JPH11318473A - 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法 - Google Patents
核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法Info
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- JPH11318473A JPH11318473A JP11018434A JP1843499A JPH11318473A JP H11318473 A JPH11318473 A JP H11318473A JP 11018434 A JP11018434 A JP 11018434A JP 1843499 A JP1843499 A JP 1843499A JP H11318473 A JPH11318473 A JP H11318473A
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- nucleic acid
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】非特異的な反応を抑制し、感度およびシグナル
の向上を達成する、配列特異的な核酸増幅技術を提供す
る。 【解決手段】エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸
もしくはそれらの塩等に例示される増幅反応改良剤を少
なくとも１種含有することを特徴とする核酸増幅用試薬
および核酸増幅反応液中に該増幅反応改良剤を添加する
ことを特徴とする配列特異的な核酸増幅方法。
の向上を達成する、配列特異的な核酸増幅技術を提供す
る。 【解決手段】エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸
もしくはそれらの塩等に例示される増幅反応改良剤を少
なくとも１種含有することを特徴とする核酸増幅用試薬
および核酸増幅反応液中に該増幅反応改良剤を添加する
ことを特徴とする配列特異的な核酸増幅方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的研究や臨
床診断などに有用な核酸増幅用試薬ならびに配列特異的
な核酸増幅方法に関する。
床診断などに有用な核酸増幅用試薬ならびに配列特異的
な核酸増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を人為的
に増幅する技術、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、
３ＳＲなどの核酸増幅法が広く知られるようになり、医
学、生物学等の研究に広く使われるようになり、現在で
は遺伝子の検出、クローニング、改変などにはなくては
ならない技術となっている。さらには、これらの増幅技
術を応用した臨床診断方法も開発されている。例えば、
結核菌などの病原体が有する特徴的な核酸を増幅し、増
幅後の核酸を検出することにとって、極めて短時間かつ
高感度に該病原体を検出する方法が開発され、既に実用
化されている。また、ヒトや他の動物の遺伝子の異常検
出などへの応用も実用化されつつある。
に増幅する技術、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、
３ＳＲなどの核酸増幅法が広く知られるようになり、医
学、生物学等の研究に広く使われるようになり、現在で
は遺伝子の検出、クローニング、改変などにはなくては
ならない技術となっている。さらには、これらの増幅技
術を応用した臨床診断方法も開発されている。例えば、
結核菌などの病原体が有する特徴的な核酸を増幅し、増
幅後の核酸を検出することにとって、極めて短時間かつ
高感度に該病原体を検出する方法が開発され、既に実用
化されている。また、ヒトや他の動物の遺伝子の異常検
出などへの応用も実用化されつつある。
【０００３】このような核酸増幅技術の１つに、ＮＡＳ
ＢＡ法（Nucleic acid sequense-based amplification
）法（Nature;第３５０巻、第９１頁、１９９１年）が
ある。このＮＡＳＢＡ法は、標的ＲＮＡと同じ配列を有
するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配
列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマ
ーを組合せ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵
素、ＲＮＡａｓｅＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作
用させて、その間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術
である。増幅されるのは、標的ＲＮＡと相補的な配列を
有するＲＮＡである。
ＢＡ法（Nucleic acid sequense-based amplification
）法（Nature;第３５０巻、第９１頁、１９９１年）が
ある。このＮＡＳＢＡ法は、標的ＲＮＡと同じ配列を有
するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配
列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマ
ーを組合せ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵
素、ＲＮＡａｓｅＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作
用させて、その間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術
である。増幅されるのは、標的ＲＮＡと相補的な配列を
有するＲＮＡである。
【０００４】このＮＡＳＢＡ法の特徴は、ＲＮＡからの
増幅が、下記工程を一段階で行えることである。ＤＮＡ
を２倍ずつ増幅することが特徴であるＰＣＲ法をＲＮＡ
からの増幅に応用する場合、ＰＣＲ反応の前段階とし
て、ＲＮＡからＤＮＡを作る逆転写反応（ＲＴ反応）を
行う必要がある（ＲＴ−ＰＣＲ法）。
増幅が、下記工程を一段階で行えることである。ＤＮＡ
を２倍ずつ増幅することが特徴であるＰＣＲ法をＲＮＡ
からの増幅に応用する場合、ＰＣＲ反応の前段階とし
て、ＲＮＡからＤＮＡを作る逆転写反応（ＲＴ反応）を
行う必要がある（ＲＴ−ＰＣＲ法）。
【０００５】上記ＲＴ−ＰＣＲ法は操作が煩雑になり、
時間もかかる（場合にもよるが、５〜６時間程度）。し
かしながら、ＮＡＳＢＡ法を用いれば、１回の反応で済
み、時間も２時間以内に終了する。
時間もかかる（場合にもよるが、５〜６時間程度）。し
かしながら、ＮＡＳＢＡ法を用いれば、１回の反応で済
み、時間も２時間以内に終了する。
【０００６】また、同一配列を有するＤＮＡの混在下で
も、ＲＮＡからの増幅反応が優先的に起こることであ
る。これは、正常遺伝子の発現量を測定したい場合など
に有用である。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＰＣＲ工程でどう
してもＤＮＡからの増幅が発生する。
も、ＲＮＡからの増幅反応が優先的に起こることであ
る。これは、正常遺伝子の発現量を測定したい場合など
に有用である。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＰＣＲ工程でどう
してもＤＮＡからの増幅が発生する。
【０００７】さらに、ＮＡＳＢＡ法は増幅反応が一定温
度で行われることが特徴である。サーマルサイクラーで
はなく、通常の恒温漕で実行できる。
度で行われることが特徴である。サーマルサイクラーで
はなく、通常の恒温漕で実行できる。
【０００８】また、ＮＡＳＢＡ法は極めて高い増幅効率
を有することが特徴である。理想的な反応においては、
検出限界以上のターゲットＲＮＡが存在すれば、増幅反
応が急激に進行し、極めて高い陽性シグナルが得られる
のに対し、検出限界以下では全くシグナルが検出されな
い。つまり、陽性／陰性の判定が極めて明瞭になるので
ある。
を有することが特徴である。理想的な反応においては、
検出限界以上のターゲットＲＮＡが存在すれば、増幅反
応が急激に進行し、極めて高い陽性シグナルが得られる
のに対し、検出限界以下では全くシグナルが検出されな
い。つまり、陽性／陰性の判定が極めて明瞭になるので
ある。
【０００９】一方、ＮＡＳＢＡ法に限らず、ＰＣＲ等の
他の核酸増幅反応で、常に問題になることの一つに、非
特異的な増幅反応の発生が挙げられる。これは主にプラ
イマーが標的配列以外の核酸に結合することによって発
生すると考えられている。非特異反応は感度、シグナル
の低下を招く。一般的に行われているＰＣＲ法とその後
の電気泳動による検出では、非特異反応は感度の低下、
目的バンドのシグナル低下・電気泳動像の不明瞭化とな
って現れる。ＮＡＳＢＡも同様である。現実的には、非
特異反応を完全に防ぐことは不可能であるが、感度など
を向上させるためには、出来るだけ低減させた方がよ
い。
他の核酸増幅反応で、常に問題になることの一つに、非
特異的な増幅反応の発生が挙げられる。これは主にプラ
イマーが標的配列以外の核酸に結合することによって発
生すると考えられている。非特異反応は感度、シグナル
の低下を招く。一般的に行われているＰＣＲ法とその後
の電気泳動による検出では、非特異反応は感度の低下、
目的バンドのシグナル低下・電気泳動像の不明瞭化とな
って現れる。ＮＡＳＢＡも同様である。現実的には、非
特異反応を完全に防ぐことは不可能であるが、感度など
を向上させるためには、出来るだけ低減させた方がよ
い。
【００１０】まず、非特異反応の発生は、プライマーの
性能や増幅領域の選定によるところが大きいので、Ｔｍ
値や配列の特異性、立体構造などを勘案し、出来るだけ
非特異反応を起こしにくいプライマーを選択することが
最も肝要である。しかし、大抵の場合は増幅したい領域
が先に決まっているので、プライマーの選定には制約が
かかることが多い。
性能や増幅領域の選定によるところが大きいので、Ｔｍ
値や配列の特異性、立体構造などを勘案し、出来るだけ
非特異反応を起こしにくいプライマーを選択することが
最も肝要である。しかし、大抵の場合は増幅したい領域
が先に決まっているので、プライマーの選定には制約が
かかることが多い。
【００１１】このような非特異的反応の発生を抑制する
方法として、ＰＣＲ法の場合、サイクル中のアニール温
度や時間など、物理的な調節によってある程度非特異反
応を低減し、限界はあるものの、増幅サイクルを増やす
ことによってある程度シグナルの向上を図ることも可能
である。さらには、増幅領域の内側に第二のプライマー
ペアを設定し、２段階ＰＣＲ法（nestedＰＣＲ）を行う
ことによって、感度の向上を図る方法もある。
方法として、ＰＣＲ法の場合、サイクル中のアニール温
度や時間など、物理的な調節によってある程度非特異反
応を低減し、限界はあるものの、増幅サイクルを増やす
ことによってある程度シグナルの向上を図ることも可能
である。さらには、増幅領域の内側に第二のプライマー
ペアを設定し、２段階ＰＣＲ法（nestedＰＣＲ）を行う
ことによって、感度の向上を図る方法もある。
【００１２】しかし、ＮＡＳＢＡ法の場合、一定温度で
反応が進むので、温度やサイクルなどの調節は出来な
い。２段階ＮＡＳＢＡ法は可能であるが、ＰＣＲ同様、
操作が非常に煩雑になり、ＮＡＳＢＡの簡便性が大きく
損なわれる。ＮＡＳＢＡ法は操作、工程の簡便性の故、
物理的な調節が難しい側面がある。
反応が進むので、温度やサイクルなどの調節は出来な
い。２段階ＮＡＳＢＡ法は可能であるが、ＰＣＲ同様、
操作が非常に煩雑になり、ＮＡＳＢＡの簡便性が大きく
損なわれる。ＮＡＳＢＡ法は操作、工程の簡便性の故、
物理的な調節が難しい側面がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
学的研究や臨床診断に有用となる、高感度な配列特異的
核酸増幅方法、特にＮＡＳＢＡ法ならびにそのための試
薬を提供することにある。
学的研究や臨床診断に有用となる、高感度な配列特異的
核酸増幅方法、特にＮＡＳＢＡ法ならびにそのための試
薬を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、配列特異
的核酸増幅技術、例えばＮＡＳＢＡ法において、種々検
討を重ねた結果、核酸増幅反応液中にエチレンジアミン
四酢酸またはその塩を添加することによって、非特異的
な反応を抑制し、感度およびシグナルの向上を達成する
ことが出来ることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。
的核酸増幅技術、例えばＮＡＳＢＡ法において、種々検
討を重ねた結果、核酸増幅反応液中にエチレンジアミン
四酢酸またはその塩を添加することによって、非特異的
な反応を抑制し、感度およびシグナルの向上を達成する
ことが出来ることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。
【００１５】すなわち、本発明は、「エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ウラ
ミル二酢酸（ＵＤＡ）、トランス−１，２−シクロヘキ
サンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリア
ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２
−アミノエチル）エーテルジアミン四酢酸［ビス（２−
アミノエチル）エーテル四酢酸］（ＧＥＤＴＡ）、トリ
エチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）よりなる群から
選択された少なくとも１種の物質もしくはその塩」（以
下、この群を増幅反応改良剤と言う）を含有することを
特徴とする核酸増幅用試薬である。
四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ウラ
ミル二酢酸（ＵＤＡ）、トランス−１，２−シクロヘキ
サンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリア
ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２
−アミノエチル）エーテルジアミン四酢酸［ビス（２−
アミノエチル）エーテル四酢酸］（ＧＥＤＴＡ）、トリ
エチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）よりなる群から
選択された少なくとも１種の物質もしくはその塩」（以
下、この群を増幅反応改良剤と言う）を含有することを
特徴とする核酸増幅用試薬である。
【００１６】更に、本発明は、核酸増幅反応液中に１種
以上の上記増幅反応改良剤を添加することを特徴とする
配列特異的な核酸増幅方法である。上記増幅反応改良剤
のいずれを選択してもよいが、なかでも、ＥＤＴＡもし
くはその塩、あるいはＮＴＡもしくはその塩が特に好ま
しい。
以上の上記増幅反応改良剤を添加することを特徴とする
配列特異的な核酸増幅方法である。上記増幅反応改良剤
のいずれを選択してもよいが、なかでも、ＥＤＴＡもし
くはその塩、あるいはＮＴＡもしくはその塩が特に好ま
しい。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明において、核酸増幅とは、
試料中の核酸から、増幅したい核酸（標的核酸）をその
固有の配列の相補性を利用して増幅することをいう。本
発明における核酸増幅用試薬および核酸増幅法が適用可
能な、該核酸増幅の方法としては、特に限定されるもの
ではないが、具体的には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、Ｓ
ＤＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などが挙げられ、いずれに
おいても適用することが可能である。なかでも、ＮＡＳ
ＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法において特に有用である。
試料中の核酸から、増幅したい核酸（標的核酸）をその
固有の配列の相補性を利用して増幅することをいう。本
発明における核酸増幅用試薬および核酸増幅法が適用可
能な、該核酸増幅の方法としては、特に限定されるもの
ではないが、具体的には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、Ｓ
ＤＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などが挙げられ、いずれに
おいても適用することが可能である。なかでも、ＮＡＳ
ＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法において特に有用である。
【００１８】本発明の核酸増幅法とは、例えばＮＡＳＢ
Ａ法であり、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワード
プライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７
プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
を５’末端に付加したリバースプライマーを組合せ、逆
転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡａｓｅＨおよび
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、その２種のプラ
イマー間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術である。
ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ活性
を有する逆転写酵素を使用してもよい。
Ａ法であり、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワード
プライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７
プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
を５’末端に付加したリバースプライマーを組合せ、逆
転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡａｓｅＨおよび
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、その２種のプラ
イマー間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術である。
ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ活性
を有する逆転写酵素を使用してもよい。
【００１９】該方法は、具体的には、下記工程からな
る。 （Ａ）標的ＲＮＡに、逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡ
と相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバ
ースプライマーを作用させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ッドを得る。 （Ｂ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａ
ｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡ
を得る。 （Ｃ）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する逆転写酵素の存在下、得られた１本鎖ＤＮ
Ａに標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマ
ーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｄ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを
作用させて、複数のＲＮＡを得る。
る。 （Ａ）標的ＲＮＡに、逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡ
と相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバ
ースプライマーを作用させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ッドを得る。 （Ｂ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａ
ｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡ
を得る。 （Ｃ）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する逆転写酵素の存在下、得られた１本鎖ＤＮ
Ａに標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマ
ーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｄ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを
作用させて、複数のＲＮＡを得る。
【００２０】（Ｅ）次いで、得られたＲＮＡに逆転写酵
素の存在下、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワード
プライマーを反応させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
を得る。 （Ｆ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａ
ｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡ
を得る。 （Ｇ）得られた１本鎖ＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼある
いはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素の存在
下、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプラ
イマーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｈ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを
作用させて、複数のＲＮＡを得る。 （Ｉ）上記工程（Ｅ）〜（Ｈ）を繰り返すことにより、
標的ＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡを多量に得
る。
素の存在下、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワード
プライマーを反応させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
を得る。 （Ｆ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａ
ｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡ
を得る。 （Ｇ）得られた１本鎖ＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼある
いはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素の存在
下、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプラ
イマーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。 （Ｈ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを
作用させて、複数のＲＮＡを得る。 （Ｉ）上記工程（Ｅ）〜（Ｈ）を繰り返すことにより、
標的ＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡを多量に得
る。
【００２１】上記工程は、１段階にて３７〜４５℃の温
度で行う。
度で行う。
【００２２】本発明の核酸増用幅試薬とは、（１）標的
ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、
（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメ
ラーゼのロモーターを５’末端に付加したリバースプラ
イマー、（３）リボヌクレオチド、（４）デオキシリボ
ヌクレオチド、（５）逆転写酵素、（６）ＲＮａｓｅ
Ｈ、（７）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を有する逆転写酵素および（８）ＲＮＡポリメ
ラーゼ、（９）緩衝液および（１０）増幅反応改良剤を
含む。これらの各成分は１つの反応液とする。
ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、
（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメ
ラーゼのロモーターを５’末端に付加したリバースプラ
イマー、（３）リボヌクレオチド、（４）デオキシリボ
ヌクレオチド、（５）逆転写酵素、（６）ＲＮａｓｅ
Ｈ、（７）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を有する逆転写酵素および（８）ＲＮＡポリメ
ラーゼ、（９）緩衝液および（１０）増幅反応改良剤を
含む。これらの各成分は１つの反応液とする。
【００２３】本発明において標的ＲＮＡは、ヒト体液、
例えば全血から常法により単離精製する。例えば、培養
菌サンプルを用意し、集菌洗浄後、カオトロピックイオ
ンの存在下に、シリカ粒子にＲＮＡを吸着させる方法
（Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法、Journal of Clinical Microb
iology 第２８巻、第３号、第４９５頁、１９９０年）
に従って、ＲＮＡを抽出する。
例えば全血から常法により単離精製する。例えば、培養
菌サンプルを用意し、集菌洗浄後、カオトロピックイオ
ンの存在下に、シリカ粒子にＲＮＡを吸着させる方法
（Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法、Journal of Clinical Microb
iology 第２８巻、第３号、第４９５頁、１９９０年）
に従って、ＲＮＡを抽出する。
【００２４】（１）標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォ
ワードプライマー、（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を
有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に
付加したリバースプライマーは、増幅しようとする標的
核酸に応じて、その塩基配列を選択したオリゴヌクレオ
チド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。その
オリゴヌクレオチド数は、一般に１５〜２５ｂｐであ
る。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、使用するＲ
ＮＡポリメラーゼによって種々異なる塩基配列を有す
る。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．０
００２５単位である。
ワードプライマー、（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を
有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に
付加したリバースプライマーは、増幅しようとする標的
核酸に応じて、その塩基配列を選択したオリゴヌクレオ
チド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。その
オリゴヌクレオチド数は、一般に１５〜２５ｂｐであ
る。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、使用するＲ
ＮＡポリメラーゼによって種々異なる塩基配列を有す
る。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．０
００２５単位である。
【００２５】（３）リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）と
は、アデノシン５’−三リン酸、グアノシン５’−三リ
ン酸、ウリジン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン
酸を指す。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約
１．６〜２．４ｍＭである。
は、アデノシン５’−三リン酸、グアノシン５’−三リ
ン酸、ウリジン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン
酸を指す。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約
１．６〜２．４ｍＭである。
【００２６】（４）デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴ
Ｐ）とは、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキ
シグアノシン５’−三リン酸、デオキシウリジン５’−
三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸を指す。核
酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．８〜１．
２ｍＭである。
Ｐ）とは、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキ
シグアノシン５’−三リン酸、デオキシウリジン５’−
三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸を指す。核
酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．８〜１．
２ｍＭである。
【００２７】（５）逆転写酵素としては、上記プライマ
ー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドプライマー）およびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得
るいかなる酵素でもよい。この酵素は、さらにＤＮＡポ
リメラーゼ活性またはＲＮａｓｅＨ活性を含んでいても
よい。このような酵素としては、例えばトリ筋芽細胞腫
ウイルス由来ポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、モロ
ニー・マウス白血病ウイルス由来ポリメラーゼ（ＭＭＬ
Ｖ逆転写酵素）、別の真核細胞由来のポリメラーゼ、Ｔ
ｔｈＤＮＡポリメラーゼなどがある。核酸増幅反応液中
の最終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
ー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドプライマー）およびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得
るいかなる酵素でもよい。この酵素は、さらにＤＮＡポ
リメラーゼ活性またはＲＮａｓｅＨ活性を含んでいても
よい。このような酵素としては、例えばトリ筋芽細胞腫
ウイルス由来ポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、モロ
ニー・マウス白血病ウイルス由来ポリメラーゼ（ＭＭＬ
Ｖ逆転写酵素）、別の真核細胞由来のポリメラーゼ、Ｔ
ｔｈＤＮＡポリメラーゼなどがある。核酸増幅反応液中
の最終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
【００２８】（６）ＲＮａｓｅＨとしては、相補的ＤＮ
ＡにアニールされたＲＮＡを加水分解し得るいかなる酵
素でもよい。例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＨ、仔牛胸腺Ｒ
ＮａｓｅＨ、ＡＭＶ逆転写酵素などが挙げられる。増幅
反応液中の最終濃度は、約０．０００２５単位である。
ＡにアニールされたＲＮＡを加水分解し得るいかなる酵
素でもよい。例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＨ、仔牛胸腺Ｒ
ＮａｓｅＨ、ＡＭＶ逆転写酵素などが挙げられる。増幅
反応液中の最終濃度は、約０．０００２５単位である。
【００２９】（７）ＤＮＡポリメラーゼとしては、上記
プライマー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌ
クレオチドプライマー）とＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成
し得るいかなる酵素でもよい。このような酵素として
は、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼα
またはβなどの真核細胞ＤＮＡポリメラーゼ、仔牛胸腺
などの哺乳動物組織由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、バクテリオフ
ァージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡ
ポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最
終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
プライマー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌ
クレオチドプライマー）とＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成
し得るいかなる酵素でもよい。このような酵素として
は、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼα
またはβなどの真核細胞ＤＮＡポリメラーゼ、仔牛胸腺
などの哺乳動物組織由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、バクテリオフ
ァージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡ
ポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最
終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
【００３０】（８）ＲＮＡポリメラーゼとしては、プロ
モーターと指称される特定のオリゴヌクレオチド配列に
結合でき、かつ、プロモーターに極めて近接した所定の
開始部位で、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を特異的に
開始し得るいかなる酵素でもよい。さらに、ＲＮＡポリ
メラーゼは適当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数
個のＲＮＡを合成し得ることが必要である。このような
酵素としては、例えば、バクテリオファージＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ、ファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、ファ
ージφＩＩＲＮＡポリメラーゼ、Salmonellaファージsp
6 ＲＮＡポリメラーゼ、Pseudomonas ファージgh-1ＲＮ
Ａポリメラーゼ、原核細胞または真核細胞由来のＲＮＡ
ポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最
終濃度は、約０．８〜１．２単位である。
モーターと指称される特定のオリゴヌクレオチド配列に
結合でき、かつ、プロモーターに極めて近接した所定の
開始部位で、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を特異的に
開始し得るいかなる酵素でもよい。さらに、ＲＮＡポリ
メラーゼは適当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数
個のＲＮＡを合成し得ることが必要である。このような
酵素としては、例えば、バクテリオファージＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ、ファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、ファ
ージφＩＩＲＮＡポリメラーゼ、Salmonellaファージsp
6 ＲＮＡポリメラーゼ、Pseudomonas ファージgh-1ＲＮ
Ａポリメラーゼ、原核細胞または真核細胞由来のＲＮＡ
ポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最
終濃度は、約０．８〜１．２単位である。
【００３１】（９）緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
などの汎用の緩衝液を使用する。
などの汎用の緩衝液を使用する。
【００３２】本発明の核酸増幅用試薬には、上記成分の
他に、必要によりマグネシウムイオン、カリウムイオン
などを含んでいてもよい。マグネシウムイオンの量は、
約１０〜１４ｍＭ、カリウムイオンの量は、約５６〜８
４ｍＭである。
他に、必要によりマグネシウムイオン、カリウムイオン
などを含んでいてもよい。マグネシウムイオンの量は、
約１０〜１４ｍＭ、カリウムイオンの量は、約５６〜８
４ｍＭである。
【００３３】（１０）増幅反応改良剤は、核酸増幅反応
液中の最終濃度（至適濃度）で、約０．５〜６０ｍＭ、
好ましくは０．５〜６ｍＭである。ＮＡＳＢＡ法におけ
る増幅反応改良剤の至適濃度は、標的核酸（すなわち、
増幅配列やプライマー配列）によって異なる。概ね、
０．５〜６ｍＭの範囲内に至適濃度が確認されている
が、標的核酸によっては、更に高い濃度や、低い濃度が
も考えられる。本発明の核酸増幅法は、６ｍＭ以上の高
濃度に至適条件をもつ標的核酸にも適用でき、６０ｍＭ
の増幅反応改良剤を添加した場合でも問題なく増幅反応
が進むことが確認された。
液中の最終濃度（至適濃度）で、約０．５〜６０ｍＭ、
好ましくは０．５〜６ｍＭである。ＮＡＳＢＡ法におけ
る増幅反応改良剤の至適濃度は、標的核酸（すなわち、
増幅配列やプライマー配列）によって異なる。概ね、
０．５〜６ｍＭの範囲内に至適濃度が確認されている
が、標的核酸によっては、更に高い濃度や、低い濃度が
も考えられる。本発明の核酸増幅法は、６ｍＭ以上の高
濃度に至適条件をもつ標的核酸にも適用でき、６０ｍＭ
の増幅反応改良剤を添加した場合でも問題なく増幅反応
が進むことが確認された。
【００３４】塩の形で存在する増幅反応改良剤として
は、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また
直接的な効果としては、ナトリウム塩も、カリウム塩も
同等であると考えられる。しかし、カリウムイオン濃度
は増幅に関与する各種酵素の反応に影響を及ぼすことが
多いので、ナトリウム塩の形がより望ましい。
は、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また
直接的な効果としては、ナトリウム塩も、カリウム塩も
同等であると考えられる。しかし、カリウムイオン濃度
は増幅に関与する各種酵素の反応に影響を及ぼすことが
多いので、ナトリウム塩の形がより望ましい。
【００３５】上記増幅反応改良剤がどのようなメカニズ
ムで、特異的シグナルを向上させるのかは、必ずしも完
全に明らかになっているわけではない。ＮＡＳＢＡ反応
液には通常約１２ｍＭの塩化マグネシウムが含まれてお
り、キレート剤としてのＥＤＴＡまたはその塩がマグネ
シウムイオンを捕捉し、マグネシウムイオンを調節して
いるとも考えられる。
ムで、特異的シグナルを向上させるのかは、必ずしも完
全に明らかになっているわけではない。ＮＡＳＢＡ反応
液には通常約１２ｍＭの塩化マグネシウムが含まれてお
り、キレート剤としてのＥＤＴＡまたはその塩がマグネ
シウムイオンを捕捉し、マグネシウムイオンを調節して
いるとも考えられる。
【００３６】それならば、塩化マグネシウムの濃度その
ものを調節すれば、同じ効果が得られるはずである。し
かしながら、実際に検討してみたところ、塩化マグネシ
ウムの濃度を１２ｍＭ以下に低下させると、むしろシグ
ナルは低下する。したがって、マグネシウムイオン濃度
の調節ではない別のメカニズムが存在すると考えられ
る。
ものを調節すれば、同じ効果が得られるはずである。し
かしながら、実際に検討してみたところ、塩化マグネシ
ウムの濃度を１２ｍＭ以下に低下させると、むしろシグ
ナルは低下する。したがって、マグネシウムイオン濃度
の調節ではない別のメカニズムが存在すると考えられ
る。
【００３７】本発明では、増幅反応改良剤がＮＡＳＢＡ
法における非特異増幅反応を抑制し、特異的増幅の効率
を向上させている。このことから、上記増幅反応改良剤
はプライマーのターゲット以外への非特異的な結合を抑
制し、ミスプライミングを抑制していることが推察され
る。したがって、本発明の核酸増幅法は、ＰＣＲ、ＴＭ
Ａ、３ＳＲなど他の核酸増幅技術にも応用が可能であ
る。
法における非特異増幅反応を抑制し、特異的増幅の効率
を向上させている。このことから、上記増幅反応改良剤
はプライマーのターゲット以外への非特異的な結合を抑
制し、ミスプライミングを抑制していることが推察され
る。したがって、本発明の核酸増幅法は、ＰＣＲ、ＴＭ
Ａ、３ＳＲなど他の核酸増幅技術にも応用が可能であ
る。
【００３８】本発明において使用する検出用プローブと
は、検出しようとする標的核酸に応じて選択された塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドである。該プローブに
は、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、ビオチン、
アビジン、蛍光色素などの標識物質を結合してもよい。
は、検出しようとする標的核酸に応じて選択された塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドである。該プローブに
は、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、ビオチン、
アビジン、蛍光色素などの標識物質を結合してもよい。
【００３９】核酸検出法としては、マイクロタイターな
どの固相に捕捉プローブを結合し、上記増幅法により増
幅したく試料中の標的核酸を捕捉した後、検出プローブ
にて、試料中の核酸をサンドイッチして、検出プローブ
の標識を常法により測定する方法が一般的である。
どの固相に捕捉プローブを結合し、上記増幅法により増
幅したく試料中の標的核酸を捕捉した後、検出プローブ
にて、試料中の核酸をサンドイッチして、検出プローブ
の標識を常法により測定する方法が一般的である。
【００４０】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００４１】実施例１ ＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結
核菌(Mycobacterium tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの
高感度検出 （１）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用プライマー
の合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１
６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用リバースプライマー、以下、プラ
イマー１と呼ぶ）および配列番号２に示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ増幅用フォワードプライマー、以下、プライマー
２と呼ぶ）を合成した。
核菌(Mycobacterium tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの
高感度検出 （１）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用プライマー
の合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１
６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用リバースプライマー、以下、プラ
イマー１と呼ぶ）および配列番号２に示される塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ増幅用フォワードプライマー、以下、プライマー
２と呼ぶ）を合成した。
【００４２】プライマー１は、増幅対象となるＲＮＡに
相補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、Ｔ７プ
ロモーター配列（２７ヌクレオチド）を連結している。
合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌ
クレオチドの精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオ
ン交換カラムにて実施した。
相補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、Ｔ７プ
ロモーター配列（２７ヌクレオチド）を連結している。
合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌ
クレオチドの精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオ
ン交換カラムにて実施した。
【００４３】（２）リンカーアームを有するオリゴヌク
レオチドの合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号３に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１
６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ産物検出用捕捉プローブ
（以下、捕捉プローブと呼ぶ）用オリゴヌクレオチド）
および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢ
Ａ産物検出用検出プローブ（以下、検出プローブと呼
ぶ）用オリゴヌクレオチド）を合成した。
レオチドの合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号３に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１
６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ産物検出用捕捉プローブ
（以下、捕捉プローブと呼ぶ）用オリゴヌクレオチド）
および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢ
Ａ産物検出用検出プローブ（以下、検出プローブと呼
ぶ）用オリゴヌクレオチド）を合成した。
【００４４】この際、特表昭６０−５００７１７号公報
に開示された合成法により、デオキシウリジンから化学
合成により調製した、５位にリンカーアームを有するウ
リジンを、上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウ
リジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴを置換しうる
が、今回は５’末端のＴを置換した。合成されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱
保護処理を施した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イ
オン交換カラムを用いて精製した。
に開示された合成法により、デオキシウリジンから化学
合成により調製した、５位にリンカーアームを有するウ
リジンを、上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウ
リジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴを置換しうる
が、今回は５’末端のＴを置換した。合成されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱
保護処理を施した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イ
オン交換カラムを用いて精製した。
【００４５】（３）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチド
のマイクロタイタープレートへの結合 上記（２）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介して、マイクロタ
イタープレート内面へ結合した。リンカーオリゴヌクレ
オチドを５０ｍＭ硼酸バッファー（ｐＨ１０）、１００
ｍＭ ＭｇＣｌ 2 の溶液に０．０５ｐｍｏｌ／μｌにな
るように希釈し、マイクロタイタープレート（MicroFLU
OR B、ダイナテック社）に各１００μｌずつ分注し、１
５時間程度、室温に放置することで、リンカーオリゴヌ
クレオチドをマイクロタイタープレート内面に結合させ
た。その後、０．１ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶ
Ｐ、５×ＳＳＣに置換して、非特異反応を抑えるための
ブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に１×Ｓ
ＳＣで洗浄して乾燥させた。
のマイクロタイタープレートへの結合 上記（２）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介して、マイクロタ
イタープレート内面へ結合した。リンカーオリゴヌクレ
オチドを５０ｍＭ硼酸バッファー（ｐＨ１０）、１００
ｍＭ ＭｇＣｌ 2 の溶液に０．０５ｐｍｏｌ／μｌにな
るように希釈し、マイクロタイタープレート（MicroFLU
OR B、ダイナテック社）に各１００μｌずつ分注し、１
５時間程度、室温に放置することで、リンカーオリゴヌ
クレオチドをマイクロタイタープレート内面に結合させ
た。その後、０．１ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶ
Ｐ、５×ＳＳＣに置換して、非特異反応を抑えるための
ブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に１×Ｓ
ＳＣで洗浄して乾燥させた。
【００４６】（４）検出プローブ用オリゴヌクレオチド
の標識化 上記（２）で合成した検出プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介してアルカリ性ホ
スファターゼとの結合を、Nucleic Acids Res.;第１４
巻、第６１１５頁（１９８６年）に従って、下記のよう
に行なった。
の標識化 上記（２）で合成した検出プローブ用オリゴヌクレオチ
ドについて、そのリンカーアームを介してアルカリ性ホ
スファターゼとの結合を、Nucleic Acids Res.;第１４
巻、第６１１５頁（１９８６年）に従って、下記のよう
に行なった。
【００４７】リンカーオリゴヌクレオチド１．５Ａ２６
０を０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 １２．５μｌに溶解し、こ
こへ１０ｍｇ／ｍｌスベリン酸ジスクシニミジル(ＤＳ
Ｓ)２５μｌを加えて室温、２分間反応させた。反応液
を１ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０)で平衡化した
セファデックスＧ−２５（ファルマシア社）カラム（１
ｃｍφ×３０ｃｍ)でゲル濾過して、過剰のＤＳＳを除
去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴ
ヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(１００ｍＭ
ＮａＨＣＯ3、３Ｍ ＮａＣｌ)に溶解したもの）と室
温で、１６時間反応させることにより、アルカリ性ホス
ファターゼ標識核酸プローブを得た。得られた標識プロ
ーブは、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラ
ムを用いて精製した。標識プローブを含む画分を集め、
セントリコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて、限外濾過
法により濃縮した。これを検出プローブとして用いた。
０を０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 １２．５μｌに溶解し、こ
こへ１０ｍｇ／ｍｌスベリン酸ジスクシニミジル(ＤＳ
Ｓ)２５μｌを加えて室温、２分間反応させた。反応液
を１ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０)で平衡化した
セファデックスＧ−２５（ファルマシア社）カラム（１
ｃｍφ×３０ｃｍ)でゲル濾過して、過剰のＤＳＳを除
去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴ
ヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(１００ｍＭ
ＮａＨＣＯ3、３Ｍ ＮａＣｌ)に溶解したもの）と室
温で、１６時間反応させることにより、アルカリ性ホス
ファターゼ標識核酸プローブを得た。得られた標識プロ
ーブは、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラ
ムを用いて精製した。標識プローブを含む画分を集め、
セントリコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて、限外濾過
法により濃縮した。これを検出プローブとして用いた。
【００４８】（５）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｎ
ＡＳＢＡ検討用試料の調製 従来の同定法でヒト型結核菌と同定されている培養菌サ
ンプルを用意し、集菌洗浄後、Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法
（Journal of Clinical Microbiology 第２８巻、第３
号、第４９５頁、１９９０年）に従ってＲＮＡを抽出
し、０．１ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌ
の３段階の希釈系列を作成した。この際、各希釈系列に
は、ネガティブＲＮＡとして、市販の酵母ＲＮＡ（和光
純薬社製を用いて、上記抽出操作をしたもの）を１０ｎ
ｇ／μｌの濃度で添加しておいた。
ＡＳＢＡ検討用試料の調製 従来の同定法でヒト型結核菌と同定されている培養菌サ
ンプルを用意し、集菌洗浄後、Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法
（Journal of Clinical Microbiology 第２８巻、第３
号、第４９５頁、１９９０年）に従ってＲＮＡを抽出
し、０．１ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌ
の３段階の希釈系列を作成した。この際、各希釈系列に
は、ネガティブＲＮＡとして、市販の酵母ＲＮＡ（和光
純薬社製を用いて、上記抽出操作をしたもの）を１０ｎ
ｇ／μｌの濃度で添加しておいた。
【００４９】（６）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１
６Ｓ ｒＲＮＡの増幅 （５）のＲＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試
薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌１６Ｓ ｒ
ＲＮＡからＲＮＡを増幅した。 試薬：プライマー１ プライマー２ 各種濃度のＥＤＴＡ−Ｎａ（表１に記載） 酵素混合液：ＡＭＶ逆転写酵素 ０．４単位 大腸菌ＲＮａｓｅＨ ０．０００２５単位 大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ １単位 ＭｇＣｌ2 １２ｍＭ ＫＣｌ ７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５） ４０ｍＭ
６Ｓ ｒＲＮＡの増幅 （５）のＲＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試
薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌１６Ｓ ｒ
ＲＮＡからＲＮＡを増幅した。 試薬：プライマー１ プライマー２ 各種濃度のＥＤＴＡ−Ｎａ（表１に記載） 酵素混合液：ＡＭＶ逆転写酵素 ０．４単位 大腸菌ＲＮａｓｅＨ ０．０００２５単位 大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ １単位 ＭｇＣｌ2 １２ｍＭ ＫＣｌ ７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５） ４０ｍＭ
【００５０】方法：まず、サンプル５μｌをプライマー
１およびプライマー２およびＥＤＴＡ−Ｎａを含む溶液
１０μｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、
ＲＮＡを変性させた。その後、酵素混合液５μｌを加え
て、４１℃で９０分間反応させた。
１およびプライマー２およびＥＤＴＡ−Ｎａを含む溶液
１０μｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、
ＲＮＡを変性させた。その後、酵素混合液５μｌを加え
て、４１℃で９０分間反応させた。
【００５１】（７）マイクロタイタープレート中でのサ
ンドイッチハイブリダイゼーション （６）の増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ Ｎａ
ＯＨ中で増幅反応液中の増幅されたＲＮＡを変性させ、
各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭクエ
ン酸リン酸バッファー（ｐＨ６．０)、２％ＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．
１％ＮａＮ3 の溶液１００μｌに加えて、上記（３）の
捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに投
入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、５０
℃で３０分間振盪させた。これによって、ヒト型結核菌
１６Ｓ ｒＲＮＡから増幅されたＲＮＡが、固定化され
た捕捉プローブによって特異的にマイクロタイタープレ
ートに捕捉される。
ンドイッチハイブリダイゼーション （６）の増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ Ｎａ
ＯＨ中で増幅反応液中の増幅されたＲＮＡを変性させ、
各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭクエ
ン酸リン酸バッファー（ｐＨ６．０)、２％ＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．
１％ＮａＮ3 の溶液１００μｌに加えて、上記（３）の
捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに投
入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、５０
℃で３０分間振盪させた。これによって、ヒト型結核菌
１６Ｓ ｒＲＮＡから増幅されたＲＮＡが、固定化され
た捕捉プローブによって特異的にマイクロタイタープレ
ートに捕捉される。
【００５２】次に、上記（４）のアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識した検出プローブを２ｆｍｏｌ／μｌの濃度で
含む５×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、０．１％ＳＤＳ、０．
５％ＰＶＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＺｎＣｌ
2 、０．１％ＮａＮ3の溶液１００μｌと置換し、同様
に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、５０℃で
３０30分間振盪させた。これによって、捕捉されたＲＮ
Ａにアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プローブが
特異的に結合した。その後、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．
０)、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に置
換し、５０℃で１０分間保温、さらに１×ＳＳＣに置換
し洗浄した。洗浄液排出後、アルカリ性ホスファターゼ
の発光基質であるジオキセタン化合物（商品名、Lumiph
os 480、Lumigen 社）１００μｌを注入し、３７℃で１
５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニ
クス社）で発光量を測定した。
ーゼ標識した検出プローブを２ｆｍｏｌ／μｌの濃度で
含む５×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、０．１％ＳＤＳ、０．
５％ＰＶＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＺｎＣｌ
2 、０．１％ＮａＮ3の溶液１００μｌと置換し、同様
に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、５０℃で
３０30分間振盪させた。これによって、捕捉されたＲＮ
Ａにアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プローブが
特異的に結合した。その後、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．
０)、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に置
換し、５０℃で１０分間保温、さらに１×ＳＳＣに置換
し洗浄した。洗浄液排出後、アルカリ性ホスファターゼ
の発光基質であるジオキセタン化合物（商品名、Lumiph
os 480、Lumigen 社）１００μｌを注入し、３７℃で１
５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニ
クス社）で発光量を測定した。
【００５３】これらの工程はすべて、ＤＮＡプローブ自
動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌; 第２０
巻、第７２８頁、１９９５年参照）により自動で行わ
れ、所要時間は、約２時間であった。
動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌; 第２０
巻、第７２８頁、１９９５年参照）により自動で行わ
れ、所要時間は、約２時間であった。
【００５４】（８）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｎ
ＡＳＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０ｎｇ／μｌ存在下
でのＥＤＴＡ添加の効果） 上記（６）にて増幅し、（７）にて検出されたヒト型結
核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出結果を表１に示す。数値は
発光量（cps；count/second）で表示され、同一条件で
４回の繰り返し実験を行った。
ＡＳＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０ｎｇ／μｌ存在下
でのＥＤＴＡ添加の効果） 上記（６）にて増幅し、（７）にて検出されたヒト型結
核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出結果を表１に示す。数値は
発光量（cps；count/second）で表示され、同一条件で
４回の繰り返し実験を行った。
【００５５】
【表１】
【００５６】「ＥＤＴＡ−Ｎａなし」に比較して、「Ｅ
ＤＴＡ−Ｎａを添加したもの」は陽性シグナルが著しく
上昇（１．５ｍＭ添加の場合、添加なしに比べ、１０ｐ
ｇ/μｌで６〜１２倍、１ｐｇ/μｌで８〜２０倍以上）
している。０．５ｍＭで既に効果がみられたが、１．５
ｍＭあたりが最適条件と考えられる。通常、該検出系で
の検出限界は、１ｐｇ／μｌあたりであるが、ＥＤＴＡ
−Ｎａ添加により陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判
定が容易になったため、１０００cps を暫定的なカット
オフ値とした場合、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加により感度が向
上したともいえる。結論として、ネガティブＲＮＡ(酵
母ＲＮＡ)１０ｎｇ／μｌ存在下でのヒト型結核菌１６
Ｓ ｒＲＮＡの増幅においては、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加
は、シグナル向上に絶大な効果を発揮すると考えられ
る。
ＤＴＡ−Ｎａを添加したもの」は陽性シグナルが著しく
上昇（１．５ｍＭ添加の場合、添加なしに比べ、１０ｐ
ｇ/μｌで６〜１２倍、１ｐｇ/μｌで８〜２０倍以上）
している。０．５ｍＭで既に効果がみられたが、１．５
ｍＭあたりが最適条件と考えられる。通常、該検出系で
の検出限界は、１ｐｇ／μｌあたりであるが、ＥＤＴＡ
−Ｎａ添加により陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判
定が容易になったため、１０００cps を暫定的なカット
オフ値とした場合、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加により感度が向
上したともいえる。結論として、ネガティブＲＮＡ(酵
母ＲＮＡ)１０ｎｇ／μｌ存在下でのヒト型結核菌１６
Ｓ ｒＲＮＡの増幅においては、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加
は、シグナル向上に絶大な効果を発揮すると考えられ
る。
【００５７】実施例２ 実施例１と同様にして、ＥＤＴＡ−Ｎａを表２に記載さ
れる濃度にて使用した。その結果を表２に示す。
れる濃度にて使用した。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】表２から明らかなように、６０ｍＭのＥＤ
ＴＡ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進む
ことが確認され、また、ＥＤＴＡ−Ｎａを加えてもブラ
ンクの上昇は見られない。
ＴＡ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進む
ことが確認され、また、ＥＤＴＡ−Ｎａを加えてもブラ
ンクの上昇は見られない。
【００６０】実施例３ ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）を添加
したＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結核菌（Mycobacteriu
m tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの高感度検出 （１）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮ
Ａの増幅 実施例１と全く同じ条件で、ＮＡＳＢＡ法によるヒト型
結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅の際にＥＤＴＡ−Ｎａに
替えてＮＴＡ−Ｎａを添加することで、ＮＴＡによるシ
グナル増強効果を検証した。ＮＡＳＡＢＡに添加するＥ
ＤＴＡ−Ｎａ以外の試薬やサンプルとその調製方法は、
実施例１と全く同一である。実施例１（５）のＲＮＡ溶
液をサンプルとして使用して、ＮＡＳＢＡ法によりヒト
型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅し
た。リバースプライマーとしてプライマー１を、フォワ
ードプライマーとしてプライマー２を使用した。方法・
条件は基本的にNature 第３５０巻、第９１頁（１９９
１年）に従ったが、反応液中に表２に記載する各濃度の
ＮＴＡ−Ｎａを添加している。まず、サンプル５μｌを
酵素以外の組成（プライマーも含む）を含む溶液１０μ
ｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡ
を変性させる。その後、酵素混合液５μｌを加えて、４
１℃で９０分間反応させる。以上でＮＡＳＡＢＡ工程は
終了する。
したＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結核菌（Mycobacteriu
m tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの高感度検出 （１）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮ
Ａの増幅 実施例１と全く同じ条件で、ＮＡＳＢＡ法によるヒト型
結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅の際にＥＤＴＡ−Ｎａに
替えてＮＴＡ−Ｎａを添加することで、ＮＴＡによるシ
グナル増強効果を検証した。ＮＡＳＡＢＡに添加するＥ
ＤＴＡ−Ｎａ以外の試薬やサンプルとその調製方法は、
実施例１と全く同一である。実施例１（５）のＲＮＡ溶
液をサンプルとして使用して、ＮＡＳＢＡ法によりヒト
型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅し
た。リバースプライマーとしてプライマー１を、フォワ
ードプライマーとしてプライマー２を使用した。方法・
条件は基本的にNature 第３５０巻、第９１頁（１９９
１年）に従ったが、反応液中に表２に記載する各濃度の
ＮＴＡ−Ｎａを添加している。まず、サンプル５μｌを
酵素以外の組成（プライマーも含む）を含む溶液１０μ
ｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡ
を変性させる。その後、酵素混合液５μｌを加えて、４
１℃で９０分間反応させる。以上でＮＡＳＡＢＡ工程は
終了する。
【００６１】（２）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｎ
ＡＳＡＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０μｇ／μｌ存在
下でのＮＴＡ添加の効果） 上記（１）において増幅し、実施例１（７）の方法に従
って、マイクロタイタープレート中でのサンドイッチハ
イブリダイゼーションを実施して検出された結果を表３
に示す。数値は発光量（cps;count/sec）で表示され、
同一条件で４回の繰り返し実験を行った。
ＡＳＡＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０μｇ／μｌ存在
下でのＮＴＡ添加の効果） 上記（１）において増幅し、実施例１（７）の方法に従
って、マイクロタイタープレート中でのサンドイッチハ
イブリダイゼーションを実施して検出された結果を表３
に示す。数値は発光量（cps;count/sec）で表示され、
同一条件で４回の繰り返し実験を行った。
【００６２】
【表３】
【００６３】「添加なし」に比較して、ＮＴＡを添加し
たものは陽性シグナルが著しく上昇（１．５ｍＭ添加の
場合、添加なしに比べて、１０ｐｇ／μｌで４〜９倍、
１ｐｇ／μｌで５〜２０倍以上）している。０．５ｍＭ
で既に効果がみられるが、ＥＤＴＡと同様に１．５ｍＭ
辺りが最適条件と考えられる。通常、本検出系における
検出限界は１ｐｇ／μｌ辺りであるが、ＮＴＡの添加に
より陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判定が容易にな
ったため、１０００cpsを暫定的なカットオフ値とした
場合、ＮＴＡの添加により感度が向上したといえる。結
論として、ネガティブＲＮＡ（酵母ＲＮＡ）１０ｎｇ／
μｌ存在下でのヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳ
ＡＢＡにおいては、ＮＴＡの添加はＥＤＴＡ添加と同様
にシグナル向上に大きな効果を発揮する。
たものは陽性シグナルが著しく上昇（１．５ｍＭ添加の
場合、添加なしに比べて、１０ｐｇ／μｌで４〜９倍、
１ｐｇ／μｌで５〜２０倍以上）している。０．５ｍＭ
で既に効果がみられるが、ＥＤＴＡと同様に１．５ｍＭ
辺りが最適条件と考えられる。通常、本検出系における
検出限界は１ｐｇ／μｌ辺りであるが、ＮＴＡの添加に
より陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判定が容易にな
ったため、１０００cpsを暫定的なカットオフ値とした
場合、ＮＴＡの添加により感度が向上したといえる。結
論として、ネガティブＲＮＡ（酵母ＲＮＡ）１０ｎｇ／
μｌ存在下でのヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳ
ＡＢＡにおいては、ＮＴＡの添加はＥＤＴＡ添加と同様
にシグナル向上に大きな効果を発揮する。
【００６４】実施例４ 実施例３と同様にして、ＮＴＡ−Ｎａを表４に記載され
る濃度にて使用した。その結果を表４に示す。
る濃度にて使用した。その結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】表４から明らかなように、６０ｍＭのＮＴ
Ａ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進行す
ることが確認され、またブランクの上昇もみられない。
Ａ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進行す
ることが確認され、またブランクの上昇もみられない。
【００６７】
【発明の効果】上述したように、本発明により、配列特
異的な核酸増幅反応において、温度などの物理的な条件
を変えることなく、極めて簡単に非特異的な反応を抑制
し、感度及びシグナルの向上を著しく向上させることが
可能となる。
異的な核酸増幅反応において、温度などの物理的な条件
を変えることなく、極めて簡単に非特異的な反応を抑制
し、感度及びシグナルの向上を著しく向上させることが
可能となる。
【００６８】また、従来ネガティブＲＮＡを一定量、共
存させた場合、項目によっては感度付近のシグナルが低
下する場合があったが、本発明では、エチレンジアミン
四酢酸またはその塩を添加することにより、非特異増幅
反応によるプライマーや基質（ｒＮＴＰやｄＮＴＰ）の
消費を抑制し、相対的に特異的増幅の効率を向上させ
る。また、本発明はＮＡＳＢＡ法をはじめとする他の核
酸増幅反応の改良として、極めて有用である。
存させた場合、項目によっては感度付近のシグナルが低
下する場合があったが、本発明では、エチレンジアミン
四酢酸またはその塩を添加することにより、非特異増幅
反応によるプライマーや基質（ｒＮＴＰやｄＮＴＰ）の
消費を抑制し、相対的に特異的増幅の効率を向上させ
る。また、本発明はＮＡＳＢＡ法をはじめとする他の核
酸増幅反応の改良として、極めて有用である。
【００６９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..47 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）16S rRNA遺伝子の配 列と相補的な配列を有する。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCTA CCCGTCGTCG CCTTGGT 47
【００７０】 配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）16S rRNA遺伝子の配 列と相補的な配列を有する。 配列 GGAAAGGTCT CTTCGGAGAT A 2 1
【００７１】 配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）16S rRNA遺伝子の配 列と相補的な配列を有する。 配列 TAGGACCACG GGATGCATGT 2 0
【００７２】 配列番号：４ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..18 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）16S rRNA遺伝子の配 列と相補的な配列を有する。 配列 GCGCTTTAGC GGTGTGGG 1 8
Claims (10)
- 【請求項１】 エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢
酸、ウラミル二酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサ
ンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチ
レングリコールビス（２−アミノエチル）エーテルジア
ミン四酢酸［ビス（２−アミノエチル）エーテル四酢
酸］、トリエチレンテトラミン六酢酸よりなる群から選
択された少なくとも１種の物質もしくはその塩を含有す
ることを特徴とする核酸増幅用試薬。 - 【請求項２】 エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢
酸よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もし
くはその塩を含有する請求項１記載の核酸増幅用試薬。 - 【請求項３】 標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワー
ドプライマー、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリ
バースプライマー、リボヌクレオチド、デオキシリボヌ
クレオチド、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメ
ラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液を含有する請
求項１または２に記載の核酸増幅用試薬。 - 【請求項４】 エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢
酸、ウラミル二酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサ
ンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチ
レングリコールビス（２−アミノエチル）エーテルジア
ミン四酢酸［ビス（２−アミノエチル）エーテル四酢
酸］、トリエチレンテトラミン六酢酸よりなる群から選
択された少なくとも１種の物質もしくはその塩の濃度
が、核酸増幅反応液中の最終濃度で０．５〜６０ｍＭで
ある請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅用試薬。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増
幅用試薬および検出用プローブを含む核酸検出用試薬。 - 【請求項６】 核酸増幅反応液中に、エチレンジアミン
四酢酸、ニトリロ三酢酸、ウラミル二酢酸、トランス−
１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸、ジエチレント
リアミン五酢酸、エチレングリコールビス（２−アミノ
エチル）エーテルジアミン四酢酸［ビス（２−アミノエ
チル）エーテル四酢酸］、トリエチレンテトラミン六酢
酸よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もし
くはその塩を添加することを特徴とする配列特異的な核
酸増幅方法。 - 【請求項７】 エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢
酸よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もし
くはその塩を添加することを特徴とする請求項６記載の
配列特異的な核酸増幅方法。 - 【請求項８】 核酸増幅反応が、ＮＡＳＢＡ法である請
求項６または７に記載の配列特異的な核酸増幅方法。 - 【請求項９】 エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢
酸、ウラミル二酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサ
ンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチ
レングリコールビス（２−アミノエチル）エーテルジア
ミン四酢酸［ビス（２−アミノエチル）エーテル四酢
酸］、トリエチレンテトラミン六酢酸よりなる群から選
択された少なくとも１種の物質もしくはその塩が、核酸
増幅反応液中の最終濃度で０．５〜６０ｍＭの濃度であ
る請求項６〜８のいずれかに記載の配列特異的な核酸増
幅方法。 - 【請求項１０】 増幅しようとする核酸がＲＮＡである
請求項６〜９のいずれかに記載の核酸増幅方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01843499A JP4196236B2 (ja) | 1998-03-17 | 1999-01-27 | 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法 |
| US09/268,710 US6261773B1 (en) | 1998-03-17 | 1999-03-16 | Reagent for nucleic acid amplification and process for nucleic acid amplification |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6698898 | 1998-03-17 | ||
| JP10-66988 | 1998-03-17 | ||
| JP01843499A JP4196236B2 (ja) | 1998-03-17 | 1999-01-27 | 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11318473A true JPH11318473A (ja) | 1999-11-24 |
| JP4196236B2 JP4196236B2 (ja) | 2008-12-17 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01843499A Expired - Fee Related JP4196236B2 (ja) | 1998-03-17 | 1999-01-27 | 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法 |
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP4196236B2 (ja) |
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| US6664081B2 (en) * | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US6949368B2 (en) * | 2001-01-30 | 2005-09-27 | The Trustees Of Princeton University | Compositions and methods for enhancing polynucleotide amplification reactions |
| US7772383B2 (en) * | 2002-01-25 | 2010-08-10 | The Trustees Of Princeton University | Chemical PCR: Compositions for enhancing polynucleotide amplification reactions |
| US7998699B2 (en) | 2002-08-15 | 2011-08-16 | University Of South Florida | Early detection of pathogens in blood |
| US8394944B2 (en) * | 2002-09-20 | 2013-03-12 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Dual-purpose primers and probes for providing enhanced hybridization assays by disruption of secondary structure formation |
| EP2103694B1 (en) | 2003-08-15 | 2011-05-25 | University of South Florida | Materials and methods for capture of pathogens and removal of aurintricarboxylic acid from a sample |
| EP1784508B1 (en) * | 2004-08-09 | 2012-10-03 | Generation Biotech, LLC | Method for nucleic acid isolation and amplification |
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| US7833716B2 (en) | 2006-06-06 | 2010-11-16 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| DE202016009003U1 (de) | 2015-05-29 | 2021-05-28 | Curevac Real Estate Gmbh | Zusammensetzung umfassend in vitro transkribierte RNA erhältlich durch ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von RNA mit mindestens einem Schritt mit einer tangentialen Flussfiltration |
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|---|---|---|---|---|
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| DK0540693T3 (da) * | 1990-07-24 | 1999-09-13 | Hoffmann La Roche | Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy |
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1999
- 1999-01-27 JP JP01843499A patent/JP4196236B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-16 US US09/268,710 patent/US6261773B1/en not_active Expired - Fee Related
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