JPH03130084A - トレハロースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は医薬品の安定剤、食品加工分野で広い用途を持
つトレハロースの製造法に関する。

トレハロースは酵母、かび、海産動物、海草等の天然物
中に広く分布する三糖類である。従来この物質を得る方
法としては、上記天然物から抽出する方法、またはアー
スロバフタ−（ＡｒｔｈｒＯｂａＣｔｅｒ）属に属する
微生物［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル
・ケミス１−リ−３３１９０，・（１９６９）　］やノ
カルヂア（ＮＯＣａｒｄｉａ）属に属する微生物（特開
昭５Ｏ−１５４４８５）等の微生物の発酵による方法が
知られている。しかし、これらの方法は、大量生産が困
難であるかまたは医薬品、食品として安全に利用できる
までに精製して得ようとれば、操作が複雑となりかつ設
備も大規模なものが必要で、多大のエネルギーが必要と
される。

マルトースを原料とし、マルトースホスホリラーゼおよ
びトレハロースホスホリラーゼなどの酵素を利用してト
レハロースに転換する方法（特開昭５８−２１６６９５
）も知られているが、酵素の調整等にもコストがかかり
、現在トレハロースを安価にしかも大量に生産する方法
は確立されていない。

課題を解決するための手段 本発明者らは、このような事情に鑑み、工業的に有利な
トレハロースの製造法について種々検討を重ねていたと
ころ、バリダマイシンまたはその誘導体を添加した培地
を用いてトレハロースを生産する能力を有する微生物、
特にリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　）属菌ま
たはスクレロチウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）属菌を培養
すると、驚くことにトレハロースの生産量が顕著に向上
することを見いだした。バリダマイシンとその誘導体が
このようなトレハロース生産促進効果を示すことは未だ
知られておらず、本発明者らはこの現象に付いて鋭意検
討を重ねた結果、工業的有利にトレハロースを製造する
方法を確立した。

すなわち本発明は、トレハロースを生産する能力を有す
る微生物を培養してトレハロースを生産させるに際し、
培地中にバリダマイシンまたはその誘導体を添加するこ
とを特徴とするトレハロースの製造方法に関する。

本発明方法で用いられる微生物は、好ましくはトレハロ
ースを生産する能力を有するリゾクトニア属またはスク
レロチウム属に属する微生物及びその変異株である。

本発明において用いられるリゾクトニア（ＲｈｉｚＯＣ
ｔＯｎｉａ　）属菌としては、たとえば、リゾクトニア
　ソラニ　ＡＧ−１（寄託番号ＩＦＯ−３０４６５〉、
リゾクトニア　ソラニ　ＡＧ−２−２（北海道大学２−
２Ｉ［ＩＢ）　、リンク１ヘニア　オリザエ（農水省、
農技研Ｃ−３０１）等、また、スクレロチウム（Ｓｃｌ
ｅｒｏｔｉｕｍ）属菌としては、たとえば、スクレロチ
ウム　オリザエー゛昔ナチバエ（同、農技研Ｃ−３４４
）、スクレロチウム　フミガツム（同、農技研Ｃ−１４
６）、スクレロチウム　ヒドロフィルム（寄託番号ＩＦ
Ｏ−５２９３〉等が挙げられる。

本発明方法に用いられるバリダマイシンは、農業用抗生
物質として広く用いられており、その構造はバリドキシ
ルアミンとＤ−グルコースとから成り立っている。

本発明方法で用いられるバリダマイシンおよびその誘導
体は、例えば一般式（Ｉ） ［式中、Ｒ１およびＲ３は同一または異なって水素原子
または水酸基を、Ｒ２は水素原子またはＤ−グルコピラ
ノシル基を、Ｒ４は水素原子、Ｄ−グルコピラノシル基
またはＤ−グルコピラノシル−〇−グルコピラノシル基
を、Ｒ５は一般式（Ｉ）Ｒ７゜ （Ｒ６およびＲ７は同一または異なって水素原子または
Ｄ−グルコピラノシル基を示す）で表わされる置換基を
示す］で表わされる化合物または（１３）−（１，４，
６１５）−３−ヒドロキシメチル−４，５，６−ドリヒ
ドロキシー２−シクロヘキシル　アミンが好ましい。

上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物のうち、さらに好
ましくは表−１で表わされる化合物である。

これらはそれぞれ単独で用いてもよいし、二種類以上を
同時に使用することもできる。

本発明においては、たとえばバリダマイシンまたはその
誘導体を精製シずに、バリダマイシン生産菌の培養物あ
るいはその処理物を本発明方法に用いる培地に添加して
もよい。

培地に添加するバリダマイシンまたはその誘導体の量は
、用いる微生物の生育を抑制しない範囲で選択すればよ
く、培地全体に対して通常的Ｏ０○○０００１〜０．０
１％（Ｗ／■）、好ましくは約０．００００１〜Ｏ９Ｏ
○２％（Ｗ／）の範囲が効果的である。

培地への添加法としては、予め培地に添加しておくのも
よいが、培養途中に間欠的に添加してもよく、また連続
的に添加してもよい。

培養に用いられる培地の栄養源としては、該菌株が利用
し得る炭素源、窒素源、無酸塩類、有機酸塩、および微
量栄養素が用いられる。

炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガ
ラクトース、マンノース、マルトース、シュークロース
、ラクトース、グリコーゲン、ペクチン、でんぷん等が
用いられ、該菌株が利用し得る炭素源であれば制限され
るものではない。

窒素源としては、例えば、各種アンモニウム塩ＦＡ（硫
安、硝安、塩安、燐安）、コーンスチーブリカー（以下
Ｃ８Ｌと称することもある）、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス、乾燥Ｖｆ母、大豆粉。

綿実粕、尿素等の無機または有機の窒素含有物が挙げら
れる。

また無機塩類としてはカリウム、ナトリウム。

カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバル１〜
．亜鉛、銅および燐酸の塩類が用いられる。

微量栄養素としてはパンミルテン酸、ビオチン。

チアミン、リボフラビンは勿論のこと、その他のビタミ
ン類、Ｌ−システィン、Ｌ−グルタミン酸が化合物とし
て、または、それらを含む物として天然物が適宜用いら
れる。

以上の培地成分は、予め培地に全量を加えておくのもよ
いが、一部をまたは全量を間欠的にまたは連続的に培養
液に加えてもよい。

培養の手段は、静置培養でも、振盪培養あるいは通気攪
拌培養法等を用いてもよい。

培養条件は、勿論菌株の種類、培地の組成、その他によ
っても異なり、要するに目的物が最も効率良く生産され
る様に個々の場合に応じて選択すればよい。例えば、培
養温度は約２５〜３５°Ｃにて行なうのがよく、培地の
ｐＨは５〜９程度が望ましい。

以上の様な条件で２〜１０日間程度培養することにより
、培地中にトレハロースが最高濃度に蓄積される。尚こ
の場合培地のｐＨが低下するのが一般的であるので、適
当な塩基物質、例えば苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニ
アを添加して、常に微生物のトレハロース生成に最も適
したｐＨに保持するのもよく、また培地に適当な緩衝剤
を添加しておいて最適のｐＨが維持される様にするのも
よい。

このようにして培養した菌体中に蓄積されたトレハロー
スは、その性状を利用したそれ自体公知の方法で分離精
製することができる。

分離・精製の方法としては、たとえば、必要に応じて乾
燥菌体を粉砕し、約１０％（Ｗ／Ｖ）トリクロロ酢酸水
溶液で数時間抽出する。濾過して残ざを除去し、クロロ
ホルムとエーテルで脂質およびトリクロロ酢酸を除去す
る。その後イオン交換カラムを通しイオン性物質を除去
して、蒸発乾固させる。これをアセトニトリルまたはこ
れと適当な溶媒（例、水、エチルアルコール、アセトン
等）の混合液に溶かし、クロマトグラフィー（例、シリ
カゲルクロマトグラフィー等）を用いてトレハロースを
分離する。

発明の効果 本発明によれば、１〜レバロースを容易かつ大量に製造
することができる。

実施例 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
。尚、培地の％は特に記載のない限り、重＠／容量％（
Ｗ／Ｖ％）を示す。接種源を培養した培地は特に記載の
ない限りジャガイモせん汁寒天培地（ジャガイモ２００
ｑ、蔗糖３０Ｑ、粉末酵母エキス２ｇ、寒天２０Ｃｌ、
ｆｌＲイオン水１０ＱＱｍｌ、ＰＳＡ培地と略称）であ
る。また、トレハロースの定量は以下に示す条件下、高
速液体クロマトグラフィー法によって行った。

高速液体クロマトグラフィー（口ＰＬＣ）測定条件 使用機器：　ＬＣ−６Ａ　（島津製作所〉カラム　：　
Ｓｈｉｍ−１）ａＣｋ　ＣＬＣ−Ｎｌ２（アミノプロピ
ル基５μｍ、島津製作所） 流速　　：　１　、　Ｏｍｌ／ｍｉｎ。

移動相　ニア０％アセトニトリル 検出器　：示差屈折計 保持時間ニドレバロース：　１２．５ｍ１ｎ。

実施例１゜ ツアペック液体培地（蔗糖３０ｇ、　硫酸マグネシュウ
ム０．５ｃ＋、硝酸ナトリウム２ｇ、燐酸二カリウムＩ
ＣＩ、硫酸鉄０．０１Ｑ、脱イオン水１０ｏ　Ｑｍｌ　
＞の蔗糖をぶどう糖に改変した培地１００ｍ１を２００
ｍ１容フラスコに分注し、１１５°Ｃで１５分間滅菌し
た。このフラスコにＰＳＡ　（ポテト−シュクロース−
アガー）寒天培地で２８℃２日間培養したりジフトニア
　ソラニＡＧ−’Ｉ　（寄託番号ＩＦＯ−３０４６５＞
の菌そう片（コルクポーラ−で打ち抜いたもの、直径１
ｃｍ）を植菌し、２８°Ｃで４日間振盪培養した。

培養液には最初からバリダマイシンＡを０．０００５％
添カロしたものと無添加のものを調整した。

このように培養して得られた菌体を上記方法で単離精製
し定量した。その結果、第１表に示すようにバリダマイ
シンＡを添加した場合は無添加の場合に比較し菌体中の
１〜レバロースが顕著に増加した。

第１表 トレハロース生産に及ぼす バリダマイシンＡの影響 実施例２゜ ツアペック液体培地１００ｍ１を２００ｍ１容フラスコ
に分注し、１１５°Ｃで１５日間滅菌した。このフラス
コにＰＳＡ寒天培地で２８°Ｃ２日間培養したりジフト
ニア　ソラニＡＧ−１（寄託番号ＩＦＯ−３０４６５＞
の菌そう片（コルクポーラ−で打ち抜いたもの、直径１
ｃｍ）を植菌し、２８°Ｃで５日間振盪培養した。培養
液には最初からバリダマイシンＡを０．０００５％添加
したものと添７ＪＯしないものを調整した。このように
培養して得られた菌体を上記方法で単離精製し定量した
。その結果、第２表に示すようにバリダマイシンＡを添
加した場合は無添加の場合に比較し菌体中のトレハロー
スが顕著に増加した。

第２表 トレハロース生産に及ぼす バリダマイシンＡの影響 実施例３゜ ツアペック液体培地の蔗糖をぶどう糖に改変した培地’
１００ｍ＋を２００ｍ１容フラスコに分注し、１１５℃
で１５分間滅菌した。このフラスコにＰＳＡ寒天培地で
２８°Ｃ２日間培養したりジフトニアソラニＡＧ−１（
寄託番号ＩＦＯ−３０４６５＞の菌そう片（コルクポー
ラ−で打ち抜いたもの、直径１Ｃｍ）を植菌し、２８°
Ｃで４日間振盪培養した後バリダマイシンＡを０−０．
０００５％添加し、さらに２日間培養した。このように
して得られた菌体を上記方法で単離精製し定量した。そ
の結果、第３表に示すようにバリダマイシンＡ添加はい
ずれの濃度でも無添加に比較し国体中の１−レバロース
が顕著に増加した。

第３表　トレハロース生産に及ぼす バリダマイシンＡの影響 実施例４゜ ツアペック液体培地の蔗糖をぶどう糖に改変した培地１
００ｍ１を２００ｍ１容フラスコに分注し、１１５°Ｃ
で１５分間滅菌した。このフラスコにＰＳ八へ天培地で
２８℃２日間培養した第４表中の菌の菌そう片（コルク
ポーラ−で打ち抜いたもの、直径１ｃｍ）を植菌し、２
８℃で６日間振盪培養した。ついでこれにバリダマイシ
ンＡをｏ、ｏｏ。

５％添加し、さらに２日間培養した。また同様にしてバ
リダマイシンＡを添加ぼずに２日間培養した。このよう
にして得られた菌体を上記方法で単離精製し定量した。

その結果、第４表に示すようにバリダマイシンＡ添加に
よりいずれの菌においても無添加に比較し菌体中の１〜
レバロースが増加した。

第４表 菌核病菌のトレハロース生産 に及ぼすバリダマイシンＡの影響 ＊■リゾクトニア ソフニ Ｇ−１ （寄託番号ＩＦＯ ３０４６５） ■リゾクトニア　ソラニ　ＡＧ−２−２（北海道大学　
２−２１１ＩＢ） ■リゾクトニア　オリザエ 〈農水省、農技研Ｃ−３０１） ■スクレロチウム　オリザエーサチバエ（農水省、農技
研Ｃ−３４４＞ ■スクレロチウム　フミガツム （農水省、農技研Ｃ−１４６） 実施例５゜ ツアペック液体培地の蔗糖をぶどう糖に改変した培地１
００ｔｔｌｌを２００ｍ１容フラスコに分注し、１１５
℃で１５分間滅菌した。このフラスコにＰＳＡ寒天培地
で２８℃２日間培養したりジフトニアソラニへＧ−１（
寄託番号ＩＦＯ−３０４６５＞の菌そう片（コルクポー
ラ−で打ち抜いたもの、直径’１ｃｍ）を植菌し、２８
℃で６日間振盪培養した。ついでこれにバリダマイシン
八をｏ、ｏｏ。

５％添加したものと添加しないものを調整し、さらに２
日間Ｐｉ養した。このようにして得られた菌体を上記方
法で単離精製し定量した。その結果、第５表に示すよう
にバリダマイシンＡおよびバリダマイシンＢ添加は無添
加に比較し菌体中のトレハロースが顕著に増加した。

第５表 トレハロース生産に及ぼす バリダマイシンＡおよび バリダマイシンＢの影響

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）トレハロースを生産する能力を有する微生物を培
   養してトレハロースを生産させるに際し、培地中にバリ
   ダマイシンまたはその誘導体を添加することを特徴とす
   るトレハロースの製造法。
2. （２）トレハロースを生産する能力を有する微生物がリ
   ゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属に属する微生
   物である請求項（１）記載の製造法。
3. （３）トレハロースを生産する能力を有する微生物がス
   クレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）属に属する微生
   物である請求項（１）記載の製造法。