JP6940835B2 - 細胞の培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の培養方法、細胞の凝集体、細胞凝集制御剤、及び、培地に関し、詳しくは、細胞の凝集塊の径を制御すること、及び、細胞を大量に得ることが可能な細胞の培養方法、該方法により得られる細胞の凝集体、細胞凝集制御剤、及び、該細胞凝集制御剤を含有する培地に関するものである。

通常、ヒトの肝臓は約２５００億個の細胞で構成されている。多能性幹細胞を用いて肝臓を組織化する場合、元の肝臓の１割程度が必要になると考えた場合、細胞数としては約２５０億個の細胞が必要になる。また、薬物試験でも均一な品質（以下「均質」とも言う）の細胞で試験を行う必要があることから多能性幹細胞を均質でかつ大量に培養する技術は産業への応用展開には不可欠なプロセスである。このような背景から多能性幹細胞を安定的に大量供給するために、簡便かつ高密度な培養が可能であることから浮遊培養法が提案されている。この培養方法は再生医療等への応用に堪えうる細胞数を得られることが期待されている培養方法の一つで、特に設備面及びコスト面で有利である。

しかしながら、多能性幹細胞は凝集体を形成し易いため，巨大凝集体を形成したり、得られる凝集体の径が不均一であるなど、様々な凝集体を形成する。また、このような凝集体は継代時の細胞生存率が低い等という問題があった。そこで培養容器中での細胞及び細胞塊の沈降を防止するためにスピナーフラスコ等を用いた撹拌操作を伴う三次元浮遊培養法が提案されている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。しかしながら多能性幹細胞が撹拌操作により発生する力学的ストレスに敏感であるため、培養中に細胞にダメージが発生する可能性があり、ストレスによる質の低下が発生するという点で問題がある。

そこで近時、培養バッグ中に培養液、メチルセルロース及びジェランガムを含有させ、その中で多能性幹細胞を培養し、継代時にナイロンメッシュフィルターを用いて多能性幹細胞スフェアを分解することが提案されている（非特許文献３参照）。しかしながら、この方法では、得られる細胞の数の面で満足できるものではなかった。さらに、ジェランガムにより細胞及び細胞塊の沈降を防止しするために培養液の粘度を上昇させているため、細胞が増殖するのに最低限必要な栄養と酸素を供給する程度の撹拌をもすることができないことから、大きな細胞塊とする場合は内側の細胞が生存できくなり、細胞の質が低下するという問題がある。また、得られる細胞塊の細胞すべてを生存させようとして、細胞塊を大きく成長させない場合は得られる細胞数が少なくなるという問題がある。このようなことから、この培養方法から得られる幹細胞は細胞の質及び得られる細胞数の両方を同時に満足できるものではなかった。

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｖｏｌ．９２，ＮＯ．７，９２０〜９３３，ＤＥＣＥＭＢＥＲ ３０，２００５

ＴＩＳＳＵＥ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ｐａｒｔ Ｃ Ｖｏｌ．１８，ＮＯ．１０，１〜１３，２０１２

Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．２，７３４〜７４５，Ｍａｙ ６，２０１４

そこで本発明の目的は、細胞の凝集塊の径を制御すること、及び、細胞を大量に得ることが可能な細胞の培養方法、該方法により得られる細胞の凝集体、細胞凝集制御剤、及び、該細胞凝集制御剤を含有する培地を提供することにある。

本発明者等は鋭意検討した結果、培地中に細胞接着分子を阻害する物質を含有させることによって、凝集体の形成に関与する細胞接着分子の機能を制御することが可能であること、及び、これによって浮遊培養において凝集体の径を制御することによって、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、細胞の培養方法に関する、以下の［１］〜［４］である。
［１］浮遊培養による細胞の培養方法であって、
前記細胞の細胞接着分子を阻害する物質（但し、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを除く）を培地中に添加して浮遊培養し、前記細胞の細胞凝集を制御する凝集制御工程、及び、
前記凝集制御工程で得られた細胞の凝集体を、前記細胞接着分子を阻害する物質を含まない培地中で浮遊培養する工程を含み、
前記細胞接着分子を阻害する物質が、（１）Ｅ−カドヘリン、（２）Ｅ−カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上であり、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質、及び、（３）Ｅ−カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上の領域を含み、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有する融合タンパク質の中から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする培養方法。
［２］前記凝集制御工程において、前記培地中に前記細胞接着分子を阻害する物質を１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含有するように添加することを特徴とする前記［１］記載の培養方法。
［３］前記細胞が、幹細胞または上皮細胞である前記［１］または［２］のいずれかに記載の培養方法。
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の培養方法で、細胞を培養することを特徴とする細胞の凝集体の製造方法。

本発明により、細胞の凝集塊の径を制御し、細胞を大量に得ることが可能な細胞の培養方法、該方法により得られる細胞の凝集体、細胞凝集制御剤、及び、該細胞凝集制御剤を含有する培地を提供することが可能となる。

本発明の培養方法の一実施形態を示す説明図である。 実施例１−１〜１−５及び比較例１−１で得られた、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃの使用量を０、５、１０、２０、５０及び１００μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ処理し、５日間ヒトｉＰＳ細胞を旋回浮遊懸濁培養した際の凝集体の形状を位相差顕微鏡で撮影した写真図（（Ａ）〜（Ｆ））である。スケールバーは５００μｍを示す。 実施例１−１〜１−５及び比較例１−１で用いた培地から測定した細胞のグルコース消費量を示すグラフ図である。 実施例１−１〜１−５及び比較例１−１で５日間培養して回収した細胞の培地１ｍｌ当たりの密度を示すグラフ図である。 実施例２−１〜２−３及び比較例２−１で得られた、それぞれリコンビナントＥ−カドヘリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｅ−カドヘリン抗体（１６μｇ／ｍｌ）、及び、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）で処理、並びに、細胞接着分子を阻害する物質を添加せずに処理し、１日間ヒトｉＰＳ細胞を旋回浮遊懸濁培養した際の凝集体の形状を位相差顕微鏡で撮影した写真図（（Ａ）〜（Ｄ））である。スケールバーは５００μｍを示す。 実施例３−１、３−２及び比較例３−１で得られた、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃの使用量を０、５０及び１００μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ処理し、２日間ヒトｉＰＳ細胞を旋回浮遊懸濁培養した際の凝集体の形状を位相差顕微鏡で撮影した写真図（（Ａ）〜（Ｃ））である。スケールバーは５００μｍを示す。 実施例３−１、３−２及び比較例３−１で得られた、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃの使用量を０、５０及び１００μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ処理し、５日間ヒトｉＰＳ細胞を旋回浮遊懸濁培養した際の凝集体の形状を位相差顕微鏡で撮影した写真図（（Ａ）〜（Ｃ））である。スケールバーは５００μｍを示す。図７（Ｃ）の凝集体の形態はピペッティングの際に変形したものと考えられる。 実施例３−１、３−２及び比較例３−１で用いた培地から測定した細胞のグルコース消費量を示すグラフ図である。 実施例３−１、３−２及び比較例３−１で５日間培養して回収した細胞の培地１ｍｌ当たりの密度を示すグラフ図である。

本発明の培養方法は、浮遊培養による細胞の培養方法であって、前記細胞の細胞接着分子を阻害する物質を培地中に添加し、前記細胞の細胞凝集を制御する凝集制御工程を含むことを特徴とするものである。また、本発明の培養方法によれば、凝集体の径を均一に制御することにより均一な質の細胞を大量に培養することも可能である。

下記に詳述するように、浮遊培養に用いる細胞を得る方法は特に限定されない。また、細胞は、Ｅ−カドヘリンを有する細胞であることが好ましく、幹細胞又は上皮細胞であることがより好ましい。

前記細胞の細胞接着分子を阻害する物質としては、細胞接着分子、細胞接着分子の一部の領域からなるタンパク質、細胞接着分子の全部または一部の領域を含む融合タンパク質、細胞接着分子の中和抗体、細胞接着分子と結合するペプチド、及び、これらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。前記細胞接着分子は、カドヘリン・ファミリーに属する分子であることがより好ましい。前記カドヘリン・ファミリーに属する分子は、Ｅ−カドヘリンであるか、又は当該分子と構造的に類似性を有する分子であってＥ−カドヘリンに係るＥＣ１ドメイン並びにＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメイン及びＥＣ５ドメインのうち１つ以上のドメインを含み、かつ、前記多能性幹細胞と同種親和性の結合能を有する分子であることが好ましい。

また、前記細胞の細胞接着分子を阻害する物質としては、Ｅ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンの一部の領域からなるタンパク質、Ｅ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、Ｅ−カドヘリンの中和抗体、Ｅ−カドヘリンと結合するペプチド、及び、これらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１種であることがより好ましい。

また、前記凝集制御工程の後に、得られた細胞の凝集体を、前記細胞接着分子を阻害する物質を含まない培地中で浮遊培養してもよい。これは、前記凝集制御工程において初期の凝集体の径を均一に制御すれば、その後の培養において前記細胞接着分子を阻害する物質を含まない培地中で浮遊培養しても、凝集体の大きさを均一に制御できるからである。このように後で前記細胞接着分子を阻害する物質を含まない培地中で浮遊培養することは、細胞数を増やす観点から好ましい。

本発明の細胞の培養方法の具体的な一実施形態として、ヒトｉＰＳ細胞を用いた一例を、図１を参照しつつ説明するが、本発明はこれに限定されない。まず、浮遊培養するための細胞を得るために、一般的な培養基材であるマトリゲル上に接着しているヒトｉＰＳ細胞を酵素処理によって剥離し（図１（Ａ））、回収する（図１（Ｂ））。前記凝集制御工程として、回収したｉＰＳ細胞と、ｉＰＳ細胞の細胞接着分子を阻害する物質であるＥ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質とを混合し、浮遊培養することで細胞同士の接着阻害処理を行う（図１（Ｃ））。Ｅ−カドヘリンはヒトｉＰＳ細胞の細胞間接着を司る膜タンパクであり、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質はＥ−カドヘリンの接着ドメインに抗体のＦｃタグを付けたリコンビナントタンパクであり、ヒトｉＰＳ細胞上のＥ−カドヘリン接着ドメインにＥ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質を接着させることで、細胞同士のＥ−カドヘリンを用いた接着を阻害する。他のＥ−カドヘリン阻害物質としては、例えばリコンビナントＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン抗体、Ｅ−カドヘリン阻害ペプチド等が挙げられる。この処理時間は１日から２日間程度で、その間シェーカーを用いて旋回培養を行う。前記処理後、通常の培養液に交換し、その後毎日培地交換を行う（図１（Ｄ））。

本発明を実施するための形態を、以下に詳細に説明する。尚、本明細書中に使用するとき、用語「多能性幹細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞をいう。「多能性幹細胞」は、初期胚より単離されるＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離されるＥＧ細胞を含むが、これに限定されない。本明細書中、「ＥＳ細胞」と表記した場合は「ＥＧ細胞」も含むこともある。

本明細書中に使用するとき、用語「未分化性」とは、多能性幹細胞において、少なくとも１つ以上の未分化マーカー、例えばＡＬＰ活性やＯｃｔ−３／４遺伝子（産物）の発現、または種々の抗原分子の発現により確認することができる未分化な状態を呈する性質を意味する。多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。

本明細書中に使用するとき、用語「分化多能性」とは、様々な種類の細胞に分化する能力をいう。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。

本明細書中に使用するとき、用語「培地」とは、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができる液体培地をすべて含む。

本発明の浮遊培養で使用する細胞を得る方法は特に限定されず、従来から行われている培養方法を用いることができる。以下では、多官能性幹細胞の培養方法について説明する。

多官能性幹細胞の培養方法としては培養皿（ディッシュ）や９６穴、４８穴などのマイクロプレート、プレート等の容器を用いる平面培養法、フラスコやバッグ、リアクター等を用いる浮遊培養法など、多能性幹細胞の培養に用いられているもののいずれをも使用できる。

前記平面培養を行う場合、ディッシュやプレート等の容器表面に細胞接着基材を設ける必要がある。このような細胞接着基材としては、寒天、ゼラチン、マトリゲルやラミニン、ビトロネクチン、Ｅ−カドヘリン等が挙げられる。これらの使用量は多能性幹細胞を培養する際に用いられる濃度であれば、特に制限はないが、容器に固定する際の水溶液濃度としては、２〜５０μｇ／ｍｌ程度である。

前記接着基材を、前記容器の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、接着基材を含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数分間〜一昼夜、より好ましくは２０分間〜１２時間、接触させることで達成できる。また、前もって接着性分子に人為的に抗原性分子を付加・融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。

上述の様に作製した培養容器は、多能性幹細胞の通常の培養法にそのまま使用することができる。すなわち、適当数の多能性幹細胞を、通常用いられる液体培地又は細胞培養液に懸濁し、それを当該培養基材に添加すればよい。その後の液体培地の交換や継代も、従来法と同様に行なうことができる。

前記材料により多能性幹細胞を培養することで、浮遊培養で必要な数の多能性幹細胞を得ることができる。細胞基材と細胞との分離及び細胞の回収は、通常、酵素処理によって行われる。このとき用いる酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ等が挙げられる。

［細胞接着分子を阻害する物質］
本発明の培養方法に用いられる細胞接着分子を阻害する物質は、細胞の凝集性に関与する細胞接着分子を阻害することが可能なものであり、上記のとおり、細胞接着分子やその誘導体等が好ましく、Ｅ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンの一部の領域からなるタンパク質、Ｅ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、Ｅ−カドヘリンの中和抗体、Ｅ−カドヘリンと結合するペプチド、及び、これらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１種であることがより好ましい。

カドヘリンとは、接着結合又はアドヘレンス・ジャンクション（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれるＣａ^２＋依存性の細胞間接着・結合に関与する接着分子であり、Ｅ（上皮）型、Ｎ（神経）型、Ｐ（胎盤）型の３種が代表例として知られている。これらのカドヘリン分子は、７００〜７５０アミノ酸残基からなる膜結合型糖タンパク分子であり、その細胞外領域には、約１１０アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣ）ドメインと呼ばれる領域が５個存在する。例えば、ヒトＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号１に示す）の場合、ＥＣ１、 ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５７〜２６２、２６５〜３７５、３７８〜４８６、４８７〜５９５、５９６〜７００に相当する（数値は配列番号１に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。また、マウスＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号２に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５９〜２６４、２６７〜３７７、３８０〜４８８、４８９〜５９７、５９８〜７０２に相当する（数値は配列番号２に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。これらのＥＣドメインは、異なるカドヘリン分子種の間で相同性を有しており、特にＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２）の相同性が高い。この様な類似の構造を呈するカドヘリン分子としては、現在、５０種類以上のものが知られており、これらの分子を総称してカドヘリン・ファミリーと呼ぶ。以上、カドヘリンに関する総説としては、Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：６１９，１９９５；Ｍａｒｒｓ ＆ Ｎｅｌｓｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５：１５９，１９９６；Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：１１９，１９９７；Ｙａｇｉ ＆ Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１１６９，２０００；Ｇｕｍｂｉｎｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４８：３９９，２０００等を参照のこと。

また、Ｅ−カドヘリン（別名、カドヘリン−１）は、肝臓や腎臓、肺等の内臓臓器の実質細胞やケラチノサイト等の上皮細胞に広く発現し、その細胞間接着を担う重要な接着分子であることが知られている（総説としては、Ｍａｒｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：２２７，１９９３；Ｍａｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６０：７６３，１９９５；Ｅｌ−Ｂａｈｒａｗｙ ＆ Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．４３：２２４，１９９８；Ｎｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：７７，１９９９等を参照のこと）。

Ｅ−カドヘリンに属するタンパク質を作製する方法は、特に限定されないが、分子生物学的手法を用いてリコンビナント・タンパク質を作製・精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、多能性幹細胞のＥ−カドヘリンに属するタンパク質を、生体組織・細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。

例えばＥ−カドヘリン遺伝子は、既にヒト（配列番号１）、マウス（配列番号２）、ラット等の動物で単離・同定され、その塩基配列が、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能である（アクセス番号：（ヒト）ＮＭ＿００４３６０；（マウス）ＮＭ＿００９８６４；（ラット）ＮＭ＿０３１３３４）。そのため、当業者であれば、Ｅ−カドヘリン遺伝子に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。また、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡは、理化学研究所ジーンバンク（日本・筑波）やＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ＲｅｓＧｅｎ等からも購入することができる。使用するカドヘリンファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子としては、多能性幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましく、例えば、マウスＥＳ細胞を用いて本発明を実施する場合、マウスのＥ−カドヘリンｃＤＮＡの使用が望ましい。しかし、異種動物由来のもの、即ち、ヒトやサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、又は鳥類（例えば、ニワトリ等）、又は両生類（例えば、アフリカツメガエル等）由来のＥ−カドヘリンｃＤＮＡも使用することができる。

Ｅ−カドヘリンに属するタンパク質のリコンビナント・タンパク質を作製するための好適な方法の一例は、当該分子をコードする遺伝子を、ＣＯＳ細胞や２９３細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞に導入し、発現させることを特徴としている。好ましくは、当該遺伝子は、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。また、転写・発現させる遺伝子は、さらにポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、ＳＶ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０ウイルスやサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ Ｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。

上記のリコンビナント・タンパク質を作製するために用いる遺伝子は、当該分子をコードする遺伝子の全長領域を含むものである必要はなく、部分的な遺伝子配列であっても、その部分配列がコードするタンパク質またはペプチド分子が、本来の当該分子と同程度、又はそれ以上の接着活性を有するものであればよい。例えば、本発明の好適な事例に用いられるＥ−カドヘリンの場合、細胞外領域をコードする、Ｎ末端側から６９０〜７１０アミノ酸残基を含む部分配列から作製されるリコンビナント・タンパク質、すなわちＥＣ１〜ＥＣ５ドメインを含むタンパク質を使用することができる。また、一般的にカドヘリン分子は、最もＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１）が、当該分子の結合特異性、すなわち、同種親和性を規定している（Ｎｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１：１４７，１９９０）ため、少なくともＥＣ１を含み、それ以外のドメインの１個又は数個を除いたタンパク質分子を作製、使用することも可能である。さらには、上記のタンパク質分子と、アミノ酸レベルで８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を示し、かつ、接着活性を有するタンパク質も使用することができる。

また、上記のリコンビナント・タンパク質は、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質として作製することも可能である。例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域やＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タンパク質、ＭＢＰ（Ｍａｎｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、アビジン・タンパク質、Ｈｉｓ（オリゴ・ヒスチジン）タグ、ＨＡ（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｒｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）タグ等との融合タンパク質として作製し、プロテインＡ／Ｇカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、リコンビナント・タンパク質の精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にＦｃ融合タンパク質は、２両体を形成するため、タンパク質としての活性が安定しているため、本発明の実施において好適である。

イムノグロブリンのＦｃ領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離・同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む塩基配列の配列情報は、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号：ＡＪ２９４７３０、ＡＪ２９４７３１、ＡＪ２９４７３２、及びＡＪ２９４７３３として登録されている。したがって、当業者であれば、Ｆｃ領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｆｃ領域部分をコードするｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。この場合、使用するＦｃ領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインＡ／Ｇとの結合性が強いヒトＩｇＧ１やＩｇＧ２、又はマウスＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等のＦｃ領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Ｆｃ領域に変異を導入することによりプロテインＡとの結合性を高める方法も知られており（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３参照）、当該法により遺伝子改変を加えたＦｃタンパク質も使用することもできる。

なお、本発明を実施するための好適に用いられるＥ−カドヘリンの場合、当該リコンビナント・タンパク質の作製法の一例が報告されている（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３参照）。

また、マウス又はヒトのＥ−カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、ヒトＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列及びＨｉｓタグ配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｅ社）が市販されており、マウス又はヒト由来のＥ−カドヘリン・タンパク質として使用することもできる（Ｅ−Ｃａｄ−Ｆｃタンパク質）。

また、Ｅ−カドヘリン等の細胞接着分子と結合するペプチドを作製する方法は、特に限定されず、例えば、Ｅ−カドヘリン等の細胞接着分子を標的分子として、従来から行われているファージディスプレイ等の親和性選択法（アフィニティセレクション）を用いてスクリーニングすればよい（例えば、Ｄｅｖｅｍｙ Ｅ，Ｂｌａｓｃｈｕｋ Ｏ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００８；２９：１８５３−６１）。具体的な方法の一例としては、まず、ペプチドライブラリーから選ばれたペプチドを、予めプレートのウェルにＥ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質をコーティングされたウェル中に入れインキュベートする。次いで、ウェルから未結合ファージを除去するために洗浄する。結合したファージは、２段階で溶出する。第一溶出工程で２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴＢＳを用いて行い、第２溶出工程では０．２ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出する。ｐＨ２．２の溶出液に１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を使用し中和する。溶出したファージの各画分をＥＲ２７３８細胞に感染させることにより増幅し、ポリエチレングリコール沈殿により精製する。ＥＤＴＡ画分からの増幅したファージは、２回目のバイオパニング操作に用い、ＥＤＴＡ溶出液のみは３回目のバイオパニング操作に使用した。酸分画から増幅したファージはまた、２回目のバイオパニング操作に用いられ、酸溶出液のみは増幅され、最終バイオパニング操作に用いられた。スクリーニングの最後に、ファージを播種し、単離されたクローンをランダムに採取し、増幅する。各ファージクローンの一本鎖ＤＮＡを抽出し、アミノ酸配列を、ＤＮＡシークエンスにより推定する。Ｅ−カドヘリンと結合するペプチドとしては、例えば配列番号３のアミノ酸配列に示すＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬや配列番号４〜３０のアミノ酸配列に示すペプチド等が挙げられる。これらのペプチドは、標的分子との結合が失われない範囲で公知慣用の修飾（例えばＰＥＧ化やＣ末端のアミド化等）がされていてもよい。これらのペプチドは単独でも用いることもできるが２種以上を組み合わせて用いることもできる。

また、Ｅ−カドヘリン等の細胞接着分子の中和抗体を作製する方法は、特に限定されず、従来から行われている公知の方法を用いることができる。前記Ｅ−カドヘリン等の細胞接着分子と結合するペプチドを抗体化して用いてもよい。例えば、細胞接着分子や細胞接着分子と結合するペプチドを抗原とし、動物に免疫して作製する方法や、発現ベクターに組み込んだ目的タンパク質の遺伝子を動物に導入し、動物の体内で発現させ、その目的タンパク質を抗原として抗体を作製、回収する方法（ＤＮＡ免疫法）等が挙げられる。

本明細書において、細胞接着分子やＥ−カドヘリンの一部の領域からなるタンパク質とは、細胞接着分子やＥ−カドヘリンの親分子と比較して、１以上の分子が欠損したタンパク質であって、細胞接着性を有するものである。

また、本明細書において、誘導体とは、親分子と比較してその配列に１つ以上の相違を呈する分子であり、かつ、細胞接着性を有するものである。例えば細胞接着分子やＥ−カドヘリンの全部または一部と、他の化学物質または低分子量のポリマー成分もしくはオリゴマー成分との反応生成物が挙げられる。前記誘導体は、親分子との相同性が７５％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。

［凝集制御工程］
本発明の培養方法における凝集制御工程は、培養する細胞の細胞接着分子を阻害する物質を培地中に添加し、前記細胞の細胞凝集を制御する工程である。凝集制御工程は、容器内に所望の培地を入れ、その中に細胞と細胞接着分子を阻害する物質とを含有させ、静置もしくは撹拌等を行いながら浮遊培養すればよい。これによって、細胞表面に細胞接着分子を阻害する物質を作用させ、所望の凝集体の大きさになるように細胞間接着性を制御することができる。

このときの細胞接着分子を阻害する物質の添加量は細胞の量や培地成分により適宜選択され、特に細胞接着分子を阻害する物質を添加して浮遊培養を開始してから４８時間経過後の凝集体の大きさ（径）が２０μｍ以上１ｍｍ未満になるように適宜選択されるが、例えば、Ｅ−カドヘリンに属するタンパク質や中和抗体を用いた場合は５〜１００μｇ／ｍｌの濃度となるように、また、Ｅ−カドヘリン等の細胞接着分子と結合するペプチドを用いた場合は０．０１〜１０００μＭの濃度となるように、添加するのが好ましい。上記範囲より添加量が少ないと得られる凝集体の大きさが大きくなり過ぎる場合があるため、凝集体の内側の細胞が生存できなくなったり、幹細胞の場合は未分化性を失う場合がある。また、上記範囲を超えると、凝集体の大きさが顕著に不均一になったり、大きな凝集体の表面を小さな凝集体が覆われることによって、内側の大きな凝集体の細胞が生存できなくなる場合がある。また、均質な細胞を大量に得るという点からは、Ｅ−カドヘリンに属するタンパク質や中和抗体を用いた場合の濃度は、好ましくは７〜８０μｇ／ｍｌ、より好ましくは８〜６５μｇ／ｍｌの範囲、さらに好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌの範囲であり、Ｅ−カドヘリン等の細胞接着分子と結合するペプチドを用いた場合の濃度は、好ましくは０．１〜９００μＭ、より好ましくは０．５〜８００μＭの範囲、さらに好ましくは１〜６００μＭの範囲である。上記範囲であれば、４８時間経過後の凝集体の大きさを２０μｍ以上１ｍｍ未満の範囲にコントロールすることができる。凝集体をこの大きさにコントロールすることにより、最終的に得られる凝集体の大きさを均質にすることができ、結果的に細胞生存率及び細胞数を多くすることができる。これは、従来のように細胞同士を単に接着しにくくする方法とは異なり、本発明においては、細胞接着分子を阻害する物質が接着因子に直接働きかけ細胞同士の接着量を細胞レベルでコントロールしているからであると考えられる。

さらに、Ｅ−カドヘリンに属するタンパク質や中和抗体を用いた細胞接着分子を阻害する物質の添加量は、培地中のタンパク質含有量に起因するタンパク質吸着性を考慮すると、タンパク質含有量が少ない培地（例えばタンパク質含有量が１ｍｇ／ｍｌ以下）を用いる場合は２５〜１００μｇ／ｍｌ、３０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲、タンパク質含有量が多い培地（例えば１０ｍｇ／ｍｌ以上）を用いる場合は７〜８０μｇ／ｍｌ、より好ましくは８〜６５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌの範囲が好ましい。このような量で細胞接着分子を阻害する物質を添加することで、細胞接着分子を阻害する物質が目的の細胞膜カドヘリンをブロックする前に他の細胞膜や培養基材への吸着し、細胞膜カドヘリンを確実にブロックすることが可能である。

また、細胞接着分子を阻害する物質を添加した際の細胞への処理時間は、凝集体の大きさにより適宜決定することができるが、通常、２４〜４８時間である。この期間より短いと凝集体を形成することが難しくなる場合があり、また、この範囲を超えると凝集体が大きくなり難くなるため得られる細胞数が少なくなる場合がある。

本発明の培養方法においては、細胞数を増やす観点から、上記のとおり、凝集制御工程で得られた細胞の凝集体を、通常の浮遊培養、即ち前記細胞接着分子を阻害する物質を含まない培地中で浮遊培養することが好ましい。この際、培養終了の目安は、全ての凝集体の大きさが２５０μｍ以上１ｍｍ未満、好ましくは２５０〜９５０μｍ、より好ましくは３００〜７５０μｍ、さらに好ましくは３００〜６００μｍ程度の範囲となるタイミングである。

本発明において、浮遊培養方法は、バッグやフラスコ、リアクター等の容器内で細胞を浮遊培養する方法であれば特に限定されない。浮遊培養であれば静地培養でもよいが、細胞への栄養分付与性及び酸素付与性の面からこれらを付与できる条件、例えば撹拌や流れ等を伴う条件下で培養するのが好ましい。
撹拌を行う際の条件としては、例えば２０〜１５０ｒｐｍ程度の撹拌を行うことが好ましい。撹拌以外で栄養分や酸素を付与する方法としては培養液中に気体を含有させるバブリング方法や培養液を還流させる方法などが挙げられるまた、酸素を付与する方法としては、前述の方法以外に培養液中にヘモグロビンを含有させて効率的に酸素を供給する方法等が挙げられる。

本発明の浮遊培養で用いる培地は、特に制限はなく細胞を培養する際に使用されている培地を細胞の種類に合わせ用いることができる。以下では、多能性幹細胞を培養するための培地について詳述する。多能性幹細胞を培養するための液体培地としては、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができるものであれば特に限定されない。その具体例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられ、通常、２ｍＭ程度のグルタミン及び／又は１００μＭ程度の２−メルカプトエタノールを添加して使用する。また、ＥＳ細胞培養用培地として市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）や、ＥＳ ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌ ＆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴＸ−ＷＥＳ（Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社）等も用いることができる。これらの培地にはＦＢＳを５〜２５％程度添加することが好ましいが、無血清培養することも可能で、例えば、１５〜２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を代用することができる。また、ＭＥＦ細胞の培養上清やｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、ＳＣＦ等を添加した培地を使用してもよく、その詳細な方法は公知である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１；国際公開番号第０１／５１６１６号；国際公開番号第０３／０２０９２０号；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７，２００４）。多能性幹細胞の培養に用いる液体培地としては、上記のほかに、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＩＰＬ４１培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ウィリアム培地Ｅ、ＭＣＤＢ１３１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（ギブコ社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）等の公知慣用の培地を用いることができる。

培地としてアルブミンをはじめとしたタンパク質を多く含む培地（例えばタンパク質含有量が１０ｍｇ／ｍｌ以上）を用いる場合、培地中のタンパク質により細胞膜表面や培養基材などへのタンパク質の吸着は抑制される傾向を示し、タンパク質含有量が少ない培地（例えば１ｍｇ／ｍｌ以下）を用いると、タンパク質を多く含む培地に比べ細胞膜表面や培養基材などへのタンパク質の吸着が発生する可能性が高くなる傾向を示す。

また、培地中には多能性幹細胞を培養する際に慣用的に用いられている成分、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等を目的に合わせて添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、目的に合わせてその他の化学成分あるいは生体成分を一種以上組み合わせて添加することもできる。

前記動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、例えばウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、ウシ血清アルブミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ポリエチレングリコール、ピルビン酸ナトリウム、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックス、各種細胞接着分子等が挙げられる。

前記サイトカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）等が挙げられる。

前記ホルモンとしては、例えばメラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、アディポネクチン、抗ミュラー管ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン、アンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インスリン、インスリン様成長因子、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、オキシトシン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、プロラクチン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、エンケファリン等が挙げられる。

前記増殖因子としては、例えばトランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子−１、２、３、４、５、６、７、８又は９（ＦＧＦ−１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１等）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５又は７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。

遺伝子組替え技術により前記サイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも培地に添加してもよい。その例としては、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）等が挙げられる。

前記細胞外マトリックスや細胞接着分子としては、例えばコラーゲンＩ〜ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１〜１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、各種インテグリン、デスモコリン、デスモグレイン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、マトリゲル、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル等が挙げられ、これらの切断断片等であってもよい。

前記抗生物質としては、例えばサルファ製剤、ペニシリン、アンピシリン、フェネチシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、アンジノシリン、メシリナム、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、ピペミド酸、クラブリン酸、β−ブロモペニシラン酸、β−クロロペニシラン酸、６−アセチルメチレン−ペニシラン酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、スルバクタム、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、ｍ−カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン等が挙げられる。

本発明の凝集体は、本発明の培養方法により得られた細胞の凝集体であって、均一な凝集径を有することを特徴とするものである。本発明の凝集体からは、多くの細胞が得られ、かつ、得られる細胞はいずれも未分化性、分化多能性を維持している。細胞の増殖性及び分化多能性の観点から、浮遊培養４８時間後の全ての凝集体の径が２０μｍ以上１ｍｍ未満の範囲、好ましくは２０〜９５０μｍの範囲、より好ましくは２０〜７５０μｍの範囲、さらに好ましくは５０〜５００μｍの範囲、特に好ましくは１００〜３００μｍの範囲である。

また、本発明の細胞凝集制御剤は、細胞接着分子を阻害する物質を含有することを特徴とするものである。本発明の細胞凝集制御剤は、細胞の浮遊培養で凝集体の粒径を制御するために用いることが好ましい。細胞接着分子を阻害する物質は特に限定されないが、Ｅ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンの一部の領域からなるタンパク質、Ｅ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、Ｅ−カドヘリンの中和抗体、Ｅ−カドヘリンと結合するペプチド、及び、これらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の培養方法は、細胞、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を均一な品質でかつ大量に得ることが可能な幹細胞の培養する方法として極めて有用である。また、本発明の培養、細胞の凝集体、細胞凝集制御剤、細胞凝集制御剤、及び、培地は再生医療や創薬分野において極めて有用である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。

＜多能性幹細胞の準備＞
マトリゲル水溶液（ＤＭＥＭにて５０倍で希釈）を未処理のティッシュカルチャー６ウェルプレート（Ｉｗａｋｉ社製）に１ｍＬ／ｗｅｌｌの量で加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後，コート剤を取り除き，ヒトｉＰＳ細胞培養プレートを準備した。
多能性幹細胞としてｈｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４−Ｍ、東京大学ステムセルバンク）を用いた。この細胞を準備した前記培養プレートに１００，０００〜４００，０００個／ｗｅｌｌの密度で細胞を播種し、４日間培養した。培養液にはｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い，２ｍＬ／ｗｅｌｌの培地量で培養した。その間、播種１日後を除き、毎日培地交換を行った。
細胞の剥離・回収にはトリプシン様酵素であるＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。培養液を取り除いた後、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを１ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、３７℃で２〜５分インキュベートした。その後，ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを取り除き、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を１０μＭ含んだｍＴｅＳＲ１を２ｍＬ／ｗｅｌｌで加え、１０００μＬマイクロピペットでピペッティングすることで細胞を剥離した。この回収した細胞懸濁液は、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ）を透過させ、細胞を単一細胞あるいは微小凝集体として回収し、浮遊懸濁培養への導入用細胞を得た。

＜Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製＞
Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質の発現と精製を、Ｎａｇａｏｋａ Ｍ， Ａｋａｉｋｅ Ｔ．， ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ． ２００３；１６：２４３−２４５．に準拠して行った。本実施例において、マウスのＥ−カドヘリン全長（理研 ＢＲＣ ＤＮＡバンク、コード１１８４）から得た細胞外ドメインｃＤＮＡと、変異導入ＩｇＧ１−Ｆｃドメイン ｃＤＮＡ （Ｔ２５２Ｍ／Ｔ２５４Ｓ）をライゲーションし、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。

＜細胞の凝集体の径の測定＞
下記実施例及び比較例では、培養期間中の細胞の凝集体の形態及び大きさは位相差顕微鏡（製品名：ＤＭ ＩＲＢ、ＬＥＩＣＡ社製）を用いて観察及び測定した。

＜実施例１＞
［実施例１−１］
低細胞接着処理を施した１２ウェルプレートにｍＴｅＳＲ１を１ｍＬ／ｍｌを加え、その中にあらかじめ用意したｈｉＰＳ細胞（２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と、ｈｉＰＳ細胞の細胞接着分子を阻害する物質としてＥ−カドヘリン−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）とを同時に入れ、９０〜１２０ｒｐｍの速度で４８時間旋回培養した。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理後４８時間経過時の凝集体の大きさは３００〜７００μｍの範囲であった。次いで培地交換を行いＥ−カドヘリン−Ｆｃを添加しない以外は前記と同条件で３日間培養し凝集体を得た。この凝集体の大きさは５００〜１０００μｍの範囲であった。

［実施例１−２］
実施例１−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃの濃度を１０μｇ／ｍｌとした以外は全て実施例１と同様にして凝集体を得た。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理後４８時間経過時の凝集体の大きさは２００〜４００μｍの範囲であり、培地交換を行いＥ−カドヘリン−Ｆｃを添加しないで３日間培養した時の凝集体の大きさは３００〜１０００μｍの範囲であった。

［実施例１−３］
実施例１−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃの濃度を２０μｇ／ｍｌとした以外は全て実施例１と同様にして凝集体を得た。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理後４８時間経過時の凝集体の大きさは１００〜５００μｍの範囲であり、培地交換を行いＥ−カドヘリン−Ｆｃを添加しないで３日間培養した時の凝集体の大きさは３００〜６００μｍの範囲であった。

［実施例１−４］
実施例１−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃの濃度を５０μｇ／ｍｌとした以外は全て実施例１と同様にして凝集体を得た。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理後４８時間経過時の凝集体の大きさは１００〜３００μｍの範囲であり、培地交換を行いＥ−カドヘリン−Ｆｃを添加しないで３日間培養した時の凝集体の大きさは３００〜６００μｍの範囲であった。

［実施例１−５］
実施例１−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃの濃度を１００μｇ／ｍｌとした以外は全て実施例１と同様にして凝集体を得た。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理後４８時間経過時の凝集体の大きさは１５０〜７００μｍの範囲であり、培地交換を行いＥ−カドヘリン−Ｆｃを添加しないで３日間培養した時の凝集体の大きさは３００〜１０００μｍの範囲であった。

［比較例１−１］
実施例１−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃを用いなかった以外は全て実施例１と同様にして凝集体を得た。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理後４８時間経過時の凝集体の大きさは１０００〜３０００μｍの範囲、３日間培養した時の凝集体の大きさもまた１０００〜３０００μｍの範囲であった。

＜細胞の凝集体の観察＞
実施例１−１〜１−５及び比較例１−１において、培養２日目（４８時間Ｅ−カドヘリン−Ｆｃで処理）における細胞の凝集体の形態を位相差顕微鏡（製品名：ＤＭ ＩＲＢ、ＬＥＩＣＡ社製）を用いて観察した。得られた顕微鏡写真を図２（Ａ）〜（Ｆ）に示す。図２（Ａ）〜（Ｆ）から、比較例１−１（Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ濃度＝０μｇ／ｍｌ）で得られた凝集体に比べ、実施例１−１〜１−５（それぞれＥ−カドヘリン−Ｆｃ濃度＝５、１０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌ）で得られた凝集体は大きさが制御されていることが分かる。特にＥ−カドヘリン−Ｆｃの濃度を１０〜５０μｇ／ｍｌの範囲としたものは、過剰凝集が抑制され、単純な旋回培養であっても均一な凝集体形成を達成させる効果も得られていることが分かる。

＜グルコース消費量の測定＞
全培養期間中、培地交換の際に培養液を３００μＬ採取し、酵素電極式バイオアナライザー（ＹＳＩ２９５０）を用いてのグルコース濃度を解析し、グルコース消費量変化を求めた。その結果を図３に示す。

＜細胞数の測定＞
培養終了後、細胞はＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞に分散した後、トリパンブルー（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびエオジノフィルカウンター（タタイ社製）を用いて生細胞数を計数した。その結果を図４に示す。

図３、４に示すグラフからグルコース消費量を生存している細胞数の指標とすることができる。図３、４に示す結果から、比較例１−１（Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ濃度＝０μｇ／ｍｌ）で得られた凝集体に比べ、実施例１−１〜１−５（それぞれＥ−カドヘリン−Ｆｃ濃度＝５、１０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌ）で得られた凝集体はグルコース消費量及び細胞数のいずれにおいても優れた効果を発揮していることが分かる。特に培養５日目におけるグルコース消費量は、実施例１−１は比較例１−１に比べ約２倍、細胞数は１．５〜１．７５倍程度まで増加している。この傾向は実施例１−２〜１−５ではさらに強く、グルコース消費量は実施例１−２及び１−５で２倍、実施例１−３及び１−４で２．５倍となり、細胞数はおおよそ実施例１−２で１．８倍、実施例１−３で２．５倍、実施例１−４で３倍、実施例１−５で２．３倍まで増加していることから、大量の多能性幹細胞が得られていることが分かる。また、図２に示すように凝集体の径がより均一に制御された実施例１−２〜１−４の方が優れた結果であったことから、過剰な細胞の凝集を抑制し、適正な粒径の凝集体をより多く形成させることで増殖効率を高めることが可能となることが分かる。このことから、得られる細胞は未分化性及び分化多能性を維持した幹細胞であることが分かる。一般に細胞凝集体は栄養基質や酸素の拡散により成長できる限界のサイズが存在することも考慮すると、凝集体の径の制御はヒトｉＰＳ細胞の大量培養プロセスの簡易化に大いに寄与することが推察される。

＜実施例２＞
［実施例２−１］
低細胞接着処理を施した１２ウェルプレートにｍＴｅＳＲ１を１ｍＬ加え、その中にあらかじめ用意したｈｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４−Ｍ、東京大学ステムセルバンク）（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と、ｈｉＰＳ細胞の細胞接着分子を阻害する物質としてリコンビナントＥ−カドヘリン（ＬＤ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社製ｈＲＰ−０３３９）（１０μｇ／ｍｌ）とを同時に入れ、９０ｒｐｍの速度で１日旋回培養した。

［参考例２−２］
実施例２−１において、ｈｉＰＳ細胞の細胞接着分子を阻害する物質をＥ−カドヘリンの中和抗体（ミリポア社製のＥ−カドヘリン抗体、ＭＡＢ３１９９Ｚ）（１６μｇ／ｍｌ）に変えた以外は全て実施例２−１と同様にして凝集体を得た。

［実施例２−３］
実施例２−１において、ｈｉＰＳ細胞の細胞接着分子を阻害する物質をＥ−カドヘリン−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）に変えた以外は全て実施例２−１と同様にして凝集体を得た。

［比較例２−１］
実施例２−１においてリコンビナントＥ−カドヘリンを用いなかった以外は全て実施例２−１と同様にして凝集体を得た。

＜細胞の凝集体の観察＞
実施例２−１、参考例２−２、実施例２−３及び比較例２−１における細胞の凝集体の形態を位相差顕微鏡（製品名：ＤＭ ＩＲＢ、ＬＥＩＣＡ社製）を用いて観察した。得られた顕微鏡写真を図５（Ａ）〜（Ｄ）に示す。図５（Ａ）〜（Ｄ）から、比較例２−１（細胞接着分子を阻害する物質の添加なし）で得られた凝集体に比べ、リコンビナントＥ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンの中和抗体及びＥ−カドヘリン−Ｆｃはいずれも凝集体の径を均一に調整できることが分かる。また、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃは、リコンビナントＥ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンの中和抗体と比べ、凝集体が大きくかつその形状が均一であることから、リコンビナントＥ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンの中和抗体よりも４８時間後の全ての凝集体の径を２０μｍ以上１ｍｍ未満の範囲で大きくすることができ、多くの細胞が得られることが推測される。

＜実施例３＞
［実施例３−１］
低細胞接着処理を施した１２ウェルプレートにＥｓｓｅｎｔｉａｌ８を１ｍＬ加え、その中にあらかじめ用意したｈｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４−Ｍ、東京大学ステムセルバンク）（２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と、ｈｉＰＳ細胞の細胞接着分子を阻害する物質としてＥ−カドヘリン−Ｆｃ（５０μｇ／ｍｌ）とを同時に入れ、１００ｒｐｍの速度で５日間旋回培養した。尚、培養２日目以降（培養開始から４８時間経過後）は、Ｅ−カドヘリン−Ｆｃを添加していない培地で毎日培地交換を行った。

［実施例３−２］
実施例３−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃの濃度を１００μｇ／ｍｌとした以外は全て実施例３−１と同様にして凝集体を得た。

［比較例３−１］
実施例３−１においてＥ−カドヘリン−Ｆｃを用いなかった以外は全て実施例３−１と同様にして凝集体を得た。

＜細胞の凝集体の観察＞
実施例３−１、３−２及び比較例３−１において、培養２日目及び５日目における細胞の凝集体の形態を位相差顕微鏡（製品名：ＤＭ ＩＲＢ、ＬＥＩＣＡ社製）を用いて観察した。得られた顕微鏡写真を図６、７に示す。図６、７に示す結果から、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８を培地として用いた場合にも、凝集体の大きさを制御できることがわかる。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃを添加した場合、培養５日目は、凝集体サイズが培養２日目よりも成長しており、その直径は５００μｍ前後で制御されている。
ここで、培地としてｍＴｅＳＲ１を用いた実施例１−１〜１−５（図２）を考慮すると、培地としてタンパク質含有量が多いｍＴｅＳＲ１（タンパク質含有量約１８ｍｇ／ｍｌ）を用いた場合、タンパク質含有量が少ない培地であるＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（タンパク質含有量約９μｇ／ｍｌ）を用いた場合と比較して、細胞接着分子を阻害する物質の量が少なくても同等の効果が得られることが分かる。これは、タンパク質含有量が少ない培地を用いた場合、細胞接着分子を阻害する物質が目的の細胞膜カドヘリンをブロックする前に他の細胞膜や培養基材に吸着したことが推察される。

＜グルコース消費量及び細胞数の測定＞
実施例３−１、３−２及び比較例３−１について、上記と同様にグルコース消費量及び細胞数を測定した結果（図８及び図９）、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの添加によってグルコース消費量及び細胞数のいずれにおいても優れた効果が示されることを確認した。

Claims (4)

1. 浮遊培養による細胞の培養方法であって、
   前記細胞の細胞接着分子を阻害する物質（但し、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを除く）を培地中に添加して浮遊培養し、前記細胞の細胞凝集を制御する凝集制御工程、及び、
   前記凝集制御工程で得られた細胞の凝集体を、前記細胞接着分子を阻害する物質を含まない培地中で浮遊培養する工程を含み、
   前記細胞接着分子を阻害する物質が、（１）Ｅ−カドヘリン、（２）Ｅ−カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上であり、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質、及び、（３）Ｅ−カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上の領域を含み、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有する融合タンパク質の中から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする培養方法。
2. 前記凝集制御工程において、前記培地中に前記細胞接着分子を阻害する物質を１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含有するように添加することを特徴とする請求項１記載の培養方法。
3. 前記細胞が、幹細胞または上皮細胞である請求項１または２記載の培養方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項記載の培養方法で、細胞を培養することを特徴とする細胞の凝集体の製造方法。

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