ES2289985T3

ES2289985T3 - Derivados de eritropoyetina.

Info

Publication number: ES2289985T3
Application number: ES00113115T
Authority: ES
Inventors: Pascal Sebastian Bailon
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2020-06-28
Also published as: CZ299516B6; KR20010049676A; AR055650A2; PT1064951E; PA8497801A1; GB0400086D0; EP1064951A2; RS49928B; MY128500A; NO20003372D0; CZ20002386A3; DE122007000064I1; CY1107719T1; NO327043B1; NL300289I9; HU226233B1; ATE370748T1; MA26746A1; BG65449B1; LU91363I2

Abstract

Un conjugado de eritropoyetina, dicho conjugado comprende una glucoproteína, la eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presenten la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la fórmula -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR con el -CO de cada grupo de poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m se encuentra entre 450 y 900; n se encuentra entre 1 y 3; y n y m se eligen de modo que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons.

Description

Derivados de eritropoyetina.

Antecedentes de la invención

La eritropoyesis es la producción de glóbulos rojos, que se produce con el objetivo de contrarrestar la destrucción celular. La eritropoyesis es un mecanismo fisiológico controlado, que proporciona los suficientes glóbulos rojos necesarios para una oxigenación tisular adecuada. La eritropoyetina humana producida de forma natural (hEPO), se produce en el riñón y es el factor plasmático humoral que estimula la producción de glóbulos rojos (Carnot, P and Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak, LF (1957) Nature 179: 6331-4). La EPO que se produce de forma natural estimula la división y diferenciación de los progenitores eritrocíticos específicos en la médula ósea y ejerce su actividad biológica mediante la unión a receptores en los precursores eritrocíticos (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419).

La eritropoyetina se ha producido biosintéticamente mediante el uso de la tecnología del DNA recombinante (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224) y es el producto del gen EPO humano clonado, insertado y expresado en células de tejido de ovario de hámster chino (células CHO). La estructura primaria de la forma completamente procesada y predominante de hEPO se ilustra en SEQ ID NO:1. Hay dos puentes disulfuro entre Cys^{7}-Cys^{161} y Cys^{29}-Cys^{33}. El peso molecular de la cadena polipeptídica de EPO sin las porciones de los azúcares es 18.236 Da. En la molécula intacta de EPO, aproximadamente el 40% del peso molecular viene dado por los grupos de carbohidrato que glicosilan la proteína en los sitios de glicosilación de la proteína (Sasaki, H. Bothner, B, Dell, A and Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).

Debido a que la eritropoyetina humana es esencial en la formación de glóbulos rojos, la hormona es útil en el tratamiento de los trastornos sanguíneos caracterizados por la baja o defectiva producción de glóbulos rojos. Clínicamente, la EPO es utilizada en el tratamiento de la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF) (Eschbach, JEW, Egri, JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, JEW, Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T. Adamson, JEW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) y en pacientes con SIDA y cáncer que han sido tratados con quimioterapia (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI In: MB, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p. 301-324). Sin embargo, la disponibilidad biológica de agentes terapéuticos basados en proteínas disponibles comercialmente tales como EPO, se encuentra limitada por su corta vida media en el plasma y por su susceptibilidad a la degradación por parte de proteasas. Estos defectos impiden que se pueda alcanzar una potencia clínica máxima.

La WO 99/11781 describe polipéptidos que tienen parte o todo de la conformación estructural primaria y propiedad biológica de la eritropoyetina y con una vida media in vivo mejorada y actividad bilógica debido a un perfil de glicosilación modificado.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona un conjugado de eritropoyetina, dicho conjugado comprende una glucoproteína, la eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la fórmula -CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR, con el -CO (por ejemplo carbonilo) de cada grupo de poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde R es alquilo C_{1}-C_{6}; x es 2 ó 3; m se encuentra entre alrededor de 450 y alrededor de 900; n se encuentra entre 1 y 3; y n y m se eligen de modo que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons. Esta invención también proporciona composiciones que contienen conjugados descritos aquí en las cuales el porcentaje de conjugados en la composición en la que n es 1 es al menos del noventa por ciento.

Si se comparan con las EPO no modificadas (es decir, EPO sin un PEG unido) y con los conjugados EPO-PEG convencionales, los presentes conjugados tienen tanto una vida media de circulación como un tiempo de residencia en el plasma mayores, un menor aclaramiento, y una mayor actividad clínica in vivo. Los conjugados de esta invención presentan los mismos usos que EPO. En concreto, los conjugados de esta invención son útiles para tratar pacientes mediante la estimulación de la división y diferenciación de los progenitores eritrocíticos específicos en la médula ósea por la misma vía por la que se utiliza EPO para el tratamiento de los pacientes.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona conjugados, dichos conjugados comprenden una glucoproteína, la eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presenten la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la fórmula -CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR, con el -CO (es decir, carbonilo) de cada grupo de poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m se encuentra entre alrededor de 450 y alrededor de 900; n se encuentra entre 1 y 3; y n y m se eligen de modo que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons.

Se ha descubierto que los conjugados de esta invención se pueden usar del mismo modo que la EPO no modificada. Sin embargo, los conjugados de esta invención presentan tanto una vida media de circulación como tiempo de residencia en el plasma mayores, una menor aclaramiento y una mayor actividad clínica in vivo. Debido a la mejora de estas propiedades, los conjugados de esta invención se pueden administrar una vez a la semana, en lugar de administrar tres veces a la semana la EPO no modificada. Se espera que esta menor frecuencia de administración dé como resultado un mejor cumplimiento del paciente lo cual mejore los resultados del tratamiento, así como la calidad de vida del paciente. Si se comparan con los conjugados convencionales de EPO unidos a poli(etilen glicol), se ha descubierto que los conjugados que presentan un peso molecular y una estructura de unión de los conjugados de esta invención tienen una potencia, estabilidad, ABC y vida media en circulación mejorados y un perfil de coste
menor.

Los conjugados de acuerdo con esta invención, se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva a pacientes del mismo modo en que se administra EPO. La cantidad terapéuticamente efectiva es la cantidad de conjugado necesaria para dar la actividad biológica in vivo que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos. La cantidad exacta de conjugado es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de trastorno a tratar, el estado del paciente a tratar, así como otros ingredientes en la composición. Por ejemplo, entre 0,01 y 10 \mug por kg de peso corporal, preferiblemente entre 0,1 y 1 \mug por kg de peso corporal, se pueden administrar por ejemplo una vez a la semana.

Las composiciones farmacéuticas que contienen el conjugado se pueden formular con una potencia efectiva para la administración por varios medios a un paciente humano que experimente trastornos sanguíneos caracterizados por la baja o defectiva producción de glóbulos rojos. La media de las cantidades efectivas terapéuticamente del conjugado pueden variar y en concreto deben estar basadas en las recomendaciones y prescripción de un médico cuali-
ficado.

Los productos de la glucoproteína eritropoyetina preparados de acuerdo con esta invención, se pueden preparar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable mediante métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, se han descrito composiciones adecuadas en W097/09996, W097/40850, W098/58660, y WO99/07401. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables preferidos para la formulación de los productos de la invención se encuentran la albúmina de suero humano, proteínas de plasma humano, etc. Los compuestos de la presente invención se podrían formular en tampón de fosfato de sodio/potasio 10 mM a pH 7 que contiene un agente de tonicidad, por ejemplo cloruro de sodio 132 mM. De forma opcional la composición farmacéutica puede contener un conservante. La composición farmacéutica puede contener diferentes cantidades de eritropoyetina, por ejemplo 10-1000 \mug/ml, por ejemplo 50 \mug or 400 \mug.

El término "eritropoyetina" o "EPO" se refiere a una glucoproteína que presenta la secuencia aminoacídica expuesta en (SEQ ID NO: 1) ó (SEQ ID NO: 2) o una secuencia aminoacídica substancialmente homóloga a las mismas, cuyas propiedades biológicas se refieren a la estimulación de la producción de glóbulos rojos y a la estimulación de la división y diferenciación de los progenitores eritrocíticos específicos en la médula ósea. Tal como se emplean aquí, estos términos incluyen dichas proteínas modificadas de forma deliberada, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida o de forma accidental, por mutaciones. Estos términos también incluyen análogos que presentan entre 1 y 6 sitios adicionales para la glicosilación, análogos que presentan al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo de la glucoproteína, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glicosilación y análogos que presentan una secuencia aminoacídica que incluye una nueva disposición de al menos un sitio para la glicosilación. Estos términos incluyen tanto la eritropoyetina humana producida de forma natural como la producida de forma recombinante.

Los conjugados de eritropoyetina de esta invención se pueden representan mediante la Fórmula 1:

(I)P-[NHCO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]_{n}

en donde x, m, n y R son tal como se han descrito anteriormente. En la Fórmula I, P es el residuo de la glucoproteína eritropoyetina descrita aquí (es decir, sin el grupo o grupos amino que forman un enlace amida con el carbonilo mostrado en la Fórmula I), con una actividad biológica in vivo que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos.

En una realización preferida de la presente invención, R es metilo. Preferiblemente, m se encuentra entre alrededor de 650 y alrededor de 750 y n preferiblemente es 1.

\newpage

En la realización más preferida de la presente invención, R es metilo, m se encuentra entre alreddor de 650 y alrededor de 750, y n es 1, es decir el conjugado es como se ha definido anteriormente con la fórmula

[CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CO-NH]_{n}-P

en donde m se encuentra entre 650 y 750, n es 1 y P es como se ha definido anteriormente. Preferiblemente m presenta un valor medio de alrededor de 680.

Preferiblemente, la glucoproteína de los conjugados como se ha definido anteriormente es una eritropoyetina humana. La eritropoyetina humana y proteínas análogas como se han definido anteriormente se pueden expresar mediante una activación génica endógena. Las glucoproteínas eritropoyetinas humanas preferidas son aquéllas que presentan la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, más preferiblemente las que presentan la SEQ ID NO:1.

Además P se puede seleccionar del grupo que consiste en residuos de eritropoyetina humana y análogos de la misma que contienen entre 1 y 6 sitios adicionales para la glicosilación. Tal como se expone en detalle a continuación, la preparación y purificación de EPO son bien conocidas en el campo. Mediante EPO se denota la proteína natural o recombinante, preferiblemente humana, así como la obtenida de cualquier fuente convencionales tales como tejidos, síntesis protéica, cultivo celular con células naturales o recombinantes. Se incluye cualquier proteína que presente actividad de EPO, tal como muteínas o proteínas modificadas de otra manera. La EPO recombinante se puede preparar mediante su expresión en líneas celulares CHO-, BHK- o HeLa mediante la tecnología del DNA recombiante o mediante activación génica endógena. La expresión de proteínas, incluyendo EPO, mediante activación génica endógena es bien conocida en el campo y se revela, por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.733.761, 5.641.670 y 5.733.746 y en la publicación de patente internacional Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955, cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia. Las especies de EPO preferidas para la preparación de productos de glucoproteína eritropoyetina son especies de EPO humanas. La especie EPO más preferida es la EPO humana que presenta la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO:2, más preferiblemente la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1.

En una realización, P puede ser el residuo de un análogo de glucoproteína que tiene entre 1 y 6 sitios adicionales para la glicosilación. La glicosilación de una proteína, con uno o más grupos de oligosacárido, se produce en localizaciones específicas a lo largo de la cadena polipeptídica y afecta en gran medida a las propiedades físicas de la proteína tales como estabilidad, secreción, localización subcelular y actividad biológica de la proteína. Normalmente la glicosilación es de dos tipos. Los oligosacáridos que presentan unión O se encuentran unidos a residuos de serina o de treonina y los que presentan unión N se encuentran unidos a residuos de asparagina. Un tipo de oligosacárido hallado tanto en oligosacáridos con unión N como con unión O es ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), el cual es una familia de amino azúcares que contienen 9 o más átomos de carbono. El ácido siálico normalmente es el residuo terminal tanto de oligosacáridos con unión N como con unión O y debido a que lleva carga negativa, confiere propiedades acídicas a la glucoproteína. La eritropoyetina humana, que tiene 165 aminoácidos, contiene tres cadenas de oligosacáridos N-unidos y una de oligosacárido con unión O, que comprenden alrededor del 40% del peso molecular total de la glucoproteína. La glicosilación con unión N se produce en los residuos de asparagina localizados en las posiciones 24, 38, y 83 y la glicosilación con unión O se produce en un residuo de serina localizado en la posición 126. Las cadenas de oligosacáridas se encuentran modificadas con residuos terminales de ácido siálico. La separación enzimática de todos los residuos de ácido siálico de la eritropoyetina glicosilada provoca la pérdida de actividad in vivo pero no de actividad in vitro porque la sialilación de la eritropoyetina evita su unión, y la posterior aclaramiento, por la proteína de unión hepática.

Las glucoproteínas de la presente invención incluyen análogos de la eritropoyetina humana con uno o más cambios en la secuencia aminoacídica de la eritropoyetina humana, que resultan en un incremento en el número de sitios de unión del ácido siálico. Estos análogos de glucoproteína se pueden generar por mutagénesis dirigida con adiciones, deleciones o sbstituciones de residuos aminoacídicos que incrementan o alteran sitios que están disponibles para la glicosilación. Los análogos de glucoproteína con mayores niveles de ácido siálico que los hallados en la eritropoyetina humana, se generan mediante la adición de sitios de glicosilación que no perturban la conformación secundaria o terciaria necesaria para la actividad biológica. Las glucoproteínas de la presente invención también incluyen análogos con mayores niveles de unión a carbohidrato en un sitio de glicosilación que normalmente involucra la substitución de uno o más aminoácidos cercanos a un sitio con unión N o con unión O. Las glucoproteínas de la presente invención también incluyen análogos que tienen uno o más aminoácidos que se prolongan a partir del extremo carboxilo de la eritropoyetina y que proporcionan al menos un sitio de unión a carbohidrato adicional. Las glucoproteínas de la presente invención también incluyen análogos que tienen una secuencia aminoacídica que incluye una nueva disposición de al menos un sitio para la glicosilación. Dicha nueva disposición del sitio de glicosilación involucra la deleción de uno o más sitios de glicosilación en la eritropoyetina humana y la adición de uno o más sitios de glicosilación que no se dan de forma natural. El aumento del número de cadenas de carbohidrato en la eritropoyetina y por lo tanto, el número de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, puede conferir propiedades beneficiosas tales como una mayor solubilidad, una mayor resistencia a la proteólisis, una menor inmunogenicidad, una mayor vida media en suero y una mayor actividad biológica. Los análogos de eritropoyetina con sitios de glicosilación adicionales se revelan con más detalle en la Aplicación de Patente Europea 640 619, de Elliot publicada el 1 de Marzo de 1995.

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En una realización preferida, las glucoproteínas de la presente invención comprenden una secuencia aminoacídica que incluye al menos un sitio adicional para la glicosilación tales como, pero no limitadas a, eritropoyetinas que comprenden la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por una modificación seleccionada de las siguientes:

Asn^{30}Thr^{32};

Asn^{51}Thr^{53},

Asn^{57}Thr^{59};

Asn^{69};

Asn^{69}Thr^{7l};

Ser^{68}Asn^{69}Thr^{7l};

Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90};

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92};

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162};

Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};

Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{9l};

Asn^{136}Thr^{138};

Asn^{138}Thr^{140};

Thr^{125}; y

Pro^{124}Thr^{125}.

La notación que se ha utilizado para la modificación de la secuencia aminoacídica indica que la posición de la correspondiente proteína no modificada (por ejemplo hEPO de SEQ ID NO:1 ó SEQ ID NO:2) indicada por el número en superíndice se sustituye por el aminoácido que precede inmediatamente al número en superíndice.

La glucoproteína también puede ser un análogo con al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo de la glucoproteína, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glicosilación, es decir, el conjugado tal como se ha definido anteriormente también se refiere a un compuesto en donde la glucoproteína tiene una secuencia que comprende la secuencia de eritropoyetina humana y una segunda secuencia en el extremo carboxilo de la secuencia de la eritopoyetina humana, en donde la segunda secuencia contiene al menos un sitio de glicosilación. El aminoácido adicional puede comprender un fragmento peptídico derivado del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica. Preferiblemente, la glucoproteína es un análogo seleccionado del grupo que consiste en (a) eritropoyetina humana que tiene la secuencia aminoacídica Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), prolongándose desde el extremo carboxilo; (b) el análogo en (a) también comprende EPO Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y (c) el análogo en (a) también comprende EPO Asn^{30} Thr^{32} Val^{87} Asn^{88} Thr^{90}.

La glucoproteína también puede ser un análogo con una secuencia aminoacídica que incluya una nueva disposición de al menos un sitio para la glicosilación. La nueva disposición puede comprender una deleción de cualquiera de los sitios de unión N a carbohidrato en la eritropoyetina humana y una adición de un sitio de unión N de carbohidrato en la posición 88 de la secuencia aminoacídica de la eritropoyetina humana. Preferiblemente, la glucoproteína es una análogo seleccionado del grupo que consiste en EPO Gln^{24} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; EPO Gln^{38} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y EPO Gln^{83} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}.

Tal como se ha empleado aquí, el término "alquilo inferior" significa un grupo alquilo lineal o ramificado que presenta entre uno y séis átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo inferior incluyen metilo, etilo e isopropilo. De acuerdo con esta invención, R es cualquier alquilo inferior. Se prefieren los conjugados en los que R es metilo.

El símbolo "m" representa el número de residuos de óxido de etileno (OCH_{2}CH_{2}) en el grupo de poli(etileno óxido). Una única subunidad de PEG de óxido de etileno tiene un peso molecular de alrededor de 44 daltons. Así, el peso molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO) depende del número "m". En los conjugados de esta invención, "m" se encuentra entre alrededor de 450 y alrededor de 900 (correspondiendo al peso molecular de entre 20 kDa y alrededor de 40 kDa), preferiblemente entre alrededor de 650 y alrededor de 750 (correspondiendo al peso molecular de alrededor de 30 kDa). El número m se selecciona de forma que el conjugado resultante de esta invención tenga una actividad fisiológica comparable a la EPO no modificada, cuya actividad puede representar igual o más que una fracción de la correspondiente actividad de la EPO no modificada. Un peso molecular de "alrededor" de un cierto número, significa que está dentro de un rango razonable de dicho número determinado mediante técnicas analíticas convencionales. El número "m" se selecciona de forma que el peso molecular de cada grupo poli(etilenglicol) unido de forma covalente a la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre alrededor de 20 kDa a alrededor de 40 kDa, y se encuentre preferiblemente entre alrededor de 30 kDa.

En los conjugados de esta invención, el número "n" es el número de grupos de polietilenglicol unidos covalentemente a grupos amino libres (incluyendo grupos \varepsilon-amino de un aminoácido de lisina y/o el grupo amino del extremo amino) de la proteína eritropoyetina mediante uniones amida. Un conjugado de esta invención puede tener uno, dos o tres grupos PEG por molécula de EPO. "n" es un entero que se encuentra entre 1 y 3, preferiblemente "n" es 1 ó 2, y más preferiblemente "n" es 1.

El compuesto de la Fórmula I se puede preparar a partir de material polimérico conocido:

1

en el cual R y m son como se han descrito anteriormente, por condensación del compuesto de Fórmula II con la glucoproteína eritropoyetina. Los compuestos de Fórmula II en los cuales x es 3 son alfa-alcoxilo inferior, ácido butírico succinimidíl ésteres de poli(etilenglicol) (alcoxilo inferior-PEG-SBA). Los compuestos de Fórmula II en los cuales x es 2 son alfa-alcoxilo inferior, ácido propiónico ésteres succinimidíl de poli(etilenglicol) (alcoxilo inferior-PEG-SPA). Se puede utilizar cualquier método convencional para hacer reaccionar un éster activado con una amina para formar una amida. En la reacción descrita anteriormente, el éster succinimidílico ejemplificado es un grupo saliente causante de la formación de la amida. El uso de los ésteres succinimidílicos tales como los compuestos de la fórmula II para producir conjugados con proteínas se revelan en la Patente Estadounidense No. 5.672.662, publicada el 30 de Septiembre de 1997 (Harris, et al.).

La EPO humana contiene nueve grupos amino libres, el grupo amino del extremo amino más los grupos \varepsilon-amino de 8 residuos de lisina. Cuando el reactivo de pegilación se combinó con un compuesto SBA de Fórmula II, se halló que a pH 7,5, una relación proteína: PEG de 1:3 y una temperatura de reacción de alrededor de 20-25ºC, se obtuvo una mezcla de especies mono-, di-tripegiladas y pequeñas cantidades de especies tri-pegiladas. Cuando el reactivo de pegilación era un compuesto SPA de la Fórmula II, en condiciones similares excepto que la relación de proteína:PEG era de 1:2, se produjeron principalmente las especies mono-pegiladas. La EPO pegilada se puede administrar en forma de mezcla, o como diferentes especies pegiladas separadas a través de cromatografía de intercambio catiónico. Mediante la manipulación de las condiciones de reacción (por ejemplo la relación de reactivos, pH, temperatura, concentración de la proteína, tiempo de reacción, etc.) se pueden variar las cantidades relativas de las diferentes especies pegiladas.

La eritropoyetina humana (EPO) es una glucoproteína que estimula la formación de eritrocitos. Su preparación y aplicación terapéutica están descritas en detalle por ejemplo en la Patente Estadounidense Nos. 5.547.933 y 5.621.080, EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 y EPB 0 411 678 así como por Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, y Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. La eritropoyetina para usos terapéuticos se puede producir de forma recombinante (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 y Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224).

Los métodos para la expresión y preparación de la eritropoyetina en medio sin suero están descritas por ejemplo en WO 96/35718, to Burg publicado el 14 de Noviembre de 1996, y en European Patent Publication No. 513 738, to Koch publicado el 12 de Junio de 1992. En adición a las publicaciones mencionadas anteriormente, se sabe que se puede llevar a cabo una fermentación libre de suero de células CHO recombinantes que contengan un gen EPO. Tales métodos están descritos por ejemplo en EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 y de forma general por Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. y Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967.

En EP-A 0 267 678 se describe una cromatografía de intercambio iónico en S-Sefarosa, un HPLC en fase reversa preparativo en una columna C_{8} y una cromatografía de filtración en gel para la purificación de EPO producida en cultivo libre de suero tras realizar una diálisis. En esta relación, el paso de cromatografía de filtración en gel se puede sustituir por cromatografía de intercambio iónico en S-Sefarosa fast flow. También se propone realizar una cromatografía con pigmento en una columna de Azul de Trisacrilo previamente a la cromatografía de intercambio iónico.

Se describe un proceso para la purificación de la EPO recombinante en Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. En este proceso, la EPO se trata con una solución de Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, etilmaleimida, pestatina A, sulfato de cobre y ácido oxámico de forma previa a los pasos de purificación. Las publicaciones, incluyendo WO 96/35718, a Burg publicado el 14 de Noviembre de 1996, revela un proceso para la preparación de eritropoyetina en un proceso de fermentación libre de suero (EPOsf).

La actividad específica de EPO o conjugados de EPO de acuerdo con esta invención, se puede determinar mediante varios ensayos conocidos en el campo. La actividad biológica de las proteínas EPO purificadas de esta invención es tal que la administración de la proteína EPO por inyección a pacientes humanos consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos comparado con los sujetos no inyectados o grupos control. La actividad biológica de las proteínas EPO, o fragmentos de las mismas, obtenidos y purificados de acuerdo con esta invención se pueden determinar por métodos de acuerdo con Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 y Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Otro ensayo biológico para determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo normocitémico de ratón, se describe en el Ejemplo 4.

Esta invención proporciona una composición formada por conjugados tal como se ha descrito anteriormente. Se puede preparar una composición que contiene al menos el noventa por ciento de conjugados mono-PEG, es decir en la cual n es 1, tal como se muestra en el Ejemplo 5. Normalmente se prefieren los conjugados mono-PEG de glucoproteínas eritropoyetinas porque tienden a tener una mayor actividad que los conjugados di-PEG. El porcentaje de conjugados mono-PEG así como la relación de especies mono y di-PEG se pueden controlar mediante la combinación de las fracciones anchas del pico de elución para disminuir el porcentaje de mono-PEG, o de las fracciones estrechas para incrementar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Alrededor del noventa por ciento de conjugados mono-PEG es un buen balance de rendimiento y actividad. Se pueden preferir algunas composiciones en las cuales, por ejemplo, al menos un noventa y dos por ciento o al menos noventa y seis por ciento de los conjugados sean especies mono-PEG (n igual a 1). En una realización de esta invención, el porcentaje de conjugados en donde n es 1 se encuentra entre el noventa por ciento y el noventa y séis por ciento.

La invención también se refiere a las correspondientes composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado o una composición tal como se ha descrito anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los conjugados y composiciones de la presente invención son especialmente útiles para la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF), y para el tratamiento de pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a quimioterapia.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para el tratamieto profiláctico y/o terapéutico de trastornos relacionados con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF), y pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a quimioterapia, comprende el paso de la administración a un paciente de una composición tal como se ha descrito anteriormente.

Además, la invención se refiere a un proceso para la preparación de compuestos como se ha descrito anteriormente, cuyo proceso comprende la condensación del compuesto de Fórmula II

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con la glucoproteína eritropoyetina y en la cual R, m y x son como se han definido anteriormente.

La invención se refiere también a compuestos como se han definido anteriormente para el tratamiento de enfermedades las cuales están asociadas con anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF), y pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a quimioterapia.

La invención se entenderá mejor con los siguientes ejemplos que ilustran, pero no por ello limitan la invención descrita hasta aquí.

Ejemplos Ejemplo 1 Fermentación y Purificación de EPO Humana a) Preparación del inóculo y Fermentación

Se toma un vial del Working Cell Bank, originada a partir de una línea celular CHO que produce EPO (se puede usar ATCC CRL8695, revelada en EP 411 678 (Genetics Institute)) a partir de la fase gas del depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido. Las células se transfirieron en tubos de centrífuga de vidrio y se cultivaron en un medio tamponado de hidrógeno carbonato en un incubador humidificado de CO_{2}. Los medios sin suero típicos usados para la preparación del inóculo y la fermentación se revelan en la Aplicación de Patente Europea 513 738, de Koch publicado el 12 Junio de 1992, o WO 96/35718, de Burg publicado el 14 de Noviembre de 1996, por ejemplo contienen como medio DMEM/F12 (por ejemplo JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, No. 57736) y de modo adicional hidrógenocarbonato sódico, L+glutaminna, D+glucosa, insulina recombinante, selenita sódica, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro (II), asparagina, ácido aspártico, serina y un estabilizante para células de mamífero tales como por ejemplo alcohol de polivinilo, metil celulosa, polidextrano, polietilenglicol, Pluronic F68, expansor de plasma poligelina (HEMACCEL®) o polivinil pirrolidona (WO 96/35718).

Los cultivos se comprobaron microscópicamente para detectar la ausencia de microorganismos contaminantes y se determinaron las densidades celulares. Estos ensayos se realizaron en cada paso de fraccionamiento.

Tras el período de crecimiento inicial, el cultivo celular se diluyó con medio fresco hasta conseguir la densidad celular inicial y comenzar otro ciclo celular. Este procedimiento se repitió hasta que se obtuvo un volumen de cultivo de aproximadamente 2 litros por tubo de centrífuga de vidrio. Tras aproximadamente 12 duplicaciones, se usó de 1 a 5 litros de este cultivo como inóculo para la fermentación de 10 litros.

Tras entre 3 y 5 días, el cultivo del fermentador de 10 litros se puede usar como inóculo para el fermentador de inóculo de 100 litros.

Tras otros 3-5 días de cultivo, el cultivo en los 100 litros de fermentación se puede usar como inóculo para el fermentador de inóculo de 1000 litros.

b) Recogida y Separación Celular

Se usó un proceso de realimentación en lote, es decir cuando se alcanza la densidad celular deseada, aproximadamente el 80% del cultivo se recoge. El cultivo remanente es rellenado con medio de cultivo fresco y se hace crecer hasta la siguiente recogida. Una ronda de producción consiste en un máximo de 10 ciclos de recogida: 9 ciclos de recogidas parciales y 1 ciclo de recogida completa al final de la fermentación. El ciclo de recogida se da al cabo de entre 3 y 4 días.

El volumen de cultivo recogido es transferido a un recipiente enfriado. Las células son separadas por centrifugación o filtración y eliminadas. La EPO que contiene el sobrenadante del paso de la centrifugación se filtró en línea y se recogió en un segundo recipiente enfriado. Cada cultivo recogido se procesa de modo separado durante la purificación.

Un proceso típico para la purificación de la proteína EPO se revela en WO 96/35718, de Burg publicado el 14 de Noviembre de 1996. El proceso de purificación se explica a continuación.

a) Cromatografía de Sefarosa Azul

La Sefarosa azul (Pharmacia) consiste en bolitas de Sefarosa, en la superficie de las cuales el colorante Cibacron azul se encuentra unido covalentemente. Como la EPO se une con más fuerza a la Sefarosa Azul que muchos de los contaminantes no protéicos, algunas impurezas protéicas y pVA, la EPO se puede enriquecer en este paso. La elución de la columna de Sefarosa Azul se lleva a cabo incrementando la concentración de sales, así como el pH.

La columna se empaqueta con entre 80-100 litros de Sefarosa Azul, se regenera con NaOH y se equilibra con tampón de equilibración (cloruro de sodio/calcio y acetato sódico). Se carga el sobrenadante de la fermentación acidificado y filtrado. Tras finalizar la carga, la columna se lava primero con un tampón similar al tampón de equilibrado, que contiene una mayor concentración de cloruro de sodio y posteriormente con un tampón Tris-base. El producto se eluye con un tampón Tris-base y se recoge en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.

b) Cromatografía de Butil Toyopearl

El Butil Toyopearl 650 C (Toso Haas) es una matriz basada en poliestireno a la cual están acoplados residuos alifáticos de butilo. Como la EPO se une con más fuerza a este gel que muchas de las impurezas y PVA, se eluye con un tampón que contiene isopropanol.

La columna se empaqueta con entre 30-40 litros de Butil toyopearl 650 C, se regenera con NaOH, se lava con un tampón Tris-base y se equilibra con un tampón Tris-base que contiene isopropanol.

El eluído de Sefarosa Azul se ajusta a la concentración de isopropanol en el tampón de quilibración de la columna y se carga en la columna. Entonces la columna se lava con el tampón de equilibración siguiendo una concentración creciente de isopropanol. El producto se eluye con el tampón de elución (tampón Tris-base con un mayor contenido de isopropanol) y se recoge en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.

c) Cromatografía Ultrogel Hidroxiapatita

El Ultrogel Hidroxiapatita (Biosepra) consiste en Hidroxiapatita que se incorpora en una matriz de agarosa para mejorar las propiedades mecánicas. La EPO tiene una menor afinidad por la Hidroxiapatita y se puede eluir por tanto a concentraciones menores de fosfato que las impurezas protéicas.

La columna se rellena con entre 30-40 litros de Ultrogel Hidroxiapatita y se regenera con un tampón de fosfato potásico/cloruro cálcico y NaOH seguido por un tampón Tris-base. Entonces se equilibra con un tampón Tris-base que contiene una cantidad menor de isopropanol y cloruro sódico.

La EPO contenida en el eluído de la cromatografía Butil Toyopearl se introduce en la columna. Posteriormente la columna se lava con tampón de equilibrado y un tampón Tris-base sin isopropanol y cloruro sódico. El producto se eluye con un tampón Tris-base que contiene una menor concentración de fosfato potásico y se recoge en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.

d) HPLC de Fase Reversa en Vydac C4

El material RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste en partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales llevan cadenas C4-alquilo. La separación de EPO de las impurezas protéicas se basa en las diferencias en cuanto a la fuerza de las interacciones hidrofóbicas. La elución se lleva a cabo con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluído.

El HPLC preparativo se realiza mediante una columna de acero inoxidable (rellenada con entre 2,8 y 3,2 litros de gel de sílice Vydac C4). El eluído Hidroxiapatita Ultrogel se acidificó mediante la adición de ácido trifluoroacético y se introdujo en la columna Vydac C4. Para el lavado y la elución se utilizó un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético. Las fracciones se recogieron e inmediatamente se neutralizaron con tampón fosfato. Las fracciones EPO que se encontraron dentro de los límites IPC se combinaron.

e) Cromatografía Sefarosa DEAE

El material de Sefarosa DEAE (Pharmacia) consiste en grupos dietilaminoetil (DEAE) que se encuentran covalentemente unidos a la superficie de bolas de Sefarosa. La unión de EPO a los grupos DEAE está mediada por interacciones iónicas. El acetonitrilo y el ácido trifluoroacético pasan a través de la columna sin ser retenidos. Después de que estas substancias han sido lavadas, se eliminan las trazas de impurezas mediante el lavado de la columna con tampón acetato a bajo pH. Entonces la columna se lavó con tampón fosfato neutro y la EPO se eluyó con un tampón con fuerza iónica creciente.

La columna se empaquetó con Sefarosa DEAE fast flow. El volumen de la columna se ajustó para asegurar una carga de EPO en el rango de 3-10 mg EP/ml gel. La columna se lavó con agua y tampón de equilibrado (fosfato sódico/potásico). Las fracciones combinadas del eluído de HPLC se cargaron y la columna se lavó con tampón de equilibración. Entonces la columna se lavó con tampón de lavado (tampón de acetato sódico) y posteriormente con tampón de equilibrado. Posteriormente, la EPO se eluyó de la columna con tampón de elución (cloruro sódico, fosfato sódico/potásico) y se recogió en un fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón.

El eluído de la columna Sefarosa DEAE se ajustó a la conductividad especificada. La substancia resultante se filtró para quedar estéril en botellas de Teflon y se conservó a -70ºC.

Ejemplo 2 Pegilación de EPO con mPEG-SBA

La EPO purificada de acuerdo con el procedimiento sin suero del Ejemplo 1 (EPOsf) fue homogéneo tal como se determinó mediante métodos analíticos y mostró el patrón típico isoforma consistente en 8 isoformas. Tuvo una actividad biológica específica de 190.000 IU/mg, tal como se determinó mediante el ensayo normocitémico de ratón. El reactivo de pegilación usado fue metoxi-PEG-SBA, el cual es un compuesto de Fórmula II en el cual R es metilo; x es 3; y m se encuentra entre 650 y 750 (valor medio entre alrededor de 680, correspondiente a una peso molecular medio de alrededor de 30 kDa).

Reactivación de Pegilación

A cien miligramos de EPOsf (9,71 ml de una solución madre de EPOsf de 10,3 mg/ml, 5,48 \mumol) se añadieron 10 ml de un tampón de fosfato de potasio, pH, 7,5, conteniendo 506 mg de metoxi-PEG-SBA (16,5 \mumol) (obtenido a partir de Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) y se mezcló durante 2 horas a temperatura ambiente (20-23ºC). La concentración de proteína final fue de 5 mg/ml y la relación proteína: reactivo PEG fue de 1:3. Tras dos horas, la reacción se paró mediante el ajuste del pH a 4,5 con ácido acético glacial y se conservó a -20ºC, hasta el momento de la purificación.

Purificación

1. Mecla del conjugado: Aproximadamente 28 ml de SP-SEPHAROSE FF (resina de intercambio catiónico de sulfo-propilo) se empaquetaron en una columna de vidrio AMICON (2,2 x 7,5 cm) y se equilibró con tampón de acetato 20 mM, pH 4,5 a un flujo de 150 ml/h. Seis mililitros de la mezcla de reacción que contenían 30 mg de proteína se diluyeron 5 veces con el tampón de equilibración y se aplicaron a la columna. Los materiales no adsorbidos se lavaron con el tampón y la mezcla del conjugado con PEG adsorbida se eluyó de la columna con NaCl 0,175 M en el tampón de equilibrado. La EPOsf no modificada aún remanente en la columna se eluyó con NaCl 750 mM. La columna se volvió a equilibrar en el tampón de inicio. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y se determinó su nivel de pegilación. Se halló que el eluído de NaCl 0,175 M contenía especies mono- así como di-pegiladas y pequeñas cantidades de especies tri-pegiladas, mientras que el eluído de NaCl 750 mM contenía la EPOsf sin modificar.

2. Di-PEG y Mono-PEG-EPOsf: La mezcla del conjugado purificada eluída de la columna en el paso anterior se diluyó 4 veces con el tampón, se volvió a aplicar en la columna y se lavó como se ha descrito anteriormente. La Di-PEG-EPOsf y mono-PEG-EPOsf se eluyeron de modo separado de la columna con NaCl 0,1 M y NaCl 0,175 M respectivamente. La elución también se realizó con NaCl 750 mM con la finalidad de eluir cualquier EPOsf remanente no modificado.

Por otro lado, la mezcla de reacción se diluyó 5 veces con el tampón de acetato y se aplicó en la columna de SP-Sefarosa (\sim0.5 mg proteína/ml gel). La columna se lavó y las mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf adsorbidas y EPOsf no modificada se eluyeron como se ha descrito en la sección anterior.

Resultados

Se sintetizó PEG-EPOsf mediante la conjugación química de una molécula de PEG lineal con un valor de peso molecular medio de 30 KDa. La EPO-EPOsf se derivó de la reacción entre los grupos amino primarios de EPOsf y el éster de succinimidilo derivado de un ácido PEG-butírico de 30 kDa, resultando en un enlace amida.

Los resultados se resumen en la Tabla 2. La mezcla de conjugado purificada estaba formada por mono y di-PEG-EPOsf y estaba libre de EPOsf no modificada como se determinó mediante análisis por SDS-PAGE. La mezcla del conjugado resultó en 23,4 mg o 78% del material de partida. La separación cromatográfica por intercambio catiónico de mono y di-PEG-EPsf indicó que la relación mono a di-PEG en la mezcla de conjugado fue de casi 1:1. Tras la finalización de la reacción, la relación de los componentes individuales de Mono:Di: No modificada fueron de 40:38:20 (%). El rendimiento global fue casi cuantitativo.

TABLA 1 Resumen de los resultados de pegilación de EPOsf

3

Ejemplo 3 Pegilación de EPO con mPEG-SPA

Una alícuota diferente de EPOsf utilizada en el Ejemplo 2 se hizo reaccionar con metoxi-PEG-SPA de 30 kDa (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). La reacción se llevó a cabo a una relación de proteína: reactivo de 1: 2 y las técnicas de purificación utilizadas están de acuerdo con el Ejemplo 2. Se produjeron principalmente las especies mono-pegiladas.

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Ejemplo 4 Actividad in vivo de EPO pegilada determinada mediante el ensayo normocitémico de ratón

El bioensayo normocitémico de ratón es conocido en el campo (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) y se describe un método en la monografía de eritropoyetina de Ph. Eur. BRP. Las muestras se diluyeron con BSA-PBS. A ratones sanos normales, de 7-15 semanas de edad, se les administraron s.c. 0,2 ml de la fracción de EPO que contenía EPO no pegilada o EPO tri-, di- o mono-pegilada del ejemplo 2 ó 3. Durante un período de 6 días, se les extrajo sangre por punción de la vena de la cola y se diluyó de forma que 1 \mul de sangre se encontraba presente en 1 ml de una solución de tinción naranja de acridina 0,15 \mumol. El tiempo de tinción fue de entre 3 y 10 minutos. Los contajes de reticulocito se llevaron a cabo de forma microfluorométrica en un citómetro de flujo mediante análisis del histograma de fluorescencia rojo. Los contajes de reticulocito se dieron en términos de figuras absolutas (por 30.000 células sanguíneas analizadas). Para los datos presentados, cada grupo consistió en 5 ratones por día, y los ratones fueron sangrados sólo una vez.

En experimentos separados, se administraron a ratones una única dosis de EPO no modificada (25 ng de EPO), la mezcla de PEG(SBA)-EPO del ejemplo 2 (10 ng de conjugado), EPOs mono- y di-pegiladas del Ejemplo 2 (10 ng del conjugado), el PEG(SPA)-EPO del Ejemplo 3 (10 ng del conjugado) y solución tampón. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Los resultados muestran una mayor actividad y una vida media prolongada de las especies de EPO pegiladas, lo cual viene indicado por las cantidades significativamente incrementadas de reticulocitos y el cambio del máximo número de reticulocitos usando la misma dosis por ratón (10 ng), comparado con una dosis de 25 ng para EPO no modificado.

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TABLA 2

4

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Ejemplo 5 Preparación de mono-PEG-EPO predominante Reacción de Pegilación

Se inició con 100 mg (5,48 \mumol) de EPOsf en tampón de fosfato de potasio pH 7,5, preparado de acuerdo con el Ejemplo 1, se anadió 329 mg (10,96 \mumol) de reactivo de PEG-SBA 30 kDa disueltos en 30 ml de HCl 1 mM. Se añadió el suficiente tampón de fosfato de potasio 100 mM para llevar el volumen de la mezcla de reacción a 20 ml. La concentración de proteína final fue de 5 mg/ml y la relación de proteína: reactivo de PEG fue de 1:2. La mezcla de reacción se mezcló durante 2 h a temperatura ambiente (20-2ºC). Tras 2 h, la reacción se paró mediante el ajuste del pH a 4,5 con ácido acético glacial y se conservó congelada a -20ºC hasta su purificación.

Purificación

La mezcla de reacción del paso anterior se diluyó 1:5 con acetato de sodio 10 mM, pH 4,5 y se aplicó a 300 ml de SP-Sefarosa FF (resina de intercambio catiónico de sulfopropilo) empaquetada en una columna de 4,2 x 19 cm. La columna se equilibró previamente con el mismo tampón. Se hizo un seguimiento de los efluyentes de la columna a 280 nm con un monitor UV Gilson y se grabó con un grabador Kipp y Zonen. La columna se lavó con 300 ml o un volumen de residencia de tampón de equilibrado para eliminar los reactivos en exceso, los productos colaterales de reacción y PEG-EPO oligoméricos. Esto fue seguido por un lavado con 2 volúmenes de residencia de NaCl 100 mM para eliminar di-PEG-EPO. El Mono-PEG-EPO fue entonces eluído con NaCl 200 mM. Durante la elución de mono-PEG-EPO, los primeros 50 ml del pico de proteína fueron eliminados y el mono-PEG-EPO fue recogido como una fracción de 150 ml. Las EPOsf no modificadas que permanecieron en la columna fueron eluídas con NaCl 750 mM. Todos los tampones de elución se elaboraron con tampón de equilibrado. Todas las muestras eluídas se analizaron mediante SDS-PAGE y mediante Cromatografía de Exclusión por tamaño de alta resolución (SEC). El conjunto de mono-PEG-EPO obtenido de la fracción de 150 ml, que no presentaba EPOsf no modificado detectable, fue entonces concentrado a entre \sim4.5-7,5 mg/ml y diafiltrado en tampón de conservación, fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,6. La concentración/ Diafiltración se llevó a cabo con el Millipore Labscale^{TM} TFF System con una membrana de tamaño de poro de 50 kDa off Millipore Pellicon XL Biomax 50 a temperatura ambiente. El mono-PEG-EPO concentrado se filtró para quedar estéril y se conservó a -20ºC.

Aproximadamente el 75% de las EPOsf se pegilaron. Tras la purificación, el rendimiento total fue de \sim30% de mono-PEG-EPO con EPOsf no modificada no detectable y alrededor del 25% de di-PEG-EPO. Oligómeros y EPOsf no pegilada quedaron en la proteína remanente. El mono-PEG-EPO obtenido de la fracción de 150 ml contuvo aproximadamente 90% de mono-PEG-EPO y aproximadamente el 10% de di-PEG-EPO.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche AG

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(B): CALLE: 124 Grenzacherstrasse

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(C): CIUDAD: Basilea

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(E): PAÍS: Suiza

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070

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(G): TELÉFONO: (61) 688 11 11

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(H): FAX: (61) 688 13 95

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(I): TELEX: 962 292 hlr ch

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Conjugados de Eritropoyetina

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:

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(A): TIPO DE SOPORTE: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA DE OPERACIÓN: WORD

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release 2.0

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

6

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<210> 3

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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8

Claims

1. Un conjugado de eritropoyetina, dicho conjugado comprende una glucoproteína, la eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presenten la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o mediante una nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; dicha glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la fórmula

-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR

con el -CO de cada grupo de poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde

R es alquilo inferior;

x es 2 ó 3;

m se encuentra entre 450 y 900;

n se encuentra entre 1 y 3; y

n y m se eligen de modo que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons.

2. El conjugado de la reivindicación 1, de la fórmula:

(I)P-[NHCO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]_{n}

en donde x, m, n y R son como se han definido en la reivindicación 1, y P es el residuo de la glucoproteína sin el grupo o grupos n amino que forman el enlace o enlaces con el grupo o grupos de poli(etilen glicol).

3. El conjugado de cualquier reivindicación precedente, en donde R es metilo.

4. El conjugado de cualquier reivindicación precedente, en donde m está comprendido entre 650 y 750.

5. El conjugado de cualquier reivindicación precedente, en donde n es 1.

6. El conjugado de cualquier reivindicación precedente, en donde R es metilo; m está comprendido entre 650 y 750; y n es 1.

7. El conjugado de cualquier reivindicación precedente que presente la fórmula

[CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CO-NH]_{n}-P

en donde m se encuentra entre 650 y 750, n es 1 y P es como se ha definido en la reivindicación 2.

8. El conjugado de cualquier reivindicación precedente, en donde la glicroproteína es una eritropoyetina humana.

9. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la glucoproteína eritropoyetina humana es expresada mediante activación génica endógena.

10. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la glucoproteína presenta la secuencia SEQ ID NO:1.

11. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación.

12. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en:

Asn^{30}Thr^{32};

Asn^{51}Thr^{53},

Asn^{57}Thr^{59};

Asn^{69};

Asn^{69}Thr^{7l};

Ser^{68}Asn^{69}Thr^{7l};

Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90};

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92};

Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162};

Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};

Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};

Ser^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{9l};

Asn^{136}Thr^{138};

Asn^{138}Thr^{140};

Thr^{125}; y

Pro^{124}Thr^{125}.

13. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la glucoproteína presenta una secuencia que comprende la secuencia de la eritropoyetina humana y una segunda secuencia en el extremo carboxilo de la secuencia de la eritropoyetina humana, en donde la segunda secuencia contiene al menos un sitio de glicosilación.

14. El conjugado de la reivinidicación 13, en donde la segunda secuencia comprende una secuencia derivada de la secuencia del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica humana.

15. El conjugado de la reivindicación 13, en donde la glucoproteína pressenta una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a): la secuencia de la eritropoyetina humana y la secuencia SEQ ID NO:3 en el extremo carboxilo de la secuencia de la eritropoyetina humana;

(b): la secuencia en (a) modificada por Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y

(c): la secuencia en (a) modificada por Asn^{30} Thr^{32} Val^{87} Asn^{88} Thr^{90}.

16. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante la nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación.

17. El conjugado de la reivindicación 16, en donde la nueva disposición comprende la deleción de cualquiera de los sitios de glicosilación con unión N en la eritropoyetina humana y la adición de un sitio de glicosilación con unión N en la posición 88 de la secuencia de la eritropoyetina humana.

18. El conjugado de la reivindicación 17, en donde la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en:

Gln^{24} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90};

Gln^{38} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}; y

Gln^{83} Ser^{87} Asn^{88} Thr^{90}.

19. Una composición que comprende conjugados, cada uno de dichos conjugados comprendiendo una glucoproteína eritropoyetina que tiene al menos un grupo amino libre y que presenta una actividad biológica in vivo que hace que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se seleccionan del grupo que consiste en eritropoyetina humana y eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glicosilación o una nueva disposición de al menos un sitio de glicosilación; la glucoproteína en cada uno de dichos conjugados está covalentemente unida a "n" grupos de poli(etilen glicol) de la fórmula -CO-(CH_{2})_{x}(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR con el -CO de cada grupo poli(etilen glicol) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde en cada uno de dichos conjugados R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m se encuentra entre 450 y 900; n se encuentra entre 1 y 3; n y m son seleccionados de forma que el peso molecular de cada conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina se encuentre entre 20 kilodaltons y 100 kilodaltons; el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el noventa por ciento.

20. La composición que comprende conjugados tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el noventa por ciento.

21. La composición de acuerdo con las reivindicaciones 19 ó 20, en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el noventa y dos por ciento.

22. La composición de la reivindicación 21 en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos el noventa y séis por ciento.

23. La composición de la reivindicación 19 ó 20 en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es entre el noventa por ciento y el noventa y seis por ciento.

24. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y un excipiente farmacéuticamente acetable.

25. El uso de un conjugado o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF), SIDA y para el tratamiento de pacientes de cáncer que han sido tratados con quimioterapia.

26. Un proceso para la preparación de conjugados de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, cuyo proceso comprende la condensación del compuesto de la Fórmula II

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con la glucoproteína eritropoyetina y en la cual R, m y x son como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

27. Conjugados de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para el tratamiento de enfermedades asociadas con anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF), SIDA y pacientes con cáncer que han sido tratados con quimioterapia.

28. Un conjugado, dicho conjugado comprende una glicoproteína eritropoyetina, que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, dicha glucoproteína se encuentra unida covalentemente a "n" grupos de poli(etilenglicol) de la fórmula

-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR

R es metilo;

x es 3;

m se encuentra entre 650 y 750;

n es 1; y

n y m se eligen de modo que el peso molecular del conjugado menos la glicoproteína eritropoyetina es de unos 30 kilodaltons.