ES2827281T3 - Métodos y composiciones para la generación de agentes de unión contra antígenos de superficie celular - Google Patents

Métodos y composiciones para la generación de agentes de unión contra antígenos de superficie celular Download PDF

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Abstract

Un método para identificar un polipéptido de unión que se une específicamente a un antígeno de la superficie celular, el método comprendiendo: (a) poner en contacto un primer tipo de célula, que muestra un antígeno de la superficie celular en su superficie exterior, con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada de polipéptidos de unión, formando de este modo una población de complejos de polipéptido de unión/antígeno; (b) poner en contacto el primer tipo de célula con un surfactante, por lo que la población de complejos de polipéptido de unión/antígeno se solubiliza; y (c) aislar la población solubilizada de complejos de polipéptido de unión/antígeno, aislando de este modo por lo menos un miembro de la biblioteca que se une específicamente al antígeno de la superficie celular en la superficie exterior del primer tipo de célula, identificando de este modo un polipéptido de unión que se une específicamente al antígeno de la superficie celular.

Description

D E S C R IP C IÓ N
Métodos y com posiciones para la generación de agentes de unión contra antígenos de superficie celular
S O L IC IT U D E S R E L A C IO N A D A S
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61 /881.203 , presentada el 23 de septiem bre de 2013.
A N T E C E D E N T E S
Los polipéptidos de unión, com o anticuerpos y fragm entos de los mismos, son com ercialm ente importantes com o agentes terapéuticos y de diagnóstico. Los métodos tradicionales de detección de polipéptidos de unión generalm ente em plean antígenos solubles. Sin em bargo, para ciertos antígenos de la superficie celular, los epítopos conform acionales de estos antígenos se alteran cuando los antígenos se solubilizan de la m em brana plasm ática, lo que da com o resultado un fallo en la generación de polipéptidos de unión que puedan reconocer el antígeno nativo. Por consiguiente, hay una necesidad en la técnica de m étodos novedosos de detección para unir polipéptidos que puedan unirse específicam ente a antígenos de la superficie celular en su conformación nativa.
S U M A R IO
La invención proporciona m étodos y com posiciones para identificar polipéptidos de unión (por ejem plo, anticuerpos o fragm entos de unión a antígeno de los mismos) que se unen específicam ente a un antígeno de la superficie celular. Los m étodos de la invención com prenden generalm ente poner en contacto una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada de polipéptidos de unión con un antígeno de la superficie celu lar presentado en la superficie exterior de una célula; y aislar de la biblioteca por lo m enos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular en la superficie exterior de la célula. Los m étodos y com posiciones de la invención son particularm ente ventajosos porque perm iten la identificación rápida de polipéptidos de unión que se unen a form as nativas del antígeno de la superficie celular objetivo, y polipéptidos de unión que poseen propiedades funcionales y especificidad de epítopo novedosas (por e jem plo internalización, agonism o, antagonism o o propiedades m oduladoras alostéricas). Estos m étodos y com posiciones tam bién permiten la identificación de antígenos o epítopos específicos del tipo celu lar nuevos y terapéuticam ente útiles. Tam bién se proporcionan bibliotecas de expresión de ácidos nucleicos de dominio V (por ejem plo, dominio V H y/o VL) novedosas (por ejem plo, bibliotecas de expresión de A D N ) que pueden usarse para detectar nuevos polipéptidos de unión.
B R E V E D E S C R IP C IÓ N DE L O S D IB U J O S
La Figura 1 es un esquem a de com posiciones de expresión de A D N y m étodos de detección e jem plares de la invención.
La Figura 2 es un esquem a de com posiciones de expresión de A D N y m étodos de detección e jem plares de la invención.
La Figura 3 es un esquem a de estrategias de detección de células objetivo e jem plares em p lead as en los métodos de la invención.
La Figura 4 es un esquem a de selección en paralelo e jem plar y estrategias de secuenciación profunda em pleadas en los m étodos de la invención.
La Figura 5 es un esquem a de selección en paralelo e jem plar y estrategias de secuenciación profunda em pleadas en los m étodos de la invención.
La Figura 6 es un esquem a de selección en paralelo e jem plar y estrategias de secuenciación profunda em pleadas en los m étodos de la invención.
La Figura 7 es un esquem a de los resultados de estrategias de selección en paralelo e jem plares y análisis de secuenciación profunda em pleados en los m étodos de la invención.
La Figura 8 representa un gráfico que m uestra los resultados de un ensayo de unión basado en FA CS de m oléculas V H de alta afinidad seleccionadas usando los m étodos de la invención.
La Figura 9 representa gráficos que muestran la unión diferencial de m oléculas V H seleccionadas usando los métodos de la invención.
La Figura 10 representa gráficos que m uestran la unión diferencial de m oléculas V H seleccionadas usando los métodos de la invención.
La Figura 11 es un esquem a de estrategias de secuenciación profunda y detección paralela ejem plares em pleadas en los m étodos de la invención, en las que se aplican rondas iterativas de selección de células vivas con presiones selectivas funcionales paralelas para enriquecer anticuerpos que se unen y m odulan proteínas específicas de la superficie celular. Los grupos seleccionados se m arcan con barras y se som eten a una secuenciación profunda. El análisis bioinformático com parativo de secuencias enriquecidas de selecciones paralelas permite la identificación de anticuerpos que poseen selectividad y actividad que coinciden con los criterios principales.
La Figura 12 representa los resultados de estrategias de detección en paralelo ejem plares usando los m étodos divulgados en la presente para identificar dominios V H del receptor anti-glucagón (G C G R ). Los grupos enriquecidos de selecciones de G C G R de células vivas (un G P C R de clase B) se som etieron a ensayos de unión y funcionales, que incluyen unión com petitiva (en sentido contrario a las agujas del reloj), cAM P, adhesión sin m arcador, internalización celular, y ensayos de b-arrestina. Se aislaron un conjunto diverso de dominios V H anti-G C G R m oduladores de la actividad que m ostraban distintas actividades funcionales a través de varios m ecanism os de acción diferentes.
La Figura 13 representa los resultados de los ensayos de cA M P y b-arrestina de dominios V H an ti-G C G R seleccionados usando los m étodos divulgados en la presente. Las células H E K 293 que expresan G C G R se desafiaron con glucagón 10nM en presencia o ausencia de los dominios V H indicados. Los clones B07 y B05 inhiben la actividad p-arrestina inducida por G C G R pero tienen poco efecto sobre la producción de cAM P activada por el receptor.
La Figura 14 representa los resultados de los ensayos de liberación de cA M P y glucosa de los dominios V H anti-G C G R seleccionados usando los m étodos divulgados en la presente. Se estim ularon hepatocitos hum anos primarios con glucagón 2 nM en ausencia o presencia de los dominios VH de G C G R indicados. Tanto la producción de cA M P activada por glucagón com o la liberación de glucosa son inhibidas por los dominios V H , lo que dem uestra la actividad funcional de estos clones contra el receptor endógeno y en ensayos biológicam ente relevantes.
La Figura 15 es un esquem a de una selección de células vivas en paralelo e jem plar que identifica dominios VH an ti-G C G R con una variedad de diversidad y características funcionales.
La Figura 16 representa los resultados de los ensayos de unión, cA M P y quimiotaxis de dominios V H anti-C X C R 4 seleccionados usando los m étodos divulgados en la presente. Las selecciones funcionales de células vivas contra C X C R 4 (G P C R dequim iocina de clase A) produjeron un conjunto diverso de dominios V H que dem uestran unión específica a células que expresan C X C R 4, inhibición de la señalización de cA M P m ediada por S D F -1 a e inhibición de la quimiotaxis inducida por ligando sen células Jurkat con C X C R 4 expresado endógenam ente.
La Figura 17 representa los resultados de los ensayos de respuesta celular sin m arcador B IN D de células H E K 293 que expresan N av1.7 estim uladas con veratridina y veneno de escorpión. El B IN D perm ite m ediciones de respuesta celular sin m arcadores en tiem po real monitorizando los cam bios en los valores m áximos de longitud de onda (P W V ) de la luz reflejada desde la superficie de los biosensores ópticos. S e estim ularon células N a v 1.7 /H E K 293 recom binantes con veratrid ina (V ) veneno de escorpión (SVqq) para activar los canales. El B IN D midió una respuesta secundaria retardada a la apertura de canales que provocó una disminución en la P W V después de 1 hora después de la estim ulación. La tetrodotoxina (T T X ) inhibió los canales N a v 1.7 e invirtió el cam bio de P W V negativo a una respuesta observada en las células H E K 293 originales.
La Figura 18 es un esquem a de una detección paralela e jem plar que identifica dominios V H que se unen específicam ente a células de enferm edad hum anas. La selección de células vivas se usó para identificar objetivos o epítopos que se expresan específicam ente en distintas poblaciones celulares, incluyendo pacientes con enferm edad frente a células hum anas normales. S e aplicaron estrategias de selección específicas del tipo de célula y se usó secuenciación profunda para identificar los dominios V H enriquecidos con perfiles de especificidad de unión previstos. S e aislaron aglutinantes de alta afinidad (pM ) que dem uestran perfiles de unión específicos de células de enferm edad m edidos por FACS.
D E S C R IP C IÓ N D E T A L L A D A
La invención proporciona un método para identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente a un antígeno de la superficie celular, el m étodo com prendiendo:
(a) poner en contacto un prim er tipo de célula, que m uestra un antígeno de la superficie celu lar en su superficie exterior, con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada de polipéptidos de unión, form ando de este modo una población de com plejos de polipéptido de unión/antígeno;
(b) poner en contacto el prim er tipo de célula con un surfactante, por lo que la población de com plejos de polipéptido de unión/antígeno se solubiliza; y
(c) a is lar la población solubilizada de com plejos de polipéptido de unión/antígeno, aislando de este modo por lo m enos un m iembro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular en la superficie exterior del prim er tipo de célula, identificando de este modo un polipéptido de unión que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular.
Los m étodos de la invención generalm ente com prenden poner en contacto una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada de polipéptidos de unión con un antígeno de la superficie celular expresado en la superficie exterior de una célula; y aislar de la biblioteca por lo menos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular en la superficie exterior de la célula. Los m étodos y com posiciones de la invención son particularm ente ventajosos porque perm iten la identificación rápida de polipéptidos de unión que se unen a form as nativas del antígeno de la superficie celular objetivo, y polipéptidos de unión que poseen nueva especificidad de epítopo y propiedades funcionales (por ejem plo, internalización, agonism o, antagonism o o propiedades m oduladoras alostéricas). Estos m étodos y com posiciones tam bién permiten la identificación de nuevos antígenos o epítopos específicos de tipo celular terapéuticam ente útiles. Tam bién se proporcionan bibliotecas de expresión de ácidos nucleicos del dominio V (por ejem plo, dominio V H y/o VL) novedosas (por ejem plo, biblioteca de expresión de A D N ) que pueden usarse para detectar nuevos polipéptidos de unión.
I. D e fin ic io n e s
Com o se usa en la presente, el térm ino "biblioteca de expresión de ácidos nucleicos" se refiere a cualquier expresión ligada a fenotipo-genotipo libre de células in vitro reconocida en la técnica incluyendo, sin limitación, las que se exponen, por ejem plo, en las Patentes de Estados Unidos N° 7.195.880 ; 6.951.725 ; 7.078.197 ; 7.022.479 ; 6.518.018 ; 7.125.669 ; 6.846.655 ; 6.281.344 ; 6.207.446 ; 6.214.553 ; 6.258.558 ; 6.261.804 ; 6.429.300 ; 6.489.116 ; 6.436.665 ; 6.537.749 ; 6.602.685 ; 6.623.926 ; 6.416.950 ; 6.660.473 ; 6.312.927 ; 5.922.545 ; 6.348.315. W O 2012125733 y W O 2010 /011944.
Com o se usa en la presente, el térm ino "antígeno" se refiere a la m olécula reconocida por un polipéptido de unión.
Com o se usa en la presente, el térm ino "se une específicam ente a" se refiere a la capacidad de una m olécula de unión (por ejem plo, un dominio V H o VL) para unirse a un antígeno con una afinidad de por lo menos aproxim adam ente 1 x 10~6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M o más, y/o unirse a un objetivo con una afinidad que es por lo m enos dos veces m ayor que su afinidad por un antígeno no específico.
Com o se usa en la presente, el térm ino "anticuerpo" se refiere a m oléculas de inmunoglobulina que com prenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H ) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así com o m ultímeros de las m ism as (por ejem plo, IgM). C ad a cadena pesada com prende una región variable de la cadena pesada (abreviado V H ) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada com prende tres dominios, C H 1, C H 2 y C H 3. C ad a cadena ligera com prende una región variable de la cadena ligera (abreviado VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera com prende un dominio (CL1). Las regiones V H y VL pueden subdividirse adem ás en regiones de hipervariabilidad, denom inadas regiones determ inantes de la com plem entariedad (C D R ), intercaladas con regiones que están más conservadas, denom inadas regiones marco (FR).
Com o se usa en la presente, el térm ino "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluye cualquier polipéptido o glicoproteína de origen natural, obtenible enzim áticam ente, sintética o m anipulada genéticam ente que se une específicam ente a un antígeno para form ar un com plejo. Los fragm entos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivarse, por ejem plo, de m oléculas de anticuerpo com pletas usando cualquier técnica estándar adecuad a com o digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recom binante que implican la m anipulación y expresión del A D N que codifica los dominios variable y opcionalm ente constantes del anticuerpo. Los ejem plos no limitativos de porciones de unión a antígeno incluyen: (i) fragm entos Fab; (ii) fragm entos F(ab ')2; (iii) fragm entos Fd; (iv) fragm entos Fv; (v) m oléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragm entos dAb; y (vii) unidades de reconocim iento m ínim as que consisten de los residuos de am inoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejem plo, una región determ inante de la com plem entariedad aislada (C D R )). O tras m oléculas m anipuladas, com o diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, tam bién se incluyen dentro de la expresión "porción de unión a antígeno".
Com o se usa en la presente, el térm ino "dominio V" se refiere a un polipéptido individual que com prende un dominio V H o dominio VL que está desprovisto de secuencias de región constante que facilitan el apaream iento covalente de dicho dominio V H o dominio VL con un dominio VL o dominio V H com plem entario, respectivam ente.
Com o se usa en la presente, los térm inos "dominio VH" y "dominio VL" se refieren a dominios pesados y ligeros variables de anticuerpos individuales, respectivam ente, que com prenden FR (regiones m arco) 1, 2, 3 y 4 y C D R (regiones determ inantes de la com plem entariedad) 1, 2 y 3 (ver Kabat et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Im m unological Interest (Publicación N IH N° 91 -3242 , Bethesda).
Com o se usa en la presente, el térm ino "FR 1-FR 3" se refiere a la región de un V H que abarca FR1, C D R 1, FR2, C D R 2 y FR3, pero excluyendo las regiones C D R 3 y FR4.
Com o se usa en la presente, el térm ino "C D R 3-FR 4" se refiere a la región de un V H que abarca C D R 3 y FR4, pero excluyendo las regiones F R 1, C D R 1, FR2, C D R 2 y FR3.
Com o se usa en la presente con respecto a dominios variables de anticuerpos, el término "quimérico" se refiere a un dominio variable de anticuerpos que com prende secuencias de am inoácidos de dos o más dominios variables de anticuerpos diferentes, por ejem plo, un dominio variable con secuencias C D R 3 de un anticuerpo de referencia y secuencias F R 1-F R 3 de uno o más anticuerpos diferentes.
II. A n tíg e n o s d e s u p e rfic ie c e lu la r
En los m étodos de la invención puede em plearse cualquier antígeno que sea capaz de expresarse en la superficie de una célula incluyendo, sin limitación, antígenos de proteínas, glicanos y/o lípidos. En ciertas realizaciones, el antígeno es una m olécula de origen natural. Los ejem plos no limitativos adecuados de antígenos de origen natural incluyen proteínas transm em brana (por ejem plo, receptores acoplados a proteína G ) y proteínas ancladas a G P I. En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno recom binante o sintético que no se produce de form a natural. Los ejem plos adecuados no limitativos de antígenos de origen natural incluyen, sin limitación, antígenos quiméricos que com prenden partes de diferentes m oléculas de antígeno. En ciertas realizaciones, la identidad del antígeno se conoce antes de preform ar los m étodos de la invención. En ciertas realizaciones, se desconoce la identidad del antígeno antes de preform ar los m étodos de la invención.
En ciertas realizaciones, el antígeno es una proteína transm em brana. En ciertas realizaciones, el antígeno es una proteína transm em brana m ulticapa (por ejem plo, receptores acoplados a proteína G (G P C R ) y canales iónicos). Los ejem plos no limitativos de antígenos objetivo incluyen, sin limitación, receptor de glucagón (G C G R ),
C X C R 1, C X C R 2, C X C R 3, C X C R 4, C X C R 6, C C R 1, C C R 2, C C R 3, C C R 4, C C R 5, C C R 6, C C R 8, C F T R , C IC -1, C IC -2 ,
C IC -4 , C IC -5 , C IC -7 , C IC -K a , C IC -K b, bestrofinas, T M E M 16A , receptor de GABA, receptor de glicina, transportadores de ABC, N A V 1.1, N A V 1.2 , N A V 1.3 , N A V 1.4 , N A V 1.5 , N A V 1.6 , N A V 1.7 , N A V 1.8 , N A V 1.9 , receptor de esfingosina-1-fosfato (S 1 P 1R ) y canales de N M D A . En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno hum ano.
En ciertas realizaciones, el antígeno es G C G R , C X C R 4 o N A V 1.7 (por ejem plo, G C G R , C X C R 4 o N A V 1.7 hum ano).
Los antígenos de superficie celular em pleados en los m étodos de la invención pueden expresarse en cualquier célula o partícula sim ilar a una célula (por ejem plo, vesícula lipídica). En ciertas realizaciones, la célula es un tipo de célula que expresa de m anera natural el antígeno de la superficie celular. En ciertas realizaciones, la célula es una célula recom binante que está m anipulada para expresar heterólogam ente el antígeno de la superficie celular. En ciertas realizaciones, la célula es una variante asociada a la enferm edad de una célula normal (por ejem plo, una célula tumoral).
III. P o lip é p tid o s d e u n ió n
En los m étodos de la invención puede em plearse cualquier tipo de polipéptido de unión incluyendo, sin limitación, anticuerpos o fragm entos de los mismos y dominios de tipo inmunoglobulina. Los dominios de tipo inm unoglobulina adecuados incluyen, sin limitación, dominios de fibronectina (ver, por ejem plo, Koide et al. (2007 ),
M ethods Mol. Biol. 352: 95 -109 ), DARPin (ver, por ejem plo, Stumpp et al. (2008 ) Drug Discov. Today 13 (15-16):
695 -701 ), dominios Z de la proteína A (ver, Nygren et al. (2008 ) FE B S J.275 (11): 2668 -76 ), Lipocalinas (ver, por ejem plo, Skerra et al. (2008 ) FEB S J. 275 (11): 2677 -83 ), Affilinas (ver, por ejem plo, Ebersbach et al. (2007 ) J. Mol.
Biol. 372 (1): 172 -85), Affitinas (ver, por ejem plo, Krehenbrink et al. (2008 ). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68 ), Avím eros
(ver, por ejem plo, Silverm an et al. (2005 ) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 ), Finómeros, (ver, por ejem plo, Grabulovski et al. (2007 ) J Biol Chem 282 (5): 3196 -3204 ), y péptidos de dominio de Kunitz (ver, por ejem plo, Nixon et al. (2006 ) C urr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261 -8).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de unión es un dominio V H o VL de anticuerpo.
IV. B ib lio te c a s d e e x p re s ió n d e á c id o s n u c le ic o s
En ciertos aspectos, los m étodos de la divulgación em plean bibliotecas de expresión de ácidos nucleicos.
En un aspecto, la divulgación proporciona una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de dominios V quim éricos (por ejem plo, dominios V H o VL), cada m iem bro de la biblioteca com prendiendo secuencias de la región
F R 1-F R 3 de un prim er anticuerpo y secuencias de la región C D R 3 -F R 4 de un segundo anticuerpo. En la presente se divulgan bibliotecas ejem plares, por ejem plo, en el Ejemplo 2. Las bibliotecas divulgadas en la presente son adecuadas para su uso en cualquiera de los m étodos divulgados en la presente.
Las bibliotecas de la divulgación pueden com prender secuencias de dominio V H o VL de cualquier fuente o especie. En ciertas realizaciones, las secuencias de la región F R 1-F R 3 son del repertorio inmunológico de un hum ano sin tratam iento. En ciertas realizaciones, las secuencias de la región C D R 3 -F R 4 son del repertorio inmunológico de un hum ano sin tratam iento. En ciertas realizaciones, los dominios V son dominios V H (por ejem plo, dominios V H hum anos).
En ciertas realizaciones, la biblioteca se preselecciona para unirse a un antígeno, de tal m anera que cada m iem bro de la biblioteca se une al mismo antígeno. En ciertas realizaciones, cada m iem bro de la biblioteca se une a
G C G R , C X C R 4, o N A V 1.7 (por ejem plo, G C G R , C X C R 4 o N A V 1.7 hum ano).
En ciertas realizaciones, la biblioteca com prende por lo m enos 102 (por ejem plo, por lo m enos 102, 103, 104,
105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o 1015) dominios V únicos (por ejem plo, dominio Las bibliotecas de la divulgación pueden e laborarse usando cualquier m étodo reconocido en la técnica. En ciertas realizaciones, la biblioteca se genera (por ejem plo, m ediante P C R ) usando por lo m enos un oligonucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que cosiste de la S E Q ID N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
En un aspecto, la divulgación proporciona uno o más oligonucleótidos (por ejem plo, un oligonucleótido de A D N ) que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las S E Q ID N°: 1 ,2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
V . M é to d o s d e e x p re s ió n d e la s u p e rfic ie c e lu la r
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un m étodo para identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente a un antígeno de la superficie celular. El m étodo com prende generalm ente: (a) poner en contacto una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión con un antígeno de la superficie celular expresado en la superficie exterior de un prim er tipo de célula; y (b) aislar de la biblioteca por lo m enos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno de la superficie celu lar en la superficie exterior del prim er tipo de célula. En ciertas realizaciones, antes del paso (a), la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión se pone en contacto con un segundo tipo de célula que no expresa el antígeno expresado en la superficie exterior, con el fin de borrar previam ente la biblioteca de polipéptidos de unión que no se unen específicam ente al antígeno.
En ciertos aspectos, la divulgación proporciona un m étodo para identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente a un antígeno de la superficie celular. El m étodo generalm ente com prende: (a) poner en contacto una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión con un prim er tipo de célula que expresa un antígeno de la superficie celular, y a is lar de la biblioteca por lo m enos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al prim er tipo de célula; (b) poner en contacto la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión con un segundo tipo de célula que no expresa el antígeno de la superficie celular, y a is lar de la biblioteca por lo m enos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al segundo tipo de célula; y (c) seleccionar m iem bros de la biblioteca que se unen específicam ente al prim er tipo de célula pero no al segundo tipo de célula. En ciertas realizaciones, el paso (a) y el (b) se realizan en paralelo usando alícuotas separadas de la biblioteca para identificar conectores selectivos para el prim er o el segundo tipo de células, como se predice por análisis de secuenciación profunda de la frecuencia de una unión de secuencia V H a ambos tipos de célula.
El prim er y el segundo tipos de célula pueden ser tipos de células estrecha o distantem ente relacionadas de la m ism a especie o de una diferente. En ciertas realizaciones, el segundo tipo de célula está estrecham ente relacionado con el prim er tipo de célula. Por ejem plo, el segundo tipo de célula puede ser un tipo de célula de la m ism a especie y linaje pero de una e tap a de maduración diferente a la del prim er tipo de célula. A lternativam ente, el segundo tipo de célula puede ser isogénico con el prim er tipo de célula, difiriendo sólo en la expresión del antígeno objetivo. En ciertas realizaciones, el segundo tipo de célula es isogénico con el prim er tipo de célula pero expresa un ortólogo del antígeno objetivo expresado en el prim er tipo de célula (por ejem plo, un antígeno equivalente de una especie diferente). El uso de tales tipos de células estrecham ente relacionados com o contraselecciones perm ite la selección de polipéptidos de unión (por ejem plo, dominios V ) que se unen al objetivo deseado sin ninguna reactividad cruzada con ortólogos de antígeno relacionados. A lternativam ente, el uso de tipos de células estrecham ente relacionados en ensayos de co-selección perm ite la selección de polipéptidos de unión (por ejem plo, dominios V ) que se unen al objetivo deseado y tam bién reaccionan de m anera cruzada con ortólogos de antígeno relacionados. Este enfoque de co-selección es útil para generar polipéptidos de unión (por ejem plo, dominios V ) que se unen tanto a antígenos objetivos hum anos com o a ortólogos de ratón o simio, evitando la necesidad de producir polipéptidos de unión sustitutos (por ejem plo, dominios V ) para estudios con anim ales.
Las bibliotecas de expresión de ácidos nucleicos adecuadas para su uso en los m étodos de la divulgación se exponen, por ejem plo, en las Patentes de Estados Unidos N° 7.195.880 ; 6.951.725 ; 7.078.197 ; 7.022.479 ; 6.518.018 ; 7.125.669 ; 6.846.655 ; 6.281.344 ; 6.207.446 ; 6.214.553 ; 6.258.558 ; 6.261.804 ; 6.429.300 ; 6.489.116 ; 6.436.665 ; 6.537.749 ; 6.602.685 ; 6.623.926 ; 6.416.950 ; 6.660.473 ; 6.312.927 ; 5.922.545 ; 6.348.315 ; W O 2012125733 y W O 2010 /0119. En ciertas realizaciones, la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada es una biblioteca de expresión de A D N . En ciertas realizaciones, la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos es una biblioteca de expresión de A D N descrita en la presente o en la W O 2012125733 y/o la W O 2010 /011944.
En ciertas realizaciones, cada m iem bro de la biblioteca de expresión de A D N com prende un polipéptido de unión en lazado a través de un conector de A D N interm edio a una secuencia de codificación de A D N que codifica el polipéptido de unión, en donde el conector de A D N com prende un sitio de endonucleasa de restricción (ver, por ejem plo, la Figura 1). Puede em plearse cualquier sitio de endonucleasa de restricción. En una realización particular, el sitio de la endonucleasa de restricción no está presente en la secuencia de codificación de A DN de los miembros de la biblioteca de expresión de A D N , evitando a s í la escisión de la secuencia de codificación de A D N tras la digestión con endonucleasa de restricción de los miem bros de la biblioteca. En una realización particular, el sitio de la endonucleasa de restricción es un sitio N o t1.
En ciertas realizaciones, es deseable separar fís icam ente la secuencia de codificación de A D N de los miembros de la biblioteca aislados del polipéptido de unión enlazado. Puede em plearse cualquier método de separación física. Cuando los miem bros de la biblioteca aislados com prenden un conector de A D N que com prende un sitio de endonucleasa de restricción (ver, por ejem plo, la Figura 1), la separación física puede lograrse m ediante digestión con endonucleasa de restricción de los m iem bros de la biblioteca aislados. Las secuencias de codificación de A D N liberadas resultantes pueden separarse adicionalm ente de los com plejos de célula/polipéptido de unión m ediante cualquier m étodo reconocido en la técnica, por ejem plo, centrifugación.
En ciertas realizaciones, es deseable separar fís icam ente los miembros de la biblioteca aislados intactos del prim er y/o segundo tipo de célula. Puede em plearse cualquier método de separación física. En ciertas realizaciones, los m iem bros de la biblioteca aislados se separan del prim er o segundo tipo de célula m ediante elución con un ligando (por ejem plo, un ligando natural) del antígeno objetivo. En ciertas realizaciones, los miembros de la biblioteca aislados se separan del prim er o segundo tipo de célula m ediante escisión enzim ática del antígeno de la superficie celular. Puede em plearse cualquier m étodo de escisión enzim ática del antígeno, por ejem plo, escisión enzim ática de proteasas, lipasas y/o glicosidasas. En ciertas realizaciones, donde el antígeno de la superficie celu lar se une a la superficie celular m ediante un anclaje de glicolípidos, los miem bros de la biblioteca aislados se separan del prim er o segundo tipo de célula m ediante escisión por fosfolipasa del anclaje de glicolípidos. Los m iem bros de la biblioteca liberados resultantes pueden separarse adicionalm ente del prim er o segundo tipo de célula m ediante cualquier m étodo reconocido en la técnica, por ejem plo, centrifugación.
U na v ez que se han aislado los miem bros de la biblioteca que se unen específicam ente al prim er y/o al segundo tipo de célula, puede determ inarse la secuencia de codificación de A D N de estas m oléculas. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los m étodos de la invención com prenden adem ás el paso de determ inar la secuencia de codificación de A D N de por lo menos una parte de los miem bros de la biblioteca aislados. Puede em plearse cualquier medio reconocido en la técnica para la determ inación de la secuencia de A D N . En una realización particular, la secuencia de codificación de A D N se determ ina m ediante técnicas de secuenciación profunda de m oléculas individuales (por ejem plo, pirosecuenciación). Las técnicas de secuenciación profunda de m oléculas individuales son bien conocidas en la técnica (ver, por ejem plo, las descritas en la US 6.210.891 ). En ciertas realizaciones, cuando los polipéptidos de unión son anticuerpos, o fragm entos de unión a antígeno de los mismos, se determ ina la secuencia de codificación de A D N de la región C D R 3. En ciertas realizaciones, se determ inan las secuencias de codificación de A D N del m iembro de la biblioteca que se une al prim er y al segundo tipos de células. Se considera que los miem bros de la biblioteca que se unen específicam ente al prim er tipo de célula pero no al segundo tipo de célula com prenden polipéptidos de unión que se unen específicam ente a un antígeno específico para el prim er tipo de célula.
U na vez que se ha identificado un polipéptido de unión que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular, puede expresarse heterólogam ente in vitro (por ejem plo, en células o en un sistem a de expresión libre de células) o in vivo (por ejem plo, en un anim al transgénico). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los m étodos de la invención com prenden adem ás el paso de expresar heterólogam ente in vitro (por ejem plo, en células o en un sistem a de expresión libre de células) o in vivo (por ejem plo, en un anim al transgénico), el polipéptido de unión identificado.
En ciertas realizaciones, la identidad del antígeno se conoce antes de preform ar los m étodos de la invención. Sin em bargo, no es necesario conocer la identidad del antígeno. De hecho, en ciertas realizaciones, se desconoce la identidad del antígeno antes de preform ar los m étodos de la invención. Por tanto, en este último caso, los m étodos de la invención perm iten la identificación de nuevos antígenos y epítopos presentes en la superficie de un tipo de célula de interés (por ejem plo, una célula tumoral).
En ciertas realizaciones, los m étodos divulgados la presente com prenden la selección de polipéptidos de unión que son capaces de internalización funcional tras la unión al antígeno de la superficie celular. Tales polipéptidos de unión son particularm ente útiles en la producción de conjugados de fárm acos ya que permiten la administración de un fárm aco citotóxico al interior de una célula objetivo. Puede em plearse cualquier m etodología para la detección de la internalización funcional. Por ejem plo, la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión puede ponerse en contacto con células objetivo en condiciones que perm itan la internalización del polipéptido de unión (por ejem plo, durante aproxim adam ente 1-2 horas a 37° C). Luego, las células pueden lavarse y lisarse con tam pón de lisis celular en presencia de inhibidores de proteasa. Los miembros de la biblioteca internalizados pueden luego precipitarse con etanol y las secuencias de codificación de A DN enriquecerse m ediante amplificación por PCR.
Los m étodos divulgados en la presente pueden aplicarse a cualquier proceso de descubrim iento de epítopos objetivo. Por ejem plo, los epítopos objetivo pueden incluir: dominios de localización para la inflamación; epítopos objetivos específicos de tum ores de tum ores primarios con o sin resistencia al tratam iento, líneas celulares de tum ores, y tum ores que albergan cualquier mutación que pueda dar lugar a neoepítopos; y otros epítopos específicos de enferm edades que m edian el mal funcionam iento específico de la enferm edad y están dirigidos a terapia biológica.
V I. S o lu b iliza c ió n d e a n tíg e n o s
En ciertos aspectos, los m étodos de la invención implican la solubilización de antígenos (por ejem plo, antígenos de la superficie celular, por ejem plo, un G P C R ) de células que usan surfactantes que pueden m antener la conformación nativa del antígeno y permitir la recuperación de com plejos de polipéptidos de unión (por ejem plo, dominios V H o VL) y antígeno. Estos m étodos son particularm ente útiles para seleccionar polipéptidos de unión (por ejem plo, dominios V H ) que se unen a la conformación nativa de los antígenos de la superficie celular (por ejem plo, G P C R ).
En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un polipéptido de unión (por ejem plo, dominio V H o VL) que se une específicam ente a un antígeno de la superficie celular. El m étodo generalm ente com prende: poner en contacto un prim er tipo de célula, que expresa el antígeno de la superficie celu lar en la superficie exterior, con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión, de tal m anera que se form a una población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno; poner en contacto el prim er tipo de célula con un surfactante, de tal m anera que se solubilice la población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno; y aislar la población solubilizada de complejos de polipéptidos de unión/antígeno.
En ciertas realizaciones, la población solubilizada de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno se aísla usando un agente de unión específico para una parte del polipéptido de unión. En este m étodo puede usarse cualquier agente de unión que se una al polipéptido nativo. Los agentes de unión adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos específicos para el polipéptido (o una etiqueta de epítopo fusionada genéticam ente con el polipéptido).
En ciertas realizaciones, pueden usarse agentes de unión específicos para un estado de activación específico para aislar la población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno. Los agentes de unión adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos específicos para una variante quím icam ente m odificada (por ejem plo, una fosforilada) del antígeno (por ejem plo, anticuerpos específicos de fósforo).
En ciertas realizaciones, pueden usarse agentes de unión específicos para m oléculas accesorias que se asocian con el antígeno durante un estado de activación específico (por ejem plo, m oléculas de señalización citosólica o correceptores) para aislar la población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno.
En los m étodos de la invención puede em plearse cualquier surfactante que pueda extraer el antígeno de la m em brana celular y m antener la conform ación nativa del antígeno. Los surfactantes adecuados incluyen, sin limitación, n-dodecil-p-d-m altósido (D D M ) y 3-[(3-colam idopropil)dim etilam onio]-1-propanosulfonato (C H A P S ). En ciertas realizaciones, el antígeno o la población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno se solubiliza usando una m ezcla de DDM y C H A P S .
U sando este m étodo puede aislarse cualquier antígeno de la superficie celular conocido en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente). En este método puede em plearse cualquier tipo de célula conocido en la técn ica (incluyendo los divulgados en la presente). En este m étodo puede em plearse cualquier biblioteca de expresión de ácidos nucleicos conocida en la técnica (incluyendo las divulgadas en la presente). En este método puede detectarse cualquier polipéptido de unión o m olécula pequeña conocida en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente) para unirse a un antígeno de la superficie celular.
V II. In te rn a liza c ió n
En ciertos aspectos, los m étodos de la invención implican la selección de polipéptidos de unión que se unen específicam ente a un antígeno de la superficie celu lar deseado y se internalizan junto con el antígeno. Tales m étodos son particularm ente útiles para producir polipéptidos de unión que pueden adm inistrar cargas útiles (por ejem plo, quim iotoxinas) en una célula.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para identificar un polipéptido de unión de internalización (por ejem plo, dominio V H o VL) que se une específicam ente a un antígeno de la superficie celular. El m étodo generalm ente com prende: poner en contacto un prim er tipo de célula que expresa el antígeno de la superficie celular en la superficie exterior, con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión, en condiciones que perm itan la internalización del antígeno de la superficie celular, y de tal m anera que se form e una población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno internalizados; lavar el primer tipo de celda para e lim inar los miem bros de la biblioteca unidos a la superficie exterior; y a islar los com plejos de polipéptidos de unión/antígeno internalizados.
Los m étodos de la invención pueden incluir adem ás lo siguiente:
el contactar en el paso (a) se produce bajo condiciones que perm iten la internalización del antígeno de la superficie celular, y de tal m anera que se form a una población de los com plejos de polipéptido de unión/antígeno internalizados, el m étodo com prendiendo adem ás lavar el prim er tipo de célula para e lim inar m iem bros de la biblioteca unidos a la superficie exterior;
y el aislam iento en el paso (c) com prende aislar los com plejos de polipéptido de unión/antígeno internalizados usando un agente de unión específico para una porción del polipéptido de unión o el antígeno, identificando de esta m anera un polipéptido de unión de internalización que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular.
En ciertas realizaciones, los com plejos de polipéptidos de unión/antígeno internalizados se aíslan m ediante extracción con surfactante. En los m étodos de la invención puede em plearse cualquier surfactante que pueda extraer el antígeno de la m em brana celular y m antener la conform ación nativa del antígeno. Los surfactantes adecuados incluyen, sin limitación, n-dodecil-p-d-m altósido (D D M ) y 3-[(3-colam idopropil)d im etilam onio]-1-propanosulfonato (C H A P S ). En ciertas realizaciones, el antígeno o la población de com plejos de polipéptido de unión/antígeno se solubilizan usando una m ezcla de DDM y C H A P S .
En ciertas realizaciones, los com plejos de polipéptido de unión/antígeno internalizados se aíslan adicionalm ente usando un agente de unión específico para una parte del polipéptido de unión. Los agentes de unión adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos específicos para una variante quím icam ente m odificada (por ejem plo, una fosforilada) del antígeno (por ejem plo, anticuerpos específicos de fósforo). En ciertas realizaciones, pueden usarse agentes de unión específicos para m oléculas accesorias que se asocian con el antígeno durante un estado de activación específico (por ejem plo, m oléculas o correceptores de señalización citosólica) para aislar la población de com plejos de polipéptidos de unión/antígeno.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión internalizados se aíslan adicionalm ente m ediante precipitación del ácido nucleico que codifica los polipéptidos de unión (por ejem plo, m ediante precipitación con etanol).
Los miem bros de la biblioteca unidos a la superficie exterior del prim er tipo de célula pueden elim inarse usando cualquier tam pón de lavado adecuado. En ciertas realizaciones, los miem bros de la biblioteca unidos a la superficie exterior del prim er tipo de célula se elim inan lavando con una solución de pH bajo (por ejem plo, una solución con un pH m enor de aproxim adam ente 5, por ejem plo, m enor de aproxim adam ente pH 4, m enor de aproxim adam ente pH 3, o m enor de aproxim adam ente pH 2). Las soluciones de pH bajo adecuadas incluyen HCl o glicina a menos de pH 3. En ciertas realizaciones, la solución de pH bajo es HCl 0,1 M a aproxim adam ente pH 2,7.
En ciertas realizaciones, donde se em plean múltiples rondas de detección, los polipéptidos de unión internalizados se aíslan m ediante precipitación del ácido nucleico que codifica los polipéptidos de unión (por ejem plo, m ediante precipitación con etanol) en las rondas iniciales de detección, y se aíslan usando un agente de unión específico para una porción del polipéptido de unión en una o más (m ás estrictas) rondas posteriores de detección.
Usando este m étodo puede aislarse cualquier antígeno de la superficie celular conocido en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente). En este método puede em plearse cualquier tipo de célula conocido en la técn ica (incluyendo los divulgados en la presente). En este m étodo puede em plearse cualquier biblioteca de expresión de ácidos nucleicos conocida en la técnica (incluyendo las divulgadas en la presente). En este método puede detectarse cualquier polipéptido de unión o m olécula pequeña conocida en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente) para la unión a un antígeno de la superficie celu lar nativo.
V III. D ire c c io n a m ie n to d e a n tíg e n o s
En ciertos aspectos, los m étodos de la invención implican la selección de polipéptidos de unión que se unen específicam ente a un antígeno en un epítopo diferente al reconocido por un agente de unión de referencia (por ejem plo, un anticuerpo). Tales m étodos son particularm ente útiles para producir polipéptidos de unión con nuevas propiedades funcionales.
En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un polipéptido de unión (por ejem plo, dominio V H o VL) que se une específicam ente a un antígeno en un epítopo diferente al reconocido por un agente de unión de referencia (por ejem plo, anticuerpo). El m étodo generalm ente com prende: poner en contacto el antígeno con un agente de unión de referencia en condiciones tales que se form e un com plejo del antígeno y el agente de unión de referencia (por ejem plo, un anticuerpo); poner en contacto el com plejo del antígeno y el anticuerpo de referencia con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión, de tal m anera que se form e por lo m enos un com plejo de polipéptido de unión/antígeno; y aislar de la biblioteca por lo m enos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno.
Los m étodos de la invención pueden com prender adem ás lo siguiente:
antes del paso (a), poner en contacto el antígeno con un agente de unión de referencia bajo condiciones tales que se form e un com plejo del antígeno y el agente de unión de referencia,
el agente de unión de referencia se une específicam ente al antígeno en un epítopo diferente al reconocido por el polipéptido de unión, de tal m anera que en el paso (a) se form e por lo m enos un com plejo de agente de unión/antígeno; y
el paso (c) com prende identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente al antígeno en un epítopo diferente al reconocido por el agente de referencia.
Usando este m étodo puede aislarse cualquier antígeno de la superficie celular conocido en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente). En este método puede em plearse cualquier tipo de célula conocido en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente). En este m étodo puede em plearse cualquier biblioteca de expresión de ácidos nucleicos conocida en la técnica (incluyendo las divulgadas en la presente). En este método puede detectarse cualquier polipéptido de unión o m olécula pequeña conocida en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente) para la unión a un antígeno de la superficie celu lar nativo.
En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno de la superficie celular expresado en la superficie exterior de una célula (por ejem plo, un receptor de la superficie celular, com o un G P C R ). En ciertas realizaciones, el antígeno es G C G R , c X c R4 o N A V 1.7 (por ejem plo, G C G R , C X C R 4 o N A V 1.7 hum ano).
IX . D e s p la za m ie n to pa ra el e s ta d o d e a c tiv a c ió n d e a n tíg e n o
En ciertos aspectos, los m étodos de la invención implican la selección de un polipéptido de unión que se une específicam ente a un estado de activación deseado de un antígeno (por ejem plo, un antígeno de la superficie celular). Ta les m étodos son particularm ente útiles para producir polipéptidos de unión que modulan alostéricam ente (por ejem plo, inhiben) el antígeno objetivo.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para identificar un polipéptido de unión de internalización (por ejem plo, dominio V H o VL) que se une específicam ente a un estado de activación deseado de un antígeno de la superficie celular. El m étodo generalm ente com prende: poner en contacto un prim er tipo de célula, que expresa el antígeno de la superficie celular en la superficie exterior, con i) un agente de unión que se une específicam ente a, y modula el estado de activación del antígeno de la superficie celular; y ii) una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos variada de polipéptidos de unión; y aislar de la biblioteca por lo m enos un m iem bro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno de la superficie celu lar en la superficie exterior del prim er tipo de células.
Los m étodos de la invención pueden com prender adem ás lo siguiente:
antes del paso (a), poner en contacto el prim er tipo de células con un agente de unión que se une específicam ente a y m odula el estado de activación del antígeno de la superficie celular; y
el paso (c) com prende identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente al estado de activación deseado del antígeno de la superficie celular.
Puede em plearse cualquier m odulador del antígeno en los m étodos de la invención incluyendo agonistas, antagonistas, agonistas parciales y similares. En ciertas realizaciones, el m odulador es un ligando natural del antígeno. En ciertas realizaciones, el m odulador bloquea el antígeno en una conformación inactiva.
Usando este m étodo puede aislarse cualquier antígeno de la superficie celular conocido en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente). En este método puede em plearse cualquier tipo de célula conocido en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente). En este m étodo puede em plearse cualquier biblioteca de expresión de ácidos nucleicos conocida en la técnica (incluyendo las divulgadas en la presente). En este método puede detectarse cualquier polipéptido de unión o m olécula pequeña conocida en la técnica (incluyendo los divulgados en la presente) para la unión a un antígeno de la superficie celu lar nativo.
X . F o rm a to s d e a n tic u e rp o s
Los dominios V H y/o VL em pleados en los m étodos de la invención pueden usarse en aislam iento o fusionados a aminoácidos adicionales (por ejem plo, etiquetas de epítopo) y/o dominios. En ciertas realizaciones, por lo m enos un dominio V H en una biblioteca se fusiona con por lo m enos un dominio C H 1, dominio C H 2, dominio C H 3 o una com binación de los mismos. En una realización particular, por lo m enos un dominio V H en una biblioteca se fusiona con por lo m enos una región constante de la cadena pesada que com prende por lo m enos un dominio C H1, un dominio C H 2 y un dominio C H 3. En ciertas realizaciones, por lo m enos un dominio VL de una biblioteca se fusiona con por lo m enos una región constante de la cadena ligera.
Los dominios V H o VL identificados usando los m étodos divulgados en la presente tam bién pueden estar sujetos a m étodos de detección adicionales para seleccionar pares de V H /V L com plem entarios usando, por ejem plo, los m étodos descritos en la W O 2012125733.
Los dominios V H o VL y/o los pares V H /V L seleccionados usando los m étodos de la invención pueden incorporarse en otro form ato de anticuerpo que incluye, sin limitación, scFv, Fab y/o anticuerpo tetram érico completo.
X I. E je m p lific a c ió n
E je m p lo 1: Id e n tific a c ió n d e e p íto p o s e s p e c ífic o s d e c é lu la s o b je tiv o u s a n d o b ib lio te c a d e V H h u m a n a y te c n o lo g ía d e e x p re s ió n d e A D N d c q u e in c o rp o ra s e le c c ió n d e c é lu la s v iv a s y a n á lis is d e s e c u e n c ia c ió n p ro fu n d a .
A. resum en
Se construyó una biblioteca de V H de anticuerpos com pletam ente hum anos obtenida de m édula ósea, sangre periférica y esplenocitos de donantes hum anos y se identificaron num erosos aglutinantes de V H específicos y de alta afinidad para múltiples objetivos usando tecnología de presentación de A DN dc. Los epítopos específicos de las células objetivo se identificaron m ediante selección de células vivas y análisis de secuenciación profunda usando la biblioteca de V H hum ana y la tecnología de expresión de A DN dc. En estos m étodos se aplicaron estrategias de selecciones diferenciales paralelas y selecciones selectivas de células objetivo (ver las Figuras 4, 5, 6). La tabulación de la frecuencia de C D R 3 de la secuenciación profunda de todos los grupos en todas las rondas predijo la selectividad de los clones V H . Se identificaron V H de alta afinidad que se unen selectivam ente a células objetivo y tipos de células relacionados.
B. Diseño de bibliotecas y m étodos de selección para el descubrim iento de epítopos de células vivas
Se desarrollaron dos m étodos para recuperar eficazm ente los miembros de la biblioteca que se unieron a células vivas.
El prim er m étodo implicó desprender los aglutinantes de las células vivas m ediante digestión por restricción del A D N fusionado con los anticuerpos unidos. Este m étodo perm ite la recuperación com pleta de los V H unidos a todos los epítopos de las células. S e diseñó un extrem o C-term inal de la biblioteca de A D N de V H para que llevara un sitio de restricción NotI (ver Figura 1). No hay sitios Notl en estructuras de V H no tratadas y, por lo tanto, solo se eluyen de las células los aglutinantes de V H de longitud com pleta para su posterior amplificación. El tam pón de digestión de restricción NotI se probó en células vivas, y con una incubación de hasta 2 horas a 37° C las células eran viables. La eficiencia de la digestión con Notl fue alta. Después de la unión de la biblioteca a las células durante 1 hora a 4° C, las células se lavaron y digirieron con tam pón Notl a 37° C durante 1 hora, luego se centrifugaron las células, se recogió el sobrenadante (que contenía A D N de V H unido) para amplificación por PC R (ver Figura 1).
El segundo m étodo consiste en recortar los aglutinantes de V H de las células vivas usando digestión con fosfolipasa C (PLC). Este m étodo perm ite la elución de los V H que se unen a los epítopos de cualquier proteína de m em brana anclada a G P I (es decir, un subconjunto de epítopos). La eficiencia del recorte del PLC es alta, según lo validado en FA CS con m olécula de control. Después de la incubación de la biblioteca con células durante 1 hora a 4° C, las células se lavaron y se incubaron con PLC a 37° C durante 15 minutos. Posteriorm ente, las células se centrifugaron y el sobrenadante, que contenía la fusión VH com plejada con el dominio extracelular de la proteína de m em brana anclada a G P I, se amplificó por PC R (ver la Figura 2).
C. Selecciones en paralelo, selecciones diferenciales y selecciones selectivas de células objetivo en tipos de células objetivo y relacionadas/no deseadas
La biblioteca de fusión no tratada m aestra se produjo de acuerdo con el protocolo expuesto en la W O 2010 /011944. Para la prim era ronda de selección, la biblioteca de fusión purificada se dividió por igual en múltiples bibliotecas que tenían la m ism a diversidad para todas las ram as de selección (ver Figura 5).
Las células prim arias, obtenidas de donantes o pacientes normales, se descongelaron al m om ento o se aislaron de m atraces de cultivo celular, siguiendo los protocolos estándar de biología celular. Luego, las células se recuperaron durante 1 hora en medio com pleto a 37° C seguido de bloqueo en tam pón de selección durante 30 minutos en hielo. Todas las selecciones se llevaron a cabo en hielo para evitar la internalización de anticuerpos y objetivos.
Para las selecciones en paralelo, las bibliotecas se aclararon previam ente con 200 ul de perlas de estreptavidina prebloqueadas y 200 ul de perlas de hlgG-Epoxi prebloqueadas durante 30 minutos a tem peratura am biente secuencialm ente para elim inar cualquier m iem bro de biblioteca mal plegado o pegajoso. Las bibliotecas preaclaradas se enfriaron luego en hielo y se som etieron a células prebloqueadas y se incubaron en hielo durante 1 hora.
Para las selecciones selectivas de células objetivo, se realizó un preaclaram iento en tipos celulares no deseados y estrecham ente relacionados durante 1 hora en hielo para elim inar cualquier aglutinante no selectivo y luego se sometió a células objetivo.
En la ronda de selección 4, se aplicaron m étodos de selección diferencial a las ram as de selección en las células objetivo (con y sin preaclaram iento en las células). En esta ronda, las bibliotecas se dividieron en varios tubos y se unieron a cada tipo de célula y a las células del paciente de diferentes etapas de la enferm edad en paralelo. Esta estrategia permitió la com paración directa de las células objetivo con otros tipos de células m ediante un análisis de secuenciación profunda y la identificación de aglutinantes que reconocen diferentes epítopos que surgieron con la progresión de la enferm edad (ver Figura 6).
Para todas las ram as de selección, después de la unión, las células se lavaron con 10 ml de tam pón de unión y se som etieron a digestión de restricción NotI para recuperar todos los aglutinantes a la proteína de m em brana o recorte de PLC para recuperar los aglutinantes a proteínas de m em brana ancladas a G P I com o se ha descrito anteriorm ente.
D. Análisis de secuenciación profunda para predecir los aglutinantes selectivos para las células objetivo
Después de cada ronda de selección, los grupos de unión se amplificaron por PC R. E1H C D R 3 de cada grupo de unión se elevó m ediante PC R con oligos que ceban el extrem o C -term inal del marco 3 y el extrem o N-term inal del m arco 4 de los fragm entos V H . Estos fragm entos de H C D R 3 derivados de rondas y ram as de selección individuales se m arcaron luego con un código de barras de A D N específico usado para la secuenciación de Illumina m ediante PC R. Los H C D R 3 m arcados se agruparon y enviaron para secuenciación de alto rendimiento con tecnología Hi Seq. Los grupos de unión de la ronda 4 de las células objetivo tam bién se marcaron con código de barras de A D N y se enviaron para secuenciación 454 para obtener secuencias VH de longitud com pleta.
Las secuencias se deconvolucionaron basándose en el código de barras de A D N después de la secuenciación. Se tabularon millones de secuencias derivadas de cada ronda de selección y ram a de selección com parando la frecuencia de una secuencia de C D R 3 particular presente en diferentes rondas y ram as de selección. Los criterios usados para la identificación de aglutinantes selectivos fueron: 1) enriquecim iento específico de una secuencia de C D R 3 desde la ronda anterior a la ronda posterior en las células objetivo, no en los tipos de células de control o estrecham ente relacionadas; 2 ) frecuencia más alta en el tipo de célula específico objetivo y baja en el tipo de célula de control o estrecham ente relacionado en la ronda de selección diferencial (ver la Figura 7); y 3) secuencias no presentes en otras selecciones de células u objetivos de otros program as en la base de datos. Los clones selectivos identificados por secuenciación de Illumina se sintetizaron luego en base a la información de la secuencia de longitud com pleta 454.
E. Ensayos de producción, purificación y unión de FACS
Los grupos de unión y los V H sintetizados se subclonaron luego en vectores de expresión pE T22b . Los VH se produjeron en células de E. coli BL-21 y se purificaron a través de la etiqueta His C-term inal usando protocolos estándar. S e realizó un ensayo FA CS para eva lu ar la unión y selectividad de V H a diferentes tipos de células y la E C 50 de los aglutinantes. Los aglutinantes de V H de alta afinidad y selectivos se identificaron m ediante el proceso de selección de células vivas (ver las Figuras 8, 9 y 10).
E je m p lo 2: C o n s tru c c ió n d e b ib lio te c a V H d e d iv e rs id a d m e jo ra d a
Para am pliar la diversidad de bibliotecas no tratadas de V H existentes (por ejem plo, las divulgadas en la W O 2010 /011944 ), se adoptó un enfoque de reorganización de C D R 3 y del marco. Brevem ente, se realizó PCR usando oligos cebando la región C term inal del m arco 3 de V H y la región N term inal del m arco 4. Esta estrategia se diseñó para am plificar el dominio de giro de C D R 3 com pleto de cada una de las fam ilias de V H derivadas de bibliotecas de V H no tratadas. Los marcos 1-3 de V H se amplificaron m ediante PC R con oligos del marco 1 N-term inal y del marco 3 C -term inal degenerados específicos de la fam ilia de la m ism a biblioteca no tratada. La PCR superpuesta se realizó usando T 7 U TR y oligos de m arco 4 con C D R 3 y m arcos m ezclados en una proporción molar igual. La biblioteca reorganizada se modificó adicionalm ente para llevar las etiquetas de purificación para la biblioteca de fusión de A D N dc para las selecciones. Específicam ente, la H C D R 3 de la biblioteca no tratada se elevó a partir de cada fam ilia de V h con el marco 3 y el m arco 4 con oligos directos e inversos y se montó en una biblioteca que com prendía regiones marco 1-3 de dominios de V h hum ano no tratados amplificados a partir de células B de m édula ósea y P B M C usando oligonucleótidos específicos del marco. Se amplificaron las regiones 1-3 de m arco VH hum ano usando cebadores inversos FR 3 genéricos 3' y específicos de la fam ilia V H 5' para c rear bibliotecas separadas de las regiones marco de la fam ilia V H . Las bibliotecas de m arco de la fam ilia V H y e1H C D R 3 obtenido de la m ism a biblioteca se reordenaron m ediante amplificación adicional por PC R usando oligos 5 T 7 T M V y 3' FR4. Esto tam bién añadió una secuencia prom otora de T 7 T M V en el extrem o 5' para transcripción/traducción in vitro. Tam bién se añadieron una secuencia C-term inal C p3 y una etiqueta FLAG (para purificación después de la traducción) m ediante PC R usando cebadores FR 4 C u3 inversos e Y 109 , respectivam ente, junto con el cebador 5 'T 7 T M V . Las secuencias de ácido nucleico de los oligonucleótidos usados para la preparación de la biblioteca de VH reordenado de H C D R 3 se exponen en la Tab la 1.
La diversidad de la biblioteca puede m ejorarse aún más expandiéndose para incluir más donantes de individuos normales y pacientes con enferm edades, si a s í se desea.
Figure imgf000013_0001
La biblioteca de diversidad m ejorada puede diseñarse adicionalm ente para la m etodología de selección de desprendim iento de la superficie de células vivas, com o se describe en la presente.
E je m p lo 3: S e le c c ió n d e c é lu la s v iv a s u s a n d o u n a b ib lio te c a d e VH h u m a n a y te c n o lo g ía d e e x p re s ió n d e A D N d c in c o rp o ra d a p o r in m u n o p re c ip ita c ió n .
Se evaluó la capacidad de varios surfactantes para solubilizar los G P C R y conservar aún las conform aciones funcionales nativas. Específicam ente, se desarrolló un ensayo de unión de anticuerpos m arcados con 35S usando una m olécula de control de V H (que incluye una etiqueta de afinidad Myc) y una línea celu lar que expresa G P C R . En este ensayo, se lisaron cantidades iguales de células que expresan el objetivo de G P C R con surfactantes Triton X 100 , C H A P S , DDM o Brij35, seguido de inmunoprecipitación con anticuerpo anti-etiqueta Myc y captura m ediante perlas m agnéticas de Proteína G. Un control positivo de V H que se une a las células objetivo se radiom arcó con 35S durante la reacción de traducción in vitro. El V H m arcado se incubó con la objetivo de G P C R y se capturó m ediante el anticuerpo anti-M yc después de la lisis celular con los diferentes surfactantes descritos anteriorm ente. La cantidad de V H unido al objetivo de G P C R se cuantificó usando un contador de centelleo. La conformación funcional conservada por la solubilización del surfactante se clasificó basándose en la actividad de unión de V H . Parale lam ente, la cantidad de G P C R inm unoprecipitado con anticuerpo anti-M yc se evaluó m ediante transferencia W estern. El control positivo de V H mostró una m ejor actividad de unión a G P C R cuando las células se lisaron con DDM o C H A P S . La com binación de DDM y C H A P S mostró la actividad de G P C R funcional m áxim a y la cantidad de G P C R óptim a en estos dos ensayos y se seleccionó para su uso en selecciones para dominios V H de unión al (receptor de glucagón) G C G R .
En una ram a de selección de G C G R , la biblioteca de expresión de A D N de V H purificada y preaclarada se puso en contacto con células que expresan G C G R durante 1 hora. Las células se lavaron y lisaron con D D M /C H A P S , seguido de inmunoprecipitación con anticuerpo anti-etiqueta Myc. El com plejo V H -G C G R -M y c Ab se recuperó y el A D N de V H se eluyó usando KOH 0.1N . Usando este método, se identificaron VH de alta afinidad que se unen a células que expresan G C G R después de 4 rondas de selecciones.
A lternativam ente, las selecciones pueden realizarse usando un objetivo de G P C R solubilizado y concentrado (u otro objetivo de interés) que ha sido inm unoprecipitada con anticuerpo anti-M yc después de la solubilización de células con D D M /C H A P S . La biblioteca de V H puede eluirse luego de la incubación con estos objetivos capturados en perlas.
A dem ás de los m étodos descritos anteriorm ente, tras la unión de la biblioteca V H a células vivas que expresan G P C R funcionales (u otro objetivo de interés), las células pueden lisarse e inm unoprecipitarse con anticuerpos anti-intracelulares N- o C -term inales similares al anticuerpo anti-M yc. Pueden aplicarse anticuerpos específicos contra la fosforilación para capturar receptores activados y segregarlos de los inactivados. La inmunoprecipitación tam bién puede realizarse con anticuerpos contra las m oléculas accesorias que se asocian con objetivos activados o inactivados para capturar V H que modulan varios estados de activación e inactivación de vías específicas del objetivo. Los miem bros de la biblioteca de expresión de A D N en estos grupos de unión pueden luego etiquetarse con códigos de barras de A D N durante la amplificación por PC R y enviarse para una secuenciación profunda para identificar aglutinantes funcionales con diferentes m ecanism os de acción.
E je m p lo 4: S e le c c ió n p o r in te rn a liza c ió n
Se desarrolló una m etodología de selección para identificar anticuerpos agonistas o antagonistas con actividad de internalización. B revem ente, se incubó una biblioteca de VH de expresión A D N dc hum ano sin tratam iento previo (como se ha descrito anteriorm ente) a 37° C con células vivas que expresan un G P C R (u otro objetivo de interés) en presencia de N H 4C 1 50 m M , para permitir la internalización de V H de unión a G P C R . Luego, las células se lavaron con tam pón y el V H de la superficie celular se desprendió m ediante ácido de pH bajo (por ejem plo, HCl 0,1 M, pH 2 ,7). Después del desprendim iento de pH bajo, las células se lisaron con una combinación de C H A P S /D D M , com o se ha descrito anteriorm ente, y la precipitación del A D N para recuperar las secuencias codificantes de los miembros de la biblioteca de expresión de A DN dc internalizados. A lternativam ente, puede realizarse la inmunoprecipitación con anticuerpo anti-c-term inal o anti-etiqueta Myc. Ambos m étodos tam bién pueden com binarse. Por ejem plo, en una selección de V H de unión a G C G R , se realizaron cuatro rondas de detección en las que los miem bros de la biblioteca internalizados se recuperaron m ediante precipitación de A D N , seguido de una quinta ronda de detección donde se aplicó inm unoprecipitación de los miembros de la biblioteca internalizados con un anticuerpo anti-M yc para aum entar la rigurosidad selectiva. En estos experim entos, se identificaron antagonistas de alta afinidad después de cinco rondas de selecciones de internalización. Estos V H de unión a G C G R dem ostraron una actividad de internalización consistente con la presión selectiva aplicada.
E je m p lo 5: S e le c c io n e s d e c é lu la s v iv a s en el e s ta d o a c tiv a d o /d e s a c tiv a d o d e las c é lu la s o b je tiv o
Para m ejorar los epítopos funcionales de direccionam iento de los objetivos de G P C R y la identificación de V H m oduladores alostéricos, se desarrollaron estrategias de selección para permitir selecciones en células objetivos activadas y desactivadas (por ejem plo, G P C R activado por agonista o inactivado por antagonista en células vivas). Las selecciones en presencia del ligando endógeno (o análogo de aligando) favorecen la identificación de V H que se unen a posiciones distintas del sitio de unión ortostérico o a nuevos epítopos presentados tanto por el ligando como por el receptor. Brevem ente, las células que expresan G C G R se bloquearon y se incubaron con una biblioteca de V H de expresión de A D N dc hum ano sin tratam iento (com o se ha descrito anteriorm ente) en presencia de agonista (ligando, anticuerpos análogos o agonistas) o antagonista (inhibidores o anticuerpos neutralizantes). Por ejem plo, en selecciones contra G C G R , una ram a de selección se realizó en presencia de glucagón. En otra selección de G P C R , se realizaron algunas ram as de selección en presencia de un ligando mimético, y antagonista, para identificar m oduladores alostéricos. Estas selecciones con células objetivos activadas y desactivadas se acoplaron con los varios m étodos de recuperación de bibliotecas divulgados en la presente para la captura eficaz de VH que se unen a objetivos de G P C R en el estado de activación deseado.
E je m p lo 6: E lu c ió n d e lig a n d o s y d ire c c io n a m ie n to d e e p íto p o s en c é lu la s v iv as pa ra id e n tific a r m o d u la d o re s o rto s té r ic o s y a lo s té ric o s d e G P C R
Se desarrollaron m étodos para dirigirse a epítopos funcionales específicos de G P C R (u otros objetivos de interés) usando selecciones de células vivas. Estos m étodos perm iten la identificación de m oduladores ortostéricos (agonistas/antagonistas) y alostéricos de los G P C R . Por ejem plo, en una selección de V H de unión a G C G R , se realizó una ram a de selección en presencia de glucagón. Para otra ram a de la selección G C G R , después de que se hubo incubado la biblioteca de anticuerpos con células objetivo que expresaban G C G R , las células se lavaron y eluyeron con glucagón durante cuatro horas. Los aglutinantes restantes que se unían a epítopos distintos del dominio de unión al ligando se desprendieron luego de las células usando los m étodos divulgados en la presente. A partir de estos experim entos, se identificaron varios dominios V H de alta afinidad que bloquean la unión de glucagón y la inducción de cA M P inducida por ligando por G C G R . Uno de los dominios V H identificados funcionó com o un m odulador alostérico positivo. Para otro objetivo, hem os usado anticuerpos antagonistas para prebloquear el epítopo en células seleccionadas en presencia del anticuerpo antagonista. Este experim ento dio com o resultado la identificación de múltiples dominios V H que reconocen distintos epítopos de los anticuerpos de referencia antagonistas existentes.
E je m p lo 7: S e le c tiv id a d p ara ro e d o re s , p rim a te s , h o m o lo g ía d e p ro te ín a s d e m e m b ra n a
Para aum entar la selectividad de los anticuerpos an ti-G P C R para los homólogos de especies de G P C R , las líneas celulares que expresan estos homólogos relacionados pueden generarse en paralelo y utilizarse en los procesos de selección de expresión de A D N descritos en la presente, ya sea com o herram ientas de contraselección (si no se desean especies cruzadas) o se usan en paralelo con las selecciones de células objetivo, seguido de secuenciación profunda y tabulación bioinform ática para identificar clones selectivos. Para generar anticuerpos con reactividad cruzada con roedores o prim ates para estudios posteriores de eficacia y toxicidad en anim ales, las selecciones se realizaron con una ronda inicial de selección en células objetivos hum anas, seguida de selecciones cruzadas contra células que expresan objetivo de roedores. A lternativam ente, pueden usarse células hum anas y de roedor en rondas alternas de selección. Muchos de los dominios V H identificados dem ostraron unión a tanto el objetivo hum ano com o de roedor en las células, evitando la necesidad de generar anticuerpos sustitutos para estudios con anim ales.
E je m p lo 8: A p lic a c ió n d e s e c u e n c ia c ió n p ro fu n d a
La tecnología de secuenciación profunda se ha aplicado am pliam ente en los procesos de selección de expresión de A D N descritos en la presente. En ciertos experim entos, los criterios principales se incorporaron al proceso de selección y se realizaron m uchas selecciones paralelas. Los fragm entos de H C D R 3 derivados de rondas de selección individuales y ram as se etiquetaron códigos de barras de A D N específicos usados para la secuenciación de Illum ina m ediante PC R. Los H C D R 3 etiquetados se agruparon y enviaron para secuenciación de alto rendimiento con tecnología Hi Seq o My Seq. Las secuencias se deconvolucionaron en base al código de barras de A D N después de la secuenciación. S e tabularon millones de secuencias derivadas de cada ronda de selección y ram a de selección com parando las frecuencias de una secuencia de C D R 3 particular presente en diferentes rondas y ram as de selección para guiar la selección de m oléculas líderes con unión selectiva, cobertura de epítopo y perfiles funcionales incorporados.

Claims (13)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un m étodo para identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente a un antígeno de la superficie celular, el m étodo com prendiendo:
(a) poner en contacto un prim er tipo de célula, que m uestra un antígeno de la superficie celu lar en su superficie exterior, con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada de polipéptidos de unión, form ando de este modo una población de com plejos de polipéptido de unión/antígeno;
(b) poner en contacto el prim er tipo de célula con un surfactante, por lo que la población de com plejos de polipéptido de unión/antígeno se solubiliza; y
(c) a is lar la población solubilizada de com plejos de polipéptido de unión/antígeno, aislando de este modo por lo m enos un m iembro de la biblioteca que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular en la superficie exterior del prim er tipo de célula, identificando de este modo un polipéptido de unión que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular.
2. El m étodo de la reivindicación 1, que com prende adem ás:
(d) poner en contacto un segundo tipo de célula, que no expresa el antígeno de la superficie celu lar en la superficie exterior, con una biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada de polipéptidos de unión, y aislar de la biblioteca por lo m enos un m iembro de la biblioteca que se une específicam ente al segundo tipo de células; y
(e) seleccionar los miem bros de la biblioteca que se unen específicam ente al prim er tipo de célula pero no al segundo tipo de célula.
3. El m étodo de la reivindicación 1,
en donde el poner en contacta en el paso (a) se produce bajo condiciones que permiten la internalización del antígeno de la superficie celular, y de tal m anera que se form a una población de los com plejos de polipéptido de unión/antígeno internalizados, el m étodo com prendiendo adem ás lavar el prim er tipo de célula para elim inar m iem bros de la biblioteca unidos a la superficie exterior;
y en donde el aislam iento en el paso (c) com prende aislar los com plejos de polipéptido de unión/antígeno internalizados usando un agente de unión específico para una porción del polipéptido de unión o el antígeno, identificando de esta m anera un polipéptido de unión de internalización que se une específicam ente al antígeno de la superficie celular.
4. El m étodo de la reivindicación 1, que com prende adem ás:
antes del paso (a), poner en contacto el antígeno con un agente de unión de referencia bajo condiciones tales que se form e un com plejo del antígeno y el agente de unión de referencia,
en donde el agente de unión de referencia se une específicam ente al antígeno en un epítopo diferente al reconocido por el polipéptido de unión, de tal m anera que en el paso (a) se form e por lo m enos un com plejo de agente de unión/antígeno; y
por lo que el paso (c) com prende identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente al antígeno en un epítopo diferente al reconocido por el agente de referencia.
5. El m étodo de la reivindicación 1, que com prende adem ás:
antes del paso (a), poner en contacto el prim er tipo de células con un agente de unión que se une específicam ente a y modula el estado de activación del antígeno de la superficie celular; y
por lo que el paso (c) com prende identificar un polipéptido de unión que se une específicam ente al estado de activación deseado del antígeno de la superficie celular.
6. El m étodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada es una biblioteca del dominio V, cada m iem bro de la biblioteca com prendiendo secuencias de la región F R 1-F R 3 de un prim er anticuerpos y secuencias de la región C D R 3 -F R 4 de un segundo anticuerpo.
7. El m étodo de la reivindicación 6, en donde las secuencias de la región F R 1 -F R 3 y/o las secuencias de la región C D R 3 -F R 4 son del repertorio inmunológico no tratado de un hum ano, y/o los dominios V son dominios VH .
8. El m étodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste del receptor de glucagón (G C G R ), C X C R 1, C X C R 2, C X C R 3, C X C R 4, C X C R 6, C C R 1, C C R 2, C C R 3, C C R 4, C C R 5, C C R 6, C C R 8, C F T R , C IC -1, C IC -2 , C IC -4 , C IC -5 , C IC -7 , C IC -K a , C IC -K b, una Bestrofina, T M E M 16A , receptor de G a BA, receptor de glicina, transportadores de ABC, N A V 1.1, N A V 1.2 , N A V 1.3 , N A V 1.4 , N A V 1.5 , N A V 1.6, N A V 1.7, N A V 1.8, N A V 1.9, receptor de esfingosina-1-fosfato (S1 P 1R ), y un canal de NM DA .
9. El m étodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biblioteca de expresión de ácidos nucleicos libres de células variada es una biblioteca de expresión de A D N libre de células.
10. El m étodo de la reivindicación 9, en donde cada m iembro de la biblioteca de expresión de A D N libre de células com prende un polipéptido de unión en lazado a través de un conector de A D N intermedio a una secuencia de codificación de A D N que codifica el polipéptido de unión, en donde el conector de A DN com prende un sitio de endonucleasa de restricción,
opcionalm ente en donde el sitio de la endonucleasa de restricción no está presente en la secuencia de codificación de A D N de los miem bros de la biblioteca de expresión de A D N libre de células, y/o
opcionalm ente en donde el m étodo com prende adem ás separar fís icam ente la secuencia de codificación de A DN y el polipéptido de unión en lazado de los miem bros de la biblioteca aislados.
11. El m étodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el m étodo com prende adem ás determ inar la secuencia de codificación de A D N de por lo m enos una parte de los m iem bros de la biblioteca aislados.
12. El m étodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el prim er tipo de célula es una célula que expresa de m anera natural el antígeno de la superficie celular, y/o
en donde el prim er tipo de célula es una célula recom binante que está d iseñada para expresar heterólogam ente el antígeno de la superficie celular, y/o
en donde el prim er tipo de célula es una variante asociada a la enferm edad de una célula normal, y/o
en donde el prim er tipo de célula es una célula tumoral.
13. El m étodo de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido de unión es un anticuerpo o fragm ento del mismo.
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