DE69129990T2

DE69129990T2 - Modifizierter menschlicher tumornekrosisfaktor-alpha-rezeptor

Info

Publication number: DE69129990T2
Application number: DE69129990T
Authority: DE
Inventors: Fionula Mary The Charing Cross Hammersmith London W6 8Lw Brennan; Marc The Charing Cross Sunley Hammersmith London W6 8Lw Feldmann; Patrick William Icos Corporation Bothell Wa 98021 Gray; Martin J. C. H. Hughes Med. Inst. Univer Ann Arbor Mi 48109 Turner
Original assignee: Kennedy Institute of Rheumotology
Current assignee: Kennedy Trust for Rheumatology Research
Priority date: 1990-10-18
Filing date: 1991-10-18
Publication date: 1998-12-24
Anticipated expiration: 2011-10-19
Also published as: EP0556207A1; DE69129990D1; DE69129990T3; GB9022648D0; EP0556207B1; DK0556207T3; DK0556207T4; ES2121789T3; EP0556207B2; US5863786A; ATE169675T1; JPH06504192A; ES2121789T5; WO1992007076A1; US5633145A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Proteine und ihre Verwendung.
Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) ist eine potentes Zytokin, welches ein breites Spektrum an biologischen Reaktionsantworten hervorruft. TNFα verursacht die Zytolyse oder Zytostase von vielen Tumorzellinien in vitro, induziert die Hämorrhagische Nekrose von transplantierten Tumoren in Mäusen, steigert die Phagozytose und Zytotoxizität von polymorphnuklearen Neutrophilen und moduliert die Expression von vielen Proteinen, einschließlich Lipoproteinlipase, Klasse-I- Antigenen des Major-Histokompatibilitäts-Komplexes und Zytokinen, wie Interleukin 1 und Interleukin 6. TNFα scheint für eine normale Immunantwort notwendig zu sein, jedoch erzeugen große Mengen dramatische pathogene Wirkungen. TNFα wurde als "Cachectin" bezeichnet, da es der vorherrschende Faktor ist, der für das Auszehr-Syndrom (Cachexia), das mit neoplastischer Erkrankung und Parasitämie in Verbindung steht, verantwortlich ist. TNF trägt ebenfalls hauptsächlich zur Toxizität bei gram-negativer Sepsis bei, da Antikörper gegen TNF infizierte Tiere schützen können.
Die vielen Aktivitäten von TNFα werden durch das Binden an einen Zelloberflächenrezeptor vermittelt. Radioliganden-Bindungsstudien haben die Anwesenheit von TNF-Rezeptoren auf einer großen Vielzahl von Zell-Typen bestätigt. Obgleich diese Rezeptoren in einer begrenzten Anzahl (1.000 bis 10.000 Rezeptoren/Zelle) ausgedrückt bzw. expremiert werden, binden sie TNFα mit hoher Affinität (Ka = 10&sup9;M&supmin;¹ bei 4ºC). Lymphotoxin (LT, ebenfalls als TNFβ bezeichnet) besitzt ähnliche, wenn nicht identische biologische Aktivitäten zu TNFα, möglicherweise, da sie beide von dem gleichen Rezeptor erkannt werden.
Kürzlich haben mehrere Laboratorien Heterogenität in TNF-Rezeptorpräparationen nachgewiesen. Zwei unterschiedliche Zelloberflächen-Rezeptoren, welche TNFα und TNFβ binden, sind kürzlich auf molekularem Niveau charakterisiert worden. cDNA für eine Form des Rezeptors mit einer Mr von 55 kD wurde isoliert, und zwar unter Anwendung von Sonden, die aus der Peptidsequenz einer löslichen Form des Rezeptors (1, 2) entworfen wurden. Ein zweiter Rezeptor mit einer Mr von 75 kD wurde mittels eines COS-Zell-Expressionsweges kloniert (3). Beide Rezeptoren sind Vertreter einer größeren Familie von Zytokin-Rezeptoren, welche den Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor, das B-Zell-Antigen CD40, das Ratten-T-Zell-Antigen MRC 0X40 einschließen. Darüber hinaus sind diese Rezeptoren zu dem vorhergesagten Produkt eines transkriptionell aktiven offenen Leserasters vom Shope-Fibroma-Virus homolog, welcher ein ausgeschiedenes Protein hervorzurufen scheint.
Das am meisten konservierte Merkmal unter dieser Gruppe von Zell-Oberflächen-Rezeptoren ist der cysteinreiche extrazelluläre Liganden-Bindungsbereich, welcher in vier sich wiederholende Motive (motifs) von etwa 40 Aminosäuren eingeteilt werden kann. Wir haben nun vier lösliche Rezeptorderivate des 55kD-TNFα-Rezeptors (TNFR) erzeugt. Jedes Derivat besteht aus dem extrazellulären Bindungsbereich, jedoch ohne einen der cysteinreichen Teilbereiche. Wir haben herausgefunden, daß das Derivat, welchem der Membran-nahe vierte Teilbereich fehlt, die Fähigkeit beibehält, TNFα mit hoher Affinität zu binden. Diese Erkenntnis findet allgemeine Anwendbarkeit.
Demzufolge stellt die folgende Erfindung ein Polypeptid bereit, welches in der Lage ist, Human- TNFα zu binden, und welches aus folgendem besteht:
(a) der Aminosäuresequenz der drei ersten cysteinreichen Teilbereiche, jedoch nicht des vierten cysteinreichen Teilbereichs des extrazellulären Bindungsbereichs des 55KD- oder 75kD-Rezeptors für Human- TNFα, oder
(b) einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90% oder mehr zur genannten Sequenz (a).
Die Erfindung sieht ebenfalls folgendes vor:
- eine DNA-Sequenz, welche für ein solches Polypeptid kodiert;
- einen Vektor, welcher eine DNA-Sequenz der Erfindung in sich inkorporiert und welcher in der Lage ist, das Polypeptid der Erfindung, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, zu exprimieren, wenn er in einem transformierten Wirt vorgesehen wird; und ein Wirt, der mit einem solchen Vektor transformiert ist.
Zu den begleitenden Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz der Human-TNFα-cDNA (SEQ-ID-Nr.: 24) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr.: 25). Die vorhergesagten Signalsequenzreste sind von -40 bis -1 numeriert. Der Transmembranbereich ist im Kasten und mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind oberhalb mit einem Strich versehen. Die mit der entworfenen Oligonucleotidsonde homologe Sequenz wird bei den Nucleotidpositionen 477-533 gefunden.
Fig. 2 ist ein Northern-Blott (Spuren 1-3) von 10 ug Oligo-dT-gewählter RNA aus Human-293- Zellen (Fibroplastenzellinie) (Spur 1), Placenta (Spur 2) und Milz (Spur 3), hybridisiert mit der TNF-Rezeptor-cDNA (Sma1-EcoRI-Fragment). Der Southern-Blott (Spuren 4-6) wurde mit der gleichen Sonde hybridisiert. Humane genomische DNA (5 ug pro Spur) wurde mit Pst1 (Spur 4), Hind III (Spur 5) und EcoRI (Spur 6) verdaut.
Fig. 3 zeigt die Bindungscharakteristika vom rekombinanten Human-TNF-Rezeptor, exprimiert in COS-7-Zellen. Die direkte Bindung von rekombinantem ¹²&sup5;I-TNFα an COS-7-Zellen, transfiziert mit prTNFR, ist in Diagramm A dargstellt. Das eingebundene Diagramm enthält eine Scatchard- Analyse, die sich aus diesen Daten ableitet. Wie in Diagramm B gezeigt, wurden Monoschichten von COS-7-Zellen, die mit TNFR-cDNA transfiziert waren, mit 1nM ¹²&sup5;I-TNF in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an nicht markiertem TNFα oder TNFβ inkubiert.
Fig. 4 zeigt die Wirkungen von löslichem TNFR auf die TNFα-Bindung und biologische Aktivität. Das Diagramm A zeigt die Wirkungen von Überständen von COS-7-Zellen, die mit einer cDNA transtiziert waren, welche für eine lösliche Form des TNF-Rezeptors (pTNFRecd, gefüllte Kreise) kodierte, oder Pseudo(mock)-transfiziert (offene Kreise) waren, auf ¹²&sup5;I-TNF- Bindung an U937-Zellen. Das Diagramm B zeigt die Wirkungen dieser Überstände auf die TNF- vermittelte Abtötung von WEHI 164(Klon 13)-Linie. Assays wurden wie in Materialien und Methoden beschrieben durchgeführt.
Fig. 5 ist ein Diagramm der DNA-Sequenz von pTNFRecd und stellt ebenfalls ein Strategieplan für die auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Bereichsdeletion dar, in der 5'UTR die 5'-untranslatierte Region ist und I bis IV die vier cysteinreichen Unterbereiche sind. Die in der PCR im Beispiel angewandten Oligonucleotide und relevante Restriktionsstellen sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 6 zeigt aufgereiht die Aminosäuresequenzen der vier cysteinreichen Unterbereiche der 55kD(TNFR-55)- und 75kD(TNFR-75)-Rezeptoren und vom Rattennerven-Wachstumsfaktorrezeptor (NGFR), Human-CD40 und Ratten-OX40. Die Homologie wird mittels Boxen gezeigt.
Fig. 7 bis 11 zeigen die Nucleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids von pTNFRecd, PΔI, pΔII, pΔIII und PΔIV.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 1 beschriebenen Assays.
Fig. 13 zeigt diagrammartig die 75kD-Rezeptor-kodierende DNA, in der I bis IV die vier cysteinreichen Unterbereiche sind. Oligonucleotide, die bei der PCR-Bereichsdeletion angewandt werden, sind ebenfalls gezeigt.
Ein Polypeptid gemäß der Erfindung ist in der Lage, Human-TNFα zu binden. Typischerweise besitzt das Polypeptid eine Bindungsafnnität für Human-TNFα von 10&sup7;M&supmin;¹ oder mehr, z.B. 10&sup8;M&supmin;¹ oder mehr. Die Affinität kann zwischen 10&sup7; und 10¹&sup0;M&supmin;¹, z.B. von 10&sup8; bis 10&sup9;M&supmin;¹ liegen. Ein bevorzugtes Polypeptid besteht aus den ersten drei cysteinreichen Unterbereichen des extrazellulären Bindungsbereiches von dem 55kD-Rezeptor für Human-TNFα. Die Sequenz (a&sub1;) dieser drei Unterbereiche ist folgende:
Ein brauchbares Polypeptid hat die folgende Aminosäuresequenz (c):
Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Polypeptid aus den ersten drei cysteinreichen Unterbereichen des extrazellulären Bindungsbereiches des 75kD-Rezeptors bestehen.
Abgesehen von der Aminosauresequenz (a) können die Polypeptide alternativ aus einer Aminosäuresequenz (b) bestehen, die eine Homologie von 90% oder mehr mit der Sequenz (a) besitzt. Der Grad der Homologie kann 95% oder mehr oder 98% oder mehr betragen. Die Aminosäuresequenz (a) kann deshalb durch eine oder mehrere Aniinosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen und/oder durch eine Verlängerung an einem der beiden Enden oder an jedem Ende modifiziert werden. Gleichwohl sollte keine Modifizierung der Cysteinreste vorliegen. Ein die Sequenz (b) umfassendes Polypeptid muß natürlich in der Lage sein, Human-TNFα zu binden.
Zum Beispiel konnen em oder mehrere Aminosäurereste der Sequenz (a), die kein Cysteinrest sind, substituiert oder deletiert werden, oder ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste können eingeführt werden; vorausgesetzt, daß der physikochemische Charakter der ursprünglichen Sequenz beibehalten bleibt, d.h. hinsichtlich der Ladungsdichte, Hydrophobizität/Hydrophilizität, Größe und Konfiguration. Konservative Substitutionen können vorgenommen werden. Mögliche Substitutionen basieren auf dem Ein-Buchstaben-Code (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984).:
A für G und umgekehrt;
V durch A,L oder G;
K durch R;
S durch T und umgekehrt;
E für D und umgekehrt; und
Q durch N und umgekehrt.
Bis zu 15 Reste können aus dem N-Ende und/oder C-Ende des Polypeptids deletiert werden, z.B. bis zu 11 Reste oder bis zu 5 Reste.
Die Polypeptide der Erfindung bestehen aus der Sequenz (a) oder (b). Sie enthalten keinen vierten cysteinreichen Unterbereich. Gleichwohl können die Polypeptide längere Polypeptide sein, von denen die Sequenz (a) oder (b) ein Teil ist. Eine kurze Sequenz von bis zu 50 Aminosäureresten kann an einem der beiden oder an jedem Ende der Sequenz (a) oder (b) vorgesehen sein. Die Sequenz kann bis zu 30, z.B. bis zu 20 oder bis zu 10 Aminosäurereste aufweisen.
Alternativ kann eine viel längere Verlängerung an einem oder beiden Enden der Sequenz (a) oder (b) von bis zu z.B. 100 oder 200 Aminosäureresten vorliegen. Längere Aminosäuresequenzen können an einem der beiden oder an jedem Ende verschmolzen sein. Ein chimäres Protein kann vorgesehen werden, indem die oder jede Verlängerung eine heterologe Aminosäuresequenz ist, d.h. eine Sequenz, die nicht natürlich an der oben erwähnten Aminosäuresequenz geknüpft ist. Solch ein chimäres Protein kann somit die Fähigkeit in sich vereinigen, spezifisch an Human- TNFα mit einer anderen Funktionalität zu binden.
Den Polypeptiden der Erfindung mangelt der vierte cysteinreiche Unterbereich des 55kD- oder 75kD-Rezeptors, je nach vorliegendem Fall. Insbesondere mangelt den Cysteinresten der vierte Unterbereich. Deshalb beinhalten sie, direkt nach dem dritten cysteinreichen Unterbereich, keine der Aminosäuresequenzen bis zu dem letzten Cysteinrest des vierten cysteinreichen Unterbereiches des relevanten Rezeptors, bis auf möglicherweise den ersten Aminosäurerest dieser Sequenz. Die Polypeptide können sich jenseits dieses ersten Aminosäurerestes, wie oben angegeben, erstrecken, obgleich auch nur vermittels anderer Aminosäuresequenzen.
Die Polypeptide sind üblicherweise rekombinante Polypeptide, obgleich sie durch synthetisches Verfahren, wie durch die Festphasen- oder Lösungsphasen-Polypeptidsynthese, hergestellt werden können, wobei ein automatischer Peptid-Synthesizer zur Anwendung kommen kann. Sie können deshalb mit einem N-terminalen Rest M anfangen. Sie werden durch die rekombinante DNA-Technologie hergestellt. Die Herstellung der Polypeptide hängt deshalb von der Bereitstellung einer das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz ab. Eine geeignete Sequenz, die für die ersten cysteinreichen Unterbereiche des exrazellulären Bindungsbereiches des 55kD-Rezeptors kodiert, umfaßt:
(SEQ-ID-Nr.: 3).
Eine DNA-Sequenz kann ferner eine DNA-Sequenz beinhalten, die für eine Signalsequenz kodiert, welche an dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz gebunden ist. Jedwede Signalsequenz kann geeignet sein. Die Signalsequenz sollte in der Lage sein, die Sekretion des Polypeptids der Erfindung aus der Zelle zu lenken, in welcher das Polypeptid exprimiert wird. Die Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz für den 55kD-TNFα-Rezeptor sein. Eine geeignete DNA- Sequenz, die für die ersten drei cysteinreichen Unterbereiche des extrazellulären Bindungsbereiches des 55kD-Rezeptors und eine solche Signalsequenz kodiert, ist deshalb:
(SEQ-ID-Nr.:1).
Eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid der Erfindung kodiert, kann synthetisiert werden. Alternativ kann sie konstruiert werden, indem eine DNA-Sequenz, die den 55kD- oder 75kD- Rezeptor kodiert, aus einer Gen-Bibliothek isoliert wird und DNA stromabwärts der kodierenden Sequenz für die ersten drei cysteinreichen Unterbereiche des extrazellulären Bindungsbereiches des Rezeptors deletiert wird. Dies führt zu DNA, die für die ersten drei Unterbereiche jedes Rezeptors kodiert. Als ein Zwischenschritt kann DNA, die für den gesamten oder fast den gesamten extrazellulären Bindungsbereich kodiert, isoliert werden und verdaut werden, um DNA stromabwärts der kodierenden Sequenz für die ersten drei Unterbereiche zu entfernen.
Eine modifizierte Nucleotidsequenz, die z.B. eine Aminosäuresequenz (b) kodiert, kann erhalten werden durch die Verwendung einer geeigneten Technik, einschließlich der Restriktion mit einer Endonuclease, der Einführung von Linkern, der Verwendung von Exonuclease und/oder Polymerase und ortsspezifischer Mutagenese. Ob eine modifizierte DNA-Sequenz für ein Polypeptid der Erfindung kodiert, kann leicht festgestellt werden. Das durch die Sequenz kodierte Polypeptid kann in einem geeigneten Wirt exprimiert und auf seine Fähigkeit hin getestet werden, spezifisch an Human-TNFα zu binden.
Zur Expression eines Polypeptids der Erfindung wird ein Expressionsvektor konstruiert. Ein Expressionsvektor wird hergestellt, welcher eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid der Erfindung kodiert, umfaßt, und welcher in der Lager ist, das Polypeptid zu exprimieren, wenn er in einem geeigneten Wirt vorgesehen wird. Angemessene transkriptionelle und translationale Kontrollelemente werden vorgesehen, einschließlich eines Promotors für die DNA-Sequenz, einer transkriptionellen Terminationsstelle und translationalen Start- und Stoppkodons. Die DNA- Sequenz wird in dem korrekten Raster vorgesehen, so daß die Expression des Polypeptids in einem Wirt auftreten kann, der mit dem Vektor kompatibel ist.
Der Expressionsvektor wird dann in einem angemessenen Wirt vorgesehen. Zellen, die den Vektor beherbergen, werden wachsen gelassen, so daß die Expression ermöglicht wird. Der Vektor kann ein Plasmid oder ein viraler Vektor sein. Jedwedes angemessene Wirt-Vektor- System kann zur Anwendung kommen.
Der transformierte Wirt kann ein prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt sein. Ein bakterieller oder Hefewirt kann angewendet werden, z.B. E. coli oder S. cerevisiae. Insektenzellen können in alternativer Weise verwendet werden, in welchem Fall ein Bakulovirus-Expressions-System angemessen sein kann. Als eine weitere Alternative können Zellen einer Säugerzellinie, wie Zellen von Eierstöcken des chinesischen Hamsters (CHO), transformiert werden. Ein Polypeptid, welches an einer, an zwei oder an drei der in Fig. 1 gezeigten Stellen glykosyliert ist, kann durch geeignete Wahl der Wirtszellkultur erhalten werden.
Das Polypeptid der Erfindung kann isoliert und gereinigt werden. Der N-Terminus des Polypeptids kann heterogen sein, aufgrund der Prozessierung des Translationsproduktes innerhalb einer Zelle oder während das Produkt aus der Zelle sekretiert wird. Eine Mischung aus Polypeptiden gemäß der Erfindung mit unterschiedlichen N-Termini kann deshalb erhalten werden. Das Polypeptid ist löslich.
Die Polypeptide der Erfindung besitzen Aktivität zum Binden von Human-TNFα. Diese Aktivität weist auf die mögliche Verwendung der Polypeptide bei der Regulation von durch TNFα vermittelten Antwortreaktionen durch Binden und Sequestrieren von Human-TNFα hin, z.B. auf eine mögliche Verwendung bei der Behandlung von Lungenerkrankungen, septischem Schock, HIV-Infektion, Malaria, viraler Meningitis, Transplantat-versus-Wirt-Reaktionen und Autoimmun- Erkrankungen, wie rheumatoide Artritis bzw. primär-chronischer Gelenkrheumatismus.
Zu diesem Zweck kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt ebenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Carrier oder Verdünnungsmittel.
Das Polypeptid der Erfindung kann an einen Patienten mittels jedweder herkömmlichen Route verabreicht werden. Die Wahl, ob eine orale Route oder eine parenterale Route, wie eine subkutane, intravenöse oder intramuskulare Verabreichung, gewählt wird; der Dosis und der Häufigkeit der Verabreichung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Diese Faktoren schließen den Zweck der Verabreichung, das Alter und das Gewicht des behandelten Patienten und dem Zustand des Patienten ein. Typischerweise wird das Polypeptid jedoch in einer Menge von 1 bis 1000 ug pro Dosis, stärker bevorzugt von 10 bis 100 ug pro Dosis für jede Verabreichungsroute verabreicht.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Ein Referenzbeispiel wird vorgelegt.

REFERENZBEISPIEL

1. Materialien und Methoden

Reagenzien

Rekombinantes Human-TNFα und -TNFβ wurden als aus E. coli abgeleitete hochgereinigte Proteine erworben. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparationen lagen bei etwa 10&sup7; Einheiten/mg, gemessen in dem Zytotoxizitäts-Assay mit L929-Mauszellen (4). Die synthetischen Oligonucleotide wurden durch den Oswel DNA Service (University of Edinburgh) hergestellt.

Isolation von TNFα-55kD-Rezeptor-cDNA-Klonen

Die Sequenz eines Peptidfragmentes (E M G Q V E I S S T V D R D T V C G (SEQ-ID-Nr.: 5)) des TNF-Bindeproteins wurde verwendet, um eine synthetische Oligonucleotidsonde (5' AAG GAG ATG GGC CAG GTT GAG ATC TCT TCT ACT GTT GAC AAT GAC ACT GTG TGT GGC-3' (SEQ-ID-Nr.: 6)) zu entwerfen. Die 57-mer-DNA-Sonde wurde mit ³²P und T4- Polylnucleotidkinase (New England Biolab, Beverly, MA) markiert und verwendet, um eine Plazenta-cDNA-Bibliothek in gt10 zu screenen (5,6). Etwa 800.000 Phagen wurden auf Nitrocellulosefilter überführt und bei verringerter Stringenz gescreent (7). Filter wurden 2 Stunden bei 42ºC in 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,5, 20% Formamid, 0,75 M Natriumchlorid, 0,075 M Natriumcitrat, 1% Polyvinylpyrrolidon (Sigma, St. Louis, MO), 1% Ficoll, 1% Rinderserumalbumin (Sigma) und 50 ng/ml mit Ultraschall behandelter Lachsspermien-DNA (Sigma) inkubiert. Die radioaktiv markterte Sonde wurde dann den Filtern (10&sup8; cpm/ml Endkonzentration) hinzugesetzt, welche 16 Stunden lang hybridisiert wurden. Filter wurden eingehend in 0,06 M Natriumchlorid, 0,006 Natriumcitrat, 1% SDS bei 37º gewaschen, und positive Klone wurden mittels Autoradiographie identifiziert. Zehn hybridisierende Klone wurden Plaque-gereinigt (5), und die cDNA-Insertionsgröße wurde mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese von EcoRI-verdauter Phagen-DNA bestimmt. Die Einfügungen der zwei cDNA-Klone wurden unter Verwendung der Didesoxy-Kettenabbruchs-Technik (8) sequenziert.

Southern- und Northern-Blott-Analyse

DNA wurde aus menschlichen Lymphozyten mittels des Verfahrens von Blin und Stafford (9) isoliert und für die Southern-Blott-Analyse (10) verwendet. DNA wurde mit Restriktionsendonuclease (New England Biolabs) verdaut, auf einem 1%igen Agarosegel fraktioniert und auf Nitrocellulose transferiert. Die Hybridisierung und das Waschen wurden unter stringenten Bedingungen (6) unter Verwendung einer ³²P-markierten Präparation eines 600 bp großen Fragmentes der TNF-Rezeptor-cDNA durchgeführt. Eine Northern-Blott-Analyse wurde durchgeführt (11) bei einer Oligo-dT-selektierten RNA, isoliert aus menschlicher Placenta, Milz (großzügig von der Cooperative Human Tissue Network, Birmingham, AL, zur Verfügung gestellt) und einer Fibroplasten-Zellinie (293 Zellen). Nach der Elektrophorese auf einem Formaldehyd-1,2%-Agarose- Gel wurde die RNA auf Nitrocellulose überführt und mit der TNFα-Rezeptor-DNA-Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Säugerzellexpression des Human-TNFα-55kD-Rezeptors und von Derivaten

Die kodierende Region des Großteils des Human-TNFα-55kD-Rezeptors wurde als ein EcoRI- Fragment isoliert und in einen Säugerzell-Expressionsvektor (12) kloniert, was zum Plasmid prTNFR führte. Das EcoRI-Fragment kodiert 374 Aminosäuren des TNF-Rezeptors; die 81 Carboxyl-terminalen Reste des zytoplasmatischen Bereichs fehlen deshalb aus dieser Plasmidkonstruktion. Ein Derivat des TNFα-Rezeptors wurde erzeugt, indem ein Terminationskodon direkt vor dem Transmembranbereich eingebaut wurde. Die Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Technik (13) wurde angewandt, um ein 300 bp großes Restriktionsfragment zu erzeugen, das eine BgIII- Stelle an dem 5'-Ende und eine HindIII-Stelle, der ein TAG-Stoppkodon vorgeschaltet war, an dem 3'-Ende enthielt. Die PCR-Primer waren
5'GCTGCTCCAAATGCCGAAAG (SEQ-ID-Nr.: 7) und
5'AGTTCAAGCTTTTACAGTGCCCTTAACATTCTAA (SEQ-ID-Nr. 8).
Das PCR-Produkt wurde gelgereinigt und in das TNF-Rezeptor-Expressionsplasmid (oben beschrieben), verdaut mit BGIII und HindIII, kloniert. Die DNA-Sequenzierung bestätigte, daß das resultierende Plasmid (pTNFRecd) die entworfene DNA-Sequenz enthielt. E. coli mit beherbergtem pTNFRecd wurde bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB, am 11. September 1990, unter der Hinterlegungsnr. NCIMB 40315 hinterlegt.
Die TNFα-Rezeptor-Expressions-Plasmide wurden in Affen-COS-7-Zellen unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL, Bethesda, MD) gemäß den Hinweisen des Herstellers transfiziert. Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das 10% tötales Kälberserum enthielt, kultiviert.

Analyse von rekombinanten TNFα-55kD-Rezeptor-Derivaten

TNFα wurde mittels der Iodogen-Methode (Pierce) gemäß den Anleitungen des Herstellers radioaktiv iodiert. Die spezifische Aktivität des ¹²&sup5;I-TNFα lag bei 10 bis 30 uCu/ug. COS-Zellen, die mit der TNFα-Rezeptor-cDNA transfiziert waren (prTNFR, 1300 pb EcoRI-Fragment) wurden 24 Stunden lang inkubiert und dann in sechs Gewebekultur-Vertiefungsplatten (Nunc) bei 4,5 x 10&sup8; Zellen pro Vertiefung eingeimpft. Die Zellen wurden 48 weitere Stunden inkubiert, und dann wurde die Rezeptorexpression durch Radioligandenbindung während 2 Stunden bei 4ºC quantifiziert. Es wurde keine spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-TNFα in Gegenwart eines tausendfachen molaren Überschusses von nicht-markiertem TNFα bestimmt. Bindungsdaten wurden mittels der Scatchard-Methode analysiert (14).
Das TNFα-Rezeptor-Derivat wurde bezüglich der Inhibierung der ¹²&sup5;I-TNFα-Bindung am natürlichen Rezeptor von Human-U937-Zellen analysiert. Der Kulturüberstand wurde 72 Stunden geerntet, nachdem COS-Zellen mit pTNFRecd transfiziert worden waren. U937-Zellen (2 x 10&sup8; Zellen in 200 ul) wurden mit 1 nM ¹²&sup5;I-TNFα und Verdünnungen von COS-Zellmedien 2 Stunden bei 4ºC inkubiert. Zellen wurden dann durch 20%ige Saccharose zentrifugiert, um ungebundenes TNFα zu entfernen. Eine nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 uM nicht-markiertem TNFα bestimmt.
Das TNFα-Rezeptor-Derivat wurde ebenfalls bezüglich der Inhibierung von TNFα-zytotoxischen Effekten in vitro analysiert. Das Zytotoxitäts-Assay wurde so durchgeführt, wie es bei dem TNF-empfindlichen WEHI-164-Zellinien-Klon 13 beschrieben ist (15). Reihenverdünnungen von Überständen von COS-Zellen, die mit pTNFRecd transfiziert waren, oder Pseudo-transfizierte Kontrollen wurden mit einer konstanten Menge an TNFα (1 ng/ml) 1 Stunde lang bei 27ºC inkubiert, und zwar bevor Zugabe zum Assay.

2. Ergebnisse

Isolation und Charakterisierung der TNFα-55kD-Rezeptor-cDNA

Eine partielle Aminosäuresequenz des TNF-Bindungsproteins wurde verwendet, um eine synthetische Oligonucleotidsonde zu entwerfen. Die radioaktiv markierte Sonde wurde verwendet, um eine Humanplacenta-cDNA-Bibliothek in Lambda gt10 zu screenen, und zehn Hybridisierungsphagen wurden isoliert. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Klons mit der längsten cDNA sind in Fig. 1 dargestellt. Das dritte potentielle ATG-Initiierungskodon tritt bei Position 156 der Nucleotidsequenz auf, den ersten zwei ATG-Kodons folgen nahe Terminationskodons, und dem dritten ATG gehen die besten Translationsinitiations-Konsensus-Nucleotide voran (16). Die cDNA kodiert für ein offenes Leseraster von 1365 Basen, welches für ein Polypeptid mit 455 Resten kodiert. Beide der Peptidsequenzen, die durch die Aminosäuresequenzierung bestimmt wurden, wurden in der kodierten cDNA nachgewiesen (17 von 19 und 18 von 19 Paarungsresten). Das für das TNF-Bindungsprotein identifizierte Amino-terminale Ende entspricht der durch cDNA kodierten Sequenz, beginnend am Rest 41. Die ersten 35 Aminosäuren sind im allgemeinen ziemlich hydrophob und stellen wahrscheinlich eine Signalsequenz dar. Die Reste 35 bis 40 sind stark geladen (DREKR (SEQ-D-Nr.: 9)), und eine solche Sequenz wird nicht typischerweise in sekretorischen Signalsequenzen gefunden (17); vielleicht wird der natürliche Rezeptor durch Proteolyse nach dem Rest 40 prozessiert, welcher eine Dibasio- Spaltstelle enthält (KR). Die Hydropathie-Analyse der Proteinsequenz sagt einen einzelnen Transmembranbereich von 23 Aminosäuren voraus. Diese hydrophobe Sequenz teilt das Protein in einen extrazellulären Bereich von 171 Resten und einen zytoplasmatischen Bereich von 221 Resten. Die für das TNF-Bindungsprotein bestimmte Aminosäurezusammensetzung entspricht ganz gut der vorausgesagten Zusammensetzung des durch die cDNA kodierten extrazellulären Bereichs (Ergebnisse nicht gezeigt). Der Unterschied zwischen der vorausgesagten Rezeptorgröße (40.000 Dalton) und der durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmten Größe (65.000 Dalton, 18-20) ist wahrscheinlich durch Glykosylierung bedingt; es gibt vier potentielle N-verknüpfte Glykolysierungsstellen in der Sequenz, wobei sich drei davon in dem extrazellulären Bereich befinden. Die Sequenz enthält eine große Anzahl (17) von Cysteinresten, wobei 24 in dem extrazellulären Bereich vorliegen. Die Anordnung dieser Cysteinreste entspricht der von mehreren anderen Zelloberflächen-Proteinen, was nahelegt, daß der TNF-Rezeptor strukturell zu einer Familie von Rezeptoren verwandt ist.
Eine Northern-Blott-Analyse ist in Fig. 2 dargestellt. Die ³²P-markierte cDNA hybridisiert an einem einzelnen vorherrschenden Band von Oligo-dT-selektierter RNA aus Human-Placenta oder -Milz. Ein etwas größerer Transkript wurde ebenfalls in RNA aus einer Fibroplasten-Zellinie festgestellt. Die Größe der hybridisierenden Spezies beträgt 2400 Basen, was in guter Übereinstimmung mit der Größe von isolierter cDNA ist. Auch ist in Fig. 2 ein Southern-Blott von genomischer Human-DNA gezeigt, die mit einer 600 bp großen Sonde aus der cDNA hybridisiert ist. In jedem der drei unterschiedlichen Restriktionsverdauungen wurde nur ein einzelnes Hybridisierungssignal festgestellt. Somit scheint der TNF-Rezeptor, den wir isoliert haben, durch ein einzelnes Gen kodiert zu sein.

Expression von rekombinanten TNF-Rezeptorsequenzen in Säugerzellen

Um zu bestätigten, daß die in Fig. 1 gezeigte cDNA tatsächlich für den TNF-Rezeptor kodiert, wurde die cDNA für die Expression in Säugerzellen konstruiert. Die cDNA enthält eine EcoRI- Stelle an der Position 1270 von Fig. 1. Die für den Rezeptor kodierende Sequenz wurde als ein 1300 bp großes EcoRI-Fragment (das alle bis auf die letzten 81 Kodons des zytoplasmatischen Bereiches enthielt) isoliert und in einen Säugerzell-Expressionsvektor, der einen Cytomegalovirus- Promotor und SV40-Transkriptionsterminationssequenzen enthielt, inseriert (12). Das resultierende Plasmid wurde in COS-Zellen transfiziert, welche nach 3 Tagen bezüglich der TNF- Rezeptorexpression analysiert wurden. Wie in Fig. 3 gezeigt, haben die transfizierten Zellen spezifisch mit Iod radioaktiv-markiertes TNFα in einer gesättigten und dosisabhängigen Weise gebunden. Die Population an GOS-Zellen exprimierte etwa 1 x 10&sup8; Rezeptoren pro Zelle. Die gemessene Bindungsaktivität vom rekombinanten Rezeptoren betrug 2,5 x 10&sup9;M&supmin;¹ bei 4ºC, was in enger Übereinstimmung mit natürlichem Rezeptor auf menschlichen Zellen ist (19, 20). Die Bindung von ¹²&sup5;I-TNFα(1 nM) an diesen Zellen konnte durch die Zugabe von nicht-markiertem TNFα oder Lymphotoxin inhibiert werden (Fig. 3b). COS-Zellen, die nur mit dem Expressionsvektor transfiziert waren, banden nicht signifikant ¹²&sup5;I-TNFα (weniger als 2% der Bindung, die mit der cDNA-Transfektion zu sehen war).
Der extrazelluläre Bereich des TNF-Rezeptors wird natürlich von Zellen abgestoßen. Um ein ähnliches rekombinantes Derivat herzustellen, wurde ein Stoppkodon, das dem Transmembranbereich vorlag, in die cDNA mittels PCR-Mutagenese eingebaut. Die modifizierte DNA wurde in das Expressionsplasmid eingeführt und danach in COS-Zellen transfiziert. Nach 3 Tagen wurden die COS-Zellmedien bezüglich der Inhibition der TNFα-Bindung an Human-U937-Zellen getestet. Wie in Fig. 4a gezeigt, inhibierten die Medien mit transfizierten Zellen bis zu 70% der Bindung von TNFα. Das rekombinante TNF-Rezeptor-Derivat wurde als nächstes bezüglich der Inhibierung der biologischen TNFα-Aktivität getestet. Ein empfindliches Bioassay für TNFα ist die Messung der Zytolyse von Maus-WEHI-164-Zellen (Klon 13). Die Medien mit transfizierten Zellen inhibierten 60% der TNFα-Zytotoxtzität bei dieser Zelllinie (Fig. 4b). Medien von Pseudotransfizierten COS-Zellen inhibierten nicht die durch TNFα induzierte Zytotoxizität oder Bindung. Diese Experimente zeigen, daß der rekombinante extrazelluläre Bereich des TNF- Rezeptors in der Lage ist, TNF zu binden und seine biologische Aktivität zu inhibieren.

BEISPIEL 1: Eipression von Polypeptid, das im wesentlichen aus den ersten drei cysteinreichen Unterbereichen des extrazellulären Bindungsbereiches des 55kD-Rezeptors besteht

1. MATERIALIEN UND METHODEN

Reagenzien

Von E. coli abgeleitetes rekombinanates Human-TNFα besaß eine spezifische Aktivität von 2 x 10&sup7; U/mg in einem L929-Zytotoxizitätsassay. Oligonudeotide wurden von Oswel DNA Service gekauft (Universität Edinburgh).

Erzeugung der rekombinanaten löslichen TNFR-Derivate

Die Deletion jedes der Unterbereiche in dem rekombinanten löslichen TNFR wurde mit PCR- Fragment-Verknüpfung und PCR-Mutagenese erreicht. Die Sequenz der in diesen Experimenten verwendeten Oligonucleotiden ist in Tabelle 1 angeführt, und ihre Lokationen in bezug auf die vier cysteinreichen Unterbereiche ist in Fig. 5 gezeigt. Die vier Unterbereiche sind in bezug zueinander in Fig. 6 aufgereiht.
Das Plasmid-pTNFRecd (Referenzbeispiel) ist in Fig. 7 gezeigt. pTNFRecd wurde ferner modifiziert, um nicht translatierte 5'-Sequenzen durch Klonierung des Cla I/Bgl II-verdauten Produktes eines PCR unter Verwendung von Oligos 5'-Cla und IIIA in Cla I/Bgl II-verdautes pTNFRecd, um 5'-ΔCla zu erhalten. Der Verdau von 5'-ΔCla mit Pst-1 und die erneute Ligation führte zu der Erzeugung von pΔII, welchem der zweite cysteinreiche Unterbereich fehlte (Fig. 9). Der vierte cysteinreiche Unterbereich wurde entfernt durch Klonierung des Bgl II/Hind III-verdauten Produktes einer PCR unter Verwendung von Oligonudeotiden 5A und 4D in Bgl II/Hind III-5'-ΔCla; dies führte ein Terminationskodon nach Aminosäure 167 ein (gezählt von dem Anfangsmethionin), um pΔIV zu erhalten (Fig. 11). Die Konstrukte p I (Fig. 8) und pΔIII (Fig. 10), welchen der erste bzw. dritte cysteinreiche Unterbereich fehlte, wurden erzeugt durch Verbinden von PCR-Fragmenten mit Hilfe von in die für die PCR verwendeten Primer eingeführten Überhängen. Die mittels Gel gereinigten Produkte von PCRs unter Verwendung von 5' Cla und IA und IB und 5D wurden gemischt und einer weiteren Amplifizierung unter Verwendung von 5' Cla und 5D als Primer unterzogen. Das resultierende Fragment wurde mit Cla I und Bgl II verdaut und in Cla I/Bgl II-verdautes pTNFRecd kloniert, wodurch pΔI erhalten wurde.
In gleicher Weise wurden die gelgereinigten Produkte von PCRs unter Verwendung von 5' Cla und IIIA und IIIB und 5D gemischt und einer weiteren Amplifizierung unter Verwendung von 5' Cla und 5D als Primer unterzogen. Dieses Produkt wurde mit Bgl II und Hind III verdaut und in Bgl II/Hind III-geschnittenes 5'-ΔCla kioniert, um pΔIII zu erhalten. In allen Fällen wurden die klonierten Derivate durch Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemical Corporation) analysiert. Tabelle 1: Struktur der mutagenen Oligonucleotide

Analyse von rekombinanten löslichen TNFR-Derivaten

COS-Zellen wurden in von Dulbecco modifiziertem Eagles-Medium, das 5% fötales Kälberserum enthielt, gehalten. Die löslichen TNFα-Rezeptor-Derivate wurden in Affen-COS-Zellen mit Hilfe von Lipofektin (GIBO-BRL, Bethesda MD) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert und zellfreie Überstände 72 Stunden nach der Transfektion abgeerntet.

Inhibition der TNFα-Aktivität

Die löslichen TNFα-Rezeptor-Derivate wurden bezüglich der Inhibition der zytotoxischen TNFα- Aktivität in vitro analysiert. Das Zytotoxizitätsassay wurde durchgeführt, wie es bezüglich der TNFα-empfindlichen Zellinie WEHI 164-Klon 13 beschrieben ist. Reihenverdünnungen von Überständen von COS-Zellen, die mit mutanten Rezeptoren transfiziert waren, oder Pseudotransfizierten Kontrollen wurden mit einer konstanten Menge an TNF (1 ng/ml) 1 Stunde bei 37ºC vor Zugabe zu dem Assay inkubiert.

2. ERGEBNISSE

Um mehr über den Beitrag von den einzelnen cysteinreichen Unterbereichen zu der Bindung von TNFα vermittels der löslichen Form des 55kD-TNF-Rezeptors zu verstehen, entfernten wir jeden Unterbereich mittels PCR-Mutagenese (Fig. 5). COS-Zellen wurden mit jedem dieser Konstrukte transfiziert, und die Überstände wurden bezüglich ihres Vermögens getestet, die zytotoxische Aktivität von TNFα zu inhibieren. Die Tafel A von Fig. 12 zeigt, daß konditionierte Medium von COS-Zellen, die mit pTNFRecd transfiziert waren, TNFα, wie vorstehend beschrieben, inhibieren. Die Entfernung des vierten cysteinreichen Unterbereiches führte zu einem Protein, welches entsprechend TNFRecd ein potenter Inhibitor von TNFα war (Fig. 12, Tafel B). die Mutanten, welchen der erste, zweite und dritte Unterbereich fehlte, zeigten keine inhibitorische Aktivität in dem TNFα-Zytotoxizitätsassay.

BEISPIEL 2: Expression von Polypeptid, das im wesentlichen aus den ersten drei cysteinreichen Unterbereichen des extrazellulären Bindungsbereichs des 75kD-Rezeptors besteht

Die kodierende Region des Human-75kD-TNFα-Rezeptors wurde aus einer T-Zell-lambda-ZAP- Bibliothek isoliert, und zwar unter Verwendung einer Sonde, die auf veröffentlichte Sequenzen basierte (3), und in die EcoRI-Stelle eines Säugerzell-Expressionsvektors kloniert (12), was zum Plasmid P75TNFR führte. Genauer wurde RNA aus einer Zellinie, die den 75kD-Rezeptor exprimierte, extrahiert und umgekehrt transkribiert. Jedwede Zellinie, die diesen Rezeptor exprimierte, konnte verwendet werden, wie jene, die von Smith et al. (3) beschrieben sind. Das Produkt der Umkehr-Transkription wurde 25 PCR-Zyklen unter Verwendung der folgenden Primer unterzogen:
Diese Primer sind gegen die kodierende Region des extrazellulären Bindungsbereiches des 75kD- Rezeptors gerichtet und wurden aus Smith et al. (3) genommen. Das amplifizierte Produkt wurde mittels Gel gereinigt, und es wurde gezeigt, daß es für TNFR kodiert. Dieses wurde später verwendet, um die Bibliothek zu screenen. Eine Plaque-Reinigung wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es im Referenzbeispiel beschrieben ist, außer daß die Sonde durch statistisches Primen (21) markiert und in 50%igem Formamid hybridisiert wurde. Filter wurden in 0,2 x SSC (Standard-Salincitrat) zweimal bei 60ºC gewaschen.
Ein Derivat des 75kD-TNFα-Rezeptors wurde erzeugt durch Einbau eines Terminationskodons direkt vor dem Transmembranbereich. Bezugnehmend auf Fig. 13 wurde die Polymerase- Kettenreaktions(PCR)-Technik angewandt, um ein 274 bp großes Restriktionsfragment, das eine Bgl II-Stelle am 5'-Ende und eine Xba-I-Stelle, dem ein TAG-Stoppkodon voranging, am 3'-Ende enthielt. Die PCR-Primer waren 5' ACACGACTTCATCCACGGATA (SEQ-ID-Nr.: 20) und 5' ACGTTCTAGACTAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTG (SEQ-ID-Nr.: 21). Das PCR-Produkt wurde mit Bgl II und Xba I verdaut, gelgereinigt und in das TNF-Rezeptor-Expressionsplasmid (oben beschrieben), verdaut mit Bgl II und Xba I, kioniert. Die DNA-Sequenzierung bestätigte, daß das resultierende Plasmid die verdaute DNA-Sequenz enthielt.
Ein ähnlicher Weg wurde angewandt, um ein Konstrukt zu erzeugen, welchem der vierte cysteinreiche Unterbereich des 75 kD-TNFα-Rezeptors fehlte. PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines Primers stromautwärts der Esp I-Stelle in dem 75kD-TNFR und eines Primers, welcher ein TAG-Terminationskodon und eine Xba I-Stelle einführte. Die Sequenzen der Primer waren 5' CAG AAC CGC ATC TGC ACC TGC (SEQ-ID-Nr.: 22) bzw. 5' ACGTTCTAGACTTGCACACCACGTCTGATGTTTC (SEQ-ID-Nr.: 23). Das PCR-Produkt wurde mit Esp I und Xba I verdaut, und das 110 bp große DNA-Fragment wurde gelgereinigt und in Esp I/Xba I-verdautes P75TNFR kloniert.

REFERENZEN

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21. Feinburg, A. & Vogelstein, B. (1984), Analytical Biochem. 137, 266-277. SEQUENZ-AUFLISTUNG

Claims

Ansprüche für die Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, IT, LU, NL und SE

1. Ein Polypeptid, geeignet zum Binden von Human-TNFα und bestehend aus:

(a) der Aminosäuresequenz der drei ersten cysteinreichen Teilbereiche, jedoch nicht des vierten cysteinreichen Teilbereichs des extrazellulären Bindungsbereichs des 55kD- oder 75kD-Rezeptors für Human-TNFα, oder

(b) einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 % oder mehr zur genannten Sequenz (a).

2. Ein Polypeptid mit folgender Aminosäuresequenz:

3. Ein Polypeptid mit folgender Aminosäuresequenz:

4. Ein DNS-Molekül, welches ein Polypeptid gemäß der Definition in einem der vorherigen Ansprüche codiert.

5. Ein DNS-Molekül, welches ein Polypeptid gemäß der Definition in Anspruch 3 codiert und folgende Sequenz aufweist:

6. Ein DNS-Molekül nach Anspruch 4 oder 5, welches weiterhin eine 5'-Sequenz aufweist, die eine Signalaminosäuresequenz codiert.

7. Ein DNS-Molekül, welches ein Polypeptid gemäß der Definition in Anspruch 2 codiert und folgende Sequenz aufweist:

8. Ein DNS-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 7, welches ein Vektor ist, der das Polypeptid ausdrückt, wenn es in einem geeigneten Wirt vorhanden ist.

9. Ein Vektor nach Anspruch 8, bei dem es sich um ein Plasmid handelt.

10. Ein mit einem Vektor transformierter Wirt nach Anspruch 8 oder 9.

11. Ein Wirt nach Anspruch 10, bei dem es sich um eine Säugetier-Zellinie handelt.

12. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der Definition in Anspruch 1, der die Züchtung eines transformierten Wirts nach Anspruch 10 oder 11 unter solchen Bedingungen einschließt, daß das genannte Polypeptid ausgedrückt wird.

13. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner und, als Wirkungsprinzip, ein Polypeptid nach Anspruch 1 enthält.

14. Ein Polypeptid nach Anspruch 1 für den Einsatz bei der Behandlung von primär-chronischem Gelenkrheumatismus.

ANSPRÜCHE FÜR DIE VERTRAGSSTAATEN ES UND GB

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, geeignet zum Binden von Human-TNFα und bestehend aus:

(b) einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 % oder mehr zur genannten Sequenz (a),

wobei das Verfahren die Züchtung eines mit einem Vektor transformierten Wirts einschließt, der das Polypeptid unter solchen Bedingungen codiert, daß das Polypeptid ausgedrückt wird.

2. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit folgender Aminosäuresequenz:

3. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit folgender Aminosäuresequenz:

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Vektor folgende Sequenz enthält:

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Vektor weiterhin eine 5'-Sequenz enthält, die eine Signalaminosäuresequenz codiert.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Vektor folgende Sequenz enthält:

7. Ein Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem der Vektor ein Plasmid ist.

8. Ein Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem der Wirt eine Säugetier-Zellinie ist.

9. Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welches das Mischen eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers oder Verdünners und eines Polypeptids als Wirkungsprinzip gemäß der Definition in Anspruch 1 einschließt.

10. Ein Polypeptid, geeignet zum Binden von Human-TNFα und bestehend aus:

11. Ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID. NR.: 2, wie in Anspruch 2 beschrieben.

12. Ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID. NR.: 4, wie in Anspruch 3 beschrieben.

13. Ein DNS-Molekül, welches ein Polypeptid gemäß der Definition in einem der Ansprüche 10 bis 12 codiert.

14. Ein DNS-Molekül, welches ein Polypeptid gemäß der Definition in Anspruch 12 codiert und die in Anspruch 4 beschriebene Sequenz SEQ. ID. NR.: 3 aufweist.

15. Ein DNS-Molekül nach Anspruch 13 oder 14, welches weiterhin eine 5'-Sequenz aufweist, die eine Signalaminosäuresequenz codiert.

16. Ein DNS-Molekül, welches ein Polypeptid gemäß der Definition in Anspruch 11 codiert und welches die in Anspruch 6 beschriebene Sequenz SEQ. ID. NR.: 1 aufweist.

17. Ein DNS-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 16, welches ein Vektor ist, der das Polypeptid ausdrückt, wenn ein geeigneter Wirt vorhanden ist.

18. Ein Vektor nach Anspruch 17, der ein Plasmid ist.

19. Ein mit einem Vektor transformierter Wirt nach Anspruch 17 oder 18.

20. Ein Wirt nach Anspruch 19, der eine Säugetier-Zellinie ist.

21. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der Definition in Anspruch 10, der die Züchtung eines transformierten Wirts nach Anspruch 19 oder 20 unter solchen Bedingungen einschließt, daß das genannte Polypeptid ausgedrückt wird.

22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner und, als Wirkungsprinzip, ein Polypeptid nach Anspruch 10 enthält.

23. Ein Polypeptid nach Anspruch 10 für den Einsatz bei der Behandlung von primär-chronischem Gelenkrheumatismus.