 문헌, p. 47)과 꼭 같은 방식으로 2'OH를 통한 아미노헥실 CPG에의 부착이 이루어진다. 5'DMT-CPG-CI-연결 보호된 퓨로마이신이 포스포아미디트 모노머와의 사슬 연장에 적합하다. 올리고의 합성은 3'→5'방향의 순서로 진행된다: (ⅰ) 3'퓨로마이신, (ⅱ)pdCpdC, (ⅲ) 링커로써 dA의 ∼27 유니트, (ⅳ) AUG, 및 (ⅴ) 샤인-달가르노 서열. 43-P 구조체의 서열이 하기에 나타나 있다.

CPG 퓨로마이신의 합성. 보호된 CPG 퓨로마이신 합성이 이전에 소개된 대로(Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)) 디옥시뉴클리오시드에 사용되는 일반적인 경로를 따른다. 주요한 출발점은 적절한 N 봉쇄기를 선정, 2'OH의 고체 지지체에의 부착, 및 고체 지지체에의 연결반응을 포함한다. 후자의 경우, 활성 뉴클레오티드가 고체 지지체보다 훨씬 더 비싸기 때문에, 이 물질의 매우 낮은 농도에서 반응이 이루어진다. 산출되는 수율(∼μ㏖/g 지지체)은 희박 반응 조건임을 고려할 때 매우 만족스럽다.

N-트리프루오로아세틸 퓨로마이신의 합성. 퓨로마이신^*HCl 267mg(0.490m㏖)이 물에 용해되고, pH 11 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)를 첨가하고, 그리고 클로로포름(3X)으로 추출함에 의해 유리 염기(free base) 형태로 우선 전환된다. 유기물상은 건조시까지 증발되도록하고 무게를 잰다(242㎎, 0.513m㏖). 그 다음 유리 염기가 11㎖ 건조 피리미딘과 11㎖ 건조 아세토니트릴에 용해되고, 그리고 139㎕(2.0m㏖) 트리에틸아민(TEA)와 139㎕(1.0m㏖) 트리플로오로아세트산 무수물(TFAA)이 교반하에 첨가된다. 그 다음으로 혼탁한 용액의 부분표본 20㎕에 출발 물질이 모두 없어질 때까지 TFAA를 첨가하고, 박막 크로마토그래피(tlc)(93:7, 클로로포름/메탄올)(총 280㎕)로 분석한다. NH₄OH와 물로써 반응을 종결하면 생성물은 하나의 띠로 감소된다. 실리카 크로마토그래피(93:7 클로로포름/메탄올)는 293㎎(0.515m㏖)의 생성물, N-TFA-Pur을 산출한다. 본 반응의 생성물이 도 4에 개략적으로 나타나 있다.

N-트리플루오로아세틸 5'-DMT 퓨로마이신의 합성. 상기 반응에서의 생성물을 부분표본화하여 물을 제거하기 위하여 건조 피리딘과 함께 증발시킨다. 다중 튜브가 다중 반응 조건을 시험하기 위하여 준비되었다. 작은 스케일의 반응으로, 27.4㎎(48.2μmoles)의 N TFA-Pur가 0.05당량의 DMAP와 1.4당량의 TEA를 함유한 480㎕의 피리딘에 용해되었다. 이 혼합물에 20.6㎎의 트리틸클로라이드(60μmol)가 첨가되고, 반응물은 교반하에 완전히 반응하도록 진행되었다. 본 반응은 동부피의 물(약 500㎕)을 용액에 첨가함에 의해 중지된다. 이 반응이 성공적으로 보여졌기 때문에, 더 큰 스케일의 실험이 이루어졌다. 특히 262㎎(0.467m㏖) N-TFA-Pur을 2.4㎖의 피리딘에 용해하고 1.4당량의 TEA, 0.05당량의 DMAP, 그리고 1.2당량의 트리틸클로라이드를 첨가하였다. 약 2시간 후에, 부가적인 디메톡시트리틸^*Cl(DMT^*Cl) 50㎎(0.3당량)이 첨가되었고, 반응은 20분 더 진행하도록 하였다. 반응은 3㎖의 물을 첨가함에 의해 종료되었고, 3X의 CH₃CN과 함께 증발되었다. 100㎖ 실리카(건조) 2㎜ 직경의 칼럼에서 95:5 클로로포름/메탄올로 정제하였다. 불완전한 정제로 인해, 2차 칼럼이 97.5:2.5 클로로포름/메탄올로 수행되었다. 총 산출물은 325㎎ 또는 0.373m㏖(또는 72% 수율)이었다. 본 반응의 생성물이 도 4에 개략적으로 보여진다.

N-트리플루오로아세틸, 5'-DMT, 2'석시닐 퓨로마이신의 합성. 소 스케일 반응에서, 상기에서 합성된 생성물 32㎎(37μ㏖)이 1.2당량의 DMAP가 용해된 350㎕의 피리딘과 혼합되었다. 이 용액에 건조 CH₃CN 44㎕에의 숙신산 무수물 1.2당량을 투입하고 밤새 교반하였다. 대 스케일 반응에서, 상기 반응의 생성물 292㎎(336μ㏖)이 1.2당량의 DMAP가 용해된 3㎖의 피리딘과 혼합되었다. 여기에, 건조 CH₃CN의 1M 숙신산 무수물 403㎕를 투입하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 박막 크로마토그래피를 통해 잔류하는 출발 물질이 거의 없음을 확인하였다. 두 반응물이 혼합되고, 부가적인 DMAP 0.2당량과 석시네이트(succinate)가 투입되었다. 생성물은 1X 톨루엔으로 증발되었고, 고압에서 건조되어 노란색 거품이 나왔다. CH₂Cl₂가 첨가되었고(20㎖), 이 용액은 15㎖의 10% 얼음 냉각 시트르산으로 두 번 추출하고, 순수한 물로 두 번 추출하였다. 생성물을 건조하고 CH₂Cl₂ 2㎖로 재용해한 다음, 50㎖의 헥산을 교반하에 첨가하여 침전시킨다. 생성물은 와동처리(vortex)하고, 원심분리기에서 600rpm, 10분 동안 원심분리한다. 대부분의 희석액은 분리되고, 나머지 생성물 우선 저온, 그리고 고온의 데시케이터(dessicator)에서 건조된다. 이 반응의 산출물은 대략 260μ㏖이고 ∼70%의 수율이었다.

N-트리플루오로아세틸 5'-DMT, 2'석시닐, CPG 퓨로마이신의 합성. 상기 단계의 생성물이 그 다음으로 1㎖ 다이옥산과 0.2㎖ 다이옥산/0.2㎖ 피리딘에 용해되었다. 이 용액에, 40㎎의 p-니트로페놀과 140㎎의 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)가 첨가되고, 반응이 2시간동안 진행되었다. 이 반응에 의해 생성된 불용성의 사이클로헥실 요소(urea)는 원심분리에 의해 제거되었고, 반응용액이 22㎖의 건조 DMF에 현탁된 5g의 아미노헥실 조절공극유리(CPG)에 투입되고 밤새 교반되었다. 수지가 DMF, 메탄올과 에테르로 세척되고 건조되었다. 산출되는 레진은 이러한 타입의 지지체에서 수용가능한 범위내인 그램당 22.6μ㏖의 트리틸을 함유하는 것으로 분석되었다. 지지체는 15㎖의 피리딘, 1㎖의 아세트산 무수물, 그리고 60㎎의 DMAP에서 30분동안 인큐베이션(incuvate)하여 캡핑(capping)되었다. 결과적인 막대 물질은 블로킹이전의 물질은 어두운 청색의 반응물을 산출한 결과와 대조할 때 음의(무색) 닌히드린(ninhydrin) 테스트를 산출했다. 이 반응의 생성물이 도 4에 개략적으로 나타나 있다.

mRNA-퓨로마이신 컨쥬게이트의 합성. 상기에서 논의되었듯이, 퓨로마이신 결합된(thethered) 올리고가 해독 주형으로 작용하는 mRNA-퓨로마이신 컨쥬게이트를 생성하는데 두가지 방식으로 사용될 수 있다. 극도로 짧은 개방 해독틀에서, 퓨로마이신 올리고는 대개 RNA나 DNA 모노머와 함께 화학적으로 연장하여 전체 합성 주형을 만든다. 더 긴 개방 해독틀이 바람직하다면, Moore와 Sharp(Sience 256:992 (1992))에 의해 설명되었듯이 RNA나 DNA 올리고가 DNA 스플린트와 T4 DNA 리가제를 사용하여 mRNA의 3'말단에 일반적으로 리게이션된다.

생체외 해독과 RNA-단백질 융합물의 시험

상기에서 생성된 주형은 세균(bacteria)과 진핵세포(eukatyotic) 모두의 생체외 해독 시스템을 사용하여 하기와 같이 생체외에서 해독되었다.

최소 주형의 생체외 해독. 43-P 및 관련된 RNA-퓨로마이신 컨쥬게이트가 다음을 포함하는 여러 개의 상이한 생체외 해독 시스템들에 투입되었다: (ⅰ) 이.콜라이(E.coli) MRE600에서 유도된 S30시스템(Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267(1973); Collins, Gene 6:29(1979); Chen and Zubay, Methods Enzymol, 101:44(1983); Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds.(IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; 및 Ellman et al., Methods Enzymol, 202:301(1991)); (ⅱ) Kudlicki et al.에 의해 설명된 것과 같이, 동일한 균주(strain)로부터 유도된 리보좀 부분(Anal. Chem. 206:389(1992)); 및 (ⅲ) Lesley et al.에 의해 설명된 것과 같이, 이.콜라이(E.coli) BL21에서 유도된 S30시스템(J. Biol. Chem. 266:2632(1991)). 각각의 경우, 사용된 프리믹스(premix)는 Lesley et al.(J. Biol. Chem. 266:2632(1991))의 그것이고, 인큐베이션은 30분 동안 실시되었다.

융합물의 특성 시험. 43-P 주형은 첫째로 E.coli로부터의 S30 해독 추출물을 사용하여 시험되었다. 도 5(반응"A")는 43-P가 리보좀과 결합하여 fMet의 주형과 동시에 억셉터로써 작용하는 바람직한 분자내 (시스)반응을 보인다. ³⁵S-메티오닌의 결합과 주형에서 그것의 위치가 첫 번째로 시험되었고, 그 결과가 도 6a와 6b에 나타나 있다. 생체외 해독 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 생성물을 SDS-PAGE에 의해 분석한 후에, ³⁵S 표지(label) 밴드가 43-P 주형과 같은 이동성(mobility)으로서 나타나 있다. 합성된 이 물질의 양은 Mg²⁺농도(도 6a)에 의존한다. 적정 Mg²⁺농도는 9와 18mM 사이로 보이고, 이것은 본 시스템에서 해독을 위한 적정치와도 유사하다(Zubay, Ann. Rev, Genet. 7:267(1973); Collins, Gene 6:29(1979); Chen and Zubay, Methods Enzymol, 101:44(1983); Pratt, in Transctiption and Translation; A Practical Apptoach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds.(IRL Press, Oxford, 1984) pp.179-209; Ellman et al., Methods Enzymol, 202:301(1991)); Kudlicki et al. Anal. Chem. 206:389(1992));과 Lesley et al., J. Biol. Chem. 266:2632(1991)). 게다가, 결합된 표지는 NH₄OH 처리에 안정하였으며(도 6b), 표지가 분자(염기-안정 DNA 부분)의 3' 반쪽에 위치하여 있고 퓨로마이신과 fMet의 아미드 결합에 의해 기대된 것과 같이 염기-안정 결합에 의해 부착되어 있음을 가르쳐 준다.

리보좀과 주형 종속성. 상기에서 관찰된 반응이 리보좀위에서 일어났다는 것을 증명하기 위하여, 리보좀의 펩티딜 트랜스퍼라제(transferase) 기능의 특정 억제제의 효과가 시험되었고(도 6c), 메티오닌에 대한 서열 암호화를 변경하는 효과가 시험되었다(도 6d). 도 6c는 명백히 반응이 펩티딜 트랜스퍼라제 억제제, 버지니아마이신(virginiamycin), 거제로틴(gougerotin),그리고 클로람페니콜 (chloramphenicol)에 의해 강하게 억제된다는 것을 보인다(Monro and Vazquezm J. Mol. Biol. 28:161 -165(1967); Vazquez and Monro, Biochemica et Biophysical Acta 142:155- 173(1967)). 도 6d는 A에서 C까지 주형의 단독 염기(single base)를 변경하는 것은 9mM Mg²⁺에서의 ³⁵S-메티오닌의 결합을 없애고, 18mM에서의 그것을 크게 감소시킨다(고수준의 Mg²⁺는 메시지의 오해독을 가져온다는 사실과 일치한다)는 것을 보인다. 이러한 실험은 주형의 리보좀에서 일어난 반응이 반응방법에 종속한다는 것을 보인다.

링커(linker) 길이. 또한 링커의 길이에 대한 반응의 종속성이 시험되었다(도 6e). 최초의 주형은 링커가 디코드 부위(주형의 AUG가 차지함)로부터 억셉터 부위(퓨로마이신 부분이 차지함)까지의 거리, 이것은 안티코돈 루프와 tRNA의 억셉터 줄기 사이의 거리와 거의 같아 약 60-70Å인데, 이 같은 거리에 걸치도록 설계되었다. 시험된 첫 번째 링커는 30 뉴클레오티드 길이였고, 염기당 최소한 3.4Å을 기초로 하고 있었다(≥102Å). 30과 21 뉴클레오티드(n=27-18; 길이≥102-71Å)의 범위에서, 차이가 거의 보이지 않았다. 따라서, 링커 길이는 다양하게 변할 수 있다. 21과 30 뉴클레오티드사이의 링커는 바람직한 길이를 나타내지만, 80뉴클레오티드보다 짧은 링커와, 바람직하게, 45뉴클레오티드보다 짧은 것도 본 발명에서 이용될 수 있다.

분자내 대 분자간 반응. 결국, 본 발명자들은 반응이 분자내의 형태로(도 5의 반응 "A") 또는 분자간(도 5의 반응 "B")에 일어날 수 있는가를 시험하였다. 이것은 올리고뉴클레오티드를 3'퓨로마이신과 함께, 그러나 리보좀 결합 서열(주형 25-P, 13-P, 그리고 30-H)은 없이 43-P 주형을 함유하는 해독 반응물에 첨가함에 의해 시험된다(도 6f, 6g, 그리고 6h). 반응이 분자간 메커니즘(mechanism)으로 일어난다면, 더 짧은 올리고들이 또한 표지될 것이다. 도 6f-h에서 증명되듯이, 3개의 짧은 올리고들에서 ³⁵S 메티오닌의 결합이 거의 없고, 이것은 반응이 주로 분자내 형태로 일어난다는 것을 가리킨다. 25-P(서열 10), 13-P(서열 9), 그리고 30-P(서열 8)의 서열들이 하기에 나타나 있다.

망상적혈구 세포 용해물(Reticulocyte Lysate). 도 6h는 상기에서 사용된 E. coli. 세포용해물에 더하여, 생체외 해독에서 토끼 망상적혈구 세포 용해물(하기 참조)을 사용한 43-P 주형에 ³⁵S 메티오닌이 결합될 수 있다는 것을 보인다. 이 반응은 바람직하게, 주로 분자내 메카니즘으로 일어난다.

C-MYC 에피톱 택(epitope tag)을 함유하는 융합물의 합성과 시험

단백질 부위에서 c-myc 단클론(monoclonal) 항체 9E10(Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610(1985))에 대한 에피톱 택을 함유하는 일례적인 융합물이 생성되었다.

주형의 설계. 세가지 최초의 에피톱 택 주형들(예를 들어, LP77, LP154, 그리고 POOL #1)이 설계되고, 이것들이 도 7a-c에 나타나 있다. 최초의 두 주형은 c-myc 에피톱 택 서열 EQKLISEEDL(서열 2)를 포함하고 있고, 세 번째 주형은 랜덤 선별 풀(pool)의 합성에 사용되는 설계였다. LP77은 12 아미노산 서열을 세균 해독에 최적합한 코돈과 함께 부호화하였다. LP154와 그 유도체들은 코돈들이 진핵세포 해독에 최적화된 33 아미노산 mRNA 서열을 함유한다. MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA(서열 7)의 암호화된 아미노산은 9E10 항체를 분리하는데 사용된 최초 펩타이드에 해당한다. 풀#1은 myc 펩타이드(myc 에피톱 서열의 부분이 아니다)의 마지막 7개의 아미노산에 해당하는 서열이 따라오는 (랜덤 펩타이드를 생성하는) NNG/C의 27 코돈을 함유한다. 이들 서열들이 하기에 표시되어 있다.

망상적혈구 대 밀 유아 생체외 해독 시스템. 43-P, LP77, 그리고 LP154 주형이 토끼 망상적혈구와 밀 유아(wheat germ) 추출물(Promega, Boehringer Mannheim) 해독 시스템에서 시험되었다(도 8). 해독은 30℃에서 60분동안 수행되었다. 주형은 4℃의 dT₂₅ 아가로스(agarose)를 사용하여 분리되었다. 주형은 15mM NaOH, 1mM EDTA로 용출(elute)되고, NaOAc/HOAc 버퍼로 중화되고, 즉시 에탄올(2.5-3부피)로 침전되고, 100%에탄올로 세척되고, 그리고 스피드백 농축기(speedvac concentrator)에서 건조되었다. 도 8은 ³⁵S 메티오닌이 밀 유아와 망상적혈구 시스템에서 3가지 주형 모두에 결합하였음을 보인다. 망상적혈구 시스템의 융합 반응물에서 주형의 파쇄(degradation)가 덜 관찰되고, 따라서 이 시스템이 RNA-단백질 융합물의 생성에서 선호된다. 진핵세포 세포는 더 적은 수준의 뉴클레아제를 함유하는 경향이 있기 때문에, mRNA 생존주기는 세균세포 내에서 보다는 이러한 세포내에서 일반적으로 10-100배 길어진다. 하나의 특정 E. coli. 해독 시스템을 사용한 실험에서, c-myc 에피톱을 암호화하는 주형을 사용하였을 때 융합물의 생성은 관찰되지 않는다; 다양한 장소에 주형의 표지화(labeling)는 주형에서 RNA와 DNA 모두의 파쇄 때문일 것이라는 것을 증명한다.

이러한 융합물의 펩타이드 부분을 시험하기 위해서, 시료들이 코드화(coding) 서열을 제거하는 RNase로 처리되었다. 이러한 처리에 이어서, 43-P 생성물이 30-P에 첨가된 소량의 펩타이드(메티오닌 단독일 수 있음)와 같이, 32P 표지된 30-P 올리고에 거의 동등한 이동성으로써 진행되었다. LP77에 대하여, 코드화 서열의 제거는 퓨로마이신에 12 아미노산 펩타이드가 첨가된 것과 같이, 30-P 올리고보다 적은 이동성의 생성물을 만들어낸다. 마지막으로, LP154에 대하여, 코드화 서열의 제거는 30-P올리고에 부착된 33 아미노산 서열과 같이, 여전히 낮은 수준의 이동성의 생성물을 제조해낸다. RNase-처리된 LP154 망상적혈구 레인(lane)에서 로딩 에러(loading error) 때문에 올리고가 없었다. 도 9에서, 본 생성물의 이동성이 밀 유아 추출물에서 발생된 생성물과 같은 것이 보여졌다. 이러한 결과들은 생성물에 저항성인 RNase가 30-P의 말단에 투입되었고, 생성물의 크기는 코드화 서열의 길이에 비례하며, 생성물은 크기에서 매우 균일하다는 것을 가리킨다. 또한, 두가지 시스템이 유사한 융합물을 생성함에도, 망상적혈구 시스템은 더 높은 주형 안정성 때문에 더 우수한 것으로 보인다.

RNase A와 프로테나제 K에 대한 민감성(sensitivity). 도 9에서 RNase와 프로테나제 K에 대한 감수성이 LP154 용합물을 사용하여 시험되었다. 2-4 레인에서 보듯이, ³⁵S 메티오닌의 결합이 LP154 주형으로 증명되었다. 이 생성물이 RNase A로 처리되었을 때, 33아미노산 펩타이드를 3'말단에 첨가한 것과 일관되게 융합물의 이동성은 감소하지만, ³²P 표지된 30-P올리고뉴클레오티드보다는 현저히 높다. 이 물질이 또한 프로테나제 K로 처리되었을 때, 표지가 30-P 부분의 3'말단에서 펩타이드에 존재한다는 인식과 일관되게, ³⁵S 표시는 완전히 사라진다. 유사한 결과가 43-P와 LP-77융합물을 사용한 동등한 실험에서 얻어진다.

³⁵S Met로 표지화한 주형이 해독의 결과이고, 좀 더 세부적으로는 리보좀의 트랜스퍼라제 활성으로부터 유래된 것이라는 것을 확인하기 위하여, 표지화 반응에서의 다양한 억제제들의 효과가 시험되었다. 사이클로헥시미드(cycloheximide)와 에메틴(emetin) (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis(Springer-Verlag, New York), pp. 312(1979)) 뿐만 아니라, 진핵세포 펩티딜 트랜스퍼라제의 특정 억제제들, 아니소마이신(anisomycin), 거제로틴(gougerorin), 및 스파소마이신 (sparsomycin) (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, New York), pp. 312(1979))은 모두 긴 myc 주형과 망상적혈구 세포 용해물 해독 추출물을 사용한 RNA-펩타이드 융합물 형성을 ∼95% 감소시킨다.

면역침강(Immonoprecipitation) 실험. mRNA-펩타이드 융합물을 면역침강시키는 것을 보이도록 계획된 실험에서, 생체외 해독에 의해 생성된 유리 c-myc 펩타이드를 면역침강하는 시도가 이루어졌다. 도 10은 이들 실험의 결과가 SDS PAGE 펩타이드 겔에 분석되었음을 보인다. 레인 1과 2는 RNA124(LP154의 RNA 부분) 또는 β-글로빈 mRNA를 함유하는, 해독 반응으로부터 표지된 물질을 보인다. 레인 3-8은 6-7가지 다른 버퍼 조건(하기에 설명됨)하에서, c-myc 단클론 항체 9E10을 사용하여 이러한 반응 시료들을 면역침강하는 것을 보인다. 레인 3-5는 RNA124로부터 유도된 펩타이드가 효과적으로 면역침강되었고, 특히 레인 4가 ∼83%의 총 TCA 침전가능물이 분리되었음을 보인다. 레인 6-8은 β-글로빈이 거의 없음을 보이는데, 이는 100배 이상의 정제가 되었음을 가리킨다. 이러한 결과들은 RNA124( 및 LP154)에 의해 암호화된 펩타이드가 이러한 면역침강 프로토콜(protocol)에 의하여 정량적으로 분리될 수 있음을 제시한다.

융합물의 면역침강. 본 발명자들은 다음으로 LP154 해독 반응물과 c-myc 단클론 항체 9E10을 사용하여, 키메릭(chimeric) RNA-펩타이드 생성물을 면역침강시 키는 능력을 시험하였다(도 11). 망상적혈구 반응에서의 해독 생성물이 면역침강에 의해 분리되었고, 1㎍의 RNase A로 상온에서 30초간 처리하여 코드화 서열을 제거하였다. 이것은 5'OH를 생성하는데, 이는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 표지된 ³²P이고 PAGE를 변성시킴(denaturing)에 의해 분석된다. 도 11은 LP154융합물의 RNase처리에 의해 생성된 30-P와 c-myc 에피톱의 융합물에 대해 보이는 것과 비슷한 이동성을 갖는 생성물이 분리되는 것을 보이지만, 단지 주형(RNA124)의 RNA부분만이 해독되었을 때는 이에 상응하는 생성물은 제조되지 않는다. 도 12에서, 분리된 융합 단백질의 양이 결정되어 개질되지 않은(unmodified) 30-P(이 도면에 나타나 있지 않음)의 양에 대하여 플롯(plot)되었다. 링커-myc 펩타이드 융합물에 대한 개질되지 않은 링커의 비의 크기는 입력 메시지(input message) 중 0.2-0.7%가 융합 생성물로 전환되었음을 보인다. 더 높은 리보좀/주형 비에서는 입력 RNA의 더 높은 비율이 융합 생성물로 전환되었다; 시험된 입력 mRNA 농도 전반에 걸쳐, 해독 추출물의 ㎖당 대략 0.8-1.0×10¹²의 융합 분자들이 만들어졌다.

부가적으로, 본 결과들은 RNA종에 부착된 펩타이드는 mRNA에 의해 코드화되었는데, 예를 들어 성장 초기의 펩타이드는 기타 mRNA의 퓨로마이신으로 옮겨지지 않았다. 링커(30-P)가 긴 myc 주형과 함께 해독 추출물에서 20:1의 비로 인큐베이션되었을 때, 크로스-트랜스퍼(cross-transfer)를 제시하는 것은 보이지 않았고, 유리된 링커의 존재도 생성된 긴 myc 융합물의 양을 현저하게 줄이지도 않았다. 유사하게, 짧은 주형과 긴 주형, 즉 43-P와 LP154의 동시-해독(co-translation)은 긴 myc 펩타이드와 짧은 주형의 융합에서 기대되어진 것과 같이, 주형이 단독으로 해독되었을 때 보여지는 융합 생성물밖에는 생성하지 않았고, 중간체 이동성의 어떠한 생성물도 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 모두 융합물 형성이 주로 같은 리보좀에 묶여 있는 성장 초기의 펩타이드와 mRNA에서 주로 일어난다는 것을 제시한다.

서열 분리. 생체외 해독된 LP154 주형 생성물의 성질에 대한 심화된 확인으로서, 본 발명자들은 이 생성물의 거동을 두가지 다른 타입의 크로마토그래피 매체에서 시험하였다. 티오프로필(TP) 세파로스(sepharose)는 유리 시스테인을 함유하는 생성물의 분리를 허용한다(예를 들어, LP154 생성물은 C말단에 인접한 시스테인 잔기를 갖는다)(도 13). 유사하게, dT₂₅ 아가로스는 폴리 dA 서열을 함유하는 주형의 분리를 가능하게 한다(예를 들어, 30-P)(도 13). 도 14는 TP 세파로스에 이은 dT₂₅ 아가로스에서의 서열분리는 dT₂₅ 아가로스 단독에서의 분리와 똑같은 생성물을 생성한다. 생체외 해독 생성물이 폴리-A 트랙트(tract)와 유리 티올(thiol) 모두를 함유한다는 사실은 해독 생성물이 목적 RNA-펩타이드 융합물이라는 것을 강하게 제시한다.

상기의 결과들은 mRNA-펩타이드 융합물을 합성하고 그들을 생체외 해독 추출물로부터 본래대로 회복시키는 능력과 일치하는 것이다. 이렇게 합성된 융합물의 펩타이드 부분은 면역침강과 적당한 크로마토그래피 기술을 사용한 분리에 의해 보여진 것과 같이 의도된 서열을 갖는 것으로 보인다. 상기에 나타난 결과들에 따라서, 반응들은 분자내, 및 주형 종속 형태로 이루어진다. 결국, 1% 이하의 주형 개 질로도, 본 시스템은 약 10¹³ 분자들의 후보 복합체(candidate complex)에 기초한 선별을 촉진할 수 있다.

C-Myc 에피톱 회복 선별. 추가적인 c-myc 에피톱을 선택하기 위하여, 랜덤화된 영역을 포함하는 해독 주형의 커다란 도서관(예를 들어, 10¹⁵ 구성요소)이 생성되었다(도 7c와 하기 참조). 이 도서관은 생체외 선별의 반복되는 주기에서 c-myc-코드화 주형을 풍부하게 하기 위해 항-c-myc 항체로 처리되는(예를 들어, 면역침강 또는 칼럼 또는 기타 고체 지지체에 고정된 항체를 사용함에 의해) ∼10¹²-10¹³ 융합물을 생성하는데 사용된다.

융합물 형성의 모델. 특정한 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 해독이 평범하게 개시하고 성장이 개방 해독틀의 말단까지 연장이 진행되는 융합물 형성의 메카니즘에 대한 모델을 제안하였다. 리보좀이 주형의 DNA 부분에 다다르면, 해독이 멈춘다. 이 시점에서, 복합체는 두가지 운명으로 나뉠 수 있다: 성장 초기의 펩타이드의 분해, 또는 주형의 3'-말단에서 성장 초기 펩타이드의 퓨로마이신으로의 전이(transfer). 전이 반응의 효율은 멈춘 해독 복합체의 안정성과 3'-퓨로마이신 잔기가 펩티딜 트랜스퍼라제 중심의 A 부위로 진입하는 것에 영향을 주는 수 많은 인자에 의해 조절되는 것 같다. 전이 반응 이후에, 알려진 해리(release) 인자들은 RNA와 펩타이드 영역 사이의 안정한 아미드 결합을 가수분해할 수 없기 때문에, mRNA-펩타이드 융합물은 리보좀과 컴플렉스하여 남는다.

연장의 고전적 모델(Watson, Bull. Soc. Chim. Biol. 46:1399(1964))과 중간체 상태 모델(Moazed and Noller, Nature 342:142(1989))은 퓨로마이신이 펩티딜 트랜스퍼라제 중심에 진입하기 위하여 A 부위가 비어있을 것을 요구한다. 퓨로마이신이 비어있는 A 부위에 진입하기 위하여, 링커는 리보좀의 외부 둘레를 둘러싸거나(loop), 디코드화(decoding) 부위로부터 A 부위를 통하여 펩티딜 트랜스퍼라제 중심으로 직접 통과하여야 한다. 본원에서 설명된 데이터는 시험된 최소 링커(21 nts)가 리보좀의 외부 둘레를 통과하기에는 여전히 충분히 길기 때문에 이러한 대안들을 명백하게 구별하고 있지 않다. 리보좀 구조의 몇가지 모델들(Frank et al., Nature 376:441(1995))에서, 디코드화 부위의 양쪽으로 연장되어 있는 채널(channel)을 통해 mRNA는 꿰어져 있는데, 이 경우 링커를 채널에 꿰지지 않게 하는 것이 퓨로마이신을 A 부위를 통해 펩티딜 트랜스퍼라제 중심부에 도달하도록 하기 위해 요구된다.

링커에 부착된 펩타이드의 균질성과 길이에 의해 증명되듯이, 성장과정에 비교해볼 때 성장 초기의 펩타이드를 퓨로마이신으로 전이하는 것은 느린 것으로 보여졌다. 퓨로마이신이 성장하는 동안 아미노아실 tRNA들과 효과적으로 경쟁한다면, 융합 생성물에 존재하는 링커-펩타이드 융합물은 크기에서 균질한 것으로 기대될 것이다. 게다가, Met-주형 융합물과 개질되지 않은 링커 사이에서의 겔 이동성의 유사성에서 제시된 바와 같이,리보좀은 링커 영역으로 해독하여 들어가지 않는 것으로 보인다. dA_3n은 확실히 링커의 이동성을 감소시킬 (리신)_n을 코드화하여야 한다. mRNA를 푸는(unthreading) 느린 속도는 위치이동(translocation) 속도에 비교하여 융합물 형성의 느린 속도를 설명할 수 있다. 예비적인 결과는, 아마도 성장 초기 펩타이드를 퓨로마이신으로 전이하는데 이용할 수 있는 시간이 늘어났기 때문에, 저온에서의 연장된 해독후 인큐베이션(extended post-translation incubation) 후에 형성되는 융합 생성물의 양이 현저하게 증가될 것임을 시사한다.

상세한 재료와 방법

하기에는 myc 에피톱 택을 포함하여 본 생체외 해독과 RNA-단백질 융합물의 시험에 관한 상세한 재료들과 방법들이 설명되어 있다.

서열. RNA-단백질 융합물의 생성을 위하여 수 많은 올리고뉴클레오티드가 상기에서 사용되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열을 갖는다.

모든 올리고뉴클레오티드들이 5'에서 3' 방향으로 나열되어 있다. 리보뉴클레오티드 염기들(ribonucleotide bases)은 뉴클레오티드 지정에 앞서 소문자 "r"에 의해서 지칭된다; P는 퓨로마이신; rN은 동량의 rA, rG, rC, 및 rU를 지칭한다; rS는 동량의 rG와 rC를 지칭한다; 그리고 모든 기타 염기 지정은 DNA 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.

화학약품. 퓨로마이신 HCl, 장쇄 알킬아민 조절 공극 유리, 거제로틴, 클로람페니콜, 버지니아마이신, DMAP, 디메틸트리틸 클로라이드, 및 아세트산 무수물이 Sigma Chemical(St. Louis, MO)로부터 입수될 수 있다. 피리딘, 디메틸포름아마이드, 톨루엔, 숙신산 무수물, 및 파라-니트로페놀이 Fluka Chemical(Ronkonkoma, NY)으로부터 입수될 수 있다. β-글로빈 m-RNA가 Novagen(Madison, WI)로부터 입수될 수 있다. TMV RNA는 Boehringer Mannheim(Indianipolis, IN)으로부터 입수될 수 있다.

효소. 프로테나제 K는 Promega(Madison, WI)로부터 얻어질 수 있다. DNase가 없는 RNAase가 Sambtook et al. (상술한 문헌)의 프로토콜에 의해 제조되거나 또는 Boehringer Mannheim으로부터 구입할 수 있다. T7 폴리메라제는 Grodberg Dunn (J. Bacteriol 170:1245(1988))에 공개된 프로토콜과 Zawadzki Gross(Nucl. Acids Res T4 DNA New England Biolabs(Beverly, MA)의 개조법에 의해서 제조될 수 있다.

방사성표지 결합의 정량(Quantitation of Radiolabel Incorporation). 라디오액티브(radioactive)한 겔 밴드에 대하여, 각 밴드에 존재하는 방사성 동위원소 표지(³⁵S 또는 ³²P)가 Betagen 603 블롯(blot) 분석기 (Betagen, Waltham, MA) 또는 포스포이메이져 플레이트(phosphotimager plates)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 정량함에 의해 결정되었다. 액체 및 고체 시료에 대하여, 존재하는 방사성표지(³⁵S 또는 ³²P)의 양이 신틸레이션 카운팅(scintillation counting)(Beckman, Columbia, MD)에 의해 결정되었다.

겔 이미지(Gel Images). 겔의 이미지는 오토라디오그래피(autoradiography)( Kodak XAR 필름을 사용) 또는 포스포이메이져 플레이트(phosphrimager pltes)(Molecular Dynamics)를 사용하여 얻어질 수 있다.

CPG 퓨로마이신의 합성. 이. 콜라이(E. coli) 추출물을 사용한 키나제, 전사, PCR, 그리고 해독 반응을 위한 핵산의 제조는 대개 동일하다. 각각의 제조 프로토콜은 동 부피의 1:1 페놀/클로로포름을 사용한 추출물로써 시작하고, 수용액상의 원심회전과 분리가 뒤따른다. 소듐아세테이트(pH 5.2)와 스퍼미딘(spermidine)이 각각 300mM과 1mM의 최종 농도로 첨가되고, 시료는 100% 에탄올 3부피의 첨가와 -70℃에서 20분 동안의 인큐베이션으로 침전된다. 시료들은 12,000g 이상에서 원심분리되고, 상층액이 제거되며, 펠렛(pellet)은 과량의 95% 에탄올로 0℃에서 수세된다. 산출되는 펠렛은 진공하에 건조되고 다시 현탁(suspending)된다.

올리고뉴클레오티드. 모든 합성 DNA와 RNA는 제조사에서 공급되는 표준 화학물질을 사용한 Millipore Expedite 합성기(Milligen, Bedford, MA)에서 합성된다. 3' 퓨로마이신을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 30-50㎎(∼20μ㏖ 퓨로마이신/그램)의 고체 지지체로 채워진 CPG 퓨로마이신 칼럼을 사용하여 합성된다. 3' 바이오틴(biotin)을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 Glen Research(Sterling, VA)의 1μ㏖ bioteg CPG 칼럼을 사용하여 합성되었다. 5' 바이오틴을 함유하는 올리고뉴클레오티드들은 바이오텍 포스포라미디트(bioteg phosphoramidite)(Glen Research)를 5'염기로 첨가하여 합성된다. RNA 분자들의 3' 말단에 리게이션되는 올리고뉴클레오티드들은 보호제거(deptotection)에 앞서 5' 말단에서 (Glen Research의 화학적 인산화제를 사용하여) 화학적으로 인산화(phosphorylated)되거나 또는 보호 후에 ATP와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(New England Biolabs)를 사용하여 효소적으로 인산화된다. 단지 DNA만(그리고 3' 퓨로마이신 또는 3' 바이오틴)을 함유하는 시료들은 25%의 NH₄OH를 첨가하고 55℃에서 12시간 동안 인큐베이션하여 탈보호된다. RNA 모노머(예를 들어, 43-P)를 함유하는 시료들은 에탄올(25%(v/v))를 NH₄OH 용액에 첨가하고 55℃에서 12시간 동안 인큐베이션하여 보호된다. 2'OH는 상온 48시간 동안 THF하의 1M TBAF(Sigma)를 사용하여 보호된다. TBAF는 NAP 25 Sephadex 칼럼(Pharmacia, Piscataway, NJ)을 사용하여 제거된다.

보호제거된 DNA와 RNA 시료들은 그리고 나서 변성 PAGE를 사용하고 이어서 속킹(soaking) 또는 Elutrap(Schleicher and Schuell, Keene, NH)을 사용하여 겔로부터 전기-용출(electro-eluting)하고 NAP-25 Sephadex 칼럼 또는 에탄올 침전을 사용하여 탈염함으로써 정제된다.

Myc DNA 구조체. c-myc 에피톱 택을 함유한 두가지 DNA 주형이 구축되었다. 첫 번째 주형은 올리고뉴클레오티드 64.27 (5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3')(서열 18)과 18.109(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3')(서열 19)의 조합으로부터 제조되었다. 이 주형을 사용한 전사는 펩타이드MEQKLISEEDLN(서열 20)으로 코드화된 RNA 47.1을 생성하였다. RNA 47.1을 30-P로 연결한 것은 도 7a에서 보이는 LP77을 산출한다.

두 번째 주형은 한 개의 올리고뉴클레오티드 99 염기로서 제조되는데, PWR 99.6로 지칭되며 서열 5'AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTC CAG RRR GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG TTT CTF TTC TTC AGC CAT-3'(서열 21)을 갖는다.

이러한 서열을 함유하는 이중가닥 전사 주형은 공개된 프로토콜(Ausubel et al., 상술한 문헌, chapter 15)에 따라, 올리고 PWR 21.103(5'AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3')(서열 22)와 PWR 63.26(5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3')(서열 23)과 PCR에 의해서 구축될 수 있다. 이러한 주형을 사용한 전사는 펩타이드 MAAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(서열 24)로 코드화된 RNA124로 불리우는 RNA를 산출한다. 이러한 서열을 함유하는 펩타이드는 담체 단백질에 컨쥬게이트되었을 때 단클론 항체 9E10를 상승시키는데 사용된다(Oncogene Science Technical Bulletin). RNA124는 길이에서 124뉴클레오티드이고, RNA124의 30-P로 연결하는 것은 도 7b에 보이는 LP154를 산출한다. RNA124의 서열은 다음과 같다(서열 32):

5'- rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA rCrArC rArArAr rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU-3'

랜덤화된 풀(Pool) 구조체. 랜덤화된 풀은 RWR130.1로 알려진 길이 올리고뉴클레오티드 130 염기로 구축된다. 3' 말단에서 시작하여 서열은 3'CCC TGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC(NNS)₂₇ GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5'(서열 25)였다. N은 랜덤 위치를 나타내고, 이 서열은 표준 합성기 프로토콜에 따라 생성된다. S는 동량의 dG와 dC 염기를 나타낸다. PCR은 올리고뉴클레오티드 42.108(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA)(서열 26)과 21.103(5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG)(서열 27)로 실행된다. 이들 주형을 모두 전사하면 풀 130.1로 나타나는 RNA가 생성된다. 풀 130.1을 30-P로 연결시키면 도 7c에서 보이는 풀#1(또한 LP160으로 언급된다)이 산출된다.

PCR의 7사이클이 다음의 예외들을 적용하여 공개된 프로토콜(Ausubel et al., 상술한 문헌)에 따라 시행되었다:(ⅰ) PWR130.1의 출발 농도는 30나노몰이었고, (ⅱ) 각 프라이머는 1.5μM의 농도로 사용되었으며, (ⅲ) dNTP 농도는 각 염기당 400μM였고, (ⅳ) Taq 폴리메라제(Boehringer Mannheim)는 100㎕당 5단위가 사용되었다. 이중 가닥 생성물은 비변성 PAGE로 정제되었고, 전기용출로 분리되었다. DNA의 양은 260nm에서의 자외선 흡광과 알려진 기준물질과의 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 형광 비교 양자로써 결정되었다.

RNA의 효소 합성. 이중 가닥 PCR DNA로부터의 전사 반응과 합성 올리고뉴클레오티드가 이전에 설명(Milligan and Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51(1989))되었던 대로 수행되었다. RNA 전체 길이가 변성 PAGE로 정제되었고, 전기용출되었고, 탈염되었다. 풀 RNA 농도는 1300O.D./μ㏖; RNA124, 1250O.D./μ㏖; RNA47.1, 480O.D./μ㏖의 소멸 계수를 사용하여 측정되었다. 이중 가닥 풀 DNA로부터의 전사는 ∼90나노몰의 풀 RNA를 생성하였다.

RNA-퓨로마이신 컨쥬게이트의 효소 합성. myc와 풀 메신저(messenger) RNA 서열을 올리고뉴클레오티드를 함유하는 퓨로마이신으로 연결하는 것이 19.35(5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A)(서열 28)로 규정되는 DNA 스플린트를 사용하고, Moore and Sharp(Science 250:992(1992))에 의해 설명된 것과 유사한 과정을 거쳐 수행되었다. 반응은 mRNA, 스플린트, 및 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드(30-P, dA27dCdCP)가 0.8:0.9:1.0의 몰비와 풀 mRNA 피코몰당 DNA 리가제 1-2.5유니트로 하여 구성되었다. 반응은 상온에서 1시간동안 이루어졌다. 풀 RNA 융합물의 제조에서, mRNA 농도는 ∼6.6μ몰이었다. 결합에 이어서, RNA-퓨로마이신 컨쥬게이트가 상기 설명된 효소 반응에 따라 제조되었다. 침전물은 다시 현탁(resuspend)되었고, 융합물의 총 길이는 상기 설명된 바와같이, 변성 PAGE로 정제되고, 전기용출로 분리되었다. 풀 RNA 농도는 1650O.D./μ㏖과 myc 주형 1600O.D./μ㏖의 소멸 계수를 사용하여 측정되었다. 이런 방식으로, 2.5나노몰의 컨쥬게이트가 생성되었다.

dT ₂₅ 스트렙타비딘(Streptavidin) 아가로스의 제조. 3'바이오틴(바이오텍 포스포라미디트 칼럼에서 합성됨(Glen Research))을 함유하는 dT₂₅가 1-10μM로 상온에서 1시간동안 스트렙타비딘 아가로스 슬러리(아가로스 50부피%, Pierce Rockford, IL)와 함께 인큐베이션 되고 세척되었다. 아가로스의 바인딩 용량이 용액에서의 바이오틴-dT₂₅의 소멸 및/또는 알려진 양의 상보성 올리고뉴클레오티드로의 수지의 적정에 의해 광학적으로 측정되었다.

이. 콜라이(E. coli) 유래 추출물과 리보좀을 사용한 해독 반응. 일반적으로, 해독반응이 구입된 키트(예를들어, 이. 콜라이(E. coli) S30 Extract for Linear Templates, Promega, Madison, WI)를 가지고 수행되었다. 그러나, Kudlicki et al (anal. Biochem. 206:389(1992))에 의해 설명된 바에 따라 제조된 리보좀 부분뿐만 아니라, E. coli MRE600 (ATCC, Rockville, MD로부터 얻음)이 또한 공개된 프로토콜(예를 들면, Ellman et al., Meth. Enzymol. 202: 301(1991))에 따라 제조되는 S30 추출물을 생성하는데 사용되었다. 표준 반응이 마커(marker)로서 ³⁵S 메티오닌 20-40μCi와 함께 50㎕ 부피로 실시되었다. 반응 혼합물은 30% 추출물 v/v, 9-18mM MgCl₂, 메티오닌이 제외된 40% 프리믹스 (Promega) v/v, 그리고 주형 5μM (예를 들면, 43-P)로 구성되었다. 공동 인큐베이션 실험을 위하여, 올리고 13-P와 25-P가 5μM의 농도로 첨가되었다. 리보좀을 이용한 실험에서, 반응당 3㎕ 리보좀 용액이 세포 용해물을 대신하여 첨가되었다.

밀 유아 해독 반응. 도 8의 해독 반응이 메티오닌이 없는 구입 키트(Promega)를 사용하여 제조자의 추천 방법에 따라 실시되었다. 주형 농도는 43-P이 4μM이고, LP77과 LP154가 0.8μM이었다. 반응은 30μCi ³⁵S 메티오닌과 함께 25℃에서 총부피 25㎕로 실시되었다.

망상적혈구 해독 반응. 해독반응이 구입된 키트(Novagen, Madison, WI)로써 또는 공개된 프로토콜(Jackson and Hunt, Meth. Enzymol. 96:50(1983))에 따라서 제조된 추출물을 사용하여 실시되었다. 망상적혈구가 풍부한 혈액이 Pel-Freeez Biologicals(Rogers, AK)로부터 얻어졌다. 두 경우에, 반응 조건은 Red Nova Lysate(Novagen)를 사용할 때 추천되었던 것들이었다. 반응물은 100mM KCl, 0.5mM MgOAc, 2mM DTT, 20mM HEPES pH 7.6, 8mM 크레아틴 포스페이트(creatin phosphate), 각각의 아미노산 25μM(³⁵S MET이 사용되었다면 메티오닌이 없는 것으로), 그리고 세포 용해물 40% v/v로 구성되었다. 인큐베이션은 30℃, 1시간으로 시행되었다. 주형 농도는 실험에 따라 다르지만 50nM에서 1μM의 범위에 일반적으로 걸쳐있고, 다만 43-P(도 6h)는 예외적으로 4μM였다.

랜덤화된 풀을 생성하기 위해, 10㎖의 해독 반응물 주형 농도 ∼0.1μM(주형 1.25나노몰)로 실험되었다. 부가적으로, ³²P표지된 주형이 정제와 선별 과정 각 단계에 존재하는 물질의 양을 측정하기 위하여 포함되었다. 30℃에서 1시간동안 해독한 후, 반응물은 30-60분 동안 얼음으로 냉각되었다.

dT ₂₅ 스트렙타비딘 아가로스와의 융합물의 분리. 인큐베이션 이후에, 해독 반응물은 10X몰 이상의 과량이고 그 dT₂₅ 농도가 ∼10μM(세포 용해물의 부피와 같거나 그 이상의 슬러리 부피)인 dT₂₅-바이오틴-스트렙타비딘 아가로스를 함유한 분리 버퍼(1.0M NaCl, 0.1M 트리스 클로라이드 pH 8.2, 10mM EDTA, 1mM DTT)에 약 150배 정도 희석되었고, 4℃, 1시간 교반하에 인큐베이션된다. 아가로스는 필터링(Millipore ultrafree MC 필터) 또는 원심분리에 의해 혼합물에서 제거되고 찬 분리 버퍼로 2-4회 세척되었다. 주형은 15mM NaOH, 1mM EDTA의 50-100㎕ 부분표본으로 반복 세척됨에 의해 dT₂₅ 스트렙타비딘 아가로스로부터 분리되었다. 용리액(eluent)은 즉시 3M NaOAc pH 5.2, 10mM 스퍼미딘으로 중화되었고, 에탄올로 침전되었다. 풀 반응에서, 회복된 총 방사성량은 대략 50-70%의 입력(input) 주형이 회복되었음을 제시한다.

티오프로필 세파로스(Thiopropyl Sepharose)와의 융합물의 분리. 도 13에서와 같이 시스테인을 함유한 융합물이 티오프로필 세파로스 6B(Pharmacia)를 사용하여 정제될 수 있다. 본원에서 설명된 실험에서, 분리는 해독 반응물로부터 직접 또는 융합물(예를 들면, 스트렙타비딘 아가로스)의 개시 분리(initial isolation)에 이어서 실시되었다. 직접 정제된 시료들에서, 세파로스에 대하여 1:10(v/v)비의 세포 용해물이 사용되었다. 풀에서, 모든 융합물질을 5㎖ 반응 혼합물로부터 분리하기 위하여 0.5㎖의 세파로스 슬러리가 사용되었다. 시료들은 DNase가 없는 RNase를 함유한 1X TE 8.2(10mM 트리스-Cl, 1mM EDTA, pH 8.2) (Boehringer Mannheim)에서 티오프로필 세파로스의 50:50 (v/v) 슬러리로 희석되었고, 4℃에서 1-2시간 회전하에 인큐베이션시켜 완전히 반응하도록 하였다. 과량의 액체가 제거되었고, 세파로스는 20mM DTT를 함유한 분리 버퍼로 반복해서 세척되고 원심분리 또는 필터링에 의해 회수된다. 융합물은 10mM 트리스 클로라이드 pH8.2, 1mM EDTA에서의 25-30mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 용액을 사용하여 세파로스로부터 용출되었다. 융합물은 그리고 상기에 설명된 바와 같이 고압하의 증발과 에탄올 침전의 조합에 의해서 농후화된다. 풀 반응에서, 총 회복된 방사성은 주형의 약 1%가 융합물로 전환되었음을 보인다.

어떠한 응용에서는, dT₂₅를 첨가하고 4℃에서 1시간동안 회전시킨다. 아가로스는 찬 분리 버퍼로 3번 헹궈지고, 필터링을 통해 분리되며, 상기와 같이 바인딩되어 있던 물질(bound material)이 용출(eluting)된다. 담체 tRNA가 첨가되고, 융합 생성물은 에탄올로 침전된다. 시료는 주형의 RNA 부분을 제거하기 위하여 DNase이 없는 RNase A를 함유하는 TE pH 8.2에 재현탁(resuspend)된다.

면역침강 반응. 해독 반응물로부터 펩티드의 면역침강(도 10)은 4㎕의 망상적혈구 해독 반응물, 2㎕의 평균적 쥐 혈청, 그리고 20㎕의 Protein G+A 아가로스 (Calbiochem, La Jolla, CA)를 20㎕ PBS (58mM Na₂HPO₄, 17mM NaH₂PO₄, 68mM NaCl), 버퍼 희석액(10mM 트리스 클로라이드 pH 8.2, 140mM NaCl, 1% v/v Triton X-100), 또는 PBSTDS(PBS + 1% Triton X-100, 0.5% 디옥시콜레이트(deoxycholate), 0.1% SDS) 중의 하나와 혼합함에 의해 실시되었다. 시료들은 4℃에서 1시간동안 회전되고, 이어서 2500rpm으로 15분 동안 원심분리된다. 일루언트가 제거되고, 10㎕의 c-myc 단클론 항체 9E10(Calbiochem, La Jolla, CA)와 15㎕의 Protein G+A 아가로스가 첨가되고 4℃에서 2시간동안 회전되었다. 그리고 나서 시료들은 1㎖ 부피의 PBS, 버퍼 희석액, 또는 PBSTDS 중의 둘로 세척되었다. 40㎕의 겔 로딩(loading) 버퍼(Calbiochem Product Bulletin)가 혼합물에 첨가되었고, Schagger von Jagow(Anal. Biochem. 166:368(1987))에 의해 설명된 것과 같이 20㎕가 변성 PAGE에 로딩되었다.

융합물의 면역 침강(도 11에 보임)이 8㎕의 망상적혈구 해독 반응물과 300㎕ 의 버퍼 희석액(10mM 트리스클로라이드 pH 8.2, 140mM NaCl, 1% v/v Triton X-100), 15㎕ Protein G 세파로스(Sigma), 그리고 10㎕(1㎍) c-myc 항체 9E10(Calbiochem)를 혼합함에 의해 실시되었고, 이어서 4℃에서 6-7시간동안 회전되었다. 분리 이후에 시료들은 세척되고, DNase가 없는 RNase로 처리되었고, 폴리뉴클레오티드 키나제와 ³²P 감마 ATP로 표지되었고, 그리고 변성 요소(urea) PAGE로 분리되었다(도 11).

융합물 풀의 역전사. 역전사 반응이 주형, 물, 그리고 프라이머가 70℃에서 2분 동안만 인큐베이션된 것(Gibco BRL, Grand Island, NY)을 제외하고 Superscript Ⅱ의 제조자의 추천방법에 따라서 실시되었다. 연장을 관찰하기 위하여, 50μCi 알파 ³²P dCTP가 몇가지 반응에서 포함되었다; 기타 반응들에서는, 역전사가 ³²PαATP(New England Nuclear, Boston, MA)와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 제조된 5'³²P-표지된 프라이머를 사용하여 관찰되었다.

단백질 G와 항체 세파로스의 제조. 50㎕ Protein G 세파로스 슬러리(고형분 50부피%)(Sigma)가 버퍼 희석액(10mM 트리스 클로라이드 pH 8.2, 140mM NaCl, 0.025% NaN₃, 1% v/v Triton X-100)으로 세척되고 원심분리되었다. 첫 번째 표본 용액은 선별 매트릭스(selection matrix)에 앞서 프리칼럼(precolumn)으로 사용하기 위해 보존되었다. 버퍼 희석액에서의 두 번째 표본 용액의 재현탁(resuspension) 이후에, c-myc AB-1 단클론 항체(Oncogene Science) 40㎍이 첨가되었고, 반응물은 회전하에 4℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 항체 세파로스는 1500-2500rpm에서 15분동안 원심분리되었고, 1-2회 버퍼 희석액으로 세척되었다.

선별(selection). 융합물의 분리와 상보적 가닥 합성 이후에, 전체 역 트랜스크립타제(transcriptase) 반응이 선별 과정에서 즉시 실행되었다. 두가지 프로토콜이 여기서 제시된다. 라운드(round) 1에서, 역 트랜스크립타제 반응물이 직접 상기에서 설명된 것과 같이 제조된 항체 세파로스로 첨가되었고, 2시간 동안 인큐베이션 되었다. 이후의 라운드에서, 반응물은 고정된(immobilized) 항체보다 단백질 G와 상호작용하는 바인더의 수를 줄이기 위하여 항체 칼럼에 앞서, 세척된 단백질 G 세파로스와 함께 ∼2시간동안 인큐베이션되었다.

매트릭스로부터 풀을 용출하기 위하여, 6-7가지의 시도가 행해질 수 있다. 첫 번째는 선별 매트릭스를 4% 아세트산으로 세척하는 것이다. 이 과정은 펩타이드를 매트릭스로부터 분리한다. 대안적으로, 더 격렬한 세척(예를들어, 요소나 다른 변성제를 사용한)이 아세트산 방법 대신 또는 부가하여 행해질 수 있다.

선별된 융합물의 PCR. 선별된 분자들은 풀의 구축에 대하여 상기에서 설명된 것과 같은 표준 프로토콜을 사용한 PCR에 의해 증대될 수 있다.

β-글로빈 융합물의 합성 및 시험

β-글로빈 융합물 구조체를 합성하기 위하여, β-글로빈 cDNA는 생산자의 프로토콜에 따라 프라이머 18.155(5'GTG GTA TTT GTG AGC CAG)(서열 29) 200 pm 및 슈퍼스크립트 역전사 효소(Gibco BRL)를 이용한 역전사에 의해 글로빈 mRNA 2.5 ㎍으로부터 생산되었다. 상기 프라이머 서열은 종결 코돈 β-글로빈 5'의 18 뉴클레오티드에 상보적이었다. T7 프로모터를 첨가하기 위하여, 20㎕의 역전사 반응물을 취해서 프라이머 18.155 및 40.54(5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C)(서열 30)를 이용하여 여섯 사이클의 PCR이 행해졌다. 이어서 "합성 β-글로빈(syn-β-globin)" mRNA가 밀리간(Milligan) 및 울렌벡(Ulenbeck)(Methods Enzymol. 180:51(1989))에 따른 T7 런오프(runoff) 전사에 의해 생산된 후, 본원에 기술된 바와 같이 겔 정제(gel purified)되고, 전기용출되고, 탈염되었다. 이후에 "LP-β-글로빈"은 프라이머 20.262를 스플린트로서 사용하는 무어(Moore) 및 샤프(Sharp)의 방법(Science 256:992(1992))에 따라 syn-β-글로빈 구조체로부터 상기 구조체를 30-P에 연결하는 것에 의해 생성되었다. 이후에 상기 연결 반응의 생성물은 상기와 같이 겔로 세정되고, 전기용출되고, 탈염되었다. 상기 최종 생성물의 농도는 260nm의 흡광도에 의해 결정되었다.

이들 β-글로빈 주형은 이후에 표 1에서 기술한 바와 같이 각 25㎕의 총 부피에 있어서 생체외에서 해독되었다. Mg²⁺는 25mM의 스톡 용액으로부터 첨가되었다. 모든 반응은 30℃에서 한 시간동안 인큐베이션되었고 -20℃에서 밤새 놓아두었다. 이어서 dT₂₅ 침전가능한 CPM을 6㎕의 세포용해물을 사용하여 두차례에 걸쳐 측정하였고 배경값을 뺀 후 평균내었다.

β글로빈 주형에 의한 해독반응
반응	주형	Mg2+(mM)	36S Met(㎕)	TCA CPM(2㎕)	dT25CPM(6㎕)
1	---	1.0	2.0(20μCi)	3312	0
2	2.5㎍ syn-β-글로빈	0.5	2.0(20μCi)	33860	36
3	2.5㎍ syn-β-글로빈	1.0	2.0(20μCi)	22470	82
4	2.5㎍ syn-β-글로빈	2.0	2.0(20μCi)	15696	218
5	2.5㎍ LP-β-글로빈	0.5	2.0(20μCi)	32712	218
6	2.5㎍ LP-β-글로빈	1.0	2.0(20μCi)	24226	402
7	2.5㎍ LP-β-글로빈	2.0	2.0(20μCi)	15074	270

겔 분석을 위한 샘플을 준비하기 위하여, 6㎕의 각 해독 반응은 1000㎕의 분리 버퍼(1M NaCl, 100mM Tris-Cl pH 8.2, 10mM EDTA, 0.1mM DTT), 1㎕의 RNA분해효소 A(DNA분해효소 없음, 보링거 만하임), 및 20㎕의 20μM dT₂₅ 스트랩타비딘 아가로스와 혼합되었다. 샘플들은 한 시간동안 회전하면서 4℃에서 인큐베이션되었다. 여분의 분리 버퍼는 제거되었고, 상기 샘플들은 잔여 분리 버퍼를 제거하기위하여 밀리포어(Millipore) MC 필터에 첨가되었다. 이후에 샘플들은 50㎕의 H₂O에 의해 네 번 세정되었고, 50㎕의 15mM NaOH 및 1mM EDTA에 의해 두 번 세정되었다. 상기 샘플(300㎕)는 pH 6.8인 100㎕의 TE(10 mM Tris-Cl, 1mM EDTA)에 의해 중화되었고, 1㎕의 1mg/ml RNA분해효소 A(상술한 바와 같은)가 첨가되었고, 상기 샘플은 37℃에서 인큐베이션되었다. 10㎕의 2X SDS 로딩 버퍼(125 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 2% β-메캅토에탄올 20% 글리세롤, 0.001% 브롬펜 블루)가 첨가되었고, 상기 샘플은 건조를 위해 냉동건조(lyophilized) 및 20㎕의 H₂O 및 1% β-메캅토에탄올 내에서 고정되었다. 이후에 샘플들은 샤거 및 폰 야곱(Analytical Biochemistry 166:368(1987))에 기술된 바와 같이 겔을 용해하는 펩타이드 위에 로드되었고 방사선사진에 의해 가시화되었다.

이들 실험의 결과는 도 15A 및 15B에 도시된다. 도 15A에 나타낸 바와 같이, ³⁵S-메치오닌은 syn-β-글로빈 및 LP-β-글로빈 융합물의 단백질 부분으로 병합되었다. 상기 단백질은 불균일(heterogeneous)하였으나, 하나의 강한 밴드가 β-글로빈 mRNA에 예상되는 움직임을 보였다. 또한, 도 15B에 도시된 바와 같이, dT₂₅ 분리 및 RNA분해효소의 절단 후에, 어떤 ³⁵S-표지된 물질도 syn-β-글로빈 레인 내에 남아있지 않았다(도 15B, 레인 2-4). 이와는 반대로, LP-β-글로빈 레인 내에는 동일한 크기의 ³⁵S-표지된 생성물이 관찰되었다.

이들 결과는 상술한 바와 같이, 융합 생성물이 상기 주형이 퓨로마이신으로 채워진 경우에만 올리고 뉴클레오티드 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된다는 것을 나타낸다. 이는 신틸레이션 카운팅에 의해 명확해진다(표 1을 보라). 상기 수득된 물질은 β-글로빈의 어느 부분에 융합된 30-P 링커로 채워져 있을 것으로 예상된다. 상기 융합 생성물은 겔 분석에 의해 측정되었을 때 그 크기에 있어서 매우 균일 하였다. 그러나, 상기 생성물은 천연 β-글로빈에 매우 유사한 움직임을 보이기 때문에(도 15A 및 15B, 제어 레인), 융합 생성물의 단백질 부분의 정확한 길이를 결정하기 어렵다.

RNA-단백질 융합물 형성의 부가적 최적화

몇몇 인자들이 RNA-단백질 융합물 형성의 효과를 더욱 증가하기 위하여 발견되어 왔다. 융합 형성, 즉, mRNA의 3' 말단에 있어서 tRNA로부터 퓨로마이신 부분으로의 성장 초기의 펩타이드 사슬의 전달은, 성장 초기의 펩타이드를 생산하는 개방 해독틀의 초기의 상대적으로 빠른 해독에 이어지는 느린 반응이다. 융합물 형성의 범위는 본질적으로 높은(elevated) Mg²⁺조건(바람직하게는, 50-100mM의 범위에서) 내에서 해독 후 인큐베이션 및/또는 mRNA 및 퓨로마이신 부분 사이에서 더 유연한 링커의 사용에 의해 강화될 수 있다. 더욱이, 저온(바람직하게는, -20℃)에서의 긴 인큐베이션(12-48시간) 또한 30℃에서의 인큐베이션 동안에 일어나는 것보다 적은 mRNA 분해에 의해 증가된 수율의 융합물을 얻는 결과를 낳는다. 이들 인자를 결합함에 의해, 후술하는 바와 같이 입력된 mRNA의 40%까지 mRNA-펩타이드 융합 생성물로 전환될 수 있다.

mRNA-퓨로마이신 콘쥬게이트의 합성. 이러한 최적화 실험에 있어서, 일반적으로 상술한 바와 같이, 퓨로마이신을 포함하는 링커 올리고뉴클레오티드는 상보적인 DNA 스플린트에 있어서 박테리오파지 T4 DNA 리가제를 사용하는 mRNA의 3' 말단에 연결되었다. T4 DNA 리가제는 연결 접합부 근처의 정확한 염기-쌍짓기(base-pairing)를 선호하거나 또는 T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리메라제에 의한 런-오프 전사 생성물(runoff transcription product)은 종종 그들의 3' 말단에서 상이하기 때문에(Nucleic Acids Research 15:8783(1987)), 옳은 3'-말단을 포함하는 RNA들만이 효과적으로 연결되었다. 표준 DNA 스플린트가 사용된 경우에, 대략 40%의 런오프 전사 생성물이 퓨로마이신 올리고에 연결되었다. 연결 생성물의 양은 여분의 RNA를 사용함에 의해 증가되었으나, 여분의 퓨로마이신 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우에는 증가하지 않았다. 특별한 이론에 얽메이지 않고, 연결을 위한 제한 인자(limiting factor)는 DNA 스플린트의 해당 영역에 대하여 전체가 상보적인 RNA의 양이었다.

이들의 연결이 3' 말단("N+1 생성물"이라 함)에 있어서 주형이 없는 뉴클레오티드에 의해 말단으로 전사되도록 하기 위하여, 표준 DNA 스플린트와 연결 접합에 있어서 부가적인 랜덤 염기를 포함하는 신규한 DNA 스플린트의 혼합물이 사용되었다. 연결 효율은 이러한 혼합된 DNA 스플린트에 있어서 예시적 RNA 주형(즉, RNA124)에 대하여 70% 이상까지 증가되었다.

이 변형된 DNA 스플린트 방법 이외에, mRNA-퓨로마이신 콘쥬게이트 형성의 효율은 후술하는 세 인자를 고려함에 의해 또한 부가적으로 최적화된다. 첫째, 바람직하게는 스플린트 올리고뉴클레오티드에 대한 어닐링을 방해하게 되는 중요하고 안정한 2차 구조를 갖는 3' 말단이 결여되도록 설계되거나 이용될 수 있다. 더욱이, 고농도의 염은 때때로 리게이션 반응의 실패를 가져오기 때문에, NAP-25를 이용하는 올리고 뉴클레오티드의 탈염을 통하여 칼럼들은 바람직하게 과정 중 하나의 단계로서 포함되었다. 최종적으로, 연결 반응은 상대적으로 빠르고 일반적으로 상온에서 40분내에 완성되기 때문에, 긴 인큐베이션 기간은 일반적으로 실시되지 않고 때때로 불필요한 RNA의 분해를 가져왔다.

상기 조건을 이용하여, mRNA-퓨로마이신 콘쥬게이트는 후술하는 바와 같이 합성되었다. myc RNA 서열(RNA124)의 퓨로마이신을 포함하는 올리고뉴클레오티드로의 연결은 표준 DNA 스플린트(즉, 5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA) 또는 연결 접합에 있어서 랜덤 염기(N)를 포함하는 스플린트(즉, 5'-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA)를 이용하여 수행되었다. 상기 반응은 몰비 1.0:1.5-2.0:1.0의 mRNA, DNA 스플린트, 및 퓨로마이신 뉴클레오티드로 구성되었다. 이들 구성요소의 혼합물은 먼저 1분 동안 94℃로 가열되고 이후에 15분 동안 얼음으로 냉각되었다. 연결 반응은 50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mM ATP, 25㎍/ml BSA, 15μM 퓨로마이신 올리고, 15μM mRNA, 22.5 30μM DNA 스플린트, 1U/㎕의 RNA분해효소 억제자(프로메가), 및 퓨로마이신 올리고의 피코몰당 1.5 단위의 T4 DNA 리가제내에서 상온으로 한 시간 동안 수행되었다. 이어지는 인큐베이션에서, EDTA는 30mM의 최종 농도에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 페놀/클로로포름으로 추출되었다. 총 길이의 콘쥬게이트는 변성 PAGE 및 전기용출에 의해 분리되었다.

일반적인 망상적혈구(Reticulocyte) 해독 조건. mRNA-퓨로마이신 콘쥬게이트의 합성을 향상하는 데 부가하여, 해독 반응은 또한 더욱 후술하는 바와 같이 최적화된다. 반응은 상이한 여러 판매원(Novagen, Madison, WI; Amersham, Arlington Heights, IL;Bochringer Mannheim, Indianapolis, IN; Ambion, Austin, TX; 및 Promega, Madison,WI)으로부터의 토끼 망상적혈구 용해물 내에서 수행된다. 전형적인 반응 혼합물(최종 부피 25㎕)은 pH7.6의 20mM HEPES, 2mM DTT, 8mM 크레아틴 포스페이트, 100mM KCl, 0.75mM Mg(OAc)₂,1mM ATP, 0.2mM GTP, 25μM의 각 아미노산(³⁵S-Met가 사용되는 경우 0.7μM 메치오닌), 1U/㎕의 RNA분해효소, 및 60%(v/v)의 세포용해물로 구성되었다. 주형의 최종 농도는 50nM 내지 800nM의 범위내였다. 각 인큐베이션에 대하여, 세포용해물을 제외한 모든 구성요소는 얼음 상에서 주의 깊게 혼합되었고, 상기 동결된 세포용해물은 사용 전에 즉시 녹였다. 세포용해물의 첨가 후에, 반응 혼합물은 부드러운 피펫팅에 의해 총체적으로 혼합되었고 해독을 개시하기 위하여 30℃로 인큐베이션되었다. Mg²⁺ 및 K⁺의 최적화된 농도는 다른 mRNA에 대하여 각각 0.25mM-2mM 및 75mM-200mM의 범위 내에서 변하였고 바람직하게는 예비 실험에서 결정되었다. 특히 제대로 해독되지 않은 mRNA에 대하여, 헤민, 크레아틴 포스페이트, tRNA, 및 아미노산의 농도는 또한 때때로 최적화되었다. 포타슘 클로라이드는 융합 반응에 대하여 일반적으로 포타슘 아세테이트보다 적합하나, KCl 및 KPAc의 혼합물은 때때로 더 나은 결과를 생산한다.

30 내지 90분 동안 30℃에서의 해독 후에, 반응은 40분간 얼음 위에서 냉각되었고, Mg²⁺가 첨가되었다. 이 단계에서 첨가된 Mg²⁺의 최종 농도는 또한 다른 mRNA 주형에 대하여 최적화되었으나, 일반적으로 50mM에서 100mM의 범위내였다(혼합 주형의 풀의 경우에는 50mM가 선호됨). 상기 혼합 결과물은 -20℃에서 16내지 48분간 인큐베이션되었다. 표지된 융합 생성물을 가시화하기 위하여, 상기 2㎕의 반응 혼합물이 4㎕의 로딩 버퍼와 혼합되었고, 상기 혼합물은 3분간 75℃에서 가열되었다. 결과되는 혼합물은 이후에 6% 글리신 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(³²P-표지된 주형의 경우) 또는 8% 트리신(tricine) SDS-폴리아크릴아마이드 겔(³⁵S-Met-표지된 주형의 경우)상에 로딩되었다. 이러한 접근 대신에, 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이, 융합 생성물은 또한 dT₂₅ 스트렙타비딘 아가로스 또는 티오프로필 세파로스(또는 둘 다)를 사용하여 분리될 수 있다.

SDS-PAGE에 의한 본질적 분석을 위한 RNA-링커-퓨로마이신-펩타이드 콘쥬게이트의 RNA 부분을 제거하기 위하여, 적당한 양의 EDTA가 해독후 인큐베이션 이후에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 마이크로콘-10(또는 마이크로콘-30) 칼럼을 사용하여 탈염되었다. 2㎕의 결과 혼합물(대략 총 25㎕)이 18㎕의 RNA분해효소 H 버퍼(30mM Tris-HCl, pH 7.8, 30mM(NH₄)₂SO₄, 8mM MgCl₂, 1.5mM β-메캅토에탄올, 및 적당한 양의 상보성 DNA 스플린트)와 혼합되었고, 상기 혼합물은 4℃에서 45분간 인큐베이션되었다. 이후에 RNA분해효소 H가 첨가되었고, 절단이 37℃에서 20분간 수행되었다.

퓨로마이신 올리고의 질(Quality). 퓨로마이신 올리고의 질 또한 효과적인 융합 생성물을 위해 중요했다. 5'-DMT, 2'-석시닌, N-트리플로로아세틸 퓨로마이신과 CPG의 결합은 표준 뉴클레오티드의 결합만큼 효과적이지 못했다. 이와 같이, 결합 반응은 너무 낮은 농도의 결합된 퓨로마이신을 갖는 CPG가 생성되지 않도록 주의깊게 모니터링되었고, CPG 상의 반응하지않은 아미노기는 3'-말단 퓨로마이신이 없는 올리고뉴클레오티드의 본질적인 합성을 피하기 위해 모두 식혀졌다. 또한 매우 미세한 그물 입자를 포함하는 CPG의 사용을 피하는 것 역시 중요한데, 이는 순차적인 자동 올리고뉴클레오티드 합성 과정 동안 밸브가 막히는 문제의 원인이 될 수 있기 때문이다.

더욱이, 합성된 퓨로마이신 올리고는 바람직하게는 3' 말단에서 퓨로마이신의 존재를 명확히 하기 위하여 큰 스케일의 사용 전에 시험된다. 본 실험에서는, 퓨로마이신이 3' 말단에서 1차 아미노기를 포함하는 디옥시아데노신과 치환되는 경우에는 어떠한 융합물도 관찰되지 않았다. 3' 하이드록실기(즉, 3' 말단-퓨로마이신이 없는 올리고의 바람직하지않은 합성)의 존재를 시험하기 위하여, 퓨로마이신 올리고는 먼저 방사선표지될 수 있고(즉, 5'-포스포릴레이션에 의해), 이후에 말단 디옥시뉴클레오티딜 전달효소에 의한 확장을 위해 프라이머로 사용되었다. 3'-말단 퓨로마이신 부분의 존재에 있어서, 신장 생성물은 관찰되지 않았다.

해독의 시간 과정 및 해독후 인큐베이션 해독 반응은 상대적으로 빠르고 일반적으로 30℃에서 25분내에 완성된다. 그러나, 융합 반응은 더욱 느리다. 표준링커(dA₂₇dCdCP)가 30℃에서 사용되면, 융합물 합성은 부가적인 45분내에 그 최고 수준에 이르렀다. 해독후 인큐베이션은 저온, 예를 들면, 상온, 0℃, 또는 -20℃에서 수행될 수 있다. mRNA 주형의 적은 분해가 -20℃에서 관찰되었고, 가장 좋은 융합 결과가 2일간 -20℃에서의 인큐베이션 후에 수득되었다.

Mg²⁺농도의 효과 해독후 인큐베이션에 있어서 Mg²⁺의 고농도는 융합 형성을 크게 자극하였다. 예를 들면, 상술한 바와 같은 myc RNA 주형에 대하여, 융합 형 성의 3-4배 자극이 -20℃에서 16 시간의 인큐베이션 동안 50 mM Mg²⁺의 존재 하에 표준 링커(dA₂₇dCdCP)를 사용하여 관찰되었다(도 17, 레인 3 및 4를 비교하라). 이와 유사하게, 반응이 30-45분간 상온에서 수행되는 경우에 효과적인 융합 형성이 또한 50-100 mM Mg²⁺ 농도의 존재 하에 해독후 인큐베이션을 사용하여 관찰되었다.

링커 길이와 서열. 융합 반응의 링커 길이에 대한 의존성도 조사하였다. 21 및 30 뉴클레오티드(n=18-27) 사이의 범위 내에서, 융합 반응의 효율에 있어서 작은 변화가 보인다(상술한 바와 같이). 짧은 링커들(즉, 길이에 있어서 13 뉴클레오티드)이 낮은 융합을 보인다. 더욱이, 긴 길이의 특별한 링커(즉,45 뉴클레오티드 및 54 뉴클레오티드의) 또한 얼마간의 낮은 융합 효율을 가짐에도 불구하고, 훨씬 더 긴 링커 또한 융합 반응의 효율을 최적화하는데 사용될 수 있다.

링커 서열에 대하여, 리보뉴클레오티드 잔여물에 의한 3' 말단 근처의 디옥시리보뉴클레오티드 잔여물의 치환은 융합 효율을 그다지 변화시키지 않는다. 그러나, 링커의 3' 말단에서의 dCdCP(또는 rCrCp) 서열은 융합 형성에 중요하다. dCdCP의 dUdUP로의 치환은 융합 형성의 효율을 매우 감소시켰다.

링커 유연성. 링커의 유연성에 대한 융합반응의 의존성이 시험되었다. 이들 실험에서, 링커의 강직함이 3' 말단 근처의 상보적 올리고 뉴클레오티드에 의한 어닐링에 의해 증가된 경우에 융합 효율이 낮은가가 평가되었다. 이와 마찬가지로 더 유연한 링커(예를 들면, dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP, 여기서 C₉는 HO(CH₂CH₂O)₃PO₂)가 사용되었을 때, 융합 효율은 매우 향상되었다. 표준 링커(dA₂₇dCdCP)와 비교하면, 더 유연한 링커(dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP)의 사용은 RNA124에 대하여 4배 이상 융합 효율을 향상시킨다(도 17, 레인 1 및 레인 9를 비교하라). 더욱이, 해독후 융합이 Mg²⁺의 높은 농도 없이는 잘 진행되지 않는 표준 링커에 의한 주형과는 반대로(도 17, 레인 3 및 4), 유연한 링커에 의한 주형은 -20℃에서의 확장된 해독후 인큐베이션에 있어서 융합 생성물의 좋은 산출을 위해 고농도의 Mg²⁺를 요하지 않았다(도 17, 레인 11 및 레인 12를 비교하라). 그러므로, 고농도의 Mg²⁺의 해독후 첨가가 바람직하지 않는 경우에 이 링커는 매우 유용하다. 더욱이, 상기 유연한 링커는 또한 고농도의 Mg²⁺의 존재 하에 최적화된 융합 산출을 생산한다.

융합 효율의 정량. 융합 효율은 융합 생성물로 전환하는 해독된 펩타이드의 비 또는 융합 생성물로 전환하는 입력의 비로 표현될 수 있다. 융합 생성물로 전환하는 해독된 펩타이드의 비를 결정하기 위하여, 해독된 펩타이드의 ³⁵S-Met 표지가 실시되었다. 이들 실험에 있어서, dA₂₇dCdCP 또는 dA₂₇rCrCP 링커가 사용되었을 때, 약 3.5%의 해독된 펩타이드는 30℃에서 한시간의 해독 인큐베이션 후에 그의 mRNA에 융합되었다. 이 수치는 -20℃에서 밤샘 인큐베이션 후에 12%로 증가되었다. 해독후 인큐베이션이 Mg²⁺의 고농도의 존재하에 수행되었을 때, 해독된 펩타이드의 50% 이상이 주형으로 융합되었다.

유연한 링커를 갖는 주형에 대하여, 30℃에서 1시간의 해독 후에 해독된 펩타이드의 약 25%가 주형으로 융합되었다. 이 수치는 -20℃에서 밤샘 인큐베이션 후에 50%로 증가되었고 해독후 인큐베이션이 50mM Mg²⁺의 존재 하에 수행되었을 때에는 75%이상으로까지 증가되었다.

융합 생성물로 전환되는 입력 주형의 %를 결정하기 위하여, 상기 해독은 ³²P-표지된 mRNA-링커 주형을 사용하여 수행되었다. 유연한 링커가 사용되고 해독후 인큐베이션이 -20℃에서 Mg²⁺없이 수행되었을 때, 입력 RNA 주형의 농도가 각각 800, 400, 200, 100, 및 50nM인 경우 약 20%, 40%, 40%, 35%, 및 20%의 입력 주형이 mRNA-펩타이드 융합으로 전환되었다(도 18). 50mM Mg²⁺의 존재 하에 해독후 인큐베이션이 수행되었을 때 유사한 결과가 수득되었다. 최상의 결과는 노바젠(Novagen), 아머샴(Amersham), 또는 앰비온(Ambion)으로부터 입수된 세포용해물을 사용하여 얻어졌다(도 19).

SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이 mRNA 주형이 길다면 mRNA와 mRNA-펩타이드 융합물 간의 이동성 차이는 매우 작다. 이러한 경우에, 주형은 ³²P를 가진 링커의 5' 말단에 표지될 수 있다. 상기 긴 RNA 부분은 이후에 해독/인큐베이션 후의 상보적 DNA 스플린트의 존재 하에 RNA분해효소 H에 의해 절단되었고, 상기 융합 효율은 변형되지 않은 링커 대 링커-펩타이드 융합비의 정량에 의해 결정되었다. 3'-P 및 5'-OH를 생산하는 RNA분해효소 A 절단물과 비교하여, 이런 접근은 링커의 5' 말단에서의 ³²P가 제거되지 않은 경우에 장점을 갖는다.

해독후 인큐베이션 동안의 분자내 대 분자간 융합. 상술한 실험에 부가하여, Mg²⁺의 존재 하에 -20℃에서 일어나는 융합 반응이 자연상태에서 분자내 인지 분자간인지 여부를 시험하였다. 자유 링커(dA₂₇dCdCP 또는 dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP, 여기서 C₉는 HO(CH₂CH₂O)₃PO₂)는 DNA 링커를 포함하는 주형과 함께 공인큐베이션되었으나, 이는 3' 말단의 퓨로마이신이 없이, 상술한 바와 같은 해독 및 해독후 인큐베이션 조건하에서이다. 이들 실험에서, ³⁵S-Met의 감지가능한 얼마만큼의 양도 링커-펩타이드 생성물에 편입되지 않았는데, 이는 해독후 융합이 주로 동일한 리보좀에 결합된 성장 초기의 펩타이드와 mRNA 사이에서 일어난다는 사실을 제시하는 것이다.

최적화 결과. 상술한 바와 같이, 고농도의 Mg²⁺의 존재 하에 유연한 링커를 사용 및/또는 해독후 인큐베이션을 수행함에 의해, 융합 효율이 입력 mRNA의 약 40%까지 증가되었다. 이들 결과는, 생체외 해독 반응 혼합물 ㎖ 당 10¹⁴개의 mRNA-펩티드 융합물 분자가 생성됨으로써, 생체외 선별 실험에 사용하기 위한 고도로 복잡한 mRNA-펩타이드 융합물 풀이 생산될 수 있음을 시사한다.

RNA-단백질 융합물의 선별적 농후화

본 발명자들은 코드화된 펩타이드에 기초하여 랜덤 서열 융합물의 복잡한 풀로부터 특정한 RNA-펩타이드 융합물을 농후화함에 의해 선별 및 진화 실험에 있어서 RNA-펩타이드 융합물을 이용할 수 있다는 것을 입증하였다. 구체적으로, 소량의 공지의 서열(이 경우, 긴 myc 주형, LP154)이 약간의 랜덤 서열 풀(즉, LP160)과 취합된 일련의 혼합물들이 준비되었다. 이들 혼합물은 해독되었고, RNA-펩타이드 융합 생성물은 본원에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 및 디설파이드(disulfide) 친화 크로마토그래피에 의해 선별되었다. myc-주형 융합은 선별적으로 안티-myc 단클론 항체에 의해 면역침강되었다(도 16A). 이러한 선별 단계에서 달성되는 농후성을 측정하기 위하여, 면역침강 이전 및 이후로부터의 cDNA/mRNA-펩타이드 융합물의 혼합물 분취량을 방사성표지된 프라이머의 존재 하에 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 DNA는 myc 주형 서열을 절단하지만 풀은 절단하지 않는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의해 절단되었다(도 16B 및 16C). 절단 및 절단되지 않은 DNA의 비율의 정량은 상기 myc 서열이 면역침강에 의한 랜덤 도서관(library)에 비해 20-40배로 농후화됨을 나타내었다.

이 실험은 후술하는 바와 같이 수행되었다.

해독 반응. 해독 반응은 일반적으로 상술한 바와 같이 수행되었다. 특히, 반응은 30℃에서 생산자(Novagen)의 설명서에 따라 한시간동안 수행되었고 밤새 -20℃로 동결되었다. 여섯 샘플의 두가지 사양이 만들어졌는데, 하나는 ³⁵S 메치오닌을 포함하고 하나는 52μM의 최종 농도에 첨가된 비방사성(cold) 메치오닌을 포함한다. 반응 1-6은 표 2에 기술된 양의 주형을 포함하였다. 표 2 내의 모든 숫자는 25㎕ 반응 혼합 당 주형의 피코몰을 나타낸다.

도프된(Doped) 선별에 사용되는 주형
반응	LP154	LP160
1	---	---
2	5	---
3	1	20
4	0.1	20
5	0.01	20
6	---	20

dT ₂₅ 스트렙타비딘 아가로스의 준비. 스트렙타비딘 아가로스(Pierce)는 TE 8.2(10mM Tris-Cl pH8.2, 1mM EDTA)에 의해 세 번 세정되었고 TE 8.2에 있어서 1:1(v/v) 슬러리(slurry)로 고정되었다. 바이오테그 CPG(Glen Research)를 이용하여 합성된 3'바이오티닐 T₂₅은 이후에 원하는 최종 농도(일반적으로 10 또는 20μM)로 첨가되었고, 인큐베이션이 1 시간동안 교반과 함께 수행되었다. dT₂₅ 스트랩타비딘 아가로스는 이후에 TE 8.2에 의해 세 번 세정되었고 사용시 까지 4℃에서 보관되었다.

해독 반응으로부터의 주형의 정제. 해독 반응으로부터 주형을 정제하기 위하여, 25㎕의 각 반응이 제거되고 7.5ml의 분리 버퍼(1M NaCl, 100mM Tris-Cl pH 8.2, 10mM EDTA, 0.1mM DTT) 및 125㎕의 20μM dT₂₅ 스트랩타비딘 아가로스가 첨가되었다. 이 용액은 4℃에서 1시간동안 회전과 함께 인큐베이션되었다. 튜브는 원심분리되었고 용리액은 제거되었다. 1ml의 분리 버퍼가 첨가되었고, 슬러리는 고정되었고, 상기 혼합물은 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 전달되었다. 샘플은 이후에 얼음 냉각 분리 버퍼의 1ml 분취량에 의해 네 번 세정되었다. 동일한 반응으로부터의 방사성 및 비방사성 샘플은 이후에 밀리포어 MC 필터에 결합되었고 100㎕ H₂O, 0.1 mM DTT의 2부피, 및 15mM NaOH, 1mM EDTA의 2부피에 의한 세정에 의해 dT₂₅ 아가로스로부터 분리되었다.

이 용리액에 세정된 티오프로필 세파로스(thiopropyl sepharose)(Pharmacia)의 50% 슬러리 40㎕가 첨가되었고, 인큐베이션이 4℃에서 회전과 함께 1시간동안 수행되었다. 상기 샘플들은 이후에 1ml 부피의 TE 8.2에 의해 세정되었고 용리액은 제거되었다. 1㎕의 1M DTT가 상기 고체(약 20-30㎕의 총 부피)에 첨가되었고, 상기 샘플은 7 시간동안 인큐베이션되었고, 옮겨졌고, 20㎕ H₂O(총 부피 90㎕)에 의해 4번 세정되었다. 상기 용리액은 UV 흡광도에 의해 측정된 바와 같이 2.5mM 티오피리돈(thiopyridone)을 포함한다. 50㎕의 샘플은 6㎕ 3M NaOAc pH 5.2, 10mM 스퍼민(spermine), 1㎕ 글리코겐(10mg/ml, 보링거 만하임), 및 170㎕ 100% EtOH를 첨가하고, 30분간 -70℃에서 인큐베이션하고, 마이크로원심분리기 내에서 30분간 13,000rpm으로 원심분리함에 의해 에탄올 침전되었다.

역전사 효소 반응. 역전사 효소 반응이 후술하는 바와 같이 에탄올 침전된 샘플 및 티오피리돈 용리액 샘플 상에서 수행되었다. 에탄올 침전된 샘플에 대하여, 30㎕의 고정된 주형, 40㎕의 H₂O, 및 200피코몰의 프라이머 21.103(서열 22)는 70℃에서 5분간 어닐링되었고 얼음상에서 냉각되었다. 이 샘플에, 16㎕의 제 1 요소 버퍼(pH 8.3인 250mM Tris-Cl, 375mM KCl, 및 15mM MgCl₂; 기브코 비알엘(Gibco BRL)로부터 이용가능, Grand Island, NY), 100mM DTT 8㎕, 및 10mM NTP 4㎕가 첨가되었고 42℃에서 평형을 이루었으며, 슈퍼스크립트(Superscript) II 역전사 효소(Gibco BRL, Grand Island, NY)가 첨가되었다. H₂O(13㎕)가 TP 세파로스 용리액(35㎕)에 첨가되었고, 상술한 바와 같이 반응이 수행되었다. 한시간 동안의 인큐베이션 후에, 같은 번호가 매겨진 샘플들이 결합되었다(총 부피 160㎕). 10㎕의 샘플이 각각 선별되지 않은 PCR 과정 동안 보존되었고, 150㎕의 샘플이 면역침강을 위하여 보존되었다.

면역침강. 면역침강을 수행하기 위하여, 170㎕의 역전사 반응이 1ml의 희석 버퍼( pH8.2인 10mM Tris-Cl, 140mM NaCl, 1% 트리톤(triton) X-100) 및 20㎕의 단백질 G/A 콘쥬게이트(Calbiochem, La Jolla, CA)에 첨가되었고, 4℃에서 한시간동안 회전과 함께 하는 인큐베이션에 의해 예비세정되었다(precleared). 상기 용리액을 제거 후, G/A 콘쥬게이트 20㎕ 및 20㎕의 단클론 항체(2㎍, 12pmole)를 첨가한 다음, 샘플을 4℃에서 두시간동안 회전과 함께 인큐베이션하였다. 상기 콘쥬게이트는 2500rpm에서 5분간의 마이크로원심분리에 의해 침전되었고, 상기 용리액은 제거되었고, 상기 콘쥬게이트는 얼음 냉각된 희석 버퍼 1ml에 의해 세 번 세정되었다. 상기 샘플은 이후에 pH8.2인 10mM Tris-Cl 1ml, 100mM NaCl에 의해 세정되었다. 결합된 단편들(fragments)은 3 부피의 동결된 4%의 IIOAc를 사용하여 제거되었고, 상기 샘플은 건조물로 동결건조되었다.

선별 및 선별되지 않은 샘플들의 PCR. PCR 반응은 20㎕의 농도인 NH₄OH를 10㎕의 선별되지 않은 물질 및 선별된 물질의 전체에 첨가하고 샘플 내에 존재하는 어떤 RNA도 제거하기 위하여 각각 55℃, 70℃, 및 90℃로 5분간 인큐베이션함에 의해 수행되었다. 상기 샘플은 이후에 스피드백(speedvac)을 이용하여 건조물이 되도록 증발되었다. 200㎕의 PCR 혼합물(1μM 프라이머 21.103 및 42.108, PCR 버퍼 플러스 Mg²⁺내의 200μM dNTP(Boehringer Mannheim), 및 2㎕의 택(Taq) 폴리메라제(Boehringer Mannheim))가 각 샘플에 첨가되었다. 16 사이클의 PCR이 선별되지않은 샘플 번호 2 상에서 수행되었고, 19 사이클의 PCR이 모든 나머지 샘플 상에서 수행되었다.

샘플들은 이후에 표 3에 따라 ³²P-표지된 프라이머 21.103의 존재 하에 증폭되었고, 모든 프라이머 및 짧은 단편들을 제거하기 위하여 각각 위저드 다이렉트(Wizard direct) PCR 정제 키트(Promega)를 사용하여 두 번 정제되었다.

선별 및 선별되지 않은 샘플들의 증폭
샘플	타입	부피	사이클
1	선별되지 않음	20㎕	5
2	선별되지 않음	5㎕	4
3	선별되지 않음	20㎕	5
4	선별되지 않음	20㎕	5
5	선별되지 않음	20㎕	5
6	선별되지 않음	20㎕	5
1	선별	20㎕	5
2	선별	5㎕	4
3	선별	20㎕	5
4	선별	20㎕	7
5	선별	20㎕	7
6	선별	20㎕	7

제한효소 절단물. 상기 PCR 반응의 각각으로부터 준비된 ³²P 표지된 DNA가 표 4에 따른 제한 절단 반응에 같은 양(샘플의 cpm 단위로)으로 첨가되었다. 각 반응의 총 부피는 25㎕이었다. 0.5㎕의 AlwnI(5 단위, New England Biolab)가 각 반응에 첨가되었다. 샘플들은 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었고, 효소는 65℃ 20분간의 인큐베이션에 의해 열 불활성화되었다. 상기 샘플들은 이후에 10㎕의 변성된 로딩 버퍼(울트라퓨어 포름아미드 1ml(UCB), 0.5M EDTA 20㎕, 및 1M NaOH 20㎕)와 혼합되었고, 90℃까지 1분간 가열되었고, 냉각되었고, 8M 요소(urea)를 포함하는 12% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에 로딩되었다. 이어지는 전기영동(electrophoresis)에서, 상기 겔은 10%(v/v) HOAc, 10%(v/v) MeOH, H₂O에 의해 고정되었다.

제한 절단물 조건 w/AlwnI
샘플	타입	반응에 첨가되는 DNA 부피	총 부피
1	선별되지 않음	20㎕	25㎕
2	선별되지 않음	4㎕	25㎕
3	선별되지 않음	20㎕	25㎕
4	선별되지 않음	20㎕	25㎕
5	선별되지 않음	4㎕	25㎕
6	선별되지 않음	20㎕	25㎕
1	선별	20㎕	25㎕
2	선별	8㎕	25㎕
3	선별	12㎕	25㎕
4	선별	12㎕	25㎕
5	선별	20㎕	25㎕
6	선별	20㎕	25㎕

절단물의 정량. 샘플 내에 존재하는 myc 대 풀 DNA는 포스포르이메이져(phosphorimager)를 사용하여 정량되었다(Molecular Dynamics). 각 밴드에 존재하는 물질의 양은 겔 밴드 주위에 도시된 동일 직사각형의 적분 부피로 결정되었다. 각 밴드에 존재하는 총 cpm은 상기 부피에서 배경을 제함으로써 계산되었다. 세 가지 배경 수치가 사용되었다: (1) 겔 상에서 계수하는 지역 밖의 동일 사각형의 평균; (2) myc 밴드가 나타나는 비선별된 풀 레인에 존재하는 cpm(이 위치에서는 겔 상에 밴드가 나타나지 않는다); 및 (3) 비선별된 레인들 간에 10-배 주형 증가에 가장 근접한 수치를 재현하는 표준화된 수치. 도 16B 및 16C의 레인 2, 3, 및 4는 타겟 대 풀 서열의 농후화를 증명한다. 레인 3(선별되지 않은/선별된)에 있어서 상기 증명된 농후화는 샘플에 대한 신호 대 노이즈 비의 최적화에 기인하여 가장 큰 수치(1방법 1-3을 사용하여 각각 7, 43, 및 27배)를 산출하였다. 이 결과는 표 5에 요약된다.

Myc 주형 대 풀의 농후화
방법	레인 2(20)	레인 3(200)	레인 4(2000)
1	7.0	16.6	5.7
2	10.4	43	39
3	8.7	27	10.2

실험의 제 2 집합에 있어서, 이들 동일한 PCR 생성물들은 1회 위저드 다이렉트 PCR 정제 키트를 사용하여 정제되었고, 절단물은 상술한 방법(2)에 의하여 정량되었다. 이들 실험에 있어서, 비슷한 결과가 수득되었다; 10.7, 38, 및 12배의 농후화가 상기 레인 2, 3, 및 4에 있는 샘플과 동등한 샘플에 대하여 각각 측정되었다.

단백질 선별 시스템의 용도

본 발명의 선별 시스템은 치료학상, 진단학상, 산업상의 문제를 해결하는데 단백질 기술이 사용되는 모든 분야에 상업적인 적용이 가능하다. 이 선별 시스템은 기대되는 기능의 신규한 단백질을 분리하는 것뿐만 아니라 공지의 단백질을 향상시키고 변화시키는 데에도 유용하다. 이러한 단백질은 천연 서열일 수도 있고, 천연 서열의 변형된 형태일 수도 있고, 부분적 혹은 전체적인 합성 서열일 수도 있다.

신규한 결합 시약들의 분리. 바람직한 일 구현예에 있어서, 본원에 기술된 RNA-단백질 융합물 기술은 특이적인 결합(예를 들면 리간드(ligand) 결합) 속성을 갖는 단백질의 분리에 유용하다. 매우 특이적인 결합 상호작용을 시현하는 단백질은 비-항체 인지 시약(recognition reagents)으로 사용될 수도 있어서, RNA-단백질 융합물 기술이 종래 단클론 항체(antibody) 기술의 문제점을 극복하는 것을 가능케 한다. 이 방법으로 분리된 항체-타입 시약은 진단학상과 치료학상의 적용을 포함하여 종래의 항체가 사용되어지던 모든 분야에 사용될 수 있다.

인간 항체의 개량. 본 발명은 또한 수많은 질병들 중 임의의 질병을 치료하기 위한 목적으로 인간의 혹은 인간화된(humanized) 항체를 개량하는데 사용될 수 있다. 이러한 용례에서, 항체 도서관은 생체외에서 생성되고 탐색되기 때문에, 세포융합 또는 파아지 디스플레이(phage display)와 같은 기술이 필요없게 된다. 중요한 일 구현예에 있어서, 본 발명은 단일쇄(single chain) 항체 도서관을 개량하는데 유용하다(Ward et al., Nature 341:533(1989); and Goulot etal., J. Mol. Biol. 213:617(1990)). 이러한 구현예에서 가변 영역(variable region)은 인간 소스(피이식자의 가능한 역 면역 반응을 최소화 하기 위해서)로부터 구성될 수도 있고, 완전히 랜덤화된 카셋트(cassette)(도서관 복잡성(complexity)을 최대화 하기 위해)를 포함할 수도 있다. 개량된 항체 분자를 탐색(screen)하기 위해서 하나의 풀(pool)의 후보 분자들이 목표 분자(예를들면 도 2에 도시된 바와 같은 고정된 항원)에의 결합에 대해 시험되었다. 선별이 한 라운드에서 다음 라운드로 진행됨에 따라, 더 높은 수준의 엄격성(stringency)이 결합 단계에 적용된다. 엄격성을 증가시키기 위하여, 세정 단계의 횟수, 여분의 경쟁자(competitor)의 농도, 버퍼 조건, 결합 반응 시간의 길이, 및 고정 매트릭스의 선택 등과 같은 조건이 변경된다.

단일쇄 항체는 치료를 위해 직접적으로 또는 표준 항체 설계를 위해 간접적으로 사용될 수 있다. 이러한 항체는 항-자가면역 항체의 분리, 면역 억제, 및 AIDS와 같은 바이러스성 질병에 대한 백신의 개발을 포함하여 잠재적인 응용가능성이 매우 크다.

신규한 촉매의 분리. 본 발명은 또한 신규한 촉매 단백질을 선별하는데 사용될 수 있다. 생체 외에서 선별 및 진화는 신규한 촉매 RNA들 및 DNA들의 분리에 이전부터 사용되어 왔고, 본 발명에 있어서는, 신규한 단백질 효소의 분리에 사용된다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 촉매는 촉매의 전이상태(transition state)의 화학적 아날로그로의 결합에 대한 선별에 의해 간접적으로 분리될 수 있다. 또 다른 일 실시예에 있어서, 직접적인 분리가 기질(예를 들면, 친화 태그에 연결된 기질)과의 공유결합 형성에 대한 선별 또는 절단(cleavage)에 의해(예를 들면, 특이적인 결합을 파괴함으로써 도서관의 촉매성 멤버를 고체 지지체로부터 유리시키는 능력에 대해 선별함으로써) 수행될 수 있다.

신규한 촉매를 분리하기 위한 이러한 접근법은 촉매성 항체 기술에 비하여 적어도 두 가지 장점을 갖는다(Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)에 설명됨). 먼저, 촉매성 항체 기술에 있어서는, 최초 풀(initial pool)이 일반적으로 면역글로블린 배수에 제한되나; 이와 반대로 RNA-단백질 융합물의 출발 도서관은 완전히 랜덤하거나, 또는 제한없이 공지의 효소 구조체 또는 단백질 골격(scaffold)의 변이체로 구성될 수 있다. 더욱이, 촉매성 항체의 분리는 일반적으로 반응 항체에 대한 어려운 스크리닝에 선행하는 전이상태 반응 아날로그로의 결합에 대한 최초의 선별에 의존한다; 다시 말하면, 이와는 대조적으로, 앞서 RNA 도서관을 사용하여 증명된 바와 같이, RNA-단백질 융합물 도서관 접근법을 사용하여 촉매작용(catalysis)에 대한 직접적인 선별이 가능하다. 단백질 효소를 분리하기 위한 대안적인 접근법에서는, 전이상태-아날로그 및 직접적 선별 접근법이 조합될 수 있다.

이 방법에 의해 수득되는 효소는 매우 가치가 높다. 예를 들면, 향상된 화학적 과정의 개발을 허용하는 신규하고 효과적인 산업적 촉매가 현재 절실히 요구되고 있다. 본 발명의 주요 장점은 선별이 임의의 조건에서 수행되고 제한되지-예를 들면, 생체내 조건에-않는다는 것이다. 그러므로 본 발명은 신규한 효소 또는 공지의 효소의 향상된 변이체의 분리를 용이하게 하는데, 상기 효소 또는 변이체들은 선결된 환경-예를 들면, 높은 온도, 압력, 또는 용매 농도의 환경-에서 작용하는 동안 매우 특이적인 변환(및 이에 의한 원하지 않는 부산물의 형성의 최소화)을 수행할 수 있다.

생체외 상호작용 트랩. RNA-단백질 융합물 기술은 또한 단백질-단백질간 반응을 기초로 하여 cDNA 도서관을 스크리닝하고 신규한 유전자를 클로닝하는데 유용하다. 이 방법에 의해, cDNA 도서관이 목적 소스로부터 생성된다(예를 들면, Ausubel et al., supra, chapter 5의 방법에 의하여). 후보 cDNA의 각각에게 펩타이드 억셉터(예를 들면, 퓨로마이신 테일과 같은)가 리게이션된다(예를 들면, LP77, LP154, 및 LP160의 생성에 대한 상술한 기술을 이용하여). RNA-단백질 퓨로마이신은 이후에 본원에 기술된 바와 같이 생성되고, 특정한 분자와 반응하는 이들 융합물(또는 융합의 향상된 버젼)의 능력은 상술한 바와 같이 시험된다. 원한다면, 종결 코돈 및 3' UTR 영역은, (i) 정지 영역의 통독(readthrough)을 허용하는 서프레서(suppressor) tRNA를 첨가하거나, (ii) 유리 인자를 면역침강에 의해 해독 반응으로부터 제거하거나, (iii) (i)과 (ii)를 조합하거나, 또는 (iv) DNA 서열로 부터 종결 코돈 및 3' UTR을 제거함으로써, 이 과정에서 회피될 수 있다.

상기 반응이 생체외에서 일어난다는 사실은 비특이적 경쟁자, 온도, 및 이온 조건을 이용하여 반응의 엄격성을 세심하게 제어하는 것을 가능케 한다. 정상적인 소분자를 비-가수분해성 아날로그로 변경(즉, ATP 대 ATPgS)하는 일은 동일 분자의 여러 이형태체들(conformers)을 구분하는 선별을 제공한다. 선별된 바인딩 파트너의 RNA 서열은 공유결합되어 있어서 쉽게 분리될 수 있기 때문에 이러한 접근법은 클로닝 및 많은 단백질의 기능 동정에 모두 유용하다. 더욱이, 이 기술은 약 50-100,000 인간 유전자의 작용 및 반응을 동정하는데 유용한데, 상기 인간 유전자의 서열은 주로 인간 게놈 프로젝트에 의해 결정되고 있다.

마이크로 칩 형성에 있어서 RNA 단백질 융합물의 이용

"DNA 칩"은 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 클로닝된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편의 공간적으로 제한된 어레이들(spatially defined arrays)로 구성되고, 신속한 서열결정 및 전사체 프로파일링(transcript profiling)에 응용된다. 이러한 DNA 칩에, RNA-단백질 융합물의 혼합물(예를 들면, 세포 DNA 또는 RNA 풀로부터 생성된)을 어닐링함에 의해, "단백질 디스플레이 칩"을 생성하는 것이 가능한데, 여기서 하나의 고정된 서열에 해당하는 개개의 스팟(spot)을 RNA-단백질 융합물의 풀 내에 있는 그의 상응하는 RNA 서열에 어닐링하는 것이 가능하다. 이러한 접근법에 의해, 해당 단백질은 그 자신의 mRNA에 연결되어 있기 때문에 공간적으로 제한된 방식으로 고정되고, DNA 서열의 집합을 포함하는 칩은 해당 단백질의 집합을 디스플레이한다. 이와 달리, 더 작은 cDNA 또는 게놈 DNA 단편으로부터 융합물 도서관이 생성되는 경우에는, 이들 단백질의 펩타이드 단편들이 디스플레이될 수도 있다.

이와 같이 정렬된 단백질 및 펩타이드의 디스플레이는 많은 용도를 갖는다. 예를 들면, 그들은 미리 알려지지 않은 단백질-단백질간 반응의 동정을 위한 강력한 도구가 된다. 한 특정 형식에 있어서, 프로브 단백질은 인지할 수 있도록 표지되고(예를 들면, 형광 염색에 의해), 상기 표지된 단백질은 단백질 디스플레이 칩과 함께 인큐베이션된다. 이 접근법에 의해, 프로브 단백질과 결합할 수 있는 단백질의 번호가, 프로브의 결합에 기인하여 표지된 칩상의 스팟의 위치로부터 결정된다. 또다른 구현예는 변형(modifying) 효소(예를 들면, 단백질 키나제, 아실 트랜스페라제, 및 메틸 트랜스페라제)의 작용을 통하여 화학적으로 변형된 단백질의 신속한 결정이다. 단백질 디스플레이 칩을 관심있는 효소 및 방사선 표지된 기질과 함께 인큐베이션하고, 세정 및 방사선사진촬영을 행함으로써, 상기 변형 효소의 기질인 단백질들의 위치 결정 및 동정이 신속하게 이루어질 수 있다. 더욱이, 작은 펩타이드들의 정렬된 디스플레이와 이러한 접근법을 병용하는 것은 이러한 변형 부위의 부가적인 위치결정을 가능케 한다.

단백질 디스플레이 기술은 적합한 고체 지지체상에 고정된 핵산(RNA를 포함하나, 바람직하게는 DNA)의 어레이를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 고체 지지체는 유리(즉, 유리 플레이트), 실리콘 또는 실리콘-유리(즉, 마이크로 칩), 또는 금(즉, 금 플레이트)과 같은 물질로 만들어질 수 있다. 핵산을 고체 표면 상의 정확한 영역에 부착하는 방법, 즉 포토리소그래피법은 당 업계에 공지되어 있고, 본 발명에 사용하기 위한 고체 지지체(DNA 칩과 같은)를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적 방법은 제한없이 Schena et al., Science 270:467-470(1995); Kozal et al., Nature Medicine 2:753-759(1996); Cheng et al., Nucleic Acids Reseach 24:380-385(1996); Lipshutz et al., BioTechniques 19:442-447(1995); Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026(1994); Fodor et al., Nature 364:555-556(1993); Pirrung et al., U.S. Patent No. 5,143,854; 및 Fodor et al., WO 92/10092를 포함한다.

Claims (43)

1. 다음 단계들을 포함하는, 목적 단백질의 선별(selection) 방법:

   a) 각자 후보 단백질 코드화 서열(candidate protein coding sequence)에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열(translation initiation sequence)과 개시 코돈(start codon)을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들(candidate RNA molecules)의 집단을 제공하는 단계;

   (b) 상기 후보 단백질 코드화 서열을 생체외(in vitro) 또는 인 시츄(in situ) 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물(candidate RNA-protein fusions)의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 단계; 및

   (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 선별하여 목적으로 하는 단백질을 선별해내는 단계.
2. 다음 단계들을 포함하는, 목적 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 선별 방법:

   (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;

   (b) 상기 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 단계;

   (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 선별하는 단계; 및

   (d) 상기 융합물의 RNA 부분으로부터 목적 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 생성하는 단계.
3. 다음의 단계들을 포함하는, 기준 단백질(reference protein)에 비해 변화된 기능을 갖는 단백질의 선별 방법:

   (a) 후보 DNA 주형들의 집단으로부터 후보 RNA 분자들의 집단을 생산하는 단계로서, 여기서 상기 후보 DNA 주형들은 각자 상기 기준 단백질 코드화 서열과는 상이한 후보 단백질 코드화 서열을 갖고, 상기 RNA 분자들은 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는, 후보 RNA 분자들의 집단을 생산하는 단계;

   (b) 상기 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 단계; 및

   (c) 변화된 기능을 갖는 RNA-단백질 융합물을 선별하여, 상기 변화된 기능을 갖는 상기 단백질을 선별해내는 단계.
4. 다음의 단계들을 포함하는, 기준 단백질에 비해 변화된 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 선별 방법:

   (a) 후보 DNA 주형들의 집단으로부터 후보 RNA 분자들의 집단을 생산하는 단계로서, 여기서 상기 후보 DNA 주형들은 각자 기준 단백질 코드화 서열과는 상이한 후보 단백질 코드화 서열을 갖고, 상기 RNA 분자들은 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는, 후보 RNA 분자들의 집단을 생산하는 단계;

   (b) 상기 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 단계;

   (c) 변화된 기능을 갖는 RNA-단백질 융합물을 선별하는 단계; 및

   (d) 융합물의 RNA 부분으로부터 상기 변화된 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 생성하는 단계.
5. 다음의 단계들을 포함하는, 목적 RNA 분자의 선별 방법:

   (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;

   (b) 상기 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 단계; 및

   (c) 목적으로 하는 RNA-단백질 융합물을 선별하여 상기 목적으로 하는 RNA를 선별해내는 단계.
6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩타이드 억셉터가 퓨로마이신인 방법.
7. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 후보 RNA 분자들 각각이 일시 정지 서열을 추가로 포함하거나 상기 RNA 분자의 3' 말단에 공유결합되어 있는 DNA 또는 DNA 유사 서열을 추가로 포함하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 후보 RNA 분자들의 집단이 적어도 10¹³ 개의 상이한 RNA 분자들을 포함하는 방법.
9. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 진핵 세포 또는 그의 일부분으로부터 준비된 용해물(lysate)에서 행해지는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 망상적혈구 용해물에서 행해지는 방법.
11. 제 9항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 밀 유아 용해물(wheat germ lysate)에서 행해지는 방법.
12. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 세균 세포 또는 그의 일부분으로부터 준비된 용해물에서 행해지는 방법.
13. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 선별 단계가 상기 목적 단백질을 고정된 바인딩 파트너(immobilized biding partner)에 결합시키는 과정을 포함하는 방법.
14. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 선별 단계가 상기 목적 단백질의 기능적 활성(functional activity)을 분석하는 과정을 포함하는 방법.
15. 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 상기 DNA 분자가 증폭되는 방법.
16. 제 1항, 제 3항, 또는 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법이 단계 (a) 내지 단계 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제 2항 또는 제 4항에 있어서, 상기 방법이 상기 DNA 분자로부터 RNA 분자를 전사하는 단계 및 단계 (a) 내지 단계 (d)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 RNA가 상기 RNA-단백질 융합물에서 상기 단백질에 아미드 결합(amide bond)을 통해서 공유결합되어 있는 방법.
19. 삭제
20. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생체외 해독 단계 다음에, 50-100 mM Mg²⁺의 존재하에서 인큐베이션이 수행되는 방법.
21. 제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 RNA-단백질 융합물이 상기 펩타이드 억셉터에 가까이 위치된 유연성(flexibility)을 향상시키는 핵산 또는 핵산 유사 서열(nucleic acid analog sequence)을 추가로 포함하는 방법.
22. 삭제
23. 아미드 결합 및 펩타이드 억셉터를 통해 단백질에 공유결합되어 있는 리보핵산을 포함하는 분자로서, 상기 단백질이 상기 리보핵산에 의해 코드화되는 분자.
24. 삭제
25. 제 23항에 있어서, 상기 리보핵산이 전령 RNA인 분자.
26. 단백질에 공유결합되어 있는 리보핵산을 포함하는 분자로서, 상기 단백질이 전적으로 상기 리보핵산에 의해 코드화되는 분자.
27. 제 26항에 있어서, 상기 리보핵산이 전령 RNA인 분자.
28. 삭제
29. 삭제
30. 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고, 상기 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 공유결합되어 있는 리보핵산.
31. 다음의 단계들을 포함하는, 목적 단백질 또는 목적 RNA의 선별방법:

    (a) 각자 후보 단백질 코드화 서열에 작동가능하도록 연결되어 있는 해독 개시 서열과 개시 코돈을 포함하고 각자 후보 단백질 코드화 서열의 3' 말단에 있는 펩타이드 억셉터에 작동가능하도록 연결되어 있는 후보 RNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;

    (b) 후보 단백질 코드화 서열을 생체외 또는 인 시츄 해독하여 후보 RNA-단백질 융합물의 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 단계;

    (c) RNA-단백질 융합물의 집단을, 바인딩 파트너-RNA-단백질 융합물 복합체와 결합되지 않은 집단의 멤버들을 구별할 수 있는 조건하에서, 상기 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분 또는 단백질 부분중 어느 한 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너(binding partner)와 접촉시키는 단계;

    (d) 상기 복합체로부터 상기 결합된 RNA-단백질 융합물을 유리시키는 단계; 및

    (e) 단계 (d)에서 수득된 상기 RNA-단백질 융합물의 집단을, 바인딩 파트너-RNA-단백질 융합물 복합체와 결합되지 않은 집단의 멤버들을 구별할 수 있는 조건하에서, 목적 RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 대해 특이적인 바인딩 파트너와 접촉시켜, 목적으로 하는 단백질 및 목적으로 하는 RNA를 선별해내는 단계.
32. 제 31항에 있어서, 상기 방법이 단계 (a) 내지 단계 (e)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
33. 제 31항에 있어서, 상기 펩타이드 억셉터가 퓨로마이신인 방법.
34. 제 31항에 있어서, 상기 후보 RNA 분자들이 각각 일시 정지 서열을 추가로 포함하거나 상기 RNA 분자의 3' 말단에 공유결합되어 있는 DNA 또는 DNA 유사 서열을 추가로 포함하는 방법.
35. 제 31항에 있어서, 상기 후보 RNA 분자들의 집단이 적어도 10¹³개의 상이한 RNA 분자들을 포함하는 방법.
36. 제 31항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 진핵세포 또는 그의 융해물의 일부로부터 제조된 세포 용해물(lysate)에서 행해지는 방법.
37. 제 36항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 망상적혈구 용해물 또는 밀 유아 용해물(wheat germ lysate)에서 수행되는 방법.
38. 제 31항에 있어서, 상기 생체외 해독 반응이 원핵세포 또는 그의 융해물의 일부로부터 제조된 추출물에서 수행되는 방법.
39. 제 31항에 있어서, 상기 바인딩 파트너들중 적어도 하나가 고체 지지체(solid support)에 고정되는 방법.
40. 제 31항에 있어서, 상기 생체외 해독 단계 다음에, 50-100 mM Mg²⁺의 존재하에서 인큐베이션이 수행되는 방법.
41. 제 31항에 있어서, 상기 RNA-단백질 융합물이 펩타이드 억셉터에 가까이 위치된 유연성(flexibility)을 향상시키는 핵산 또는 핵산 유사 서열을 추가로 포함하는 방법.
42. RNA-단백질 융합물과 혼성화되는 고정된 단일-가닥 핵산의 어레이를 포함하는 마이크로칩(microchip)으로서, 여기서 각각의 RNA-단백질 융합물의 RNA 부분이, 펩타이드 억셉터(peptide acceptor)를 통해서, RNA-단백질 융합물의 단백질 부분에 공유 결합되어 있고 단백질 부분을 코드화하는 마이크로칩.
43. 제 42항에 있어서, 상기 단백질이 상기 RNA에 의해 코드화되는 마이크로칩.

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