DE69129990T3

DE69129990T3 - Modifizierter menschlicher tumornekrosisfaktor-alpha-rezeptor

Info

Publication number: DE69129990T3
Application number: DE69129990T
Authority: DE
Inventors: Marc The Charing Cross Sunley Feldmann; Patrick William Icos Corporation Bothell GRAY; Martin J. C. H. Hughes Med. Inst. Univer Ann Arbor TURNER; Fionula Mary The Charing Cross Brennan
Original assignee: SYNOVIS Ltd LONDON; Synovis Ltd
Current assignee: Kennedy Trust for Rheumatology Research
Priority date: 1990-10-18
Filing date: 1991-10-18
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2011-10-19
Also published as: EP0556207A1; DE69129990D1; GB9022648D0; DE69129990T2; EP0556207B1; DK0556207T3; DK0556207T4; ES2121789T3; EP0556207B2; US5863786A; ATE169675T1; JPH06504192A; ES2121789T5; WO1992007076A1; US5633145A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Proteine und ihre Verwendung.
Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) ist ein wirkungsvolles Cytokin, welches ein breites Spektrum an biologischen Antworten hervorruft. TNFα verursacht die Cytolyse oder Cytostase von vielen Tumorzelllinien in vitro, induziert die hämorrhagische Nekrose von transplantierten Tumoren in Mäusen, steigert die Phagozytose und Cytotoxizität von polymorphkernigen Neutrophilen und moduliert die Expression von vielen Proteinen, einschließlich Lipoproteinlipase, Klasse-I-Antigenen des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes und Cytokinen, wie Interleukin 1 und Interleukin 6. TNFα scheint für eine normale Immunantwort notwendig zu sein, jedoch erzeugen große Mengen dramatische pathogene Wirkungen. TNFα wurde als "Cachectin" bezeichnet, da es der vorherrschende Faktor ist, der für das Auszehrungs-Syndrom (Kachexie), das mit neoplastischer Erkrankung und Parasitämie in Verbindung steht, verantwortlich ist. TNF trägt ebenfalls hauptsächlich zur Toxizität bei gramnegativer Sepsis bei, da Antikörper gegen TNF infizierte Tiere schützen können.
Die vielen Aktivitäten von TNFα werden durch das Binden an einen Zelloberflächenrezeptor vermittelt. Radioliganden-Bindungsstudien haben die Anwesenheit von TNF-Rezeptoren auf einer großen Vielzahl von Zelltypen bestätigt. Obgleich diese Rezeptoren in einer begrenzten Anzahl (1000–10 000 Rezeptoren/Zelle) exprimiert werden, binden sie TNFα mit hoher Affinität (Ka = 10⁹ M^–1 bei 4°C). Lymphotoxin (LT, ebenfalls als TNFβ bezeichnet) besitzt ähnliche, wenn nicht identische biologische Aktivitäten zu TNFα, wahrscheinlich, da sie beide von dem gleichen Rezeptor erkannt werden.
Kürzlich haben mehrere Laboratorien Heterogenität in TNF-Rezeptorpräparationen nachgewiesen. Zwei unterschiedliche Zelloberflächenrezeptoren, welche TNFα und TNFβ binden, sind kürzlich auf molekularem Niveau charakterisiert worden. cDNA für eine Form des Rezeptors mit einem Mr von 55 kD wurde isoliert, und zwar unter Anwendung von Sonden, die aus der Peptidsequenz einer löslichen Form des Rezeptors (1, 2) entworfen wurden. Ein zweiter Rezeptor mit einem Mr von 75 kD wurde mittels eines COS-Zell-Expressionsvorgehens kloniert (3). Beide Rezeptoren sind Vertreter einer größeren Familie von Zytokin-Rezeptoren, welche den Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor, das B-Zell-Antigen CD40 sowie das Ratten-T-Zell-Antigen MRC OX40 einschließen. Darüber hinaus sind diese Rezeptoren zu dem vorhergesagten Produkt eines transkriptionell aktiven offenen Leserasters aus dem Shope-Fibroma-Virus homolog, welcher zu einem sezernierten Protein zu führen scheint.
Das am stärksten konservierte Merkmal unter dieser Gruppe von Zelloberflächenrezeptoren ist die cysteinreiche extrazelluläre Liganden-Bindungsdomäne, welche in vier sich wiederholende Motive von etwa vierzig Aminosäuren eingeteilt werden kann. Wir haben nun vier lösliche Rezeptorderivate des 55kD-TNFα-Rezeptors (TNFR) erzeugt. Jedes Derivat besteht aus der extrazellulären Bindungsdomäne, jedoch ohne eine der cysteinreichen Subdomänen. Wir haben festgestellt, dass das Derivat, welchem die zur Membran proximale vierte Subdomäne fehlt, die Fähigkeit beibehält, TNFα mit hoher Affinität zu binden. Diese Feststellung findet allgemeine Anwendbarkeit.
Demzufolge stellt die folgende Erfindung ein Polypeptid bereit, welches in der Lage ist, humanen TNFα zu binden, und welches aus folgendem besteht:

(a) der Aminosäuresequenz der drei ersten cysteinreichen Subdomänen der extrazellulären Bindungsdomäne des 55kD-Rezeptors für humanen TNFα; oder
(b) einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90% oder mehr zur Sequenz (a);

Die Erfindung sieht ebenfalls folgendes vor:

– eine DNA-Sequenz, welche ein solches Polypeptid codiert;
– einen Vektor, welcher eine DNA-Sequenz der Erfindung beinhaltet und welcher in der Lage ist, das Polypeptid der Erfindung, das von der DNA-Sequenz codiert wird, zu exprimieren, wenn er in einem transformierten Wirt vorgesehen wird; und ein Wirt, der mit einem solchen Vektor transformiert ist.

In den begleitenden Zeichnungen:
zeigt die 1 die Nucleotidsequenz der humanen TNFα-cDNA (SEQ ID Nr.: 24) und die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 25). Die vorhergesagten Signalsequenzreste sind mit –40 bis –1 numeriert. Die Transmembrandomäne ist eingerahmt und mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind oberhalb mit einem Strich versehen. Die mit der entworfenen Oligonucleotidsonde homologe Sequenz findet sich an den Nucleotidpositionen 477–533.
2 ist ein Northern-Blot (Spuren 1–3) von 10 μg Oligo-dT-selektierter RNA aus humanen 293-Zellen (Fibroblastenzelllinie) (Spur 1), Placenta (Spur 2) und Milz (Spur 3), hybridisiert mit der TNF-Rezeptor-cDNA (Sma1-EcoRI-Fragment). Der Southern-Blot (Spuren 4–6) wurde mit der gleichen Sonde hybridisiert. Humane genomische DNA (5 μg pro Spur) wurde mit Pst1 (Spur 4), Hind III (Spur 5) und EcoRI (Spur 6) verdaut.
3 zeigt die Bindungscharakteristika von rekombinantem humanem TNF-Rezeptor, welcher in COS-7-Zellen exprimiert wurde. Die direkte Bindung von rekombinantem ¹²⁵I-TNFα an COS-7-Zellen, welche mit prTNFR transfiziert sind, ist in Diagramm A dargestellt. Das eingebundene Diagramm enthält eine Scatchard-Analyse, die sich aus diesen Daten ableitet. Wie in Diagramm B gezeigt, wurden Monoschichten von Cos-7-Zellen, die mit TNFR-cDNA transfiziert waren, mit 1 nM ¹²⁵I-TNF in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an nicht markiertem TNFα oder TNFβ inkubiert.
4 zeigt die Effekte von löslichem TNFR auf die TNFα-Bindung und biologische Aktivität. Das Diagramm A zeigt die Effekte von Überständen von Cos-7-Zellen, die mit einer cDNA transfiziert waren, welche für eine lösliche Form des TNF-Rezeptors (pTNFRecd, gefüllte Kreise) codierte, oder pseudo-transfiziert (offene Kreise) waren, auf die ¹²⁵I-TNF-Bindung an U937-Zellen. Das Diagramm B zeigt die Effekte dieser Überstande auf die TNF-vermittelte Abtötung der WEHI 164(Klon 13)-Linie. Assays wurden wie in Materialien und Methoden beschrieben durchgeführt.
5 ist ein Diagramm der DNA-Sequenz von pTNFRecd und stellt ebenfalls einen Strategieplan für die auf Polymerasekettenreaktion (PCR) basierende Domänendeletion dar, wobei 5'UTR die 5'-untranslatierte Region ist und I bis IV die vier cysteinreichen Subdomänen sind. Die in der PCR in dem Beispiel verwendeten Oligonucleotide und relevante Restriktionsstellen sind ebenfalls gezeigt.
6 zeigt aufgereiht die Aminosäuresequenzen der vier cysteinreichen Subdomänen der 55kD(TNFR-55)- und 75kD(TNFR-75)-Rezeptoren und von Ratten-Nervenwachstumsfaktorrezeptor (NGFR), humanem CD40 und Ratten-OX40. Homologie wird durch Einrahmungen gezeigt.
Die 7 bis 11 zeigen die Nucleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids von pTNFRecd, pΔI, pΔII, pΔIII und pΔIV.
12 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 1 beschriebenen Assays.
Ein Polypeptid gemäß der Erfindung ist in der Lage, humanen TNFα zu binden. Typischerweise besitzt das Polypeptid eine Bindungsaffinität für humanen TNFα von 10⁷ M^–1 oder mehr, zum Beispiel 10⁸ M^–1 oder mehr. Die Affinität kann zwischen 10⁷ und 10¹⁰ M^–1, zum Beispiel von 10⁸ bis 10⁹ M^–1 liegen.
Ein bevorzugtes Polypeptid besteht aus den ersten drei cysteinreichen Subdomänen der extrazellulären Bindungsdomäne des 55kD-Rezeptors für humanen TNFα. Die Sequenz (a1) dieser drei Subdomänen ist folgende:
Ein brauchbares Polypeptid weist die folgende Aminosäuresequenz (c) auf:
Abgesehen von der Aminosäuresequenz (a) können die Polypeptide alternativ aus einer Aminosäuresequenz (b) bestehen, die eine Homologie von 90% oder mehr mit der Sequenz (a) besitzt. Der Grad der Homologie kann 95% oder mehr oder 98% oder mehr betragen. Die Aminosäuresequenz (a) kann deshalb durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen und/oder durch eine Verlängerung an einem der beiden Enden oder an jedem Ende modifiziert werden. Gleichwohl sollte keine Modifizierung der Cysteinreste vorliegen. Ein die Sequenz (b) umfassendes Polypeptid muß natürlich noch in der Lage sein, humanen TNFα zu binden.
Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste der Sequenz (a), die kein Cysteinrest sind, substituiert oder deletiert werden, oder ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste können inseriert werden; vorausgesetzt, dass der physikochemische Charakter der ursprünglichen Sequenz beibehalten bleibt, d.h. hinsichtlich der Ladungsdichte, Hydrophobizität/Hydrophilizität, Größe und Konfiguration. Konservative Substitutionen können vorgenommen werden. Mögliche Substitutionen sind, basierend auf dem Ein-Buchstaben-Code (Eur. J. Biochem. 138, 9–37, 1984), die folgenden:
A für G und umgekehrt;
V durch A, L oder G;
K durch R;
S durch T und umgekehrt;
E für D und umgekehrt; und
Q durch N und umgekehrt.
Die Polypeptide der Erfindung bestehen aus der Sequenz (a) oder (b). Sie enthalten keine vierte cysteinreiche Subdomäne.
Den Polypeptiden der Erfindung fehlt die vierte cysteinreiche Subdomäne des 55kD-Rezeptors. Insbesondere fehlen ihnen die Cysteinreste der vierte Subdomäne. Deshalb beinhalten sie, direkt nach der dritten cysteinreichen Subdomäne, nichts von der Aminosauresequenz bis zu dem letzten Cysteinrest der vierten cysteinreichen Subdomäne des relevanten Rezeptors.
Die Polypeptide sind typischerweise rekombinante Polypeptide, obgleich sie durch synthetische Verfahren, wie durch Festphasen- oder Lösungsphasen-Polypeptidsynthese, hergestellt werden können, wobei in diesem Falle ein automatischer Peptid-Synthesizer zur Anwendung kommen kann. Sie können deshalb mit einem N-terminalen Rest M beginnen. Sie werden durch die rekombinante DNA-Technologie hergestellt. Die Herstellung der Polypeptide hängt deshalb von der Bereitstellung einer das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz ab. Eine geeignete Sequenz, welche die ersten drei cysteinreichen Subdomänen der exrazellulären Bindungsdomäne des 55kD-Rezeptors codiert, umfasst:
Eine DNA-Sequenz kann ferner eine DNA-Sequenz beinhalten, die für eine Signalsequenz codiert, welche an das 5'-Ende der codierenden Sequenz angeheftet ist. Jedwede Signalsequenz kann geeignet sein. Die Signalsequenz sollte in der Lage sein, die Sekretion des Polypeptids der Erfindung aus der Zelle zu lenken, in welcher das Polypeptid exprimiert wird. Die Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz für den 55kD-TNFα-Rezeptor sein. Eine geeignete DNA-Sequenz, welche die ersten drei cysteinreichen Subdomänen der extrazellulären Bindungsdomäne des 55kD-Rezeptors und eine solche Signalsequenz codiert, ist deshalb:
Eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, kann synthetisiert werden. Alternativ kann sie konstruiert werden, indem eine DNA-Sequenz, die den 55kD- oder 75kD-Rezeptor codiert, aus einer Gen-Bibliothek isoliert wird und DNA stromabwärts der codierenden Sequenz für die ersten drei cysteinreichen Subdomänen der extrazellulären Bindungsdomäne des Rezeptors deletiert wird. Dies führt zu DNA, welche die ersten drei Subdomänen jedes Rezeptors codiert. Als ein Zwischenschritt kann DNA, welche die gesamte oder fast die gesamte extrazelluläre Bindungsdomäne codiert, isoliert werden und verdaut werden, um DNA stromabwärts der codierenden Sequenz für die ersten drei Subdomänen zu entfernen.
Eine modifizierte Nucleotidsequenz, die zum Beispiel eine Aminosäuresequenz (b) codiert, kann erhalten werden durch die Verwendung einer geeigneten Technik, einschließlich der Restriktion mit einer Endonuclease, der Insertion von Linkem, der Verwendung einer Exonuclease und/oder einer Polymerase und ortsspezifischer Mutagenese. Ob eine modifizierte DNA-Sequenz ein Polypeptid der Erfindung codiert, kann leicht festgestellt werden. Das durch die Sequenz codierte Polypeptid kann in einem geeigneten Wirt exprimiert und auf seine Fähigkeit hin getestet werden, spezifisch an humanen TNFα zu binden.
Für die Expression eines Polypeptids der Erfindung wird ein Expressionsvektor konstruiert. Ein Expressionsvektor wird hergestellt, welcher eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, umfasst, und welcher in der Lager ist, das Polypeptid zu exprimieren, wenn er in einem geeigneten Wirt vorgesehen wird. Passende transkriptionelle und translationale Kontrollelemente werden vorgesehen, einschließlich eines Promotors für die DNA-Sequenz, einer transkriptionellen Terminationsstelle und translationalen Start- und Stopcodons. Die DNA-Sequenz wird in dem korrekten Raster vorgesehen, so dass die Expression des Polypeptids in einem Wirt, der mit dem Vektor kompatibel ist, stattfinden kann.
Der Expressionsvektor wird dann in einem passenden Wirt vorgesehen. Zellen, die den Vektor beherbergen, werden wachsen gelassen, so dass das Stattfinden der Expression ermöglicht wird. Der Vektor kann ein Plasmid oder ein viraler Vektor sein. Jedwedes angemessene Wirt-Vektor-System kann zur Anwendung kommen.
Der transformierte Wirt kann ein prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt sein. Ein bakterieller oder Hefewirt kann verwendet werden, zum Beispiel E. coli oder S. cerevisiae. Insektenzellen können in alternativer Weise verwendet werden, in welchem Fall ein Baculovirus-Expressions-System angemessen sein kann. Als eine weitere Alternative können Zellen einer Säugerzelllinie, wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), transformiert werden. Ein Polypeptid, welches an einer, an zwei oder an drei der in 1 gezeigten Stellen glykosyliert ist, kann durch geeignete Wahl der Wirtszellkultur erhalten werden.
Das Polypeptid der Erfindung kann isoliert und gereinigt werden. Der N-Terminus des Polypeptids kann, aufgrund der Prozessierung des Translationsproduktes innerhalb einer Zelle oder während das Produkt aus einer Zelle sezerniert wird, heterogen sein. Deshalb kann eine Mischung von Polypeptiden gemäß der Erfindung mit unterschiedlichen N-Termini erhalten werden. Das Polypeptid ist löslich.
Die Polypeptide der Erfindung besitzen Aktivität zum Binden von humanem TNFα. Diese Aktivität weist auf die mögliche Verwendung der Polypeptide bei der Regulation von durch TNFα vermittelten Antwortreaktionen durch Binden und Sequestrieren von humanem TNFα hin, zum Beispiel auf eine mögliche Verwendung bei der Behandlung von Lungenerkrankungen, septischem Schock, HIV-Infektion, Malaria, viraler Meningitis, Transplantat-versus-Wirt-Reaktionen und Autoimmun-Erkrankungen, wie rheumatoider Arhritis.
Zu diesem Zweck kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst ebenfalls ein(en) pharmazeutisch annehmbaren(s) Träger oder Verdünnungsmittel.
Das Polypeptid der Erfindung kann an einen Patienten mittels jedweder herkömmlichen Route verabreicht werden. Die Entscheidung, ob eine orale Route oder eine parenterale Route, wie eine subkutane, intravenöse oder intramuskulare Verabreichung, gewählt wird; über die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Diese Faktoren schließen den Zweck der Verabreichung, das Alter und das Gewicht des behandelten Patienten und den Zustand des Patienten ein. Typischerweise wird das Polypeptid jedoch in einer Menge von 1 bis 1000 μg pro Dosis, stärker bevorzugt von 10 bis 100 μg pro Dosis für jede Verabreichungsroute verabreicht.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Es wird ein Referenzbeispiel angegeben.
REFERENZBEISPIEL
1. Materialien und Methoden
Reagenzien
Rekombinanter humaner TNFα und TNFβ wurden als aus E. coli abgeleitete hochgereinigte Proteine vorgesehen. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparationen lagen bei etwa 10⁷ Einheiten/mg, wie gemessen in dem Cytotoxizitäts-Assay mit L929-Mauszellen (4). Die synthetischen Oligonucleotide wurden durch den Oswel-DNA-Service (University of Edinburgh) hergestellt.
Isolation von TNFα-55kD-Rezeptor-cDNA-Klonen
Die Sequenz eines Peptidfragmentes (E M G Q V E I S S T V D R D T V C G (SEQ ID Nr.: 5)) des TNF-Bindeproteins wurde verwendet, um eine synthetische Oligonucleotidsonde (5' AAG GAG ATG GGC CAG GTT GAG ATC TCT TCT ACT GTT GAC AAT GAC ACT GTG TGT GGC-3' (SEQ ID Nr.: 6)) zu entwerten. Die 57-mer-DNA-Sonde wurde mit ³²P und T4-Polylnucleotidkinase (New England Biolab, Beverly, MA) markiert und verwendet, um eine Plazenta-cDNA-Bibliothek in gt10 zu screenen (5,6). Etwa 800 000 Phagen wurden auf Nitrocellulosefilter überführt und bei verminderter Stringenz gescreent (7). Filter wurden 2 Stunden bei 42°C in 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,5, 20% Formamid, 0,75 M Natriumchlorid, 0,075 M Natriumcitrat, 1% Polyvinylpyrrolidon (Sigma, St. Louis, MO), 1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon (Sigma, St. Louis, MO), 1% Ficoll, 1% Rinderserumalbumin (Sigma) und 50 ng/ml mit Ultraschall behandelter Lachsspermien-DNA (Sigma) inkubiert. Die radioaktiv markierte Sonde wurde dann den Filtern (10⁸ cpm/ml Endkonzentration) zugesetzt, welche 16 Stunden lang hybridisiert wurden. Die Filter wurden gründlich in 0,06 M Natriumchlorid, 0,006 M Natriumcitrat, 1% SDS bei 37°C gewaschen, und positive Klone wurden mittels Autoradiographie identifiziert. Zehn hybridisierende Klone wurden Plaque-gereinigt (5), und die cDNA-Insertionsgröße wurde mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese von EcoRI-verdauter Phagen-DNA bestimmt. Die Inserts von zwei cDNA-Klonen wurden unter Verwendung der Didesoxy-Kettenabbruch-Technik (8) sequenziert.
Southern- und Northern-Blot-Analyse
DNA wurde aus menschlichen Lymphozyten mittels des Verfahrens von Blin und Stafford (9) isoliert und für die Southern-Blot-Analyse (10) verwendet. DNA wurde mit Restriktionsendonuclease (New England Biolabs) verdaut, auf einem 1%igen Agarosegel fraktioniert und auf Nitrocellulose transferiert. Die Hybridisierung und das Waschen wurden unter stringenten Bedingungen (6) unter Verwendung einer ³²P-markierten Präparation eines 600 bp großen Fragmentes der TNF-Rezeptor-cDNA durchgeführt. Eine Northern-Blot-Analyse wurde (11) auf Oligo-dT-selektierter RNA durchgeführt, welche aus menschlicher Placenta, Milz (großzügigerweise von dem Cooperative Human Tissue Network, Birmingham, AL, zur Verfügung gestellt) und einer Fibroblasten-Zelllinie (293-Zellen) isoliert worden war. Im Anschluss an die Elektrophorese auf einem Formaldehyd-1,2%-igem Agarose-Gel wurde die RNA auf Nitrocellulose überführt und mit der TNFα-Rezeptor-DNA-Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Säugerzellexpression des humanen TNFα-55kD-Rezeptors und von Derivaten
Die codierende Region des Großteils des humanen TNFα-55kD-Rezeptors wurde als ein EcoRI-Fragment isoliert und in einen Säugerzell-Expressionsvektor (12) kloniert, was zum Plasmid prTNFR führte. Das EcoRI-Fragment codiert 374 Aminosäuren des TNF-Rezeptors; die 81 carboxyterminalen Reste der cytoplasmatischen Domäne fehlen deshalb bei dieser Plasmidkonstruktion. Ein Derivat des TNFα-Rezeptors wurde erzeugt, indem ein Terminationscodon direkt vor der Transmembrandomäne eingebaut wurde. Die Polymerasekettenreaktion(PCR)-Technik (13) wurde angewandt, um ein 300 bp großes Restriktionsfragment zu erzeugen, das eine BglII-Stelle am 5'-Ende und eine HindIII-Stelle, der ein TAG-Stoppcodon vorgeschaltet war, am 3'-Ende enthielt. Die PCR-Primer waren 5'GCTGCTCCAAATGCCGAAAG (SEQ ID Nr.: 7) und 5'AGTTCAAGCTTTTACAGTGCCCTTAACATTCTAA (SEQ ID Nr.: 8).
Das PCR-Produkt wurde über ein Gel gereinigt und in das TNF-Rezeptor-Expressionsplasmid (oben beschrieben), das mit BglII und HindIII verdaut worden war, kloniert. Die DNA-Sequenzierung bestätigte, dass das resultierende Plasmid (pTNFRecd) die entworfene DNA-Sequenz enthielt. E. coli, welcher pTNFRecd enthielt, wurde bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB, am 11. September 1990, unter der Zugangs-Nummer NCIMB 40315 hinterlegt.
Die TNFα-Rezeptor-Expressionsplasmide wurden in Affen-COS-7-Zellen unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL, Bethesda, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, kultiviert.
Analyse von rekombinanten TNFα-55kD-Rezeptor-Derivaten
TNFα wurde mittels der Iodogen-Methode (Pierce) gemäß den Anleitungen des Herstellers radioaktiv iodiert. Die spezifische Aktivität des ¹²⁵I-TNFα lag bei 10 bis 30 μCi/μg. COS-Zellen, die mit der TNFα-Rezeptor-cDNA (prTNFR, 1300-bp-EcoRI-Fragment) transfiziert waren, wurden 24 Stunden lang inkubiert und dann in Sechs-Loch-Gewebekulturplatten (Nunc) bei 4,5 × 10⁸ Zellen pro Vertiefung eingeimpft. Die Zellen wurden 48 weitere Stunden inkubiert, und dann wurde die Rezeptorexpression durch Radioligandenbindung während 2 Stunden bei 4°C quantifiziert. Die unspezifische Bindung von ¹²⁵I-TNFα wurde in Gegenwart eines tausendfachen molaren Überschusses von nicht-markiertem TNFα bestimmt. Bindungsdaten wurden mittels der Scatchard-Methode analysiert (14).
Das TNFα-Rezeptorderivat wurde bezüglich der Inhibierung der ¹²⁵I-TNFα-Bindung an den natürlichen Rezeptor auf humanen U937-Zellen analysiert. Der Kulturüberstand wurde 72 Stunden, nachdem COS-Zellen mit pTNFRecd transfiziert worden waren, geerntet. U937-Zellen (2 × 10⁸ Zellen in 200 μl) wurden mit 1 nM ¹²⁵I-TNFα und Verdünnungen von COS-Zellmedien 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann durch 20%ige Saccharose zentrifugiert, um ungebundenen TNFα zu entfernen. Eine nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM nicht-markiertem TNFα bestimmt.
Das TNFα-Rezeptor-Derivat wurde ebenfalls bezüglich der Inhibierung von zytotoxischen TNFα-Effekten in vitro analysiert. Das Zytotoxizitäts-Assay wurde so durchgeführt, wie es bei dem TNF-empfindlichen WEHI-164-Zelllinien-Klon 13 beschrieben wurde (15). Reihenverdünnungen von Überständen von COS-Zellen, die mit pTNFRecd transfiziert waren, oder pseudotransfizierten Kontrollen wurden mit einer konstanten Menge an TNFα (1 ng/ml) 1 Stunde lang bei 27°C vor Zugabe zum Assay inkubiert.
2. Ergebnisse
Isolierung und Charakterisierung der TNFα-55kD-Rezeptor-cDNA
Eine partielle Aminosäuresequenz des TNF-Bindungsproteins wurde verwendet, um eine synthetische Oligonucleotidsonde zu entwerfen. Die radioaktiv markierte Sonde wurde verwendet, um eine humane Plazenta-cDNA-Bibliothek in Lambda-gt10 zu screenen, und zehn hybridisierende Phagen wurden isoliert. Die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des längsten cDNA-Klons sind in 1 dargestellt. Das dritte potentielle ATG-Initiationscodon tritt bei Position 156 der Nucleotidsequenz auf; auf die ersten zwei ATG-Codons folgen dicht Terminationscodons, und dem dritten ATG gehen die besten Translationsinitiations-Konsensus-Nucleotide voran (16). Die cDNA codiert ein offenes Leseraster von 1365 Basen, welches für ein Polypeptid mit 455 Resten codiert. Beide der Peptidsequenzen, die durch die Aminosäuresequenzierung bestimmt wurden, wurden in der codierten cDNA identifiziert (17 von 19 und 18 von 19 passende Reste). Das für das TNF-Bindungsprotein identifizierte Amino-terminale Ende entspricht der von der cDNA codierten Sequenz, beginnend am Rest 41. Die ersten 35 Aminosäuren sind im allgemeinen ziemlich hydrophob und stellen wahrscheinlich eine Signalsequenz dar. Die Reste 35–40 sind stark geladen (DREKR (SEQ-ID-Nr.: 9)), und eine solche Sequenz wird typischerweise nicht in sekretorischen Signalsequenzen gefunden (17); vielleicht wird der natürliche Rezeptor durch Proteolyse nach dem Rest 40 prozessiert, welcher eine dibasische Spaltungsstelle enthält (KR). Die Hydropathie-Analyse der Proteinsequenz sagt eine einzelne Transmembrandomäne von 23 Aminosäuren voraus. Diese hydrophobe Sequenz teilt das Protein in eine extrazelluläre Domäne von 171 Resten und eine zytoplasmatische Domäne von 221 Resten. Die für das TNF-Bindungsprotein bestimmte Aminosäurezusammensetzung entspricht gut der vorausgesagten Zusammensetzung der von der cDNA codierten extrazellulären Domäne (Ergebnisse nicht gezeigt). Der Unterschied zwischen der vorausgesagten Rezeptorgröße (40 000 Dalton) und der durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese be stimmten Größe (65 000 Dalton, 18–20) ist wahrscheinlich durch Glykosylierung bedingt; es gibt vier potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen in der Sequenz, wobei sich drei davon in der extrazellulären Domäne befinden. Die Sequenz enthält eine große Anzahl (17) von Cysteinresten, wobei 24 davon in der extrazellulären Domäne vorliegen. Die Anordnung dieser Cysteinreste ähnelt derjenigen von mehreren anderen Zelloberflächen-Proteinen, was nahelegt, dass der TNF-Rezeptor strukturell zu einer Familie von Rezeptoren verwandt ist.
Eine Northern-Blot-Analyse ist in 2 dargestellt. Die ³²P-markierte cDNA hybridisierte an eine einzelne vorherrschende Bande von Oligo-dT-selektierter RNA aus humaner Plazenta oder Milz. Ein nebenrangiges größeres Transkript wurde ebenfalls in RNA aus einer Fibroblasten-Zelllinie festgestellt. Die Größe der hybridisierenden Spezies beträgt 2400 Basen, was in guter Übereinstimmung mit der Größe von isolierter cDNA steht. Des weiteren wird in der 2 ein Southern-Blot von humaner genomischer DNA gezeigt, die mit einer 600 bp großen Sonde aus der cDNA hybridisiert wurde. In jedem der drei unterschiedlichen Restriktionsverdaus wurde nur ein einzelnes Hybridisierungssignal beobachtet. Somit scheint der TNF-Rezeptor, den wir isoliert haben, durch ein einzelnes Gen codiert zu sein.
Expression von rekombinanten TNF-Rezeptorsequenzen in Säugerzellen
Um zu bestätigen, dass die in 1 gezeigte cDNA tatsächlich den TNF-Rezeptor codiert, wurde die cDNA für die Expression in Säugerzellen manipuliert. Die cDNA enthält eine EcoRI-Stelle an der Position 1270 von 1. Die für den Rezeptor codierende Sequenz wurde als ein 1300 bp großes EcoRI-Fragment (das alle bis auf die letzten 81 Codons der zytoplasmatischen Domäne enthielt) isoliert und in einen Säugerzell-Expressionsvektor, der einen Cytomegalovirus-Promotor und SV40-Transkriptionsterminationssequenzen enthielt, inseriert (12). Das resultierende Plasmid wurde in COS-Zellen transfiziert, welche nach drei Tagen hinsichtlich der Expression des TNF-Rezeptors analysiert wurden. Wie in 3 gezeigt, hatten die transfizierten Zellen spezifisch radioaktiv iodiertes TNFα in einer gesättigten und dosisabhängigen Weise gebunden. Die Population von COS-Zellen exprimierte etwa 1 × 10⁸ Rezeptoren pro Zelle. Die gemessene Bindungsaktivität der rekombinanten Rezeptoren betrug 2,5 × 10⁹ M^–1 bei 4°C, was in enger Übereinstimmung zum natürlichen Rezeptor auf menschlichen Zellen ist (19, 20). Die Bindung von ¹²⁵I-TNFα (1 nM) an diese Zellen konnte durch die Zugabe von nicht-markiertem TNFα oder Lymphotoxin inhibiert werden (3b). COS-Zellen, die lediglich mit dem Expressi onsvektor transfiziert waren, banden nicht signifikant ¹²⁵I-TNFα (weniger als 2% der Bindung, welche bei der cDNA-Transfektion zu sehen war).
Die extrazelluläre Domäne des TNF-Rezeptors wird natürlicherweise von den Zellen abgeworfen. Um ein ähnliches rekombinantes Derivat herzustellen, wurde ein Stoppcodon, das der Transmembrandomäne vorausgeht, mittels PCR-Mutagenese in die cDNA eingebaut. Die modifizierte DNA wurde in das Expressionsplasmid inseriert und anschließend in COS-Zellen transfiziert. Nach drei Tagen wurden die COS-Zellmedien bezüglich der Inhibition der TNFα-Bindung an humane U937-Zellen getestet. Wie in 4a gezeigt, inhibierten die Medien der transfizierten Zellen bis zu 70% der Bindung von TNFα. Das rekombinante TNF-Rezeptor-Derivat wurde als nächstes bezüglich der Inhibierung der biologischen TNFα-Aktivität getestet. Ein empfindlicher Bioassay für TNFα ist die Messung der Zytolyse von Maus-WEHI-164-Zellen (Klon 13). Die Medien der transfizierten Zellen inhibierten 60% der TNFα-Zytotoxizität bei dieser Zelllinie (4b). Medien von pseudotransfizierten COS-Zellen inhibierten nicht die durch TNFα induzierte Zytotoxizität oder Bindung. Diese Experimente zeigen, dass die rekombinante extrazelluläre Domäne des TNF-Rezeptors in der Lage ist, TNF zu binden und seine biologische Aktivität zu inhibieren.
BEISPIEL 1: Expression von Polypeptid, das im wesentlichen aus den ersten drei cysteinreichen Subdomänen der extrazellulären Bindungsdomäne des 55kD-Rezeptors besteht
1. MATERIALIEN UND METHODEN
Reagenzien
Von E. coli abgeleiteter rekombinanter humaner TNFα besaß eine spezifische Aktivität von 2 × 10⁷ U/mg in einem L929-Zytotoxizitätsassay. Oligonucleotide wurden von Oswel DNA Service (Universität Edinburgh) erworben.
Erzeugung der rekombinanten löslichen TNFR-Derivate
Die Deletion jeder der Subdomänen in dem rekombinanten löslichen TNFR wurde mittels PCR-Fragment-Verknüpfung und PCR-Mutagenese erreicht. Die Sequenz der in diesen Experimenten verwendeten Oligonucleotide ist in Tabelle 1 angeführt, und ihre Lokalisierungen in bezug auf die vier cysteinreichen Subdomänen ist in 5 gezeigt. Die vier Subdomänen sind in bezug aufeinander in 6 aufgereiht.
Das Plasmid pTNFRecd (Referenzbeispiel) ist in der 7 gezeigt. pTNFRecd wurde ferner modifiziert, um untranslatierte 5'-Sequenzen durch Klonierung des ClaI/BglII-verdauten Produktes einer PCR unter Verwendung der Oligos 5'Cla und IIIA in ClaI/BglII-verdauten pTNFRecd zu entfernen, wodurch man 5'-ΔCla erhielt. Der Verdau von 5'-ΔCla mit Pst-1 und erneute Ligation führten zu der Erzeugung von pΔII, welchem die zweite cysteinreiche Subdomäne fehlte (9). Die vierte cysteinreiche Subdomäne wurde entfernt durch Klonierung des BglII/HindIII-verdauten Produktes einer PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 5A und 4D in BglII/HindIII-5'-ΔCla; dies führte ein Terminationscodon nach Aminosäure 167 ein (gezählt von dem Anfangs-Methionin), wodurch man pΔIV erhielt (11). Die Konstrukte pI (8) und pΔIII (10), welchen die erste bzw. dritte cysteinreiche Subdomäne fehlte, wurden erzeugt durch Verknüpfen von PCR-Fragmenten mit Hilfe von in die für die PCR verwendeten Primer eingeführten Überhängen. Die über ein Gel gereinigten Produkte von PCRs unter Verwendung von 5' Cla und IA und IB und 5D wurden gemischt und einer weiteren Amplifizierung unter Verwendung von 5' Cla und 5D als Primer unterzogen. Das resultierende Fragment wurde mit ClaI und BglII verdaut und in ClaI/BglII-verdauten pTNFRecd kloniert, wodurch pΔI erhalten wurde.
In ähnlicher Weise wurden die gelgereinigten Produkte von PCRs unter Verwendung von 5' Cla und IIIA und IIIB und 5D gemischt und einer weiteren Amplifizierung unter Verwendung von 5' Cla und 5D als Primer unterzogen. Dieses Produkt wurde mit BglII und HindIII verdaut und in BglII/HindIII-geschnittenen 5'-ΔCla kloniert, um pΔIII zu erhalten. In allen Fällen wurden die klonierten Derivate durch Restriktionsenzym-Analyse und DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemical Corporation) analysiert.
Tabelle 1: Struktur der mutagenen Oligonucleotide
Analyse von rekombinanten löslichen TNFR-Derivaten
COS-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium, das 5% fötales Kälberserum enthielt, gehalten. Die löslichen TNFα-Rezeptor-Derivate wurden in Affen-COS-Zellen mit Hilfe von Lipofectin (GIBCO-BRL, Bethesda MD) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert, und zellfreie Überstände wurden 72 Stunden nach der Transfektion abgeerntet.
Inhibition der TNFα-Aktivität
Die löslichen TNFα-Rezeptor-Derivate wurden bezüglich der Inhibition der zytotoxischen TNFα-Aktivität in vitro analysiert. Der Zytotoxizitätsassay wurde durchgeführt, wie es bezüglich der TNFα-empfindlichen Zelllinie WEHI 164, Klon 13, beschrieben wurde. Reihenverdünnungen von Überständen von COS-Zellen, die mit mutanten Rezeptoren transfiziert waren, oder pseudotransfizierten Kontrollen wurden mit einer konstanten Menge an TNF (1 ng/ml) 1 Stunde lang bei 37°C vor Zugabe zu dem Assay inkubiert.
2. ERGEBNISSE
Um mehr über den Beitrag der einzelnen cysteinreichen Subdomänen zu der Bindung von TNFα durch die lösliche Form des 55kD-TNF-Rezeptors zu verstehen, entfernten wir jede Subdomäne mittels PCR-Mutagenese (5). COS-Zellen wurden mit jedem dieser Konstrukte transfiziert, und die Überstände wurden hinsichtlich ihres Vermögens getestet, die zytotoxische Aktivität von TNFα zu inhibieren. Die Tafel A von 12 zeigt, dass konditioniertes Medium von COS-Zellen, die mit pTNFRecd transfiziert waren, TNFα, wie vorstehend beschrieben, inhibiert. Die Entfernung der vierten cysteinreichen Subdomäne führte zu einem Protein, welches, ähnlich zu TNFRecd, ein potenter Inhibitor von TNFα war (12, Tafel B). Die Mutanten, welchen die erste, zweite und dritte Subdomäne fehlte, zeigten keinerlei inhibitorische Aktivität in dem TNFα-Zytotoxizitätsassay.
BEZUGSTELLEN

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Polypeptid, welches in der Lage ist, an Human-TNFα zu binden und aus folgendem besteht: (a) der Aminosäuresequenz der ersten drei Cystein-reichen Subdomänen der extrazellulären Bindungsdomäne des 55 kD-Rezeptors für Human-TNFα; oder (b) einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90% oder mehr mit der Sequenz (a); wobei es dem Polypeptid an der vierten Cystein-reichen Subdomäne des Rezeptors mangelt.
Polypeptid, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
Polypeptid, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
DNA-Molekül, welches ein Polypeptid codiert, wie in mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche definiert.
DNA-Molekül, welches ein Polypeptid codiert, wie in Anspruch 3 definiert, und welches die folgende Sequenz aufweist:
DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 oder 5, welches ferner eine 5'-Sequenz aufweist, die eine Signal-Aminosäuresequenz codiert.
DNA-Molekül, welches ein Polypeptid codiert, wie in Anspruch 2 definiert, und welches die folgende Sequenz aufweist:
DNA-Molekül gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 7, welches ein Vektor ist, der das Polypeptid exprimiert, wenn er in einem geeigneten Wirt vorgesehen wird.
Vektor gemäß Anspruch 8, welcher ein Plasmid ist.
Wirt, der mit einem Vektor, wie in Anspruch 8 oder 9 beansprucht, transformiert ist.
Wirt gemäß Anspruch 10, welcher eine Säuger-Zelllinie ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Verfahren das Kultivieren eines transformierten Wirts, wie in Anspruch 10 oder 11 beansprucht, unter solchen Bedingungen umfasst, dass das Polypeptid exprimiert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein(en) pharmazeutisch annehmbaren(s) Träger oder Verdünnungsmittel und, als einen aktiven Hauptwirkstoff, ein Polypeptid, wie in Anspruch 1 beansprucht.
Polypeptid, wie in Anspruch 1 definiert, zur Verwendung bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis.