JPH06504192A - ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドおよびその使用 本発明は、組換え蛋白質およびそれらの使用に関するものである。

腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は、生物学的応答の広いスペクトラムを引出す育 力なサイトカインである。ＴＮＮαは、インビトロにおいて多くの腫瘍細胞系の 細胞崩壊または細胞性塞栓を引起こし、また多形核好中球の食菌作用および細胞 毒性を増強し、ならびに、リポ蛋白リパーゼ、主要組織適合性複合体のクラス■ 抗原、およびインターロイキン１あるいはインターロイキン６等のサイトカイン 類を含む多くの蛋白質の発現を調節する。

ＴＮＦαは、正常な免疫応答に必要なものと考えられるが、大量であると劇的な 病原効果を生じる。ＴＮＦαは、それが新形成疾患および寄生虫血症に伴うるい そう症候群（悪液質）について原因となる主要な因子であることから、“カケク チン”と称されてきた。またＴＮＦは、それに対する抗体が感染動物を保護し得 ることから、グラム陰性菌敗血症の毒性に対する主要な寄与因子でもある。

ＴＮＦαの多くの活性は、細胞表面レセプタに対する結合によって媒介される。

ラジオリガンド結合の研究は、広範囲の種類の細胞車上にＴＮＦレセプタが存在 することを確かなものとした。これらのレセプタ類は、制限された数をもって（ １，０００−１０，０００レセプタ／細胞）発現されるが、それらは高い親和性 （４℃にてＫａ＝ＩＯ１Ｍ−１）をもってＴＮＦαと結合する。リンホトキシン （ＬＴ、ＴＮＦＲとも称される）は、同等ではないにせよＴＮＦαに類似する生 物学的活性を有し、多分、それは両者が同じレセプタに認識されるからであろう 。

最近、いくつかの研究室は、ＴＮＦレセプタ調製物中に異種性を検出し７た。Ｔ ＮＦαおよびＴＮＦＲを結合する２種類の異なる細胞表面レセプタが、最近、分 子レベルで特徴付けされている。５５ｋＤのＭｒを有するレセプタの１つの形態 についてｃＤＮＡが、該レセプタの可溶性形態のペプチド配列から設計されたプ ローブを使用して単離された（１．２）。Ｍｒ７５ｋＤの第２のレセプタは、Ｃ Ｏ３細胞発現方法によりクローン化された（３）。

両レセプタは、神経成長因子レセプタ、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、ラットＴ細胞抗原 ＭＲＣ０Ｘ４０を含むサイトカインレセブタの大きい集団の一員である。加つる に、これらのレセプタは、分泌蛋白質を生じると考えられるショーブ線維腫ウィ ルスの転写的に活性な開放された読粋の予想される生成物に対して相同的である 。

細胞表面レセプタ類のこの群の内の最も保存的な特徴は、システィン富有細胞外 リガンド結合領域であり、これは約４０個のアミノ酸からなる４つの反復モチー フに分割され得る。我々は、ここに５５ｋＤ　ＴＮＦαレセプタ（ＴＮＦＲ）の ４種の可溶性レセプタ誘導体を創製した。各誘導体は、細胞外結合領域からなる が、１個のシスティン富有部分領域を含まない。我々は、膜−近接第４部分領域 を欠失する誘導体が、高い親和性をもってＴＮＦαを結合する能力を維持するこ とを見出した。この知見は、一般的応用性を有している。

しかして本発明は、ヒトＴＮＦαに結合可能であって、基本的に： （ａ）ヒトＴＮＦαに対する５５ｋＤまたは７５ｋＤレセプタの細胞外結合領域 の第４のシスティン富有部分領域を除く最初の３つのシスティン富有部分領域二 または（ｂ）前記配列（ａ）に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列 からなるポリペプチドを提供する。

また、本発明は、 −かかるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列ニ一本発明のＤＮＡ配列が組込ま れ、形質転換宿主中に与えられた場合に該ＤＮＡ配列によりコードされる本発明 のポリペプチドを発現可能なベクター；および、このようなベクターにより形質 転換された宿主をも提供する。

添付される図面において： 図１は、ヒトＴＮＦα　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ 酸配列を示す。予想されるシグナル配列残基には、−４０〜−１の番号を付しで ある。

膜内外領域を枠で囲み、可能性のあるＮ−結合グリコシル化には上線を付しであ る。設計したオリゴヌクレオチドプローブと相同的な配列は、ヌクレオチド位置 ４７７−５３３に見出される。

図２は、ＴＮＦレセプタｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｍａｌ　−ＥｃｏＲ［断片）とハ イブリダイズさせたヒトの２９３個の細胞（線維芽細胞系（レーンｌ）、胎盤（ レーン２）、および膵臓（レーン３））由来のオリゴ−ｄＴ選択ＲＮＡ１０℃ｇ のノーサンプロット（レーン１−３）である。サザンプロット（レーン４−６） は、同じプローブとハイブリダイズさせた。ヒトゲノムＤＮＡ　（レーンあたり ５μｇ）は、Ｐｓｔ　１　（レーン４　）　、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　（レーン５） およびＥｃｏＲＩ　（レーン６）によって消化されている。

図３は、ＣＯ３−７細胞中で発現された組換えヒトＴＮＦレセプタの結合特性を 示す。組換え”’Ｉ−ＴＮＦαの、ｐｒＴＮＦＲによりトランスフェクトされた ＣＯ３−７細胞に対する直接結合は、パネル八に示されている。

挿入は、このデータから誘導された５ｃａｔｃｈａｒｄ分析を含む。パネル已に 示されるように、ＴＮＦＲｃＤＮＡによりトランスフェクトされたＣＯ３−７細 胞の単層は、種々の濃度の非標識ＴＮＦαまたはＴＮＦＲの存在下においてＩｎ Ｍ　”’Ｉ−ＴＮＦと共にインキュベートされた。

図４は、ＴＮＦα結合および生物学的活性に対する可溶性ＴＮＦＲの効果を示す 。パネルＡは、ＴＮＦレセプタの可溶形態をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＴ ＮＦＲｅｃｄ、閉環）によりトランスフェクトされるか、またはモックトランス フェクト（開環）されたＣ０８−７細胞からの上澄の、”’Ｉ−ＴＮＦのＵ９３ ７細胞に対する結合への効果を示している。パネルＢは、これらの上澄のＷＥＨ Ｉ　１６４（クローン１３）系のＴＮＦ媒介殺細胞に対する効果を示している。

アッセイは、材料および方法に記述されているように行なわれた。

図５は、ｐＴＮＦＲｅｃｄのＤＮＡ配列のダイアグラムであり、かつポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく領域削除の方策図であって、ここにおいて５’Ｕ ＴＲは、５′−非翻訳領域であり、■〜ｎは、４つのシスティン富有部分領域で ある。例においてＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドおよび関連する制限部位 も示されている。

図６は、５５ｋＤ（ＴＮＦＲ−５５）および７５ｋＤ（ＴＮＦＲ−７５）レセプ タ類、ならびにラット神経成長因子レセプタ（ＮＧＦＲ）　、ヒトＣＤ４０およ びラット０Ｘ４０の４つのシスティン富有部分領域のアミノ酸配列を並べて示す ものである。相同性を、枠を付して示した。

図７〜ｌｌは、ｐＴＮＦＲｅｃｄＳりΔｈｐΔｔｒＳｐΔＩＩＩおよびｐΔｎの ヌクレオチド配列ならびにコードされるポリペプチドの予想されるアミノ酸配列 を示す。

図１２は、例１に記述されるアッセイの結果を示す。

図１３は、７５ｋＤレセプタをコードするＤＮＡを図形的に示すもので、ここに おいてｌ−４Ｖは、４つのシステイン富有部分領域である。ＰＣＲ−領域削除に 使用されたオリゴヌクレオチドも示されている。

本発明によるポリペプチドは、ヒトＴＮＦαと結合可能である。典型的には、該 ポリペプチドは、１０７Ｍ−’以上、例えばＩＯ’Ｍ−’以上のヒトＴＮＦαに 対する結合アフィニティを有する。該アフィニティは、１０７〜１０１０Ｍ−１ 、例えば１０’〜ｌＯ’Ｍ−’であってよい。

好ましいポリペプチドは、基本的にはヒトＴＮＦαの５５ｋＤレセプタの細胞外 結合領域の最初の３つのシスティン富有部分領域からなる。これらの３つの部分 領域の配列（ａｌ）は： ｃｐｇａ Ｋ！１１）Ｑ）ＩｌｌＩＣＣτ］ＣＣｌｌＸ０？ＹＬＶＷＤｅＰＧＰ＠Ｑり？Ｄ Ｃ）ＥｌＩＣＩｇＧａｖｒｈｓｚｗｒａＬｘ箆ｃｒａｓｃｓ＊ｃ鳳ｘＸＭＯＱＶ ＸＺ！！５Ｃ？ＶｆｌｌＤ？ＶｅＧＣ１ｘ舅ＱＹＩＩＴＶ！ｉ！舅ＬＦＱＣＦ） ｉｃｓＬ　ＣＬ　１１　Ｇ　？　Ｖ　ＨＬ　Ｓ　ＣＱ　！　Ｋ　Ｑ　Ｂ　Ｔ　Ｖ 　Ｃ。

である。

青用なポリペプチドはアミノ酸配列（Ｃ）：ＭＧＬＩ　ｓ　ＴＶＰＤＬ’ＬＬ　 ｐ　Ｔ、ＩＬＬ　！　Ｌ　Ｌ　ｖＧ工Ｙ！”８ＧＶＸＧＬＶ！’）ｉＬＧＤｌｌ ！ＫＩＤ８ＶＣ！’ＱＧＸＹＺＨＰＱ）ｉ）ＩＳ　ＸＣＣＴｘｃＩＩｘｃｔｙｚ ｙｘｏｃｐａｐａａｏ〒ＤＣ１１１ＣＸＩＪａｍｌＴｋｌＪＸＷＭＬＲＨＣＬＳ ＣＢＫＣＲＩＬＺＮＧＱＶＥＺ８ｆｔＣＴＶＤＲＤ？ＶＣＧＣＲＫ）ｌＱＹｌ翼 Ｙ冒ｓｚｗｒ。

ｒＱｃＩＭｃＭＬｃＬＭＧＴＶＨシＢＣＱＥ）ＣＱｌｆ　丁　ｖ　Ｃ丁。

を育する。

別の実施態様において、ポリペプチドは、基本的に７５ｋＤレセプタの細胞外結 合領域の最初の３つのシスティン富有部分領域からなるものでよい。

アミノ酸配列（ａ）とは別に、代わりにポリペプチドは基本的に、配列（ａ）に 対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（ｂ）からなるものであっても よい。相同性の程度は、９５％以上、または９８％以上であってもよい。従って 、アミノ酸配列（ａ）は、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入および／ または削除、ならびに／あるいはいずれか、またはそれぞれの端部の伸長によっ て修飾されてもよい。しかしながら、システィン残基の修飾はあってはならない 。配列（ｂ）を含んでなるポリペプチドは、当然であるが、ヒトＴＮＦαに結合 可能でなくてはならない。

例えば、配列（ａ）のシスティン残基以外の１個またはそれ以上のアミノ酸残基 を、置換または削除してよく、あるいは１個以上の付加的なアミノ酸残基が挿入 されてもよく、但し、元の配列の物理化学的性質、すなわち電価密度、疎水性／ 親水性、大きさおよび配置については保存される。保存的置換が行なわれてもよ い。置換の候補は、−文字コード（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３８ ．９−３７．１９８４）に基いて： ＧをＡに、およびその逆、 ＶをＡ、ＬまたはＧにより； ＫをＲにより； ＳをＴにより、およびその逆； ＤをＥに、およびその逆：ならびに ＱをＮにより、およびその逆、 である。

該ポリペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端から、１５個までの残基、例 えば１１個までまたは５個までの残基を除去してもよい。

本発明のポリペプチドは、基本的に配列（ａ）または（ｂ）からなる。それらは 、第４のシスティン富有部分領域を含まない。しかしながら、該ポリペプチドは 、配列（ａ）または（ｂ）が一部分であるより長いポリペプチドであってもよい 。５０個までのアミノ酸残基である短い配列は、配列（ａ）または（＋１）のい ずれかもしくはそれぞれの末端に与えられてもよい。該配列は、３０個まで、例 えば２０個まであるいは１０個までのアミノ酸残基を有していてもよい。

別法として、例えば１００または２００個までのアミノ酸残基のより長い伸長が 、配列（ａ）または（ｂ）のいずれかもしくはそれぞれの末端に存在してもよい 。より長いアミノ酸配列は、いずれかまたはそれぞれの末端に融合されてもよい 。キメラ蛋白質は、そのまたはそれぞれの伸長が異種的アミノ酸配列、すなわち 上記アミノ酸配列に天然には連結されない配列をもって与えられてもよい。した かってこのようなキメラ蛋白質は、ヒトＴＮＦαに特異的に結合する能力とその 他の機能とを組合せたものであってもよい。

本発明のポリペプチド類は、場合により５５ｋＤまたは７５ｋＤレセプタの第４ のシスティン富有部分領域を欠失している。特に、それらは第４の部分領域のシ スティン残基を欠失している。従って、それらは、第３のシスティン富有部分領 域の直後には、関連するレセプタの第４のシスティン富有部分領域の最後のシス ティン残基までのいずれのアミノ酸配列も、その配列の第１のアミノ酸残基を多 分除いて含まない。該ポリペプチドは、上述したように他のアミノ酸配列によっ てではあるが、第１のアミノ酸残基を越えて伸長してもよい。

該ポリペプチドは、典型的には組換えポリペプチドであるが、それらは自動ペプ チド合成装置が使用され得る固相または液相ポリペプチド合成等の合成方法によ り調製されてもよい。従ってそれらは、Ｎ−末端残基Ｍから開始されてもよい。

それらは組換えＤＮＡ技術により調製される。従って、該ポリペプチドの調製は 、該ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の規定に依存する。

５５ｋＤレセプタの細胞外結合領域の最初の３つのシスティン富有部分領域をコ ードする好ましい配列は：−気８αχＣＡＡ急 ＪＬＡＡ　ＴＡＴ　ＡＴＣＣＡＣＣｔ’ｒ　ＣＡＡ　轟＾Ｔ＾＾丁　丁Ｃａ　＾ ！テ！ＧＣテＧ！入ＣＣｊＪ１５　ＴＧＣａＣ為入入ＧＧＡ　＾ＣＣ’ｆｆｉ入 Ｃテ！Ｇ　丁＾Ｃ為ＡＴＣλＣτＣ〒ＣＣ＾　０５ｅ　Ｃｃｅ　（５ｅ＾Ｇ−α 鯨工儲Ｃ六を鯨ｔω４面ロー麿ａ如堂ガ℃ｋＣαゴ賀講ｍｍｅａｘｃ’ｔでＡｍ 　ｃ＆ｅ　’ｔＧｃ　ｃ’ｒｅ　鯨ｔＴＧＣＴＣＩ：　ＡＡＡ　’ＦＸｉ　ｅＱ 　ＡＡＧ０１薊℃απ口り釧℃υ１＾π買ゴ寞ゴ賀に鯨１釧℃ａＣ（２）儲ＣＡ ＣＩＣ（ｉＴＧ　’Ｗ！　Ｇ１１ＣヘｔＡＧＧ　ＡＭ　ＡＭ：　Ｇ４）襲ＣＧＧ 　ＣＡＣＴＡＴ　ｎＧ　ｈＤＴＧＪＡ　ｈｈｃＣＴ’！　’Ｐｍ　ＣＡＣＴＧＣ ｎ℃Ｗ　％ＣＪ＆　ｌ：？ｃ：　’ｇ　４％：　ＡＡ’ｒ　ＧＧＧａｃｅ　ａ’ ｒｃ　ａｃ　ｃ’＋’ｅ　’ｒｃｃ　ＴＧＣＣＡＷ　ＱＧ　ＡＡＡ　ａｘ　Ｗ　 ＡＣＣＧＴＯ’ｒｃｃ。

を含む。

ＤＮＡ配列は、該コード配列の５′末端に融合されるシグナル配列をコードする ＤＮＡ配列を更に含んでもよい。任意のシグナル配列でも適当であろう。該シグ ナル配列は、本発明のポリペプチドの、該ポリペプチドが発現される細胞からの 分泌を支配するものであるべきである。該シグナル配列は、５５ｋＤ　ＴＮＦα レセプタの天然シグナル配列であってもよい。５５ｋＤレセプタの細胞外結合領 域の最初の３つのシスティン富有部分領域、およびそのようなシグナル配列をコ ードする適当なりＮＡ配列は、したがって： Ａ？Ｇαｔａ℃にＣ虞がηαπ儲Ｃロ耀ロＣ閃α石ｒ％Ｇ？Ｇ　Ｃ’！’ｅ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ｍ　１ｍαｎ＾シ’ｍｃ　ｃｃｃ　’ｍ　ＱＧ５　ｓテ ム豐ｍ　ｃ’ｓ　ＧＴＯａテロｃａ１α４ωＣ鯨ｔω４Ｍ−紀徨儲τ纜ｃｓｍデ Ｃｃｅ　ｃｕ　ａｍ　ｕ＾テ＾ｉム！ｃｃ＾（：　ＣＣ？　ｃ＾為＾＾Ｔ　ＡＡ Ｔ　？１ｍ　Ａ？１’！ｌ＄ｅ’ｍムｅｅムムＧ　ＴＧＣＣＡＣＡＡＡ　ＧＱ　 Ａｃｃデｘ’ｒｍテムｃＡ轟ＴＧムｃ’ｍニ慎に幅弼ｅＡｌ：　ＱＴ　Ａ偶ωぽ ｔｔ繍■鵡紮παＡＧＣＧＧＣ？ＣＣ雷虞Ｃへ■紘ＡＡｅ伽α鳩伽＝ｒａｃ口υ ■４弱？ＣＣＡＡ＆πを一鵬ω１＾爬αぼロ１−■−ム■賀ゴ爾堂ＡＱ　ｍ　Ｇ Ｍ：ｃｗ　ＧＥ　ＡＣＣＧ’！’Ｇ　Ｔ（πＧＧＩ：　覧ＡＨＡＡＧ　ＪＩＡＣ ロー四ｃｗＡα■鯉溜鯨π賜鮎Ｃ雷士α諒番πυぼ覧λｔｅｒａ　’＋’ｃｃ　 ｃｙ　Ｗ　ＧＧＧ　ｈｃｃ　（：鶏（ＪＣ（？Ｃ’ｗ　’！’ＧＷ　ＱＧ　ＱＧ 　ｍ　ＣＡＧＡ＆１：　ｍ　ｃ’ｓ　’ｒａｃ　Ａｃｃ。

である。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、合成されてもよい。別法とし て、それは、遺伝子ライブラリから５５ｋＤまたは７５ｋＤＬ／セブタをコード するＤＮＡ配列を単離し、該レセプタの細胞外結合領域の最初の３つのシスティ ン富有部分領域のフード配列の下流のＤＮＡを除去することによって構築するこ ともできる。これは、いずれのレセプタの最初の３つの部分領域をコードするＤ ＮＡを与える。中間段階として、細胞外結合領域の全体またはほぼ全体をコード するＤＮＡを単離し、最初の３つの部分領域をコードする配列の下流側ＤＮＡを 除去すべく消化することもできる。

例えばアミノ酸配列（ｂ）をコードする修飾ヌクレオチド配列は、エンドヌクレ アーゼを用いる制限、リンカ−類の挿入、エキソヌクレアーゼおよび／またはポ リメラーゼの使用、ならびに部位指向性変異生成等を含む任意の適当な技術を使 用して得ることができる。修飾ＤＮＡ配列が、本発明のポリペプチドをコードす るか否かは、容易に確認され得る。該配列によりコードされるポリペプチドは、 適当な宿主内で発現され得、ヒトＴＮＦαに特異的に結合する能力について試験 され得る。

本発明のポリペプチドの発現のためには、発現ベクターが構築される。発現ベク ターは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、かつ適当な宿主 内に与えられた場合に該ポリペプチドの発現が可能であるように調製される。Ｄ ＮＡ配列のためのプロモータ、転写停止部位、ならびに翻訳開始および停止コド ンを含む適切な転写および翻訳調節要素が与えられる。該ＤＮＡ配列は、ベクタ ーに適合する宿主内で起こる該ポリペプチドの発現が可能となるように正しい枠 をもって与えられる。

次いで、発現ベクターは、適切な宿主中に与えられる。

該ベクターを保有する細胞は、発現が可能となるように育生される。該ベクター は、プラスミドまたはウィルスベクターであってよい。任意の適切な宿主−ベク ター系が使用されてもよい。

形質転換される宿主は、原核性または真核性宿主であってよい。細菌または酵母 宿主、例えばＥ、　ｃｏｌｉまたはＳ、　ｃｅｒｖｅｓｉａｅが使用され得る。

別法として、昆虫細胞を使用することができ、その場合、バキュロウィルス（ｂ ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　）発現系が適当であろう。更に別の方法として、モルモ ット卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞系の細胞が形質転換されてもよい。宿 主細胞培養の適切な選択によって、図１に示す部位の１個所、２個所または３個 所でグリコジル化されたポリペプチドを得ることができる。

本発明のポリペプチドは、単離および精製され得る。

該ポリペプチドのＮ−末端は、細胞内における翻訳生成物の処理により、あるい は生成物が細胞から分泌されることによって異種混合となってもよい。しかして 、異なるＮ−末端を有する本発明によるポリペプチドの混合物が得られる。該ポ リペプチドは可溶性である。

本発明のポリペプチドは、ヒトＴＮＦαに対して結合活性を有する。この活性は 、ＴＮＦαに結合し、隔離することによって、例えば肺疾患、敗血症ショック、 Ｈ［Ｖ感染、マラリア、ウィルス性髄膜炎、移植片対宿主反応およびリューマチ 性関節炎等の自己免疫疾患等の処置において可能性のある用途等、ＴＮＦα−媒 介応答の＃御における該ポリペプチドの可能性ある用途を示している。

この目的のため、本発明のポリペプチドは、医薬組成物として製剤化されてもよ い。該医薬組成物は、医薬的に許容される担体または希釈剤を含んでもよい。

本発明のポリペプチドは、任意の慣用的経路により患者に投与されてもよい。経 口的経路を採用するか、または皮下的、静脈内的もしくは筋肉内的投与等、非経 口的経路を採用するか；また投与量；および投与頻度等の選択は、種々の因子に 依存するものである。これらの因子は、投与の目的、治療を受ける患者の年令お よび体重、ならびに患者の症状等を含む。しかしながら、典型的には該ポリペプ チドは、投与経路のそれぞれにおいてｌ投与あたり１〜１０００μｇの量、より 好ましくは、１投与あたり１０〜１００μｇである。

以下の例は、本発明を例示するものである。参考例が示される。

組換えヒトＴＮＦαおよびＴＮＦβは、Ｅ、　ｃｏｌｉから誘導された高度に精 製された蛋白質として供給された。

これらの調製物の比活性は、ネズミＬ９２９細胞での細胞毒性アッセイ（４）に て測定して約１０７単位／ｍｇであった。合成オリゴヌクレオチドは、Ｏｓｗｅ ｌ　ＤＮＡ５ｅｒｖｉｃｅ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｄｉｎｂｕｒｒ ｇｈ）によって調製さＴＮＦ結合蛋白質のペプチド断片の配列（ＥＭＧＱＶＥ　 Ｉ　５ＳＴＶＤＲＤＴＶＣＧ）を、合成オリゴヌクレオチドプローブ（５’　Ａ ＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＴＣＴ　ＴＣＴ 　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＡＴ　ＧＡＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＣ−３ ′）の設計に使用した。５７−量体ＤＮＡプローブを、３２Ｐおよびポリヌクレ オチドキナーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ　、 　ＭＡ）で標識し、ｇｔｌＯ（５，６）中の胎盤ｃＤＮＡライブラリのスクリー ニングに使用した。約ｓｏｏ、ｏｏｏ個のファージをニトロセルロースフィルタ に移し、低下させた厳密性をもってスクリーニングした（７）。フィルタを、０ ．０５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６，５，２０％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナ トリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン（Ｓｉ ｇｍａ　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）　、１％フィコール、１％ウシ血 清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　）　、および５０ｎｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子Ｄ ＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　）中で、４２°Ｃにて２時間インキュベートした。次いで 、放射標識プローブをフィルタに加え（最終濃度１０　”　ｃｐｍ　／ｍｌ）　 、これを１６時間ハイブリッドさせた。フィルタを０．０６Ｍ塩化ナトリウム、 ０．００６Ｍクエン酸ナトリウム、１％ＳＯＳにより３７℃にて充分に洗浄し、 オートラジオグラフィによって正のクローンを同定した。ハイブリッドした１０ 個のクローンをプラーク精製（５）し、ｃＤＮＡ挿入物の大きさをＥｃｏＲ［消 化ファージＤＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。２個の ｃＤＮＡクローンの挿入物を、ジデオキシ鎖停止法（８）を用いて配列決定した 。

サザンおよびノーサンプロット分析 ＤＮＡを、Ｂ１１ｎおよび５ｔａｆｆｏｒｄの方法（９）によってヒトリンパ球 から単離し、サザンプロット分析（１０）のために使用した。ＤＮＡを制限エン ドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）を用いて消化し 、１％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースに移した。ハイブリダイゼー ションおよび洗浄を、ＴＮＦレセプタｃ　ＤＮＡの６００ｂｐ断片の３２Ｐ−標 識調製物を用いて厳密条件（６）下で行なった。ノーサンプロット分析（１１） を、ヒト胎盤、膵臓（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｎ ｅｔｗｏｒｋ。

Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　Ａ　Ｌから贈与を受けた）および線維芽細胞系（２９ ３細胞）から単離されたオリゴ−ｄＴ選択ＲＮＡ上で行なった。ホルムアルデヒ ド１．２％アガロースゲル上での電気泳動に続いて、該ＲＮＡをニトロセルロー スに移し、ＴＮＦαレセプタＤＮＡプローブを用いて厳密な条件下でハイブリッ ドさせた。

ヒトＴＮＦα５５ｋＤレセプタおよび誘導体の哺乳動物細胞発現 ヒトＴＮＦα５５ｋＤレセプタの大部分のコード領域をＥｃｏＲ［断片として単 離し、哺乳動物細胞発現ベクター（１２）中にクローン化してプラスミドｐｒＴ 　Ｎ　Ｆ　Ｒを得た。該ＥｃｏＲＩ断片は、ＴＮＦレセプタの３７４個のアミノ 酸をコードしており、細胞質領域の８１個のカルボキシ末端残基は、このプラス ミド構築物では欠けている。

ＴＮＦαレセプタの誘導体は、膜内外領域の直前の停止コドンを操作することに よって生成された。５′末端にＢｇｌ　１１部位を含み３′末端のＴＡＧ停止コ ドンに先行して旧ｎｄ　［ＩＩ部位を有する３００ｂｐの制限断片を創製するた めに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｉ３）を使用した。ＰＣＲプライ マは、５’　ＧＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＡＡＧおよび５’　ＡＧＴＴ ＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＡＡであった。

ＰＣＲ生成物をゲル精製し、Ｂｇｌ　Ｉｆおよび旧ｎｄ　ＩＩＩ消化されたＴＮ Ｆレセプタ発現プラスミド（上述）中にクローン化した。ＤＮＡ配列決定で得ら れたプラスミド（ｐＴＮＦＲｅｃｄ）が、設計したＤＮＡ配列を含むことを確認 した。ｐＴＮＦＲｅｃｄを保有するＥ、　ｃｏｌｉは、１９９０年９月１１日付 で、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　Ｃ Ｂに受託番号ＮＣＩＭＢ　４０３１５のもとに寄託されている。

該ＴＮＦαレセプタ発現プラスミドは、製造者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃ ｔｉｎ　（Ｇｉｂｃｏ　Ｂ　ＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）を使用してサ ルＣＯ５−７細胞中にトランスフェクトされた。細胞を１０％のウシ胎仔血清を 含むＤｕｌ−ｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地中で培養した。

組換えＴＮＦα５５ｋＤレセプタ誘導体の分析ＴＮＦａを、Ｉｏｄｏｇｅｎ法（ Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、製造者の指示書に従って放射性ヨウ素化した。　”Ｊ− ＴＮＦαの比活性は、Ｉ　Ｏ−３０μＣｕ／μｇであった。ＴＮＦαレセプタｃ ＤＮＡ　（ｐｒＴＮＦＲ，１３００ｂｐ　ＥｃｏＲ１断片）でトランスフェクト したＣＯ８細胞を、２４時間インキユベートシ、次いで６ウエルの組織培養プレ ート（Ｎｕｎｃ）にウェルあたり４．５Ｘ１０”個細胞となるようにまいた。該 細胞を更に４８時間インキュベートし、次いて１／セブタの発現を放射性リガン ド結合により４°Ｃにて２時間で定量した。　”’Ｉ−ＴＮＦαの非特異的結合 を、１０００倍モル過剰量の非標識ＴＮＦαの存在下で測定した。結合データを 、５ｃａｔｅｈａｒａの方法（１４）によって分析した。

該ＴＮＦαレセプタ誘導体を、ヒ１−Ｕ９３７細胞上の天然レセプタに対する　 ”’Ｉ−ＴＮＦα結合の阻害について分析した。ＣＯ８細胞が、ｐＴＮＦＲｅｃ ｄによりトランスフェクトされた後、７２時間後に培養物上澄を採取した。

Ｕ９３７細胞（２００μｌ中２Ｘ１０”個の細胞）を、１０Ｍ　”’Ｉ−ＴＮＦ αおよびＣＯ３細胞培地の希釈物と共に４　’Ｃにて２時間インキュベートした 。次いて、細胞を２０％ショ糖を通して遠心分離し、非結合ＴＮＦαを除去した 。非特異的結合を、ｌμＭ非標識ＴＮＦαの存在下で測定した。

該ＴＮＦαレセプタ誘導体を、インビトロにおけるＴＮＦα細胞毒性効果の阻害 についても分析した。該細胞毒性アッセイを、ＴＮＦ感受性細胞系ＷＥＨＩ　１ ６４クローン１３（１５）について、記述されているように行なった。ｐＴＮＦ ＲｅｃｄにてトランスフェクトされたＣＯ３細胞の上澄の連続希釈物またはモッ クトランスフエクトされた対照を、アッセイに添加する前に一定量のＴＮＦα（ １ｎｇ／ｍｌ）と共に２７℃にて１時間インキュベートした。

２、結果 ＴＮＦ結合蛋白質の部分アミノ酸配列を、合成オリゴヌクレオチドプローブの設 計に使用した。放射標識プローブを、ラムダｇｔｌＯ中のヒト胎盤ｃＤＮＡライ ブラリをスクリーニングするために使用し、ハイブリッドした１０個のファージ を単離した。最長のｃＤＮＡクローンのヌクレオチドおよび演鐸されるアミノ酸 配列を図１に掲げである。第３の可能性のあるＡＴＧ開始コドンは、ヌクレオチ ド配列の１５６位に現れており；最初の２個のＡＴＧコドンは、近接して停止コ ドンに続き；また、第３のＡＴＧでは最良の翻訳開始共通ヌクレオチドが先行し ている（１６）。該ｃＤＮＡは、４５５残基のポリペプチドをコードする１３６ ５塩基の開放された読み枠をコードしている。アミノ酸配列決定により決められ たペプチド配列の両者は、コードされるｃＤＮＡ中にて同定された（１９個中の １７個、および１９個中の１８個の合致する残基）。ＴＮＦ結合蛋白質について 同定されたアミノ末端は、残基４１から始まるｃＤＮＡコード配列に対応する。

最初の３５個のアミノ酸は、全体にかなり疎水性であって、多分シグナル配列を 表している。残基３５−４０は、高度に荷電を有しており（ＤＲＥＫＲ）、この ような配列は分泌シグナル配列中に典型的に見出されるものではなく（１７）； おそらく天然のレセプタは、２塩基性切断部位（ＫＲ）を含む残基４０のあとで 蛋白分解的に処理されるであろう。蛋白質配列の水療法的（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ ｙ）分析は、２３個のアミノ酸の単一の膜内外領域を予言している。この疎水性 配列は、蛋白質を１７１残基の細胞外領域と２２１残基の細胞質領域とに分割し ている。ＴＮＦ結合蛋白質について決定されたアミノ酸組成は、ｃＤＮＡにより コードされる細胞外領域の予想される組成とよく一致した（結果は示していない ）。

予測されるし・セブタの大きさく４０．０００ドルトン）および５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動によって決定される大きさの不一致は、多分、グリコ ジル化によるものであろう。配列中には４個所の可能なＮ−結合グリコシル化部 位があり、それらのうちの３個は、細胞外領域にある。該配列は、多くのシステ ィン残基を含み（１７）、それらのうちの２４個は細胞外領域にある。

これらのシスティン残基の配置は、数種の他の細胞表面蛋白質のものと類似して おり、このことはＴＮＦレセプタがレセプタ類の集合に構造的に関連することを 示唆している。

ノーサンプロット分析は、図２に示されている。″Ｐ−標識ｃＤＮＡは、ヒト胎 盤または膵臓由来のオリゴｄＴ選択ＲＮＡの単一の主要バンドに対してハイブリ ッドした。少数のより大きい転写物も線維芽細胞系由来のＲＮＡ中に観察された 。ハイブリッドした種の大きさは、２４００塩基であって、単離されたｃＤＮＡ の大きさによく一致する。図２に示されるものは、ｃＤＮＡ由来の６００ｂｐプ ローブとハイブリッドするヒトゲノムＤＮＡのサザンプロットである。３種の異 なる制限消化物のそれぞれにおいて、単一のハイブリッドシグナルが観察された 。従って、我々か単離したＴＮＦレセプタは、単一の遺伝子によりコートされて いるものと思われる。

組換えＴＮＦレセプタ配列の哺乳動物細胞中での発現図１に示されるｃＤＮＡが 実際にＴＮＦレセプタをコードしていることを確認すべく、該ｃＤＮＡを哺乳動 物細胞中で発現するように操作した。該ｃＤＮＡは、図１の１２７０位にＥｃｏ Ｒ［部位を含む。該レセプタコード配列を、１３００　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片（ 細胞質領域の最後の８１個のコドンを除いてすべてを含む）として単離し、サイ トメガロウィルスのプロモータおよびＳＶ４０転写停止配列（１２）を含む哺乳 動物細胞発現ベクター中に挿入した。得られたプラスミドをＣｏＳ細胞にトラン スフェクトし、これを３日後にＴＮＦレセプタの発現について分析した。図３に 示されるように、トランスフェクトされた細胞は、飽和可能性を有し、かつ投与 量依存的に放射性ヨウ素化ＴＮＦαを結合した。ＣＯ８細胞の母集団は、細胞あ たりに約ｌＸｌ０”個のレセプタを発現した。組換えレセプタの測定された結合 親和性は、４℃にて２．５ｘｌＯ”Ｍ−’であり、これはヒト細胞上の天然レセ プタとよく一致する（１９．２０）。１２″Ｉ−ＴＮＦα（１ｎＭ）のこれらの 細胞への結合は、非標識ＴＮＦαまたはリンホトキシンの添加により阻害された （図３ｂ）。単に発現ベクターによりトランスフェクトされたＣＯ８細胞は、　 ”’Ｉ−ＴＮＦαを有意には結合しなかった（ｃＤＮＡトランスフェクションの ２％未満の結合が見られた）。

ＴＮＦレセプタの細胞外領域は、天然には細胞から脱離する。類似する組換え誘 導体を生成させるために、膜内外領域に先行する停止コドンを、ＰＣＲ変異生成 によりｃＤＮＡ中に組込操作した。該修飾ＤＮＡを発現プラスミドに挿入し、次 いでＣＯ８細胞にトランスフェクトした。３日後に、ＣＯ８細胞培地をヒトＵ９ ３７細胞へのＴＮＦαの結合に対する阻害について試験した。図４ａに示される ように、トランスフェクトされた細胞の培地は、ＴＮＦαの結合を７０％まで阻 害した。次に、組換えＴＮＦレセプタ誘導体を、ＴＮＦαの生物学的活性の阻害 について試験した。ＴＮＦαに対して感受性であるバイオアッセイは、マウスＷ ＥＨＩ　１６４（クローン１３）細胞の細胞溶解の測定である。トランスフェク トされた細胞培地は、この細胞系に対するＴＮＦαの細胞毒性を６０％阻害した （図４ｂ）。モックトランスフェクトされたＣＯ８細胞由来の培地は、ＴＮＦα 誘導細胞毒性または結合を阻害しなかった。これらの実験は、ＴＮＦレセプタの 組換え細胞外領域か、ＴＮＦに結合可能であり、かつその生物学的活性を阻害可 能であることを示している。

例１５５ｋＤレセプタの細胞外結合領域の最初の３個の□ システィン富有部分領域から基本的になるポリペプチドＥ、ｃｏｌｉ誘導組換え ヒトＴＮＦαは、Ｌ９２９細胞毒性アッセイにおいて、比活性２ｘｌＯ”Ｕ／ｍ ｇを存していた。オリゴヌクレオチドは、Ｏｓｗｅｌ　ＤＮＡ　５ｅｒｖｉｃｅ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ　）から購入１．た。

組換え可溶性ＴＮＦＲ誘導体の創製 組換え可溶性ＴＮＦＲにおける部分領域の各々の削除は、ＰＣＲ断片結合および ＰＣＲ変異生成によって行なった。これらの実験に使用したオリガノ？しオチド 配列を表１に示し、また４つのシスティン富有部分領域に対するそれらの位置を 図５に示しである。４つの部分領域を図６中に相互に整列させて示す。

プラスミドｐＴＮＦＲｅｃｄ　（参考例）を、図７に示す。ｐＴＮＦＲｅｅｄを 、オリゴ５’Ｃ１ａおよびＩＩＩ　Ａを使用するＰＣＲ生成物のＣ１ａ　Ｉ／Ｂ ｇｌ　ＩＩ消化物をＣ１ａ　Ｉ／Ｂｇｌ　ＩＩ消化ｐＴＮＦＲｅｃｄ中にクロー ニングすることによって５′非翻訳配列を除去して更に修飾し、５′−ΔＣ１ａ を創製した。

５′−ΔＣ１ａのｐｓｔ　−１による消化、および再連結は、ｐΔＵを生成し、 これは第２のシスティン富有部分領域を欠失している（図９）。第４のシスティ ン富有部分領域を、オリゴヌクレオチド５Ａおよび４Ｄを使用するＰＣＲ生成物 の８ｇ１目／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化物をＢｇｌ　［［／Ｈｉｎｄ［［［５’−Δ Ｃ１ａ中にクローニングすることによって除去し、これは停止コドンをアミノ酸 １６７（最初のメチオニンから計数して）のあとに導入してｐΔ［Ｖを創製した （図１１）。それぞれ第１および第３のシスティン富有部分領域を欠失する構築 物ｐｉ（図８）およびｐΔ１１１（図１０）は、ＰＣＲに使用するプライマ中に 重複を導入することによってＰＣＲ断片を結合して生成された。５　’　Ｃ１ａ およびＩＡならびにＩＢおよび５Ｄを使用する ＰＣＲのゲル精製生成物を混合し、更に５’Ｃ１ａおよび５Ｄをプライマとして 使用して増幅した。得られた断片をＣ１ａ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩで消化し、Ｃ １ａ　Ｉ／Ｂｇｌ　１１消化ｐＴＮＦＲｅｃｄ中にクローン化してｐΔ■を生成 させた。

同様にして、５’Ｃ１ａおよび［ｌＩＡならびに［ＩＩＢおよび５Ｄを使用する ＰＣＲのゲル精製生成物を混合し、更に５’Ｃ１ａおよび５Ｄをプライマとして 使用して増幅した。この生成物をＢｇｌ　［［および旧ｎｄ　ＩＩＩで消化し、 Ｂｇｌ　ＩＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ切断５’−Ｃ１ａ中にクローン化してｐΔＩ［ Ｉを生成させた。すべての場合において、クローン化誘導体を、制限酵素分析お よびシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用するＤＮＡ配列決定によ って分析した。

表Ｉ：変異生成オリゴヌクレオチドの構造５Ａ　５１６Ｃ’Ｔｅａ！−３１ ８Ｄ　Ｓｅ−ルミテロ五Ｇ＝テコにλ１℃ＣＣ（−テ入入０にτσλ入−３１組 換え可溶性ＴＮＦＲ誘導体の分析 ＣＯ８細胞を、５％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地 中で維持した。可溶性ＴＮＦＲαレセプタ誘導体を、製造者のプロトコールに従 ってリボフエクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ　、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）に よりサルＣＯ８細胞中にトランスフェクトし、細胞非含有上澄をトランスフェク トから７２時間後に採取した。

ＴＮＦα活性の阻害 可溶性ＴＮＦαレセプタ誘導体を、インビトロにおけるＴＮＦα細胞毒性活性の 阻害について分析した。細胞毒性アッセイは、ＴＮＦα感受性細胞系ＷＥＨ１１ ６４クローン１３について記述されているようにして行なった。変異レセプタに よりトランスフェクトされたＣＯ８細胞由来の上澄の連続希釈物またはモックト ランスフエクトされた対照を、アッセイに添加する前に、一定量のＴＮＦ　（ｌ ｏｇ／ｍｌ）と共に３７°Ｃにて１時間インキュベートシた。

５５ｋＤ　ＴＮＦレセプタの可溶形態によるＴＮＦαの結合に対する各々のシス ティン富有部分領域の寄与について更に理解するために、我々は、各部分領域を ＰＣＲ変異生成によって除去した（図５）。ＣｏＳ細胞を、これらの構築物のそ れぞれによってトランスフェクトし、上澄をＴＮＦαの細胞毒性活性に対する阻 害能力についてアッセイした。図１２パネルＡは、ＰＴＮＦＲｅｃｄにてトラン スフェクトされたＣＯ３細胞由来の条件培地が、前述したようにＴＮＦαを阻害 することを示している。第４のシスティン富有部分領域の除去は、ＴＮＦＲｅｃ ｄと同様な可能性あるＴＮＦα阻害剤である蛋白質を生成した（図１２、パネル Ｂ）。第１、第２および第３の部分領域を欠く変異体は、ＴＮＦα細胞毒性アッ セイにおいて、何らの阻害活性も示さなかった。

例２ニア５ｋＤレセプタの細胞外領域の最初の３個のシスティン富有部分領域か ら基本的に構成されるポリペプチドの発現 ヒト７５ｋＤ　ＴＮＦαレセプタのコード領域を、文献記載の配列に基づくプロ ーブ（３）を使用して、Ｔ細胞ラムダＺＡＰライブラリから単離し、哺乳動物細 胞発現ベクター（１２）のＥｃｏＲ［部位にクローン化してプラスミドｐ７５Ｔ ＮＦＲを生成させた。より詳細には、７５ｋＤレセプタを発現する細胞系からＲ ＮＡを抽出し、逆転写した。Ｓｍｉ　ｔｈら（３）により記述されたもの等、こ のレセプタを発現する任意の細胞系が使用され得る。逆転写生成物を下記のプラ イマを用いて２５サイクルのＰＣＨに付した：　５　’　ＣＧＣＡＧＡ　ＡＴＴ 　ＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＣＧＣＣＣＧＴ　ＣＧＣＣ３’および５　’ 　ＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣＴＡ　ＴＣＧ　ＣＣＡＧＴＧ　ＣＴＣＣＣＴ　ＴＣ Ａ　ＧＣＴ　３　’これらのプライマは、７５ｋＤレセプタの細胞外結合領域に 対して指向するものであり、Ｓａ＋ｉｔｈら（３）から採用したものである。増 幅生成物をゲル精製し、ＴＮＦＲをコードしていることを示した。これを、引続 いてライブラリのスクリーニングに使用した。プラーク精製を、プローブがラン ダムブライミング（２１）により標識されている点を除いて基本的には参考例に 記述されているようにして行ない、５０％ホルムアミド中でハイブリッドさせた 。フィルタを、０．２ＸＳＳＣ（標準クエン酸塩溶液）中で６０℃にて２回洗浄 した。

７５ｋＤ　ＴＮＦαレセプタの誘導体を、膜内外領域の直前に停止コドン導入操 作することによって生成させた。

図１３を参照しつつ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、５′末 端にＢｇｌ　１１部位、および３′末端にＴＡＧ停止コドンに先行してＸｂａ　 Ｉ部位を含む２７４ｂｐ制限断片を創製した。ＰＣＲプライマは、５　’　ＡＣ ＡＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＴＡおよび５　’　ＡＣＧＴＴＣＴＡＧＡ ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧであった。

該ＰＣＲ生成物をＢｇｌ【ＩおよびＸｂａ　Ｉにて消化し、ゲル精製し、そして Ｂｇｌ　ＩＩおよびＸｂａ　Ｉにて消化したＴＮＦレセプタ発現プラスミド（上 述）中にクローン化した。ＤＮＡ配列決定により、得られたプラスミドが設計し たＤＮＡ配列を含むことを確認した。

同様の方法を、７５ｋＤ　ＴＮＦαレセプタの第４のシスティン富有部分領域を 欠く構築物を創製するために使用した。７５ｋＤ　ＴＮＦＲのＥｓｐ　Ｉ部位の 上流のプライマ、ならびにＴＡＧ停止コドンおよびＸｂａ　１部位を導入するプ ライマを使用してＰＣＲを行なった。プライマの配列は、それぞれ、５　’　Ｃ ＡＧ　ＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣおよび５　’　ＡＣＧＴＴＣＴＡ ＧＡＣＴＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣＧＴＣＴＧＡＴＧＴＴＴＣであった。ＰＣＲ生成 物を、Ｅｓｐ　ＩおよびＸｂａ　Ｉにより消化し、ゲル精製した１１０ｂｐＤＮ Ａ断片を、Ｅｓｐ　Ｉ　Ｘｂａ　１消化ｐ７５ＴＮＦＲ中にクローン化した。

文　献 １−　Ｌａａｔｓｃｈ＊ｒ、Ｈｌ、ＰＭｎｔ、Ｙ、−Ｃ，！、、Ｉａ１ｍ、！１ ．Ｗ、、−ｎｔｓ、Ｒ，。

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６、　Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｘ、、Ｆｒｉｔｇｃｈ、Ｅ、Ｆ、、　Ｐａｒｋａｒ、ＬＣ ，、ｌ１ｌａｋａ、Ｇ　＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、？、（１９７１１１０ａｌｌ　１ ５．　１１５７−ＬＸ）４゜７、　ａｒｍｙ、Ｐ、ＩＪ、、Ｌ−ＯｒＬ９．　Ｓ 、Ｒ，、Ｆｓｅｎｎｉ＊、ｚ、、ｙａｒｒａｒ、Ｎ、Ａ、。

Ｐｉｎｇａｌ、ＪＪ、ａｎｄ　５ｃｈｙ：＊仕ｅｘ、Ｒ，Ｄ、　（１９８９）　 Ｆｒｅｅ、Ｎａｕ。

Ａｃａｄ、ｆｆｃｉ　ＵＳＡ　Ｉ６．　＠４ｓフー８５０１゜８、　５ｒｚｄ、 ｔｈ、＾Ｊ、１１．．　（１９１１０）　Ｍｏｔｈ、Σｎｚｙｍ、６５　５６０ −５１１０゜９、　Ｂ１１ｎ、Ｍ、＆　！ｔａｎｆｏｒｄ、Ｄ、Ｗ、（１９７６ ）Ｎｕｃｌ、入Ｃ１ムＲａｓ、コ。

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Ｘｅ廿ａ、９５，９９−１０５− １６、Ｘｏｚａｋ、　Ｌ　（１９１１９）　Ｊ、　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、　Ｌ ｏｇ、　２２９−２４１ｉ７．　ｖａｎ　Ｈ會１ｊｎ＊、Ｇ、（１０ｇ）　）ｆ ｕＣｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒａｍ、１４．　４６８３−４６９０゜１Ｌ　Ｃｒ＠ａＭ Ｙ、入、入、、Ｙａｌａｌｏｔｏ、Ｉｌ、＆　Ｖｉｔｔ、Ｃ，Ｒ，（１９８）） 　ｉ’ｒｏｃ。

Ｍａｔ↓、λａｎｄ、ｇｃｉ−ｒＪＳＡ、１４．　ココ９コーコ２９フ。

↓９．　ｇｔａｕｂ＠ｒ、Ｇ、Ｂ、、入１ｙａｒ、Ｒ，＾、＆＾ｇｇａｒｖａｌ 、Ｂ、Ｂ、（１９１１！１）　σ。

８１口１．Ｃｈｏ、２６コ、１９０’３１１−１９１０４゜２０、５ｃｈ＠ｕｒ ｉｃｈ、Ｐ、、ｔｒｅａｒ、Ｔ１．、Ｋｘｏｎｋａ、Ｍ、ａｎｄ　アｆｉｔｚａ ｒｕｎａｉａｒ。

Ｘ、（１９Ｅ１６）　工ｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、コ８．　ユ２７−１３３゜２ １　Ｆ＊ｉｎｂｕｒｇ、入、＆　Ｖｏｇａｌｓｔａｉｎ、Ｂ　（１９１１４）　 入ｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈａｍ、　１３７．２６６−２７７゜、ｇ　、ｉ 　Ｚ瑚、２４ま、葺。属　５、目、目２番、と＝Ｅ　ｚｇ　、ｔｉ　Ｗ這’／、 　Ｃ０ＮＤＩＴＩＯＮＥＯＭＥＤＩＬＩＭ外＋付考氾 賊ヲｊ「１　にビと月口耘！　韮ヒ石　■民ヲ　グ「葺召　Ｘξ蒼３託訃筺： Ｅ屈　卦啓３ジ占　−シ　を百　鼾３ ｔ″：　まるに５１１蒼と　Ｉ し：　足二　足り　已＝　乙二　己：　七二　べは４５　’：　ＧＷ　６Ｂ　ｍ Ｗ　ｇ−；　５：　ｇｅ。

を届べるセ訃３ゴｔ４３　Ｑ　ａるｉ訃ｐ　ＴＮＦ−ＲＥＣＯ ％ＣＭ づ゛）し？ ｐ　ｃｌｅＬｔａ　ＩＶ 十祝予…止瞥（自発） １、事件の表示 ポリペプチドおよびその使用 ４、代理人 ６−補正により増力口する請求項の数 ７、補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文 ８、補正の内容　別紙のとおり 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文の浄書（内容に変更な５ＰＣＴ／Ｇ８　９ １１０１８２６ フロントページの続き （５１）　ｌｏｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　Ｓ／１０ （７２）発明者　グレイ　パトリック　ウィリアムアメリカ合衆国９８０２１　 ワシントン州ポセル、トウエンティース　アベニュー　サウス　イースト　２２ ０２１　アイシーオーエスコーポレイション Ｉ （７２）発明者　ターナ−、マーチン　ジョン　チャールズアメリカ合衆国４８ １０９　ミシガン州アンアーバー、ウェスト　メディカル　キャンパス　ドライ ブ　１１５０．ユニバーシティオブ　ミシガン　メディカル　センター。

ハワード　ヒユーズ　メディカル　インスチチュート （７２）発明者　ブレナン、フィオヌラ　メリーイギリス国ダブリュ６８エルダ ブリュ ロンドン、ハマースミス、ラーガン　アベニュー　１．ザ　チャーリング　クロ スサンリイ　リサーチ　センター

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＴＮＦａに結合可能であって、基本的に：（ａ）ヒトＴＮＦａに対する ５５ｋＤまたは７５ｋＤレセプタの細胞外結合領域の第４のシステイン富有部分 領域を除く最初の３つのシステイン富有部分領域；または（ｂ）前記配列（ａ） に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列 からなるポリペプチド。
2. ２．基本的に、ヒトＴＮＦａに対する５５ｋＤレセプタの細胞外結合領域の最初 の３つのシステイン富有部分領域からなる請求の範囲第１項に記載のポリペプチ ド。
3. ３．アミノ酸配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第２項に記載のポリペプチド。
4. ４．上記請求の範囲のいずれか１項に定義されるポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列。
5. ５．配列： 【配列があります】 を含む請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ配列。
6. ６．ジクナルアミノ酸配列をコードする５′配列を更に含む請求の範囲第４項ま たは第５項に記載のＤＮＡ配列。
7. ７．配列： 【配列があります】 である請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ配列。
8. ８．請求の範囲第４項〜第７項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列が組込まれ、 かつ適当な宿主中に与えられた場合に前記ポリペプチドを発現可能とするベクタ ー。
9. ９．プラスミドである請求の範囲第８項に記載のベクター。
10. １０．請求の範囲第８項または第９項に記載のベクターにより形質転換された宿 主。
11. １１．哺乳動物細胞系である請求の範囲第１０項に記載の宿主。
12. １２．請求の範囲第１０項または第１１項に記載の形質転換宿主を、前記ポリペ プチドが発現される条件下で培養することを含んでなる、請求の範囲第１項に定 義されるポリペプチドの製造方法。
13. １３．医薬的に許容される担体または希釈剤、および活性成分として請求の範囲 第１項に記載のポリペプチドを含んでなる医薬組成物。
14. １４．リューマチ性関節炎の処置において使用するための請求の範囲第１項に定 義されるポリペプチド。