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Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, beispielsweise zur Verwendung zur Immunmodulation, insbesondere als Vakzine.
Impfstoffe können mehr Leben retten (bzw. Geld sparen) als irgendeine andere medizinische Intervention (Nossal, 1998) Auf Grund weltweiter Impfprogramme wurde das Auftreten vieler todlicher Erkrankungen drastisch reduziert. Obwohl dies für eine ganze Reihe von Krankheiten gilt, einschliesslich Tuberkulose, Diphtherie, Keuchhusten, Masern und Tetanus, gibt es für viele infekti- öse Erkrankungen, einschliesslich der meisten Virusinfektionen, wie AIDS, keine wirksamen Impfstoffe.
Auch für andere infektiöse oder nicht-infektiöse Erkrankungen, die jährlich Millionen von Patienten das Leben kosten, einschliesslich Malaria oder Krebs, gibt es keine wirksamen Impfstoffe Ausserdem verlangt die rapide Entwicklung von antibiotikaresistenten Bakterien und Mikroorganismen nach alternativen Behandlungen, wobei Impfstoffe eine logische Wahl darstellen Schliesslich wird der grosse Bedarf an Vakzinen auch durch die Tatsache veranschaulicht, dass Infektionskrankheiten und nicht Herz-Kreislauf-Störungen, Krebs oder Verletzungen die Hauptursache für Tod und Behinderung auf der Welt bleiben (Bloom und Widdus, 1998).
Vom immunologischen Standpunkt aus besteht ein Hauptproblem auf dem Gebiet der Vakzine darin, dass traditionelle Impfstoffe (und/oder die immunmodulierenden Verbindungen, die in diesen Präparaten enthalten sind) darauf ausgelegt sind, hohe Antikörperwerte hervorzurufen (Harlow und Lane, 1988).
Leider sind Antikörper alleine nicht dahingehend wirksam, viele Krankheiten zu verhindern, einschliesslich die meisten Krankheiten, die von Viren, intrazellulären Bakterien, gewissen Parasiten und Krebs verursacht werden Beispiele für solche Krankheiten sind das oben genannte HIV-Virus oder Plasmodium spec im Fall von Malaria In zahlreichen experimentellen Systemen ist gezeigt worden, dass fur diese Indikationen der zelluläre Arm des Immunsystems, einschliesslich T-Zellen, eher wichtig ist als der humorale Arm Daher werden neue, innovative Technologien benötigt, um diese Einschränkungen herkömmlicher Impfstoffe zu überwinden. Das Hauptaugenmerk muss dabei auf Technologien liegen, die verlässlich das zelluläre Immunsystem anregen, einschliesslich antigenspezifische T-Zellen, die auf pathogeninfizierten Zellen expnmierte Molekule erkennen.
Idealerweise werden Impfstoffe entwickelt, die sowohl T-Zellen, die erkrankte und/oder infizierte Zellen von normalen Zellen unterscheiden, als auch gleichzeitig Antikörper induzieren, die von B-Zellen sekretiert werden, die Pathogene in extrazellulären Bereichen erkennen
Mehrere etablierte Impfstoffe bestehen aus lebenden, abgeschwächten Organismen, wobei das Risiko einer Reversion in den virulenten Wildtyp-Stamm besteht. Dies kann insbesondere bei immunkompromittierten Wirten eine lebensbedrohliche Situation darstellen. Alternativ werden Vakzine als eine Kombination von Pathogen-derivierten Antigenen zusammen mit Verbindungen verabreicht, die Immunantworten gegen diese Antigene auslösen oder verstärken (diese Verbindungen werden üblicherweise als Adjuvans bezeichnet), da diese Untereinheits-Vakzine selbstandig im Allgemeinen nicht wirksam sind.
Obwohl kein Zweifel daran besteht, dass die obigen Vakzine eine wertvolle medizinische Behandlung darstellen, haben sie den Nachteil, dass sie infolge ihrer Komplexität schwere Nebenwirkungen hervorrufen können, beispielsweise infolge von in der Vakzine enthaltenen Antigenen, die eine Kreuzreaktivität mit Molekülen, welche von Zellen geimpfter Individuen exprimiert werden, aufweisen. Ausserdem ist es schwierig, bestehenden Anforderungen seitens regulierender Behörden, z.
B. der Weltgesundheitsorganisation (WHO), der Food and Drug Administration (FDA) und ihren europäischen Gegenstücken zur genauen Spezifizierung der Vakzine-Zusammensetzung und der Mechanismen zur Herbeiführung der Immunität zu entsprechen
Einige Vakzine, die in weitverbreiteter Verwendung sind, sind in Tabelle 1 klassifiziert:
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<tb> Vakzine-Kategorie <SEP> Beispiel
<tb> Ganze <SEP> Zelle
<tb> Abgeschwächte <SEP> Bakterien <SEP> oder <SEP> Viren <SEP> Bacille <SEP> Calmette-Guerin
<tb> (BCG) <SEP> (Tuberkulose)
<tb> Masern
<tb> Mumps
<tb> Röteln
<tb> Orales <SEP> Polio-Vakzin <SEP> (Sabin)
<tb>
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<tb>
<tb> Vakzine-Kategorie. <SEP> Beispiel
<tb> Abgetotete <SEP> Bakterien <SEP> oder <SEP> Viren <SEP> Keuchhusten
<tb> Inaktiviertes <SEP> Polio-Vakzin
<tb> (Salk)
<tb> Untereinheit
<tb> Toxoid <SEP> Diphtene
<tb> Tetanus
<tb> Kapselformiges <SEP> Polysaccharid <SEP> H <SEP> influenzae <SEP> Typ <SEP> B
<tb> Hefe-rekombinante <SEP> Untereinheit <SEP> Hepatitis <SEP> B <SEP> Surface-Protein
<tb>
Aus (Liljeqvist und Stahl, 1999), mit Modifikationen
Ein Vakzin kann eine ganze Vielfalt verschiedener Antigene enthalten.
Beispiele für Antigene sind im ganzen abgetötete Organismen, wie inaktivierte Viren oder Bakterien, Pilze, Protozoen oder sogar Krebszellen Antigene können auch aus Subfraktionen dieser Organismen/Geweben, Proteinen oder in ihrer einfachsten Form Peptiden bestehen. Antigene können vom Immunsystem auch in Form von glykosylierten Proteinen oder Peptiden erkannt werden und konnen auch Polysaccharide oder Lipide sein oder diese enthalten Kurze Peptide können verwendet werden, da zum Beispiel zytotoxische T-Zellen (CTL) Antigene in Form von kurzen, üblicherweise 8-11 Aminosauren langen Peptiden in Verbindung mit dem Major Histocompatibility Complex (MHC) erkennen (Rammensee et al , Immunogenetics 41 (1995), 178-228) B-Zellen erkennen längere Peptide, beginnend bei etwa 15 Aminosäuren (Harlow et al ,
Cold Spnng Harbor Cold Spnng Harbor Laboratory (1988)) Im Gegensatz zu den T-Zellen-Epitopen kann die dreidimensionale Struktur der B-Zellen-Antigene auch für das Erkennen durch Antikörper wichtig sein Um länger anhaltende, antigenspezifische Immunantworten zu erhalten, müssen Adjuvantien Immunkaskaden steuern, um alle notwendigen Zellen des Immunsystems einzubinden.
Pnmar wirken Adjuvantien auf sogenannte Antigen-prasentierende Zellen (antigen presenting cells, APCs), sind jedoch in ihrem Wirkungsmodus nicht darauf beschränkt Diese Zellen treffen üblicherweise zuerst auf das (die) Antigen(e), wonach Immuneffektorzellen prozessiertes oder nicht modifiziertes Antigen präsentiert wird Intermediärzelltypen konnen ebenfalls beteiligt sein Bei einer produktiven Immunantwort werden nur Effektorzellen mit der passenden Spezifitat aktiviert Das Adjuvans kann auch Antigene und andere gemeinsam injizierte Faktoren lokal zurückhalten. Ausserdem kann das Adjuvans als chemischer Anziehungspunkt für andere Immunzellen fungieren oder lokal und/oder systemisch als Stimulans für das Immunsystem wirken.
Antigen-präsentierende Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem, das sich als erste Wirts-Verteidigungslinie entwickelt hat, die die Infektion schon bald nach der Einwirkung von Mikroorganismen begrenzt (Hoffmann et al., 1999) Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen Muster oder relativ unspezifische Strukturen, die auf ihren Zielen exprimiert sind, eher als hoher entwickelte spezifische Strukturen, die durch das adaptive Immunsystem erkannt werden (Hoffmann et al., 1999) Beispiele fur Zellen des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen und Dendntenzellen, aber auch Granulozyten (z.
B Neutrophile), natürliche Killerzellen und andere Im Gegensatz dazu erkennen Zellen des adaptiven Immunsystems spezifische Antigen-Strukturen, einschliesslich Peptide, im Falle der T-Zellen und Peptide sowie dreidimensionale Strukturen im Falle der B-Zellen. Das adaptive Immunsystem ist viel spezifischer und höher entwickelt als das angeborene Immunsystem und verbessert sich nach wiederholter Einwirkung eines bestimmten Pathogens/Antigens Vom phylogenetischen Standpunkt aus ist das angeborene Immunsystem viel älter und ist bereits bei sehr primitiven Organismen auffindbar Trotzdem ist das angeborene Immunsystem während der Anfangsphase der Antigen-Einwirkung von kritischer Bedeutung, da Zellen des angeborenen Immunsystems (d. h.
APC), ausser, dass sie Pathogene enthalten, die Zellen des adaptiven Immunsystems initiieren, und daher eine spezifische Immunantwort auslösen, die zur Beseitigung der Eindringlinge führt. Insgesamt spielen die Zellen des angeborenen Immunsystems und insbesondere die APCs eine kritische Rolle während der Einleitungsphase der Immunantwort, indem sie a) Infektionen mittels eines primitiven Mustererkennungssystems in Schach halten und b) Zellen des adaptiven Immunsystems "pnmen", was zu spezifischen Immunantworten und einem Immungedächtnis führt und in der Beseitigung eindringender Pathogene oder anderer
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Ziele resultiert (Roitt et al., 1998).
Diese Mechanismen können auch zur Beseitigung oder zum ImSchach-Halten von Tumorzellen wichtig sein
Wie zuvor erwähnt, erkennen Zellen des angeborenen Immunsystems Muster, die auf ihren jeweiligen Zielen expnmiert sind Beispiele sind Lipopolysaccharide (LPS) im Falle von Gramnegativen Bakterien, mycobakterielle Glykolipide, Lipoteichomsauren von Gram-positiven Bakterien, Mannane von Hefe und doppelsträngige RNAs von Viren (Hoffmann et al., 1999).
Ausserdem können sie Muster, wie die veränderten Glykosylierungen von Proteinen auf Tumorzellen, erkennen
Jüngste Erkenntnisse beschreiben die DNAs von Protozoen oder niedrigen Eukaryonten als ein weiteres Muster, das vom angeborenen (aber möglicherweise auch vom adaptiven) Immunsystem der Säuger (und vermutlich der meisten, wenn nicht allen Vertebraten) erkannt wird (Kneg, 1996 ; Lipford et al., 1998)
Das Immunsystem erkennt DNA niedriger Organismen, einschliesslich Bakterien, vermutlich infolge von strukturellen und Sequenz-Verwendungs-Unterschieden zwischen dem Pathogen und der Wirts-DNA.
Insbesondere kurze Stücke der DNA, die von nicht-Vertebraten stammen oder in Form von kurzen Oligodesoxynukleotiden (ODNs), die nicht-methylierte Cytosin-Guanin-Dinukleo- tide (CpG) in einem bestimmten Basen-Kontext enthalten, werden angepeilt (Kneg et al., 1995) CpG-Motive findet man mit der erwarteten Häufigkeit in Bakterien-DNA, jedoch viel weniger haufig in Vertebraten-DNA (Lipford et al., 1998, Pisetsky, 1999) Ausserdem sind Nicht-Vertebraten- (d.
h Baktenen)-CpG-Motive nicht methyliert, wogegen Vertebraten-CpG-Sequenzen dies sehr wohl sind Diese Unterschiede zwischen Baktenen-DNA und Vertebraten-DNA ermöglichen es den Vertebraten, Nicht-Vertebraten-DNA zu erkennen
Natürliche CpG-enthaltende DNA, ODNs, sowie Thiophosphat-substituierte (Austausch des Phosphats gegen Thiophosphat-Reste) ODNs, die CpG-Motive enthalten (CpG-ODN), sind nicht nur starke Aktivatoren der Immunzellproliferation und humoraler Immunantworten (Kneg et al , 1995), sondern stimulieren auch starke Immunantworten der Zellen (zusammengefasst in (Lipford et al., 1998)). DNA/ODNs, die nicht-methylierte CpG-Motive enthalten, konnen monozytische Zellen (Dendriten-Zellen, Makrophagen) und B-Zellen direkt aktivieren.
Vermutlich werden natürliche Killer-(NK)-Zellen nicht direkt aktiviert, sondern antworten auf von Monozyten stammendes IL-12 (Interleukm 12) mit einer deutlichen Steigerung ihrer IFN-y-Produktion (Chace et al., 1997) In der Folge fördert die Induktion von Monozyten und NK-Zellen durch CpG-DNA die Induktion von Antworten des Th1-Typs und die Entwicklung zytotoxischer T-Zellen.
Dendriten-Zellen, die während der pnmaren Immunantworten wichtige Antigen-prasentierende Zellen darstellen, reifen in vitro unter dem Einfluss von CpG-ODN (Hartmann et al., 1999, Sparwasser et al , 1998) und bilden grosse Mengen an IL-12, TNF-a, IL-6 und in geringerem Ausmass IL-10 (Klinman et al , 1996 ; Sparwasser et al , 1998), wenn sie diesen Verbindungen ausgesetzt werden Somit ist eine charakteristische Wirkung von Bakterien-DNA und CpG-ODNs die Induktion von humoralen und zellvermittelten Antworten vom Th1-Typ auf Protein-Antigene, welche durch das spezifische Cytokm-Muster gekennzeichnet ist (Mosmann et al., 1986).
ODNs, die CpG-Motive enthalten, wurden als Vakzin-Adjuvantien bei Mäusen verwendet, um beispielsweise die Antikorper-Reaktion auf ein Tetanus-Vakzin (Kneg et al , 1998) zu verbessern oder um eine starke, antigenspezifische Th1-Cytokin-Antwort in einem Versuchsmodell der Virus-Infektion zu fördern (Oxenius et al., 1999) CpG-DNA wird auch als starkes Adjuvans für Antikörper und zytotoxische TLymphozyten (CTL) -Antworten gegen Hepatitis B-Virus-Antigene beschrieben (Davis et al., 1998) Die Induktion starker Th1-Cytokin- und CTL-Reaktionen weist darauf hin, dass CpG-ODN auch für Krebs-Vakzine unter Verwendung von Tumor-Antigenen nützlich sein kann Erste veröffentlichte Daten zeigen, dass Mäuse, die mit dem Idiotyp aus einem B-Lymphom in Kombination mit einem CpG-ODN als Adjuvans immunisiert wurden, längere Überlebenszeiten aufwiesen (Weiner et al.,
1997)
.
Obwohl CpG ODNs oder nicht-methylierte DNA, die CpG-Motive enthält, potentiell sehr starke Adjuvantien sind, hat diese Technologie jedoch auch eine negativere Seite (Pisetsky, 1997). Beispielsweise wurde berichtet, dass hohe Dosen von Bakterien-DNA, die nicht-methylierte CpG-Motive enthält, unter bestimmten Umständen septischen Schock auslösen können (Sparwasser et al.,
1997). Dies ist wahrscheinlich auf übermässige Mengen an Cytokinen, insbesondere TNP-a, aber auch andere, die nach Einwirkung von CpG-ODN oder von Bakterien-DNA von Zellen sekretiert
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werden, zurückzuführen (Sparwasser et al , 1997). Baktenen-DNA und ODN können auch die Ursache für entzundliche Prozesse sein, die eine häufige Komplikation bei Infektionen der Lunge sind (Schwartz et al., 1997).
Weiters wird vermutet, dass frühe Gentherapie-Versuche, bei welchen formulierte oder nicht-formulierte Plasmid-DNA, die nicht-methylierte CpG-Motive enthielt, an die Lunge von Patienten mit cystischer Fibrose verabreicht wurde, infolge starker entzundlicher Prozesse fehlschlugen, von welchen es sich zeigte, dass sie durch CpG-Motive verursacht worden waren (Paillard, 1999;
Yew et al , 1999) CpG-Sequenzen, die in Plasmid-DNA enthalten sind, scheinen auch fur den Tod von Tieren nach intravenöser Injektion von Plasmid-DNA, die mit Liposomen formuliert war, verantwortlich zu sein (Paillard, 1999) Schliesslich entwickeln Tiere, die hohen Konzentrationen von CpG ODN ausgesetzt sind, Arthritis-Symptome, die vermutlich auf entzündliche Prozesse zurückzufuhren sind, welche durch ODN verursacht wurden (Deng et al , 1999)
Insgesamt streichen diese Berichte Nachteile von ODN-Adjuvantien hervor, die umgangen werden können, wenn die Menge der fur ein Vakzin zu verwendenden ODNs wesentlich verringert werden kann.
Es hat sich gezeigt, dass polykationische Polymere, zum Beispiel die polykationischen Amino-
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von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) mit Antigenen gestatten (Buschle et al , Gene Ther Mol. Biol 1 (1998), 309-321, Buschle et al., Proc Natl Acad Sei. USA 94 (1997), 3256-3261, Schmidt et al., Proc. Natl Acad Sc@ USA 94 (1997), 3262-3267). Es wird angenommen, dass dies das Schlüsselereignis für das Auslösen von Immunkaskaden ist, die schliesslich zur Induktion antigenspezifischer Immuneffektorzellen fuhren, die in der Lage sind, Ziele zu zerstoren oder zu neutralisieren (Fig 1) Es zeigte sich schon früher, dass eine Reihe von polykationischen Verbindungen Wirkungen auf Immunzellen ausüben (Buschle et al., Gene Ther.
Mol Biol 1 (1998), 309- 321, Buschle et al., Proc Natl Acad Sci USA 94 (1997), 3256-3261).
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senden Antigen als Vakzin schutzt die Tiere in mehreren Tiermodellen vor Tumorwachstum (Buschle et al , Gene Ther. Mol. Biol 1 (1998), 309-321, Schmidt et al., Proc Natl Acad. Sci USA 94 (1997), 3262-3267).
Ein Vakzin bestehend aus polykationischen Verbindungen und Antigen(en) wird daher auf diesem Fachgebiet als sehr wirkungsvolle Form der Behandlung akzeptiert
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht dann, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die eine wirksame Abgabe an eine Zielzelle, insbesondere an das zelluläre Immunsystem, jedoch auch an andere Zelltypen gestattet, um starke Immunantworten zu mduzieren Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Mittel zur Verringerung oder sogar Ablation von Immunreaktionen zur Verfugung zu stellen
Dieses Ziel wird mittels einer pharmazeutischen Zusammensetzung erreicht, die umfasst - ein Antigen, - immunogene Oligodesoxynukleotide (ODNs), welche CpG-Motive enthalten, und - polykationische Polymere
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Kombination des immunogenen ODN,
das auch einen chemotaktischen oder die Differenzierung auslosenden Faktor als immunstimulierende Substanz inkludieren kann, und des polykationischen Polymers mit einem Antigen gemäss der vor-
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Antigenpräparat führt Die Kombination des Antigens, immunogenen ODN und polykationischen Polymers ermöglichte die Erzeugung von Vakzinen, die im Vergleich zu Vakzinen bestehend aus immunogenem ODN und Antigen oder Antigen und polykationischem Polymer, überlegen sind in der Tat wurde dies sogar bei suboptimalen Mengen der immunogenen ODNs beobachtet Obwohl bekannt war, dass solche ODNs sowie die polykationischen Polymere auf dem Gebiet (sowie viele andere Substanzen, für welche ein Adjuvans-Effekt berichtet wurde) starke Faktoren bei AntigenPräparationen darstellen, zeigt die Kombination dieser Substanzen eine Wirkung,
die weit besser ist als nur die Kombination der einzelnen, isolierten Wirkungen der Verbindungen. Im Gegensatz zu anderen Kombinationen verschiedener Klassen von Adjuvantien, wo - zumindest - nur additive Wirkungen (soferne überhaupt) festgestellt werden, zeigte die Selektion der polykationischen Polymere und der immunogenen ODNs bei einer kombinierten Anwendung zusammen mit einem Antigen eine unvorhersehbare Steigerung der Wirksamkeit bei der Immunantwort auf ein ausge-
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wahltes Antigen Auf synergistische Weise ermöglichen die immunogenen ODNs und die polykationischen Polymere eine sehr effiziente zelluläre Immunantwort sowie eine immunmodulierende Wirkung, die eine überlegene Impfperspektive ermöglicht Erfindungsgemasse polykationische Polymere sind Verbindungen,
die als Endprodukt die Aktivierung (oder Nieder-Regulierung) des adaptiven Immunsystems ermöglichen Bei einer bevorzugten Form wird die Aktivierung des adaptiven Immunsystems durch APCs (einschliesslich Dendriten-Zellen) vermittelt Zu diesen Verbindungen zählen polykationische Polymere oder Wirts-Verteidigungspeptide oder Defensine, die bei einer bevorzugten Form positiv geladen sind.
Die in den vorliegenden Zusammensetzungen zu verwendenden Antigene sind nicht kritisch Vorzugsweise werden als solche Antigene Proteine oder Peptide, abgeleitet von einem viralen oder bakteriellen Pathogen oder von Pilzen oder Parasiten, verwendet (einschliesslich denvatisierte Antigene oder glykosylierte oder lipidierte Antigene oder Polysacchande oder Lipide) Eine weitere bevorzugte Quelle für Antigene sind Tumor-Antigene Bevorzugte Pathogene sind ausgewählt aus Human-Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis A- und B-Viren, Hepatitis-C-virus (HCV), Rous-Sarkoma-Virus (RSV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Influenzavirus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobactenum tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp (PI falciparum, Pl.
vivax etc ), Aspergillus sp oder Candida albicans Antigene können auch Moleküle sein, die von Krebszellen expnmiert werden (Tumor-Antigene) Das Derivationsverfahren kann die Reinigung eines spezifischen Proteins vom (von) Pathogen/Krebszellen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteolytische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins beinhalten.
Ebenso konnen auch Tumorantigene (Krebsvakzine) oder Autoimmunantigene in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden Mit solchen Zusammensetzungen kann eine Tumonmpfung oder eine Behandlung fur Autoimmunerkrankungen durchgeführt werden
Im Falle von Peptid-Antigenen ist die Verwendung von Peptid-Mimitopen/Agonisten/Superago- nisten/Antagonisten oder Peptiden, die in bestimmten Positionen verandert sind, ohne die immunologischen Eigenschaften oder Nicht-Peptid-Mimitope/Agonisten/Superagonisten/Antagonisten zu beeinflussen (Sparbier und Waiden, 1999) in der vorliegenden Erfindung mit einbezogen PeptidAntigene konnen auch Verlängerungen entweder am Carboxy- oder am Amino-Terminus des Peptid-Antigens enthalten, die die Wechselwirkung mit der (den)
polykationischen Verbindung(en) oder der (den) immunstimulierenden Verbindung (en) erleichtern. Zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen können Peptid-Antagonisten angewendet werden.
Antigene konnen auch derivatisiert werden, um Molekule zu umfassen, die die AntigenPräsentation und das Targeting von Antigenen auf Antigen-prasentierende Zellen verstarken.
Bei einer Ausfuhrungsform der Erfindung dient die pharmazeutische Zusammensetzung dazu, eine Verträglichkeit gegenüber Proteinen oder Proteinfragmenten und Peptiden, die bei Autoimmunerkrankungen eine Rolle spielen, zu verleihen Antigene, die in diesen Ausführungsformen verwendet werden, dienen dazu, das Immunsystem tolerant zu machen oder die Immunantworten gegen Epitope, die bei Autoimmunprozessen eine Rolle spielen, abzuschwächen.
Das immunogene ODN kann prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs sein Im Falle eines eukaryontischen Ursprungs sollte die DNA - bezogen auf den phylogenetischen Stammbaum - von einer weniger entwickelten Spezies (z B Insekten, aber auch anderen) stammen Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das immunogene ODN ein synthetisch erzeugtes DNA-Molekül oder Mischungen solcher Moleküle. Derivate oder Modifikationen von ODNs, wie Thiophosphat-substituierte Analoga (Thiophosphatreste substituieren das Phosphat), wie beispielsweise in den US-Patenten US 5,723,335 und US 5,663,153 beschrieben, und andere Derivate und Modifikationen, die vorzugsweise die immunstimulatonsche(n) Zusammensetzung (en) stabilisieren, jedoch nicht ihre immunologischen Eigenschaften ändern (z. B. Sparbier und Waiden, 1999), sind ebenfalls mit umfasst.
Ein bevorzugtes Sequenz-Motiv ist ein Sechs-Basen-DNA-Motiv, das ein (unmethyliertes) CpG-Dinukleotid, flankiert von zwei 5'-Punnen und zwei 3'-Pyrimidinen (5'-PurPur-CG-Pyr-Pyr-3') enthält (Pisetsky, 1999). Diese sogenannten CpG-Motive sind in MikrobenDNA üblicher als in der DNA höherer Vertebraten und weisen Unterschiede im Methylierungsmuster auf (Bird, A. P., Nature 1986, 321:209; Pisetsky, D.S., Immunol. Res. 1999,19 (1):35-46) (Lipford et al , 1998). Überraschenderweise sind Sequenzen, die Mäuse-APCs stimulieren, für
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Human-Zellen nicht sehr effizient (Hartmann et al., 1999, Krieg, 1999) Nützliche ODN-Sequenzen zur Anwendung am Menschen werden derzeit bestimmt (Hartmann et al., 1999, Krieg, 1999). Diese und zukunftige ODNs sind in der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Abgesehen von der Stimulierung des Immunsystems, neutralisieren bestimmte ODNs Immunantworten (Krieg, 1999, Lipford et al., 1998) Diese Sequenzen sind auch in der vorliegenden Erfindung mit umfasst, beispielsweise zur Anwendung fur die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. ODNs/DNAs können chemisch oder rekombinant hergestellt werden oder aus natürlichen Quellen stammen Bevorzugte natürliche Quellen sind Insekten.
Die gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendende(n) polykationische(n) Verbindung(en) kann (können) jede polykationische Verbindung sein, die die charakteristische Wirkung gemäss WO 97/30721 zeigt Bevorzugte polykationische Verbindungen sind ausgewählt aus basischen Polypeptiden, organischen Polykationen, basischen Polyaminosauren oder Mischungen davon Diese Polyaminosäuren sollten eine Kettenlange von mindestens 4 Aminosäureresten haben (siehe Tuftsm, wie beschrieben in Goldman et al (1983)) Besonders bevorzugt sind Substanzen wie Polylysin, Polyarginin und Polypeptide, die mehr als 20%, insbesondere mehr als 50% basische Aminosäuren in einem Bereich von mehr als 8, insbesondere mehr als 20 Ammosaureresten aufweisen,
oder Mischungen davon Andere bevorzugte Polykationen und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in WO 97/30721 (z B Polyethylenimin) und WO 99/38528 beschrieben
Diese polykationischen Verbindungen konnen chemisch oder rekombinant hergestellt werden oder aus natürlichen Quellen stammen
Kationische (Poly)peptide konnen auch antibakteriell (mikrobiell) sein mit Eigenschaften, wie in Ganz und Lehrer, 1999 ; undHancock, 1999, zusammengefasst Antimikrobielle Peptide, die katio- nisch oder nicht kationisch sind, konnen Teil der Erfindung sein (Andreu und Rivas, 1998, Simmaco et al , 1998) Diese (Poly)peptide konnen prokaryontischen oder tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein oder chemisch oder rekombinant erzeugt sein (Andreu und Rivas, 1998, Ganz und Lehrer, 1999 ;
et al , 1998) Peptide können auch zur Klasse der Defensine gehoren (Ganz, 1999 ; und Lehrer, 1999) Sequenzen solcher Peptide können beispielsweise im Antimicrobial Sequences Database unter der folgenden Internet-Adresse gefunden werden
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Solche Wirts-Verteidigungspeptide oder Defensive sind auch eine bevorzugte Form des polykationischen Polymers gemäss der vorliegenden Erfindung.
Im Allgemeinen wird eine Verbindung, die als Endprodukt eine Aktivierung (oder Schwächung) des adaptiven Immunsystems ermöglicht, vorzugsweise vermittelt durch APCs (einschliesslich Dendriten-Zellen) als polykationisches Polymer verwendet Polykationische Verbindungen, die von natürlichen Quellen stammen, schliessen HIV-REV oder HIV-TAT (abgeleitete kationische Peptide, Antennapedia-Peptide, Chitosan oder andere Derivate von Chitin) oder andere Peptide ein, die von diesen Peptiden oder Proteinen durch biochemische oder rekombmante Herstellung abgeleitet sind Andere bevorzugte polykationische Verbindungen sind Cathelin oder mit Cathehn verwandte oder von diesen abgeleitete Substanzen Beispielsweise ist Mause-Cathelin ein Peptid,
das die Aminosauresequenz NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH aufweist Cathelm-verwandte oder von diesem abgeleitete Substanzen enthalten die ganze oder Teile der Cathelin-Sequenz mit mindestens 15-20 Aminosäureresten Diese Ableitungen konnen die Substitution oder Modifikation der natürlichen Aminsosäuren durch Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standard-Aminosäuren
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eingeführt werden.
Bevorzugt sind diese Cathelinmoleküle mit dem Antigen und dem immunogenen ODN gemäss der vorliegenden Erfindung vereinigt Überraschenderweise zeigte es sich jedoch, dass diese Cathehnmolekule auch als Adjuvans für ein Antigen ohne Zugabe weiterer Adjuvantien wirksam sind Es ist daher möglich, solche Cathelinmoleküle als wirksame Adjuvantien in
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Es war äusserst überraschend, dass mit der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung die immunstimulierende Wirkung signifikant höher war als von der Addition der Wirkungen jeder einzelnen Komponente oder auch der Addition der Wirkungen des Polykations mit dem Antigen und des immunogenen ODN mit dem Antigen zu erwarten gewesen wäre.
Weiters stellte sich heraus, dass die Wirkung des immunogenen ODN alleine nicht sehr gross ist, wenn ein
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Antigen direkt mit dieser Substanz angewendet wird Dies gilt insbesondere dann, wenn die Verbindungen nicht wiederholt verabreicht werden Es ist sehr wichtig, dass eine Kombination der Verbindungen es ermöglicht, weniger des immunogenen ODN zu verwenden, was dazu beitragen kann, Nebenwirkungen zu vermeiden (siehe oben).
Gemass einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Vakzine, die eine Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der Zusammensetzung gemass der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Vakzins
Die relativen Mengen der Inhaltsstoffe der vorliegenden Zusammensetzung hängen sehr stark von den Erfordernissen der einzelnen Zusammensetzung ab, z B dem zu verwendenden polykationischen Polymer.
Bei Poly-L-arginin und Poly-L-lysm liegen die bevorzugten Mengen von Antigen/immunogenem ODN/immunsuppressiver Verbindung Polykation im Bereich von 1-10000 g Antigen pro Impfung, 1pM - 1 mM immunogenem ODN pro Dosis, und 0,1 bis 1000 g Polykation pro Impfung
Die vorliegenden Zusammensetzungen können einem Patienten, z B einem Impfkandidaten, in wirksamen Mengen z B.
in wöchentlichen, 2-wöchigen oder monatlichen Intervallen verabreicht werden Mit den vorliegenden Zusammensetzungen zu behandelnde Patienten können auch wiederholt oder nur einmal geimpft werden Eine bevorzugte Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die aktive Immunisierung, insbesondere von Menschen oder Tieren ohne Schutz gegen das spezifische Antigen
Der Verabreichungsweg für die vorliegende Zusammensetzung ist nicht kritisch, subcutane, intramuskulare, intradermale oder transdermale Injektion z B ist genauso geeignet wie die orale Einnahme Die Adaption der vorliegenden Erfindung an einen solchen Weg der Anwendung wird vom Fachmann leicht vorgenommen
Es ist auch möglich, die vorliegende Zusammensetzung separat zu verabreichen, z B. durch Injektion der immunogenen ODN getrennt von der Antigen/Polykation-Zusammensetzung.
Die vorliegende Erfindung ist daher auch auf ein Set gerichtet, das eine Zusammensetzung, die das Antigen und das polykationische Polymer enthält, als eine Komponente und eine Zusammensetzung, die die immunogene ODN-Substanz enthalt, als zweite Komponente umfasst
Die Komponenten können an der selben Stelle oder zur selben Zeit verabreicht werden, eine Verabreichung an verschiedene Stellen, zu verschiedenen Zeiten oder fur unterschiedliche Zeitspannen ist jedoch ebenfalls möglich Es ist weiters auch möglich, die systemischen oder lokalen Verabreichungen der Zusammensetzung bzw. der Komponenten zu variieren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend eine ein immunogenes ODN enthaltende Komponente, eine ein polykationisches Polymer enthaltende Komponente, und eine ein Antigen enthaltende Komponente Vorzugsweise ist das Antigen bereits mit dem polykationischen Polymer gemischt vorgesehen
Genauere Details der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Beispielen und der Zeichnung beschrieben, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese besonderen Ausführungsformen beschränkt
Fig 1A und 1 B IFN-y-ELISPOT der Immunantwort gegen das OVA-Peptid SIINFEKL,
Fig. 2:
IFN-y-ELISPOT der Immunantwort gegen das vom Mause-Mastozytom P815 stammende Peptid P1A (Fig. 2A), das SCP-Peptid SYVPSAEQI (Fig. 2B), das LLO-Peptid GYKDGNEYI (Fig. 2C) und das OVA-Peptid ISQAVHAAHAEINE (Fig 2D);
Fig. 3- IFN-y-ELISPOT der Immunantwort gegen das MC1 R-Peptid WGPFFLHL ; und
Fig. 4 IFN-y-ELISPOT der Immunantwort gegen das OVA-Peptid SIINFEKL.
Fig. 5 Tumor-Nekrose Faktor a (TNF-a) im Serum (1 h nach Injektion) (A); Interlenkin-6 (IL-6) im Serum (1 h nach Injektion) (B)
BEISPIELE
Bei allen Versuchen wurden Thiophosphat-substituierte ODNs (wobei Thiophosphatreste das
Phosphat substituieren, nachstehend "Thiophosphat-substituierte Oligodesoxynukleotide" genannt) verwendet, da solche ODNs eine höhere Nuklease-Resistenz zeigen (Ballas et al., 1996 ; Krieg et
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al., 1995, Parronchi et al , 1999).
Lymphknoten wurden durch ein 70 m Zellsieb durchgeleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL), das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden auf 107 Zellen/ml in DMEM/5%FCS eingestellt IFN-y-ELISPOT-Tests wurden im Duplikat, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995), durchgeführt Diese Methode ist eine weitverbreitet verwendete Vorgangsweise, die die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermoglicht Die Lymphozyten wurden ex vivo im Duplikat mit Medium (Hintergrund) pR60, CpG-ODN und Concanavalin A (Con A), stimuliert Spots, die einzelne, IFN-y-produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezahlt, und die Anzahl der Hintergrund-Spots wurde von allen Proben abgezogen Nach der Stimulation mit Con A wurden viele Spots nachgewiesen (Daten nicht gezeigt),
was auf einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten hinweist
Beispiel 1: Die kombinierte Anwendung von CpG-ODN und Poly-L-arginin (pR 60) verstärkt sehr die Induzierung von Ovalbumin-Peptid-spezifischen T-Zellen in konzentra- tions(pR 60) -abhängiger Weise.
Mäuse C57B1/6 (Harlan/Olac)
Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse 1- (H-2Kb)-eingeschränktes
Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al , 1991), wurde unter Ver- wendung von Standard-Festphasen-F-moc-Synthese synthetisiert, HPLC- gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert
Dosis 300 g/Maus
Poly-L-argi-
EMI8.1
Argininresten;
SIGMA Chemicals
Dosis 1000,100 oder 10 ug/Maus CpG-ODN 1668 Thiophosphat-substituierte ODNs, die ein CpG-Motiv enthielten TCC ATG
ACG TTC CTG ATG CT, von NAPS GmbH, Göttingen, synthetisiert
Dosis 5 nMol/Maus Non-CPG-ODN 1911 Mit Phosphothioaten modifizierte Oligodinukleotide, die kein CpG-Motiv ent- hielten TCC AGG ACT TTC CTC AGG TT, von NAPS GmbH, Göttingen, synthetisiert
Dosis 5 nMol/Maus Versuchsgruppen (5 Mäuse pro Gruppe)
EMI8.2
2 OVA257.264-Peptid + CpG-ODN + pR 60 1000 g
EMI8.3
4 OVA257-264-Peptid + CpG-ODN + pR 60 10 g
EMI8.4
9 OVA257.264-Peptid + pR 60 1000 g
EMI8.5
Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen eine Injektion gegeben, mit einem Gesamtvolumen von 100 l (50 l pro Pfotenballen),
die die oben genannten Verbindungen enthielten. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getotet, und die poplitealen Lymphknoten wurden gesammelt Die Lymphknoten wurden durch ein 70 m-Zellsieb durchgeleitet und zweimal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL), das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt, gewaschen Die Zellen wurden in DMEM/5%FCS auf 107 Zellen/ml eingestellt. Der IFN-y-
<Desc/Clms Page number 9>
ELISPOT-Test wurde im Duplikat, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995), durchgeführt Dieses Verfahren ist eine weitverbreitet verwendete Vorgangsweise, die die Quantifizierung der antigenspezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo in Duplikaten mit Medium (Hintergrund), pR 60, CpG-ODN und Concanavalin A (Con A) stimuliert.
Es wurden die Spots gezählt, die einzelne IFN-y-erzeugende T-Zellen repräsentierten, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen Nach der Stimulation mit Con A wurden viele Spots nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), was auf einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten hinweist. Für jede Versuchsgruppe von Mausen ist die Anzahl von Spots/1x106Zellen in den Fig 1A und 1B veranschaulicht.
Beispiel @ 2: Die gemeinsame Anwendung von CpG-ODN und Poly-L-arginin verbes- sert sehr die Induktion von T-Zellen, die spezifisch sind für ein von einem Mastocytom stammendes Peptid, ein von einem Circumsporozoit-stammendes Peptid, ein von einem
Listeriolysin stammendes Peptid und ein Peptid, das von einem Ovalbumin mit einge- schränkter MHC-Klasse II stammt.
Mause DBA/2 (Harlan/Olac)
Peptide a Von Mäuse-Mastocytom P815 stammendes Peptid P1A (LPYLGWLVF), eingeschränkt auf MHC-Klasse I (H2-Ld) (Lethe et al , 1992) b CSP-Peptid (SYVPSAEQI), das vom Circumsporozoit-Protein von Plas- modium Yoelii (Rodngues et al , 1992) stammt, engeschrankt auf MHC
Klasse I (H2-Kd) c LLO-Peptid (GYKDGNEYI), das von Listeriolysin 0 91-99 von Listeriaa monocytogenes stammt (Pamer et al , 1991),eingeschränkt auf MHC-
Klasse I (H2-Kd).
d OVA323-336-Peptid (ISQAVHAAHAEINE), das von Hühner-Ovalbumin stammt, eingeschränkt auf MHC-Klasse II (I-Ad) (Shimonkevitz et al., 1984)
Alle Peptide wurden mittels Standard-Festphasen-F-moc-Synthese syntheti- siert, HPLC-gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analy- siert
Dosis 300 g/Maus
Poly-L-argi- @in 60 (pR60) Poly-L-arginin mit einem durchschnittlichen Polymensierungsgrad von 60 Argininresten, SIGMA Chemicals
Dosis 100 g/Maus
CpG-ODN 1668 Thiophosphat-substituierte ODNs, die ein CpG-Motiv enthielten TCC ATG
ACG TTC CTG ATG CT, synthetisiert von NAPS GmbH, Göttingen
Dosis 5 nMol/Maus
Non-CpG-ODN
1911 Thiophosphat-substituierte ODNs,
die kein CpG-Motiv enthielten TCC AGG
ACT TTC CTC AGG TT, synthetisiert von NAPS Göttingen GmbH
Dosis 5 nMol/Maus
Versuchsgruppen (5 Mause pro Gruppe)
1 P1A-Peptid + CpG-ODN+ pR 60 100 g
2. P1A-Peptid + Non-CpG-ODN + pR 60 100 g
3. P1A-Peptid + CpG-ODN
4 P1A-Peptid + pR 60 100 g
5. CSP-Peptid + CpG-ODN + pR 60 100 g
6. CSP-Peptid + Non-CpG-ODN + pR 60 100 g
7 CSP-Peptid + CpG-ODN
8.
CSP-Peptid + pR 60 100 g
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
10 LLO-Peptid + Non-CpG-ODN + pR 60 100 g
11 LLO-Peptid + CpG-ODN
12 LLO-Peptid + pR 60 100 g
13 OVA-Peptid + CpG-ODN + pR 60 100 g
14 OVA-Peptid + Non-CpG-ODN + pR 60 100 g
15 OVA-Peptid + CpG-ODN
12 OVA-Peptid + pR 60 100 g
Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen eine Injektion gegeben, mit einem Gesamtvolumen von 100 l (50 l pro Pfotenballen), die die oben genannten Verbindungen enthielten Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden gesammelt Die Lymphknoten (Shimonkevitz et al , 1984) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, und IFN-y-ELISPOTS wurden hergestellt.
Für jede Versuchsgruppe von Mausen ist die Anzahl von Spots/1x106-Zellen in Fig 2A-D veranschaulicht
Beispiel I 3: Die gemeinsame Anwendung von CpG-ODN und Poly-L-arginin (pR 60) verbessert auf synergistische Weise die Immunantwort gegen MC1R (Melanozyten- stimulierender Hormonrezeptor)
Mause C57B1/6 (Harlan/Olac)
Peptid MC1R-Peptid (WGPFFLHL, F Mattner, nicht veröffentlicht), ein MHC-Klasse
EMI10.2
rezeptor (MC1 R), mittels Standard-Festphasen-F-moc-Synthese syntheti- siert, HPLC-gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analy- siert
Dosis 300 g/Maus Poly-L-argi-
EMI10.3
gminresten, SIGMA Chemicals Dosis 1000,100 oder 10 g/Maus
EMI10.4
CTG ATG CT, von NAPS Gottingen GmbH synthetisiert
Dosis 5 nmol/Maus
Versuchs.gruppen (3 Mause pro Gruppe)
1 MC1 R + CpG-ODN + pR
2 MC1 R + CpG-ODN
3 MC1 R + pR
Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen eine Injektion gegeben, mit emem Gesamtvolumen von 100 l (50 l pro Pfotenballen), die die oben genannten Verbindungen enthielten. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden gesammelt Die Lymphknoten und IFN-y-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschneben hergestellt Fur jede Versuchgsgruppe von Mäusen ist die Anzahl von Spots/1x106 Zellen in Fig 3 veranschaulicht, Standardabweichungen von ex vivo-stimulierten Tnplikaten wurden angegeben
Beispiel I 4: Die gemeinsame Anwendung von CpG-ODN und Poly-L-arginin (pR 60) induziert an verschiedenen Injektionsstellen eine starke Antigen-spezifische Immun- antwort gegen Ovalbumin-Peptid.
Mäuse C57B1/6 (Harlan/Olac)
EMI10.5
<Desc/Clms Page number 11>
Epitop von Hühner-Ovalbumm (Rotzschke et al , 1991),mittels Standard-
Festphasen-F-moc-Synthese synthetisiert, HPLC-gereinigt und durch Mas- senspektroskopie auf Reinheit analysiert
Dosis. 300 g/Manus Poly-L-argi-
EMI11.1
Argininresten, SIGMA Chemicals
Dosis. 100 g/Maus CpG-ODN 1668 Thiophosphat-substituierte ODNs, enthaltend ein CpG-Motiv TCC ATG
ACG TTC CTG ATG CT, synthetisiert von NAPS Göttingen GmbH
Dosis: 5 nMol/Maus Versuchsgruppen-(5 Mäuse pro Gruppe)-Injektionsstellen- 1.
Pfotenballen 2 s.c./Flanke 3 in die Ohrmuschel
EMI11.2
(Ovalbumin-Peptid + CpG-ODN + pR60), mit einem Gesamtvolumen von 100 l (50 l pro Pfotenballen), die die oben genannten Verbindungen enthielten Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getotet, und die drainagierten Lymphknoten wurden gesammelt Die Lymphknoten und IFN-y-ELISPOTs wurden in Tnplikaten (Standardabweichung ist angegeben), wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
Fur jede Versuchgsgruppe von Mausen ist die Anzahl von Spots/1x106 Zellen in Fig 4 veranschaulicht
Tabelle 2
Peptid-Antigene, die für Impfversuche verwendet wurden
EMI11.3
<tb>
<tb> Peptid <SEP> Sequenz <SEP> Quelle <SEP> eingeschränkt <SEP> Veröffentlichung
<tb> auf
<tb> OVA257-264 <SEP> SIINFEKL <SEP> Huhner-Ovalbumin <SEP> MHC-Klasse <SEP> I <SEP> (Rotzschke <SEP> et <SEP> al <SEP> , <SEP>
<tb> H2Kb <SEP> 1991)
<tb> P1A <SEP> LPYLGWLVF <SEP> Mäuse-Mastozytom <SEP> MHC-Klasse <SEP> @ <SEP> (Lethe <SEP> et <SEP> al,
<tb> P815 <SEP> H-2Kd <SEP> 1992)
<tb> CSP <SEP> SYVPSAEQI <SEP> Circumsporozoit- <SEP> MHC-Klasse <SEP> I <SEP> (Rodngues <SEP> et <SEP> al <SEP> , <SEP>
<tb> Protein <SEP> Plasmodium <SEP> H-2Kd <SEP> 1992)
<tb> yoelii
<tb> LLO <SEP> GYKDGNEYI <SEP> Listenolysin <SEP> MHC-Klasse <SEP> I <SEP> (Pamer <SEP> et <SEP> al <SEP> ,
<SEP>
<tb> Listeria <SEP> monocyto- <SEP> H2-Kd <SEP> 1991)
<tb> genes
<tb> OVA323-336 <SEP> ISQAVHAA <SEP> Hühner-Ovalbumin <SEP> MHC <SEP> Klasse <SEP> (Shimonkevitz
<tb> HAEINE <SEP> II, <SEP> I-Ad <SEP> et <SEP> al.,1984)
<tb> MC1 <SEP> R <SEP> WGPFFLHL <SEP> Melanozyten- <SEP> MHC <SEP> Klasse <SEP> F <SEP> Mattner
<tb> stimulierender <SEP> I, <SEP> H-2Kb <SEP> unveröffentl.
<tb>
Hormonrezeptor
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Beispiel I 5: Die gemeinsame Anwendung von CpG-ODN und Poly-L-arginin (pR 60) verhindert die Induktion von systemischer TNF-a und IL-6-Produktion.
Mause C57B1/6 (Harlan/Olac) Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL, ein MHC-Klasse I (H-2Kb)-emgeschränktes
Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991),mittels Standard-
Festphasen-F-moc-Synthese synthetisiert, HPLC-gereinigt und durch Mas- senspektroskopie auf Reinheit analysiert
Dosis. 300 g/Maus Poly-L-Argi-
EMI12.1
gininresten, SIGMA Chemicals
Dosis. 100 g/Maus CpG-ODN 1668 Thiophosphat-substituierte ODNs enthaltend ein CpG-Motiv TCC ATG ACG
TTC CTG ATG CT, synthetisiert von NAPS GmbH, Göttingen
Dosis.
5 nmol/Maus Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe) 1 OVA257-264-Peptid 2 pR60
EMI12.2
Mausen wurde in jeden Hinterpfotenballen eine Injektion gegeben, mit einem Gesamtvolumen von 100 l (50 l pro Pfotenballen), die die oben genannten Verbindungen enthielt Eine Stunde nach der Injektion wurde über die Schwanzvene Blut abgenommen und Serum hergestellt Die Menge an promflammatonschen Zytokinen (TNF-a und IL-6) in den Seren war durch die Verwendung von Zytokin-spezifischen ELISAs festgelegt
EMI12.3
<tb>
<tb> TNF-a-/IL-6 <SEP> in <SEP> Seren <SEP> /1 <SEP> h <SEP> nach <SEP> Injektion
<tb> Injektion <SEP> 245+
<tb> TNF-a <SEP> (pg/ml) <SEP> IL-6 <SEP> (pg/ml)
<tb> - <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> +pR(100g) <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> CpG <SEP> 1668 <SEP> (5nMol) <SEP> 171,5 <SEP> 33,1
<tb> CpG <SEP> 1668 <SEP> (5nMol)
<SEP> + <SEP> pR <SEP> (100 <SEP> g) <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
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PATENTANSPRÜCHE :
1 Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie - ein Antigen,
EMI14.1
- ein polykationisches Polymer umfasst.