JP3659985B2 - トレハラーゼ及び該酵素を用いた糖類の製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規のトレハラーゼ及び該酵素を用いた糖類の製法に関し、より詳細には、クロレラ科ロボスファエラ属藻類由来の新規なトレハラーゼ及び該酵素を用いてトレハロース、２，２’−ジデオキシ−α，α’−トレハロース（以下２，２’−ジデオキシトレハロースという）及び２−デオキシ−α，α’−トレハロース（以下２−デオキシトレハロースという）を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、２分子のＤ−グルコースがα，α’−１，１’結合した非還元性２糖類の一種である。昆虫類では血液やリンパ液中にあり、運動エネルギー源のための貯蔵血糖として存在する。また不凍剤としての効果を有する場合もあり、昆虫は季節により、その濃度を調節して耐寒性を得ると言われている。
【０００３】
トレハラーゼは、トレハロースを２分子のグルコースに加水分解する酵素である。この酵素は、高等動物（ラット小腸、ブタ小腸など）、昆虫（カイコ等）、微生物等に分布している。トレハラーゼを生産する微生物としては、マイコバクテリウム属（Methods in Enzymology, (1972) 28, 996 ）、ストレプトマイセス属（J. Bacteriol., (1968) 96, 105 ）などの細菌及び放線菌、サッカロマイセス属（J. Biol. Chem., (1964) 239, 1671）等の酵母、あるいはアスペルギルス属（J. Bacteriol., (1966) 91, 1883）、ノイロスポラ属（J. Bacteriol., (1973) 115, 582）、フミコーラ属（Biochim. Biophys. Acta., (1978) 525,162)、フィコマイセス属（Biochim. Biophys. Acta., (1975) 391, 154) 等の糸状菌等が知られている。これはいずれも菌体内もしくは胞子内にトレハラーゼを含有している。その他、菌体外にトレハラーゼを生産する微生物としては、トリコデルマ属（Can. J. Microbiol., (1978) 24, 1280)やケトミウム属（特公昭６０−２２９１７号公報）が報告されている。しかし、緑藻類由来のトレハラーゼに関する報告はない。
【０００４】
トレハロースの用途としては、新規食品素材として、低う蝕性、抗う蝕性、かつビフィズス菌増殖促進作用を有する甘味料としての応用（特開昭６３−２４０７５８号公報）が提案されている。また、水分を有する食品原料や飲料に所定量のトレハロースを添加すると、食品原料や飲料の蛋白質の変性が抑制できること（特表平２−５０３８６４号公報）も報告されている。さらに、医薬品の分野では、タンパク質保護剤として、酵素標識抗体を長期保存させて、酵素活性の低下を抑制するためにトレハロースを添加する方法が報告されている（特開昭６０−１４９９７２号公報）。また、細胞の安定保存性を高めたり、ワクチンの安定化に使用する例や、トレハロース誘導体を抗がん剤として使用する報告例もある（特開昭６２−１７４０９４号公報）。例えば、２−デオキシグルコースにおける生理活性は、グルコースやマンノースの代謝拮抗物質として、糖タンパク質や糖脂質の連鎖形成を障害することにより、遷移芽細胞などの成育を阻害し、抗癌作用があることが知られている。
【０００５】
トレハロースの製造法としては、微生物の菌体内及び菌体外にトレハロースを蓄積させる方法の他、酵素反応により、インビトロで生成させる方法がある。微生物による生産法としては、多量にトレハロースを含有するパン酵母から得る方法が一般的である。例えば、圧搾酵母を９５％（Ｖ／Ｖ）エタノールで抽出して、トレハロースを得たり（J. Am. Chem. Soc., (1950) 2059）、パン酵母を９０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで抽出してトレハロースを得る方法（農化第２７巻，(1953) 412）が知られている。酵素法としては、マルトースにマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼを作用させて、トレハロースを製造する方法が報告されている（特公昭６３−６０９９８号公報）。
【０００６】
２，２’−ジデオキシトレハロース及び２−デオキシトレハロースの製造法としては、化学的に合成する方法（Nouveau Journal De Chimie., (1980) 4, 59) 及び酵母の代謝を利用する方法（Biochimica et Biophysica Acta., (1984) 803,284及びBiochimica et Biophysica Acta., (1969) 184, 77）がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記したような既知の、あるいは市販のトレハラーゼにおいては、微生物が産生する単位数が低く、グルコースからトレハロースへの逆反応による縮合反応率が極めて低いといった問題があった。
特に、トレハロースを、パン酵母からの抽出により得る方法では、多量の有機溶媒を必要とするとともに、夾雑物を取り除くために複雑な工程を必要とする。また、酵素を使用する方法として知られているマルトースにマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼを作用させてトレハロースを製造する方法でも、製造工程が複雑であるとともに、マルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼの酵素の製造に多大な経費と手間がかかるなど問題点が非常に多い。
【０００８】
さらに、菌体外のトレハロースを精製する方法もある（特開平５−２１１８８２）が、いずれの方法を採用しても製造経費が高くなり、よってその用途が限定されてしまう。
また、化学的合成法による２，２’−ジデオキシトレハロース及び２−デオキシトレハロースの製造にあっては、工程が煩雑で、製造歩留りが低く、酵母の代謝による製法においても、産生量も低く、かつ精製工程が複雑であるという問題があった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、トレハラーゼを生産する微生物を自然界に広く求めて検索した結果、緑藻植物門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属の緑藻類に属すると認められる新株が、目的にかなうトレハラーゼを高力価に産生することを見出した。さらにこの酵素は、従来から報告されているトレハラーゼに比べて熱安定性の高い性質を有することを見いだし、本発明に至った。
【００１０】
本発明のトレハラーゼは、緑藻門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属の微細藻類で産生され、その培養物から単離することができるものであり、以下の特性、（１）α，α’−トレハロース、２，２’−ジデオキシ−α，α’−トレハロースおよび２−デオキシ−α，α’−トレハロースを、それぞれの構成糖に加水分解するが、ネオトレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、スクロースには作用しない、（２）至適ｐＨがｐＨ５〜６であり、（３）至適温度が６５℃であり、（４）６５℃まで熱安定性を有し、（５）ゲル濾過法により測定した分子量は、４００，０００〜５００，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法によるサブユニットの分子量は１８０，０００〜２５０，０００であり、（６）焦点電気泳動により測定した等電点は２．７であり、（７）糖タンパクである、
を有する。
【００１１】
本発明者らは、大阪府八尾市の土壌から採取した藻体が、以下に示した形態学的性質及び培養的性質等を有することから、Komarek, J. & Fott, B. Chlorophyceae. In Huber - Pestalozzi (ed.) (1983) 1044 等を参考文献として、クロレラ科の各属種の藻体（保存株）と比較、同定を試みた。その結果、本藻体は、ロボスファエラ属チロレンシス（Lobosphaera tirolensis）にも類似するが、すでに発表されたものにおいて完全に一致しないため、本発明の藻体を、ロボスファエラ属の新種もしくは新変種と考え、ロボスファエラ属ＴＭ−３３と命名した。この藻体は、ＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号 75630;1993 年 12 月 21 日）。本発明は、ロボスファエラ属ＴＭ−３３の野性株、変種及び同属で、上記の特質を有するトレハラーゼを産生する能力を有する藻体を含有する。なお、変種としては、自然に生じる変種及び公知の手段、例えば、ラジオアイソトープ照射、紫外線照射、ニトロソグアニジン、その他化学処理などの常法、さらに遺伝子組み換えにより酵素産生能を高める処理を施した人工的に生じる変種を包含するものである。
【００１２】
（１）形態学的性質
ボールドの基本培地（Bold's Basal Medium,以下ＢＢＭという）の寒天培地で、２週間培養後、光学顕微鏡を使用して観察した結果、本藻体は、深い切れ込みのあるカップ状の葉緑体を持っていた。また明確なピレノイドは観察されなかった。
（２）培養的性質
ＢＢＭの培地では４日目より増殖が確認された。また、普通寒天培地では１日後より増殖が確認された。図１に、本藻体の顕微鏡写真を示す。
本発明のトレハラーゼを産生する緑藻門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属の藻体は、独立栄養状態でも生育するが、従属栄養状態の方が生育速度も大きく、トレハラーゼ生産量も多い。
【００１３】
１．ロボスファエラ属ＴＭ−３３の培養方法
本発明のトレハラーゼを生産するロボスファエラ属ＴＭ−３３の培養は、以下の方法によって行うことができるが、本発明はこれによって特に限定されるものではない。
【００１４】
好ましい基本培地としては、０．５（Ｗ／Ｖ％）ポリペプトン（特に記載のない場合は以下、容量％をいう）、酵母エキス０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、食塩０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．１％（ｐＨ６．５）である。
【００１５】
（１）炭素源の影響
表１に示した各種炭素源０．２５％を含む上記基本培地を、常法に従って調製滅菌し、この培地にロボスファエラ属ＴＭ−３３を接種する。５日間、２７℃で暗室にて振盪培養する。
【００１６】
【表１】
表１から明らかなように、本藻体は、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グリセリンなどを加えた培地で、トレハロース添加時と同等の活性が得ることができ、なかでも、グリセリンが最適である。添加するグリセリン濃度は０．２５％〜１％が好ましい。
【００１７】
（２）窒素源の影響
グリセリン０．２５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、食塩０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．１％（ｐＨ６．５）ならびに表２に示した各種窒素源を使用し、５日間、２７℃で振盪培養した後、酵素活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
表２から明らかなように、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、その他有機体窒素源を使用することにより、高活性のトレハラーゼを高産生する。
【００１９】
以上の結果を総合すると、活性の高い培地組成として、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％、グリセリン０．７５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、食塩０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．１％（ｐＨ６．５）の培地組成が挙げられるが、これに限られるものではなく、上記知見を参考として、供試藻株が目的とする酵素を大量に生産し得る成分を適宜変更したものも使用することができる。
【００２０】
２．トレハラーゼ又はその含有物の製造方法
本発明のトレハラーゼを生産するために、選定した培地にロボスファエラ属ＴＭ−３３を接種し、ｐＨを３．５〜７．５、好ましくはｐＨを５〜７、温度を２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３５℃に保ちつつ、２日間から７日間振盪あるいは通気すればよい。
【００２１】
このようにして得られた培養物より、藻体を遠心分離などの常法により採取したものが本発明のトレハラーゼを含有する。含有物の状態として、藻体そのもの、藻体のアセトンパウダー及び藻体の凍結乾燥品が挙げられる。また、藻体をフレンチプレス処理、超音波処理、マントンガウリ処理及びその他の方法で破砕し、遠心分離して得られた上清液、この上清液に８５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて得られる塩析物、遠心分離の上清液にアセトンもしくはエタノール等を加えて得られる沈殿物及びその乾燥パウダー等の状態で使用することも可能である。さらに、所望により酵素を精製することもできる。
【００２２】
菌体破砕後の上清液の精製は、塩析、イオン交換樹脂、その他通常の手段を適宜組合わせて行うことができる。例えば、菌体破砕後の上清液に、固形の硫酸アンモニウムを加え、８５％飽和で沈殿する画分を遠心分離機を使用して集める。そして、この沈殿物をｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解し、透析チューブに入れた後、同緩衝液で十分に透析する。なお、この硫酸アンモニウム塩析での回収率は９５％であった。次いで、常法に従って、市販の樹脂を用いて、イオンクロマトグラフィー及びゲル濾過等を実施した。なお、上記樹脂としては、東ソー株式会社製のＴＳＫｇｅｌ ＳＰトヨパール５５０、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−トヨパール６５０、ＴＳＫｇｅｌ トヨパールＨＷ、ファルマシア製のＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂ、ＣＭ−セファロース Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、セファロース ＣＬ−６Ｂ、セファロース ＣＬ−４Ｂ等から選ばれる少なくとも１種以上の樹脂を用いることができる。
【００２３】
最終的に、図２に示したように、スーパーロース１２（suprerose 12）のゲル濾過によるファーストプロテイン液体クロマトグラフィー（以下ＦＰＬＣという）（１０×３００ｍｍ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），５０ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍｌ／分、２８０ｎｍ）により１ピークとなった。
【００２４】
３．トレハラーゼの諸性質
上記精製された酵素を使用して調べた結果を次に示す。
（１）酵素活性測定法
０．１Ｍのトレハロース溶液１２５μｌに酵素液１２５μｌを加え、４０℃で１０分間作用させた後、生成するグルコースをソモギ−ネルソン法（N. Nelson, J. Biol. Chem., 153, 375(1944））で測定する。ここでの酵素活性１単位は１分間に２μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量と定義する。
【００２５】
（２）作用
（イ）トレハロース希薄水溶液に作用させると、トレハロースをグルコースに加水分解する。
（ロ）高濃度、例えば５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース基質に本酵素を作用させると収率が５〜２０％（収率＝トレハロース濃度／初期グルコース濃度）でトレハロースを合成する。
【００２６】
（３）基質特異性
本酵素は極めて基質特異性が高く、トレハロース、２−デオキシトレハロース及び２，２’−ジデオキシトレハロースを加水分解するが、メチル−α−グルコシド、フェニル−α−グルコシド、マルトース、イソマルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、可溶性澱粉等は分解しない。
【００２７】
（４）至適ｐＨとｐＨ安定性
上記酵素活性測定法にて、各ｐＨで活性を測定して至適ｐＨを求める。その結果を図５に示す。これによると、本酵素の至適ｐＨは５〜６である。また、５℃において、各ｐＨで２０時間保持した後の残存活性を測定したところ、図６に示したように、活性はｐＨ９までは変化せず、ｐＨ１０でも８３％の残存活性を有した。
【００２８】
（５）至適温度と温度安定性
上記酵素活性測定法にて、各温度で活性を測定して至適温度を求める。その結果を図３に示す。これによると、本酵素の至適温度は６５℃である。また、ｐＨ５．５において、各温度で１０分間保持した後の残存活性を測定したところ、図４に示したように、活性は６５℃までは変化せず、７０℃でも約７０％の残存活性を有した。
【００２９】
（６）分子量
本酵素の分子量をスーパーロース１２のカラムを使用したＦＰＬＣのゲル濾過法より測定したところ、４０万〜５０万であった。また、サブユニット分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で、１８０，０００〜２５０，０００であった。
【００３０】
（７）等電点
ｐＨ３．５〜１０．０アンフォライト（ファルマシア製）のカラム（１１０ｍｌ）を使用し、VesterbergとSvenssonの方法（Acta Chem. Scand., (1966) 20. 820)により、等電点を測定した結果、２．７となった。
【００３１】
（８）糖染色
本酵素は、R.M.Zacharriusらの方法（Anal. Biochem., (1969) 30, 148）による糖染色によって陽性になることから、糖タンパクである。
【００３２】
（９）阻害、活性化
種々の塩及び試薬を２．５ｍＭの濃度で、３０℃、１時間保温した後、本酵素に反応させ、本酵素の活性を測定した。その結果、酵素活性は、対照区に比較して、三価の鉄イオンで８８％阻害され、２．５ｍＭのアルミニウムイオンで５０％以上阻害されたが、１価の水銀イオン、２価の鉛イオン、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）によっては阻害されなかった。
また、マグネシウムイオン、カルシウムイオンでは、本酵素の安定性を高める効果は見られなかった。
【００３３】
４．トレハラーゼによるトレハロースの製造方法
本発明のトレハラーゼは、トレハロースに作用して、グルコースに加水分解できると同時に、高濃度グルコース存在下では、可逆的にトレハロースを生成する。すなわち、トレハラーゼをグルコース液に加えて処理することにより縮合反応が生じ、安価なグルコースを原料として一工程で高収率で経済的にトレハロースを生成することができる。以下具体的な例を挙げて説明する。
【００３４】
グルコースの濃度は５〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは４０〜６０％（Ｗ／Ｗ）を用いる。反応時の温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃であり、ｐＨはｐＨ４〜８の範囲が好ましい。また、酵素の必要単位数は、グルコースグラム重量当たり０．１〜２００単位である。反応時間は、酵素の使用量により変動するが、０．１〜１００時間の範囲が選ばれる。このような簡便な操作で、収率１０〜２０％（収率＝トレハロース濃度／初発グルコース濃度）のトレハロースを得ることができる。この際使用する酵素は特に精製する必要がなく、当該トレハラーゼを含有するのであれば、藻体そのもの、藻体の凍結乾燥物、藻体のアセトンパウダーもしくは粗酵素液などでもよい。また固定酵素も使用可能である。固定酵素の場合には、固定化基剤として、イオン交換樹脂や多孔性セラミックを使用することができ、固定化に際して、グルタルアルデヒド等の架橋剤を使用することもできる。
【００３５】
上記処理を施した反応液は、トレハロースと未反応グルコース等を含有する。この反応液、この反応液の濃縮液、乾固したもの又は反応液を乾燥して粉末にしたものをトレハロース含有物として使用することができるが、反応液をさらにイオン交換樹脂処理、活性炭クロマトグラフィー、吸着樹脂等のクロマトグラフ操作、再結晶、その他一般的な方法から選ばれる１種もしくはこれらを組み合せた方法により高純度に精製してもよい。
【００３６】
５．２，２’−ジデオキシトレハロース、２−デオキシトレハロースの製造方法
本発明のトレハラーゼを使用して、グルコースからトレハロースを製造する場合と同様の方法を採用することにより、２−デオキシグルコースから２，２’−ジデオキシトレハロースを製造することができる。
【００３７】
一例を挙げて説明すると、２−デオキシグルコースの濃度は、２０〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは５０〜７０％、温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃がよく、ｐＨは、ｐＨ４〜８の範囲で反応させることができる。この際の酵素の必要単位数は、２−デオキシグルコースグラム重量当たり０．１〜２００単位でよく、反応時間は酵素の使用量により変動するが、０．１〜１００時間の範囲が選ばれる。このような簡単な操作で、収率２０〜５０％（収率＝２，２’−ジデオキシトレハロース濃度／初発２−デオキシグルコース濃度）の２，２’−ジデオキシトレハロースを得ることができる。
【００３８】
また、２−デオキシトレハロースは、２−デオキシグルコースとグルコースとのモル比が１０：１〜１：１、好ましくは５：２〜１０：１から選ばれる配合比で、混合物としての糖濃度が１０〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは５０〜７０％（Ｗ／Ｗ）、濃度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃がよく、ｐＨはｐＨ４〜８の範囲で反応させることができる。この際の酵素の必要単位数は、２−デオキシグルコースグラム重量当たり０．１〜２００単位でよく、反応時間は酵素の使用量により変動するが、０．１〜１００時間の範囲が選ばれる。このような簡単な操作で、収率１０〜３０％（収率＝２−デオキシトレハロース濃度／初発２−デオキシグルコース濃度＋グルコース濃度）で２−デオキシトレハロースを得ることができる。
【００３９】
なお、本反応により生成した物質は、公知の方法で精製し、機器分析により構構造を確認することができる。例えば、反応生成物を活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、再結晶によって、単一物質とした後、Fast atom bombardment mass（以下Ｆａｂ−ＭＳという）による分子量測定、13Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により構造解析を行うことができる。
【００４０】
【実施例】
本発明に係る新規のトレハラーゼ及びその製法を説明する。
実施例１
普通寒天斜面培地に、ロボスファエラ属ＴＭ−３３株を接種し、２７℃で５日間培養後、その１白金耳をとり、酵母エキス０．２％、ポリペプトン１．０％、グリセリン０．２５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、リン酸二カリウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％（ｐＨ６．５）の組成からなる液体培地５００ｍｌに接種し、２７℃で５日間暗室で通気振盪培養した。培養終了後、酵素活性を測定すると、本液１ｍｌ当たり約３単位のトレハラーゼを含有していた。培養液を遠心分離して藻体を採集し、アセトンを２００ｍｌを添加して脱脂後、乾燥させることにより藻体のアセトンパウダー０．１５ｇを得た。本パウダー１ｍｇ当たり１０単位の酵素活性を含有していた。
【００４１】
実施例２
普通寒天斜面培地に、ロボスファエラ属ＴＭ−３３株を接種し、２７℃で５日間培養後、その１白金耳をとり、酵母エキス０．２％、ポリペプトン１．０％、グリセリン０．２５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、リン酸二カリウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％（ｐＨ６．５）の組成からなる液体培地５００ｍｌに藻株を接種し、２７℃で５日間暗室で通気振盪培養した。培養終了後、酵素活性を測定すると、本液１ｍｌ当たり３単位のトレハラーゼを含有していた。振盪培養後、培養液を遠心分離して藻体を採集し、フレンチプレス（１５００Ｋｇｆ／ｃｍ2 ）でその藻体を破砕し、９０％飽和硫酸アンモニウムにより室温で塩析した。その後、塩析物を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、５０ｍＭ酢酸緩衝液中でアセテート透析チューブにておいて透析して、トレハラーゼ含有液１０ｍｌを得た。その酵素液は１ｍｌ当たり１４０単位のトレハラーゼを含有していた。
【００４２】
実施例３
予め、グルコース２Ｋｇを水３リットルに溶解し、クエン酸を加えてｐＨを５．５とした。この溶液に、５０℃にて、実施例１の方法で得た酵素液をグルコース１ｇ当たり５０単位で加えて、同温度で１２時間撹拌した。この反応を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣとする：Column, Amido-80（東ソー（株）、溶媒：アセトニトリル／水＝７５％（Ｖ／Ｖ）、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度：３５℃、ポンプ：ＣＣＰＤ（東ソー（株））、検出器：ＲＩ−８０１２（東ソー（株））で分析したところトレハロース２０％（Ｗ／Ｖ）含んでいた。
【００４３】
反応液は９０℃、１０分間加熱して酵素を失活させた後、活性炭カラムクロマトグラフィー（１０×１５０ｃｍ）に供して、トレハロースをカラムに吸着させた。そして、このカラムを６０リットルの蒸留水で水洗することによってグルコースを除いた後、１０％エタノール液２０リットルでトレハロースを溶出させた。エタノール画分を濃縮することにより純度９７％のトレハロース０．３Ｋｇを得た。
【００４４】
実施例４
予め、グルコース５Ｋｇを水４リットルに溶解し、クエン酸を加えてｐＨを５．５とした。この溶液に、５０℃にて、実施例２の方法で得た酵素液をグルコース１ｇ当たり５０単位で加え、同温度で１２時間反応させ、実施例３と同じＨＰＬＣの条件で分析したところ、トレハロース２０％（Ｗ／Ｖ）を含んでいた。
【００４５】
反応液は９０℃、１０分間加熱して酵素を失活させた後、活性炭カラムクロマトグラフィー（１０×１５０ｃｍ）に供して、トレハロースを活性炭カラムに吸着させた。そして、このカラムを４０リットルの純水で水洗することにより未反応のグルコースを除いた後、１０％エタノール液２０リットルでトレハロースを溶出させた。溶出画分を濃縮することにより純度９５％のトレハロースを０．８Ｋｇを得た。
【００４６】
実施例５
固定化酵素調製用の担体（三菱化成製、アニオン交換樹脂、ＶＡ−２０）１Ｋｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液に浸漬し、充分に脱気後、実施例２の方法で調製した酵素溶液を添加（２０万単位）し、一晩静置して、担体に酵素を固定した。固定化された担体を酢酸緩衝液で洗浄後、カラム（６×５０ｃｍ）に充填するとともに、カラムジャケットに恒温水を循環させてカラム温度５０℃とした。そして、固定化酵素カラムの後方に活性炭を充填したカラム（１０×１００ｃｍ）を継続させ、この活性炭カラムを、ＳＶ２（ＳＶ：１時間当たりの通液量／吸着剤）で３０％グルコース（３Ｋｇグルコース／１０．０リットル蒸留水Ｗ／Ｖ）を循環させた。その結果、活性炭カラムに随時トレハロースが蓄積され、活性炭カラムを１０％（Ｗ／Ｖ）エタノールで洗浄することによりトレハロースが溶出された。そして、１０％エタノール画分を濃縮することにより、純度９５％のトレハロースを１Ｋｇを得た。
【００４７】
実施例６
２−デオキシグルコース１．４ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．６ｍｌに溶解させた後、実施例１で調製した酵素液を５０単位与え、７０℃にて４８時間反応させた。１００℃で５分間加熱し、酵素を失活させた後、反応液の一部を、実施例３と同一の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果を図７に示す。
【００４８】
反応終了後、蒸留水６ｍｌで希釈した溶液を活性炭カラム（２×１１ｃｍ）及びバイオラッド製のBio gel P-2(２．５×１４３ｃｍ）にかけて、９９％純度の２，２’−ジデオキシトレハロース１６２ｍｇを得た。この化合物の分子量を、図８に示したように、マススペクトル（Fab-MS）（機器：JEOL JMX-DX303H マススペクトルメータ、マトリックス：グリセロール) により測定し、図９に示した13Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）（機器：JEOL JMX-EX270 68.8MHz、内部標準：アセトン（δ３１．４ｐｐｍ）及び施光度（＋１５３．８０）により、図１０に示す２，２’−ジデオキシトレハロースの構造決定をした。
【００４９】
実施例７
２−デオキシグルコース５００ｍｇ及びグルコース２００ｍｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌに溶解させた後、ロボスファエラ属の産性するトレハラーゼを５０単位加え、７０℃にて４８時間反応させた。反応液の一部を実施例３と同一の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果を図１１に示す。
【００５０】
反応終了後、混合物を１００℃で５分間処理することにより酵素を失活させ、この反応液を６ｍｌの蒸留水によって希釈した後、活性炭カラム（２×１１ｃｍ）、及びバイオラッド製のＢｉｏ ｇｅｌ Ｐ−２（２．５×１４３ｃｍ）のゲル濾過にかけて、９９％純度の２−デオキシトレハロース４０ｍｇを分取した。この化合物の分子量を、図１２に示したように、マススペクトル（Ｆａｂ−ＭＳ）により測定し、図１３に示した13Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）及び施光度（＋１６５．２０）により、図１４に示す２−デオキシトレハロースの構造決定をした。
【００５１】
実施例６及び７に示す両物質は既に報告されているが、トレハラーゼを用いた合成法は知られていない。本発明のトレハラーゼを使用することにより、グルコースからトレハロース、２−デオキシグルコースから２，２’−ジデオキシトレハロース、２−デオキシグルコースとグルコースの混合物から２−デオキシトレハロースが高収率で生成し、また複雑な精製を必要とせず、高純度のものを、安価に製造することができる。
【００５２】
実験例１
本発明のトレハラーゼをＦＰＬＣで単一にまで精製した後、このトレハラーゼ４５μｌ（トレハラーゼ酵素濃度１ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６））を１００℃にて２０分加熱変性処理した。その後、加熱変性したトレハラーゼに、グリコペプチダーゼＦを５μｌ（０．５単位／ｍｌ，宝酒造（株）製）添加し、３７℃にて１２時間反応を行うことにより糖鎖を除去した。その結果、アクリルアミドのグラジエントゲル（第一化薬製、マルチプレートゲル４／１５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥより、分子量は５万〜６万、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥの測定により、約１０万〜１２万が確認された。また対照として、グリコペプチダーゼＦ未処理のトレハラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより分子量は１８万〜２５万、糖染色により赤色に染色した。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の新規なトレハラーゼを用いることによりトレハロースを製造すれば、菌体や培養液を抽出する方法に比べて、（１）グルコースからトレハロースを直接製造できるので、反応が単純で、副産物がなく、食品として安全に使用することができる。（２）原料としては、酵素以外にグルコースのみでトレハロースを高収率に生産するので、コストが非常に安くなる。
【００５４】
また、トレハロースは、食品においては冷凍保護、乾燥保護、抗う蝕のほか、他甘味料としての用途があり、酵素の冷凍保存など用途は非常に大きい。さらに、医薬の分野においても、トレハロース誘導体が制ガン剤等として利用されていることから、実用化を期待することができる。
【００５５】
さらに、２，２’−ジデオキシトレハロース、２−デオキシトレハロースの製造に関しては、化学的に合成する方法に比べて、２−デオキシグルコース及び２−デオキシグルコースとグルコースとにより、直接製造することができるので、精製工程が単純であり、工業的に利用することが可能となる。
従って、トレハラーゼ及び該酵素を用いてトレハロースを製造する方法は、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るトレハラーゼを産生する藻体の顕微鏡写真である。
【図２】本発明に係るトレハラーゼをＦＰＬＣに付した際のチャートである。
【図３】本発明に係るトレハラーゼの至適温度を示すグラフである。
【図４】本発明に係るトレハラーゼの温度安定性を示すグラフである。
【図５】本発明に係るトレハラーゼの至適ｐＨを示すグラフである。
【図６】本発明に係るトレハラーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。
【図７】２−デオキシグルコースをトレハラーゼに作用させた際に生成した２，２’−ジデオキシトレハロースのＨＰＬＣチャートである。
【図８】本発明における実施例６の縮合生成物のＦａｂ−ＭＳ解析スペクトルである。
【図９】本発明における実施例６の縮合生成物の13Ｃ−ＮＭＲ解析スペクトルである。
【図１０】２，２’−ジデオキシトレハロースの構造式である。
【図１１】２−デオキシグルコース及びグルコースをトレハラーゼに作用させた際に生成した２−デオキシトレハロースのＨＰＬＣチャートである。
【図１２】本発明における実施例７の縮合生成物のＦａｂ−ＭＳ解析スペクトルである。
【図１３】本発明における実施例７の縮合生成物の13Ｃ−ＮＭＲ解析スペクトルである。
【図１４】２−デオキシトレハロースの構造式である。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規のトレハラーゼ及び該酵素を用いた糖類の製法に関し、より詳細には、クロレラ科ロボスファエラ属藻類由来の新規なトレハラーゼ及び該酵素を用いてトレハロース、２，２’−ジデオキシ−α，α’−トレハロース（以下２，２’−ジデオキシトレハロースという）及び２−デオキシ−α，α’−トレハロース（以下２−デオキシトレハロースという）を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、２分子のＤ−グルコースがα，α’−１，１’結合した非還元性２糖類の一種である。昆虫類では血液やリンパ液中にあり、運動エネルギー源のための貯蔵血糖として存在する。また不凍剤としての効果を有する場合もあり、昆虫は季節により、その濃度を調節して耐寒性を得ると言われている。
【０００３】
トレハラーゼは、トレハロースを２分子のグルコースに加水分解する酵素である。この酵素は、高等動物（ラット小腸、ブタ小腸など）、昆虫（カイコ等）、微生物等に分布している。トレハラーゼを生産する微生物としては、マイコバクテリウム属（Methods in Enzymology, (1972) 28, 996 ）、ストレプトマイセス属（J. Bacteriol., (1968) 96, 105 ）などの細菌及び放線菌、サッカロマイセス属（J. Biol. Chem., (1964) 239, 1671）等の酵母、あるいはアスペルギルス属（J. Bacteriol., (1966) 91, 1883）、ノイロスポラ属（J. Bacteriol., (1973) 115, 582）、フミコーラ属（Biochim. Biophys. Acta., (1978) 525,162)、フィコマイセス属（Biochim. Biophys. Acta., (1975) 391, 154) 等の糸状菌等が知られている。これはいずれも菌体内もしくは胞子内にトレハラーゼを含有している。その他、菌体外にトレハラーゼを生産する微生物としては、トリコデルマ属（Can. J. Microbiol., (1978) 24, 1280)やケトミウム属（特公昭６０−２２９１７号公報）が報告されている。しかし、緑藻類由来のトレハラーゼに関する報告はない。
【０００４】
トレハロースの用途としては、新規食品素材として、低う蝕性、抗う蝕性、かつビフィズス菌増殖促進作用を有する甘味料としての応用（特開昭６３−２４０７５８号公報）が提案されている。また、水分を有する食品原料や飲料に所定量のトレハロースを添加すると、食品原料や飲料の蛋白質の変性が抑制できること（特表平２−５０３８６４号公報）も報告されている。さらに、医薬品の分野では、タンパク質保護剤として、酵素標識抗体を長期保存させて、酵素活性の低下を抑制するためにトレハロースを添加する方法が報告されている（特開昭６０−１４９９７２号公報）。また、細胞の安定保存性を高めたり、ワクチンの安定化に使用する例や、トレハロース誘導体を抗がん剤として使用する報告例もある（特開昭６２−１７４０９４号公報）。例えば、２−デオキシグルコースにおける生理活性は、グルコースやマンノースの代謝拮抗物質として、糖タンパク質や糖脂質の連鎖形成を障害することにより、遷移芽細胞などの成育を阻害し、抗癌作用があることが知られている。
【０００５】
トレハロースの製造法としては、微生物の菌体内及び菌体外にトレハロースを蓄積させる方法の他、酵素反応により、インビトロで生成させる方法がある。微生物による生産法としては、多量にトレハロースを含有するパン酵母から得る方法が一般的である。例えば、圧搾酵母を９５％（Ｖ／Ｖ）エタノールで抽出して、トレハロースを得たり（J. Am. Chem. Soc., (1950) 2059）、パン酵母を９０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで抽出してトレハロースを得る方法（農化第２７巻，(1953) 412）が知られている。酵素法としては、マルトースにマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼを作用させて、トレハロースを製造する方法が報告されている（特公昭６３−６０９９８号公報）。
【０００６】
２，２’−ジデオキシトレハロース及び２−デオキシトレハロースの製造法としては、化学的に合成する方法（Nouveau Journal De Chimie., (1980) 4, 59) 及び酵母の代謝を利用する方法（Biochimica et Biophysica Acta., (1984) 803,284及びBiochimica et Biophysica Acta., (1969) 184, 77）がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記したような既知の、あるいは市販のトレハラーゼにおいては、微生物が産生する単位数が低く、グルコースからトレハロースへの逆反応による縮合反応率が極めて低いといった問題があった。
特に、トレハロースを、パン酵母からの抽出により得る方法では、多量の有機溶媒を必要とするとともに、夾雑物を取り除くために複雑な工程を必要とする。また、酵素を使用する方法として知られているマルトースにマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼを作用させてトレハロースを製造する方法でも、製造工程が複雑であるとともに、マルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼの酵素の製造に多大な経費と手間がかかるなど問題点が非常に多い。
【０００８】
さらに、菌体外のトレハロースを精製する方法もある（特開平５−２１１８８２）が、いずれの方法を採用しても製造経費が高くなり、よってその用途が限定されてしまう。
また、化学的合成法による２，２’−ジデオキシトレハロース及び２−デオキシトレハロースの製造にあっては、工程が煩雑で、製造歩留りが低く、酵母の代謝による製法においても、産生量も低く、かつ精製工程が複雑であるという問題があった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、トレハラーゼを生産する微生物を自然界に広く求めて検索した結果、緑藻植物門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属の緑藻類に属すると認められる新株が、目的にかなうトレハラーゼを高力価に産生することを見出した。さらにこの酵素は、従来から報告されているトレハラーゼに比べて熱安定性の高い性質を有することを見いだし、本発明に至った。
【００１０】
本発明のトレハラーゼは、緑藻門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属の微細藻類で産生され、その培養物から単離することができるものであり、以下の特性、（１）α，α’−トレハロース、２，２’−ジデオキシ−α，α’−トレハロースおよび２−デオキシ−α，α’−トレハロースを、それぞれの構成糖に加水分解するが、ネオトレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、スクロースには作用しない、（２）至適ｐＨがｐＨ５〜６であり、（３）至適温度が６５℃であり、（４）６５℃まで熱安定性を有し、（５）ゲル濾過法により測定した分子量は、４００，０００〜５００，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法によるサブユニットの分子量は１８０，０００〜２５０，０００であり、（６）焦点電気泳動により測定した等電点は２．７であり、（７）糖タンパクである、
を有する。
【００１１】
本発明者らは、大阪府八尾市の土壌から採取した藻体が、以下に示した形態学的性質及び培養的性質等を有することから、Komarek, J. & Fott, B. Chlorophyceae. In Huber - Pestalozzi (ed.) (1983) 1044 等を参考文献として、クロレラ科の各属種の藻体（保存株）と比較、同定を試みた。その結果、本藻体は、ロボスファエラ属チロレンシス（Lobosphaera tirolensis）にも類似するが、すでに発表されたものにおいて完全に一致しないため、本発明の藻体を、ロボスファエラ属の新種もしくは新変種と考え、ロボスファエラ属ＴＭ−３３と命名した。この藻体は、ＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号 75630;1993 年 12 月 21 日）。本発明は、ロボスファエラ属ＴＭ−３３の野性株、変種及び同属で、上記の特質を有するトレハラーゼを産生する能力を有する藻体を含有する。なお、変種としては、自然に生じる変種及び公知の手段、例えば、ラジオアイソトープ照射、紫外線照射、ニトロソグアニジン、その他化学処理などの常法、さらに遺伝子組み換えにより酵素産生能を高める処理を施した人工的に生じる変種を包含するものである。
【００１２】
（１）形態学的性質
ボールドの基本培地（Bold's Basal Medium,以下ＢＢＭという）の寒天培地で、２週間培養後、光学顕微鏡を使用して観察した結果、本藻体は、深い切れ込みのあるカップ状の葉緑体を持っていた。また明確なピレノイドは観察されなかった。
（２）培養的性質
ＢＢＭの培地では４日目より増殖が確認された。また、普通寒天培地では１日後より増殖が確認された。図１に、本藻体の顕微鏡写真を示す。
本発明のトレハラーゼを産生する緑藻門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属の藻体は、独立栄養状態でも生育するが、従属栄養状態の方が生育速度も大きく、トレハラーゼ生産量も多い。
【００１３】
１．ロボスファエラ属ＴＭ−３３の培養方法
本発明のトレハラーゼを生産するロボスファエラ属ＴＭ−３３の培養は、以下の方法によって行うことができるが、本発明はこれによって特に限定されるものではない。
【００１４】
好ましい基本培地としては、０．５（Ｗ／Ｖ％）ポリペプトン（特に記載のない場合は以下、容量％をいう）、酵母エキス０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、食塩０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．１％（ｐＨ６．５）である。
【００１５】
（１）炭素源の影響
表１に示した各種炭素源０．２５％を含む上記基本培地を、常法に従って調製滅菌し、この培地にロボスファエラ属ＴＭ−３３を接種する。５日間、２７℃で暗室にて振盪培養する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
（２）窒素源の影響
グリセリン０．２５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、食塩０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．１％（ｐＨ６．５）ならびに表２に示した各種窒素源を使用し、５日間、２７℃で振盪培養した後、酵素活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】
以上の結果を総合すると、活性の高い培地組成として、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％、グリセリン０．７５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、食塩０．０５％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．１％（ｐＨ６．５）の培地組成が挙げられるが、これに限られるものではなく、上記知見を参考として、供試藻株が目的とする酵素を大量に生産し得る成分を適宜変更したものも使用することができる。
【００２０】
２．トレハラーゼ又はその含有物の製造方法
本発明のトレハラーゼを生産するために、選定した培地にロボスファエラ属ＴＭ−３３を接種し、ｐＨを３．５〜７．５、好ましくはｐＨを５〜７、温度を２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３５℃に保ちつつ、２日間から７日間振盪あるいは通気すればよい。
【００２１】
このようにして得られた培養物より、藻体を遠心分離などの常法により採取したものが本発明のトレハラーゼを含有する。含有物の状態として、藻体そのもの、藻体のアセトンパウダー及び藻体の凍結乾燥品が挙げられる。また、藻体をフレンチプレス処理、超音波処理、マントンガウリ処理及びその他の方法で破砕し、遠心分離して得られた上清液、この上清液に８５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて得られる塩析物、遠心分離の上清液にアセトンもしくはエタノール等を加えて得られる沈殿物及びその乾燥パウダー等の状態で使用することも可能である。さらに、所望により酵素を精製することもできる。
【００２２】
菌体破砕後の上清液の精製は、塩析、イオン交換樹脂、その他通常の手段を適宜組合わせて行うことができる。例えば、菌体破砕後の上清液に、固形の硫酸アンモニウムを加え、８５％飽和で沈殿する画分を遠心分離機を使用して集める。そして、この沈殿物をｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解し、透析チューブに入れた後、同緩衝液で十分に透析する。なお、この硫酸アンモニウム塩析での回収率は９５％であった。次いで、常法に従って、市販の樹脂を用いて、イオンクロマトグラフィー及びゲル濾過等を実施した。なお、上記樹脂としては、東ソー株式会社製のＴＳＫｇｅｌ ＳＰトヨパール５５０、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−トヨパール６５０、ＴＳＫｇｅｌ トヨパールＨＷ、ファルマシア製のＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂ、ＣＭ−セファロース Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、セファロース ＣＬ−６Ｂ、セファロース ＣＬ−４Ｂ等から選ばれる少なくとも１種以上の樹脂を用いることができる。
【００２３】
最終的に、図２に示したように、スーパーロース１２（suprerose 12）のゲル濾過によるファーストプロテイン液体クロマトグラフィー（以下ＦＰＬＣという）（１０×３００ｍｍ、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），５０ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍｌ／分、２８０ｎｍ）により１ピークとなった。
【００２４】
３．トレハラーゼの諸性質
上記精製された酵素を使用して調べた結果を次に示す。
（１）酵素活性測定法
０．１Ｍのトレハロース溶液１２５μｌに酵素液１２５μｌを加え、４０℃で１０分間作用させた後、生成するグルコースをソモギ−ネルソン法（N. Nelson, J. Biol. Chem., 153, 375(1944））で測定する。ここでの酵素活性１単位は１分間に２μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量と定義する。
【００２５】
（２）作用
（イ）トレハロース希薄水溶液に作用させると、トレハロースをグルコースに加水分解する。
（ロ）高濃度、例えば５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース基質に本酵素を作用させると収率が５〜２０％（収率＝トレハロース濃度／初期グルコース濃度）でトレハロースを合成する。
【００２６】
（３）基質特異性
本酵素は極めて基質特異性が高く、トレハロース、２−デオキシトレハロース及び２，２’−ジデオキシトレハロースを加水分解するが、メチル−α−グルコシド、フェニル−α−グルコシド、マルトース、イソマルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、可溶性澱粉等は分解しない。
【００２７】
（４）至適ｐＨとｐＨ安定性
上記酵素活性測定法にて、各ｐＨで活性を測定して至適ｐＨを求める。その結果を図５に示す。これによると、本酵素の至適ｐＨは５〜６である。また、５℃において、各ｐＨで２０時間保持した後の残存活性を測定したところ、図６に示したように、活性はｐＨ９までは変化せず、ｐＨ１０でも８３％の残存活性を有した。
【００２８】
（５）至適温度と温度安定性
上記酵素活性測定法にて、各温度で活性を測定して至適温度を求める。その結果を図３に示す。これによると、本酵素の至適温度は６５℃である。また、ｐＨ５．５において、各温度で１０分間保持した後の残存活性を測定したところ、図４に示したように、活性は６５℃までは変化せず、７０℃でも約７０％の残存活性を有した。
【００２９】
（６）分子量
本酵素の分子量をスーパーロース１２のカラムを使用したＦＰＬＣのゲル濾過法より測定したところ、４０万〜５０万であった。また、サブユニット分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で、１８０，０００〜２５０，０００であった。
【００３０】
（７）等電点
ｐＨ３．５〜１０．０アンフォライト（ファルマシア製）のカラム（１１０ｍｌ）を使用し、VesterbergとSvenssonの方法（Acta Chem. Scand., (1966) 20. 820)により、等電点を測定した結果、２．７となった。
【００３１】
（８）糖染色
本酵素は、R.M.Zacharriusらの方法（Anal. Biochem., (1969) 30, 148）による糖染色によって陽性になることから、糖タンパクである。
【００３２】
（９）阻害、活性化
種々の塩及び試薬を２．５ｍＭの濃度で、３０℃、１時間保温した後、本酵素に反応させ、本酵素の活性を測定した。その結果、酵素活性は、対照区に比較して、三価の鉄イオンで８８％阻害され、２．５ｍＭのアルミニウムイオンで５０％以上阻害されたが、１価の水銀イオン、２価の鉛イオン、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）によっては阻害されなかった。
また、マグネシウムイオン、カルシウムイオンでは、本酵素の安定性を高める効果は見られなかった。
【００３３】
４．トレハラーゼによるトレハロースの製造方法
本発明のトレハラーゼは、トレハロースに作用して、グルコースに加水分解できると同時に、高濃度グルコース存在下では、可逆的にトレハロースを生成する。すなわち、トレハラーゼをグルコース液に加えて処理することにより縮合反応が生じ、安価なグルコースを原料として一工程で高収率で経済的にトレハロースを生成することができる。以下具体的な例を挙げて説明する。
【００３４】
グルコースの濃度は５〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは４０〜６０％（Ｗ／Ｗ）を用いる。反応時の温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃であり、ｐＨはｐＨ４〜８の範囲が好ましい。また、酵素の必要単位数は、グルコースグラム重量当たり０．１〜２００単位である。反応時間は、酵素の使用量により変動するが、０．１〜１００時間の範囲が選ばれる。このような簡便な操作で、収率１０〜２０％（収率＝トレハロース濃度／初発グルコース濃度）のトレハロースを得ることができる。この際使用する酵素は特に精製する必要がなく、当該トレハラーゼを含有するのであれば、藻体そのもの、藻体の凍結乾燥物、藻体のアセトンパウダーもしくは粗酵素液などでもよい。また固定酵素も使用可能である。固定酵素の場合には、固定化基剤として、イオン交換樹脂や多孔性セラミックを使用することができ、固定化に際して、グルタルアルデヒド等の架橋剤を使用することもできる。
【００３５】
上記処理を施した反応液は、トレハロースと未反応グルコース等を含有する。この反応液、この反応液の濃縮液、乾固したもの又は反応液を乾燥して粉末にしたものをトレハロース含有物として使用することができるが、反応液をさらにイオン交換樹脂処理、活性炭クロマトグラフィー、吸着樹脂等のクロマトグラフ操作、再結晶、その他一般的な方法から選ばれる１種もしくはこれらを組み合せた方法により高純度に精製してもよい。
【００３６】
５．２，２’−ジデオキシトレハロース、２−デオキシトレハロースの製造方法
本発明のトレハラーゼを使用して、グルコースからトレハロースを製造する場合と同様の方法を採用することにより、２−デオキシグルコースから２，２’−ジデオキシトレハロースを製造することができる。
【００３７】
一例を挙げて説明すると、２−デオキシグルコースの濃度は、２０〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは５０〜７０％、温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃がよく、ｐＨは、ｐＨ４〜８の範囲で反応させることができる。この際の酵素の必要単位数は、２−デオキシグルコースグラム重量当たり０．１〜２００単位でよく、反応時間は酵素の使用量により変動するが、０．１〜１００時間の範囲が選ばれる。このような簡単な操作で、収率２０〜５０％（収率＝２，２’−ジデオキシトレハロース濃度／初発２−デオキシグルコース濃度）の２，２’−ジデオキシトレハロースを得ることができる。
【００３８】
また、２−デオキシトレハロースは、２−デオキシグルコースとグルコースとのモル比が１０：１〜１：１、好ましくは５：２〜１０：１から選ばれる配合比で、混合物としての糖濃度が１０〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは５０〜７０％（Ｗ／Ｗ）、濃度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃がよく、ｐＨはｐＨ４〜８の範囲で反応させることができる。この際の酵素の必要単位数は、２−デオキシグルコースグラム重量当たり０．１〜２００単位でよく、反応時間は酵素の使用量により変動するが、０．１〜１００時間の範囲が選ばれる。このような簡単な操作で、収率１０〜３０％（収率＝２−デオキシトレハロース濃度／初発２−デオキシグルコース濃度＋グルコース濃度）で２−デオキシトレハロースを得ることができる。
【００３９】
なお、本反応により生成した物質は、公知の方法で精製し、機器分析により構構造を確認することができる。例えば、反応生成物を活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、再結晶によって、単一物質とした後、Fast atom bombardment mass（以下Ｆａｂ−ＭＳという）による分子量測定、13Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により構造解析を行うことができる。
【００４０】
【実施例】
本発明に係る新規のトレハラーゼ及びその製法を説明する。
実施例１
普通寒天斜面培地に、ロボスファエラ属ＴＭ−３３株を接種し、２７℃で５日間培養後、その１白金耳をとり、酵母エキス０．２％、ポリペプトン１．０％、グリセリン０．２５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、リン酸二カリウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％（ｐＨ６．５）の組成からなる液体培地５００ｍｌに接種し、２７℃で５日間暗室で通気振盪培養した。培養終了後、酵素活性を測定すると、本液１ｍｌ当たり約３単位のトレハラーゼを含有していた。培養液を遠心分離して藻体を採集し、アセトンを２００ｍｌを添加して脱脂後、乾燥させることにより藻体のアセトンパウダー０．１５ｇを得た。本パウダー１ｍｇ当たり１０単位の酵素活性を含有していた。
【００４１】
実施例２
普通寒天斜面培地に、ロボスファエラ属ＴＭ−３３株を接種し、２７℃で５日間培養後、その１白金耳をとり、酵母エキス０．２％、ポリペプトン１．０％、グリセリン０．２５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、リン酸二カリウム０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％（ｐＨ６．５）の組成からなる液体培地５００ｍｌに藻株を接種し、２７℃で５日間暗室で通気振盪培養した。培養終了後、酵素活性を測定すると、本液１ｍｌ当たり３単位のトレハラーゼを含有していた。振盪培養後、培養液を遠心分離して藻体を採集し、フレンチプレス（１５００Ｋｇｆ／ｃｍ2 ）でその藻体を破砕し、９０％飽和硫酸アンモニウムにより室温で塩析した。その後、塩析物を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、５０ｍＭ酢酸緩衝液中でアセテート透析チューブにておいて透析して、トレハラーゼ含有液１０ｍｌを得た。その酵素液は１ｍｌ当たり１４０単位のトレハラーゼを含有していた。
【００４２】
実施例３
予め、グルコース２Ｋｇを水３リットルに溶解し、クエン酸を加えてｐＨを５．５とした。この溶液に、５０℃にて、実施例１の方法で得た酵素液をグルコース１ｇ当たり５０単位で加えて、同温度で１２時間撹拌した。この反応を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣとする：Column, Amido-80（東ソー（株）、溶媒：アセトニトリル／水＝７５％（Ｖ／Ｖ）、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度：３５℃、ポンプ：ＣＣＰＤ（東ソー（株））、検出器：ＲＩ−８０１２（東ソー（株））で分析したところトレハロース２０％（Ｗ／Ｖ）含んでいた。
【００４３】
反応液は９０℃、１０分間加熱して酵素を失活させた後、活性炭カラムクロマトグラフィー（１０×１５０ｃｍ）に供して、トレハロースをカラムに吸着させた。そして、このカラムを６０リットルの蒸留水で水洗することによってグルコースを除いた後、１０％エタノール液２０リットルでトレハロースを溶出させた。エタノール画分を濃縮することにより純度９７％のトレハロース０．３Ｋｇを得た。
【００４４】
実施例４
予め、グルコース５Ｋｇを水４リットルに溶解し、クエン酸を加えてｐＨを５．５とした。この溶液に、５０℃にて、実施例２の方法で得た酵素液をグルコース１ｇ当たり５０単位で加え、同温度で１２時間反応させ、実施例３と同じＨＰＬＣの条件で分析したところ、トレハロース２０％（Ｗ／Ｖ）を含んでいた。
【００４５】
反応液は９０℃、１０分間加熱して酵素を失活させた後、活性炭カラムクロマトグラフィー（１０×１５０ｃｍ）に供して、トレハロースを活性炭カラムに吸着させた。そして、このカラムを４０リットルの純水で水洗することにより未反応のグルコースを除いた後、１０％エタノール液２０リットルでトレハロースを溶出させた。溶出画分を濃縮することにより純度９５％のトレハロースを０．８Ｋｇを得た。
【００４６】
実施例５
固定化酵素調製用の担体（三菱化成製、アニオン交換樹脂、ＶＡ−２０）１Ｋｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液に浸漬し、充分に脱気後、実施例２の方法で調製した酵素溶液を添加（２０万単位）し、一晩静置して、担体に酵素を固定した。固定化された担体を酢酸緩衝液で洗浄後、カラム（６×５０ｃｍ）に充填するとともに、カラムジャケットに恒温水を循環させてカラム温度５０℃とした。そして、固定化酵素カラムの後方に活性炭を充填したカラム（１０×１００ｃｍ）を継続させ、この活性炭カラムを、ＳＶ２（ＳＶ：１時間当たりの通液量／吸着剤）で３０％グルコース（３Ｋｇグルコース／１０．０リットル蒸留水Ｗ／Ｖ）を循環させた。その結果、活性炭カラムに随時トレハロースが蓄積され、活性炭カラムを１０％（Ｗ／Ｖ）エタノールで洗浄することによりトレハロースが溶出された。そして、１０％エタノール画分を濃縮することにより、純度９５％のトレハロースを１Ｋｇを得た。
【００４７】
実施例６
２−デオキシグルコース１．４ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．６ｍｌに溶解させた後、実施例１で調製した酵素液を５０単位与え、７０℃にて４８時間反応させた。１００℃で５分間加熱し、酵素を失活させた後、反応液の一部を、実施例３と同一の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果を図７に示す。
【００４８】
反応終了後、蒸留水６ｍｌで希釈した溶液を活性炭カラム（２×１１ｃｍ）及びバイオラッド製のBio gel P-2(２．５×１４３ｃｍ）にかけて、９９％純度の２，２’−ジデオキシトレハロース１６２ｍｇを得た。この化合物の分子量を、図８に示したように、マススペクトル（Fab-MS）（機器：JEOL JMX-DX303H マススペクトルメータ、マトリックス：グリセロール) により測定し、図９に示した13Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）（機器：JEOL JMX-EX270 68.8MHz、内部標準：アセトン（δ３１．４ｐｐｍ）及び施光度（＋１５３．８０）により、図１０に示す２，２’−ジデオキシトレハロースの構造決定をした。
【００４９】
実施例７
２−デオキシグルコース５００ｍｇ及びグルコース２００ｍｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌに溶解させた後、ロボスファエラ属の産性するトレハラーゼを５０単位加え、７０℃にて４８時間反応させた。反応液の一部を実施例３と同一の条件下で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果を図１１に示す。
【００５０】
反応終了後、混合物を１００℃で５分間処理することにより酵素を失活させ、この反応液を６ｍｌの蒸留水によって希釈した後、活性炭カラム（２×１１ｃｍ）、及びバイオラッド製のＢｉｏ ｇｅｌ Ｐ−２（２．５×１４３ｃｍ）のゲル濾過にかけて、９９％純度の２−デオキシトレハロース４０ｍｇを分取した。この化合物の分子量を、図１２に示したように、マススペクトル（Ｆａｂ−ＭＳ）により測定し、図１３に示した13Ｃ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）及び施光度（＋１６５．２０）により、図１４に示す２−デオキシトレハロースの構造決定をした。
【００５１】
実施例６及び７に示す両物質は既に報告されているが、トレハラーゼを用いた合成法は知られていない。本発明のトレハラーゼを使用することにより、グルコースからトレハロース、２−デオキシグルコースから２，２’−ジデオキシトレハロース、２−デオキシグルコースとグルコースの混合物から２−デオキシトレハロースが高収率で生成し、また複雑な精製を必要とせず、高純度のものを、安価に製造することができる。
【００５２】
実験例１
本発明のトレハラーゼをＦＰＬＣで単一にまで精製した後、このトレハラーゼ４５μｌ（トレハラーゼ酵素濃度１ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６））を１００℃にて２０分加熱変性処理した。その後、加熱変性したトレハラーゼに、グリコペプチダーゼＦを５μｌ（０．５単位／ｍｌ，宝酒造（株）製）添加し、３７℃にて１２時間反応を行うことにより糖鎖を除去した。その結果、アクリルアミドのグラジエントゲル（第一化薬製、マルチプレートゲル４／１５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥより、分子量は５万〜６万、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥの測定により、約１０万〜１２万が確認された。また対照として、グリコペプチダーゼＦ未処理のトレハラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより分子量は１８万〜２５万、糖染色により赤色に染色した。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の新規なトレハラーゼを用いることによりトレハロースを製造すれば、菌体や培養液を抽出する方法に比べて、（１）グルコースからトレハロースを直接製造できるので、反応が単純で、副産物がなく、食品として安全に使用することができる。（２）原料としては、酵素以外にグルコースのみでトレハロースを高収率に生産するので、コストが非常に安くなる。
【００５４】
また、トレハロースは、食品においては冷凍保護、乾燥保護、抗う蝕のほか、他甘味料としての用途があり、酵素の冷凍保存など用途は非常に大きい。さらに、医薬の分野においても、トレハロース誘導体が制ガン剤等として利用されていることから、実用化を期待することができる。
【００５５】
さらに、２，２’−ジデオキシトレハロース、２−デオキシトレハロースの製造に関しては、化学的に合成する方法に比べて、２−デオキシグルコース及び２−デオキシグルコースとグルコースとにより、直接製造することができるので、精製工程が単純であり、工業的に利用することが可能となる。
従って、トレハラーゼ及び該酵素を用いてトレハロースを製造する方法は、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るトレハラーゼを産生する藻体の顕微鏡写真である。
【図２】本発明に係るトレハラーゼをＦＰＬＣに付した際のチャートである。
【図３】本発明に係るトレハラーゼの至適温度を示すグラフである。
【図４】本発明に係るトレハラーゼの温度安定性を示すグラフである。
【図５】本発明に係るトレハラーゼの至適ｐＨを示すグラフである。
【図６】本発明に係るトレハラーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。
【図７】２−デオキシグルコースをトレハラーゼに作用させた際に生成した２，２’−ジデオキシトレハロースのＨＰＬＣチャートである。
【図８】本発明における実施例６の縮合生成物のＦａｂ−ＭＳ解析スペクトルである。
【図９】本発明における実施例６の縮合生成物の13Ｃ−ＮＭＲ解析スペクトルである。
【図１０】２，２’−ジデオキシトレハロースの構造式である。
【図１１】２−デオキシグルコース及びグルコースをトレハラーゼに作用させた際に生成した２−デオキシトレハロースのＨＰＬＣチャートである。
【図１２】本発明における実施例７の縮合生成物のＦａｂ−ＭＳ解析スペクトルである。
【図１３】本発明における実施例７の縮合生成物の13Ｃ−ＮＭＲ解析スペクトルである。
【図１４】２−デオキシトレハロースの構造式である。
Claims (6)
- （１）α，α’−トレハロース、２，２’−ジデオキシ−α，α’−トレハロースおよび２−デオキシ−α，α’−トレハロースを、それぞれの構成糖に加水分解するが、ネオトレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、スクロースには作用しない、
（２）至適ｐＨがｐＨ５〜６であり、
（３）至適温度が６５℃であり、
（４）６５℃まで熱安定性を有し、
（５）ゲル濾過法により測定した分子量は、４００，０００〜５００，０００であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法によるサブユニットの分子量は１８０，０００〜２５０，０００であり、
（６）焦点電気泳動により測定した等電点は２．７であり、
（７）糖タンパクである、
特性を有することを特徴とするトレハラーゼ。 - 緑藻植物門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属を由来とする請求項１記載のトレハラーゼ。
- 請求項１記載のトレハラーゼを産生する能力を有する緑藻門緑藻綱クロレラ科ロボスファエラ属TM-33（受託番号ATCC 75630）。
- グルコースの存在下、請求項１または２記載のトレハラーゼを作用させることを特徴とするトレハロースの製法。
- ２−デオキシグルコースの存在下、請求項１または２記載のトレハラーゼを作用させることを特徴とする２，２’−ジデオキシ−α，α’−トレハロースの製法。
- ２−デオキシグルコースとグルコースとの存在下、請求項１または２記載のトレハラーゼを作用させることを特徴とする２−デオキシ−α，α’−トレハロースの製法。
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