KR20120017019A - 줄기 세포 배양 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 및 배아 생식 세포를 포함하는 줄기 세포를 배양하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 전후 참조
본 출원은 2009년 4월 13일자 제출된 미국 가특허 출원 61/168,679에 대해 우선권을 주장하며, 전문이 참고문헌에 통합된다.
기술 분야
본 명세서는 세포 배양 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 명세서는 실질적으로 미분화된 상태에서 높은 생존력을 유지하면서 줄기 세포의 장기 배양에 이용할 수 있는 배지 및 배양 조건에 관한 것이다.
줄기 세포는 기관이 재생될 수 있고, 조직이 복구될 수 있고, 생물학적 인자들을 준비하거나 전달하고 그리고 질병 또는 장애를 치료할 수 있는 잠재적 원천이다.
요약
인간의 만능(pluripotent) 줄기(hPS) 세포 가령, 인간 배아 줄기(hES) 및 유도된 만능 줄기(hiPS) 세포는 실질적인 응용을 방해하는 단일 세포 조건하에서 매우 공격받기 쉽다. 본 명세서는 비-근육 미오신 II (NMII)의 매우 강력한 억제제(가령, 블레비스타틴)로 치료하면 클론 밀도 및 현탁 조건하에허 실질적으로 hES 및 hiPS 세포의 생존을 실질적으로 강화하고, 그리고 합성 매트릭스와 복합하여, 자가-재생을 위한 완전하게 정의된 환경을 뒷받침한다.
본 명세서는 배양 과정으로부터 동물 또는 인간으로부터 유도된 세포 밖의 매트릭스 (ECMs)를 제거함으로써 인간 유도된 만능 줄기 (hiPS) 세포 및 인간 배아 줄기 (hES) 세포의 증식을 위한 실질적으로 병인균-없는 배양 환경을 제공한다. 본 명세서는 미오신 II의 억제는 세포-매트릭스 흡착 및 세포 생존을 증가시켜, 완전하게 정의된 배양 배지내에서 화학적으로 합성된 배양 기질인 폴리-D-리신 코팅상에서 hiPS 및 hES 세포의 자가-재생을 효과적으로 뒷받침한다는 것을 설명한다. 인간 만능 줄기 세포의 유도는 세포 유지 및 확장과 동일한 환경을 이용하기 때문에, 이러한 배양 방법은 세포-기반 치료 방법에 필수적인 이종(xeno)-유도된 물질이 완벽하게 없는 새로운 세포계 유도화에 적용할 수도 있을 것이다.
현재 피더없는(feeder-free) hESCs 배양 배양 프로토콜은 증식을 위하여 hESCs가 부착할 때 필요한 Matrigel™, 혈청 성분들, 그리고 인간 세포-유도된 ECMs와 같은 특이적 코팅을 요구한다. 본 명세서는 이러한 코딩 및 피더 층 없이 줄기 세포 성장을 용이하게 하는 배양 조성물 및 조건을 제공한다. 본 명세서는 적어도 다음과 같은 이유로 hESC 배양 기술에 영향을 준다: 첫째로, Matrigel™ 또는 인간 세포-유도된 ECM은 라미닌, 피브로넥틴, 및 콜라겐 유형 IV와 같은 다양한 세포 밖의 매트릭스 혼합물이며, 이들의 조성물은 세포-유도된 물질들의 용도를 고려하지 않음으로써 배치(batch)마다 변화될 수 있기 때문에, 코팅물질들의 질과 조건에 따라 현재 매우 가변적인 hESC를 추가 표준화시키는 것이 가능하며; 둘째, 세포-유도된 생물학적 물질들은 바이러스 및 항원을 포함하는 생물학적 오염물질이 완벽하게 없을 수는 없기 때문에, 세포-유도된 코팅 요구가 GMP 등급 hESCs의 개발에 실질적인 이점을 초래할 수 없으며; 세째, 잠재적인 오염 문제들을 회피하기 위하여 인간 재조합 ECM을 만들 수는 있지만, 준비 시간, 노력 및 비용 측면에서 플라스틱 조직 배양 플레이트의 간단한 사용만큼 경쟁적일 수 없으며; 그리고 넷째로, 합성 소분자는 이들의 상대적인 간단하고 안정적 구조로 인하여 임상 세팅으로 바꾸는 것에서 유리할 것으로 본다. 사실, 예를 들면, Rock 억제제, Y27632는 임상 연구에 성공적으로 이용되었다. 여기에서 본 명세서의 방법 및 조성물에 유용한 추가 화학 억제제를 설명한다.
본 명세서는 기초 배지 및 미오신 II 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 미오신 II 억제제는 블레비스타틴(blebbistatin) 또는 이의 유사체일 수 있다. 기초 배지는 완전하게 밝혀진 배지를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ROCK 억제제를 조성물에 또한 포함시킬 수도 있다. 특정 구체예들에서, 배양될 세포 유형에 대해 동종이계 또는 자가 혈청을 포함하는 혈청을 조성물에 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 또다른 구체예에서, 조성물은 비-필수 아미노산과 같은 아미노산을 더 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 조성물에 환원제 (가령, 베타 멀캅토에탄올)를 포함할 수 있다. 조성물에 항균제 및/또는 항곰팡이제를 포함할 수 있다.
본 명세서는 또한 비-필수 아미노산, 항산화제, 환원제, 성장 인자들, 피루베이트 염 및 미오신 II 억제제를 보충한 기초 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 미오신 II 억제제는 블레비스타틴 또는 이의 유사체일 수 있다.
본 명세서는 폴리-D-리신 또는 조직 배양 플레이트, 폴리-D-리신이 피복된 플라스크 또는 성장 기질, 명확한 배지 및 미오신 II 억제제를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 사용전에 본 명세서의 조성물을 혼합할 수 있도록 구획화된 키트일 수 있다는 것도 인지할 것이다. 미오신 II 억제제는 블레비스타틴 또는 이의 유사체일 수 있다.
본 명세서는 또한 줄기 세포(hiPS 및 ESC를 포함하는)를 배양하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 미오신 II 억제제를 포함하는 배양 배지에서 줄기 세포를 현탁시키고; 그리고 폴리-D-리신 코팅된 조직 배양 기질 존재하에 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 명확한 배지다. 또다른 구체예에서, 배양 배지는 동물 소산물이 없다.
본 명세서는 또한 줄기 세포 배양물을 제공하는데, 배양물은 명확한 배지 및 미오신 II 억제제를 포함하는 조성물내 줄기 세포를 포함하는데, 이때 줄기 세포 및 Neu5Gc 없이 그리고 줄기 세포는 임의의 동물 소산물 물질들과 함께 배양하지 않았다 (가령, 최소한 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50 또는 그 이상의 계대 동안). 한 구체예에서, 줄기 세포는 폴리-D-리신 존재하에 배양한다. 한 구체예에서, 미오신 II 억제제는 블레비스타틴 또는 이의 유사체일 수 있다.
도 1A-D은 미오신 II는 ES 세포 (A)의 세포-세포 접촉 조절에서 Rock의 하류 정규 효과물질(canonical effector)이라는 것을 보여준다. 스크램블화된 siRNA로 형질감염시킨 mES (CJ7) 세포의 형태는 세포-세포 유착(adhesion)에서 효과를 보이지 않지만, 미오신 IIA 및 IIB을 모두 표적으로 하는 siRNA로 형질감염된 세포는 눈에 띄는 세포-세포 접촉의 붕괴를 보였다. 세포 접촉 색인은 형태학적 관찰을 뒷받침한다. 데이터는 평균 ± SD이다, **p<0.001, n=5. (B) 면역형광 분석은 미분화된 ES 세포의 세포-세포 접합 부위에서 MYPT1 단백질을 발견한다. 삽화(Inset)는 동일한 콜로니의 상 대비 영상을 보여준다. (C) MYPT1 억제를 통하여 Rock가 미오신 II 기능을 조절하는 분자 경로를 나타내는 도식이다. 점선은 MRLC를 직접적으로 포스포릴화시키고, 활성화시키는 대안 Rock 기능을 나타낸다. (D) siRNA에 의한 보호 실험에서, mES 세포를 MYPT1 siRNA으로 형질감염시키고, 그리고 24시간 후, Y27632로 24시간 동안 처리하였다. 세포는 억제제의 강력한 세포-접촉 파괴 효과에 대항하여 이들 세포-세포 상태를 유지할 수 있었다. 구출 실험에서, 24시간 동안 Y27632로 처리한 mES 세포는 MYPT1를 표적으로 하는 siRNA로 후속적으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포의 사진을 찍었다. 상당한 비율의 세포는 세포-세포 접촉을 복원할 수 있었고, 프레-콜로니와 유사한 구조(pre-colony-like)를 형성하였다. 세포-세포 접촉 상태는 형태학적 관찰를 제공하는 CCI로 정량화하였다. 데이터는 평균 ± SD이다, **p<0.005, n=5. Scale bars, 25㎛.
도 2는 ES 세포에서 침묵하는 siRNA-중개된 유전자를 보여준다. mES 세포에서 siRNA의 형질감염 효과를 결정하기 위하여, 세포를 Lipofectamine 2000의 사용과 함께 40nM의 그린 형광단(FAM)-테그된 siRNA로 형질감염시키고, 그리고 24 시간 후, 형광 역상 현미경에서 세포를 평가하였다. 사실상 거의 모든 세포가 형광단-테그된 siRNA에 통합하였다. 삽화는 상 대비 영상을 나타낸다. siRNA 처리에 의한 내생성 유전자의 녹다운 수준을 평가하기 위하여, mES 세포는 두 개의 별개 siRNA를 복합하였을 때, 40nM 또는 25nM의 특정 유전자를 표적으로 하는 각 siRNA로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 수확하였고, Western 또는 QPCR 분석을 받았다. Western 분석에서, β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. Rock I siRNA의 효과는 비록 이소폼-특이적인 것으로 보이지만, Rock II siRNA는 유사한 방식으로 양쪽 이소폼 모두에 영향을 주었다. 따라서, 세포-세포 접촉에서 Rock siRNA의 효과는 Rock I 및 Rock II siRNAs의 공동-형질감염에 의해 동시에 고갈되었을때만 평가하였다. QPCR 분석을 위하여, 데이터를 β-악틴의 발현 수준으로 표준화하였다. mES 세포내에서 미오신 IIC의 내생 mRNA 수준은 다른 미오신의 수준보다 100배 적었다(two oders). 미오신 IIC-특이적 siRNA 처리는 기준 수준의 40% 아래로 발현 수준을 더 감소시켰지만, 세포-세포 접촉에서 실질적인 영향은 관찰되지 않았다. Scale bars, 25㎛.
도 3A-D는 hES 세포에서 세포-세포 소통의 조절에서 Rho-Rock-미오신 II 신호생성 축이 보존된다는 것을 보여준다. (A) 미분화된 hES 세포 (H9)의 형태는 단단히 연결된 콜로니를 보여준다. 전자현미경에 의한 미세구조(Ultrastructure) 분석은 세포-세포 접촉 부위에서 특화된 접합 복합체를 설명한다(화살표). (B) 24시간 동안 C3 엑소자임 (20㎍/㎖)으로 처리한 hES 세포는 닫힌 세포-세포 연결의 파괴를 보였다. 미세구조 분석에서 C3-처리된 세포는 세포 주변에서 작은 부위를 통하여 이웃하는 때때로 접촉하는 것을 보여준다(삽화). (C) Y27632는 mES 세포의 경우 농도(10μM)보다 더 높은 농도(20μM)의 Matrigel에서 성정한 hES 세포내 세포-세포 접합을 해체하였다. 세포 접촉 색인은 hES 세포에서 억제제의 효과를 요약한다. 데이터는 평균 ± SD이며, **p<0.001, n=5. (D) 조절 조건하에 성장한 hES 세포의 면역형광 분석은 E-캐드헤린(cadherin) 준-세포 분포와 중첩되는 세포-세포 접촉 부위에서 미오신 IIA의 배타적인 국소화를 보인다. 미오신 II-특이적 합성 억제제, 블레비스타틴 (10μM)는 C3 또는 Y27632-처리된 세포에서 볼 수 있는 것과 유사하게 hES 세포에서 세포-세포 연결을 파괴하였다. Scale bars, 25㎛.
도 4A-E에서는 미오신 II 선택적 억제제, 블레비스타틴이 명확한 조건하에서 세포-매트릭스 상호작용, 세포 생존, 인간 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포의 자가-재생을 강화시킨다는 것을 보여준다. (A) PDL 코딩에서 상이한 농도의 블레비스타틴 또는 Y27632로 처리된 hiPS 세포의 형태. hiPS 세포는 억제제 없이 PDL 코딩에 부착하지 않는다(데이터 제공하지 않음). (B) 블레비스타틴 또는 Y27632의 상이한 농도로 처리된 현탁 배양에서 hiPS 세포의 배상체형성. 5가지 상이한 필드에서 배상체의 수를 현미경 하에서 카운트하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=5이다. 세 가지 별도 실험에서 유사한 결과를 관찰하였다. (C) 2.5μM의 블레비스타틴 또는 Y27632 존재하에 Matrigel 또는 PDL상에서 성장한 hiPS 세포의 세포 성장. (D) QPCR에 의해 결정하였을 때 2.5μM의 블레비스타틴 또는 Y27632 존재하에 Matrigel 또는 PDL상에서 성장한 hiPS 세포에서 Oct3/4의 발현. (E) 15 계대 동안 2.5μM의 블레비스타틴으로 코팅한 PDL 상에서 성정한 hiPS 세포의 형태(상부). 중간 패널은 면역세포화학에 의해 평가하였을 때 동일한 조건하에 성장한 hiPS 세포에서 Oct3/4 발현을 보여준다. Matrigel상에서 성장한 hiPS 세포는 미분화된 콜로니 및 분화된 섬유아 세포의 혼합물을 설명한다(하부). Scale bars, 50㎛ (E) 하부 패널의 경우 제외, 100㎛.
도 5는 ES 세포에서 기본적인 세포-세포 상호작용을 조절하는 Rho-Rock-미오신 신호생성 경로를 요약한 모델을 보여준다. 연구에 이용한 화학물질 및 siRNAs는 각각 붉게 그리고 *로 강조한다. 점선은 세포-온전성(cell-integrity) 및 자가-재생 경로내에 또는 이들 사이에 잠재적인 기계적인 상호작용을 나타낸다. 화살표는 활성화를 나타내고, 막대는 억제를 나타낸다.
도 6A-L은 블레비스타틴에 의한 NMII의 억제는 클론 및 현탁 배양 조건하에 hPS 세포의 생존을 강화시킨다는 것을 나타낸다. (a) Western 및 면역세포화학 분석에 의해 측정하였을 때, hES 세포내 NMHCIIA 및 IIB의 발현. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (b) ALP 분석에 의해 평가된 hiPS 세포의 클론 분석. hiPS 세포는 블레비스타틴, 5μM 존재하에 또는 부재하에 7일간 96-웰 플레이트에서 웰당 단일 세포로 도말하였고, ALP 분석에 의해 후속적으로 평가하였다. (c) 클로닝 효과는 ALP-양성 콜로니가 있는 웰의 수에 대한 접종된 웰의 수의 비율로 결정하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, **p<0.01, n=3. 유사한 결과는 hES 세포로부터 수득하였다. (d-g) 흡착 조건하에 hiPS 세포의 세포 생존능 분석. 세포를 3중으로 PDL-코팅된 12개 웰 플레이트상에 웰당 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 세포의 사진을 찍었고(d), 그리고 트립판 블루 압출 검사(e)를 통하여 살아있는 세포의 수를 헤아렸다. 블레비스타틴과 함께 도말된 세포는 기준보다 실질적으로 더 높은 생존율을 보였다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n=3. 동일한 실험을 세포계당 최소한 3 회 반복하였고, 대표적인 데이터를 나타낸다. 상이한 농도의 블레비스타틴 또는 Y-27632에 대한 동일한 반응 패턴을 각 개별 세포계에서 반복적으로 관찰하였다. hES 세포에서도 유사한 결과를 얻었다. (f) hiPS 세포의 아팝토시스 평가. (e)에서 세포 생존 평가에 이용된 세포는 TUNEL 검사를 받았다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, n=3. (g) (e)에 나타낸 것과 동일한 조건하에 도말된 세포들은 절단된 카스파제-3에 대항하는 항체를 이용한 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (h-l) 블레비스타틴 처리는 현탁 배양에서 hPS 세포의 생존을 증가시킨다. hiPS(FS) 또는 hES (BGN01) 세포를 블레비스타틴 또는 Y-27632 존재하에 또는 부재하에 2일간 현탁 배양에서 성장시켰고, 이어서 사진을 찍었고(hiPS 세포를 보여줌) (h), 그리고 살아있는 세포 수를 헤어렸다(i,j). 절단된 카스파제-3 (I)을 탐지하기 위하여 TUNEL 분석 (k) 및 Western 분석을 실행하였다(hiPS 세포의 데이터를 나타냄). 데이터는 평균 ± SD이다, *p<0.05, **p<0.01, n=3. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. Scale bars, 25㎛.
도 7A-H는 NMHCIIA-/A- mES 세포에서 강화된 생존율을 보여준다. (a) 부모 야생형 (RW4) 및 NMHCIIA-/A- 돌연변이 mES 세포에서 NMHCIIA 및 NMHCIIB의 발현은 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (b) 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 성장한 RW4 및 NMHCIIA-/A- 돌연변이 세포의 형태. 돌연변이 세포는 느슨한 세포-세포 접촉을 보이며, RW4 세포는 단단한 세포-세포 흡착을 보인다. (c-e) NMHCIIA-/A- mES 세포는 RW4보다 더 높은 비율로 생존한다. 세포를 3중으로 젤라틴-코팅된 12개 웰 플레이트 상에 웰당 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 세포를 사진찍었고(c), 살아있는 세포 카운트(d)와 TUNEL 분석 (e)으로 평가하였다. 그래프는 3가지 독립 실험의 대표적인 데이터이다. 데이터는 평균 ± SD이다, *p<0.05, n=3. (f) NMHCIIB-/B- mES 세포의 상 대비 영상. 세포는 세포-세포 흡착을 유지한다. (c,d) NMHCIIB-/B- mES 세포를 상기와 같이 도말하였고, 그리고 세포 생존능(g) 및 TUNEL (h) 분석을 실행하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, n=3. Scale bars, 25㎛.
도 8A-G는 NMII의 억제가 인간 및 마우스 만능 줄기 세포에서 자가-재생 조절물질의 발현을 강화한다는 것을 보여준다. (a-d) hES 세포는 블레비스타틴 없이 mTeSR에서 Matrigel-코팅된 6개 웰 플레이트 상에 웰당 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 배지는 블레비스타틴없이 또는 상이한 농도의 블레비스타틴과 함께 새로운 mTeSR 또는 hESm으로 교체하였다. 배지 교체 후 48시간 시점에서, RNA 또는 단백질 추출을 위하여 세포를 수확하였다. Oct3/4 및 Nanog 발현은 mTeSR (a) 또는 hESm (b)에서 성장한 세포로부터 QPCR에 의해, 또는 hESm (c,d)에서 성장한 세포로부터 Western 분석에 의해 측정하였다. 블레비스타틴 없이 mTeSR에서 성장한 세포의 조건을 “기준”으로 나타낸다. hiPS 세포에서도 유사한 결과를 얻었다(데이터는 나타내지 않음). QPCR의 경우, 데이터를 β-악틴의 발현 수준에 대해 표준화시켰다. Y-축의 발현 수준은 임의 단위로 나타낸다(기준은 1.0으로 설정함). Western 분석의 경우, β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (e) Oct3/4 발현을 탐지하기 위하여 동일한 조건(5μM의 블레비스타틴과 함께 또는 없는 hESm)에서 성장한 세포들은 면역세포화학을 받았다. 영상은 각 필터에 대한 노출 시간을 포함한 각 조건 사이에 정확히 동일한 매개변수로 포착되었다. 상 대비 영상은 hESm에서 성장한 세포는 크고 평평한 형태를 나타내지만, mTeSR (기준)에서 성장한 세포는 빽빽하고 조밀하고 형태를 유지한다는 것을 보여주었다. Scale bar, 25㎛. (f) LIF 존재하에 성장한 야생형 (RW4) 및 NMHCIIA-/A- mES 세포에서 Oct3/4 및 Nanog의 발현은 QPCR에 의해 분석하였다. 데이터는 β-악틴의 발현 수준에 대해 표준화하였다. 기준은 1.0으로 설정함. (g) LIF 존재하에 또는 부재하에 2일간 성장한 mES 세포계의 동일한 세트를 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다.
도 9A-H는 블레비스타틴 처리가 완전하게 명확한 조건하에 hPS 세포의 자가-재생을 지원한다는 것을 보여준다. (a-d) hiPS 세포는 20 계대 동안 블레비스타틴 존재하에 PDL에서 성장하였다. 블레비스타틴/PDL 조건 (a) 또는 표준 피더-없는 조건(Matrigel?) (b)하에 hiPS 세포의 형태를 나타낸다. 공촛점 현미경을 이용한 면역형광에 의해 평가된 블레비스타틴/PDL 조건하에 성장한 세포의 Oct3/4 발현 또는 상 대비 영상의 고출력 검시(c). (d) 표준 피더-없는(Matrigel), 블레비스타틴/PDL, 또는 Y-27632/PDL 조건에서 성장한 세포내 Oct3/4 및 Nanog 발현은 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (e) 블레비스타틴/PDL, Y-27632/PDL, 또는 표준 피더(Matrigel)-없는 조건 하에서 배양된 hiPS 세포의 세포 성장 곡선은 살아있는 세포 수의 카운트로 결정하였다. 각 데이터 포인트는 평균 ± SD, n=3을 나타낸다. 블레비스타틴/PDL, Y-27632/PDL, 또는 표준 피더-없는 조건하에 성장한 세포의 집단 배가 시간은 차례로 대략 32.1 h, 32.2, 또는 31.8 h이다. hES 세포에서도 유사한 결과를 얻었다. (f) 20회 계대 동안 블레비스타틴/PDL 조건하에서 성장한 세포를 수확하였고, 대략 2× 106 세포를 SCID/베이지 마우스의 피하로 주사하였다. 4-8주 후, 기형종을 수거하였고, 조직 평가를 하였다. 각 기형종 시료에서 3 배엽-유도된 조직의 존재를 확인하였다. (g) 파라핀에 박아둔(embedded) 기형종 단편은 면역형광 분석으로 검사하였다. 기형종-유도된 조직에서 조직 특이적 마커 가령, 네스틴, α-태아단백질, 그리고 α-평활근 악틴을 탐지하였다. (h) 20 계대 동안 명확한 조건(블레비스타틴/PDL)에서 성장한 hiPS(FS) 세포는 표준 G-밴딩에 의해 염색체 분석하였고, 그리고 염색체 일체성을 유지한다는 것을 확인하였다. Scale bars, 25㎛.
도 10A-D는 흡착 조건하에 블레비스타틴 처리는 hPS 세포의 생존을 강화시킨다는 것을 보여준다. (a) hiPS 세포는 Matrigel-코팅된 12개 웰 플레이트 상에서 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 트립판 블루 압출 분석으로 살아있는 세포의 수를 헤아렸다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n=3. (b) hiPS 세포의 아팝토시스 분석. TUNEL-FITC-양성 세포는 형광 현미경하에 측정하였고, TUNEL-양성 세포의 수에 대한 PI-양성 세포 수의 비율을 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, n=3. (c) 상이한 농도의 블레비스타틴이 포함된 배지로 24시간 동안 PDL-코팅된 접시에서 성장한 hiPS 세포의 상 대비 영상의 고 출력 사진(High power view). 블레비스타틴으로 처리한 흡착된 세포의 연장된 세포 프로세스 기록함. (d) MLCK의 억제제, ML-7은 상이한 농도에서 PDL-코팅된 접시상에 도말된 hiPS 세포를 이용한 세포 생존 분석에 대해 테스트하였다. 세포 생존에서 유의적인 증가가 관찰되지 않았다. hES 세포를 이용한 실험에서 유사한 결과를 얻었다. Scale bars, 25㎛.
도 11A-C는 블레비스타틴에 의한 현탁 배양에서 성장한 hiPS 세포의 생존 증가를 보여준다. hiPS(NHDF1) 세포는 블레비스타틴 또는 Y-27632 존재하에 또는 없이 2일간 현탁 배양에서 성장하였고, 그리고 살아있는 세포 카운트를 하였고(a) TUNEL 분석 (b)을 하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, n=3. (c) 현탁 조건하에 성장한 hiPS 세포는 다양한 농도의 ML-7으로 처리하였다. ML-7로 처리한 세포에서 생존율의 차이가 관찰되지는 않았다.
도 12는 명확한 조건하에 배양한 hES 세포에서 염색체 보존은 유지됨을 보여준다. hES (H9) 세포는 20회 계대동안 명확한 조건(블레비스타틴/PDL)하에 성장하였고, 표준 G-밴드 비타민색체분석으로 평가하였다. 이상없이 암컷 염색체분석을 확인하였다.
당업계 수련자가 인지할 수 있는 것과 같이, 첨부된 도면에서 제공하는 데이터 및 정보는 오로지 대표적인 것이며, 본 명세서의 완전한 부분을 나타내지 않는다.
도 2는 ES 세포에서 침묵하는 siRNA-중개된 유전자를 보여준다. mES 세포에서 siRNA의 형질감염 효과를 결정하기 위하여, 세포를 Lipofectamine 2000의 사용과 함께 40nM의 그린 형광단(FAM)-테그된 siRNA로 형질감염시키고, 그리고 24 시간 후, 형광 역상 현미경에서 세포를 평가하였다. 사실상 거의 모든 세포가 형광단-테그된 siRNA에 통합하였다. 삽화는 상 대비 영상을 나타낸다. siRNA 처리에 의한 내생성 유전자의 녹다운 수준을 평가하기 위하여, mES 세포는 두 개의 별개 siRNA를 복합하였을 때, 40nM 또는 25nM의 특정 유전자를 표적으로 하는 각 siRNA로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 수확하였고, Western 또는 QPCR 분석을 받았다. Western 분석에서, β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. Rock I siRNA의 효과는 비록 이소폼-특이적인 것으로 보이지만, Rock II siRNA는 유사한 방식으로 양쪽 이소폼 모두에 영향을 주었다. 따라서, 세포-세포 접촉에서 Rock siRNA의 효과는 Rock I 및 Rock II siRNAs의 공동-형질감염에 의해 동시에 고갈되었을때만 평가하였다. QPCR 분석을 위하여, 데이터를 β-악틴의 발현 수준으로 표준화하였다. mES 세포내에서 미오신 IIC의 내생 mRNA 수준은 다른 미오신의 수준보다 100배 적었다(two oders). 미오신 IIC-특이적 siRNA 처리는 기준 수준의 40% 아래로 발현 수준을 더 감소시켰지만, 세포-세포 접촉에서 실질적인 영향은 관찰되지 않았다. Scale bars, 25㎛.
도 3A-D는 hES 세포에서 세포-세포 소통의 조절에서 Rho-Rock-미오신 II 신호생성 축이 보존된다는 것을 보여준다. (A) 미분화된 hES 세포 (H9)의 형태는 단단히 연결된 콜로니를 보여준다. 전자현미경에 의한 미세구조(Ultrastructure) 분석은 세포-세포 접촉 부위에서 특화된 접합 복합체를 설명한다(화살표). (B) 24시간 동안 C3 엑소자임 (20㎍/㎖)으로 처리한 hES 세포는 닫힌 세포-세포 연결의 파괴를 보였다. 미세구조 분석에서 C3-처리된 세포는 세포 주변에서 작은 부위를 통하여 이웃하는 때때로 접촉하는 것을 보여준다(삽화). (C) Y27632는 mES 세포의 경우 농도(10μM)보다 더 높은 농도(20μM)의 Matrigel에서 성정한 hES 세포내 세포-세포 접합을 해체하였다. 세포 접촉 색인은 hES 세포에서 억제제의 효과를 요약한다. 데이터는 평균 ± SD이며, **p<0.001, n=5. (D) 조절 조건하에 성장한 hES 세포의 면역형광 분석은 E-캐드헤린(cadherin) 준-세포 분포와 중첩되는 세포-세포 접촉 부위에서 미오신 IIA의 배타적인 국소화를 보인다. 미오신 II-특이적 합성 억제제, 블레비스타틴 (10μM)는 C3 또는 Y27632-처리된 세포에서 볼 수 있는 것과 유사하게 hES 세포에서 세포-세포 연결을 파괴하였다. Scale bars, 25㎛.
도 4A-E에서는 미오신 II 선택적 억제제, 블레비스타틴이 명확한 조건하에서 세포-매트릭스 상호작용, 세포 생존, 인간 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포의 자가-재생을 강화시킨다는 것을 보여준다. (A) PDL 코딩에서 상이한 농도의 블레비스타틴 또는 Y27632로 처리된 hiPS 세포의 형태. hiPS 세포는 억제제 없이 PDL 코딩에 부착하지 않는다(데이터 제공하지 않음). (B) 블레비스타틴 또는 Y27632의 상이한 농도로 처리된 현탁 배양에서 hiPS 세포의 배상체형성. 5가지 상이한 필드에서 배상체의 수를 현미경 하에서 카운트하였다. 데이터는 평균 ± SD, n=5이다. 세 가지 별도 실험에서 유사한 결과를 관찰하였다. (C) 2.5μM의 블레비스타틴 또는 Y27632 존재하에 Matrigel 또는 PDL상에서 성장한 hiPS 세포의 세포 성장. (D) QPCR에 의해 결정하였을 때 2.5μM의 블레비스타틴 또는 Y27632 존재하에 Matrigel 또는 PDL상에서 성장한 hiPS 세포에서 Oct3/4의 발현. (E) 15 계대 동안 2.5μM의 블레비스타틴으로 코팅한 PDL 상에서 성정한 hiPS 세포의 형태(상부). 중간 패널은 면역세포화학에 의해 평가하였을 때 동일한 조건하에 성장한 hiPS 세포에서 Oct3/4 발현을 보여준다. Matrigel상에서 성장한 hiPS 세포는 미분화된 콜로니 및 분화된 섬유아 세포의 혼합물을 설명한다(하부). Scale bars, 50㎛ (E) 하부 패널의 경우 제외, 100㎛.
도 5는 ES 세포에서 기본적인 세포-세포 상호작용을 조절하는 Rho-Rock-미오신 신호생성 경로를 요약한 모델을 보여준다. 연구에 이용한 화학물질 및 siRNAs는 각각 붉게 그리고 *로 강조한다. 점선은 세포-온전성(cell-integrity) 및 자가-재생 경로내에 또는 이들 사이에 잠재적인 기계적인 상호작용을 나타낸다. 화살표는 활성화를 나타내고, 막대는 억제를 나타낸다.
도 6A-L은 블레비스타틴에 의한 NMII의 억제는 클론 및 현탁 배양 조건하에 hPS 세포의 생존을 강화시킨다는 것을 나타낸다. (a) Western 및 면역세포화학 분석에 의해 측정하였을 때, hES 세포내 NMHCIIA 및 IIB의 발현. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (b) ALP 분석에 의해 평가된 hiPS 세포의 클론 분석. hiPS 세포는 블레비스타틴, 5μM 존재하에 또는 부재하에 7일간 96-웰 플레이트에서 웰당 단일 세포로 도말하였고, ALP 분석에 의해 후속적으로 평가하였다. (c) 클로닝 효과는 ALP-양성 콜로니가 있는 웰의 수에 대한 접종된 웰의 수의 비율로 결정하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, **p<0.01, n=3. 유사한 결과는 hES 세포로부터 수득하였다. (d-g) 흡착 조건하에 hiPS 세포의 세포 생존능 분석. 세포를 3중으로 PDL-코팅된 12개 웰 플레이트상에 웰당 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 세포의 사진을 찍었고(d), 그리고 트립판 블루 압출 검사(e)를 통하여 살아있는 세포의 수를 헤아렸다. 블레비스타틴과 함께 도말된 세포는 기준보다 실질적으로 더 높은 생존율을 보였다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n=3. 동일한 실험을 세포계당 최소한 3 회 반복하였고, 대표적인 데이터를 나타낸다. 상이한 농도의 블레비스타틴 또는 Y-27632에 대한 동일한 반응 패턴을 각 개별 세포계에서 반복적으로 관찰하였다. hES 세포에서도 유사한 결과를 얻었다. (f) hiPS 세포의 아팝토시스 평가. (e)에서 세포 생존 평가에 이용된 세포는 TUNEL 검사를 받았다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, n=3. (g) (e)에 나타낸 것과 동일한 조건하에 도말된 세포들은 절단된 카스파제-3에 대항하는 항체를 이용한 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (h-l) 블레비스타틴 처리는 현탁 배양에서 hPS 세포의 생존을 증가시킨다. hiPS(FS) 또는 hES (BGN01) 세포를 블레비스타틴 또는 Y-27632 존재하에 또는 부재하에 2일간 현탁 배양에서 성장시켰고, 이어서 사진을 찍었고(hiPS 세포를 보여줌) (h), 그리고 살아있는 세포 수를 헤어렸다(i,j). 절단된 카스파제-3 (I)을 탐지하기 위하여 TUNEL 분석 (k) 및 Western 분석을 실행하였다(hiPS 세포의 데이터를 나타냄). 데이터는 평균 ± SD이다, *p<0.05, **p<0.01, n=3. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. Scale bars, 25㎛.
도 7A-H는 NMHCIIA-/A- mES 세포에서 강화된 생존율을 보여준다. (a) 부모 야생형 (RW4) 및 NMHCIIA-/A- 돌연변이 mES 세포에서 NMHCIIA 및 NMHCIIB의 발현은 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (b) 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 성장한 RW4 및 NMHCIIA-/A- 돌연변이 세포의 형태. 돌연변이 세포는 느슨한 세포-세포 접촉을 보이며, RW4 세포는 단단한 세포-세포 흡착을 보인다. (c-e) NMHCIIA-/A- mES 세포는 RW4보다 더 높은 비율로 생존한다. 세포를 3중으로 젤라틴-코팅된 12개 웰 플레이트 상에 웰당 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 세포를 사진찍었고(c), 살아있는 세포 카운트(d)와 TUNEL 분석 (e)으로 평가하였다. 그래프는 3가지 독립 실험의 대표적인 데이터이다. 데이터는 평균 ± SD이다, *p<0.05, n=3. (f) NMHCIIB-/B- mES 세포의 상 대비 영상. 세포는 세포-세포 흡착을 유지한다. (c,d) NMHCIIB-/B- mES 세포를 상기와 같이 도말하였고, 그리고 세포 생존능(g) 및 TUNEL (h) 분석을 실행하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, n=3. Scale bars, 25㎛.
도 8A-G는 NMII의 억제가 인간 및 마우스 만능 줄기 세포에서 자가-재생 조절물질의 발현을 강화한다는 것을 보여준다. (a-d) hES 세포는 블레비스타틴 없이 mTeSR에서 Matrigel-코팅된 6개 웰 플레이트 상에 웰당 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 배지는 블레비스타틴없이 또는 상이한 농도의 블레비스타틴과 함께 새로운 mTeSR 또는 hESm으로 교체하였다. 배지 교체 후 48시간 시점에서, RNA 또는 단백질 추출을 위하여 세포를 수확하였다. Oct3/4 및 Nanog 발현은 mTeSR (a) 또는 hESm (b)에서 성장한 세포로부터 QPCR에 의해, 또는 hESm (c,d)에서 성장한 세포로부터 Western 분석에 의해 측정하였다. 블레비스타틴 없이 mTeSR에서 성장한 세포의 조건을 “기준”으로 나타낸다. hiPS 세포에서도 유사한 결과를 얻었다(데이터는 나타내지 않음). QPCR의 경우, 데이터를 β-악틴의 발현 수준에 대해 표준화시켰다. Y-축의 발현 수준은 임의 단위로 나타낸다(기준은 1.0으로 설정함). Western 분석의 경우, β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (e) Oct3/4 발현을 탐지하기 위하여 동일한 조건(5μM의 블레비스타틴과 함께 또는 없는 hESm)에서 성장한 세포들은 면역세포화학을 받았다. 영상은 각 필터에 대한 노출 시간을 포함한 각 조건 사이에 정확히 동일한 매개변수로 포착되었다. 상 대비 영상은 hESm에서 성장한 세포는 크고 평평한 형태를 나타내지만, mTeSR (기준)에서 성장한 세포는 빽빽하고 조밀하고 형태를 유지한다는 것을 보여주었다. Scale bar, 25㎛. (f) LIF 존재하에 성장한 야생형 (RW4) 및 NMHCIIA-/A- mES 세포에서 Oct3/4 및 Nanog의 발현은 QPCR에 의해 분석하였다. 데이터는 β-악틴의 발현 수준에 대해 표준화하였다. 기준은 1.0으로 설정함. (g) LIF 존재하에 또는 부재하에 2일간 성장한 mES 세포계의 동일한 세트를 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다.
도 9A-H는 블레비스타틴 처리가 완전하게 명확한 조건하에 hPS 세포의 자가-재생을 지원한다는 것을 보여준다. (a-d) hiPS 세포는 20 계대 동안 블레비스타틴 존재하에 PDL에서 성장하였다. 블레비스타틴/PDL 조건 (a) 또는 표준 피더-없는 조건(Matrigel?) (b)하에 hiPS 세포의 형태를 나타낸다. 공촛점 현미경을 이용한 면역형광에 의해 평가된 블레비스타틴/PDL 조건하에 성장한 세포의 Oct3/4 발현 또는 상 대비 영상의 고출력 검시(c). (d) 표준 피더-없는(Matrigel), 블레비스타틴/PDL, 또는 Y-27632/PDL 조건에서 성장한 세포내 Oct3/4 및 Nanog 발현은 Western 분석으로 평가하였다. β-악틴은 로딩 기준으로 이용하였다. (e) 블레비스타틴/PDL, Y-27632/PDL, 또는 표준 피더(Matrigel)-없는 조건 하에서 배양된 hiPS 세포의 세포 성장 곡선은 살아있는 세포 수의 카운트로 결정하였다. 각 데이터 포인트는 평균 ± SD, n=3을 나타낸다. 블레비스타틴/PDL, Y-27632/PDL, 또는 표준 피더-없는 조건하에 성장한 세포의 집단 배가 시간은 차례로 대략 32.1 h, 32.2, 또는 31.8 h이다. hES 세포에서도 유사한 결과를 얻었다. (f) 20회 계대 동안 블레비스타틴/PDL 조건하에서 성장한 세포를 수확하였고, 대략 2× 106 세포를 SCID/베이지 마우스의 피하로 주사하였다. 4-8주 후, 기형종을 수거하였고, 조직 평가를 하였다. 각 기형종 시료에서 3 배엽-유도된 조직의 존재를 확인하였다. (g) 파라핀에 박아둔(embedded) 기형종 단편은 면역형광 분석으로 검사하였다. 기형종-유도된 조직에서 조직 특이적 마커 가령, 네스틴, α-태아단백질, 그리고 α-평활근 악틴을 탐지하였다. (h) 20 계대 동안 명확한 조건(블레비스타틴/PDL)에서 성장한 hiPS(FS) 세포는 표준 G-밴딩에 의해 염색체 분석하였고, 그리고 염색체 일체성을 유지한다는 것을 확인하였다. Scale bars, 25㎛.
도 10A-D는 흡착 조건하에 블레비스타틴 처리는 hPS 세포의 생존을 강화시킨다는 것을 보여준다. (a) hiPS 세포는 Matrigel-코팅된 12개 웰 플레이트 상에서 1× 105 세포로 도말하였다. 24시간 후, 트립판 블루 압출 분석으로 살아있는 세포의 수를 헤아렸다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n=3. (b) hiPS 세포의 아팝토시스 분석. TUNEL-FITC-양성 세포는 형광 현미경하에 측정하였고, TUNEL-양성 세포의 수에 대한 PI-양성 세포 수의 비율을 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, n=3. (c) 상이한 농도의 블레비스타틴이 포함된 배지로 24시간 동안 PDL-코팅된 접시에서 성장한 hiPS 세포의 상 대비 영상의 고 출력 사진(High power view). 블레비스타틴으로 처리한 흡착된 세포의 연장된 세포 프로세스 기록함. (d) MLCK의 억제제, ML-7은 상이한 농도에서 PDL-코팅된 접시상에 도말된 hiPS 세포를 이용한 세포 생존 분석에 대해 테스트하였다. 세포 생존에서 유의적인 증가가 관찰되지 않았다. hES 세포를 이용한 실험에서 유사한 결과를 얻었다. Scale bars, 25㎛.
도 11A-C는 블레비스타틴에 의한 현탁 배양에서 성장한 hiPS 세포의 생존 증가를 보여준다. hiPS(NHDF1) 세포는 블레비스타틴 또는 Y-27632 존재하에 또는 없이 2일간 현탁 배양에서 성장하였고, 그리고 살아있는 세포 카운트를 하였고(a) TUNEL 분석 (b)을 하였다. 데이터는 평균 ± SD이며, *p<0.05, **p<0.01, n=3. (c) 현탁 조건하에 성장한 hiPS 세포는 다양한 농도의 ML-7으로 처리하였다. ML-7로 처리한 세포에서 생존율의 차이가 관찰되지는 않았다.
도 12는 명확한 조건하에 배양한 hES 세포에서 염색체 보존은 유지됨을 보여준다. hES (H9) 세포는 20회 계대동안 명확한 조건(블레비스타틴/PDL)하에 성장하였고, 표준 G-밴드 비타민색체분석으로 평가하였다. 이상없이 암컷 염색체분석을 확인하였다.
당업계 수련자가 인지할 수 있는 것과 같이, 첨부된 도면에서 제공하는 데이터 및 정보는 오로지 대표적인 것이며, 본 명세서의 완전한 부분을 나타내지 않는다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 이용한 것과 같이, 단수형은 내용에서 명시적인 언급이 없는 한 복수 관계를 포함한다. 따라서, 예를 들면, “세포”는 이러한 세포의 다수를 포함하고, 물질은 당업계 숙련자에 공지된 하나 이상의 물질을 포함한다.
또한, 다른 언급이 없는 한, “또는”은 “및/또는”을 의미한다. 유사하게, “포함하는(comprise, comprising, include, includes 및 including)”는 호환되며, 제한하고자 하는 의도는 없다.
다양한 구체예들의 설명에서 용어“포함하는(comprising)”이 이용되는 경우, 일부 특정 구체예에서, 구체예는“기본적으로 구성되는(consisting essentially of)” 또는 “~로 구성되는(consisting of)”을 이용하여 대체 설명할 수 있다.
여기에서 예시적인 방법, 장치 및 물질을 설명하지만, 여기에서 설명하는 것과 유사한 또는 등가의 방법들 및 물질들이 공개된 방법의 실행에 이용될 수 있다.
다른 언급이 없는 한, 여기에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 이 내용이 속하는 기술 분야의 숙련자들이 통상적으로 인지하는 것과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 출원을 통하여 이용된 다음의 용어들은 다음의 의미를 가질 것이다.
만능 줄기 세포는 자가-재생을 하면서, 세 가지 배엽-유도된 조직 및 생식 세포 계통을 발생시키는 능력을 유지하는 세포 유형이다. 인간 배반포로부터 유도된 만능 인간 배아 줄기(hES) 세포가 파킨슨 질환, 심근 경색, 척추 손상, 및 당뇨병과 같은 질환 및 장애 치료를 위한 세포-기반 요법의 장래성 있는 원천이지만, 이들의 임상적 가능성은 면역원성 및 윤리적인 우려로 방해를 받아왔다.
본 명세서는 Rho-Rock-미오신 II (RRM) 신호발생 축은 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용, 그리고 hiPS 및 hES 세포 모두의 세포 생존을 조절한다는 것을 설명한다.
이러한 정보에 근거하여, 본 명세서는 미오신 II의 화학 억제제 (가령, 미오신 II에 선택적인 화학 억제제)를 복합시키는 배양 시스템을 제공한다. 더욱이, 본 명세서는 명확한 합성 D-리신 상에서 hES 및 hiPS 성장을 이용하여 hES 및 hiPS 세포를 성장시킬 수 있다는 것을 설명한다. 따라서, 단일 합성 매트릭스와 함께 저 농도의 미오신 II 억제제(가령, 블레비스타틴 및 이의 유사체)의 추가와 완벽하게 명확한 배지는 인간 유도된 또는 동물 유도된 배양 시스템에서 병인균이 존재하는 것을 감소 (또는 제거하는) 배양 시스템을 제공한다.
본 명세서의 배지를 이용하여 배양할 수 있는 세포 유형은 인간, 원숭이, 및 유인원을 포함하는 임의의 포유동물 종으로부터 유도한 줄기 세포를 포함하고, 그리고 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 및 Nanog iPS 세포 (가령, Nature , 448:313-318, July 2007; and Takahashi et al ., Cell , 131(5):861-872 참고; 전문이 참고문헌에 통합된다)를 포함한다. 예를 들면, 유도된 만능 줄기 세포(iPSs, 또는 iPSCs)는 선택적 유전자 발현 (내생 유전자의)에 의한 또는 이계(heterologous) 유전자로 형질감염에 의해 비-만능 세포로부터 수득한 만능 줄기 세포 유형이다.
유도된 만능 줄기 세포는 일본 동경대 Shinya Yamanaka 연구팀에서 설명하였고, 배아 줄기 세포에서 특히 활성인 유전자를 확인하였고, 그리고 이들 유전자의 선택성을 가진 마우스 섬유아 세포를 형질감염시키기 위하여 레트로 바이러스를 이용하였다. 결국, 만능 줄기 세포의 생산에 필수적인 4개 주요 만능 유전자를 분리하였다; Oct-3/4, SOX2, c-Myc, 및 Klf4. 세포는 Fbx15+ 세포에 대한 항생제 선택성으로 분리하였다. 동일한 연구팀은 Harvard, MIT, 및 University of California, Los Angeles의 두 개의 독립된 연구팀과 함께한 연구를 발표하였는데, 마우스 섬유아세포를 iPS로 성공적으로 재프로그램화한 것을 보여주고, 심지어 살아있는 키메라를 생산하였다.
iPS 세포는 분자 및 기능 수준에서 실질적으로 ES 세포와 동일하였지만, 이들의 치료 잠재성을 의학적으로 적용시키는데 있어서 심각한 장애물이 있다. 문제중 하나는 iPS 세포의 재프로그램화 및 증식을 위한 현행 표준 프로토콜이 잠재적 임상 목적에 부적합한 동물로부터 유도된 물질들을 포함한다는 점이며, hiPS 세포를 생성시키고, 확장시킬 충분히 명확한 방법을 개발시킬 필요가 있다.
hiPS 및 hES 세포의 배양 환경은 기본적으로 두 가지 주요 요소들, 즉, 배양 배지 및 ECM 코팅에 따라 달라지며, 코팅의 경우 피더-없는 배양법에 광범위하게 이용되는 마우스 종양세포-유도된 ECM의 칵테일인 Matrigel을 포함한다. 자가-재생 기전을 이해하는 최근 과정으로 인하여 충분히 명확한 배양 배지를 제조하지만, ECMs의 구조적 성분의 복잡성 및 만능 중기 세포의 세포-세포 또는 세포-매트릭스 상호작용에 초점을 둔 기초 연구의 불충분으로 인하여, 엄격한 임상 표준을 충족하는 코팅 방법 개발이 여전히 주요 과제로 남아있다.
세포 이동, 미오신 합성, 및 ECM 상호작용은 세포 발생, 세포의 분화 및 아테롬성동맥경화증, 관절염, 그리고 사구체 신염과 같은 특징 질환의 발생에 중요하다. 세포 이동에서 초기 사건은 이동 방향에서 분극(polarization) 및 돌출부의 연장이다. Rho 패밀리의 작은 GTPases는 세포 골격 및 세포 유착을 조절함으로써 이러한 돌출부(라멜리포디아<lamellipodia> 및 필로포디아<filopodia>)의 형성을 조절한다. Rac 및 Cdc42는 차례로 라멜리포디아 및 필로포디아의 형성에 관여하고, Rho는 스트레스 섬유 형성 및 수축에 관여한다. 이러한 Rho 패밀리 멤버에 의한 공동 조절로 세포가 이동할 수 있도록 한다.
항진제에 의한 세포 자극시에, Rho 패밀리 작은 GTPases의 GDP-결합된 형태는 GTP-결합된 형태로 전환되고, 그리고 이들의 효과물질 분자와 상호작용한다. Rho는 Rho-키나제/ROCK/ROK 및 미오신 포스파타제의 미오신 결합 소단위(MBS)와 같은 이의 효과물질 분자를 통하여 미오신 포스포릴화를 조절한다(Kimura et al . 1996). 활성화된 Rho는 Rho-키나제 및 MBS와 상호작용하고, 그리고 Rho-키나제를 활성화시킨다. 후속적으로, 활성화된 Rho-키나제는 미오신 경쇄 (MLC) 및 MBS를 포스포릴화시킨다. MBS의 포스포릴화는 미오신 포스파타제를 비활성화시킨다.
ESCs는 배반포의 안쪽 세포량(ICM)으로부터 유도된다. ESCs는 모든 체세포 유형 및 생식 세포 계통(전능)을 생성하는 능력은 유지하면서, 무한정으로 성장할 수 있다(자가-재생). 이러한 특이적 줄기 세포 기능은 분자 수준에서 조사되었으며, Oct3/4 및 Nanog, 그리고 백혈병 억제 인자(LIF) 및 골 형성 단백질(BMP) 및 Wnt를 포함하는 분비된 신호발생 분자와 같은 주요 전사 인자의 주요 역할들을 확인할 수 있다. hESCs의 최근 유도화는 파킨슨 질병 및 당뇨병과 같은 질환 치료용 세포 이식 요법의 원천으로 만능 줄기 세포 사용에 문을 열었다. 의료 용도에 대한 hESC 연구의 기하급수적으로 증가하는 수요와 함께, 성인 세포의 임의의 분화된 유형을 유도하기 전에 전체 세포 치료 전략의 줄기에서 hECS를 유도하고 확장하는 타협하지 않는 기술을 개발하기 위하여 만능(pluripotency)을 어떻게 조절하는 지를 조사하는 것이 필수적이다.
줄기 세포는 특별히 특화된 기능을 가지는 세포들(가령, 조직 특이적 세포, 실질 세포 및 이의 선조)을 포함하는 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포다. 선조 세포 (가령, "다능")는 상이한 말단 분화된 세포 유형 및 다양한 선조 세포를 발생시키는 세포들이다. 유기체의 모든 세포는 아니지만, 일부 또는 많은 세포 유형을 발생시키는 세포를 "만능" 줄기 세포라고 하며, 성숙한 유기체의 몸에서 임의의 세포 유형으로 분화될 수 있지만, 재프로그램없이 이들은 이들이 유도된 세포로 탈-분화(de-differentiate)할 수는 없다. 인지하는 바와 같이, "다능" 줄기/선조 세포 (가령, 신경 신경 줄기 세포)는 만능 줄기 세포보다는 더 좁은 분화 능력을 가진다. 만능 줄기 세포보다 좀더 원시적인 또다른 부류의 세포(가령, 특정한 분화 운명에 얽메이지 않는)는 소위 "분화전능성(totipotent)" 줄기 세포(가령, 수정된 난모세포, 발생의 2단계 및 4단계의 배아 세포)로 불리는데, 특정 종의 임의의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가진다. 예를 들면, 단일 분화전능성 줄기 세포는 완전한 동물을 발생시키고, 그리고 특정 종(가령, 인간)에서 볼 수 있는 임의의 무수한 세포 유형을 발생시킬 수 있다.
인지할 수 있는 바와 같이, 이식, 세포 재생 및 대체 요법, 약물 개발, 포유류 발달 연구를 위한 모델 시스템 생성, 그리고 유전자 요법에 사용하기 위한 줄기 세포의 분리 및 성장에 상당한 관심이 있다. 그러나, 현재 배양 조건은 미분화된 그럼에도 불구하고 증식성 상태로 분리된 줄기 세포를 유지시키는 이들의 능력에 명확하다. 예를 들면, 배아 줄기 세포 및 생식 세포는 백혈병 억제 인자(LIF)가 보충된 피더-없는 배양물을 이용하여 유지할 수 있다. 다른 한편, 인간 배아 줄기 세포를 유지시키는 통상적인 기술은 적합한 피더 세포 층 또는 적합한 피더 세포계로부터 조건화된 배지 없이 배양하였을 때, 심지어 LIF 존재하에서도 신속한 분화를 유도할 수 있다.
추가적으로, 미분화된 줄기 세포를 배양하는 현행 방법은 피더 세포 층에 추가하여(또는 적합한 피더 세포 계로부터 조건화된 배지) 혈청의 사용과 같은 것을 요구한다. 혈청, 피더 세포, 및/또는 조건화된 배지와 같은 성분들의 요구는 줄기 세포를 배양하는 프로세스를 복잡하게 하고, 추가적으로 생체내 사용을 위하여 배양 조건은 이종 물질들에 의한 오염을 초래할 수 있다. 더욱이, 피더 세포 및 이종 배양 성분들 (가령, 태아 소 혈청 및 이와 유사한 것들)의 사용은 줄기 세포가 원하지 않는 성분들(가령, 변종 세포, 바이러스, 줄기 세포 집단 수용체에 면역 반응을 유도하는 세포, 이종 융합 세포, 및 이와 유사한 것들)로 오염되어, 치료제로써 또는 치료제 생산에서 줄기 세포의 가능성을 제한하게 되는 위험이 증가할 수 있다.
본 명세서는 동물 소산물 없이 줄기 세포를 배양하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 따라서, 본 명세서는 동물 소산물-없는 줄기 세포, 줄기 세포 및 이러한 줄기 세포를 포함하는 조성물을 이용하는 방법을 제공한다. 본 명세서는 또한 피더 세포 및 동물 재료 없이, 충분히 명확한 배지에서 높은 생존능(가령, 통상적인 줄기 세포 배양 기술과 대등한 또는 더 높은) 및 미분화 상태로 세포를 유지하면서, 줄기 세포를 배양하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 명세서는 줄기 세포 유지 동안 세포 신호발생을 변형하여, 강력한 세포 증식은 유지하지만 분화를 방지하는 방법 및 조성물을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서의 배양물은 동물 소산물에 존재하는 배양물로부터 유래된 오염물인 N-글리코일뉴라민산 (Neu5Gc) 및/또는 락테이트 데하이드로게나제-상승 바이러스 (LDEV)는 부족할 것이다.
본 명세서는 선택적 화학억제제, 블레비스타틴에 의한 미오신 II 억제가 임상적으로 관련된 배양 환경 하에서 인간 만능 줄기 세포를 성공적으로 성장시키기 위한 주요 요소인 hiPS 및 hES 세포의 세포 생존을 강화시킨다는 것을 설명한다.
더욱이, hiPS 세포 및 hES 세포의 유도 프로세스를 위한 배양 조건이 인간 만능 줄기 세포의 정기적 유지 및 성장을 위한 조건과 기본적으로 동일하기 때문에, 본 명세서에서 개발한 기술을 동물-유도된 물질들 없이 새로운 hiPS 및 hES 세포계를 만드는데 적용할 수 있을 것이다.
세포-세포 접촉은 다양한 유착 분자들의 공조적 협력, 이들의 서로 연결된 비계 단백질 및 특이적 세포내 신호 발생 경로에 의해 조절되는 악틴-세포 골격에 의해 이루어진다. LIF, BMP, FGF, TGF-β/Nodal, 및 Wnt와 같은 몇 가지 세포외부적으로 분비된 신호발생 분자가 만능 유전적 프로그램에 중요한 것으로 연구를 통하여 밝혀졌지만, 만능 ESCs에서 세포-세포간 소통 및 통합을 조절하는 특이적 세포내 신호발생 분자의 기능적 의미에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
세포-세포 접촉은 미오신, ATP-구동된 분자 모터를 포함하는 다양한 유형의 유착 분자 및 서로 연결된 세포골격 기전에 의해 조절되며, 세포-세포 접촉은 또한 세포 구조 및 분극화된 세포 기능을 결정한다. siRNA-중개된 기능 상실 실험에서 ES 세포에서 세포 유착을 위한 비-근육 미오신 II의 요구를 설명한다. 보편적인 쌍두(two-headed) 미오신인, 미오신 II는 3개의 이소폼, IIA, IIB, 및 IIC으로 구성되며, IIC를 제외하고 모두 ES 세포에서 발현되며, 분화된 세포들은 세가지 이소폼 모두를 발현시킨다. 놀라운 것은 미오신 IIA 및 IIB 이소폼이 동시에 고갈될 때, 세포는 Rho 또는 Rock의 기능 상실과 함께 세포에서 볼 수 있는 세포-세포 접촉의 표현형 모사의 붕괴를 보여준다. Rock은 미오신 II 기능을 구동하는 포스포릴화된 활성 형 MRLC를 보호하기 위하여 MYPT1을 포스포릴화시키고, 비활성화시킨다. MYPT1은 mES 세포 안에서 세포-세포 접촉 부위에 독점적으로 국소화되는 것으로 밝혀졌다. mES 세포에서 MYPT1의 억제를 통하여 미오신 기능을 조절한다면, Rock 억제제의 강한 효과로부터 고유의 세포-세포 소통을 구출할 것이다. 이러한 가설과 일치하게, 억제제 처리 전 후, MYPT1의 고갈은 차례로 세포-세포 접촉의 유의적인 보호 또는 복원을 초래하였다.
ESCs는 작은 세포 크기와 함께 핵/세포질의 높은 비율을 유지하고, 그리고 미분화된 상태로 성장할 때 엄격한 콜로니 형성을 겪는다. 그러나, 이들이 분화를 시작할 때 더 크고 평평한 형태를 나타내고, 그리고 때때로 세포-세포 접촉을 감소시키고, 콜로니 외부로 이동한다. 형태학적 관찰의 설명적 특징에도 불구하고, 줄기 세포의 특이적 생물학적 형태를 정확하게 나타내기 때문에, 형태는 ESCs의 분화 상태를 판단하는 1차적이며 신뢰성있는 판독으로 여전히 이용한다.
예를 들면, G 단백질 결합된 수용체(GPCRs), 인테그린 및 수용체 티로신 키나제 (RTKs)를 통한 세포 골격으로의 신호발생은 세포 모양의 변화, 이동, 증식 및 생존을 포함하는 세포 활동에서 효과를 다양하게 유도할 수 있다. 초점 유착 (FA) 복합체의 다른 성분들과 함께 인테그린은 세포 밖의 매트릭스와 세포 골격 사이에 링크로 작용한다. 인테그린 활성화는 초점 유착 키나제 (FAK) 및 Src 키나제의 활성화를 유도하여, 파실린(paxillin) 및 Crk-연합된 기질 p130 CAS과 같은 다른 FA 성분들의 포스포릴화 및 신호발생 아답터(adaptor) 단백질의 모집을 초래한다. FA 역학 및 FA 턴오버의 변화에 추가하여 악틴 어셈블리에 의해 이루어진다.
유사한 방식으로, RTKs는 고유 티로신 키나제 활성을 이용하여 이들의 세포내 루프 및/또는 연합된 신호발생 성분들상에서 부위들을 포스포릴화한다. 이는 포스포이노시티드 신호발생의 하류 중개물질들, 작은 GTPase 활성화, 그리고 MAP 키나제 캐스캐이드를 조절하는 아답터 단백질 및 신호발생 키나제의 모집을 유도한다. GPCR은 악틴 역학 거동에 영향을 주는 유사한 신호발생 기전에 연결시키기 위하여 이종삼량체 G단백질에 의해 개시되는 제 2 메신져를 이용한다.
외부 신호에 대한 세포 반응의 세포내 조절은 작은 GTPases의 Rho 패밀리(Rho, Rac 및 cdc42) 및 이들의 활성물질들, 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자들(GEFs) 그리고 Rho-키나제/ROCK 및 p21 활성화된 키나제 (PAK)를 포함하는 하류 단백질 키나제 효과물질을 포함하는 다수의 신호발생 캐스캐이드를 통하여 발생한다. 이러한 캐스캐이드는 코피린, Arp2/3, Ena/VASP, 포르민, 프로피린 및 겔졸린과 같은 악틴 상호작용 조절 단백질을 포함하는 악틴 세포 골격의 거동을 조절하는 단백질에 모인다. 상이한 경로를 통한 신호발생은 별개의 악틴-의존성 구조 형성으로 이어지는데, 이들의 공동작용되는 어셈블리/디스어셈블리(assembly/disassembly)는 유도된 세포 이동 및 기타 세포 거동에 중요하다. 이동 또한 미오신에 신호발생에 의해 조절되며, 가장자리 악틴 역학을 이끄는데 관여하고, 세포 후부의 수축을 가능하게 한다.
Rho는 작은 GTP-결합 단백질로서, 미엘린-유도된 성장 억제 신호의 중심적인 통합자(integrator)로 제안되었었다(McKerracher and Winton , Neuron , 36:345-348, 2002). 미엘린-연합된 억제제 (가령 MAG 또는 Nogo-A) 없이, 신경 성장 및 재생은 Rho 활성의 Rho-GDI-유도된 억제 결과로 발생하는 것으로 보인다. 한 가지 비-제한적인 기전에서, 미엘린-연합된 억제제 (MAG 및 Nogo-A)는 NgR에 결합하고, 다시, p75에 결합하여 활성화시킨다. 활성화된 p75는 Rho로부터 Rho-GDI를 격리시키고, Rho가 GDP를 GTP로 교환을 통하여 활성화되도록 허용한다. 활성화된 GTP-결합된 Rho는 신호발생 단백질 가령, Rho 키나제 (ROCK)와 상호작용하여 축색 성장 및 재생을 억제한다(Kaplan and Miller, Nat . Neurosci ., 6:435-436, 2003 참고).
RhoA, Rac1 및 Cdc42을 포함하는 Rho GTPase 패밀리 단백질은 세포 형태, 이동성, 증식, 분화 및 아팝토시스와 같은 광범위한 다양한 세포 프로세스를 조절한다(Hall , 1994; Van Aelst and D'Souza-Schorey, 1997).
Rho-연합된 코일드-코일 형성 단백질 세린/트레오닌 키나제 (ROCK) 패밀리 구성원들은 Ras-관련된 작은 GTPase Rho의 효과물질이다. ROCK 패밀리는 p160ROCK (ROCK-1), ROKα/Rho-키나제/ROCK-II, 단백질 키나제 PKN, 그리고 시트론 및 시트론 키나제를 포함한다. ROCK는 고혈압, 뇌혈관 연축, 관상동맥 경축, 기관지 천식, 발기부전, 녹내장, 혈관 평활근 세포 증식, 심근 비대, 흑색종, 허혈/재관류-유도된 손상, 내피 기능장애, Crohn 질병 및 결장염, 신경돌기 파생물, Raynaud 질병, 앙기나, Alzheimer 질환, 아테롬성동맥경화증, 그리고 심장 비대 및 혈관 주위 섬유증을 포함하는 다양한 질병 및 질환에 연루되어 있다.
ROCK의 두 개 이소폼은 ROCKI (ROK-β 또는 p160ROCK이라고도 함) 및 ROCKII (ROK-α 또는 Rho-키나제이라고도 함)을 포함한다. 이러한 두 개의 이소폼은 전반적으로 65% 서열 유사성을 가지며, 그리고 키나제 도메인은 92% 서열 동일성을 포함한다. 두 가지 이소폼은 조직의 어디에서나 편재하여 발현되지만, 특정 조직에서 다른 강도를 가진다.
ROCK1은 Ser/Thr 단백질 키나제 활성을 가지며, 길이가 1358개 아미노산인 RhoA-결합 단백질이다. 폴리펩티드는 약 길이가 300개 아미노산인, N-말단에 촉매 키나제 도메인을 포함하고, Ser/Thr 키나제의 보존된 모티프 특징을 포함하며; 키나제 도메인은 RhoE의 결합에 또한 관여하는데, 이는 ROCK 활성의 네가티브 조절물질이다. 또한, ROCK1의 C-말단은 유연성 코일드-코일 부분내 Rho-결합 도메인, 플렉스트린 상동성(PH) 도메인, 그리고 시스테인-풍부 도메인을 포함한 몇 가지 기능 도메인을 가진다. 일부 구체예들에서, PH 도메인은 지질 메신져, 예를 들면, 아라키돈산과 상호작용에 의한 조절에 필수적인 것 같다. ROCK의 자가억제 활성은 키나제 활성을 감소시키기 위하여 키나제 도메인과 카르복실 말단의 상호작용시에 설명된다. 길이가 약 80개 아미노산이며, 활성화된 RhoA와의 상호작용에 요구되는 Rho-결합 도메인은 일부 Rho 결합 단백질에 존재하는 도메인에 상당히 유사한 서열을 포함한다.
예시적인 ROCK 억제제는 Y-27632 및 파수딜(fasudil)을 포함하는데, 키나제 도메인에 결합하여, ATP-경쟁 기전에서 이의 효소 활성을 억제시킨다. ROCK 활성화의 네가티브 조절물질은 작은 GTP-결합 단백질, 가령, Gem, RhoE 및 Rad를 포함하며, ROCK 활성을 감쇠시킬 수 있다. H-1152 디하이드로클로라이드 (H-1152P-2HCl; (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐] 호모피페라진)을 이용할 수 있다. 추가적인 ROCK 억제제는 국제 출원 공개 WO 01/56988; WO 02/100833; WO 03/059913; WO 02/076976; WO 04/029045; WO 03/064397; WO 04/039796; WO 05/003101; WO 02/085909; WO 03/082808; WO 03/080610; WO 04/112719; WO 03/062225; 및 WO 03/062227에서 설명된 것들을 포함한다. 일부 경우에서, 억제제내 모티프는 인다졸 코어; 2-아미노피리딘/피리미딘 코어; a 9-데아자구아닌 유도체; 벤자미드-포함; 아미노퓨라잔-포함 및/또는 이의 복합체를 포함한다. 예를 들면, WO 03/080610은 키나제 억제제, 가령, ROCK 억제제와 같은 이미다조피리딘 유도체와 ROCK1 및/또는 ROCK2의 효과를 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 언급한 출원들의 명세서들은 전문이 참고문헌에 통합된다.
Rho의 또다른 억제제는 S-파르네실티오살리실산(FTS) 및 이의 유도체 및 유사체다. 또다른 억제제는 이미다졸-함유 벤조디아제핀 및 유사체다(가령, WO 97/30992 참고). Rho 억제제는 ROCK (Rho 활성화된 키나제)와의 상호작용에 의해 하류에서 작용하여 Rho의 억제를 유도할 수 있다. 이러한 억제제는 미국 특허 제6,642,263호(이의 명세서는 전문이 참고문헌에 통합된다)에서 설명되어 있다. 이용할 수 있는 다른 Rho 억제제는 미국 특허 제6,642,263호 및 제6,451,825호에서 설명하고 있다. 이러한 억제제는 가령, 미국 특허 제6,620,591호(전문이 참고문헌에 통합된다))에서 설명하는 것과 같이 통상적인 세포 스크리닝 분석을 이용하여 확인할 수 있다. 본 명세서의 특정 구체예들에서, ROCK1은 ROCK 2 대신 표적화되고, 이때 이들 물질은 알로스테릭(allosteric) 부위에 결합하여, ROCK1 억제를 야기한다.
Rho GTPase의 오직 활성 형태만 특이적 효과물질 단백질(Rho 신호발생 경로의 경우 Rho 키나제 및 Diaphanous의 포유류 상동체, mDia)에 결합함으로써 하류 경로로 신호를 보낼 수 있기 때문에, 악틴 세포 골격 및 분자 모터를 더 높은 하위세포 구조의 특이적 형태로 시간공간적으로 통합시키는 분자 스위치로 간주한다(도 1). 다양한 측면의 생물학적 기능에 대하여 Rho 패밀리 단백질의 주요 역할을 상이한 많은 세포 유형에서 광범위하게 연구하였지만, 줄기 세포 조절에 대한 이들의 역할에 관한 조사는 여기에서 설명한다.
성인 피부, 조혈 및 mesenchymal 줄기 세포에서 줄기 세포 기능의 조절에 있어서 주요한 역할을 한다고 연구에서 나타났다. 본 명세서는 ESCs가 만능을 유지하면서 세포-세포 보전을 조절하기 위하여 Rho 신호발생 경로를 이용한다는 것을 설명한다.
본 명세서는 ROCK의 억제가 세포 밖의 매트릭스와 같은 임의의 코팅 요구없이 플라스틱 접시에서 성장하는 줄기 세포(가령, 인간 배아 줄기 세포- hESCs 및 유도된 줄기 세포)능력을 초래한다는 것을 설명한다. 더욱이, 본 명세서는 미오신 II 활성의 억제는 줄기 세포(가령, hES 및 hiPS)가 전능으로 성장하고 유지하는 능력을 조절한다는 것을 설명한다(가령, 설명한 경로의 도식에 대해 도 5 참고).
한 구체예에서, 미오신 II 억제제을 포함하는 배양 배지를 제공한다. 또다른 구체예에서, ROCK 억제제, 미오신 II 억제제 또는 이의 조합을 포함하는 배양 배지를 제공한다. 배양 배지는 피더 층 또는 세포 밖의 매트릭스 코팅된 조직 배양 물질 없이 hESC 및 hiPS 세포를 포함하는 줄기 세포를 배양하는데 유용하다. 또다른 구체예에서, 배양 배지는 폴리-D-리신 코팅된 조직 배양 물질에 줄기 세포를 배양하는데 이용한다.
또다른 구체예에서, 배양 배지는 ROCK 억제제, 미오신 II 억제제 또는 이의 조합에 추가하여 다른 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 아미노산 (가령, 비-필수 아미노산), 항생제, 곰팡이제거제, 성장 인자들, LIF, 황을 함유하는 생물학적 활성 화합물(가령, 베타-멀캅토에탄올), 피루베이트 (가령, 피루베이트 나트륨), 혈청 (가령, 인간 혈청, 소 혈청) 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는 임의의 추가 물질은 배양될 줄기세포와 동일한 종으로부터 유도하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 추가 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지 및 배양 조건은 임의의 동물 유도된 산물이 없다.
본 명세서는 동물 유도된 산물없이 배양물에서 줄기 세포의 증식 및 강건함을 촉진시키는데 이용할 수 있는 생물학적 물질의 발견에 일부 근거한다. 또한, 본 명세서의 생물학적 물질이 피더 층없이 줄기 세포 배양물의 성장, 복제 및 강건함을 촉진시킨다는 발견에 근거한다. 배지는 기본적으로 혈청이 없으며, 피더 세포 층의 사용 또는 피더 세포의 별도 배양물로부터의 조건화 배지를 요구하지 않지만, 일부 구체예들에서 연속 계대(가령, 1-50회 또는 그 이상의 계대)를 위하여 세포를 새로운 피더-없는 배양물로 이동하기 전에 동종이계 피더 세포(또는 이러한 세포의 조건화된 배지)를 포함하는 성장 환경에서 줄기 세포를 처음 배양하는데 이용할 수 있다.
본 명세서에 따른 배지는 미오신 II 억제제, ROCK 억제제 또는 이의 조합을 포함한다. 배지는 또한 비-필수 아미노산, 항산화제, 환원제, 성장 인자들, 그리고 피루베이트 염을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 기본 배지는 예를 들면 Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM), DMEM/F-12, 또는 KO-DMEM이며, 각각에는 L-글루타민 (가령, 이가펩티드 L-알라닐-L-글루타민 (Invitrogen)), 비-필수 아미노산, 및 β-멀캅토에탄올이 보충된다. 배지는 세포 배양물에 추가하기 전에 전형적으로 살균한다(가령, 여과에 의한). 배지는 또한 항생제 및 곰팡이제거제를 보충할 수 있다.
예시적인 미오신 II 억제제는 다음의 일반식 I을 가지는 블레비스타틴 (동의어: 1-페닐-1,2,3,4-테트라하이드로-4-하이드록시피롤로[2.3-b]-7-메틸퀴놀린-4-온; C18H16N2O2) 및 유사체를 포함한다:
화학식 I
상기 식에서 R1 -4은 개별적으로 메틸 또는 수소다.
블레비스타틴은 분기(branching), 신장(elongation)을 차단한다. 그러나, BDM과 같은 특이성이 덜한 미오신 억제제를 이용할 수 있다. 문헌에 공개된 몇 가지 블레비스타틴의 기능적 유사체가 있다(Lucas - Lopez et al . 2008). 미오신 II 기능은 미오신 경쇄 키나제 (MLCK)에 의해 조절되기 때문에, ML-7 및 ML-9와 같은 MLCK 억제제를 미오신 II의 활성을 차단하는데 또한 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 약 1.25 - 10μM의 블레비스타틴 농도가 유용하다. 이 범위중에서, 이 화합물은 인간 ES 및 iPS 세포에서 실질적으로 높은 그리고 지속적인 도말 효과와 항-아팝토시스 효과를 보이는 폴리-D-리신코팅과 함께 2.5μM 농도에서 장기 세포 배양에 일상적으로 이용되어 왔다.
성장 인자는 줄기 세포의 성장을 촉진시키는데 효과적인 물질을 말하며, 보충제로 배양 배지에 추가되지 않으면 기초 배지의 성분이 아닌 물질이다. 성장 인자들은 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 상피 성장 인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II (IGF-II), 혈소판-유도된 성장 인자-AB (PDGF), 및 맥관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 악티빈-A, Wnt 그리고 골 형성 단백질(BMPs), 인슐린, 사이토킨, 케모킨, 몰포겐트(morphogents), 중화 항체, 기타 단백질 및 작은 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
외생 성장 인자들 또한 실질적으로 미분화된 상태로 줄기 세포의 배양물 유지에 도움이 되도록 본 발명의 배지에 추가할 수 있다. 이러한 인자들과 이들의 효과적인 농도는 세포 배양 분야의 숙련자들에 공지된 기술 또는 여기에서 설명하는 것과 같이 확인할 수 있다. 본 명세서의 조성물 및 방법에 유용한 성장 인자들의 대표적인 예로는 bFGF, 인슐린, 산성 FGF (aFGF), 상피 성장 인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I), IGF-II, 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF), 그리고 맥관 내피 성장 인자 (VEGF), 악티빈-A, 뼈 형성 단백질(BMPs), 포르스콜린, 글루코코르티코드(가령, 덱사메타손), 트란스페린, 및 알부민을 포함한다.
기초 배지는 아미노산, 염, 염, 및 배양물에서 세포 성장을 지원하는데 유효한 영양소의 용액을 말하지만, 보통 이들 화합물들은 추가 화합물들이 보충되지 않는 한, 세포 성장을 지원할 수 없을 것이다. 영양소는 세포에 의해 대사될 수 있는 탄소원(가령, 포도당과 같은 당) 뿐만 아니라 세포 생존에 필수적인 다른 화합물들을 포함한다. 이런 것들은 이 화합물을 합성하는데 필수적인 단백질을 인코드하는 하나 이상의 유전자가 없기 때문에 세포 자체적으로 합성할 수 없는 화합물들이거나, 또는 세포가 합성할 수 있는 화합물의 경우, 이들의 특정 발달 상태로 인하여 필수적인 생합성 단백질을 인코드하는 유전자가 충분한 수준으로 발현되지 않는다. 포유류 세포 배양 분야에 다수의 기초 배지가 공지되어 있는데, 가령, Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM), Knockout-DMEM (KO-DMEM), 및 DMEM/F12이 있지만, bFGF, 인슐린, 및 아스코르브산이 보충된, 그리고 실질적으로 미분화된 상태에서 줄기 세포 성장을 지원하는 임의의 기초 배지를 이용할 수 있다.
"조건화된 배지"는 배지에서 배양된 세포로부터 유도된 가용성 인자들이 추가 보충된 성장 배지를 말한다. 세포 배양물로부터 조건화 배지를 분리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 인지하는 바와 같이, 조건화된 배지는 바람직하게는 기본적으로 세포가 없다. 본 내용에서, “기본적으로 세포가 없는”이란 이를 분리한 배양물과 비교하여 단위 용적당 세포수가 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 및 0.0001% 미만을 포함하는 조건화된 배지를 말한다.
"명확한" 배지는 생화학적으로 명확한 구성분만으로 구성된 생화학적으로 명확한 조제물을 말한다. 명확한 배지는 공지의 화학적 조성물을 가지는 구성물만을 포함할 수 있다. 명확한 배지는 공지의 원천으로부터 유도된 구성물을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 명확한 배지는 또한 공지의 조직 또는 세포로부터 분비된 인자들 및 기타 조성물들을 포함할 수 있지만; 그러나, 명확한 배지는 이러한 세포의 배양물의 조건화된 배지를 포함하지 않을 것이다. 따라서, "명확한 배지"로 표현되었다면, 이 배지는 배양 배지를 만들기 위하여 추가된 특정 화합물을 포함할 수 있고, 분획화되지 않은 조건화된 배지의 시료내 최소한 한 가지 탐지가능한 성분을 제거하기 위하여 분획화된 조건화된 배지의 일부분을 포함한다. 여기서, 조건화된 배지의 하나 이상의 탐지가능한 성분들의 “실질적인 제거”란 일차 줄기 세포의 실질적으로 장기적인 미분화된 배양을 지원하기 위한 능력에서 분획화되지 않는 조건화된 배지와 상이한 분획화된 조건화 배지를 만들기 위하여, 조건화된 배지로부터 탐지가능한 공지된 성분의 최소한의 양을 제거하는 것을 말한다. 조건화된 배지의 분획화(Fractionation)는 탐지가능한 성분들을 제거하는데 적합한 임의의 방법(또는 방법들의 조합)에 의해 실행할 수 있고, 예를 들면, 겔 여과크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역 침전, 및 이와 유사한 것들이 있다. 유사하게, 또는 "명확한 배지"는 인간 혈청 성분들을 포함하는 동물로부터 유도한 혈청 성분들을 포함할 수 있다. 본 내용에서, "공지된"이란 화학적 조성물 또는 성분과 관련하여 당업계 통상의 기술 지식을 말한다.
세포 배양물은 피더 세포의 배양물로부터 취한 외생적으로 첨가된 조건화 배지를 포함하지 않거나 또는 배양물에서 외생적으로 첨가된 피더 세포를 포함하지 않을 때 “기본적으로 피더-없는”이라고 하고, 여기서 “외생적으로 추가된 피더 세포가 없다”는 의미는 피더 세포 층을 발단시키기 위하여 이러한 이유로 세포를 의도적으로 도입하지 않았다는 것을 의미한다. 물론, 배양될 세포가 피더 세포를 포함하는 씨드 배양물로부터 유도된 경우, 우연한 공동-분리 및 원하는 세포 (가령, 미분화된 줄기 세포)와 함께 이러한 피더 세포의 일부 작은 부분의 또 다른 배양물안으로 후속적으로 도입은 피더 세포의 의도적인 도입으로 간주되어서는 안된다. 유사하게, 피더 세포 또는 배양물로 접종된 줄기 세포로부터 발달한 피더-유사 세포는 배양물로 의도적으로 도입된 것으로 간주되어서는 안된다.
"비-필수 아미노산"은 일반적으로 세포가 특정 아미노산 종을 합성하거나 합성할 수 있기 때문에, 주어진 세포 유형에 대해 배양 배지로 추가할 필요가 없는 아미노산 종을 말한다. 종마다 차이가 있지만, 비-필수 아미노산은 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민산, 글리신, L-프롤린, 및 L-세린을 포함하는 것으로 알려져있다.
세포 배양물은 외생적으로 추가된 혈청을 포함하지 않는 경우 “기본적으로 혈청-없는”배양물이다. 배양되는 세포가 혈청의 성분 일부 또는 전부를 생산하는 경우, 또는 배양될 세포가 혈청을 포함하는 배지에서 성장한 씨드 배양으로부터 유도된 경우, 우연한 공동-분리 및 후속적으로 혈청의 일부 소량(약 1% 미만)의 또 다른 배양물안으로 후속적으로 도입은 혈청의 의도적인 도입으로 간주해서는 안된다.
유용한 환원제는 베타-멀캅토에탄올을 포함한다. 유사한 효과를 내는데 모노티오글리세롤 또는 디티오트레톨(DTT)과 같은 다른 환원제 단독으로 또는 조합을 이용할 수 있다. 다른 등가의 물질들도 세포 배양 기술분야에 숙련자들에게는 친숙할 것이다.
피루베이트 염은 본 명세서에 따라 배지에 포함시킬 수 있다. 피루베이트 염은 실질적으로 미분화된 상태에서 줄기 세포 성장을 유지 또는 강화시키는데 효과적인 피루베이트 나트륨 또는 또다른 피루베이트 염, 가령, 피루베이트 칼륨이다.
본 명세서의 배양 배지에 보충하는데 적합한 다른 화합물들은 뉴클레오시드(가령, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘 및 티미딘), 그리고 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드는 다양한 농도로 포함시킬 수 있다.
인지하는 바와 같이, 지속적으로 또는 주기적으로, 일반적으로 1-3일마다, 사용된 배양 배지를 새로운 배양 배지로 대체하는 것이 바람직하다. 새로운 배지를 사용하는 좋은 한 가지 장점은 통상적인 기술에 따른 피더 세포에서 배양하였을 때, 또는 조건화 배지에서 배양하였을 때보다 세포를 좀더 균일하고 신속하게 확장시키기 위한 조건을 조절하는 능력이다.
기존의 출발 세포 집단과 비교하였을 때, 4-, 10-, 20-, 50-, 100-, 1000-, 또는 그 이상의 배수로 확장된 줄기 세포 집단을 얻을 수 있다. 적합한 조건하에서, 확장된 집단내 세포는 배양을 시작하기 위하여 사용한 줄기 세포와 비교하였을 때 50%, 70%, 또는 그 이상이 미분화된 상태에 있을 것이다. 계대당 확장 정도는 배양 끝에 수거한 대략적인 세포 수를 배양물에 원래 접종한 대략적인 세포수로 나누어 계산할 수 있다. 성장 환경의 기하학이 제한적이거나 또는 다른 이유로, 세포는 추가 확장을 위하여 유사한 성장 환경으로 임의의 계대될 수 있다. 전체 확장은 각 계대에서 모든 확장의 산물이다. 물론, 각 계대에서 모든 확장된 세포를 존속시킬 필요는 없다. 예를 들면, 세포가 각 배양에서 2배 확장하지만, 세포의 약 50%만 각 계대에서 유지된다면, 세포의 대략 동일한 수를 앞으로 이동시킬 것이다. 그러나, 4회 배양 후, 세포는 16배 확장을 하였다라고 한다. 세포는 당업계에 공지되어 있는 극저온 냉동 기술을 통하여 보관할 것이다.
배아 줄기 세포는 Doetschman et al . (1985) J. Embryol . Exp . Mol . Biol . 87:27-45)에서 설명하는 것과 같이 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 만들고, 그리고 유지한다. ES 세포의 임의의 세포계를 이용할 수 있다. ES 세포의 생산에 일반적으로 이용되는 하나의 마우스 균주는 129J 균주다. 또다른 ES 세포계는 뮤린 세포계(American Type Culture Collection, catalog no. CKL 1934)다. 또다른 ES 세포계는 WW6 세포계 (Ioffe et al . (1995) PNAS 92:7357-7361)다. 인간 배아 줄기 세포(hESCs)는 인간의 생체내 착상전 배, 시험관내 수정된 배, 또는 배반포 단계로 확장된 한 개 세포 인간 배로부터 수득한 인간 배반포로부터 분리할 수 있다(Bongso , et al . (1989), Hum . Reprod., vol . 4: 706). 인간 배는 G1.2 및 G2.2 배지에서 배반포 단계로 배양할 수 있다(Gardner , et al . (1998), Fertil . Steril ., vol . 69:84). 프로나아제(Sigma)에 간단하게 노출시킴으로써 배반포로부터 투명대(zona pellucida)를 제거한다. 내측 세포 물질은 면역절제술 또는 기계적인 분리에 의해 분리시킬 수 있고, 그리고 마우스 배아 피더 층에 도말하거나, 또는 여기에서 설명되는 명확한 배양 시스템에 도말한다. 9-15일 후, 내측 세포 물질-유도된 파생물은 1mM EDTA와 함께 칼슘 및 마그네슘 없는 인산완충염(PBS)에 노출시키고, 디스파제, 콜라게나제 또는 트립신에 노출, 또는 마이크로피펫으로 기계적인 해리에 의해 덩어리(clump)로 해리시킨다. 해리된 세포를 새로운 배지에서 이전과 같이 다시 도말하고, 콜로니 형성에 대해 관찰하였다. 미분화된 형태를 설명하는 콜로니는 마이크로피펫에 의해 개별적으로 선택하고, 기계적으로 덩어리로 해리시키고, 다시 도말한다. 배아 줄기 세포-유사 형태는 세포질에 대한 핵의 비율이 명백하게 높고 두드러진 핵소체(nucleoli)를 가진 조밀한 콜로니로 특징화된다. 그 다음 생성된 배아 줄기 세포는 간단한 트립신처리, Dulbecco's PBS (칼슘 또는 마그네슘 없이, 2 mM EDTA), 유형 IV 콜라게나제 (약 200 U/㎖)에 노출, 또는 예를 들면, 마이크로피펫을 이용한 기계적 해리에 의해 개별 콜로니 선별에 의해 일상적으로 매 1-2주마다 분리시킨다.
일단 분리되면, 줄기 세포는 임의의 적합한 세포 배양 기술을 이용하여 줄기 세포의 실질적으로 미분화된 성장을 지원하는 본 명세서에 따른 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 1차 피더 세포(바람직하게는 동종이계 피더 세포)의 용해전 가로놓인 매트릭스 또는 합성된 또는 정제한 매트릭스는 표준 방법을 이용하여 준비할 수 있다. 그 다음 배양할 줄기 세포를 배양배지와 함께 매트릭스의 상부에 추가한다. 다른 구체예들에서, 일반 분리된 후, 미분화된 줄기 세포는 라미닌 또는 성장-정지된 인간 피더 세포 층(가령, 인간 포피 섬유사세포 세포층)을 포함하는 세포 밖의 매트릭스에 바로 추가하고, 명세서의 배양 방법에 따른 무-혈청 성장 환경에서 유지시킬 수 있다. 또다른 구체예에서, 줄기 세포는 세포 밖의 매트릭스 물질(가령, 폴리스티렌, 유리 또는 이와 유사한 것에 직접적으로)없이 생체적합성 세포 배양 플레이트에 바로 추가할 수 있다. 통상적인 기존 기술을 이용하여 배양된 기존의 배아 줄기 세포계와는 달리, 본 발명의 방법에 따라 준비되고 배양된 배아 줄기 세포 및 이들의 유도체는 피더 층에 존재할 수 있는 이종 항원에 노출을 피하거나 또는 노출을 감소시켰다. 이는 부분적으로 피더 층 없이 또는 세포 배양 기질상에 직접적으로 성장을 촉진시키는 조성물 때문일 것이다. 이는 예를 들면, 비-인간 동물 세포에 의해 인간 세포가 오염되는 위험을 피하며, 비-인간 동물 세포로부터 인간 세포로 병인균의 전염을 피하고, 이종 융합 세포의 형성을 피하고, 인간 세포가 독성 이종 인자에 노출되는 것을 피한다.
본 명세서의 세포 배양 배지와 본 명세서에 따른 줄기 세포를 성장시키는 방법은 줄기 세포계를 이용하는 모든 기술에 적용할 수 있을 것으로 본다. 예를 들면, 본 명세서의 배지 및 방법에 근거하여 배양된 세포는 미분화된 상태로 줄기 세포를 배양하는데 유용한 성장 인자들을 확인하기 위한 스크리닝, 뿐만 아니라 세포가 특정 세포 또는 조직계로 분화를 유도하는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝에 이용할 수 있다. 본 명세서는 또한 발생할 줄기 세포의 유전적 변화를 허용하고, 새로운 줄기 세포의 생성도 허용한다.
본 명세서는 또한 미오신 II 억제제 및 다양한 기본 배지 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구체예들에서, 키트는 하나 이상의 ROCK 억제제, 세포 배양 기질을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 키트는 기질상에 코팅을 위한 실질적으로 정제된 폴리-D-리신을 포함하거나 또는 세포 배양 기질은 폴리-D-리신으로 사전-코팅될 수 있다. 키트는 기본 배지에 추가될 시점까지 생물학적 물질들이 분리된 상태를 유지하도록 구획화될 수 있다.
본 명세서의 배양 조건은 본 명세서에 따른 배양 배지, 줄기 세포의 미분화된 성장을 지원하는 생체적합성 기질을 일반적으로 포함하는 세포 배양 용기를 포함한다.
한 구체예에서, 생체적합성 기질은 플라스틱, 세라믹, 금속과 같은 고체이거나, 세포가 흡착할 수 있는 다른 생체적합성 물질이다. 한 구체예에서, 생체적합성 기질은 폴리-리신 (가령, 폴리-D-리신)이다. 생체적합성 기질은 세포 밖의 매트릭스 조성물을 배제할 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 소량의 매트릭스 물질을 제공하는데 유용할 수 있다. 일반적으로, 매트릭스 물질은 세포 유형과 동일한 종으로부터 유도된다. 예를 들면, 세포가 흡착할 수 있는 조성물(가령, 매트릭스)을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 매트릭스는 나일론(폴리아미드), 다크론(폴리에스테르), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(가령, 폴리비닐클로라이드), 폴리카르보네이트(PVC), 폴리테트라플로로에틸렌(PTFE; TEFLON), 테라마녹스(TPX), 니트로셀룰로오즈, 목화, 폴리글리콜산(PGA), 고양이 소화관 봉합사, 셀룰로오즈, 젤라틴, 덱스트란, 콜라겐, 피브로넥틴 및 이의 다양한 복합물이 될 수 있지만 이에 한정하지는 않는다. 배양 용기상에 매트릭스 물질 또는 코팅은 살아있는 유기체에서 볼 수 있는 생물학적 물질을 포함하는데, 바람직하게는, 매트릭스 물질은 배양 환경을 오염시킬 수 있는 임의의 동물 소산물 또는 세포 배양 물질이 존재하는 것을 피하기 위하여 화학적으로 합성할 수 있다.
배양 용기는 다중 웰 조직 배양 플레이트의 웰을 포함하는 임의의 모양 및 크기일 수 있거나, 또는 교반된 탱크 바이오리엑터만큼 클 수도 있다. 대규모 적용의 경우, 세포 부착을 위한 표면적은 마이크로비드 또는 배양 배지 (가령, 플라스틱 비드 또는 폴리머)에 현탁시킬 수 있는 다른 기질 또는 이용할 수 있는 이와 유사한 물질-코팅된 또는 코팅안된-을 사용하여 증가시킬 있다.
이러한 방법을 이용하여, 줄기 세포, 가령, 인간 배아 줄기 세포 또는 hiPS 세포 집단은 생성된 세포 배양물로부터 분리할 수 있고, 따라서 본 명세서의 또 다른 구체예를 나타낸다. 이러한 집단은 임의의 적합한 기술에 의해 분리시킬 수 있다. 이러한 기술은 친화력 크로마토그래피, 패닝(panning), 및 형광-지원된 세포 분류를 포함한다. 이러한 각 기술은 미분화된 상태를 나타내는 세포-기반 마커에 특이적인 하나 이상의 분리 시약(예를 들면, 항체 및 항체 단편들, 리포터 유전자/단백질 및 이와 유사한 것들이 되지만 이에 한정되지 않음)을 이용한다. 실질적으로 미분화된 인간 배아 줄기 세포에서, 이러한 마커는 예를 들면, 전사 인자 Oct-4 및 Nanog, 그리고 세포 표면 마커 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 마커는 텔로메라제, Myc, p300, 및 Tip60 히스톤 아세틸트란스퍼라제, 아세틸화된 히스톤, 및 알카리 포스파타제를 포함한다. 네가티브 선별을 또한 이용할 수 있는데, 이에 의하여 실질적으로 미분화된 상태이외의 것을 나타내는 하나 이상의 마커를 발현하는 세포, 또는 대안으로, 특정 마커를 발현시키지 못하는 세포를 원하는 세포 집단으로부터 제거할 수 있다. 이러한 집단은 인간 배아 줄기 세포와 같은 줄기 세포의 세포계를 포함한 안정적인 줄기세포계를 만드는데 이용할 수 있다. 바람직한 경우, 이러한 세포는 하나 이상의 내생 유전자의 발현을 변경(가령, 증가 또는 감소)시키거나 및/또는 세포로 도입된 하나 이상의 유전자를 발현시키기 위하여 유전적으로 변형시킬 수 있다. 이러한 유전적 변형은 예를 들면, 특정 줄기 세포계에서 탐지되는 유전적 결함을 교정하고, 그리고 비정상적 세포계(특정 질환 상태와 관련된 유전적 정황을 닮은 또는 복제한 모델 시스템으로 유용할 수 있다)를 만드는데 사용할 수 있다. 본 명세서의 이러한 줄기 세포의 단리된 집단은 동물-물질 없는 줄기 세포로 한정할 수 있다(가령, 임의의 동물에서 수득한 물질과 복합하여 배양되지 않음).
본 명세서의 또다른 구체예는 본 명세서에 따라 분리된 또는 배양된 실질적으로 미분화된 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포를 이용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 이러한 세포는 세포의 분화를 촉진시키는, 또는 대안으로 실질적으로 미분화된 상태로의 유지를 촉진시키는 또는 더 원시적인 상태(가령, 다능 줄기 세포로부터 만능 또는 분화전능성 줄기 세포로)로 탈-분화를 촉진시키는 인자를 확인하는데 이용할 수 있다. 간단하게, 분화 또는 실질적으로 미분화된 상태의 유지 상황에서, 이러한 방법은 예를 들면, 미오신 II 억제제, ROCK 억제제 또는 이의 조합을 본 명세서의 배양 배지에서 배양되는 실질적으로 미분화된 줄기 세포에 노출시키는 것을 포함한다. 테스트 화합물에 노출 후, 세포가 실질적으로 미분화된 상태에서 더 잘 유지되었는지, 또는 이러한 생물학적 물질에 의해 분화되도록 유도되었는 지를 판단하기 위하여 세포를 평가한다. 세포가 실질적으로 미분화된 상태에서 더 잘 유지되었다면, 이 생물학적 물질은 미분화된 상태 또는 줄기 세포의 자가-재생을 촉진하는 것으로 확인할 수 있다. 세포가 분화되도록 유도되었다면, 테스트 화합물은 실질적으로 미분화된 줄기 세포의 분화를 촉진시키는 물질로 확인할 수 있다. 분화된 세포는 이들의 발달 운명을 결정하기 위하여 뒤를 이를 것이며, 환원하면, 분화 결과로서 이들이 어떤 세포계가 되는 지를 결정하게 된다. 탈-분화 정황에서, 더 분화된 상태의 세포들 (가령, 조혈 줄기 세포)은 하나 이상의 화합물에 노출시키고, 노출에 의해 테스트 화합물에 처음 노출된 것보다 더 원시적 유형의 세포(가령, 줄기 세포)가 되는 지를 판단하기 위하여 평가한다. 그렇다면, 이러한 효과를 만드는 화합물은 세포의 탈-분화 또는 재프로그래밍을 촉진하는 물질로 확인된다. 일반적으로, 본 명세서에 따른 이러한 그리고 다른 스크리닝 방법은 고다수의 화합물이 동시에 스크리닝될 수 있도록 고처리량 방식으로 실행한다.
본 명세서의 또다른 구체예는 본 명세서에 따른 비-동물 기반의 명확한 성장 환경에서 줄기 세포계 특히, 미분화된 인간 배아 줄기 세포계의 분리, 확립 및 배양을 포함한다. 예를 들면, 이종-없는 성장 환경에서 배양되고 유지된 본 명세서에 따라 배양된 줄기 세포, 특히, 만능 미분화된 인간 배아 줄기 세포(hESCs) 또는 hiPS 세포 및 이들의 유도체(가령, hESC-유도된 다능 신경 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 심근세포 및 인슐린-생산 세포 및 이와 유사한 것들)는 치료요법적으로 이용할 수 있다. 대표적인 치료 용도는 심장병, 당뇨병, 간 질환, 신경퇴행성 질환, 암, 종양, 발작, 척추 손상 또는 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경색, 근위축성 척색 경화증(ALS), 그리고 단일 유전자 결함이 원인이 된 질환과 같은 질병을 치료하는 세포-기반 요법을 포함한다. 이러한 방법에서, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 미분화된 인간 배아 줄기 세포 집단 또는 실질적으로 미분화된 인간 배아 줄기 세포로부터 유도된 분화된 세포 집단을 투여한다. 투여된 세포는 비록 필수적인 것은 아니지만, 유전적으로 변형시킬 수 있다.
본 명세서의 또다른 구체예는 특이적 조직 또는 세포계로의 분화형식으로 줄기 세포의 운명을 지시하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법들의 실시예에서, 예를 들면, 실질적으로 미분화된 줄기 세포(가령, 인간 배아 줄기 세포)는 이러한 분화를 촉진시키는 하나 이상의 인자를 투여함으로써 특정 세포 유형 또는 계대로 분화되도록 유도시킨다. 역으로, 본 명세서는 또한 더 발달될 운명의 세포를 더 원시적이 되도록 또는 미성숙해지도록 재-프로그램시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 인간 조혈 줄기 세포는 조혈 계대 뿐만 아니라 다른 비-조혈 세포 유형으로 발생할 수 있도록 세포를 탈-분화되도록 유도한다. 한 구체예에서, 세포는 미분화된 만능 세포 유형을 성장시키고 유지시키기 위하여 폴리-D-리신 기질상에 미오신 II 억제제, ROCK 억제제 또는 이 모두를 포함하는 배지에서 배양한다. 미분화된 세포는 배양 배지를 분화 배지 또는 인자로 대체하거나 또는 이러한 배지에 분화 배지 또는 인자를 추가함으로써 분화된다.
다음의 실시예들은 본 명세서의 특정 측면들을 설명하고, 본 명세서를 실행함에 있어서 당업자를 돕기 위하여 제공한다. 이러한 실시예는 어떠한 방식으로도 본 명세서의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.
실시예
화학물질. 블레비스타틴 (InSolution™ 블레비스타틴), Y-27632 (InSolution™ Y-27632), 및 ML-7은 EMD로부터 구입하였다. PDL은 Millipore로부터 구입하였다.
세포 배양. 두 개의 독립적인 hES 세포계, H9 (WiCell) 및 BGN01 (BresaGen)을 검사하였다. 본 연구에 이용한 hiPS 세포는 iPS(Foreskin) Clone 1 (WiCell) 및 일련의 분자 및 기능 분석에 의해 특징화된 정상적인 인간 피부 섬유아세포 (NHDF)로부터 두 가지 독립적으로 유도된 hiPS 세포를 포함한다. 일반적인 피더-없는 배양을 위하여, hES 또는 hiPS 세포는 명확한 배지, mTeSR (StemCell Technologies)에서 Matrigel (BD Biosciences)-코팅된 플레이트상에서 성장하였다. 세포는 디스파제 (Invitrogen) 또는 트립신-EDTA (Lonza)를 이용한 표준 방법으로 정규적으로 계대하였다. 일반적인 줄기 세포 배양 기술은 Freshney et al ., Culture of Human Stem Cells( Culture of Specialized Cells ), John Wiley & Sons , 1992 (이의 명세서는 모든 목적을 위하여 전문이 참고문헌에 통합된다)에서 설명한다. 이 실험에 이용한 mES 세포는 CJ7, E14, RW4 (NMHCIIA-/A- mES 세포의 부모계), NMHCIIA-/A- 및 NMHCIIB-/B- mES 세포를 포함한다. 세포는 백혈병 억제 인자(LIF) at 1400 U/㎖ (Millipore)의 백혈병 억제 인자(LIF) 존재하에 표준 배지와 함께 유사분열적으로 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포 또는 젤라틴 (Sigma)-코팅된 접시상에서 유지하였다. 현미경 또는 면역형광 분석을 위하여, 세포는 대략 5000-10000개 세포/㎠에서 도말하였다. 명확한 배양을 위하여, 세포는 2.5 내지 5μM의 블레비스타틴 또는 Y-27632이 보충된 mTeSR에서 PDL 또는 PDL-사전 코팅된 플레이트(BD Bioscience)로 새로 코팅된 플레이트상에 대략 10000개 세포/㎠로 도말하였다. 합류에 따라 배지를 매일 또는 2일에 한번 교체하였다. 트립신-EDTA를 이용하여 매 3-4일마다 세포를 계대하였다.
세포 성장 분석을 위하여, hiPS 또는 hES 세포는 5μM의 블레비스타틴 또는 5μM의 Y-27632(PDL) 존재하에 또는 화합물 없이(Matrigel) mTeSR내 PDL 또는 Matrigel로 코팅된 플레이트상에 2.5× 104개 세포/㎠로 도말하였다. 지정된 시간대에 세포를 수거하였고, 트립판 블루로 착색하였고, 그리고 혈구계산기로 카운트하였다.
클론 분석. 블레비스타틴이 보충된 또는 보충없이 mTeSR에서 hES 또는 hiPS 세포는 웰당 단일 세포로 Matrigel-코팅된 96-웰 플레이트에 도말하였다. 도말 후 7일시점에 제조업자의 지시에 따라 세포는 Alkaline Phosphatase Detection Kit (Millipore)를 이용하여 알카리 포스파타제 분석을 받았다.
세포 생존능 분석. hES 또는 hiPS 세포는 블레비스타틴의 존부하에 또는 다양한 농도의 Y-27632에서 mTeSR내 PDL 또는 Matrigel로 코팅된 12웰 플레이트에 웰당 1× 105개 세포로 도말하였다(3중). DMSO (블레비스타틴의 용매)를 기준 조건에 또한 추가하였고, 생존능에는 영향을 주지 않았다. mES 세포의 경우, 젤라틴 코팅 및 mES 배지의 사용을 제외하고, 동일한 조건하에서 세포를 도말하였다. 24시간 후, 세포를 수거하였고, 트립신처리하여 단일 세포로 만들고, 혈구계산기를 이용하여 카운트하였다. 일관성을 확보하기 위하여 두 사람의 연구원에 의해 독립적으로 세포 카운팅을 실시하였다. 세포 카운팅을 위하여 시료의 작은 분취물을 취한 직후 동일한 시료를 TUNEL 분석에 이용하였다.
현탁 배양 하에 세포 생존능 평가를 위하여, hES 또는 hiPS 세포는 상이한 농도에서 블레비스타틴 또는 Y-27632을 포함하는 비-조건화된 표준 hESm과 비-조직 배양-처리된 6개 웰 플레이트에서 3중으로 5× 105개로 도말하였다. 2일 후, 세포는 트립신처리에 의해 수거하였고, 피페팅에 의해 광범위하게 분쇄하였고, 살아있는 세포수는 혈구계산기 및 트립판 블루 착색을 이용하여 수작업으로 카운트하였다. 세포 생존 비율(%)은 도말한 세포수에 대한 살아있는 세포 수의 비율을 나타낸다. 세포 생존 분석의 데이터와 나란히 비교할 목적으로 동일한 시료를 TUNEL 분석하였다.
면역착색. 면역세포화학을 위하여, 배양 용기상에서 성장한 세포는 4% 파라포름알데히드(USB Corporation)에 고정하였다. PBS/BSA로 세척 후, 시료는 4℃에서 하룻밤 동안 표적 단백질을 인지하는 1차 항체로 배양하였다. 본 연구에 이용된 1차 항체는 Oct3 (BD Biosciences), 미오신 IIA (Covance), 및 미오신 IIB (Covance)을 포함한다. 시료는 3차례 세척하였고, 실온에서 30분간 Alexa Fluorophore (Invitrogen)으로 콘쥬게이트된 적합한 2차 항체와 함께 항온처리하였다. 3차례 세척 후, 시료는 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Invitrogen)로 반대착색하였고, CFI Fluor 40× 대물렌즈가 구비된 Nikon TE-2000-U 형광 인버트 현미경(Nikon Instruments) 또는 Apochromate 물-침수 렌즈(Carl Zeiss)가 구비된Zeiss LSM 510 공초점 현미경으로 검사하였다.
면역조직화학을 위하여, 기형종 시료의 파라핀 단편을 크실렌 및 일련의 등급 에탄올에 담그고, 4℃에서 하룻밤동안 네스틴, α-태아단백질, 또는 α-평활근 악틴 (모두 Chemicon 제품)에 대한 1차 항체로 항온처리하였다. 2차 항체와 함께 항온처리를 포함하는 프로세스의 나머지는 상기에서 설명한 것과 동일하다.
TUNEL 분석. 세포 생존능 분석에 이용한 3중 시료는 제조업자의 프로토콜에 따라 APO-DIRECT 키트 (BD Pharmingen)를 이용한 TUNEL 분석에 의해 바로 테스트하였다. TUNEL (FITC) 또는 프로피디움 요오드화물 (PI)-양성 세포의 수는 20× 대물렌즈의 형광 현미경하게 혈구계산기로 카운트하였다. 필요한 경우, FITC-라벨된 세포는 비-특이적 신호를 배제하기 위하여 40× 대물렌즈를 이용하여 확인하였다. 각 세포에서 최소한 300개의 세포를 평가하였고, 카운팅은 2회 반복하였다. PI-양성 세포 수에 대한 TUNEL-양성 세포 수의 비율을 계산하였다. 최소한 3회 반복된 실험으로부터 대표적인 결과를 수치로 나타낸다. 비록 유세포분석을 처음에 시도하였지만, 광대한 트립신화후에도 현탁 배양 실험으로부터 지속적인 세포 응집으로 인하여, 우리는 세포 생존능 분석으로부터 수득한 데이터와 잘 연관된 수작업 세포 카운팅으로 교체하기로 결정하였다.
QPCR. Qiashredder 및 RNAeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 추출된 RNA 시료는 UV 분광광도계를 통하여 정량화하였고, RNA Nano Lab 칩(Agilent Technologies)을 이용하여 정성화하였다. 2㎍의 전체 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 SuperScript III RT-PCR 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 역-전사하였다. 3중의 각 cDNA 시료는 MyiQ 실시간 PCR 탐지 시스템 (BioRad)을 이용하여 특이적 PCR 프라이머와 FullVelocity SYBR Green QPCR 마스터 믹스(Stratagene)로 증폭된 PCR이다. 각 사이클의 임계(CT) 값은 iQ5 광학 시스템 소프트웨어(BioRad)를 이용하여 결정하였고, 그리고 β-악틴 발현 수준으로 표준화하였다. 프라이머 서열은 Primer Express 소프트웨어 (Applied Biosystems)로 기획하였고, 다른 서열과 이들의 잠재적인 교차반응성은 In Silico PCR (University of California, Santa Cruz)으로 사전-스크리닝하였다. 프라이머로 이용되는 모든 서열은 하기 표에 제공한다.
기형종 형성. 모든 동물-관련된 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee로부터 승인받았다. 간헐적 냉동 및 해동과 함께 다중 계대를 위한 명확한 조건하에 성장시킨 세포 (대략 2× 106 세포)를 복합된 심각한 면역결핍(SCID)/베이지 마우스 (Charles River Laboratories)에게 피하로 주사하였다. 4-8주 후, 발달된 기형종을 잘라내었고, 4% 파라포름알데히드 또는 10% 포르말린에 고정시켰고, 그리고 조직 단편 준비를 하였다.
Western 분석. 전체 단백질을 RIPA 완충액 (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40, 1% 데옥시콜레이트 나트륨, 2.5mM 피로포스페이트 나트륨, 1mM β-글리세로포르페이트, 1mM Na3VO4, 및 프로테아제 억제제)로 추출하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)로 결정하였다. 동량의 단백질(20 ㎍)을 각 레인에 로딩하였고, 10% SDS/PAGE로 분리하였고, 그리고PVDF 막(BioRad)으로 이동시켰다. 막은 Odyssey 차단 완충액 (LI-COR Biotechnology)으로 차단시키고, 연속하여 Oct3(Santa Cruz Biotechnology), Nanog (Millipore), 미오신 IIA (Covance), 미오신 IIB (Covance), 절단된 카스파제-3 (Cell Signaling), 또는 β-악틴 (Sigma)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하고, 과산화효소-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 또는 염소 항-토끼 IgG (Jackson ImmunoResearch, Inc.)와 함께 항온처리하고, 그리고 ECL 시약(GE Healthcare)으로 발달시켰다.
배상체 ( EB ) 형성. 디스파제 또는 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 수확하였고, 화합물 없이 비-조직 배양 처리된 접시(대략 106개 세포/웰/ 6개 월 플레이트)에 도말하였고, 14일간 비-조건화된 hES 배지에서 성장시켰다. 단백질 추출을 위하여 세포를 수확하였고, Western 분석을 하였다.
염색체분석( Karyotyping ). 대략 10 내지 20회 계대마다 각 세포계에 대해 표준-밴드 염색체분석을 실행하였다.
통계학적 분석. 생물학적 리플리케이트(조건당 3 내지 5개의 리플리케이트)를 분산 분석(ANOVA) 또는 대응 t-검증을 이용하여 통계학적으로 분석하였다. 통계학적 유의성은 **p < 0.01와 같은 유의확률로 나타내었다. 데이터 포인트는 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타낸다.
미오신 II 는 Rock 의 세포-세포 흡착을 조절한다. Rho 및 Rho-연합된 키나제 (Rock)는 만능 줄기 세포에서 세포-세포 상호작용 조절에 역할을 한다. 세포-세포 흡착의 하부 중심 기전을 추가 연구하기 위하여, Rock의 하류 원리 조절자들을 검사하였다. 기능적인 사전 스크리닝에 기초하여, 비-근육 미오신 II는 기능 분석의 siRNA-중개된 상실에 의한 효과물질로 확인되었다. 쌍두 통상적인 미오신인, 비-근육 비-근육 미오신 II (미오신 II)은 비-근육 미오신 II 중쇄(NMHC) 이량체와 두 개 세트의 미오신 경쇄(MLCs)로 구성된다. Myh9, Myh10, 및 Myh14 유전자에 의해 차례로 인코드된 3가지 상이한 NMHCs, NMHC IIA, NMHC IIB, 및 NMHC IIC가 있으며, 이들 각각은 포유동물에서 별개의 기능을 나타낸다. 이가운데, IIC를 제외한 모든 유전자는 만능 줄기 세포에서 발현하고, 반면 분화된 세포는 세 가지 이소폼 모두를 발현시킨다. 미오신 IIA 및 IIB 이소폼이 동시에 고갈되면, 세포는 Rho 또는 Rock (도 1A)의 세포-세포 접촉 표현형 모사 기능 상실이 두드러지게 나타낸다. 각 siRNA에 의한 표적 유효량의 특이성 및 녹다운 수준은 정량적인 RT-PCR (QPCR)에 의해 확인하였다(도 2). 미오신 조절 경쇄(MRLC)의 포스포릴화를 통하여 미오신 기능을 네가티브하게 조절하는 Rock의 주요 하류 표적, 미오신 포스파타제 표적 소단위 1 (MYPT1)을 검사하였다. MYPT1은 mES 세포 (도 1B)내 세포-세포 접촉 부위에 배타적으로 위치하였다. Rock이 MYPT1의 억제를 통하여 미오신 기능을 조절하면, MYPT1의 고갈은 Y27632의 강력한 효과로부터 고유 세포-세포 상호작용을 해방시킬 것이다(도 1C). 이러한 가설을 뒷받침하여, 억제제 처리 전 또는 후, MYPT1의 고갈로 세포-세포 접촉의 유의적인 보호 또는 복원이 야기되었다(도 1D). siRNA 처리에 비감응성 세포 분획물의 존재는 MRLC의 Rock-중개된 직접적인 활성화에 의해 미오신 II의 대체 조절을 제안한다. 집합적으로, 이러한 데이터는 ES 세포에서 세포-세포 접촉은 Rho-Rock-미오신 II (RRM) 신호발생 축에 의해 조절된다고 제안한다.
siRNA 서열
실시간 QPCR 프라이머 서열 (서열 번호)
Rock 및 미오신 II는 hES 세포에서 세포-세포 상효작용을 조절한다. mES 세포에서 세포-세포 접촉에서 관찰된 RRM 신호 발생 기능이 hES 세포에서 보존되는지를 테스트하기 위하여, Matrigel™ 와 피더-없는 조건 및 조건화된 배지 (CM) (도 3A)에서 성장한 H1 세포를 C3 엑소자임으로 처리하였다. C3 처리된 세포는 처리된 mES 세포에서 볼 수 있는 명백한 세포-세포 분해를 보이며, 이는 인간에서 Rho 신호발생의 보존된 역할을 제안한다(도 3B). Rock-억제제 처리는 또한 mES 세포의 경우(10μM)보다 더 높은 농도(20μM)를 요구하지만(도 3C), 세포 유착 결함으로 이어졌다. 미오신 IIA 및 IIB는 hES 세포내 세포-세포 경계에 공동-국소화되었고, 이는 세포-세포 흡착에서 이들의 잠재적 역할을 나타낸다(도 3D). 이를 뒷받침하면서, 미오신 II에 매우 선택적인 합성 억제제, 블레비스타틴으로 처리하면 Rho 또는 Rock (도 3D)의 억제 표현형을 반영하는 두드러진 세포-세포 붕괴로 이어졌다. 이러한 데이터는 인간 및 마우스 ES 세포 모두다 세포-세포 상호작용의 핵심 조절물질로 RRM 신호발생 축을 이용한다는 것을 나타낸다.
미오신 II는 hiPS 및 hiES 세포에서 세포-매트릭스 접촉 및 탈착-유도된 아팝토시스를 조절한다. 미오신 II가 또한 Rock의 하류 세포-매트릭스 접촉의 주요 조절물질로 작용하는 지를 테스트하기 위하여, hiPS 세포를 상이한 농도의 블레비스타틴으로 처리하였다. hiPS 및 hES 세포는 인간 만능 줄기 세포에 대해 충분히 명확한 배지인 mTeSR에서 성장하였을 때, 화학적으로 합성된 매트릭스인 폴리-D-리신(PDL)에 정상적으로는 부착하지 않는다. 그러나, 블레비스타틴은 세포-세포 흡착에서 결함 징후가 관찰되지 않는 2μM 최저 농도에서 PDL 상에 hiPS 세포의 흡착을 상당히 지원하였다(도 4A). 더 높은 농도에서, 블레비스타틴-처리된 hiPS 세포는 Y27632-처리된 세포의 것과 필적하는 수준에서 세포-세포 접촉의 붕괴를 나타내었다(도 4A). hES 세포를 이용한 실험에서도 유사한 결과를 얻었다. 이러한 데이터는 RRM 신호발생 또한 인간 만능 줄기 세포에서 세포-매트릭스 상호작용을 조절한다는 것을 나타낸다.
hiPS 및 hES 세포는 세포 응집체를 형성하고, 비-조직 배양-처리된 플레이트와 같은 비-흡착성 배양 표면 상에 고 밀도로 도말하였을 때 배상체와 같이 후속적으로 성장할 수 있지만, 세포가 응집체 형성을 방해하는 저밀도에서 도말하였을 때 대부분 아팝토시스를 겪는다. 이는 인간 만능 줄기 세포가 배양 표면으로부터 탈착시 세포 사멸 신호를 활성화시키도록 예정된 상피 세포이기 때문이다(anoikis). 최근 보고에서 Y27632에 의해 hES 세포에서 Rock 억제는 실질적으로 Matrigel상에서 클론 밀도와 현탁 배양에서 저밀도에서 세포 생존을 증가시켰다고 보고하지만, 숨어있는 기전에 대해서는 여전히 모르고 있다. 본 명세서는 세포 상호작용에서 Rock의 하류 주요 효과물질로서 미오신 II, 그리고 미오신 II가 림프구와 같은 비-흡착 세포의 아팝토시스에 직접적으로 연루되어 있다고 설명하고 있기 때문에, iPS 세포의 아노이키스(anoikis)를 조절함에 있어서도 역할을 할 것이라고 가정하였다. 놀랍게도, 블레비스타틴으로 처리된 hiPS 세포 및 hES 세포는 저밀도 현탁 배양에서 Y27632와 필적할 수준 또는 더 강력하게 세포 생존을 두드러지게 증가시켰다(도 4B). 이는 Rock 억제에 의해 중개된 항-아팝토시스 효과를 대체하기 위하여 미오신 II 기능 억제만으로도 충분하다는 것을 나타낸다.
명확한 인자, 블레비스타틴 및 폴리-D-리신(PDL)-코팅의 복합은 인간 만능 줄기 세포의 자가-재생을 효과적으로 지원한다. 이러한 데이터는 집합적으로 선택적 미오신 II 억제제, 블레비스타틴이 세포-매트릭스 상호작용, 및 탈착-유도된 hES 및 iPS 세포의 아팝토시스를 상당히 강화한다는 것을 나타내기 때문에, 블레비스타틴, PDL-코팅, 및 mTeSR의 조합에 근거하여 충분히 명확한 배양 조건하에 hiPS 세포가 지속적으로 자가-재생할 수 있는 지를 평가하기 위한 추가 실험을 실행하였다. 이러한 배양 방법에서, 블레비스타틴은 hiPS 세포의 세포-세포 흡착에는 영향을 주지 않고, 세포-매트릭스 상호작용을 지원하는데 최저로 충분한 2.5μM로 이용되었다. 고농도(50-100μM)의 미오신 II의 블레비스타틴-중개된 완전한 억제가 Y27632에 의한 Rock의 완전한 억제와 같이 사이토킨에 영향을 주는 것으로 알려져 있기 때문에, 최소한으로 요구되는 농도를 이용하여 임의의 부작용을 피하는 것이 중요하다. 블레비스타틴을 이용한 명확한 조건하에 15회 계대를 통하여, hiPS 세포는 다중핵형성 세포와 같은 임의의 사이토킨 결함 징후 없이 Y27632로 처리한 세포의 것과 필적하는 일정한 성장 속도로 자가-복제할 수 있었다(도 4C). 전능 표식, Oct3/4, Nanog, 및 Sox2의 유지는 면역세포화학 및 QPCR (도 4D 및 4E)에 의해 확인하였다. hES 세포계를 이용한 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다. 흥미로운 것은, 본 연구에 이용한 hiPS 세포계는 Matrigel™을 이용한 피더 없는 표준 조건하에서 성장하였을 때 분화를 하는 경향이 있었지만(도 4E, 하부 패널), 블레비스타틴을 이용한 새로운 방법으로 성장한 세포의 대부분은 강력한 Oct3/4 발현과 함께 콜로니의 미분화 형태를 유지하여, 기존의 피더 없는 과정보다 새로운 방법의 우수성을 강조한다(도 4E, 상부와 중간 부분 패널).
블레비스타틴에 의한 NMII 억제는 hPS 세포의 클론 효과를 강화한다. NMII (NMHCII)의 중쇄는 3개 이소폼을 가지는데, 이가운데 NMHCIIA 및 NMHCIIB는 (NMHCIIC는 아님) Western 분석에 의해 독립적인 hES 및 iPS 세포계에서 바로 탐지가능하다(도 6a). 면역세포화학 분석은 두 가지 이소폼은 미분화된 hPS 세포의 혈장 막에 주로 위치하고, 세포-세포 접촉에서 이들의 역할과 일관된다는 것을 설명한다(Fig. 6a). hPS 세포의 세포 사멸에서 NMII 기능을 평가하기 위하여, NMII의 ATPase 활성을 효과적으로 그리고 가역적으로 차단하여, 이에 의해 운동 기능을 억제시키는 합성 화합물인 블레비스타틴을 이용하였다. 개별 클론계를 확립하는데 처음 결정적인 방해가 되는 클론 밀도에서 Matrigel-코팅된 플레이트 상에 도말된 hES 및 hiPS 세포의 생존능을 결정하였다. 단일 hiPS 세포는 Matrigel-코팅된 96개 웰 플레이트의 각 웰에 도말하였고, 도말 후 7일 시점에서 알칼리 포스파타제 착색으로 미분화된 콜로니 형성을 평가하였다. 도말 후 7일 시점에서 기준 조건에서는 콜로니 형성이 없거나 소수의 콜로니만 형성되었고, 세포를 블레비스타틴으로 처리하였을 때 웰의 대략 30%는 단일 콜로니를 포함하였다(0.47 ± 0.25% versus 29 ± 1.8%, p<0.01) (도 6b,c). hES 세포로부터 유사한 결과를 얻었다. 이러한 클론 효과는 Y-27632를 이용하였을 때 보고된 효과와 필적하였다. 콜로니의 일부를 선택하였고, 추가 확장하였고, 전능 마커 탐지 및 시험관내 그리고 생체 분화 분석을 포함하는 일련의 분자 및 기능 분석을 통하여 만능인지를 결정하였다.
블레비스타틴 처리에 의한 흡착 조건하에 hPS 세포의 증가된 생존. 블레비스타틴의 세포보호 효과는 도말 후 짧은 시간 이내에 탐지가능하였다. 세포 (1× 105 개 세포/웰, 12-웰 플레이트)는 상이한 농도의 블레비스타틴으로 처리하거나 처리하지 않았고, 그리고 생존능은 도말후 24시간 시점에서 바로 세포 카운팅을 하여 평가하였다. 블레비스타틴으로 처리된 hiPS 세포는 폴리-D-리신(PDL)(10μM에서 7.9 ± 0.6× 104 세포 vs. 0.5 ± 0.26× 104 세포, n=3, p<0.001) 및 Matrigel 코팅(10μM에서 8.6 ± 0.6× 104 세포 vs. 1.8 ± 0.25× 104 세포, n=3, p<0.01)와 같은 상이한 기질상에서 기준보다 상당히 더 높은 수로 생존하였다(최대 효과는 5와 10μM에서 관찰되었다)도 6 d,e, 및 10a-d). 동일한 조건에서 나란하게 Y-27632도 함께 테스트하였고, 블레비스타틴의 생존 효과는 Y-27632의 효과와 필적한다는 것을 알았다(PDL상에서 10μM에서 7.2 ± 1.1× 104 세포, n=3, p<0.05) (도 6 d,e, 및도 10a-d). 이 결과는 말단 데옥시뉴클레오티딜트란스퍼라제 dUTP 니크(nick) 및 라벨링 (TUNEL) 분석으로 탐지된 아팝토시스 수준과 역관계가 있었다. 기준 조건에서 세포의 70% 이상은 TUNEL 착색에 대해 양성이었으며, 블레비스타틴으로 처리한 세포는 TUNEL-양성 세포의 수보다 상당히 낮은 수를 나타내었다(73 ± 2.5% vs 11 ± 3.8%, n=3, p<0.01) (도 6f). 이 결과는 또다른 아팝토시스의 표지가 되는 절단된 카스파제-3에 의해 추가 확인되었는데, 분석에 의하면 블레비스타틴 처리된 세포에서 감소되었고, 이는 블레비스타틴 처리 후, 아팝토시스 세포 감소가 강한 수준임을 보여주었다(도 6g). hES 세포를 이용한 실험에서도 유사한 결과를 얻었다.
블레비스타틴은 현탁 조건하에 hPS 세포의 세포 사멸을 막는다. 블레비스타틴이 세포-매트릭스 유착 없이 세포에 또한 효과가 있는지를 테스트하기 위하여, 표준 분화 프로토콜에서 배상체를 생성하기 위하여 통상 1차 단계가 되는 현탁 배양에서 세포를 성장시켰다. 주목할 만한 것은, 블레비스타틴 처리는 hiPS 세포의 생존력을 현탁 조건하에서는 기준보다 훨씬 더 높은 수준으로 증가시켰다(10μM에서, 1.6± 0.12× 105 세포 vs 0.05 ± 0.02× 105 세포, n=3, p<0.01) (도 6 h,i). hES 세포 및 기타 독립적인 hiPS 세포계는 블레비스타틴에 의해 필적할 정도의 생존 효과를 나타내었다(도 6j 및 11a). 이 결과는 TUNEL 및 절단된 카스파제-3 분석으로 뒷받침되며, 블레비스타틴 처리 조건에서 상당히 더 낮은 수준의 아팝토시스를 설명한다. (도 6 k,l, 도 11b). 그러나, 낮은 농도의 블레비스타틴 처리는 일관되게 Y-27632보다 더 높은 생존력을 초래하지만, 반면 10μM에서, 블레비스타틴 또는 Y-27632의 생존 효과는 개별 세포계에 따라 가변적이었다(도 6 i,j 및 도 11a). 따라서, 블레비스타틴은 각 세포계에서 용량 및 효과에 근거하여 hPS 세포를 보호하는 대안 전략을 제공한다. 흥미로운 것은, 다른 세포 유형에서 미오신-중개된 수축 및 아팝토시스 조절에 관여하는 미오신 경쇄 키나제 억제제(MLCK)인 ML-7은 생존에 유의적인 효과를 나타내지 않았다(도 10d, 및 11c). 이는 MLCK 보다는 미오신 경쇄 포스파타제를 통하여 ROCK가 주로 조절된다는 것을 제안하지만 이러한 가능성을 확인하기 위한 추가 연구는 필요하다.
NMHCIIA 가 부족한 mES 세포의 강화된 생존. 유전자 수준에서 세포 생존력에 NMII의 역할을 직접적으로 증명하기 위하여, NMHCIIA 유전자의 대립형질 모두 파괴된 돌연변이 마우스 배아 줄기 (mES) 세포를 이용하였다(NMHCIIA-/A-) (도 7a). 돌연변이 세포의 세포-세포 접촉은 심각하게 손상되었다(도 7b). NMHCIIA-/A- mES 세포는 도말 후 24시간 시점에서 부모계(RW4)보다는 상당히 더 높은 생존력을 나타내었고(1.3± 0.3× 105 세포 vs 0.4 ± 0.1× 105 세포 , n=3, p<0.05) (도 7 c,d), 이는 hPS 세포에 대해 블레비스타틴을 이용한 데이터와 일치하였다. TUNEL 분석으로 아팝토시스 수준 또한 결정하였는데 야생형 mES 세포와 비교하였을 때, TUNEL-양성 돌연변이 세포의 수는 상당히 더 적다는 것을 설명한다(도 7e).
NMII의 두 가지 이소폼, NMIIA 및 NMIIB은 세포 유착, 이동 및 수축에서 별개의 기능을 가진다고 제시되어 왔었다. 세포 조절에서 역할을 하는 지를 평가하기 위하여, 유전적으로 NMHCIIB (NMHCIIB-/B-)이 결핍된 돌연변이 mES 세포를 검사하였다(도 7f). NMHCIIA-/A- mES 세포의 생존력에서 상당한 증가와 대조적으로, NMHCIIB 돌연변이는 야생형 mES 세포의 것과 유사한 생존 비율을 보였다(0.54 ± 0.1× 105 세포 vs 0.55 ± 0.14× 105 세포, n=3) (도 7 g,h). 이러한 결과들은 별개의 조절 기전이 세포 유착 및 이동의 경우와 마찬가지로, 만능 줄기 세포의 세포 사멸 조절에서 NMII의 각 이소폼을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
NMII 및 자가-재생 조절물질 사이에 기계적 연결. 어레이 데이터 베이스의 조사에서, NMHCIIA 전사체는 hES 세포의 분화된 상태에서 상당히 많은 것으로 확인되었으며(표 1), 이는 자가-재생/분화 프로그램과 NMII 사이에 잠재적인 분자 연결을 제시한다. Oct3/4 및 Nanog 및 NMII와 같은 자가-재생 조절물질들을 검사하였고, hPS 세포에서 기계적으로 연결되어 있다. hiPS 또는 hES 세포는 미분화된 상태를 지원하는 mTeSR 또는 상이한 농도의 블레비스타틴 존재하에 또는 없이 수동 분화를 유도하는 비-조건화된 인간 ES 배지 (hESm)에서 48시간 동안 성장하였다. 블레비스타틴으로 처리된 hES 세포는 이들 두 배지 조건에서 용량 의존적 방식으로 이들 전사인자 모두의 상승된 수준을 설명하였다(정량적 RT-PCR (QPCR), Western 분석, 및 면역세포화학에 의해 결정됨(도 8a-e)). hiPS 세포에서 유사한 결과를 수득하였다. 이러한 연결이 마우스에서도 보존되는 지를 결정하기 위하여, 2일간 백혈병 억제 인자(LIF) 존재하에 또는 없이 성장한 mES 세포를 검사하였다. hES 세포에서 구한 데이터와 일관되게, 자가-재생 조절물질인 Oct3/4 및 Nanog 모두 각 조건에서 부모 세포와 비교하였을 때, NMHCIIA-/A- mES 세포에서 실질적으로 더 높은 단백질 수준에서 발현되었다(도 8 f,g). 이러한 데이터는 집합적으로 인간 및 마우스 만능 줄기 세포 모두에서 자가-재생의 네가티브 조절에서 결과 인자가 아닌 원인 인자로 기능을 할 수 있다는 것을 제안한다. 이러한 연결은 초점 흡착에서 NMII와 β1 인테그린 사이의 상호작용에 의해 중개될 수 있으며, 이는 다시 ES 세포의 분화에 연루되었던 ERK 신호 발생을 포함하는 다중 경로를 활성화시킨다. 대안으로, NMII는 TGF-β, PI3 키나제, 및 Wnt 신호발생과 같은 기타 자가-재생 경로와 혼선될 수도 있다. NMII 억제에 의한 자가-재생 조절물질들의 상향 조절은 자가-재생 만능 줄기 세포의 강화된 재생에 기여할 수 있다.
프로브 ID | 유전자 이름 | 미분화된 | 분화된 |
211926_s_at | NMHC IIA | 326 | 2401.2 |
212372_at | NMHC IIB | 2177.4 | 2125.3 |
217660_at | NMHC IIC | 10.4 | 8 |
프로브 ID | 유전자 이름 | 미분화된 | 분화된 |
205951_at | MYH1 | 1.4 | 18 |
204631_at | MYH2 | 37.3 | -1.8 |
205940_at | MYH3 | 1.5 | 2.3 |
208148_at | MYH4 | 3.4 | 2.8 |
204737_s_at | MYH7 | 1.3 | 10.5 |
206717_at | MYH8 | 11.2 | 8.8 |
207961_x_at | MYH11 | 7.7 | 11 |
블레비스타틴을 이용한 hPS 세포에 대한 충분히 명확한 배양 조건 확립. 본 명세서는 Y-27632 처리가 hES 세포가 정상적으로는 잘 성장하지 않는 PDL-코팅상에서 hES 세포가 자가 재생할 수 있게 만든다는 것을 설명한다. PDL은 마우스 종양으로부터 유도된 추출물인 Matrigel과는 달리 화학적으로 합성된 것이기 때문에, 본 명세서는 명확한 배지를 이용하여 hES 세포의 자가-재생을 위한 충분히 명확한 조건을 제공한다. hES 및 iPS 세포 모두에서 Y-27632의 모든 효과를 정확하게 복제하기 때문에, 블레비스타틴이 명확한 배양 조건에서 Y-27632를 충분히 대체할 수 있는 지를 판단하기 위하여 오로지 블레비스타틴만 테스트하였다. 세포-세포 흡착에는 영향을 주지 않으면서 자가-재생을 지원하는데 충분한 최저 농도인 2.5 내지 5μM 농도 사이에서 블레비스타틴을 이용하였다. 블레비스타틴의 요구되는 최저 농도는 개별적인 hES 또는 hiPS 세포계에 따라 다양하지만 대부분의 세포계는 5μM의 블레비스타틴에서 자가 재생한다. 고농도(50-100μM)의 블레비스타틴에 의한 강력한 억제는 사이토킨에 영향을 주기 때문에(고농도의 Y-276328에서도 볼 수 있음), 최저 농도의 블레비스타틴을 이용하는 것이 중요하다. 이러한 명확한 조건하에 20회 계태후 각 세포계에서 전능 표식의 전형적인 미분화된 형태 및 발현의 유지를 확인하였다(도 9a-d). hiPS 또는 hES 세포는 Y-27632으로 처리된 세포 또는 Matrigel을 이용하여 정규적인 피더-없는 조건하에 성장한 세포와 필적하는 일정한 성장률로 PDL 상에서 자가-재생할 수 있었다(도 9e). 생체내에서 충분한 분화 기능을 평가하기 위하여, 계대된 세포는 심각하게 복합 면역결핍된(SCID)/베이지 마우스의 피하로 주사하여 기형종 분석을 하였다. 기형종 시료는 조직 단편으로 검사하였으며, 멜라닌 세포(외배엽), 뉴우런 조직(외배엽), 뼈(중배엽), 골 근육(중배엽), 배상 세포와 함께 위장-유사 점막 상피(내배엽), 및 사구체(내배엽)와 같은 세 가지 모든 배엽 유도된 조직을 포함하는지를 판단하였다(도 9f). 특화된 세포-특이적 표식 단백질을 면역조직화학적으로 탐지함으로써 추가 확인하였다(Fig. 9g). 이러한 결과로 블레비스타틴과 함께 명확한 조건하에 성장한 hES 또는 hiPS 세포는 다중-분화 능력의 손상없이 연장된 기간 동안 자가-재생할 수 있고, 블레비스타틴의 효과의 충분한 가역성을 증명한다는 것을 확인하였다. 세포가 게놈 일체성을 유지하는 지에 대해 염색체분석으로 평가하여 판단하였다(도 9h는 hiPS 세포 , 그리고 도 12는 hES 세포). 블레비스타틴의 사용은 ROCK의 하류 다수의 효과물질 분자에 영향을 주는 Y-27632보다 NMII 기능을 겨냥하는데 있어서 유익할 수 있다. 또한, 블레비스타틴은 통상적인 용도에 대해 비용측면에서 Y-27632보다 더 효과적이다. 완전하게 재-프로그램된 hiPS 세포는 통상적인 피더-의존적 배양 조건보다 피더-없는 조건에서 더 효과적으로 생성될 수 있다고 제안되었다. 따라서, 이러한 새로운 배양 방법은 충분히 명확한 조건하에서 새로운 hiPS 세포계를 효과적으로 유도하고 증식시키기 위한 주요 기술을 개발하는 기반을 제공할 수 있다.
블레비스타틴으로 처리한 hiPS 세포는 Y27632로 처리된 세포보다 더 높은 성장 및 세포 생존율을 나타낸다는 것이다. 미오신 II이외의 다수의 하류 효과물질 수를 확장시킨다는 사실과 함께, 블레비스타틴에 의한 주요 조절물질인 미오신 II을 겨냥한 억제는 미오신 II이외의 다수의 하류 분자의 억제에 의한 불필요한 결과를 배제하는데 있어서 Y27632의 이용보다 상당한 이점을 가진다.
상기에서 다수의 구체예와 특징을 설명하였지만, 당업계 숙련자는 첨부된 청구범위에서 명확하게 나타낸 것과 같이 본 명세서의 교시 또는 범위를 벗어나지 않고 설명한 구체예와 특징의 변형 및 변이가 가능할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Claims (35)
- 기초 배지 및 미오신 II 억제제를 포함하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, RHO의 키나제 도메인에 결합하여 억제하는 ROCK 억제제를 추가 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 미오신 II 억제제는 블레비스타틴 또는 이의 유사체인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 혈청을 더 포함하는, 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 혈청은 배양되는 세포에 동종이계인, 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 혈청은 배양되는 세포에 자가 혈청인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 아미노산을 더 포함하는, 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 아미노산은 비-필수 아미노산인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 환원제를 더 포함하는, 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 환원제는 베타-멀캅토에탄올인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 항생제 및/또는 곰팡이제거제를 더 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 피루베이트 비타민을 더 포함하는, 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 피루베이트 비타민은 피루베이트 나트륨 또는 피루베이트 칼륨인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, LIF를 더 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, L-글루타민을 더 포함하는, 조성물.
- 비-필수 아미노산, 항산화제, 환원제, 성장 인자들, 피루베이트 비타민 및 미오신 II 억제제가 보충된 기초배지를 포함하는 조성물.
- 청구항 16에 있어서, 기초 배지는 DMEM인 조성물.
- 폴리-D-리신, 명확한 배양 배지 및 미오신 II 억제제를 포함하는 키트.
- 청구항 18에 있어서, 조직 배양 기질을 더 포함하는 키트.
- 청구항 18에 있어서, 성장 인자들을 포함하는 보충제를 더 포함하는 키트.
- 청구항 18에 있어서, 명확한 배양 배지는 혈청이 없으며, 재조합 bFGF, 재조합 TGFβ을 포함하고, 약 330-350 mOsm의 삼투 및 pH of 7.25 내지 7.45의 pH를 가지는, 키트.
- 청구항 18에 있어서, 미오신 II 억제제는 블레비스타틴 또는 이의 유사체인, 키트.
- 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서,
미오신 II 억제제를 포함하는 배양 배지에 줄기 세포를 현탁시키고; 그리고
폴리-D-리신 코팅된 조직 배양 기질의 존재하에 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법. - 청구항 23에 있어서, 배양 배지는 명확한 배지인, 방법.
- 청구항 24에 있어서, 명확한 배양 배지는 무-혈청 배지인, 방법
- 청구항 25에 있어서, 배지는 재조합 bFGF, 재조합 TGFβ을 더 포함하고, 약 330-350 mOsm의 삼투 및 7.25 내지 7.45의 pH를 가지는, 방법.
- 청구항 1의 조성물내에 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포 배양물.
- 청구항 23에 있어서, 줄기 세포는 폴리-D-리신 존재하에 배양된, 배양물.
- 청구항 27에 있어서, 미오신 II 억제제는 블레비스타틴 또는 이의 유사체인, 배양물.
- 청구항 1 또는 16의 조성물을 포함하는 키트.
- 기초 배지 또는 명확한 배지에 추가되도록 구획화된 미오신 II 억제제를 포함하는 키트.
- 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서,
줄기 세포를 피더 층 없이 청구항 1 또는 16의 조성물과 접촉시키고, 이때 줄기 세포는 성장하고, 증식하는 것을 포함하는 방법. - 재조합 bFGF, 재조합 TGFβ을 포함하는 명확한 배양 배지를 포함하는 조성물에 있어서, 조성물은 혈청이 없으며, 미오신 II 억제제를 포함하는, 조성물.
- 청구항 33에 있어서, 명확한 배양 배지는 약 330-350 mOsm의 삼투 및 7.25 내지 7.45의 pH를 가지는, 조성물.
- 줄기 세포의 증식 및 성장을 촉진시키는 배지와 폴리-D-리신기질을 포함하는 동물 없는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서, 배지는 동물 없는 성분들, 미오신 II 억제제, ROCK 억제제 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
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