JP4196236B2 - 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的研究や臨床診断などに有用な核酸増幅用試薬ならびに配列特異的な核酸増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を人為的に増幅する技術、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、３ＳＲなどの核酸増幅法が広く知られるようになり、医学、生物学等の研究に広く使われるようになり、現在では遺伝子の検出、クローニング、改変などにはなくてはならない技術となっている。さらには、これらの増幅技術を応用した臨床診断方法も開発されている。例えば、結核菌などの病原体が有する特徴的な核酸を増幅し、増幅後の核酸を検出することにとって、極めて短時間かつ高感度に該病原体を検出する方法が開発され、既に実用化されている。また、ヒトや他の動物の遺伝子の異常検出などへの応用も実用化されつつある。
【０００３】
このような核酸増幅技術の１つに、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequense-based amplification ）法（Nature;第３５０巻、第９１頁、１９９１年）がある。このＮＡＳＢＡ法は、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを組合せ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素、ＲＮＡａｓｅＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、その間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術である。増幅されるのは、標的ＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡである。
【０００４】
このＮＡＳＢＡ法の特徴は、ＲＮＡからの増幅が、下記工程を一段階で行えることである。ＤＮＡを２倍ずつ増幅することが特徴であるＰＣＲ法をＲＮＡからの増幅に応用する場合、ＰＣＲ反応の前段階として、ＲＮＡからＤＮＡを作る逆転写反応（ＲＴ反応）を行う必要がある（ＲＴ−ＰＣＲ法）。
【０００５】
上記ＲＴ−ＰＣＲ法は操作が煩雑になり、時間もかかる（場合にもよるが、５〜６時間程度）。しかしながら、ＮＡＳＢＡ法を用いれば、１回の反応で済み、時間も２時間以内に終了する。
【０００６】
また、同一配列を有するＤＮＡの混在下でも、ＲＮＡからの増幅反応が優先的に起こることである。これは、正常遺伝子の発現量を測定したい場合などに有用である。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＰＣＲ工程でどうしてもＤＮＡからの増幅が発生する。
【０００７】
さらに、ＮＡＳＢＡ法は増幅反応が一定温度で行われることが特徴である。サーマルサイクラーではなく、通常の恒温漕で実行できる。
【０００８】
また、ＮＡＳＢＡ法は極めて高い増幅効率を有することが特徴である。理想的な反応においては、検出限界以上のターゲットＲＮＡが存在すれば、増幅反応が急激に進行し、極めて高い陽性シグナルが得られるのに対し、検出限界以下では全くシグナルが検出されない。つまり、陽性／陰性の判定が極めて明瞭になるのである。
【０００９】
一方、ＮＡＳＢＡ法に限らず、ＰＣＲ等の他の核酸増幅反応で、常に問題になることの一つに、非特異的な増幅反応の発生が挙げられる。これは主にプライマーが標的配列以外の核酸に結合することによって発生すると考えられている。非特異反応は感度、シグナルの低下を招く。一般的に行われているＰＣＲ法とその後の電気泳動による検出では、非特異反応は感度の低下、目的バンドのシグナル低下・電気泳動像の不明瞭化となって現れる。ＮＡＳＢＡも同様である。現実的には、非特異反応を完全に防ぐことは不可能であるが、感度などを向上させるためには、出来るだけ低減させた方がよい。
【００１０】
まず、非特異反応の発生は、プライマーの性能や増幅領域の選定によるところが大きいので、Ｔｍ値や配列の特異性、立体構造などを勘案し、出来るだけ非特異反応を起こしにくいプライマーを選択することが最も肝要である。しかし、大抵の場合は増幅したい領域が先に決まっているので、プライマーの選定には制約がかかることが多い。
【００１１】
このような非特異的反応の発生を抑制する方法として、ＰＣＲ法の場合、サイクル中のアニール温度や時間など、物理的な調節によってある程度非特異反応を低減し、限界はあるものの、増幅サイクルを増やすことによってある程度シグナルの向上を図ることも可能である。さらには、増幅領域の内側に第二のプライマーペアを設定し、２段階ＰＣＲ法（nestedＰＣＲ）を行うことによって、感度の向上を図る方法もある。
【００１２】
しかし、ＮＡＳＢＡ法の場合、一定温度で反応が進むので、温度やサイクルなどの調節は出来ない。２段階ＮＡＳＢＡ法は可能であるが、ＰＣＲ同様、操作が非常に煩雑になり、ＮＡＳＢＡの簡便性が大きく損なわれる。ＮＡＳＢＡ法は操作、工程の簡便性の故、物理的な調節が難しい側面がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生物学的研究や臨床診断に有用となる、高感度な配列特異的核酸増幅方法、特にＮＡＳＢＡ法ならびにそのための試薬を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、配列特異的核酸増幅技術、例えばＮＡＳＢＡ法において、種々検討を重ねた結果、核酸増幅反応液中にエチレンジアミン四酢酸またはその塩を添加することによって、非特異的な反応を抑制し、感度およびシグナルの向上を達成することが出来ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、「エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ウラミル二酢酸（ＵＤＡ）、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチル）エーテルジアミン四酢酸［ビス（２−アミノエチル）エーテル四酢酸］（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もしくはその塩」（以下、この群を増幅反応改良剤と言う）を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬である。
【００１６】
更に、本発明は、核酸増幅反応液中に１種以上の上記増幅反応改良剤を添加することを特徴とする配列特異的な核酸増幅方法である。上記増幅反応改良剤のいずれを選択してもよいが、なかでも、ＥＤＴＡもしくはその塩、あるいはＮＴＡもしくはその塩が特に好ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において、核酸増幅とは、試料中の核酸から、増幅したい核酸（標的核酸）をその固有の配列の相補性を利用して増幅することをいう。本発明における核酸増幅用試薬および核酸増幅法が適用可能な、該核酸増幅の方法としては、特に限定されるものではないが、具体的には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。なかでも、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法において特に有用である。
【００１８】
本発明の核酸増幅法とは、例えばＮＡＳＢＡ法であり、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを組合せ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡａｓｅＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、その２種のプライマー間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術である。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素を使用してもよい。
【００１９】
該方法は、具体的には、下記工程からなる。
（Ａ）標的ＲＮＡに、逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを作用させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る。
（Ｂ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｃ）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素の存在下、得られた１本鎖ＤＮＡに標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｄ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、複数のＲＮＡを得る。
【００２０】
（Ｅ）次いで、得られたＲＮＡに逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーを反応させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る。
（Ｆ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｇ）得られた１本鎖ＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｈ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、複数のＲＮＡを得る。
（Ｉ）上記工程（Ｅ）〜（Ｈ）を繰り返すことにより、標的ＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡを多量に得る。
【００２１】
上記工程は、１段階にて３７〜４５℃の温度で行う。
【００２２】
本発明の核酸増用幅試薬とは、（１）標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのロモーターを５’末端に付加したリバースプライマー、（３）リボヌクレオチド、（４）デオキシリボヌクレオチド、（５）逆転写酵素、（６）ＲＮａｓｅＨ、（７）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素および（８）ＲＮＡポリメラーゼ、（９）緩衝液および（１０）増幅反応改良剤を含む。これらの各成分は１つの反応液とする。
【００２３】
本発明において標的ＲＮＡは、ヒト体液、例えば全血から常法により単離精製する。例えば、培養菌サンプルを用意し、集菌洗浄後、カオトロピックイオンの存在下に、シリカ粒子にＲＮＡを吸着させる方法（Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法、Journal of Clinical Microbiology 第２８巻、第３号、第４９５頁、１９９０年）に従って、ＲＮＡを抽出する。
【００２４】
（１）標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーは、増幅しようとする標的核酸に応じて、その塩基配列を選択したオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。そのオリゴヌクレオチド数は、一般に１５〜２５ｂｐである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、使用するＲＮＡポリメラーゼによって種々異なる塩基配列を有する。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．０００２５単位である。
【００２５】
（３）リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）とは、アデノシン５’−三リン酸、グアノシン５’−三リン酸、ウリジン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン酸を指す。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約１．６〜２．４ｍＭである。
【００２６】
（４）デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とは、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシグアノシン５’−三リン酸、デオキシウリジン５’−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸を指す。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．８〜１．２ｍＭである。
【００２７】
（５）逆転写酵素としては、上記プライマー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー）およびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得るいかなる酵素でもよい。この酵素は、さらにＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮａｓｅＨ活性を含んでいてもよい。このような酵素としては、例えばトリ筋芽細胞腫ウイルス由来ポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、モロニー・マウス白血病ウイルス由来ポリメラーゼ（ＭＭＬＶ逆転写酵素）、別の真核細胞由来のポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼなどがある。核酸増幅反応液中の最終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
【００２８】
（６）ＲＮａｓｅＨとしては、相補的ＤＮＡにアニールされたＲＮＡを加水分解し得るいかなる酵素でもよい。例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＨ、仔牛胸腺ＲＮａｓｅＨ、ＡＭＶ逆転写酵素などが挙げられる。増幅反応液中の最終濃度は、約０．０００２５単位である。
【００２９】
（７）ＤＮＡポリメラーゼとしては、上記プライマー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー）とＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得るいかなる酵素でもよい。このような酵素としては、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼαまたはβなどの真核細胞ＤＮＡポリメラーゼ、仔牛胸腺などの哺乳動物組織由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
【００３０】
（８）ＲＮＡポリメラーゼとしては、プロモーターと指称される特定のオリゴヌクレオチド配列に結合でき、かつ、プロモーターに極めて近接した所定の開始部位で、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を特異的に開始し得るいかなる酵素でもよい。さらに、ＲＮＡポリメラーゼは適当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数個のＲＮＡを合成し得ることが必要である。このような酵素としては、例えば、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、ファージφＩＩＲＮＡポリメラーゼ、Salmonellaファージsp6 ＲＮＡポリメラーゼ、Pseudomonas ファージgh-1ＲＮＡポリメラーゼ、原核細胞または真核細胞由来のＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最終濃度は、約０．８〜１．２単位である。
【００３１】
（９）緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの汎用の緩衝液を使用する。
【００３２】
本発明の核酸増幅用試薬には、上記成分の他に、必要によりマグネシウムイオン、カリウムイオンなどを含んでいてもよい。マグネシウムイオンの量は、約１０〜１４ｍＭ、カリウムイオンの量は、約５６〜８４ｍＭである。
【００３３】
（１０）増幅反応改良剤は、核酸増幅反応液中の最終濃度（至適濃度）で、約０．５〜６０ｍＭ、好ましくは０．５〜６ｍＭである。ＮＡＳＢＡ法における増幅反応改良剤の至適濃度は、標的核酸（すなわち、増幅配列やプライマー配列）によって異なる。概ね、０．５〜６ｍＭの範囲内に至適濃度が確認されているが、標的核酸によっては、更に高い濃度や、低い濃度がも考えられる。本発明の核酸増幅法は、６ｍＭ以上の高濃度に至適条件をもつ標的核酸にも適用でき、６０ｍＭの増幅反応改良剤を添加した場合でも問題なく増幅反応が進むことが確認された。
【００３４】
塩の形で存在する増幅反応改良剤としては、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また直接的な効果としては、ナトリウム塩も、カリウム塩も同等であると考えられる。しかし、カリウムイオン濃度は増幅に関与する各種酵素の反応に影響を及ぼすことが多いので、ナトリウム塩の形がより望ましい。
【００３５】
上記増幅反応改良剤がどのようなメカニズムで、特異的シグナルを向上させるのかは、必ずしも完全に明らかになっているわけではない。ＮＡＳＢＡ反応液には通常約１２ｍＭの塩化マグネシウムが含まれており、キレート剤としてのＥＤＴＡまたはその塩がマグネシウムイオンを捕捉し、マグネシウムイオンを調節しているとも考えられる。
【００３６】
それならば、塩化マグネシウムの濃度そのものを調節すれば、同じ効果が得られるはずである。しかしながら、実際に検討してみたところ、塩化マグネシウムの濃度を１２ｍＭ以下に低下させると、むしろシグナルは低下する。したがって、マグネシウムイオン濃度の調節ではない別のメカニズムが存在すると考えられる。
【００３７】
本発明では、増幅反応改良剤がＮＡＳＢＡ法における非特異増幅反応を抑制し、特異的増幅の効率を向上させている。このことから、上記増幅反応改良剤はプライマーのターゲット以外への非特異的な結合を抑制し、ミスプライミングを抑制していることが推察される。したがって、本発明の核酸増幅法は、ＰＣＲ、ＴＭＡ、３ＳＲなど他の核酸増幅技術にも応用が可能である。
【００３８】
本発明において使用する検出用プローブとは、検出しようとする標的核酸に応じて選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。該プローブには、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、ビオチン、アビジン、蛍光色素などの標識物質を結合してもよい。
【００３９】
核酸検出法としては、マイクロタイターなどの固相に捕捉プローブを結合し、上記増幅法により増幅したく試料中の標的核酸を捕捉した後、検出プローブにて、試料中の核酸をサンドイッチして、検出プローブの標識を常法により測定する方法が一般的である。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００４１】
実施例１ ＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの高感度検出
（１）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用プライマーの合成
パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用リバースプライマー、以下、プライマー１と呼ぶ）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用フォワードプライマー、以下、プライマー２と呼ぶ）を合成した。
【００４２】
プライマー１は、増幅対象となるＲＮＡに相補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、Ｔ７プロモーター配列（２７ヌクレオチド）を連結している。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムにて実施した。
【００４３】
（２）リンカーアームを有するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ産物検出用捕捉プローブ（以下、捕捉プローブと呼ぶ）用オリゴヌクレオチド）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ産物検出用検出プローブ（以下、検出プローブと呼ぶ）用オリゴヌクレオチド）を合成した。
【００４４】
この際、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法により、デオキシウリジンから化学合成により調製した、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴを置換しうるが、今回は５’末端のＴを置換した。
合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。
【００４５】
（３）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドのマイクロタイタープレートへの結合上記（２）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドについて、そのリンカーアームを介して、マイクロタイタープレート内面へ結合した。リンカーオリゴヌクレオチドを５０ｍＭ硼酸バッファー（ｐＨ１０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 の溶液に０．０５ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈し、マイクロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック社）に各１００μｌずつ分注し、１５時間程度、室温に放置することで、リンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタープレート内面に結合させた。その後、０．１ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶＰ、５×ＳＳＣに置換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に１×ＳＳＣで洗浄して乾燥させた。
【００４６】
（４）検出プローブ用オリゴヌクレオチドの標識化
上記（２）で合成した検出プローブ用オリゴヌクレオチドについて、そのリンカーアームを介してアルカリ性ホスファターゼとの結合を、Nucleic Acids Res.;第１４巻、第６１１５頁（１９８６年）に従って、下記のように行なった。
【００４７】
リンカーオリゴヌクレオチド１．５Ａ２６０を０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 １２．５μｌに溶解し、ここへ１０ｍｇ／ｍｌスベリン酸ジスクシニミジル(ＤＳＳ) ２５μｌを加えて室温、２分間反応させた。反応液を１ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０)で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社）カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ)でゲル濾過して、過剰のＤＳＳを除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3、３Ｍ ＮａＣｌ)に溶解したもの）と室温で、１６時間反応させることにより、アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブを得た。得られた標識プローブは、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて、限外濾過法により濃縮した。これを検出プローブとして用いた。
【００４８】
（５）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ検討用試料の調製
従来の同定法でヒト型結核菌と同定されている培養菌サンプルを用意し、集菌洗浄後、Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法（Journal of Clinical Microbiology 第２８巻、第３号、第４９５頁、１９９０年）に従ってＲＮＡを抽出し、０．１ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌの３段階の希釈系列を作成した。この際、各希釈系列には、ネガティブＲＮＡとして、市販の酵母ＲＮＡ（和光純薬社製を用いて、上記抽出操作をしたもの）を１０ｎｇ／μｌの濃度で添加しておいた。
【００４９】
（６）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅
（５）のＲＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡからＲＮＡを増幅した。
【００５０】
方法：まず、サンプル５μｌをプライマー１およびプライマー２およびＥＤＴＡ−Ｎａを含む溶液１０μｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させた。その後、酵素混合液５μｌを加えて、４１℃で９０分間反応させた。
【００５１】
（７）マイクロタイタープレート中でのサンドイッチハイブリダイゼーション
（６）の増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ ＮａＯＨ中で増幅反応液中の増幅されたＲＮＡを変性させ、各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ６．０)、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3 の溶液１００μｌに加えて、上記（３）の捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに投入した。
蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、５０℃で３０分間振盪させた。これによって、ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡから増幅されたＲＮＡが、固定化された捕捉プローブによって特異的にマイクロタイタープレートに捕捉される。
【００５２】
次に、上記（４）のアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プローブを２ｆｍｏｌ／μｌの濃度で含む５×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＰＶＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＺｎＣｌ2 、０．１％ＮａＮ3の溶液１００μｌと置換し、同様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、５０℃で３０30分間振盪させた。これによって、捕捉されたＲＮＡにアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プローブが特異的に結合した。その後、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に置換し、５０℃で１０分間保温、さらに１×ＳＳＣに置換し洗浄した。洗浄液排出後、アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるジオキセタン化合物（商品名、Lumiphos 480、Lumigen 社）１００μｌを注入し、３７℃で１５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測定した。
【００５３】
これらの工程はすべて、ＤＮＡプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌; 第２０巻、第７２８頁、１９９５年参照）により自動で行われ、所要時間は、約２時間であった。
【００５４】
（８）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０ｎｇ／μｌ存在下でのＥＤＴＡ添加の効果）
上記（６）にて増幅し、（７）にて検出されたヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出結果を表１に示す。数値は発光量（cps；count/second）で表示され、同一条件で４回の繰り返し実験を行った。
【００５５】
【表１】
【００５６】
「ＥＤＴＡ−Ｎａなし」に比較して、「ＥＤＴＡ−Ｎａを添加したもの」は陽性シグナルが著しく上昇（１．５ｍＭ添加の場合、添加なしに比べ、１０ｐｇ/μｌで６〜１２倍、１ｐｇ/μｌで８〜２０倍以上）している。０．５ｍＭで既に効果がみられたが、１．５ｍＭあたりが最適条件と考えられる。通常、該検出系での検出限界は、１ｐｇ／μｌあたりであるが、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加により陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判定が容易になったため、１０００cps を暫定的なカットオフ値とした場合、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加により感度が向上したともいえる。
結論として、ネガティブＲＮＡ(酵母ＲＮＡ)１０ｎｇ／μｌ存在下でのヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅においては、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加は、シグナル向上に絶大な効果を発揮すると考えられる。
【００５７】
実施例２
実施例１と同様にして、ＥＤＴＡ−Ｎａを表２に記載される濃度にて使用した。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
表２から明らかなように、６０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進むことが確認され、また、ＥＤＴＡ−Ｎａを加えてもブランクの上昇は見られない。
【００６０】
実施例３ ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）を添加したＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの高感度検出
（１）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅
実施例１と全く同じ条件で、ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅の際にＥＤＴＡ−Ｎａに替えてＮＴＡ−Ｎａを添加することで、ＮＴＡによるシグナル増強効果を検証した。ＮＡＳＡＢＡに添加するＥＤＴＡ−Ｎａ以外の試薬やサンプルとその調製方法は、実施例１と全く同一である。実施例１（５）のＲＮＡ溶液をサンプルとして使用して、ＮＡＳＢＡ法によりヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅した。リバースプライマーとしてプライマー１を、フォワードプライマーとしてプライマー２を使用した。方法・条件は基本的にNature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年）に従ったが、反応液中に表２に記載する各濃度のＮＴＡ−Ｎａを添加している。まず、サンプル５μｌを酵素以外の組成（プライマーも含む）を含む溶液１０μｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させる。その後、酵素混合液５μｌを加えて、４１℃で９０分間反応させる。以上でＮＡＳＡＢＡ工程は終了する。
【００６１】
（２）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＡＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０μｇ／μｌ存在下でのＮＴＡ添加の効果）
上記（１）において増幅し、実施例１（７）の方法に従って、マイクロタイタープレート中でのサンドイッチハイブリダイゼーションを実施して検出された結果を表３に示す。数値は発光量（cps;count/sec）で表示され、同一条件で４回の繰り返し実験を行った。
【００６２】
【表３】
【００６３】
「添加なし」に比較して、ＮＴＡを添加したものは陽性シグナルが著しく上昇（１．５ｍＭ添加の場合、添加なしに比べて、１０ｐｇ／μｌで４〜９倍、１ｐｇ／μｌで５〜２０倍以上）している。０．５ｍＭで既に効果がみられるが、ＥＤＴＡと同様に１．５ｍＭ辺りが最適条件と考えられる。通常、本検出系における検出限界は１ｐｇ／μｌ辺りであるが、ＮＴＡの添加により陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判定が容易になったため、１０００cpsを暫定的なカットオフ値とした場合、ＮＴＡの添加により感度が向上したといえる。結論として、ネガティブＲＮＡ（酵母ＲＮＡ）１０ｎｇ／μｌ存在下でのヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＡＢＡにおいては、ＮＴＡの添加はＥＤＴＡ添加と同様にシグナル向上に大きな効果を発揮する。
【００６４】
実施例４
実施例３と同様にして、ＮＴＡ−Ｎａを表４に記載される濃度にて使用した。その結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】
表４から明らかなように、６０ｍＭのＮＴＡ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進行することが確認され、またブランクの上昇もみられない。
【００６７】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、配列特異的な核酸増幅反応において、温度などの物理的な条件を変えることなく、極めて簡単に非特異的な反応を抑制し、感度及びシグナルの向上を著しく向上させることが可能となる。
【００６８】
また、従来ネガティブＲＮＡを一定量、共存させた場合、項目によっては感度付近のシグナルが低下する場合があったが、本発明では、エチレンジアミン四酢酸またはその塩を添加することにより、非特異増幅反応によるプライマーや基質（ｒＮＴＰやｄＮＴＰ）の消費を抑制し、相対的に特異的増幅の効率を向上させる。また、本発明はＮＡＳＢＡ法をはじめとする他の核酸増幅反応の改良として、極めて有用である。
【００６９】
【配列表】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的研究や臨床診断などに有用な核酸増幅用試薬ならびに配列特異的な核酸増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を人為的に増幅する技術、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、３ＳＲなどの核酸増幅法が広く知られるようになり、医学、生物学等の研究に広く使われるようになり、現在では遺伝子の検出、クローニング、改変などにはなくてはならない技術となっている。さらには、これらの増幅技術を応用した臨床診断方法も開発されている。例えば、結核菌などの病原体が有する特徴的な核酸を増幅し、増幅後の核酸を検出することにとって、極めて短時間かつ高感度に該病原体を検出する方法が開発され、既に実用化されている。また、ヒトや他の動物の遺伝子の異常検出などへの応用も実用化されつつある。
【０００３】
このような核酸増幅技術の１つに、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequense-based amplification ）法（Nature;第３５０巻、第９１頁、１９９１年）がある。このＮＡＳＢＡ法は、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを組合せ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素、ＲＮＡａｓｅＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、その間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術である。増幅されるのは、標的ＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡである。
【０００４】
このＮＡＳＢＡ法の特徴は、ＲＮＡからの増幅が、下記工程を一段階で行えることである。ＤＮＡを２倍ずつ増幅することが特徴であるＰＣＲ法をＲＮＡからの増幅に応用する場合、ＰＣＲ反応の前段階として、ＲＮＡからＤＮＡを作る逆転写反応（ＲＴ反応）を行う必要がある（ＲＴ−ＰＣＲ法）。
【０００５】
上記ＲＴ−ＰＣＲ法は操作が煩雑になり、時間もかかる（場合にもよるが、５〜６時間程度）。しかしながら、ＮＡＳＢＡ法を用いれば、１回の反応で済み、時間も２時間以内に終了する。
【０００６】
また、同一配列を有するＤＮＡの混在下でも、ＲＮＡからの増幅反応が優先的に起こることである。これは、正常遺伝子の発現量を測定したい場合などに有用である。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＰＣＲ工程でどうしてもＤＮＡからの増幅が発生する。
【０００７】
さらに、ＮＡＳＢＡ法は増幅反応が一定温度で行われることが特徴である。サーマルサイクラーではなく、通常の恒温漕で実行できる。
【０００８】
また、ＮＡＳＢＡ法は極めて高い増幅効率を有することが特徴である。理想的な反応においては、検出限界以上のターゲットＲＮＡが存在すれば、増幅反応が急激に進行し、極めて高い陽性シグナルが得られるのに対し、検出限界以下では全くシグナルが検出されない。つまり、陽性／陰性の判定が極めて明瞭になるのである。
【０００９】
一方、ＮＡＳＢＡ法に限らず、ＰＣＲ等の他の核酸増幅反応で、常に問題になることの一つに、非特異的な増幅反応の発生が挙げられる。これは主にプライマーが標的配列以外の核酸に結合することによって発生すると考えられている。非特異反応は感度、シグナルの低下を招く。一般的に行われているＰＣＲ法とその後の電気泳動による検出では、非特異反応は感度の低下、目的バンドのシグナル低下・電気泳動像の不明瞭化となって現れる。ＮＡＳＢＡも同様である。現実的には、非特異反応を完全に防ぐことは不可能であるが、感度などを向上させるためには、出来るだけ低減させた方がよい。
【００１０】
まず、非特異反応の発生は、プライマーの性能や増幅領域の選定によるところが大きいので、Ｔｍ値や配列の特異性、立体構造などを勘案し、出来るだけ非特異反応を起こしにくいプライマーを選択することが最も肝要である。しかし、大抵の場合は増幅したい領域が先に決まっているので、プライマーの選定には制約がかかることが多い。
【００１１】
このような非特異的反応の発生を抑制する方法として、ＰＣＲ法の場合、サイクル中のアニール温度や時間など、物理的な調節によってある程度非特異反応を低減し、限界はあるものの、増幅サイクルを増やすことによってある程度シグナルの向上を図ることも可能である。さらには、増幅領域の内側に第二のプライマーペアを設定し、２段階ＰＣＲ法（nestedＰＣＲ）を行うことによって、感度の向上を図る方法もある。
【００１２】
しかし、ＮＡＳＢＡ法の場合、一定温度で反応が進むので、温度やサイクルなどの調節は出来ない。２段階ＮＡＳＢＡ法は可能であるが、ＰＣＲ同様、操作が非常に煩雑になり、ＮＡＳＢＡの簡便性が大きく損なわれる。ＮＡＳＢＡ法は操作、工程の簡便性の故、物理的な調節が難しい側面がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生物学的研究や臨床診断に有用となる、高感度な配列特異的核酸増幅方法、特にＮＡＳＢＡ法ならびにそのための試薬を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、配列特異的核酸増幅技術、例えばＮＡＳＢＡ法において、種々検討を重ねた結果、核酸増幅反応液中にエチレンジアミン四酢酸またはその塩を添加することによって、非特異的な反応を抑制し、感度およびシグナルの向上を達成することが出来ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、「エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ウラミル二酢酸（ＵＤＡ）、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチル）エーテルジアミン四酢酸［ビス（２−アミノエチル）エーテル四酢酸］（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もしくはその塩」（以下、この群を増幅反応改良剤と言う）を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬である。
【００１６】
更に、本発明は、核酸増幅反応液中に１種以上の上記増幅反応改良剤を添加することを特徴とする配列特異的な核酸増幅方法である。上記増幅反応改良剤のいずれを選択してもよいが、なかでも、ＥＤＴＡもしくはその塩、あるいはＮＴＡもしくはその塩が特に好ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において、核酸増幅とは、試料中の核酸から、増幅したい核酸（標的核酸）をその固有の配列の相補性を利用して増幅することをいう。本発明における核酸増幅用試薬および核酸増幅法が適用可能な、該核酸増幅の方法としては、特に限定されるものではないが、具体的には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。なかでも、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法において特に有用である。
【００１８】
本発明の核酸増幅法とは、例えばＮＡＳＢＡ法であり、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを組合せ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡａｓｅＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、その２種のプライマー間の配列を有するＲＮＡを増幅する技術である。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素を使用してもよい。
【００１９】
該方法は、具体的には、下記工程からなる。
（Ａ）標的ＲＮＡに、逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを作用させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る。
（Ｂ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｃ）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素の存在下、得られた１本鎖ＤＮＡに標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｄ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、複数のＲＮＡを得る。
【００２０】
（Ｅ）次いで、得られたＲＮＡに逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマーを反応させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る。
（Ｆ）得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、ＲＮａｓｅＨを作用させて、ＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｇ）得られた１本鎖ＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素の存在下、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーを反応させて、２本鎖ＤＮＡを得る。
（Ｈ）得られた２本鎖ＤＮＡに、ＲＮＡポリメラーゼを作用させて、複数のＲＮＡを得る。
（Ｉ）上記工程（Ｅ）〜（Ｈ）を繰り返すことにより、標的ＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡを多量に得る。
【００２１】
上記工程は、１段階にて３７〜４５℃の温度で行う。
【００２２】
本発明の核酸増用幅試薬とは、（１）標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのロモーターを５’末端に付加したリバースプライマー、（３）リボヌクレオチド、（４）デオキシリボヌクレオチド、（５）逆転写酵素、（６）ＲＮａｓｅＨ、（７）ＤＮＡポリメラーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素および（８）ＲＮＡポリメラーゼ、（９）緩衝液および（１０）増幅反応改良剤を含む。これらの各成分は１つの反応液とする。
【００２３】
本発明において標的ＲＮＡは、ヒト体液、例えば全血から常法により単離精製する。例えば、培養菌サンプルを用意し、集菌洗浄後、カオトロピックイオンの存在下に、シリカ粒子にＲＮＡを吸着させる方法（Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法、Journal of Clinical Microbiology 第２８巻、第３号、第４９５頁、１９９０年）に従って、ＲＮＡを抽出する。
【００２４】
（１）標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、（２）標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマーは、増幅しようとする標的核酸に応じて、その塩基配列を選択したオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。そのオリゴヌクレオチド数は、一般に１５〜２５ｂｐである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、使用するＲＮＡポリメラーゼによって種々異なる塩基配列を有する。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．０００２５単位である。
【００２５】
（３）リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）とは、アデノシン５’−三リン酸、グアノシン５’−三リン酸、ウリジン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン酸を指す。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約１．６〜２．４ｍＭである。
【００２６】
（４）デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とは、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシグアノシン５’−三リン酸、デオキシウリジン５’−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸を指す。核酸増幅反応液中の最終濃度は、それぞれ約０．８〜１．２ｍＭである。
【００２７】
（５）逆転写酵素としては、上記プライマー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー）およびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得るいかなる酵素でもよい。この酵素は、さらにＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮａｓｅＨ活性を含んでいてもよい。このような酵素としては、例えばトリ筋芽細胞腫ウイルス由来ポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、モロニー・マウス白血病ウイルス由来ポリメラーゼ（ＭＭＬＶ逆転写酵素）、別の真核細胞由来のポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼなどがある。核酸増幅反応液中の最終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
【００２８】
（６）ＲＮａｓｅＨとしては、相補的ＤＮＡにアニールされたＲＮＡを加水分解し得るいかなる酵素でもよい。例えば、大腸菌ＲＮａｓｅＨ、仔牛胸腺ＲＮａｓｅＨ、ＡＭＶ逆転写酵素などが挙げられる。増幅反応液中の最終濃度は、約０．０００２５単位である。
【００２９】
（７）ＤＮＡポリメラーゼとしては、上記プライマー（１）または（２）（オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー）とＤＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得るいかなる酵素でもよい。このような酵素としては、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼαまたはβなどの真核細胞ＤＮＡポリメラーゼ、仔牛胸腺などの哺乳動物組織由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最終濃度は、約０．３〜０．５単位である。
【００３０】
（８）ＲＮＡポリメラーゼとしては、プロモーターと指称される特定のオリゴヌクレオチド配列に結合でき、かつ、プロモーターに極めて近接した所定の開始部位で、ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を特異的に開始し得るいかなる酵素でもよい。さらに、ＲＮＡポリメラーゼは適当な時間内に鋳型の機能性コピー当たり数個のＲＮＡを合成し得ることが必要である。このような酵素としては、例えば、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、ファージφＩＩＲＮＡポリメラーゼ、Salmonellaファージsp6 ＲＮＡポリメラーゼ、Pseudomonas ファージgh-1ＲＮＡポリメラーゼ、原核細胞または真核細胞由来のＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。核酸増幅反応液中の最終濃度は、約０．８〜１．２単位である。
【００３１】
（９）緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの汎用の緩衝液を使用する。
【００３２】
本発明の核酸増幅用試薬には、上記成分の他に、必要によりマグネシウムイオン、カリウムイオンなどを含んでいてもよい。マグネシウムイオンの量は、約１０〜１４ｍＭ、カリウムイオンの量は、約５６〜８４ｍＭである。
【００３３】
（１０）増幅反応改良剤は、核酸増幅反応液中の最終濃度（至適濃度）で、約０．５〜６０ｍＭ、好ましくは０．５〜６ｍＭである。ＮＡＳＢＡ法における増幅反応改良剤の至適濃度は、標的核酸（すなわち、増幅配列やプライマー配列）によって異なる。概ね、０．５〜６ｍＭの範囲内に至適濃度が確認されているが、標的核酸によっては、更に高い濃度や、低い濃度がも考えられる。本発明の核酸増幅法は、６ｍＭ以上の高濃度に至適条件をもつ標的核酸にも適用でき、６０ｍＭの増幅反応改良剤を添加した場合でも問題なく増幅反応が進むことが確認された。
【００３４】
塩の形で存在する増幅反応改良剤としては、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また直接的な効果としては、ナトリウム塩も、カリウム塩も同等であると考えられる。しかし、カリウムイオン濃度は増幅に関与する各種酵素の反応に影響を及ぼすことが多いので、ナトリウム塩の形がより望ましい。
【００３５】
上記増幅反応改良剤がどのようなメカニズムで、特異的シグナルを向上させるのかは、必ずしも完全に明らかになっているわけではない。ＮＡＳＢＡ反応液には通常約１２ｍＭの塩化マグネシウムが含まれており、キレート剤としてのＥＤＴＡまたはその塩がマグネシウムイオンを捕捉し、マグネシウムイオンを調節しているとも考えられる。
【００３６】
それならば、塩化マグネシウムの濃度そのものを調節すれば、同じ効果が得られるはずである。しかしながら、実際に検討してみたところ、塩化マグネシウムの濃度を１２ｍＭ以下に低下させると、むしろシグナルは低下する。したがって、マグネシウムイオン濃度の調節ではない別のメカニズムが存在すると考えられる。
【００３７】
本発明では、増幅反応改良剤がＮＡＳＢＡ法における非特異増幅反応を抑制し、特異的増幅の効率を向上させている。このことから、上記増幅反応改良剤はプライマーのターゲット以外への非特異的な結合を抑制し、ミスプライミングを抑制していることが推察される。したがって、本発明の核酸増幅法は、ＰＣＲ、ＴＭＡ、３ＳＲなど他の核酸増幅技術にも応用が可能である。
【００３８】
本発明において使用する検出用プローブとは、検出しようとする標的核酸に応じて選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。該プローブには、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、ビオチン、アビジン、蛍光色素などの標識物質を結合してもよい。
【００３９】
核酸検出法としては、マイクロタイターなどの固相に捕捉プローブを結合し、上記増幅法により増幅したく試料中の標的核酸を捕捉した後、検出プローブにて、試料中の核酸をサンドイッチして、検出プローブの標識を常法により測定する方法が一般的である。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００４１】
実施例１ ＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの高感度検出
（１）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用プライマーの合成
パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用リバースプライマー、以下、プライマー１と呼ぶ）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅用フォワードプライマー、以下、プライマー２と呼ぶ）を合成した。
【００４２】
プライマー１は、増幅対象となるＲＮＡに相補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、Ｔ７プロモーター配列（２７ヌクレオチド）を連結している。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムにて実施した。
【００４３】
（２）リンカーアームを有するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ産物検出用捕捉プローブ（以下、捕捉プローブと呼ぶ）用オリゴヌクレオチド）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ産物検出用検出プローブ（以下、検出プローブと呼ぶ）用オリゴヌクレオチド）を合成した。
【００４４】
この際、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法により、デオキシウリジンから化学合成により調製した、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌクレオチドに導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴを置換しうるが、今回は５’末端のＴを置換した。
合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。
【００４５】
（３）捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドのマイクロタイタープレートへの結合上記（２）で合成した捕捉プローブ用オリゴヌクレオチドについて、そのリンカーアームを介して、マイクロタイタープレート内面へ結合した。リンカーオリゴヌクレオチドを５０ｍＭ硼酸バッファー（ｐＨ１０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 の溶液に０．０５ｐｍｏｌ／μｌになるように希釈し、マイクロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック社）に各１００μｌずつ分注し、１５時間程度、室温に放置することで、リンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタープレート内面に結合させた。その後、０．１ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ、０．５％ＰＶＰ、５×ＳＳＣに置換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に１×ＳＳＣで洗浄して乾燥させた。
【００４６】
（４）検出プローブ用オリゴヌクレオチドの標識化
上記（２）で合成した検出プローブ用オリゴヌクレオチドについて、そのリンカーアームを介してアルカリ性ホスファターゼとの結合を、Nucleic Acids Res.;第１４巻、第６１１５頁（１９８６年）に従って、下記のように行なった。
【００４７】
リンカーオリゴヌクレオチド１．５Ａ２６０を０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 １２．５μｌに溶解し、ここへ１０ｍｇ／ｍｌスベリン酸ジスクシニミジル(ＤＳＳ) ２５μｌを加えて室温、２分間反応させた。反応液を１ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０)で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社）カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ)でゲル濾過して、過剰のＤＳＳを除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3、３Ｍ ＮａＣｌ)に溶解したもの）と室温で、１６時間反応させることにより、アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブを得た。得られた標識プローブは、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて、限外濾過法により濃縮した。これを検出プローブとして用いた。
【００４８】
（５）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡ検討用試料の調製
従来の同定法でヒト型結核菌と同定されている培養菌サンプルを用意し、集菌洗浄後、Ｒ．Ｂｏｏｍらの方法（Journal of Clinical Microbiology 第２８巻、第３号、第４９５頁、１９９０年）に従ってＲＮＡを抽出し、０．１ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌの３段階の希釈系列を作成した。この際、各希釈系列には、ネガティブＲＮＡとして、市販の酵母ＲＮＡ（和光純薬社製を用いて、上記抽出操作をしたもの）を１０ｎｇ／μｌの濃度で添加しておいた。
【００４９】
（６）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅
（５）のＲＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡからＲＮＡを増幅した。
方法：まず、サンプル５μｌをプライマー１およびプライマー２およびＥＤＴＡ−Ｎａを含む溶液１０μｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させた。その後、酵素混合液５μｌを加えて、４１℃で９０分間反応させた。
【００５１】
（７）マイクロタイタープレート中でのサンドイッチハイブリダイゼーション
（６）の増幅反応液を１０倍に希釈し、０．３Ｎ ＮａＯＨ中で増幅反応液中の増幅されたＲＮＡを変性させ、各サンプルごとに増幅反応液２０μｌを２００ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ６．０)、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3 の溶液１００μｌに加えて、上記（３）の捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに投入した。
蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、５０℃で３０分間振盪させた。これによって、ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡから増幅されたＲＮＡが、固定化された捕捉プローブによって特異的にマイクロタイタープレートに捕捉される。
【００５２】
次に、上記（４）のアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プローブを２ｆｍｏｌ／μｌの濃度で含む５×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＰＶＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＺｎＣｌ2 、０．１％ＮａＮ3の溶液１００μｌと置換し、同様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、５０℃で３０30分間振盪させた。これによって、捕捉されたＲＮＡにアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プローブが特異的に結合した。その後、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０)、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に置換し、５０℃で１０分間保温、さらに１×ＳＳＣに置換し洗浄した。洗浄液排出後、アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるジオキセタン化合物（商品名、Lumiphos 480、Lumigen 社）１００μｌを注入し、３７℃で１５分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス社）で発光量を測定した。
【００５３】
これらの工程はすべて、ＤＮＡプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌; 第２０巻、第７２８頁、１９９５年参照）により自動で行われ、所要時間は、約２時間であった。
【００５４】
（８）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０ｎｇ／μｌ存在下でのＥＤＴＡ添加の効果）
上記（６）にて増幅し、（７）にて検出されたヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの検出結果を表１に示す。数値は発光量（cps；count/second）で表示され、同一条件で４回の繰り返し実験を行った。
【００５５】
【表１】
「ＥＤＴＡ−Ｎａなし」に比較して、「ＥＤＴＡ−Ｎａを添加したもの」は陽性シグナルが著しく上昇（１．５ｍＭ添加の場合、添加なしに比べ、１０ｐｇ/μｌで６〜１２倍、１ｐｇ/μｌで８〜２０倍以上）している。０．５ｍＭで既に効果がみられたが、１．５ｍＭあたりが最適条件と考えられる。通常、該検出系での検出限界は、１ｐｇ／μｌあたりであるが、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加により陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判定が容易になったため、１０００cps を暫定的なカットオフ値とした場合、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加により感度が向上したともいえる。
結論として、ネガティブＲＮＡ(酵母ＲＮＡ)１０ｎｇ／μｌ存在下でのヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅においては、ＥＤＴＡ−Ｎａ添加は、シグナル向上に絶大な効果を発揮すると考えられる。
【００５７】
実施例２
実施例１と同様にして、ＥＤＴＡ−Ｎａを表２に記載される濃度にて使用した。その結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
表２から明らかなように、６０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進むことが確認され、また、ＥＤＴＡ−Ｎａを加えてもブランクの上昇は見られない。
【００６０】
実施例３ ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）を添加したＮＡＳＢＡ法を用いたヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis)１６Ｓ ｒＲＮＡの高感度検出
（１）ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅
実施例１と全く同じ条件で、ＮＡＳＢＡ法によるヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅の際にＥＤＴＡ−Ｎａに替えてＮＴＡ−Ｎａを添加することで、ＮＴＡによるシグナル増強効果を検証した。ＮＡＳＡＢＡに添加するＥＤＴＡ−Ｎａ以外の試薬やサンプルとその調製方法は、実施例１と全く同一である。実施例１（５）のＲＮＡ溶液をサンプルとして使用して、ＮＡＳＢＡ法によりヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅した。リバースプライマーとしてプライマー１を、フォワードプライマーとしてプライマー２を使用した。方法・条件は基本的にNature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年）に従ったが、反応液中に表２に記載する各濃度のＮＴＡ−Ｎａを添加している。まず、サンプル５μｌを酵素以外の組成（プライマーも含む）を含む溶液１０μｌと混合し、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させる。その後、酵素混合液５μｌを加えて、４１℃で９０分間反応させる。以上でＮＡＳＡＢＡ工程は終了する。
【００６１】
（２）ヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＡＢＡの検討結果（酵母ＲＮＡ１０μｇ／μｌ存在下でのＮＴＡ添加の効果）
上記（１）において増幅し、実施例１（７）の方法に従って、マイクロタイタープレート中でのサンドイッチハイブリダイゼーションを実施して検出された結果を表３に示す。数値は発光量（cps;count/sec）で表示され、同一条件で４回の繰り返し実験を行った。
【００６２】
【表３】
「添加なし」に比較して、ＮＴＡを添加したものは陽性シグナルが著しく上昇（１．５ｍＭ添加の場合、添加なしに比べて、１０ｐｇ／μｌで４〜９倍、１ｐｇ／μｌで５〜２０倍以上）している。０．５ｍＭで既に効果がみられるが、ＥＤＴＡと同様に１．５ｍＭ辺りが最適条件と考えられる。通常、本検出系における検出限界は１ｐｇ／μｌ辺りであるが、ＮＴＡの添加により陽性シグナルが向上、陽性／陰性の判定が容易になったため、１０００cpsを暫定的なカットオフ値とした場合、ＮＴＡの添加により感度が向上したといえる。結論として、ネガティブＲＮＡ（酵母ＲＮＡ）１０ｎｇ／μｌ存在下でのヒト型結核菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ＮＡＳＡＢＡにおいては、ＮＴＡの添加はＥＤＴＡ添加と同様にシグナル向上に大きな効果を発揮する。
【００６４】
実施例４
実施例３と同様にして、ＮＴＡ−Ｎａを表４に記載される濃度にて使用した。その結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
表４から明らかなように、６０ｍＭのＮＴＡ−Ｎａを添加した場合でも問題なく増幅反応が進行することが確認され、またブランクの上昇もみられない。
【００６７】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、配列特異的な核酸増幅反応において、温度などの物理的な条件を変えることなく、極めて簡単に非特異的な反応を抑制し、感度及びシグナルの向上を著しく向上させることが可能となる。
【００６８】
また、従来ネガティブＲＮＡを一定量、共存させた場合、項目によっては感度付近のシグナルが低下する場合があったが、本発明では、エチレンジアミン四酢酸またはその塩を添加することにより、非特異増幅反応によるプライマーや基質（ｒＮＴＰやｄＮＴＰ）の消費を抑制し、相対的に特異的増幅の効率を向上させる。また、本発明はＮＡＳＢＡ法をはじめとする他の核酸増幅反応の改良として、極めて有用である。
【００６９】
【配列表】
Claims (4)
- 標的ＲＮＡと同じ配列を有するフォワードプライマー、標的ＲＮＡと相補的な配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを５’末端に付加したリバースプライマー、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、緩衝液を含有し、かつ、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もしくはその塩を、核酸増幅反応液中の最終濃度で１．５〜６０ｍＭの濃度で含有することを特徴とする核酸増幅用試薬。
- 請求項１に記載の核酸増幅用試薬および検出用プローブを含む核酸検出用試薬。
- ＮＡＳＢＡ法による核酸増幅反応であって、核酸増幅反応液中に、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸よりなる群から選択された少なくとも１種の物質もしくはその塩を、核酸増幅反応液中の最終濃度で１．５〜６０ｍＭの濃度で添加することを特徴とする配列特異的な核酸増幅方法。
- 増幅しようとする核酸がＲＮＡである請求項３に記載の核酸増幅方法。
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