ES2241042T3 - Conjugados de polinucleotido inmunoestimulador/ molecula inmunomoduladora. - Google Patents

Conjugados de polinucleotido inmunoestimulador/ molecula inmunomoduladora.

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ES2241042T3 ES97912831T ES97912831T ES2241042T3 ES 2241042 T3 ES2241042 T3 ES 2241042T3 ES 97912831 T ES97912831 T ES 97912831T ES 97912831 T ES97912831 T ES 97912831T ES 2241042 T3 ES2241042 T3 ES 2241042T3
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Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES DE CONJUGADOS DE POLINUCLEOTIDOS INMUNOESTIMULADORES/MOLECULAS INMUNOMODULADORAS. ESTAS COMPOSICIONES INCLUYEN UN POLINUCLEOTIDO QUE ESTA UNIDO A UNA MOLECULA INMUNOMODULADORA, LA MOLECULA COMPRENDE UN ANTIGENO Y ADEMAS PUEDE COMPRENDER INMUNOMODULADORES TALES COMO CITOQUINAS Y COADYUDANTES. LA PARTE DEL POLINUCLEOTIDO DEL CONJUGADO INCLUYE AL MENOS UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA CONSTITUIDA POR OLIGONUCLEOTIDOS INMUNOMODULADORES (ISS). TAMBIEN SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA MODULAR UNA RESPUESTA INMUNE DESPUES DE LA ADMINISTRACION DE LA PREPARACION QUE CONTIENE EL CONJUGADO POLINUCLEOTIDO/INMUNOMODULADOR A UN ANFITRION VERTEBRADO.

Description

Conjugados de polinucleótido inmunoestimulador/molécula inmunomoduladora.
Ámbito de la invención
Esta invención se refiere a composiciones que comprenden una molécula inmunomoduladora (IMM) que incluye un antígeno, conjugadas con un polinucleótido que contiene o consiste al menos en un oligonucleótido inmunoestimulante (ISS-PN). También se refiere a procedimientos para modular la respuesta inmune de un huésped vertebrado respecto un antígeno.
Historia de la técnica previa relacionada
Convencionalmente, la inmunización de un huésped respecto un antígeno se consigue vacunando repetidamente el huésped con el antígeno. Mientras que la mayoría de las vacunas actuales provocan respuestas de anticuerpos razonables, las respuestas celulares (en particular, de las células citotóxicas de la clase I-restringida del complejo de histocompatibilidad principal) están generalmente ausentes o son débiles. Para muchas enfermedades infecciosas, tales como la tuberculosis o la malaria, las respuestas humorales tienen poco valor protector frente a la infección.
Dada la débil respuesta inmune celular contra los antígenos de proteína, la modulación de las respuestas inmunes contra estos antígenos tiene una importancia clara. La capacidad para modificar las respuestas inmunes contra antígenos proteicos o peptídicos tiene implicaciones en la terapia de tumores, para el tratamiento de alteraciones alérgicas, y para el tratamiento de otras condiciones que pueden conseguirse a través de la inducción de una respuesta inmune celular enérgica.
WO-96/02555 describe oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen dinucleótidos CpG no metilados, y utilidades terapéuticas basadas en su capacidad para estimular una respuesta inmune.
Raz et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, Vol. 93; 5141-5145, describen la inducción preferencial de una respuesta inmune Th1 y la inhibición de la formación de anticuerpo IgE específico mediante inmunización con ADN de plásmido.
Raz et al., Arthritis & Rheumatism, Vol. 39, nº 9, página 615, describen el papel potencial de las secuencias de ADN inmunoestimuladoras (ISS) en la inmunización genética y la autoinmunidad.
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un ISS-PN, el cual está conjugado con una IMM (la cual incluye un antígeno) para formar conjugados ISS-PN/IMM. Los conjugados ISS-PN/IMM de la invención son modificadores de la respuesta biológica en el sentido de que modifican la respuesta inmune humoral y celular de un huésped frente a un antígeno.
En consecuencia, la presente invención proporciona una composición inmunomoduladora que comprende una molécula inmunomoduladora, en donde dicha molécula inmunomoduladora comprende un antígeno, en donde el antígeno está conjugado con un polinucleótido inmunoestimulante (ISS-PN), comprendiendo dicho ISS-PN al menos una secuencia inmunoestimulante (ISS) que comprende la secuencia no metilada 5'-citosina, guanina-3', en donde el ISS tiene una longitud de al menos seis nucleótidos, en donde dicho ISS-PN tiende desde 6 hasta aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, y en donde el antígeno se selecciona a partir de una antígeno tumoral, un antígeno viral, un alérgeno, o un microorganismo infeccioso.
La invención también proporciona el uso de una composición inmunomoduladora que comprende una molécula inmunomoduladora, en donde dicha molécula inmunomoduladora comprende un antígeno, en donde dicho antígeno está conjugado con un polinucleótido inmunoestimulante (ISS-PN), comprendiendo dicho ISS-PN al menos una secuencia inmunoestimulante (ISS) que comprende la secuencia no metilada 5'-citosina, guanina-3', para la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta de Th1 y/o suprimir una respuesta de Th2 contra el antígeno y/o reducir la producción de IgE estimulada por el antígeno.
Los aspectos preferidos de la invención se definen adicionalmente más abajo en las reivindicaciones adjuntas.
Los componentes ISS-PN/IMM de los conjugados ISS-PN/IMM cooperativamente potencian la magnitud de la respuesta inmune del huésped contra un antígeno hasta un nivel superior al de la respuesta inmune celular del huésped contra el IMM, el antígeno o el ISS solos. Los conjugados ISS-PN/IMM también desplazan la respuesta inmune celular del huésped del fenotipo de linfocito auxiliar del Tipo 2 (Th2) hacia el fenotipo de linfocito auxiliar del Tipo 1 (Th1). Estas respuestas contra los conjugados ISS-PN/IMM son particularmente agudas durante la importante fase temprana de la respuesta inmune del huésped contra un antígeno.
Con estos fines, los conjugados ISS-PN/IMM se suministran mediante cualquier ruta a través de la cual los tejidos del huésped sensibles al antígeno se pongan en contacto con el conjugado ISS-PN/IMM. Los conjugados ISS-PN/IMM administrados de esta forma potencian ambas, las respuestas inmunes humoral (anticuerpo) y celular (del tipo Th1). Por tanto, el uso del procedimiento para potenciar la capacidad de respuesta inmune de un huésped frente a un desafío subsiguiente mediante un antígeno sensibilizante sin inmunización evita el riesgo de una respuesta anafilaxis inducida por la inmunización, mediada por Th2, mediante la supresión de la producción de IgE en respuesta al desafío del antígeno. Un uso especialmente ventajoso para este aspecto de la invención es el tratamiento de respuestas alérgicas localizadas en tejidos diana en donde los alérgenos entran en el cuerpo, tales como la piel y la
mucosa.
La supresión del fenotipo de Th2 de acuerdo con la invención es útil también para reducir la producción de IL-4 e IL-5 estimulada por antígeno. Por tanto, la invención abarca el suministro de conjugados ISS-PN/IMM a un huésped para suprimir el fenotipo de Th2 asociado con la inmunización convencional con antígeno (por ejemplo, para la vacunación o inmunoterapia de alergias).
El desplazamiento hacia un fenotipo de Th1 conseguido de acuerdo con la invención está acompañado por una secreción incrementada de IFN \alpha, \beta y \gamma, así como de IL-12 e IL-18. Cada una de estas citoquinas mejora las defensas inmunes del huésped contra los patógenos intracelulares, tales como los virus. Por tanto, la invención abarca el uso de los conjugados ISS-PN/IMM para su suministro a un huésped para combatir una infección patogénica.
La angiogénesis también está potenciada en el fenotipo de Th1 (ostensiblemente a través de la estimulación mediante IL-12). Por tanto, la invención abarca el suministro de conjugados ISS-PN/IMM a un huésped para estimular la angiogénesis terapéutica para tratar condiciones en las que el flujo sanguíneo localizado juega un rol etiológico significativa, por ejemplo, las retinopatías.
Las composiciones que comprenden conjugados ISS-PN/IMM comprenden un IMM conjugado con un polinucleótido que incluye, o consiste en, al menos una porción oligonucleotídica inmunoestimulante (ISS-ODN). La porción ISS-ODN es un oligonucleótido de ADN o ARN, de hebra única o doble, que tiene al menos 6 bases nucleotídicas, las cuales podrían incluir, o consistir en, un oligonucleósido modificado o una secuencia de nucleósidos modificados.
Las porciones ISS-ODN comprenden, o podrían estar flanqueadas por, una secuencia nucleotídica conteniendo CpG o una secuencia nucleotídica p(IC), la cual podría ser palindrómica. Cuando la porción oligonucleotídica comprende una secuencia CpG, éste podría incluir una estructura hexamérica consistente en 5'-purina, purina, CG, pirimidina, pirimidina-3'. Son ejemplos de tales estructuras hexaméricas AACGTT, AGCGTT, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, y AGCGTC.
En un aspecto de la invención, el ISS-PN consiste en un ISS-ODN. Alternativamente, el ISS-PN comprende un ISS-ODN.
En un aspecto de la invención, la pareja IMM del conjugado con el ISS-PN consiste en un antígeno. Tales antígenos se seleccionan a partir del grupo de antígenos consistente en proteínas, péptidos, glicoproteínas, polisacáridos, y gangliósidos.
En otro aspecto de la invención, el IMM pareja del conjugado comprende un antígeno y además comprende una molécula inmunoestimulante seleccionada a partir del grupo de tales moléculas consistente en adyuvantes, hormonas, factores del crecimiento, citoquinas, quimioquinas, ligandos que apuntan a proteínas, y factores trans-activadores.
En otro aspecto de la invención, el conjugado ISS-PN/IMM se modifica para su suministro dirigido mediante, por ejemplo, la unión a un anticuerpo monoclonal, ligando de receptor y/o liposoma.
Se proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables de conjugados ISS-PN/IMM para su uso en la práctica de la invención. Cuando sea apropiado para el curso contemplado de la terapia, los conjugados ISS-PN/IMM podrían suministrarse con agentes antiinflamatorios o inmunoterapéuticos. Por tanto, una composición particularmente útil para su uso en la práctica del procedimiento de la invención es una en la que un agente antiinflamatorio (por ejemplo, un glucocorticoide) se mezcla con, o de conjuga adicionalmente a, un conjugado ISS-PN/IMM.
Los conjugados ISS-PN/IMM pueden proporcionarse también en forma de un equipo que comprende conjugados ISS-PN/IMM y cualesquier medicamentos adicionales, así como un dispositivo para suministrar los conjugados ISS-PN/IMM a un tejido huésped y reactivos para determinar el efecto biológico de los conjugados ISS-PN/IMM en un huésped tratado.
Breve descripción de las ilustraciones
La Figura 1 es una gráfica de datos que demuestran la vigorosa respuesta inmune del tipo-Th1 (según se mide por la producción de IgG2a contra un antígeno IMM) estimulada por ISS-PN/IMM (proporción 1:5) en comparación con los niveles de respuestas similares de Th2 estimuladas por un ISS que contiene, plásmido que codifica el antígeno (pACB-Z); el antígeno solo (\beta-gal); el antígeno mezclado con un ISS (proporción 1:5); el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.; proporción 1:5); el antígeno en adyuvante (alum) y, para referencia, los niveles de IgG2a en ratones ingenuos (no expuestos). El eje horizontal representa los niveles (unidades/ml) de anticuerpo; el eje vertical representa el número de semanas que siguen a la exposición al antígeno primario.
La Figura 2 es una gráfica de datos que demuestran la vigorosa respuesta inmune del tipo-Th2 (según se mide por la producción de IgG1 contra un antígeno IMM) estimulada por ISS que contiene plásmido que codifica el antígeno (pACB-Z); el antígeno solo (\beta-gal); el antígeno mezclado con un ISS (proporción 1:5); el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.; proporción 1:5); el antígeno en adyuvante (alum) y, para referencia, los niveles de IgG1 en ratones ingenuos (no expuestos), todos comparados con la vigorosa respuesta inmune del tipo Th1 producida en ratones inmunizados con ISS-PN/IMM (proporción 1:5). El eje horizontal representa los niveles (unidades/ml) de anticuerpo; el eje vertical representa el número de semanas que siguen a la exposición al antígeno primario.
La Figura 3 es una gráfica de datos que demuestran la vigorosa respuesta inmune del tipo-Th1 (según se mide por la producción de IgG2a contra un antígeno IMM) estimulada por ISS-PN/IMM en comparación con los niveles de respuestas similares de Th2 estimuladas el antígeno solo (AgE) y el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.). Las proporciones de antígeno respecto PN son todas de 1:5. El eje horizontal representa los niveles (unidades/ml) de anticuerpo; el eje vertical muestra los niveles a las 4 semanas después de la exposición al antígeno primario (barras sombreadas), y a las 2 semanas después del desafío secundario con antígeno (barras negras).
La Figura 4 es una gráfica de datos que demuestran los niveles de respuestas inmunes del tipo-Th2 (según se mide por la producción de IgG1 contra un antígeno IMM) estimulada por el antígeno solo (AgE) y el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.), en comparación con la vigorosa respuesta inmune del tipo Th1 estimulada en ratones inmunizado con ISS-PN/IMM. Las proporciones de antígeno respecto PN son todas de 1:5. El eje horizontal representa los niveles (unidades/ml) de anticuerpo; el eje vertical muestra los niveles a las 4 semanas después de la exposición al antígeno primario (barras sombreadas), y a las 2 semanas después del desafío secundario con antígeno (barras negras).
La Figura 5 es una gráfica de datos que demuestran la supresión de la producción de IgE anti-antígeno (AgE) asociadas con Th2 por parte del ISS-PN/IMM en comparación con los niveles de producción de IgE estimulados por el antígeno (AgE) solo y el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.). Las proporciones de antígeno respecto PN son todas de 1:5. El eje horizontal representa los niveles (cuentas por minutos; cpm) de anticuerpo; el eje vertical muestra los niveles a las 4 semanas después de la exposición al antígeno primario (barras sombreadas), y a las 2 semanas después del desafío secundario con antígeno (barras negras).
La Figura 6 es una gráfica de datos que demuestran los elevados niveles de producción de interferón \gamma (IFNg) asociados con Th1, estimulados por el ISS-PN/IMM en comparación con los bajos niveles de citoquina de Th1 estimulados por un ISS que contiene, plásmido que codifica el antígeno (pACB-Z); el antígeno solo (\beta-gal); el antígeno mezclado con un ISS; el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.); el antígeno en adyuvante (alum) y, para referencia, los niveles de IFNg en ratones ingenuos (no expuestos). Las proporciones de antígeno respecto PN son todas de 1:5. El eje horizontal representa los niveles (ng/ml) de citoquina; el eje vertical muestra los niveles a las 4 semanas después de la exposición al antígeno primario (barras sombreadas).
La Figura 7 es una gráfica de datos que demuestran la vigorosa respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específica para el antígeno, estimulada por el ISS-PN/IMM en comparación con los niveles de producción de CTL estimulados por un ISS que contiene, plásmido que codifica el antígeno (pACB-Z); el antígeno solo (\beta-gal); el antígeno mezclado con un ISS; el antígeno conjugado con un PN no estimulador (mISS conj.); el antígeno en adyuvante (alum) y, para referencia, los niveles de CTL en ratones ingenuos (no expuestos). Las proporciones de antígeno respecto PN son todas de 1:5. El eje horizontal representa los niveles de lisis celular específica para el antígeno (como porcentaje del control; sin antígeno); el eje vertical muestra los niveles de CTL detectados a diferentes proporciones de efector (antígeno) respecto la diana, desde 0:1 hasta 1:0. La leyenda identifica cómo se trató cada población de células.
Descripción detallada de la invención A. Actividad biológica de los conjugados ISS-PN/IMM
La respuesta inmune estimulada por los conjugados ISS-PN/IMM de la invención difiere de la respuesta inmune de vertebrados a la vacunación convencional, tanto en magnitud como en calidad. En el primer aspecto, la respuesta inmune del huésped contra un antígeno se potencia a un nivel superior al conseguido en la exposición a un ISS-PN o antígeno administrado solos o juntos en una forma no conjugada. Por tanto, un aspecto sorprendente de la invención es que la conjugación de un ISS-PN a un antígeno que contiene IMM produce una sinérgia entre la actividad inmunoestimulante del ISS-PN y la actividad inmunomoduladora del IMM, la cual inmuniza al huésped contra el antígeno más efectivamente de lo que alguien prediría.
Ventajosamente, la respuesta inmune estimulada de acuerdo con la invención difiere de la respuesta inmune de vertebrados frente a la vacunación convencional en que ésta última se desarrolla en un fenotipo de Th2, mientras que la primera se desarrolla en un fenotipo de Th1. En relación a esto, es útil recordar que los linfocitos CD4+ generalmente se agrupan en uno de dos subconjuntos distintos; es decir, las células Th1 y Th2. Las células Th1 secretan principalmente IL-2, IFN\gamma y TNF\beta (de los cuales, los dos últimos median en la activación de macrófagos y la hipersensibilidad del tipo retrasado), mientras que las células Th2 principalmente secretan IL-4 (la cual estimula la producción de anticuerpos IgE), IL-5 (la cual estimula la infiltración de granulocitos en el tejido), IL-6 e IL-10. Estos dos subconjuntos de CD4+ ejercen una influencia negativa el uno en el otro; es decir, la secreción de linfoquinas de Th1 inhibe la secreción de linfoquinas de Th2, y viceversa.
Los factores que se cree que favorecen la activación de Th1 se parecen a los inducidos por una infección viral e incluyen los patógenos intracelulares, la exposición a IFN-\beta, INF-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 e IL-18, y la exposición a dosis bajas de antígeno. Las respuestas inmunes del tipo Th1 también predominan en las enfermedades autoinmunes. Los factores que se cree favorecen la activación de Th2 incluyen la exposición a IL-4 e IL-10, la actividad APC por parte de los linfocitos B, y las dosis elevadas de antígeno.
Las células Th1 activas (IFN\gamma) mejoran la inmunidad celular y son, por tanto, de especial valor para responder a infecciones intracelulares, mientras que las células Th2 activas mejoran la producción de anticuerpo y son, por tanto, valiosas para responder a infecciones extracelulares (a riesgo de sucesos anafilácticos asociados con la inducción de producción de anticuerpo IgE estimulada por IL-4). Por tanto, la capacidad de desplazar la respuesta inmune del repertorio de Th1 al de Th2 y viceversa tiene una importancia clínica sustancial para controlar la inmunidad del huésped frente al desafío con antígeno (por ejemplo, en condiciones infecciosas y alérgicas).
Con este fin, los procedimientos de la invención desplazan la respuesta inmune del huésped frente a antígeno sensibilizante hacia un fenotipo Th1 (Ejemplo 1). En consecuencia, la producción de citoquinas asociada con Th2, y la producción de IgE estimulada por el antígeno (Ejemplos II y III) están suprimidas, reduciéndose, por tanto, el riesgo del huésped de inflamación alérgica prolongada y minimizando el riesgo de anafilaxis inducida por el antígeno. La producción de CTL también está estimulada a un grado superior en animales tratados de acuerdo con la invención. Puesto que la producción de CTL está unida al procesamiento de antígeno en las vías del MHC Clase I, la producción incrementada de CTL puede producirse a partir de PN/IMM no estimuladores así como de ISS-PN/IMM (Ejemplo IV).
Aunque la invención no está limitada por ningún mecanismo de acción concreto, es concebible que el PN facilita la captación de antígeno exógeno por parte de células que presentan antígeno para su presentación a través de las vías de procesamiento del MHC Clase I del huésped que normalmente no son estimuladas por el antígeno soluble. Por tanto, el ISS-PN/IMM llevan el antígeno a las vías de procesamiento del MCH Clase I (lo que también podría conseguirse mediante PN/IMM sin actividad ISS), a continuación estimula una cascada de citoquinas en un fenotipo Th1 (a resultas de la actividad ISS). Cualquiera que sea el mecanismo de acción, el uso de ISS-PN/IMM para potenciar la capacidad de respuesta del sistema inmune del huésped frente a un antígeno sensibilizante y el desplazamiento de la respuesta inmune hacia un fenotipo Th1 evita el riesgo de anafilaxis inducida por la inmunización, suprime la producción de IgE en respuesta a un antígeno sensibilizante, y elimina la necesidad de identificar el antígeno sensibilizante para su uso en la inmunización.
En referencia a la invención, la "potenciación de la capacidad de respuesta inmune en un fenotipo Th1" en un huésped tratado con ISS-PN/IMM está evidenciada por:
(1)
una reducción en los niveles de IL-4 medidos antes y después del desafío con el antígeno; o la detección de niveles inferiores (o incluso ausentes) de IL-4 en huéspedes tratados en comparación con un control cebado, o cebado y potenciado, con antígeno;
(2)
un incremento en los niveles de IL-12, IL-18 y/o IFN (\alpha, \beta o \gamma) antes y después del desafío con antígeno; o la detección de niveles superiores de IL-12, IL-18 y/o IFN (\alpha, \beta o \gamma) en un huésped tratado con ISS-PN/IMM en comparación con un control cebado, o cebado y potenciado, con antígeno;
(3)
La producción de anticuerpo IgG2a en un huésped tratado; o
(4)
una reducción en los niveles de IgE específica contra el antígeno según se mide antes y después del desafío con antígeno; o la detección de niveles inferiores (o incluso ausentes) de IgE específica contra el antígeno en un huésped tratado con ISS-PN/IMM en comparación con un control cebado, o cebado y potenciado, con antígeno.
Los procedimientos ilustrativos para determinar tales valores se describen adicionalmente en los Ejemplos.
Por tanto, los conjugados ISS-PN/IMM de la invención proporcionan medios efectivos, relativamente seguros, para estimular una respuesta inmune robusta en un huésped vertebrado contra cualquier antígeno.
B. Conjugados ISS-PN/IMM: Estructura y preparación 1. Estructura raíz del ISS-PN
La base ISS-ODN de los conjugados ISS-PN/IMM de la invención incluye un oligonucleótido, el cual podría ser parte de una construcción nucleotídica mayor, tal como un plásmido. Por tanto, el término "polinucleótido" incluye los oligonucleótidos, los oligonucleótidos modificados, y los oligonucleósidos, solos o como parte de una construcción mayor. El polinucleótido podría ser ADN de hebra única (ADNss), ADN de doble hebra (ADNds), ARN de hebra única (ARNss), o ARN de doble hebra (ARNds).
La porción de polinucleótido puede estar configurada lineal o circularmente, o la porción oligonucleotídica puede contener tanto segmentos lineales como circulares. Las modificaciones de los oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, las modificaciones de los grupos 3'OH o 5'OH, las modificaciones de las bases de los nucleótidos, las modificaciones del componente azúcar, y las modificaciones del grupo fosfato.
La base oligonucleotídica de los conjugados ISS-PN/IMM podría comprender ribonucleótidos (que contienen ribosa como el único o principal componente azúcar), desoxiribonucleótidos (la desoxiribosa es el principal componente azúcar), o, de acuerdo con el estado de la técnica establecida, podrían incorporarse azúcares modificados o análogos de azúcares en el oligonucleótido de la presente invención. Por tanto, además de la ribosa y desoxiribosa, la porción azúcar podría ser pentosa, desoxipentosa, hexosa, desoxihexosa, glucosa, arabinosa, xilosa, lixosa, y un grupo ciclopentilo "análogo" de azúcar. El azúcar podría estar en forma de piranosil o de furanosil. En los oligonucleótidos modificados de la presente invención, el grupo azúcar es preferiblemente el furanósido de ribosa, desoxiribosa, arabinosa, o 2'-O-metilribosa, y el azúcar podría unirse a las bases heterocíclicas respectivas en la configuración anomérica I ó J. La preparación de estos azúcares o análogos de azúcares, y los respectivos "nucleósidos" en donde tales azúcares o análogos están unidos a la base heterocíclica (base del ácido nucleico) se conoce por sí misma, y no es necesario describirla aquí, excepto hasta el punto en que tal preparación podría pertenecer a cualquier ejemplo específico.
El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) al cual podría unirse la porción azúcar o análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente invención podría ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosfotioato, fosforoditioato, o similares. La preparación de los análogos de fosfato mencionados más arriba, y su incorporación en los nucleótidos, nucleótidos modificados, y oligonucleótidos, es también conocida por sí misma y no necesita ser descrita aquí.
Las bases heterocíclicas, o bases de ácidos nucleicos, las cuales se incorporan en las bases oligonucleotídicas de los conjugados ISS-PN/IMM, podrían ser las principales bases purínicas y pirimidínicas que ocurren de forma natural, (a saber, uracilo o timidina, citosina, adenina y guanina, tal como se ha mencionado más arriba), así como modificaciones que ocurren de forma natural y sintéticamente de dichas bases principales. Los especialistas en la técnica reconocerán que un número elevado de nucleósidos "sintéticos" no naturales, que comprenden varias bases heterocíclicas y varios grupos azúcares (y análogos de azúcares), han pasado a estar disponibles en la técnica previa, de tal forma que la base oligonucleotídica de los conjugados ISS-PN/IMM podría incluir una o varias bases heterocíclicas distintas de las cinco bases principales que son componentes de los ácidos nucleicos que existen de forma natural. No obstante, preferiblemente, la base heterocíclica en la base del oligonucleótido de los conjugados ISS-PN/IMM se selecciona de entre los grupos uracil-5-ilo, citosin-5-ilo, adenin-7-ilo, adenin-8-ilo, guanin-7-ilo, guanin-8-ilo, 4-aminopirrolo [2,3-d] pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirolo [2,3-d] pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirrolo [2,3-d] pirimidin-5-ilo, en donde las purinas es unen a las porciones azúcares de los oligonucleótidos en la posición 9, las pirimidinas a través la posición 1, la pirrolopirimidinas a través de la posición 7, y la pirazolopirimidinas a través de la posición 1.
Estructuralmente, la raíz oligonucleotídica del componente ISS-PN del ISS-PN/IMM es una secuencia no codificante, la cual podría incluir al menos un motivo CpG no metilado. La posición relativa de cualquier secuencia CpG en el ISS-PN con actividad inmunoestimulante en ciertas especies de mamíferos (por ejemplo, roedores) es la 5'-CG-3' (es decir, la C está en la posición 5' respecto la G en la posición 3'). El PN/IMM puede obtenerse convenientemente sustituyendo la citosina en el dinucleótido CpG con otro nucleótido: una sustitución particularmente útil es con una guanina para formar PN conteniendo el dinucleótido GpC.
Se conocen algunos oligonucleótidos ISS (ISS-ODN). En tales ISS-ODN, el motivo CpG está flanqueado por al menos dos nucleótidos de purina (por ejemplo, GA o AA) y al menos dos nucleótidos de pirimidina (5'-purina-purina-[C]-[G]-pirimidina-pirimidina-3'). Se cree que los ISS-ODN que contienen el motivo CpG estimulan la proliferación de los linfocitos B (ver, por ejemplo, Krieg et al., Nature 374:546-549 (1995)).
La estructura hexamérica del núcleo de los ISS-PN precedentes podría estar flanqueada cadena arriba y/o cadena abajo por cualquier número o composición de nucleótidos o nucleósidos. Sin embargo, los ISS-PN tienen al menos una longitud de 6 bases, y preferiblemente tienen entre 6 y 200 bases de longitud, para mejorar la captación del ISS-PN/IMM en los tejidos diana. Aquéllos con formación ordinaria en la técnica estarán familiarizados con, o podrán identificar fácilmente, secuencias nucleotídicas descritas de ISS-ODN conocidos para referencia en la preparación de ISS-PN. Para facilitar la referencia en este sentido, son especialmente útiles las siguientes fuentes:
Yamamoto, et al., Microbiol. Immunol. 36:983 (1992)
Ballas, et al., J. Immunol. 157:1840 (1996)
Klinman, et al., J. Immunol. 158:3635 (1997)
Sato, et al., Science 273:352 (1996)
Cada uno de estos artículos ilustra el nivel de conocimiento en la técnica concerniente a la composición de nucleótidos de ISS-ODN conocidos.
En particular, los ISS-PN y PN útiles en la invención incluyen aquéllos que tienen las siguientes secuencias nucleotídicas hexaméricas:
1.
para los ISS-PN, los hexámeros que tienen motivos "CpG" o, para los PN, los hexámeros que tienen motivos XpY, en donde X no puede ser C su Y es G, y viceversa; y
2.
las sustituciones de nucleótidos por inosina y/o uracilo en las secuencias hexaméricas anteriores, para su uso como ISS-ODN de ARN.
Por ejemplo, los ISS-PN de ADN útiles en la invención incluyen aquéllos que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos hexaméricas:
AACGTT, AGCGTC, GACGTT, GGCGTT, AACGTC,
GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC,
AGCGCT, GACGCT, GGCGCT, TTCGAA.
Los ISS-PN basados en ARN útiles en la invención incluyen aquéllos que tienen las siguientes secuencias de nucleótidos hexaméricas:
AACGUU, AACGpI, AACGpC, AGCGUC, AGCGpI, AGCGpC,
GACGCU, GACGCpI, GACGCpC, GACGUU, GACGpI, GACGpC,
GACGUC, GACGpI, GACGpC, y poli(I\cdotC).
El ISS-PN podría incluir o no regiones palindrómicas. Si está presente, un palíndromo podría extenderse sólo hasta un motivo CpG, si está presente, en la secuencia hexamérica del núcleo, o podría abarcar más de la secuencia hexamérica así como de las secuencias nucleotídicas flanqueadoras.
Además, las modificaciones del grupo fosfato del esqueleto (por ejemplo, enlaces entre nucleótidos con metilfosfonato, fosforotioato, fosforoamidato y fosforoditioato) pueden conferir actividad antimicrobiana al ISS-PN y mejorar su estabilidad in vivo, haciéndolos especialmente útiles en aplicacions terapéuticas. Una modificación del grupo fosfato particularmente útil es la conversión a las formas fosforotioato o fosforoditioato del ISS-PN. Además de sus propiedades potencialmente antimicrobianas, los fosforotioatos y fosforoditioatos son más resistentes a la degradación in vivo que sus contrapartidas oligonucleotídicas no modificadas, haciendo los ISS-PN/IMM de la invención más disponibles para el huésped.
2. IMM parejas del conjugado
La base oligonucleotídica del conjugado ISS-PN/IMM está conjugada con un IMM, el cual incluye un antígeno y podría contener además un agente inmunomodulador. Un "antígeno" es una sustancia que es reconocida y unida específicamente por un anticuerpo o un receptor de antígeno de la célula T. Los antígenos incluyen péptidos, proteínas, glicoproteínas y polisacáridos, incluyendo porciones de los mismos y combinaciones de los mismos. Los antígenos pueden ser los hallados en la naturaleza o pueden ser sintéticos.
El término "inmunomodulador" tal como se usa en ésta incluye los efectos inmunoestimulantes así como los inmunosupresores. Los efectos inmunoestimulantes incluyen, pero no se limitan a, aquéllos que directa o indirectamente mejoran las respuestas inmune celular o humoral. Los ejemplos de efectos inmunoestimulantes incluyen, pero no se limitan a, producción incrementada de anticuerpo específico contra el antígeno; activación o proliferación de una población de linfocitos, tal como las células NK, los linfocitos T CD4+, los linfocitos T CD80, los macrófagos, y similares; así como una síntesis incrementada de citoquinas inmunoestimulantes asociadas con Th1, incluyendo, pero no limitándose a, IL-6, IL-12, IL-18, IFN-\alpha, \beta y \gamma, TNF-\alpha, y similares. Los efectos inmunosupresores incluyen aquéllos que directa o indirectamente disminuyen las respuestas inmunes celulares o humorales.
Los ejemplos de efectos inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a, una reducción en la producción de anticuerpos específicos contra el antígeno, tal como la producción reducida de IgE; la activación de linfocitos u otras poblaciones celulares que tienen actividades inmunosupresoras, tales como las que resultan en tolerancia inmune; y la síntesis incrementada de citoquinas que tienen efectos supresores sobre ciertas funciones celulares. Un ejemplo de esto es el IFN-\gamma, el cual puede bloquear el cambio de clase inducido por la IL-4 hacia IgE e IgG1, reduciendo por tanto los niveles de estas subclases de anticuerpos.
Por tanto, un "agente inmunomodulador" apropiado para su uso como pareja del conjugado para ISS-PN/IMM puede ser un péptido, tal como un antígeno o citoquina. Cuando la pareja del conjugado ISS-PN/IMM es un péptido, los péptidos apropiados incluyen los péptidos nativos purificados, los péptidos sintéticos, las proteínas recombinantes, los extractos de proteína crudos, los virus atenuados o desactivados, las células, los microorganismos, o los fragmentos de tales péptidos.
Los antígenos proteicos que pueden servir como IMM pareja del conjugado proceden de una amplia variedad de fuentes, incluyendo los alérgenos tales como los pólenes de plantas, las proteínas de ácaros en el polvo, las escamas de animales, la saliva, las esporas de hongos, así como los microorganismos infecciosos. Los ejemplos de estos últimos incluyen los virus atenuados o desactivados, tales como el HIV-1, HIV-2, el de la hepatitis, el herpes simplex, el rotavirus, el virus de la polio, el virus del sarampión, el virus del papiloma humano y bovino, y los virus cerebrales lentos. Para la inmunización contra la formación de tumores, el conjugado puede incluir células tumorales (vivas o irradiadas), extractos de células tumorales, o subunidades de proteínas de antígenos tumorales. Las vacunas para la anticoncepción inmunobasada pueden formarse incluyendo proteínas del esperma como la porción peptídica del conjugado.
Entre las citoquinas apropiadas para su uso como componentes del IMM pareja del conjugado, están las interleukinas (IL-1, IL-2, IL-3, etc.), los interferones (por ejemplo, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma), la eritropoyetina, los factores estimuladores de colonias (por ejemplo, G-CSF, M-CSF, GM-CSF) y el TNF-\alpha.
Los IMM parejas del conjugado pueden incluir también secuencias de aminoácidos que median la unión de proteínas a un receptor específico, o que median el apuntamiento contra un tipo celular o tejido específico. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos; hormonas peptídicas, tales como la hormona del crecimiento humana; y enzimas. Las moléculas co-estimuladoras, tales como la B7 (CD80), las proteínas trans-activadoras, tales como los factores de transcripción, las quimioquinas tales la proteína quimiotáctica del macrófago (MCP), y otros péptidos quimioatractores o quimiotácticos, son también parejas del conjugado útiles basadas en péptidos.
Más específicamente, los antígenos apropiados para su uso como pareja del conjugado ISS-PN/IMM incluyen cualquier molécula capaz de conjugarse con un oligonucleótido y elicitar una respuesta de células B o células T específica para el antígeno. Preferiblemente, los antígenos elicitan una respuesta específica para el antígeno. Una amplia variedad de moléculas son antígenos. Estas incluyen, pero no se limitan a, azúcares, lípidos, autacoides y hormonas, así como macromoléculas tales como los carbohidratos complejos y los fosfolípidos. La moléculas pequeñas podrían necesitar haptenización con objeto de hacerlas antigénicas.
Preferiblemente, los antígenos son péptidos, polisacáridos (tales como los polisacáridos capsulares usados en las vacunas de Haemophilus influenza), gangliósidos y glicoproteínas. El antígeno podría ser un antígeno intacto o un(os) epítopo(s) para célula T del antígeno. Estos pueden obtenerse a través de diversos procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo el aislamiento y la síntesis usando procedimientos químicos y enzimáticos. En ciertos casos, tales como para muchos esteroles, ácidos grasos y fosfolípidos, las porciones antigénicas están disponibles comercialmente.
Se conocen, y están disponibles, muchos péptidos y proteínas antigénicas en la técnica; otros pueden identificarse usando técnicas convencionales. Los ejemplos de antígenos conocidos incluyen, pero no se limitan a:
a.
Alérgenos tales como los principales alérgenos de ácaros en el polvo Der pI y Der pII (ver, Chua, et al., J. Exp. Med. 167:175-182 (1988); y, Chua, et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129 (1990), los péptidos del epítopo para células T del alérgeno Der pII (ver, Joost van Neerven, et al., J. Immunol. 151:2326-2335 (1993), el altamente abundante Antígeno E (Amb aI) del alérgeno del polen de ambrosía (ver, Rafnar, et al., J. Biol. Chem. 266:1229-1236 (1991), el alérgeno de la fosfolipasa A_{2} (veneno de abeja) y los epítopos para células T en el mismo (ver, Dhillon, et al., J. Allergy Clin. Immunol. 90:42-51 (1992), el polen del abedul blanco (Betvl) (ver, Breiteneder, et al., EMBO 8:1935-1938 (1989), el alérgeno principal Fel dI del gato doméstico (ver, Rogers, et al., Mol. Immunol. 30:559-568 (1993), el polen de árbol (ver, Elsayed et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31 (1991) y el polen de la hierba (ver, Malley, J. Reprod. Immunol. 16:173-86 (1989)).
b.
Microorganismos vivos, atenuados o desactivados, tales como el virus de la polio (Jiang et al., J. Biol. Stand. 14:103-9 (1986)), cepas atenuadas del virus de la hepatitis A (Bradley et al., J. Med. Virol. 14:373-86 (1984)), virus del sarampión atenuados (James et al., N. Engl. J. Med. 332:1262-6 (1995)) y epítopos del virus de pertusis (por ejemplos, ACEL-IM-UNE® DTP acelular, Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics).
c.
Antígenos anticonceptivos tales como la proteína del esperma humano (Lea et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:263 (1996)).
Los datos de secuencias publicadas y los procedimientos para aislar y sintetizar los antígenos descritos en estos artículos ilustran el conocimiento en la técnica en relación a fuentes de antígenos útiles. Aquéllos con formación ordinaria en la técnica estarán familiarizados con, o pueden discernir fácilmente, la identidad de otros antígenos útiles para su uso como parejas del conjugado ISS-PN/IMM.
Los péptidos inmunoestimulantes particularmente útiles para su inclusión en el IMM son aquéllos que estimulan las respuestas inmunes de Th1, tales como la IL-12 (Bliss et al., J. Immunol. 156:887-894 (1996)), IL-18, INF-\alpha, \beta y \gamma, o TGF-\alpha. La conjugación de adyuvantes (tales como la hemocianina de la lapa de ojo de cerradura, KLH) al conjugado ISS-PN/IMM puede mejorar aún más la actividad de los conjugados ISS-PN/IMM de la invención.
Otros adyuvantes útiles incluyen la toxina del cólera, el procoleragenoide, la subunidad B de la toxina del cólera, y los polisacáridos de hongos, incluyendo, pero no limitándose a, el schizophyllan, el dipéptido muramil, los derivados del dipéptido muramil, los ésteres de forbol, las microesferas, los lisados bacterianos que no son de Helicobacter pylori, la toxina lábil de Escherichia coli, los polímeros de bloque, las saponinas, y los ISCOM. Para adyuvantes adicionales, aquéllos con formación ordinaria en la técnica podrían dirigirse a, por ejemplo, Azuma, I., "Synthetic Immunoadjuvants: Application to Non-Specific Host Stimulation and Potentiation of Vaccine Immunogenicity", Vaccine 10:1000 (1992); Pockley, A.G. y Montgomery, P.C., "In vivo Adjuvant Effect of Interleukins 5 and 6 on Rat Tear IgA Antibody Responses", Immunology 73:19-23 (1991); Adam, A. y Lederer, E., "Muramyl peptides as Immunomodulators" ISI ATLAS OF SCIENCE 205 (1988); Clements, J.D., et al., "Adjuvant Activity of Escherichia coli Heat-labile Enterotoxin and Effect on the Induction of Oral Tolerance in Mice to Unrelated Protein Antigens", Vaccine 6:269 (1988); Ben Ahmeida, E.T.S., et al., "Immunopotentiation of Local and Systemic Humoral Immune Responses by ISCOMs, Liposomes and FCA: Role in Protection Against Influenza A in Mice", Vaccine 11:1302 (1993); y Gupta, R.K. et al. "Adjuvants-A Balance Between Toxicity and Adjuvanticity" Vaccine 11:290-308 (1993).
Aquéllos con formación ordinaria en la técnica apreciarán que los componentes que no son antígeno del IMM descritos más arriba, también pueden administrarse en forma no conjugada con un conjugado ISS-PN/IMM (solamente antígeno). Por tanto, la co-administración de tales componentes también está abarcada por la invención.
C. Síntesis de conjugados de polinucleótidos 1. Porción del polinucleótido
El ISS-PN puede sintetizarse usando técnicas y equipamiento para la síntesis de ácidos nucleicos, los cuales son bien conocidos en la técnica. Para referencia en relación a esto, consultar, por ejemplo, Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 2 y 4 (Wiley Interscience, 1989); Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Nueva York, 1982); las patentes estadounidenses nº 4.458.066 y 4.650.675. Cuando se ensamblan enzimáticamente, las unidades individuales pueden ligarse con una ligasa, tal como la ligasa del ADN o ADN de T4, como se describe en, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.124.246. La degradación del oligonucleótido podría conseguirse a través de la exposición de un oligonucleótido a una nucleasa, como se ilustra en la patente estadounidense nº 4.650.675. Estas referencias se incorporan en ésta por referencia con el único propósito de demostrar el conocimiento en la técnica concerniente a la producción de polinucleótidos sintéticos. Puesto que el ISS-PN no es codificante, no hay preocupación por mantener una pauta de lectura abierta durante la síntesis.
Alternativamente, el ISS-PN podría aislarse a partir de especies microbianas (especialmente micobacterias) usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como la hibridación de ácidos nucleicos. Preferiblemente, tales ISS-PN aislados se purificarán hasta un estado sustancialmente puro; es decir, que estén libres de contaminantes endógenos, tales como lipopolisacáridos. Los ISS-PN aislados como parte de un polinucleótido mayor pueden reducirse a la longitud deseada mediante técnicas bien conocidas en la técnicas, tales como mediante digestión con endonucleasas. Aquéllos con formación ordinaria en la técnica estarán familiarizados con, o pueden averiguar fácilmente, las técnicas apropiadas para el aislamiento, purificación y digestión de polinucleótidos para obtener ISS-ON con uso potencial en la invención.
Los ISS-PN circulares pueden aislarse, sintetizarse a través de procedimientos recombinantes, o sintetizarse químicamente. Cuando el ISS-PN circular se obtiene a través del aislamiento o a través de procedimientos recombinantes, el ISS-PN preferiblemente será un plásmido. La síntesis química de oligonucleótidos circulares menores puede realizarse usando procedimientos de la literatura (Gao et al., Nucleic Acids Res. 23:2025-2029 (1995); Wang et al., Nucleic Acids Res. 22:2326-2333 (1994)).
El ISS-PN también puede contener oligonucleótidos modificados. Estos oligonucleótidos modificados pueden sintetizarse usando transformaciones químicas estándares. La construcción eficiente, basada en soporte sólido, de metilfosfonatos ha sido descrita. Agrawal et al., Tet. Lett. 28:3539-3542 (19). La síntesis de otros oligonucleótidos modificados basados en el fósforo, tales como los fosfotriésteres (Miller et al., JACS 93:6657-6665), fosforamidatos (Jager et al., Biochemistry 27:7247-7246), y fosforoditioatos (Patente estadounidense nº 5.453.496) también ha sido descrita. También pueden usarse otros oligonucleótidos modificados no basados en fósforo (Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17:6129-6141).
La preparación de nucleósidos modificados en la base, y la síntesis de oligonucleótidos modificados usando dichos nucleósidos modificados en la base como precursores, ha sido descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4.910.300, 4.948.882 y 5.093.232. Estos nucleósidos modificados en la base se han diseñado de forma que pueden ser incorporados mediante síntesis química en posiciones terminales o internas de un oligonucleótido. Tales nucleósidos modificas en la base, presentes en posiciones terminales o internas de un oligonucleótido pueden servir como sitios para la unión de un péptido u otro antígeno. Los nucleósidos modificados en su grupo azúcar también han sido descritos (por ejemplo, en las patentes estadounidenses nº 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, 5.118.802) y pueden usarse de forma similar.
Las técnicas para realizar modificaciones del grupo fosfato a oligonucleótidos son conocidas en la técnica y no requieren una explicación detallada. En una de tales técnicas, se prepara un intermediario fosfatotriéster para el producto oligonucleótido diana y se oxida al fosfatotriéster que ocurre de forma natural con yodo acuoso o con otros agentes, tales como aminas anhidras. Los fosforoamidatos de oligonucleótido resultantes pueden tratarse con sulfuro para rendir fosforotioatos. La misma técnica general (exceptuando el paso de tratamiento con sulfuro) puede aplicarse para rendir metilfosfoamiditos a partir de metilfosfonatos. Para más detalles concernientes a las técnicas de modificación de grupos fosfato, aquéllos con formación ordinaria en la técnica podría desear consultar las patentes estadounidenses nº 4.425.732, 4.458.066, 5.218.103 y 5.453.496, así como el Tetrahedron Lett. en 21:4149 (1995), 7:5575 (1986), 25:1437 (1984) y el Journal Am. Chem. Soc. 93:6657 (1987), los descubrimientos de los cuales ilustran el nivel de conocimiento estándar en la técnica concerniente a la preparación de estos compuestos.
2. Uniendo el componente PN al componente IMM
El componente ISS-PN podría unirse a la porción IMM del conjugado en una variedad de formas. El enlace puede hacerse en el extremo 3' o 5' del ISS-PN, o en una base convenientemente modificada en una posición interna del PN. Si el péptido contiene un grupo reactivo apropiado (por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimido), éste puede hacerse reaccionar directamente con el grupo amino N^{4} de los residuos de citosina. Dependiendo del número y ubicación de los residuos cisteína del ISS-PN, podría conseguirse el marcaje específico de uno o más residuos.
Alternativamente, los oligonucleósidos modificados, tal como se conocen en la técnica, pueden incorporarse en cualquier extremo, o en una posición interna del ISS-PN. Estos pueden contener grupos funcionales bloqueados, los cuales, cuando se desbloquean, son reactivos con una variedad de grupos funcionales, los cuales están presentes sobre, o unidos a, un péptido de interés.
La porción IMM del conjugado puede unirse al extremo 3' del ISS-PN a través de la química de soporte sólido. Por ejemplo, la porción ISS-PN puede añadirse a una porción polipeptídica que se ha sintetizado previamente sobre un soporte (Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 18:493-99 (1990); Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 18:501-505 (1990)). Alternativamente, el PN puede sintetizarse de tal forma que esté conectado a un soporte sólido a través de un eslabón cortable que se extiende desde el extremo 3'. A partir del corte químico del ISS-PN del soporte, se deja un grupo tiol terminal en el extremo 3' del ISS-PN (Zuckermann et al., Nucleic Acids Res. 15:5305-5321 (1987); Corey et al., Science 238:1401-1403 (1987)), o se deja un grupo amina terminal en el extremo 3' del PN (Nelson et al., Nucleic Acids Res. 17:1781-1794 (1989)). La conjugación del PN amino-modificado con los grupos amino del péptido puede realizarse tal como se describe en Benoit et al., Neuromethods 6:43-72 (1987). La conjugación del ISS-PN tiol-modificado con los grupos carboxilo del péptido puede realizarse tal como se describe en Sinah et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach (1991) IRL Press.
La porción IMM del conjugado puede unirse al extremo 5' del ISS-PN a través de una amina, un tiol, o un grupo carboxilo que ha sido incorporado en el ISS-PN durante su síntesis. Preferiblemente, mientras el ISS-PN está fijado sobre el soporte sólido, un grupo de enlace que comprende una amina, tiol o carboxilo protegido en un extremo, y un fosforamidito en el otro, se une covalentemente al 5'-hidroxilo (Agrawal et al., Nucleic Acids Res. 14:6227-6245 (1986); Connolly, Nucleic Acids Res. 13:4485-4502 (1985); Coull et al., Tetrahedron Lett. 27:3991-3994 (1986); Kremsky et al., Nucleic Acids Res 15:2891-2909 (1987); Connolly, Nucleic Acids Res. 15:3131-3139 (1987); Bischoff et al., Anal. Biochem. 164:336-344 (1987); Blanks et al., Nucleic. Acids Res. 16:10283-10299 (1988); patentes estadounidenses nº 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, y 5.118.802). A continuación de la desprotección, las funcionalidades amina, tiol y carboxilo latentes pueden usarse para unir covalentemente el PN a un péptido (Benoit et al., Neuromethods 6:43-72 (1987); Sinah et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach (1991) IRL Press.
Una porción peptídica puede unirse a una citosina o uracilo modificados en cualquier posición en el ISS-PN. La incorporación de un "brazo de enlace" que posee una funcionalidad reactiva latente, tal como un grupo amina o carboxilo, en el C-5 de la base modificada proporciona un asa para la unión del péptido (Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research, p. 123).
La unión del ISS-PN a un péptido puede formarse también a través de una interacción no covalente de elevada afinidad, tal como un complejo biotina-estreptoavidina. Por ejemplo, puede unirse un grupo biotinilo a una base modificada de un oligonucleótido (Roget et al., Nucleic Acids Res. 17:7643-7651 (1989)). La incorporación de un grupo estreptoavidina en la porción peptídica permite la formación un complejo unido no covalentemente del péptido conjugado con la estreptoavidina y el PN biotinilado.
La unión del ISS-PN a un lípido puede formarse usando procedimientos estándares. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la síntesis de conjugados oligonucleótido-fosfolípido (Yanagawa et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192 (1988)), de conjugados oligonucleótido-ácido graso (Grabarek et al., Anal. Biochem. 185:131-135 (1990); Staros et al., Anal. Biochem. 156:220-222 (1986)), y de conjugados oligonucleótido-esterol (Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)90:5728-5731 (1993)).
La unión del ISS-PN a un oligosacárido puede formarse usando procedimientos estándares conocidos. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la síntesis de conjugados oligonucleótidos-oligosacáridos, en donde el oligosacárido es una porción de una inmunoglobulina (O'Shannessy et al., J. Applied Biochem. 7:347-355
(1985)).
Los adyuvantes y citoquinas también podrían unirse genética o químicamente a los conjugados ISS-ODN. Los ejemplos de este tipo de péptido de fusión son conocidos por los especialistas en la técnica y pueden hallarse también en Czerkinsky et al., Infect. Immun. 57:1072-77 (1989); Nashar et al., Vaccine 11:235-40 (1993); y Dertzbaugh y Elson, Infect. Immun. 61:48-55 (1993).
La unión de un ISS-PN circular a un IMM puede formarse de varias formas. Cuando el PN circular se sintetiza usando procedimientos recombinantes o químicos, puede incorporarse un nucleósido modificado (Ruth, en Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (1991) IRL Press). A continuación puede usarse la tecnología de enlace estándar para conectar el ISS-PN circular al antígeno o péptido inmunoestimulante (Goodchild, Bioconjugate Chem. 1:165 (1990)). Cuando el ISS-PN se aisla, o sintetiza usando procedimientos recombinantes o químicos, el enlace podría formarse activando químicamente, o fotoactivando, un grupo reactivo (por ejemplo, un carbeno, un radical) que se ha incorporado en el antígeno o péptido inmunoestimulante.
Pueden hallarse procedimientos adicionales para la unión de péptidos y otras moléculas a los ISS-PN en C. Kessler: Nonradioactive labeling methods for nucleic acids en L.J. Kricka (ed.) "Nonisotopic DNA Probe Techniques," Academic Press, 1992, y en Geoghegan y Stroh, Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992).
D. Procedimientos y rutas para la administración de ISS-PN/IMM a un huésped 1. Suministro del fármaco
Los ISS-PN/IMM de la invención se administran a un huésped usando cualquier procedimiento disponible y ruta apropiada para suministrar el fármaco, incluyendo los procedimientos ex vivo (por ejemplo, administración de células incubadas o transfectadas con un ISS-PN/IMM), así como las rutas sistémicas o localizadas. No obstante, aquéllos con formación ordinaria en la técnica apreciarán que, en la mayoría de las circunstancias, se preferirán los procedimientos y rutas localizadas que dirigen el ISS-PN/IMM hacia el tejido sensible al antígeno, respecto a las rutas sistémicas de administración, tanto por la inmediatez del efecto terapéutico como por evitar la degradación in vivo.
El punto de entrada en un huésped para muchos antígenos exógenos es a través de la piel o mucosa. Por tanto, los procedimientos y rutas de administración que apuntan a la piel (por ejemplo, para condiciones cutáneas o subcutáneas) o mucosa (por ejemplo, para condiciones respiratorias, oculares, linguales o genitales) serán especialmente útiles. Aquéllos con formación ordinaria en las técnicas clínicas estarán familiarizados con, o pueden averiguar fácilmente, los medios para suministrar el fármaco en la piel o mucosa. No obstante, para una revisión, más abajo se discuten brevemente procedimientos y rutas ilustrativos de administración de fármacos útiles en la invención.
Los medios de administración intranasal son particularmente útiles para tratar la inflamación respiratoria nasal, particularmente la inflamación mediada por antígenos transmitidos desde las fosas nasales hacia la tráquea o bronquiolos. Tales medios incluyen la inhalación de suspensiones en aerosol o la insuflación de las composiciones de polinucleótido de la invención. Los dispositivos nebulizadores apropiados para suministrar las composiciones de polinucleótido a la mucosa nasal, traqueal y bronquiolos son bien conocidos en la técnica, y, por tanto, no serán discutidos aquí con detalle. Para una revisión general en relación a la administración intranasal de fármacos, aquéllos con formación ordinaria en la técnica podrían desear consultar Chien, Novel Drug Delivery Systems, capítulo 5 (Marcel Dekker,
1992).
Las rutas de administración dérmicas, así como las inyecciones subcutáneas, son útiles para tratar las reacciones alérgicas y las inflamaciones de la piel. Los ejemplos de medios para administrar fármacos a la piel son la aplicación tópica de una preparación farmacéutica apropiada, la transmisión transdérmica, la inyección, y la administración epidérmica.
Para las transmisión transdérmica, son procedimientos apropiados los promotores de absorción o la iontoforesis. Para una revisión en relación a tales procedimientos, aquéllos con formación ordinaria en la técnica podrían desear consultar Chien, ver más arriba, en el capítulo 7. La transmisión iontoforética podría conseguirse usando "parches" comercialmente disponibles, los cuales suministran su producto continuamente, mediante pulsos eléctricos, a través de la piel intacta durante períodos de varios días o más. El uso de este procedimiento permite la transmisión controlada de composiciones farmacéuticas en concentraciones relativamente elevadas, permite la infusión de drogas de combinación, y permite el uso simultáneo de un promotor de la absorción.
Un producto de parche de ejemplo para su uso en este procedimiento es el producto con nombre comercial LECTRO PATCH de General Medical Company de Los Angeles, CA. Este producto, electrónicamente mantiene los electrodos del depósito a pH neutro, y puede adaptarse para proporcionar dosis de diferentes concentraciones, para dosificar continuamente y/o para dosificar periódicamente. La preparación y uso del parche debería realizarse de acuerdo con las instrucciones impresas del fabricante que acompañan el producto LECTRO PATCH.
La administración epidérmica esencialmente implica irritar mecánica o químicamente la capa más externa de la epidermis de forma suficiente como para provocar una respuesta inmune contra el irritante. Un dispositivo de ejemplo para su uso en la administración epidérmica emplea una multiplicidad de tynes cortos, de diámetro muy pequeño, los cuales pueden usarse para introducir el ISS-PN/IMM que recubre los tynes al arañar la piel. El dispositivo incluido en el viejo ensayo de tuberculina MONO-VAC fabricado por Pasteur Merieux de Lyon, Francia, es apropiado para su uso en la administración epidérmica de ISS-PN/IMM. El uso del dispositivo es de acuerdo con las instrucciones escritas del fabricante incluidas con el dispositivo; estas instrucciones referidas al uso y administración ilustran el uso convencional del dispositivo. Los dispositivos similares que también podrían usarse en esta realización son aquéllos que se usan actualmente para realizar ensayos de alergia.
La administración oftálmica (por ejemplo, para el tratamiento de la conjuntivitis alérgica) implica la aplicación invasora o tópica de una preparación farmacéutica al ojo. Las gotas para ojos, las cremas tópicas, y los líquidos inyectables son todos ellos ejemplos de formas apropiadas para administrar fármacos al ojo.
La administración sistémica implica la administración tópica invasora o sistémicamente absorbida de preparaciones farmacéuticas. Las aplicaciones tópicas, así como las inyecciones intravenosas e intramusculares son ejemplos de medios comunes para la administración sistémica de fármacos.
2. Parámetros de dosificación
Una ventaja particular de los ISS-PN/IMM de la invención es su capacidad para ejercer su actividad inmunomoduladora incluso en dosis relativamente minúsculas. Aunque la dosificación usada variará dependiendo de los objetivos clínicos a conseguirse, un rango de dosis apropiado es uno que proporciona hasta aproximadamente 1-1000 \mug de ISS-PN/IMM/ml de portador en una única dosis. Alternativamente, puede considerarse que una dosis diana de ISS-PN/IMM es aproximadamente 1-10 \muM en una muestra de sangre del huésped extraída durante las primeras 24-48 horas posteriores a la administración del ISS-PN/IMM. En base a estudios actuales, se cree que los ISS-PN/IMM tienen poca o ninguna toxicidad a estos niveles de dosificación.
En relación a esto, debería destacarse que la actividad antiinflamatoria e inmunoterapéutica del ISS-PN/IMM de la invención es esencialmente dependiente de la dosis. Por tanto, para incrementar la potencia del ISS-PN/IMM en una magnitud de dos, cada dosis única debe doblarse en su concentración. Clínicamente, podría ser aconsejable administrar el ISS-PN/IMM en una dosis baja (por ejemplo, de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 50 \mug/ml), incrementar a continuación la dosis según se necesite para conseguir el objetivo terapéutico deseado.
A la luz de las enseñanzas proporcionadas por este descubrimiento, aquéllos con formación ordinaria en las técnicas clínicas estarán familiarizados con, o pueden averiguar fácilmente, los parámetros apropiados para la administración de los ISS-PN/IMM acordes con la invención.
3. Composiciones de ISS-PN/IMM
Los ISS-PN/IMM se prepararán en una composición farmacéuticamente aceptable para su administración a un huésped. Los portadores farmacéuticamente aceptables preferidos para su uso con el ISS-PN/IMM de la invención podrían incluir las soluciones estériles acuosas o no acuosas, las suspensiones y las emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y los ésteres orgánicos inyectables tales como el etiloleato. Los portadores acuosos incluyen el agua, las soluciones alcohólicas/acuosas, las emulsiones o suspensiones, incluyendo la solución salina y el medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen los regeneradores de fluidos y nutrientes, los regeneradores de electrólitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer), y similares. También podrían estar presentes los conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, los antimicrobianos, los antioxidantes, los agentes quelantes, y los gases inertes y similares. Una composición de ISS-PN/IMM también podría liofilizarse usando medios bien conocidos en la técnica, para su subsiguiente reconstitución y uso de acuerdo con la invención.
Los promotores de absorción, los detergentes y los agentes químicos irritantes (por ejemplo, los agentes queratinolíticos) pueden mejorar la transmisión de una composición de ISS-PN/IMM hacia un tejido diana. Para referencia concerniente a los principios generales relativos a la absorción de promotores y detergentes que se han usando exitosamente en la administración mucosal de fármacos orgánicos y basados en péptidos, consultar Chien, Novel Drug Delivery Systems, Ch. 4 (Marcel Dekker, 1992).
En particular, los ejemplos de promotores de la absorción nasal apropiados se detallan en Chien, ver más arriba, en el capítulo 5, tablas 2 y 3; son preferibles los agentes más suaves. Los agentes apropiados para su uso en el procedimiento de esta invención para administración mucosal/nasal se describen también en Chang, et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on Controlled Drug Delivery", capítulo 9 y tabla 3-4B del mismo, (Marcel Dekker, 1992). En Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Capítulo 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery" (Marcel Dekker, 1992), y en diferentes lugares del texto, se describen agentes apropiados, los cuales se sabe potencian la absorción de fármacos a través de la piel. Todas estas referencias se incorporan en ésta con el único propósito de ilustrar el nivel de conocimiento y capacitación en la técnica concerniente a las técnicas de administración de fármacos.
Un sistema de dispersión coloidal podría usarse para la administración dirigida del ISS-PN/IMM al tejido específico. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen los complejos de macromoléculas, las nanocápsulas, las microesferas, las cuentas, y los sistemas basados en lípidos, incluyendo las emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma.
Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Se ha mostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV), que oscilan en tamaño desde 0,2-4,0 \mum pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contenga macromoléculas grandes. El ARN, ADN y los viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso y administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77 (1981)). Además de a las células de mamífero, los liposomas se han usado para la administración de polinucleótidos en plantas, levaduras, y células bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia de genes eficiente, debe debería tener presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes que codifican los polinucleótidos antisentido con elevada eficiencia, a la vez que no se compromete su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula diana en comparación con células que no son diana; (3) suministro del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con elevada eficiencia; y (4) expresión precisa y efectiva de la información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682 (1988)).
La composición del liposoma es usualmente una combinación de fosfolípidos, particularmente de fosfolípidos con elevada temperatura de transición de fase, usualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También podría usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica, y de la presencia de cationes divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen los compuestos fosfatidilio, tales como el fosfatidilglicerol, la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina, la fosfatidiletanolamina, los esfingolípidos, los cerebrósidos, y los gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en donde la porción lipídica contiene de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono, y está saturada. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen la fosfatidilcolina de huevo, la dipalmitoilfosfatidilcolina, y la diestearoilfosfatidilcolina.
El apuntamiento de liposomas puede clasificarse en base a sus factores anatómicos y mecánicos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específico para un órgano, específico para una célula, y específico para un orgánulo. La apuntamiento mecánico puede distinguirse en base a si es pasivo o activo. El apuntamiento pasivo utiliza la tendencia natural de los liposomas para distribuirse a células del sistema reticulo-endotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales. El apuntamiento activo, por otra parte, implica la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico, tal como un anticuerpo monoclonal, un azúcar, un glicolípido, o proteína, o cambiando la composición o tamaño del liposoma con objeto de conseguir apuntar a órganos y tipos celulares distintos de los sitios de localización que ocurren de forma natural.
La superficie del sistema de suministro apuntado podría modificarse de diferentes formas. En el caso de un sistema de suministro liposómico apuntado, pueden incorporarse grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma con objeto de mantener el apuntamiento del ligando en asociación estable con la bicapa liposómica. Pueden usarse varios grupos de enlace bien conocidos para unir las cadenas lipídicas al ligando apuntador (ver, por ejemplo, Yanagawa, et al., Nuc. Acids Symp. Ser., 19:189 (1988); Grabarek, et al., Anal. Biochem., 185:131 (1990); Staros, et al., Anal. Biochem., 156:220 (1986) y Boujrad, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5728 (1993), los descubrimientos de los cuales se incorporan en ésta por referencia solamente para ilustrar el nivel estándar de conocimiento en la técnica concerniente a la conjugación de PN a lípidos). El suministro apuntado de ISS-PN/IMM puede conseguirse también mediante conjugación del ISS-PN/IMM a la superficie de vectores de expresión recombinante virales y no virales, a un antígeno u otro ligando, a un anticuerpo monoclonal o a cualquier molécula que tenga la especificidad de unión deseada.
La co-administración de un fármaco peptídico con un ISS-PN/IMM acorde con la invención podría conseguirse también mediante la incorporación del ISS-PN/IMM en cis o en trans en un vector de expresión recombinante (plásmido, cósmido, virus o retrovirus), el cual codifica cualquier proteína terapéuticamente beneficiosa suministrable mediante un vector de expresión recombinante. Si se desea la incorporación de un ISS-PN/IMM en un vector de expresión para su uso en la práctica de la invención, tal incorporación podría conseguirse usando técnicas convencionales, la cuales no requieren una explicación detallada para alguien con formación ordinaria en la técnica. No obstante, para revisión, aquéllos con formación ordinaria podría desear consultar Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, ver más arriba.
D. En busca de ISS-PN/IMM activos
La confirmación de que un compuesto particular tiene las propiedades de un ISS-PN/IMM útil en la invención puede obtenerse evaluando si el ISS-PN/IMM afecta la secreción de citoquinas y la producción de anticuerpo del isotipo IgG como se describe en la SECCIÓN A.I, más arriba. Los detalles de las técnicas in vitro utiles para realizar tal evaluación se proporcionan en los ejemplos; aquéllos con formación ordinaria en la técnica también conocerán, o podrán averiguar fácilmente, otros procedimientos para medir la secreción de citoquinas y la producción de anticuerpos, a la vez que los parámetros enseñados en ésta.
E. Equipos para su uso en la puesta en práctica de los procedimientos de la invención
La invención también proporciona equipos, para su uso en los procedimientos descritos más arriba. Tales equipos podrían incluir cualquiera o la totalidad de los siguientes: ISS-PN/IMM (conjugado o sin conjugar); un portador farmacéuticamente aceptable (podría mezclarse previamente con el ISS-PN/IMM) o una base de suspensión para reconstituir el ISS-PN/IMM liofilizado; medicamentos adicionales; un vial estéril para cada ISS-PN/IMM y medicamento adicional, o un único vial para las mezclas de los mismos; dispositivo(s) para su uso en el suministro de ISS-PN/IMM a un huésped; reactivos de ensayo para detectar indicios de que se han alcanzado, en los animales tratados, los efectos antiinflamatorios y/o inmunoestimulantes buscados, y un dispositivo de ensayo apropiado.
Los ejemplos que ilustran la práctica de la invención se detallan más abajo. Los ejemplos sólo tienen propósito de referencia, y no deberían considerarse como limitantes de la invención, la cual se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Todas las abreviaturas y términos usados en los ejemplos tiene su significado esperado y ordinario a menos que se especifique de otro modo.
Ejemplo I Inducción selectiva de una respuesta Th1 en un huésped después de la administración de un ISS-PN/IMM
En los ratones, los anticuerpos IgG 2A son marcadores serológicos de una respuesta inmune del tipo Th1, mientras que los anticuerpos IgG 1 son indicativos de una respuesta inmune del tipo Th2. Las respuestas Th2 incluyen la clase de anticuerpos IgE asociada con alergia; los antígenos de proteínas solubles tienden a estimular respuestas Th2 relativamente fuertes. Por contra, las respuestas Th1 son inducidas por la unión del antígeno a macrófagos y células dendríticas.
Para determinar qué respuesta, si alguna, se produciría en ratones que recibieran ISS-PN/IMM de acuerdo con la invención, se inmunizaron ocho grupos de ratones Balb/c con 10 \mug de proteína \beta-galactosidasa (conjugada con avidina; Sigma, St. Louis, MO) para producir un fenotipo alérgico modelo. Tal como se detalla en la tabla siguiente, algunos de los ratones recibieron antígeno solo, algunos recibieron un conjugado antígeno-ISS-PN o un conjugado usando un PN mutante, no estimulador, como conjugado del antígeno, y otros recibieron el antígeno en una mezcla no conjugada con un ISS-PN. Los ratones ingenuos se muestran por referencia:
Grupo de ratones Tratamiento con ISS-PN/IMM
1 Ninguno (vacunados con antígeno de \beta-gal)
2 conjugado DY1018-\betaGal (ISS/PN-IMM)
3 conjugado DY1019-\betaGal (PN/IMM)
4 DY1018 mezclado con \betaGal (sin conjugar)
5 \betaGal en adyuvante (alum)
6 ADN de plásmido (ISS-ODN presente pero no expresable con antígeno)
7 ratones ingenuos (sin cebado con antígeno)
DY1018 tiene la secuencia de nucleótidos:
5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'
con un esqueleto fosfotioato, y DY1019 tiene la secuencia de nucleótidos:
5'-TGACTGTGAAGGTTGGAGATGA-3'
con un esqueleto fosfotioato.
A intervalos de 2 semanas, se midieron cualesquiera IgG 2A e IgG 1 contra la \beta-galactosidasa, presentes en el suero de cada ratón, mediante ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (usando anticuerpos específicos para las subclases IgG 1 e IgG 2A) sobre placas de microvaloración recubiertas con el enzima.
Tal como se muestra en la Figura 1, tan sólo los ratones que recibieron el ISS-PN/IMM produjeron títulos elevados de anticuerpos IgG 2A, los cuales incrementaron en número a lo largo de un período de 8 semanas. Tal como se muestra en la Figura 2, la inmunización de los ratones con el propio antígeno o con el PN/IMM indujo la producción de títulos relativamente elevados de anticuerpos IgG. Los datos mostrados en las figuras comprenden los promedios de los valores obtenidos a partir de cada grupo de ratones.
Para evaluar el efecto del tratamiento de un huésped antes y después de un desafío con antígeno secundario, se inmunizaron 3 grupos de ratones Balb/c con 10 \mug de antígeno E (AgE) en alum para producir un fenotipo alérgico modelo y se desafiaron de nuevo con el antígeno, ISS-PN/IMM o PN mutante/IMM (no estimulador) a las 5 semanas después del cebado. Se realizó un ELISA para los anticuerpos IgG1 e IgG2a, tal como se ha descrito, 4 semanas después del cebado (una semana antes del desafío con antígeno secundario) y de nuevo a las 7 semanas (2 semanas después del desafío secundario).
De nuevo, los ratones que recibieron el ISS-PN/IMM generaron una intensa respuesta del tipo Th1 contra el antígeno (IMM) en comparación con los ratones inmunizados con el antígeno y con el PN mutante/IMM (Figura 3), mientras que lo contrario causó una respuesta del tipo Th21 en el mismo ratón (Figura 4).
Estos datos indican que se induce una respuesta Th1 selectiva mediante la administración de un ISS-PN/IMM acorde con la invención, a ambos, un huésped cebado con antígeno (desafío pre-antígeno) y uno desafiado con antígeno.
Ejemplo II Supresión de la respuesta de anticuerpo IgE contra el antígeno mediante inmunización con ISS-PN/IMM
Para demostrar la supresión de IgE conseguida a través de la estimulación de una respuesta inmune celular del tipo Th1 en preferencia a una respuesta inmune celular del tipo Th2, se inmunizaron ratones Balb/c de cinco a ocho semanas de edad con AgE, tal como se ha descrito en el ejemplo anterior.
Las IgE anti-AgE se detectaron usando un radioinmunoensayo en fase sólida (RAST) en una placa de polivinilo de 96 pocillos (una modificación radioisotópica del procedimiento de ELISA descrito en Coligan, "Current Protocols In Immunology", Unidad 7.12.4, volumen 1, Wiley & Sons, 1994), excepto que se usaron anticuerpos policlonales de cabra purificados específicos para cadenas \varepsilon de ratón en vez de anticuerpos específicos para Fab humanos. Para detectar el IgE anti-AgE, se recubrieron las placas con AgE (10 \mug/ml). La concentración de IgE más baja medible mediante el ensayo empleado fue de 0,4 ng de IgE/ml.
Midiendo específicamente las respuesta anti-antígeno por parte de cada grupo de ratones, tal como se muestra en la Figura 5, los niveles de IgE anti-AgE en los ratones inmunizados con ISS-PN/IMM fueron consistentemente bajos, tanto antes como después de la potenciación, mientras que los ratones inyectados con la proteína y el ISS-PN/IMM mutante desarrollaron niveles elevados de anti-AgE después del desafío con antígeno.
Estos datos muestran que los ratones inmunizados con ISS-PN/IMM desarrollaron una respuesta Th1 específica para el antígeno (suprimiendo la respuesta de IgE de Th2) contra el antígeno.
Ejemplo III Niveles de INF\gamma en ratones después de la administración de ISS-PN/IMM
Se inmunizaron ratones Balb/c con \betagal tal como se describe en el Ejemplo 1, y se sacrificaron a continuación 24 horas más tarde. Se recolectaron los esplenocitos procedentes de cada ratón.
Se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos con anticuerpo anti-CD3 (Pharmingen, La Jolla, CA) a una concentración de 1 \mug/ml de solución salina. El anticuerpo anti-CD3 estimula las células T liberando una señal química que imita los efectos de unirse al complejo del receptor de las células T (TCR). Se lavaron las placas y se añadieron esplenocitos en cada pocillo (4 \times 10^{5}/pocillo) en un medio de RPMI 1640 con un 10% de suero fetal bovino. Los sobrenadantes se obtuvieron a los días 1, 2 y 3.
Los niveles de citoquina de Th1 (INF\gamma) se ensayaron con un ensayo con anticuerpo anti-INF\gamma de ratón (ver, por ejemplo, Coligan, "Current Protocols in Immunology", unidad 6.9.5., volumen 1, Wiley & Sons, 1994). En ratones con un fenotipo Th2 se esperaría niveles relativamente bajos de INF-\gamma, mientras que se esperarían niveles relativamente elevados en ratones con un fenotipo Th1.
Tal como se muestra en la Figura 5, los niveles de secreción de INF-\gamma estimulados por Th1 incrementaron enormemente en los ratones tratados con ISS-PN/IMM, pero se redujeron sustancialmente en cada uno de los otros conjuntos de ratones (en comparación con el control), indicando el desarrollo de un fenotipo del tipo Th2 en los últimos ratones y de un fenotipo Th1 en los ratones tratados con ISS-PN/IMM.
Ejemplo IV Potenciación de las respuestas de CTL mediante ISS-PN/IMM
Se obtuvo una mezcla de linfocitos y se pusieron en contacto con antígeno \beta-gal solo o como parte de las construcciones y mezclas descritas en el Ejemplo I. Tal como se muestra en la Figura 6, la producción de CTL en respuesta al ISS-PN/IMM fue considerablemente mayor que la respuesta al antígeno suministrado en otras formas; incluso dos veces más intensa que en animales tratados con una mezcla no conjugada de ISS-PN y antígeno IMM.
En el experimento, los valores más elevados para los ratones tratados con M-ISS-PN/IMM después del desafío con antígeno, en comparación con los ratones inmunizados convencionalmente, lo más probable es que se deban a las propiedades como portador del DY1019.
Por tanto, la inmunidad a largo plazo mediada por las respuestas inmunes celulares se beneficia mediante el tratamiento acorde con la invención.

Claims (23)

1. Composición inmunomoduladora que comprende una molécula inmunomoduladora, en donde dicha molécula inmunomoduladora comprende un antígeno, en donde el antígeno está conjugado con un polinucleótido inmunoestimulante (ISS-PN), comprendiendo dicho ISS-PN al menos una secuencia inmunoestimulante (ISS) que comprende la secuencia no metilada 5'-citosina, guanina-3', en donde el ISS tiene al menos seis nucleótidos de longitud, en donde dicho ISS-PN tiene de 6 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, y en donde el antígeno se selecciona de entre un antígeno tumoral, un antígeno viral, un alérgeno o un microorganismo infeccioso.
2. Composición según la reivindicación 1, en donde el alérgeno se selecciona de entre el grupo que consiste en un alérgeno de polen de planta, una proteína de ácaro del polvo, un alérgeno de escama de animal, una alérgeno de saliva, y un alérgeno de espora de hongo.
3. Composición según la reivindicación 2, en donde el alérgeno es el antígeno E Amb aI, el antígeno del polen de ambrosía, o un antígeno de polen de árbol.
4. Composición de la reivindicación 1, en donde el antígeno viral es un antígeno de un virus seleccionado de HIV-1, HIV-2, un virus de la hepatitis, un virus del herpes simplex, un rotavirus, un virus de la polio, un virus del sarampión, y un virus del papiloma humano.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ISS comprende una secuencia palindrómica.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ISS comprende la secuencia 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina-3'.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ISS comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AACGTT, AGCGTT, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AACGCT, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT y TTCCGA.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ISS comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AACGTT, AGCGTT, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AACGCT, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT y TTCCGA, la cual está alterada por una sustitución con uracilo.
9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ISS comprende la secuencia TGACTGT
GAACGTTCGAGATGA.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polinucleótido comprende además una modificación del esqueleto en el fosfato.
11. Composición según la reivindicación 10, en donde la modificación del esqueleto en el fosfato es fosforotioato o fosforoditioato.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polinucleótido comprende además al menos un nucleótido modificado.
13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende además una molécula inmunoestimulante seleccionada del grupo que consiste en adyuvantes, hormonas, factores del crecimiento, citoquinas, quimioquinas, ligandos de proteínas de reconocimiento, y factores transactivadores.
14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además un agente antiinflamatorio.
15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polinucleótido es lineal.
16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el polinucleótido es circular.
17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno no está conjugado covalentemente al polinucleótido.
18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el antígeno está conjugado mediante un brazo de enlace con el C-5 de una citosina modificada o una base uracilo del polinucleótido.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la molécula inmunomoduladora está unida a un anticuerpo monoclonal.
20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su utilización en un procedimiento de tratamiento.
21. Utilización de una composición inmunomoduladora que comprende una molécula inmunomoduladora, en donde dicha molécula inmunomoduladora comprende un antígeno, en donde el antígeno está conjugado con un polinucleótido inmunoestimulante (ISS-PN), comprendiendo dicho ISS-PN al menos una secuencia inmunoestimulante (ISS) que comprende la secuencia no metilada 5'-citosina, guanina-3', para la fabricación de un medicamento destinado a potenciar una respuesta Th1 y/o suprimir una respuesta Th2 contra el antígeno, y/o reducir la producción de IgE estimulada por el antígeno.
22. Utilización según la reivindicación 21, en donde la molécula inmunomoduladora es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
23. Equipo que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
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