JP4921356B2 - 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 - Google Patents
癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4921356B2 JP4921356B2 JP2007510369A JP2007510369A JP4921356B2 JP 4921356 B2 JP4921356 B2 JP 4921356B2 JP 2007510369 A JP2007510369 A JP 2007510369A JP 2007510369 A JP2007510369 A JP 2007510369A JP 4921356 B2 JP4921356 B2 JP 4921356B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- cancer
- value
- width
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 29
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 title description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 172
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 26
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 14
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000004085 squamous epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000005712 Keratin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- -1 that is Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1429—Signal processing
- G01N15/1433—Signal processing using image recognition
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
- G01N21/51—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid inside a container, e.g. in an ampoule
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1477—Multiparameters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N2021/4704—Angular selective
- G01N2021/4707—Forward scatter; Low angle scatter
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Signal Processing (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
この発明は、生体から採取された細胞群（検体）から癌・異型細胞を弁別する方法およびその弁別に必要な凝集粒子の弁別方法に関する。
癌・とくに子宮頸癌の早期発見のためのスクリーニング法として、健康診断等では、細胞診が有効に利用されている。
ここで、子宮頸癌の細胞診は、子宮頸部表面を綿棒やスクレーバー等で擦過し、擦過した細胞を、直ちにスライドグラス上に塗抹して標本を作り、顕微鏡等で観察することにより診断を行っている。顕微鏡による細胞の形態観察による診断は、細胞検査士が、検体毎に行っているのが実情であり、精度、処理速度の点で、改善が求められている。
近年、細胞検体を自動的に検査して、癌細胞の有無を判断する装置が知られている。
この自動判別装置は、子宮頸癌細胞を含む検体をスライドグラスに塗抹して塗抹標本を作製し、標本の細胞核及び細胞質をパパニコウロウ染色で染色し、標本細胞の形態イメージを処理した形態情報から癌細胞の有無を判別している。しかし、この自動細胞判別装置の性能は、正常細胞の除外効率が２５％、処理速度が８〜１０検体／時間程度である。このような精度、処理速度は、健康診断で癌の有無を判別する現場担当者にとって、満足のゆくものではない。
この自動判別装置は、子宮頸癌細胞を含む検体をスライドグラスに塗抹して塗抹標本を作製し、標本の細胞核及び細胞質をパパニコウロウ染色で染色し、標本細胞の形態イメージを処理した形態情報から癌細胞の有無を判別している。しかし、この自動細胞判別装置の性能は、正常細胞の除外効率が２５％、処理速度が８〜１０検体／時間程度である。このような精度、処理速度は、健康診断で癌の有無を判別する現場担当者にとって、満足のゆくものではない。
一方、細胞形態観察によらず、癌細胞に特異的なマーカーを検出することにより、癌細胞の有無を判断する細胞診断方法がある。
例えば、特許文献１には、子宮頸癌及びその前癌状態に特異的なマーカーとして、子宮頸癌関連タンパク質及びそれを認識する抗体を用いたイムノアッセイが提案されている。
特許文献２には、子宮頸部塗抹標本だけでなく、個々に分散された細胞群の検体について、腫瘍細胞及びそれらの前駆細胞の自動検出方法が提案されている。これは、癌細胞における２種以上のマーカーを、マーカーに特異的に反応する抗体又は核酸プローブに蛍光標識した試薬を用いて、前記マーカーと結合した試薬の蛍光シグナルの有無を自動的に測定することにより癌細胞の有無を検出する方法である。
しかしながら、このようなマーカーを用いる方法でも、癌・異型細胞の弁別において、操作の簡便性や、測定の精度や速度などがまだ十分に満足できるものではない。
特表２００１−５００６０９号公報
特開２００２−２９６２７４号公報
この発明はこのような事情を考慮してなされたもので、フローサイトメトリーを用い、得られる光学信号の波形を分析することにより、癌・異型細胞を能率よく高精度に分別する方法と、癌・異型細胞の分別に必要な凝集粒子の弁別方法を提供するものである。
この発明は、複数の子宮頸部細胞をフローサイトメータにて計測し、個々の細胞について散乱光信号を取得し、各散乱光信号の波形を解析することにより、前記波形の幅、半値幅、面積、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれか２つ以上の特徴パラメータを算出し、その特徴パラメータを組合わせて用いて前記複数の子宮頸部細胞から癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞凝集塊とを弁別する方法を提供するものである。ここで、散乱光信号とは、前方および側方散乱光を表す信号の内の少なくとも１つを含む。
別の観点からこの発明は、子宮頸部細胞を含む試料流を形成するためのフローセルと、フローセル中の前記試料流に光を照射するための光源と、前記試料流からの細胞の散乱光を検出して散乱光信号を出力する検出部と、出力された前記散乱光信号の波形を解析することにより、前記波形の幅、半値幅、面積、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれか２つ以上の特徴パラメータを算出する波形解析部と、算出された前記特徴パラメータを組合わせて用いて前記子宮頸部細胞から癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞凝集塊とを弁別するための制御部と、を備えた細胞分析装置を提供するものである。
フローサイトメータから得られる子宮頸部細胞の散乱光信号の波形からその波形の幅、半値幅、面積、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれか２つ以上の特徴パラメータを算出し、その特徴パラメータを組合わせて用いて、癌・異型細胞の弁別を行うので、顕微鏡で観察する方法やマーカーのみによって弁別する方法に比べて、多量の細胞に対して簡単に、能率よく、また、高精度に行うことができる。
また、以下に述べる本発明の実施形態におけるフローサイトメータの構成では、散乱光信号に加えて蛍光信号を検出できるようになっており、本発明の方法に前記蛍光標識されたマーカーによって検出する方法を組み合わせることも可能である。その場合には蛍光標識されたマーカーのみによって検出する方法における前記測定精度の問題を本発明により大幅に改善できることが期待できる。
１００ フローセル
１０１ レンズ
１０２ ビームストッパ
１０３ 対物レンズ
１０４ ダイクロイックミラー
１０５ 検出器
１０６ 検出器
１０７ 対物レンズ
１０８ ダイクロイックミラー
１０９ ダイクロイックミラー
１１０ 干渉フィルタ
１１１ 検出器
１１２ ダイクロイックミラー
１１３ 干渉フィルタ
１１４ 検出器
１１５ ダイクロイックミラー
１１６ 干渉フィルタ
１１７ 検出器
１１８ 干渉フィルタ
１１９ 検出器
１２０ パルスレーザ
１２１ カメラ
１２３ Ａｒイオンレーザー
１０１ レンズ
１０２ ビームストッパ
１０３ 対物レンズ
１０４ ダイクロイックミラー
１０５ 検出器
１０６ 検出器
１０７ 対物レンズ
１０８ ダイクロイックミラー
１０９ ダイクロイックミラー
１１０ 干渉フィルタ
１１１ 検出器
１１２ ダイクロイックミラー
１１３ 干渉フィルタ
１１４ 検出器
１１５ ダイクロイックミラー
１１６ 干渉フィルタ
１１７ 検出器
１１８ 干渉フィルタ
１１９ 検出器
１２０ パルスレーザ
１２１ カメラ
１２３ Ａｒイオンレーザー
以下、図面に示す実施形態を用いてこの発明を詳述する。これによってこの発明が限定されるものではない。
フローサイトメータの構成
光学系
まず、この発明には、例えば、図１に示すような光学系を有するフローサイトメータが用いられる。
このフローサイトメータでは、フローセル１００を通過する細胞又は粒子からの前方蛍光（ＦＦＬ）および側方蛍光（ＦＬ１〜ＦＬ３）を検出するとともに、前方散乱光（ＦＳＣ）および側方散乱光（ＳＳＣ）を検出し、カメラ１２１で細胞（粒子）画像を撮像している。また、このフローサイトメータでは、フローセル１００で細胞又は粒子が１個ずつ流れるように細胞又は粒子を含む試料流が形成され、形成された試料流中の細胞又は粒子から光を検出するようにしている。
フローサイトメータの構成
光学系
まず、この発明には、例えば、図１に示すような光学系を有するフローサイトメータが用いられる。
このフローサイトメータでは、フローセル１００を通過する細胞又は粒子からの前方蛍光（ＦＦＬ）および側方蛍光（ＦＬ１〜ＦＬ３）を検出するとともに、前方散乱光（ＦＳＣ）および側方散乱光（ＳＳＣ）を検出し、カメラ１２１で細胞（粒子）画像を撮像している。また、このフローサイトメータでは、フローセル１００で細胞又は粒子が１個ずつ流れるように細胞又は粒子を含む試料流が形成され、形成された試料流中の細胞又は粒子から光を検出するようにしている。
さらに詳述すると、まず連続発光のＡｒイオンレーザー１２３から出射された４８８ｎｍの発振波長を持つ青色レーザーがレンズ１０１を経ることにより、短径１０μｍ、長軸１００μｍ程度の扁平な楕円形ビームプロファイルを持つように整えられて、フローセル１００に入射する。
フローセル１００に入射した光は、フローセル１００を経てビームストッパ１０２に集光し、ここで遮られる。細胞又は粒子からの前方蛍光（ＦＦＬ）および前方散乱光（ＦＳＣ）は対物レンズ１０３で集められ、５３０ｎｍ以上の波長の光が通過する性質を持ったダイクロイックミラー１０４を経て、１０度前後の立体角の前方蛍光（ＦＦＬ）は検出器（光電子増倍管）１０５に入射され、そこで検出される。５３０ｎｍ以下の波長を持つ１０度前後の立体角の前方散乱光（ＦＳＣ）が検出器（フォトダイオード）１０６に入射され、そこで検出される。
フローセル１００に入射した光は、フローセル１００を経てビームストッパ１０２に集光し、ここで遮られる。細胞又は粒子からの前方蛍光（ＦＦＬ）および前方散乱光（ＦＳＣ）は対物レンズ１０３で集められ、５３０ｎｍ以上の波長の光が通過する性質を持ったダイクロイックミラー１０４を経て、１０度前後の立体角の前方蛍光（ＦＦＬ）は検出器（光電子増倍管）１０５に入射され、そこで検出される。５３０ｎｍ以下の波長を持つ１０度前後の立体角の前方散乱光（ＦＳＣ）が検出器（フォトダイオード）１０６に入射され、そこで検出される。
一方、細胞又は粒子から発せられた側方蛍光および側方散乱光は、フローセル１００の側方に配置された高い開口数（ＮＡ）をもつ対物レンズ１０７で集められる。対物レンズ１０７を出射した光は、まず７４０ｎｍより短い波長の光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１０８に入射する。このミラー１０８を反射した側方蛍光および側方散乱光は、まず５００ｎｍ以下の波長をもつ光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１０９に入射する。ミラー１０９を反射した光は、中心波長４７４ｎｍ、通過波長４９ｎｍの干渉フィルタ１１０を経て検出器（光電子増倍管）１１１に入射され、そこで側方散乱光（ＳＳＣ）検出がされる。
ダイクロイックミラー１０９を透過した光は、５５０μｍ以下の波長を持つ光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１１２に入射する。ミラー１１２を反射した光は、中心波長５３４ｎｍ、通過波長２６ｎｍの干渉フィルタ１１３を経て検出器（光電子増倍管）１１４に入射され、そこで、側方緑蛍光（ＦＬ１）が検出される。
ダイクロイックミラー１０９を透過した光は、５５０μｍ以下の波長を持つ光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１１２に入射する。ミラー１１２を反射した光は、中心波長５３４ｎｍ、通過波長２６ｎｍの干渉フィルタ１１３を経て検出器（光電子増倍管）１１４に入射され、そこで、側方緑蛍光（ＦＬ１）が検出される。
ダイクロイックミラー１１２を通過した光は、ダイクロイックミラー１１５で６３０ｎｍ以下と６３０ｎｍ以上の光に分けられる。６３０ｎｍ以下の光は、中心波形５９７ｎｍ、通過波長４９ｎｍの干渉フィルタ１１６を経て検出器（光電子倍増管）１１７に入射され、そこで側方橙蛍光（ＦＬ２）が検出される。６３０ｎｍ以上の光は、中心波形６８９ｎｍ、通過波長４６ｎｍの干渉フィルタ１１８を経て、検出器（光電子増倍管）１１９に入射され、そこで側方赤蛍光（ＦＬ３）が検出される。
捕捉された前方散乱光（ＦＳＣ）、前方蛍光（ＦＦＬ）、側方散乱光（ＳＳＣ）、側方緑蛍光（ＦＬ１）、側方橙蛍光（ＦＬ２）、側方赤蛍光（ＦＬ３）を表す電気信号波形はＡ／Ｄ変換器１２４（図２）によりＡ／Ｄ変換後、分析装置２００（図２）に入力される。細胞（粒子）がフローセルを通過中に、必要に応じて７８０ｎｍの発振波長を持つ近赤外のパルスレーザ１２０が発光する。このパルスレーザ１２０からのレーザ光は透過照明として働き、フローセル１００から出射した光は、ダイクロイックミラー１０８を通過し、カメラ１２１に結像する。このようにして細胞又は粒子の静止画像の捕捉が可能となる。
なお、上記実施形態においては、散乱光信号を用いて、癌・異型細胞を弁別する方法を述べたが、細胞を癌や異型細胞と特異的に反応する蛍光マーカーで染色し、前記蛍光マーカーと結合した細胞の蛍光信号を取得し、蛍光強度、蛍光パルス幅及び蛍光パルス面積等の蛍光パラメータを算出し、これら蛍光パラメータのうち少なくとも１つと、以下に述べる散乱光の特長パラメータの少なくとも１つと組み合わせることにより、より高精度に癌・異型細胞を弁別することができる。例えば、腺癌細胞検出用マーカーとして、Ｒ−ＰＥ標識サイトケラチン８抗体、子宮頸部扁平上皮系異型細胞用マーカーとして、Alexa４８８標識ＮＭＰ１７９抗体を用いることができる。これらのマーカーを用いて細胞を染色し、例えば図１に示すような光学系を有するフローサイトメータで測定し、各標識由来の蛍光（Ｒ−ＰＥ標識の場合は橙色蛍光、Alexa４８８標識の場合は緑色蛍光）を検出して、ある一定量以上の蛍光強度を有する細胞について散乱光の特長パラメータを用いて解析することにより、腺癌あるいは扁平上皮異型細胞以外の細胞を効率よく除外することができる。
制御系
次に、図２はフローサイトメータの制御系を示すブロック図である。同図に示すように、制御部２００は、検出器１０５、１０６、１１１、１１４、１１７、１１９からの信号波形をＡ／Ｄ変換器１２４を介して受け、得られた波形データを波形データ格納部２０１に一旦格納し、格納したデータを波形データ分析部２０２で分析し、分析結果に基づいて細胞（粒子）を細胞（粒子）弁別部２０３で弁別し、弁別結果を出力部４００に出力させる。
さらに、制御部２００では、入力部３００からの設定条件に基づき、撮像制御部２０４がパルスレーザー１２０を発光させる。
それによって、カメラ１２１は細胞（粒子）を撮像し、その画像データは画像データ格納部２０４に格納され、必要に応じて、出力部４００から出力される。また、波形データ格納部２０１に格納された信号波形とデータ格納部２０４に格納された撮像された細胞（粒子）画像とは対応付けられたテーブルが制御部２０５に記憶されている。
次に、図２はフローサイトメータの制御系を示すブロック図である。同図に示すように、制御部２００は、検出器１０５、１０６、１１１、１１４、１１７、１１９からの信号波形をＡ／Ｄ変換器１２４を介して受け、得られた波形データを波形データ格納部２０１に一旦格納し、格納したデータを波形データ分析部２０２で分析し、分析結果に基づいて細胞（粒子）を細胞（粒子）弁別部２０３で弁別し、弁別結果を出力部４００に出力させる。
さらに、制御部２００では、入力部３００からの設定条件に基づき、撮像制御部２０４がパルスレーザー１２０を発光させる。
それによって、カメラ１２１は細胞（粒子）を撮像し、その画像データは画像データ格納部２０４に格納され、必要に応じて、出力部４００から出力される。また、波形データ格納部２０１に格納された信号波形とデータ格納部２０４に格納された撮像された細胞（粒子）画像とは対応付けられたテーブルが制御部２０５に記憶されている。
ここで、制御部２００は、マイクロコンピュータやパーソナルコンピュータにより一体的に構成される。
入力部３００は、主に波形データ分析部２０２の分析条件、細胞（粒子）弁別部２０３の弁別条件および、撮像制御部２０４の撮像条件などを入力設定するためのものであり、キーボード、タッチパネル、又はマウスなどにより構成される。
出力部はＣＲＴやＬＣＤ又はプリンタなどで構成される。
入力部３００は、主に波形データ分析部２０２の分析条件、細胞（粒子）弁別部２０３の弁別条件および、撮像制御部２０４の撮像条件などを入力設定するためのものであり、キーボード、タッチパネル、又はマウスなどにより構成される。
出力部はＣＲＴやＬＣＤ又はプリンタなどで構成される。
なお、Ａ／Ｄ変換器１２４は、１つのアナログ信号波形を、２０nsecのサンプリング周期で時刻Ｘ0，Ｘ1，Ｘ2，・・・Ｘnにおいてサンプリングし、最大電圧１０Ｖとベースライン（Baseline）電圧0.05Ｖの間の計測電圧を８ビットの分解能で量子化してデジタル信号に変換するようになっている。
そこで、波形データ分析部２０２では、次の（１）〜（１０）に示す１０種類の特徴パラメータについて分析計算を行う。
（１）ピーク値〔Peak〕：図３に示すように波形の最大値であり、
で表される。
（１）ピーク値〔Peak〕：図３に示すように波形の最大値であり、
（２）幅〔Width〕：図３に示すようにベースラインBaselineより大きい部分の幅であり、
で表される。但し、ＰはＸｐがピーク値になる添字である。
（３）半値幅〔ＨＷ〕：図４に示すようにPeak／２の高さにおける波形幅であり、
で表される。但し、ＰはＸｐがピーク値になる添字である。
（４）面積〔Area〕：図５に示すように波形の面積に対応し、
で表される。
（５）差分積分値÷ピーク値〔Ｂ〕
で表される。ここで、差分積分値とは、隣り合うサンプリングデータの差の絶対値の累積加算値を表す。
（６）正規化２次モーメント〔Ｍ〕
で表される。但し、ＰはＸｐがピーク値となる添字である。
Ｍは波形の波打ち度合い、特に左右（時間軸）方向に離れた部位にピーク値（山なり又は隆起）が存在する度合を評価する。図６（ａ）の波形のＭは横軸のｉにおいて値が大きくなるが、図６（ｂ）ではＭの値は小さい。
なお、式（６）では、Ｍの値を正規化するために分母の値で除算している。
Ｍは波形の波打ち度合い、特に左右（時間軸）方向に離れた部位にピーク値（山なり又は隆起）が存在する度合を評価する。図６（ａ）の波形のＭは横軸のｉにおいて値が大きくなるが、図６（ｂ）ではＭの値は小さい。
なお、式（６）では、Ｍの値を正規化するために分母の値で除算している。
（７）波打ち度合い〔Ｊ〕
とするとき、
Ｊ≡（ａ＋ｃ）×（ｂ＋ｄ）・・・（７）
で表される。但し、ｐはＸpがピーク値となる添字である。
Ｊは波形の波打ち度合、特に三角形から乖離度合を評価するためのパラメータである。つまり、Ｊは図７（ａ）に示すように破線の上にある部分の面積と下にある部分の面積との積であり、図７（ｂ）のような波形ではＪの値は非常に小さくなる。
Ｊ≡（ａ＋ｃ）×（ｂ＋ｄ）・・・（７）
で表される。但し、ｐはＸpがピーク値となる添字である。
Ｊは波形の波打ち度合、特に三角形から乖離度合を評価するためのパラメータである。つまり、Ｊは図７（ａ）に示すように破線の上にある部分の面積と下にある部分の面積との積であり、図７（ｂ）のような波形ではＪの値は非常に小さくなる。
（８）幅÷ピーク値〔Ｃ〕：波形の形状、特に扁平度合を評価するものであり、
で表される。つまり、図８（ａ）の場合は図８（ｂ）の場合に比べてＣの値が大きくなる。
（９）面積÷（幅×ピーク値）〔Ｄ〕：図９に示すように波形の形状、特に三角形に近いのか、方形に近いのかを評価するパラメータであり、
で表される。
図９（ａ）の場合にはその値は大きくなり、図９（ｂ）の場合にはその値は小さくなる。
（９）面積÷（幅×ピーク値）〔Ｄ〕：図９に示すように波形の形状、特に三角形に近いのか、方形に近いのかを評価するパラメータであり、
図９（ａ）の場合にはその値は大きくなり、図９（ｂ）の場合にはその値は小さくなる。
（１０）ピーク左側面積÷ピーク右側面積〔Ｅ〕：波形の形状、特にピーク値の（時間軸での）位置およびその左右での不均衡度合を評価するものであり、
で表される。
ＰはＸpがピーク値となる添字である。図１０（ａ）の場合、Ｅは大きく、図１０（ｂ）の場合、Ｅは小さくなる。
図１〜１０に示されるように、散乱光信号波形は、複雑な形態したものを含み、前述した特徴パラメータは複雑な散乱光信号波形の形態的特徴を反映したものとなっている。
なお、波形分析部２０２で分析された各特徴パラメータは、画像データ格納部に記憶された細胞（粒子）画像と対応付けられて、制御部２０５に記憶される。
次に、図２における細胞（粒子）弁別部２０３は、波形データ分析部２０２で算出された上記の各特徴パラメータを予めそれぞれ設定されたしきい値（入力部３００から入力される）と比較し、そのしきい値以上、又は未満のものを求め、フローサイトメータで検出された全細胞（全粒子）に対して除外することによって所望の細胞（粒子）を弁別する。例えば、単一細胞（粒子）と凝集塊との弁別、癌・異型細胞と白血球凝集塊との弁別、癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞との弁別、および癌・異型細胞と扁平上皮細胞凝集塊との弁別などを行う。
ＰはＸpがピーク値となる添字である。図１０（ａ）の場合、Ｅは大きく、図１０（ｂ）の場合、Ｅは小さくなる。
図１〜１０に示されるように、散乱光信号波形は、複雑な形態したものを含み、前述した特徴パラメータは複雑な散乱光信号波形の形態的特徴を反映したものとなっている。
なお、波形分析部２０２で分析された各特徴パラメータは、画像データ格納部に記憶された細胞（粒子）画像と対応付けられて、制御部２０５に記憶される。
次に、図２における細胞（粒子）弁別部２０３は、波形データ分析部２０２で算出された上記の各特徴パラメータを予めそれぞれ設定されたしきい値（入力部３００から入力される）と比較し、そのしきい値以上、又は未満のものを求め、フローサイトメータで検出された全細胞（全粒子）に対して除外することによって所望の細胞（粒子）を弁別する。例えば、単一細胞（粒子）と凝集塊との弁別、癌・異型細胞と白血球凝集塊との弁別、癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞との弁別、および癌・異型細胞と扁平上皮細胞凝集塊との弁別などを行う。
測定動作
このような構成における全体的な測定動作の流れを図１１に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、測定用試料を調製し（ステップＳ１）、調製した試料を図１および図２に示すフローサイトメータに供給して測定を行う（ステップＳ２）。
次に、各検出器から得られる信号波形を制御部２００の波形データ格納部２０１に格納し（ステップＳ３）、格納した信号波形から波形データ分析部２０２が特徴パラメータを算出する（ステップＳ４）。そして、細胞（粒子）弁別部２０３は、算出された特徴パラメータを用いて測定用試料に含まれる細胞（粒子）の種類を弁別し、その結果を出力部４００に出力させる。なお、撮像制御部２０４は必要な細胞（粒子）画像をカメラ１２１に撮像させ、画像データ格納部２０５に画像データを格納させると共に、画像を出力部４００に出力させる。
このような構成における全体的な測定動作の流れを図１１に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、測定用試料を調製し（ステップＳ１）、調製した試料を図１および図２に示すフローサイトメータに供給して測定を行う（ステップＳ２）。
次に、各検出器から得られる信号波形を制御部２００の波形データ格納部２０１に格納し（ステップＳ３）、格納した信号波形から波形データ分析部２０２が特徴パラメータを算出する（ステップＳ４）。そして、細胞（粒子）弁別部２０３は、算出された特徴パラメータを用いて測定用試料に含まれる細胞（粒子）の種類を弁別し、その結果を出力部４００に出力させる。なお、撮像制御部２０４は必要な細胞（粒子）画像をカメラ１２１に撮像させ、画像データ格納部２０５に画像データを格納させると共に、画像を出力部４００に出力させる。
癌・異型細胞は、検体中に白血球凝集塊、正常扁平上皮細胞、および正常扁平上皮細胞凝集塊などと混在する。従って、その中から癌・異型細胞を弁別するためには、凝集塊から単一細胞を弁別することが必要条件となる。
そこで、この発明によるその弁別能を模擬的に調べるため、細胞の代わりに人工粒子、つまりビーズを用いて測定を行った。
図１１に示す手順に従い、まず、粒径９μｍの単一ビーズ（ラテックス粒子）約１２０００個をレットシース液（シスメックス（株）製）に懸濁させ、測定試料（１）を調製した。続いて、若干の自然凝集を生じている粒径５μｍの単一ビーズ（ラテックス粒子）約１２０００個をレットシース液（シスメックス（株）製）に懸濁させ、測定試料（２）を調製した（ステップＳ１）。そして、各測定試料をフローサイトメータで測定した（ステップ２）。
そこで、この発明によるその弁別能を模擬的に調べるため、細胞の代わりに人工粒子、つまりビーズを用いて測定を行った。
図１１に示す手順に従い、まず、粒径９μｍの単一ビーズ（ラテックス粒子）約１２０００個をレットシース液（シスメックス（株）製）に懸濁させ、測定試料（１）を調製した。続いて、若干の自然凝集を生じている粒径５μｍの単一ビーズ（ラテックス粒子）約１２０００個をレットシース液（シスメックス（株）製）に懸濁させ、測定試料（２）を調製した（ステップＳ１）。そして、各測定試料をフローサイトメータで測定した（ステップ２）。
次に、図１１のステップＳ３に示すように、前方散乱光による信号波形のとり込みを行い、同時にカメラ１２１（図１）による撮像を行った。ここで、各粒子に対応する信号波形は、撮像された粒子画像と対応付けられて記憶される。
ステップＳ４において、前述の１０種類の特徴パラメータを算出した。ここで、特徴パラメータは、撮像された画像と対応付けられて記憶される。各粒子の特徴パラメータは、各粒子の撮像画像と対応付けて記憶されているので、弁別する対象粒子を画像データ格納部２０４に記憶された撮像画像から選択し、選択された撮像画像に対応する特徴パラメータとしきい値を比較することによって、特徴パラメータによる弁別能が分かる。
そして、しきい値を適当に設定し撮像画像と比較した結果、特徴パラメータＢ（差分積分値÷ピーク値）、又はＭ（正規化２次モーメント）を用いると、ビーズ凝集（粒子凝集）から単一ビーズ（単一粒子）が比較的良好に弁別できることが確認された。
撮像された画像から５μｍビーズのビーズ凝集を選択し、選択された画像に対応する特徴パラメータＢとしきい値を比較した。しきい値は、ビーズ凝集と単一ビーズを良好に弁別できる値を設定し、しきい値２．２以上のものをビーズ凝集とし、しきい値２．２未満のものを単一ビーズとして、判定するようにした。その結果、撮像画像にて確認した５μｍビーズのビーズ凝集に対して１１．４％がしきい値２．２未満ものであり、単一ビーズとして判定された。また、撮像された画像から９μｍビーズの単一ビーズを選択し、選択された画像に対応する特徴パラメータＢとしきい値を比較した。しきい値は、ビーズ凝集と単一ビーズを良好に弁別できる値を設定し、しきい値２．２以上のものをビーズ凝集とし、しきい値２．２未満のものを単一ビーズとして、判定するようにした。その結果、撮像画像で確認した９μｍ単一ビーズに対して９７．１％がしきい値２．２未満ものであり、単一ビーズとして判定された。従って、結果的に８５．７％の精度（図１６において(２)の％値が大きく、(１)の％値が小さいほど弁別能が良いことになるので(２)−(１)の値を便宜的に「精度」と定義した。以下同様。）で単一ビーズが弁別されることが分かる。そのデータを図１６に示す。
ステップＳ４において、前述の１０種類の特徴パラメータを算出した。ここで、特徴パラメータは、撮像された画像と対応付けられて記憶される。各粒子の特徴パラメータは、各粒子の撮像画像と対応付けて記憶されているので、弁別する対象粒子を画像データ格納部２０４に記憶された撮像画像から選択し、選択された撮像画像に対応する特徴パラメータとしきい値を比較することによって、特徴パラメータによる弁別能が分かる。
そして、しきい値を適当に設定し撮像画像と比較した結果、特徴パラメータＢ（差分積分値÷ピーク値）、又はＭ（正規化２次モーメント）を用いると、ビーズ凝集（粒子凝集）から単一ビーズ（単一粒子）が比較的良好に弁別できることが確認された。
撮像された画像から５μｍビーズのビーズ凝集を選択し、選択された画像に対応する特徴パラメータＢとしきい値を比較した。しきい値は、ビーズ凝集と単一ビーズを良好に弁別できる値を設定し、しきい値２．２以上のものをビーズ凝集とし、しきい値２．２未満のものを単一ビーズとして、判定するようにした。その結果、撮像画像にて確認した５μｍビーズのビーズ凝集に対して１１．４％がしきい値２．２未満ものであり、単一ビーズとして判定された。また、撮像された画像から９μｍビーズの単一ビーズを選択し、選択された画像に対応する特徴パラメータＢとしきい値を比較した。しきい値は、ビーズ凝集と単一ビーズを良好に弁別できる値を設定し、しきい値２．２以上のものをビーズ凝集とし、しきい値２．２未満のものを単一ビーズとして、判定するようにした。その結果、撮像画像で確認した９μｍ単一ビーズに対して９７．１％がしきい値２．２未満ものであり、単一ビーズとして判定された。従って、結果的に８５．７％の精度（図１６において(２)の％値が大きく、(１)の％値が小さいほど弁別能が良いことになるので(２)−(１)の値を便宜的に「精度」と定義した。以下同様。）で単一ビーズが弁別されることが分かる。そのデータを図１６に示す。
また、特徴パラメータＭを用いた場合、しきい値２１００以上のものをビーズ凝集とし、しきい値２１００未満のものを単一ビーズとして、判定するようにした。その結果、撮像画像にて確認した５μｍビーズのビーズ凝集に対して２．９％がしきい値２１００未満ものであり、単一ビーズとして判定された。また、撮像画像にて確認した９μｍビーズの単一ビーズに対して９９．７％がしきい値２１００未満ものであり、単一ビーズとして判定された。従って、結果的に９６．８％の精度で単一ビーズが弁別されることが分かる。
なお、９μｍ単一ビーズと５μｍビーズの凝集の各撮像画像例を図１２と図１３に示す。
なお、９μｍ単一ビーズと５μｍビーズの凝集の各撮像画像例を図１２と図１３に示す。
次に、臨床検体として子宮頸部細胞を用いて測定した場合について説明する。
まず、図１１のステップＳ１に示すように、次の要領で測定試料を調製した。
保存液PreservCyt（Cytyc）中に保存した臨床検体（約２ｘ１０5細胞／tube）を 10,000rpmの回転速度で１分間、遠心処理し、得られたペレットに１０％ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン PBS溶液を添加後、再度10,000rpmの回転速度で１分間、遠心処理し、粘液除去したペレットを得た。
このペレットに、Zamboni固定溶液（０．２％ 2,4,6−トリニトロフェノール, ２％ パラホルムアルデヒド） を添加し、１０分間の反応後、10,000rpmの回転速度で１分間、遠心後、上清を捨て、酵素反応液（０．２％コラゲナーゼ タイプＩ、０．２％コラゲナーゼ タイプII、０．１％プロテアーゼ(SIGMA) 含有PBS）を添加し、３７℃で２分３０秒間反応させた。反応後、氷上で冷やした１％ プロテアーゼインヒビター（SIGMA）PBS溶液を添加し、10,000rpmの回転速度で１分間、遠心後、上清を捨て、細胞分散処理されたペレットを調製した。
さらに、PBST（0.05％ Tween ２０入りPBS）を 添加して懸濁し、メッシュ径１００μｍのフィルターを通すことにより細胞凝集物を除去した後、10,000rpmの回転速度で１分間、遠心し、上清を捨て、レットシース液（シスメックス（株））を添加して再懸濁し、測定用試料を調製した。そして、測定試料をフローサイトメータで測定した（ステップ２）。
まず、図１１のステップＳ１に示すように、次の要領で測定試料を調製した。
保存液PreservCyt（Cytyc）中に保存した臨床検体（約２ｘ１０5細胞／tube）を 10,000rpmの回転速度で１分間、遠心処理し、得られたペレットに１０％ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン PBS溶液を添加後、再度10,000rpmの回転速度で１分間、遠心処理し、粘液除去したペレットを得た。
このペレットに、Zamboni固定溶液（０．２％ 2,4,6−トリニトロフェノール, ２％ パラホルムアルデヒド） を添加し、１０分間の反応後、10,000rpmの回転速度で１分間、遠心後、上清を捨て、酵素反応液（０．２％コラゲナーゼ タイプＩ、０．２％コラゲナーゼ タイプII、０．１％プロテアーゼ(SIGMA) 含有PBS）を添加し、３７℃で２分３０秒間反応させた。反応後、氷上で冷やした１％ プロテアーゼインヒビター（SIGMA）PBS溶液を添加し、10,000rpmの回転速度で１分間、遠心後、上清を捨て、細胞分散処理されたペレットを調製した。
さらに、PBST（0.05％ Tween ２０入りPBS）を 添加して懸濁し、メッシュ径１００μｍのフィルターを通すことにより細胞凝集物を除去した後、10,000rpmの回転速度で１分間、遠心し、上清を捨て、レットシース液（シスメックス（株））を添加して再懸濁し、測定用試料を調製した。そして、測定試料をフローサイトメータで測定した（ステップ２）。
次に、図１１のステップＳ３に示すように、前方散乱光と側方散乱光による信号波形のとり込みを行い、同時にカメラ１２１（図１）による撮像を行った。
まず、撮像した画像の形態的特徴から、測定された白血球凝集塊、扁平上皮細胞、扁平上皮細胞凝集塊および異型細胞を確認して分類し、それぞれの数Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ4を計数した。異型細胞と扁平上皮細胞の画像例を図１４と図１５に示す。
まず、撮像した画像の形態的特徴から、測定された白血球凝集塊、扁平上皮細胞、扁平上皮細胞凝集塊および異型細胞を確認して分類し、それぞれの数Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ4を計数した。異型細胞と扁平上皮細胞の画像例を図１４と図１５に示す。
次に、図１１のステップＳ４において表１に示す前方散乱光と側方散乱光による特徴パラメータの算出を行い、ステップＳ５において表１に示す全ての特徴パラメータとしきい値を順に比較した。まず、撮像画像にて確認した白血球凝集塊を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを白血球凝集塊とし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを白血球凝集塊とし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないもの（白血球凝集塊）とし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ1とし、ｎ1／Ｎ1×１００を算出した。
次に、撮像画像にて確認した扁平上皮細胞を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを扁平上皮細胞とし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを扁平上皮細胞とし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないもの（扁平上皮細胞）とし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ2とし、ｎ2／Ｎ2×１００を算出した。
次に、撮像画像にて確認した扁平上皮細胞凝集を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを扁平上皮細胞凝集とし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを扁平上皮細胞凝集とし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないもの（扁平上皮細胞凝集）とし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ3とし、ｎ3／Ｎ3×１００を算出した。
次に、撮像画像にて確認した異型細胞を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを異型細胞でないものとし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを異型細胞でないものとし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないものとし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ4とし、ｎ4／Ｎ4×１００を算出した。
次に、撮像画像にて確認した扁平上皮細胞を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを扁平上皮細胞とし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを扁平上皮細胞とし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないもの（扁平上皮細胞）とし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ2とし、ｎ2／Ｎ2×１００を算出した。
次に、撮像画像にて確認した扁平上皮細胞凝集を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを扁平上皮細胞凝集とし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを扁平上皮細胞凝集とし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないもの（扁平上皮細胞凝集）とし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ3とし、ｎ3／Ｎ3×１００を算出した。
次に、撮像画像にて確認した異型細胞を選択し、選択された画像に対して特徴パラメータＭとしきい値を比較した。しきい値２０，０００以上のものを異型細胞でないものとし、しきい値２０，０００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。次に、しきい値２０，０００未満のものであり、異型細胞として判定されたものに対して、特徴パラメータＷｉｄｔｈにおいて、しきい値１，２００以上のものを異型細胞でないものとし、しきい値１，２００未満のものを異型細胞として、判定するようにした。このように、順番にひとつの特徴パラメータにおいてしきい値以上又は未満の細胞を異型細胞でないものとし、表１の全ての特徴パラメータとしきい値の比較が終わった段階で異型細胞でないと判定されなかったものを異型細胞として、計数された個数をｎ4とし、ｎ4／Ｎ4×１００を算出した。
その結果を図１７に示す。つまり、白血球凝集塊に対し８．５％、扁平上皮細胞に対し２．８％、扁平上皮細胞凝集に対し０．９％が異型細胞として判定され、これらの平均が４．１％となり、異型細胞に対し７８．８％が異型細胞として判定され、平均との差が７４．７％となるので、異型細胞が効率よく弁別されることが分かる。
第２実施例の測定時に得られた前方散乱光による信号波形から、前述の１０種類の特徴パラメータを算出し、その各特徴パラメータの、
（イ）異型細胞と白血球凝集塊、
（ロ）異型細胞と扁平上皮細胞、
（ハ）異型細胞と扁平上皮細胞凝集塊、
についての弁別能を調べた。なお、弁別するしきい値は最適値に設定した。
（イ）異型細胞と白血球凝集塊、
（ロ）異型細胞と扁平上皮細胞、
（ハ）異型細胞と扁平上皮細胞凝集塊、
についての弁別能を調べた。なお、弁別するしきい値は最適値に設定した。
その結果、各細胞の残存率から得られた比較的弁別能の高い特徴パラメータをそれぞれ図１８、１９、２０に示す。
つまり、前記（イ）の弁別に適した単一の特徴パラメータとしては、図１８に示すようにＢ（差分積分値÷ピーク値）、Ｍ（正規化２次モーメント）又はＪ（波打ち度合い）であり、前記（ロ）の弁別に適した単一の特徴パラメータとしては、図１９に示すようにWidth（幅）、ＨＷ（半値幅）、Ｂ（差分積分値÷ピーク値）、Ｍ（正規化２次モーメント）又はＪ（波打ち度合い）であり、前記（ハ）の弁別に適した単一の特徴パラメータとしては、図２０に示すようにWidth（幅）、ＨＷ（半値幅）、Area（面積）、Ｂ（差分積分値÷ピーク値）、Ｍ（正規化２次モーメント）又はＪ（波打ち度合い）であることが分かる。
つまり、前記（イ）の弁別に適した単一の特徴パラメータとしては、図１８に示すようにＢ（差分積分値÷ピーク値）、Ｍ（正規化２次モーメント）又はＪ（波打ち度合い）であり、前記（ロ）の弁別に適した単一の特徴パラメータとしては、図１９に示すようにWidth（幅）、ＨＷ（半値幅）、Ｂ（差分積分値÷ピーク値）、Ｍ（正規化２次モーメント）又はＪ（波打ち度合い）であり、前記（ハ）の弁別に適した単一の特徴パラメータとしては、図２０に示すようにWidth（幅）、ＨＷ（半値幅）、Area（面積）、Ｂ（差分積分値÷ピーク値）、Ｍ（正規化２次モーメント）又はＪ（波打ち度合い）であることが分かる。
Claims (8)
- 複数の子宮頸部細胞をフローサイトメータにて計測し、個々の細胞について散乱光信号を取得し、各散乱光信号の波形を解析することにより、前記波形の幅、半値幅、面積、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれか２つ以上の特徴パラメータを算出し、その特徴パラメータを組合わせて用いて前記複数の子宮頸部細胞から癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞凝集塊とを弁別する方法。
- 前記弁別する工程はさらに、癌・異型細胞と白血球凝集塊とを弁別する、請求項１記載の方法。
- 前記特徴パラメータは、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合のうちのいずれかである請求項２記載の方法。
- 前記弁別する工程はさらに、癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞とを弁別する、請求項１記載の方法。
- 前記特徴パラメータは、幅、半値幅、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合のうちのいずれかである請求項４記載の方法。
- 子宮頸部細胞を含む試料流を形成するためのフローセルと、
フローセル中の前記試料流に光を照射するための光源と、
前記試料流からの細胞の散乱光を検出して散乱光信号を出力する検出部と、
出力された前記散乱光信号の波形を解析することにより、前記波形の幅、半値幅、面積、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれか２つ以上の特徴パラメータを算出する波形解析部と、
算出された前記特徴パラメータを組合わせて用いて前記子宮頸部細胞から癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞凝集塊とを弁別するための制御部と、を備えた細胞分析装置。 - 前記特徴パラメータは、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれかであり、前記制御部は、前記特徴パラメータに基づいて、癌・異型細胞と白血球凝集塊とを弁別する請求項６記載の細胞分析装置。
- 前記特徴パラメータは、幅、半値幅、差分積分値／ピーク値、正規化２次モーメントおよび波打ち度合いのうちのいずれかであり、前記制御部は、前記特徴パラメータに基づいて、癌・異型細胞と正常扁平上皮細胞を弁別する請求項６記載の細胞分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007510369A JP4921356B2 (ja) | 2005-03-29 | 2006-03-14 | 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005095238 | 2005-03-29 | ||
| JP2005095238 | 2005-03-29 | ||
| JP2007510369A JP4921356B2 (ja) | 2005-03-29 | 2006-03-14 | 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 |
| PCT/JP2006/305012 WO2006103920A1 (ja) | 2005-03-29 | 2006-03-14 | 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2006103920A1 JPWO2006103920A1 (ja) | 2008-09-04 |
| JP4921356B2 true JP4921356B2 (ja) | 2012-04-25 |
Family
ID=37053183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007510369A Expired - Fee Related JP4921356B2 (ja) | 2005-03-29 | 2006-03-14 | 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080108103A1 (ja) |
| EP (1) | EP1865303A1 (ja) |
| JP (1) | JP4921356B2 (ja) |
| CN (1) | CN101151517A (ja) |
| WO (1) | WO2006103920A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015121443A (ja) * | 2013-12-20 | 2015-07-02 | アズビル株式会社 | 粒子検出装置及び粒子の検出方法 |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5259305B2 (ja) * | 2007-10-03 | 2013-08-07 | シスメックス株式会社 | 細胞分析装置及び細胞分析方法 |
| JP5378228B2 (ja) * | 2007-10-29 | 2013-12-25 | シスメックス株式会社 | 細胞分析装置及び細胞分析方法 |
| JP5399647B2 (ja) * | 2008-03-28 | 2014-01-29 | シスメックス株式会社 | 試料分析装置及びコンピュータプログラム |
| CN101983328B (zh) | 2008-03-31 | 2013-04-24 | 希森美康株式会社 | 细胞处理装置、制样装置及细胞分析装置 |
| WO2009121212A1 (zh) * | 2008-04-03 | 2009-10-08 | 西门子公司 | 一种微生物细胞形态的检测系统和方法 |
| JP5502655B2 (ja) | 2009-09-30 | 2014-05-28 | シスメックス株式会社 | 試料調製装置、細胞分析装置及び分析物の濃縮方法 |
| JP2011095181A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Sysmex Corp | 粒子分析装置 |
| JP2011095182A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Sysmex Corp | 細胞分析装置及び細胞分析方法 |
| JP5537347B2 (ja) * | 2009-11-30 | 2014-07-02 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| JP5816416B2 (ja) * | 2010-04-23 | 2015-11-18 | 国立大学法人名古屋大学 | 細胞評価装置、インキュベータ、プログラム、および、培養方法 |
| FR2971337B1 (fr) * | 2011-02-04 | 2013-03-01 | Horiba Abx Sas | Dispositif et procede de mesures multiparametriques de microparticules dans un fluide |
| EP2705349A4 (en) * | 2011-05-05 | 2015-01-28 | Emd Millipore Corp | APPARATUS AND METHOD FOR INCREASING FLOW CYTOMETRY COLLECTION YIELD BASED ON CAPILLARIES |
| JP5822534B2 (ja) * | 2011-05-13 | 2015-11-24 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 自動分析装置 |
| EP2725341A4 (en) * | 2011-06-27 | 2015-02-25 | Sysmex Corp | CELL ANALYZER |
| KR20160103175A (ko) * | 2011-07-19 | 2016-08-31 | 오비지오 이미징 시스템스 엔.브이. | 세포 샘플에서의 암 세포들의 검출 및/또는 분류를 위한 방법 및 시스템 |
| JP2013024629A (ja) * | 2011-07-19 | 2013-02-04 | Sysmex Corp | フローサイトメータ |
| JP5138801B2 (ja) * | 2011-07-22 | 2013-02-06 | シスメックス株式会社 | 癌化情報提供方法および装置 |
| US9176055B2 (en) * | 2012-01-04 | 2015-11-03 | Sony Corporation | System and method for measuring narrow and wide angle light scatter on a high-speed cell sorting device |
| JP5970223B2 (ja) | 2012-03-30 | 2016-08-17 | シスメックス株式会社 | 癌化情報提供方法および癌化情報提供装置 |
| JP5876359B2 (ja) | 2012-03-30 | 2016-03-02 | シスメックス株式会社 | 癌化情報提供方法および癌化情報提供装置 |
| JP5959988B2 (ja) | 2012-08-16 | 2016-08-02 | シスメックス株式会社 | 癌化情報取得装置、細胞分析装置、および細胞採取適否判定装置、ならびに、癌化情報取得方法および細胞採取適否判定方法。 |
| CN104755603B (zh) | 2012-09-28 | 2018-01-02 | 希森美康株式会社 | 试样调制装置 |
| JP5920830B2 (ja) | 2012-09-28 | 2016-05-18 | シスメックス株式会社 | 試料調製装置および細胞分析装置 |
| JP5699118B2 (ja) * | 2012-11-14 | 2015-04-08 | シスメックス株式会社 | 細胞分析装置、癌化情報提供方法、ｄｎａ量ヒストグラムの作成方法および検査方法 |
| JP5892967B2 (ja) | 2013-03-29 | 2016-03-23 | シスメックス株式会社 | 細胞分析装置、細胞測定装置の管理方法およびコンピュータプログラム |
| JP6100658B2 (ja) * | 2013-03-29 | 2017-03-22 | シスメックス株式会社 | 血球分析装置および血球分析方法 |
| JP6165574B2 (ja) | 2013-09-26 | 2017-07-19 | シスメックス株式会社 | フィルタ部材および細胞取得方法 |
| JP6092132B2 (ja) * | 2014-01-29 | 2017-03-08 | シスメックス株式会社 | 血球分析装置 |
| EP3177908B1 (en) * | 2014-08-06 | 2019-04-17 | Beckman Coulter Inc. | Evaluation of multi-peak events using a flow cytometer |
| JP6238856B2 (ja) | 2014-08-25 | 2017-11-29 | シスメックス株式会社 | 尿中異型細胞の分析方法、尿分析装置および体液中異型細胞の分析方法 |
| EP3259574B1 (en) * | 2015-02-18 | 2024-03-27 | Becton, Dickinson and Company | Optical detection systems and methods of using the same |
| JP6544600B2 (ja) | 2015-02-24 | 2019-07-17 | 国立大学法人 東京大学 | 動的高速高感度イメージング装置及びイメージング方法 |
| US20180058987A1 (en) * | 2015-03-23 | 2018-03-01 | New York University | Systems and methods for selecting cellular strains |
| JP6790490B2 (ja) | 2015-09-18 | 2020-11-25 | ソニー株式会社 | 情報処理装置、情報処理方法及び情報処理システム |
| CN114062231B (zh) | 2015-10-28 | 2024-09-10 | 国立大学法人东京大学 | 分析装置 |
| JP6286455B2 (ja) * | 2016-01-20 | 2018-02-28 | シスメックス株式会社 | 細胞分析方法、癌化情報提供方法、細胞分析装置および癌化情報提供装置 |
| JP6784507B2 (ja) | 2016-04-26 | 2020-11-11 | 日本光電工業株式会社 | がん診断装置、がん診断方法、及びプログラム |
| US10337975B2 (en) | 2016-05-06 | 2019-07-02 | Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin | Method and system for characterizing particles using a flow cytometer |
| EP3244191B1 (en) | 2016-05-06 | 2024-10-30 | Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin | Method and system for characterizing particles using a flow cytometer |
| EP4306931A3 (en) | 2018-06-13 | 2024-02-07 | ThinkCyte K.K. | Methods and systems for cytometry |
| EP3933376A1 (en) | 2020-07-02 | 2022-01-05 | Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin | Method and system for characterizing particles using an angular detection in a flow cytometer |
| JPWO2022239596A1 (ja) * | 2021-05-11 | 2022-11-17 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10253624A (ja) * | 1997-03-13 | 1998-09-25 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子測定装置 |
| JP3290786B2 (ja) * | 1993-11-26 | 2002-06-10 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| JP2002188993A (ja) * | 2000-12-21 | 2002-07-05 | Sysmex Corp | 粒子分析装置 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5710437A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-20 | Toa Medical Electronics Co Ltd | Particle analyzer |
| JP3375203B2 (ja) * | 1994-08-08 | 2003-02-10 | シスメックス株式会社 | 細胞分析装置 |
| JP3347495B2 (ja) * | 1994-11-14 | 2002-11-20 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| JP2001281132A (ja) * | 2000-03-30 | 2001-10-10 | Sysmex Corp | フローサイトメータ |
| JP2001330550A (ja) * | 2000-05-19 | 2001-11-30 | Sysmex Corp | パルス信号計測回路およびそれを用いたフローサイトメータ |
| JP2001345647A (ja) * | 2000-06-05 | 2001-12-14 | Sysmex Corp | 光電変換素子用アンプとそれを用いたフローサイトメータ |
| JP2002195932A (ja) * | 2000-12-22 | 2002-07-10 | Sysmex Corp | フローサイトメータ |
| EP1245944B1 (en) * | 2001-03-29 | 2007-02-14 | Sysmex Corporation | Flow cytometer |
| CA2442879A1 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Molecular Diagnostics, Inc. | Detection of abnormal cells |
-
2006
- 2006-03-14 WO PCT/JP2006/305012 patent/WO2006103920A1/ja active Application Filing
- 2006-03-14 CN CNA2006800098450A patent/CN101151517A/zh active Pending
- 2006-03-14 JP JP2007510369A patent/JP4921356B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-14 EP EP06729046A patent/EP1865303A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-09-28 US US11/906,083 patent/US20080108103A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3290786B2 (ja) * | 1993-11-26 | 2002-06-10 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
| JPH10253624A (ja) * | 1997-03-13 | 1998-09-25 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子測定装置 |
| JP2002188993A (ja) * | 2000-12-21 | 2002-07-05 | Sysmex Corp | 粒子分析装置 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015121443A (ja) * | 2013-12-20 | 2015-07-02 | アズビル株式会社 | 粒子検出装置及び粒子の検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2006103920A1 (ja) | 2008-09-04 |
| WO2006103920A1 (ja) | 2006-10-05 |
| EP1865303A1 (en) | 2007-12-12 |
| CN101151517A (zh) | 2008-03-26 |
| US20080108103A1 (en) | 2008-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4921356B2 (ja) | 癌・異型細胞および凝集粒子を弁別する方法および細胞分析装置 | |
| JP4982385B2 (ja) | イメージングフローサイトメータを使用した血液及び細胞の分析 | |
| US7634125B2 (en) | Blood and cell analysis using an imaging flow cytometer | |
| US8660332B2 (en) | Blood and cell analysis using an imaging flow cytometer | |
| JP4359389B2 (ja) | 白血球百分率及び網状赤血球計数の決定 | |
| JP5058171B2 (ja) | 血小板の測定を実施するための方法および装置 | |
| JP2941041B2 (ja) | フローサイトメトリーによる白血球の分類方法 | |
| US20080262384A1 (en) | Method and Devices for Screening Cervical Cancer | |
| US20050221399A1 (en) | Method for screening cervical cancer | |
| JPS61195358A (ja) | 血球の副細胞集団の分析法 | |
| JP2005315862A (ja) | 子宮頸癌のスクリーニング方法及び子宮頸癌診断薬 | |
| US6118522A (en) | Apparatus and method for differentiating erythrocytes in urine | |
| US9354161B2 (en) | Sample analyzing method and sample analyzer | |
| JP2010085194A (ja) | 試料分析装置 | |
| Bakke | The principles of flow cytometry | |
| US20220317020A1 (en) | Flow cytometer performance evaluation method and standard particle suspension | |
| JPS60107565A (ja) | 赤血球異常のスクリ−ニング方法 | |
| Camacho et al. | Characterization of extracellular vesicles by flow cytometry | |
| Jeffery | Flow Cytometry | |
| Neukammer et al. | Concept for the traceability of fluorescence (beads) in flow cytometry: exploiting saturation and microscopic single molecule bleaching | |
| WO2022132985A1 (en) | Threshold gating for flow cytometry methods | |
| Yun et al. | Fluorescence-intensity multiplexing using fluorescent silica nanoparticles in a sheathless microchip flow cytometer | |
| CN114813515A (zh) | 一种微粒子分析方法 | |
| Tárnok et al. | Immunophenotyping using a laser scanning cytometer | |
| Van Pham | Flow Cytometry Data Analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090303 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090303 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110524 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110721 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120110 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120202 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150210 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |