DE69715857T2

DE69715857T2 - Verfahren zur cilia stimulierung

Info

Publication number: DE69715857T2
Application number: DE69715857T
Authority: DE
Inventors: Paul Vinson
Original assignee: Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: DE69715857D1; DK0910398T3; JP4256473B2; EP0910398B1; AU3040997A; GB9612164D0; WO1997047315A1; ES2184093T3; EP0910398A1; ATE224723T1; US6139860A; JP2000512289A; PT910398E

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Angiotensin II (Ang II) oder eines Analogons davon zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von Cilien, wie Eileitercilien und Cilien auf dem sekretorischen Epithel des Atemsystems. Insbesondere bezieht sie sich auf die Verwendung von Ang II oder eines Analogons davon zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung von Cilien, um dadurch zum Beispiel den Transport im Eileiter, besonders beim Menschen, zu fördern, was eine günstige Wirkung auf die Empfängnis zur Folge hat. Alternativ dazu kann das Medikament auch zur Behandlung von Zuständen der Atemwege, wie Asthma, Bronchitis oder Lungenentzündung, verwendet werden.
Angiotensin II ist ein Octapeptid, von dem gewöhnlich angenommen wird, dass es im Blut erzeugt wird, erstens durch die Wirkung von Renin, einem von der Niere sezernierten Enzym, auf Angiotensinogen, was zur Bildung der Decapeptid- Vorstufe, Angiotensin I, führt, und zweitens durch die Wirkung einer Dipeptidase, des "Angiotensin-konvertierenden Enzyms"; dieses Enzym wirkt auf Angiotensin I unter Bildung von Angiotensin II. Angiotensin II erfährt wiederum eine Hydrolyse durch eine Aminopeptidase unter Bildung des Heptapeptids Angiotensin III (Angiotensin 1-7).
Das Hormon Angiotensin II (Ang II) bildet eines Teil des Renin-Angiotensin- Systems, das dabei hilft, das Elektrolytgleichgewicht und den Blutdruck innerhalb des Körpers zu steuern. Es gibt mehrere Gewebe innerhalb des Körpers, auf die Ang II einwirkt, und dazu gehören die Nebennieren, der Uterus, die Leber, das Gehirn und die Nieren.
Von den mehreren festgestellten Funktionen von Angiotensin II ist es bekanntermaßen an der Gefäßverengung beteiligt, was zu einem erhöhten Blutdruck führt. Die meisten Behandlungen von hohem Blutdruck beinhalten die Blockierung der Angiotensinfunktion auf die eine oder andere Weise. Ang II stimuliert auch die Sekretion von Aldosteron durch die Nebennierenrinde. Aldosteron ist ein wirkungsvolles Hormon, das primär auf die Niere wirkt, wobei es die Natriumretention fördert und dadurch unter anderem die hypertonischen Wirkungen von Angiotensin, das direkt auf die Blutgefäße wirkt, erhöht.
Es ist bekannt, dass Ang II auf verschiedene Stellen im Gehirn wirkt, und eine seiner Wirkungen bei Tieren ist die Regulierung des Durstes und des Trinkens.
Angiotensin hat auch trophische Wirkungen auf die Blutgefäße und fördert das Wachstum der Muskeln in der Arterienwand. Man vermutet, dass es auch angiogen ist, d. h. die Gefäßversorgung eines sich neu entwickelnden Gewebes bewirkt.
Von den meisten sicher bekannten Wirkungen von Ang II hat sich gezeigt, dass sie über den AT&sub1;-Subtyp des Ang-II-Rezeptors erfolgen, der ein Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen ist. Dieser Rezeptor wurde aus einer Vielzahl von Geweben kloniert und sequenziert, und es hat sich gezeigt, dass es sich um ein Polypeptid mit 359 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 40 kD handelt (Berstein und Alexander (1992), Endocr. Rev., 13, 381- 386). Studien unter Verwendung von Photoaffinitätsmarkierung und Vernetzungsmitteln lassen Molekulargewichte für den reifen Rezeptor von ungefähr 65 kD bzw. 116 kD vermuten, was eine Glycosylierung von Asparaginresten innerhalb der extrazellulären Domäne widerspiegeln kann.
Aufgrund der jüngsten Entwicklung einer Hybridomzelllinie, siehe S. Barker et al., J. Mol. Endocr., 11, 241-245 (1993), erschien es möglich, monoklonale Antikörper gegen den AT&sub1;-Subtyp des Ang-II-Rezeptors herzustellen. In der Folge hat sich gezeigt, dass solche Rezeptoren auf reifenden Spermienschwänzen von Ratten und Menschen sowie auf freischwimmenden Spermien, die durch Vaginalausspülung von Ratten nach der Paarung erhalten wurden, sowie in menschlichem ejakuliertem Sperma vorkommen.
WO 95/01202 offenbart die Verwendung von Angiotensin II zur Förderung der Befruchtung von Säugereiern durch erhöhte Spermienbeweglichkeit. Insbesondere wird offenbart, dass Ang II verwendet werden kann, um die in-vitro- Fertilisation zu fördern.
Obwohl Ang-II-Rezeptoren im Eierstock und Uterus ausführlich untersucht wurden, gibt es keine Informationen über ihre Anwesenheit und Rolle im Eileiter. Tatsächlich wurde berichtet, dass der AT1-Subtyp im Uterus fehlt, obwohl der AT2-Subtyp vorhanden ist. Ang-II-Rezeptoren wurden jetzt im menschlichen Eileiter und Uterus lokalisiert, wobei man monoklonale Antikörper gegen den AT1-Subtyp des Ang-II-Rezeptors verwendete. Der Antikörper zeigt, dass der Rezeptor im Eileiter und auch in den Nierenkanälchen, den Atemwegen, dem Darm, den Milchgängen, den Prostatagängen, dem Ductus pancreaticus und in Blutgefäßen speziell in den Epithelzellen (Endothelzellen bei Blutgefäßen) lokalisiert ist, was eine Rolle des Rezeptors beim Transport im Epithel und in den Gängen vermuten lässt. Im Eileiter, wie auch in den Atemwegen, zeigt seine Verteilung speziell eine enge Beziehung zu den Cilien, die diese Epithelzellen tragen, und dass daher die Cilienfunktion vielleicht durch diesen Rezeptor reguliert wird.
Die Häufigkeit der chronischen Atemwegserkrankung hat in den letzten Jahren eine erhebliche Steigerung gezeigt. Es scheint wenig Zweifel zu geben, dass dies großenteils mit der Luftverschmutzung zusammenhängt. Zur Zeit werden solche chronischen Zustände mit einer Vielzahl von lindernden Methoden behandelt. Obwohl diese im Allgemeinen wertvoll sind, zielen nur wenige dieser Behandlungen direkt auf die mukoziliäre Clearance. Dieser Mechanismus ist ein wichtiges natürliches Abwehrsystem für die gesamten Atemwege, der potentiell schädliches material durch den koordinierten Schlag der Cilien in einer Schleimauskleidung entfernt. Zu den Faktoren, die die Clearancerate beeinflussen, gehören daher die rheologischen Eigenschaften der Schleims selbst sowie die Schlagfrequenz der Cilien. Das Mittel, durch das diese Eigenschaften unter normalen physiologischen Bedingungen reguliert werden, ist weitgehend unklar, obwohl bekannt ist, dass die Cilientätigkeit durch mehrere Faktoren beeinflusst wird. Dazu gehören Neurotransmitter und ihre Agonisten und Antagonisten sowie die intrazellulären Signalmoleküle, cyclisches AMP und Calciumionen.
Es hat sich jetzt gezeigt, dass Ang II oder ein Analogon davon eine stimulierende Wirkung auf die Eileiter-Cilienschlagfrequenz (CBF) und auf die Cilienschlagfrequenz der Bronchienepithelzellen (Flimmerzellen) hat, und diese Verbindungen können daher an den oben genannten Stellen eine ähnliche stimulierende Wirkung auf die Cilien haben.
Aufgrund dieser neu gefundenen Eigenschaft kann Ang II verwendet werden, um bei Frauen, die nicht zur Empfängnis befähigt sind oder Schwierigkeiten mit der Empfängnis haben, den Eitransport durch den Eileiter zu fördern. Frauen können zwar auch ohne Eileitercilienaktivität schwanger werden, doch da die Cilienaktivität einer der Mechanismen ist, die für den Eitransport verantwortlich sind, hilft die stimulierende Wirkung von Ang II dabei, die Empfängnis zu fördern.
Außerdem kann Ang II verwendet werden, um die mukoziliäre Clearance zu fördern und damit die quälenden Symptome von Asthma oder anderer Bronchialkrankheiten zu lindern.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Angiotensin II oder eines Salzes oder Analogons davon zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Stimulierung von Cilien bereitgestellt, insbesondere zur Erhöhung der Cilienschlagfrequenz, vorzugsweise der Eileiter-Cilienschlagfrequenz und der Cilienschlagfrequenz der Bronchienepithelzellen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Angiotensin II oder eines Salzes oder Analogons davon zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Eitransports in einem Eileiter bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Angiotensin II oder eines Salzes oder Analogons davon zur Herstellung eines Medikaments zur Linderung von Asthma oder einer anderen Bronchialkrankheit bereitgestellt.
Zu den Analoga von Ang II, die zum Stimulieren der Cilien, d. h. Erhöhung der Cilienschlagfrequenz, verwendet werden können, gehören Ang-II-amid, Angiotensin III (Ang 1-7) und Angiotensin IV (Ang 3-8).
Das Medikament kann eine Formulierung sein, die als Tablette, Kapsel, Sirup, injizierbare Lösung, Zäpfchen, Pessar, Spray, Inhalationsmittel, Implantat mit langsamer Freigabe oder Creme zubereitet sein kann und die lokal oder innerlich zum Beispiel über die Vagina, das Rectum, den Mund oder die Nase appliziert werden kann. Solche Formulierungen könnten also oral, intramuskulär, intravenös, rektal, intranasal oder vaginal verabreicht werden. Im Falle der Behandlung einer Bronchialkrankheit ist eine bevorzugte Form der Medikamentenformulierung ein Aerosol für die Inhalation.
Zu den Arzneimittelhilfsstoffen, die in solche Formulierungen eingearbeitet werden können, gehören Träger, Bindemittel, Stabilisatoren, Konservierungsstoffe und Aromen. Beispiele für geeignete Arzneimittelhilfsstoffe, die in die Formulierungen eingearbeitet werden können, sind ein Bindemittel, wie Traganth, Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine, eine Trägersubstanz, wie mikrokristalline Cellulose, ein Sprengmittel, wie Maisstärke, prägelatinisierte Stärke, Alginsäure und dergleichen, ein Gleitmittel, wie Stearinsäure oder Magnesiumstearat, ein Süßmittel, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, ein Aromastoff, wie Orange, Pfefferminz, Methylsalicylat oder Kirsch. Wenn die Formulierung eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien des obigen Typs noch einen flüssigen Träger, wie ein Fettöl, enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorhanden sein, oder um die physikalische Form der Zubereitung auf andere Weise zu modifizieren. Zum Beispiel können Tabletten mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet (dragiert) sein. Ein Sirup oder Elixier kann den Wirkstoff, Saccharose als Süßmittel, Methyl- und Propylparaben als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und einen Aromastoff, wie Kirsch- oder Orangenaroma, enthalten.
Die Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel beschrieben:

Beispiel 1: Studien zur Eileiter-Cilienschlagfrequenz (CBF)

Eileiter wurden von Frauen erhalten, die einer Sterilisation oder Hysterektomie im gutartigen Zustand unterzogen wurden, nachdem sie aufgeklärt worden waren und zugestimmt hatten und die lokale Ethikkommission zugestimmt hatte. Eine venöse Blutprobe wurde unmittelbar vor der Operation für FSH-, LH-, Estradiol- (E&sub2;) und Progesteron-Messungen entnommen, um den hormonellen Status zu bestimmen, der durch eine histologische Untersuchung des Endometriums unter Verwendung von Kriterien, die von Noyes et al., 1950, Fertil. Steril. 1, 3-25, beschrieben wurden, bestätigt wurde. In einer Untergruppe von normalen Frauen mit Eisprung und erwiesener Fruchtbarkeit wurde der Menstruationscyclus durch Nachweis des LH-Anstiegs in einer täglichen Probe von venösem Blut und/oder frühmorgendlichem Urin datiert. Keine der Patientinnen erhielt eine Hormonersatztherapie oder nahm orale Kontrazeptiva. Nach der Entnahme wurden die Eileiter sofort zum Labor transportiert, und zwar in MEM- Earle-Medium, das 1,81 E/ml Heparin, 50 ug/ml Streptomycin, 100 IE/ml Penicillin und 10 mmol/l HEPES enthielt und so hergestellt wurde, wie es bereits beschrieben wurde (Kervancioglu et al., 1995, Biol. Cell, 82, 103-107). Kurz gesagt, das Gewebe wurde aufgeschnitten und zweimal gespült, um sichtbare Spuren von Blut zu entfernen. Die Schleimhautfalten des Eileitersegments wurden freigeschnitten, in Stücke von 1 mm³ geschnitten, und diese wurden in dasselbe Kulturmedium ohne Heparin oder HEPES gegeben. Alle Experimente zur Cilienschlagfrequenz (CBF) wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Ein Stück Schleimhaut wurde in eine Falcon-Gewebekulturschale (60 · 15) (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) gelegt, die 1 ml Kulturmedium enthielt. Die Cilienaktivität wurde unter einem umgekehrten Mikroskop von Olympus (Keymed, Essex, UK) beobachtet und während Zeiträumen von bis zu 30 min auf Videobändern aufgezeichnet. Die Experimente zeigten, dass eine stabile CBF innerhalb von 3 min erreicht wurde. Die Aufzeichnungen wurden 5 min nach der Zugabe eines Reagens begonnen. Jedes Gewebeexplantat ergab sowohl eine Kontroll- als auch eine stimulierte Ablesung. Ang II wurde in Konzentrationen von 0,1 bis 100 nmol/l in Anwesenheit oder Abwesenheit von Losartan (1000 nmol/l) oder CGP42112B (1000 nmol/l) verwendet. Die Aufzeichnungen wurden mit Hilfe eines CE-1-Verstärkers (Brian Reece Scientific Instruments, Newbury, UK) analysiert, das den Kontrast des Videosignals so erhöhte, dass es möglich war, die Cilien auf einem Fernsehmonitor sichtbar zu machen. Die CBFs von sechs verschiedenen Zellen wurden über einen Zeitraum von 1 min bestimmt. Die Position von einzelnen Cilien wurde auf dem Bildschirm mittels eines Kreuzhaar- Lichtsensors fixiert, und Unterschiede in der Lichtintensität, die sich aus der Cilienbewegung am Kreuzungspunkt des Sensors ergaben, wurden durch die Verwendung eines Computers analysiert, in den eine PCX1-Video-Digitiser-Karte (Version 7.11) und die Software Cell Tracek 8 (Brian Reece Scientific Instruments) eingebaut war. Die Unterschiede in den Lichtintensitäten wurden in der Einheit Hertz berechnet. Für die Berechnung wurde der Mittelwert von sechs Messungen an einem Explantat verwendet, und Daten von sechs Frauen vor der Menopause wurden für eine statistische Analyse miteinander verglichen.

Ergebnisse

Die CBF wurde von Ang II in nanomolaren Konzentrationen stimuliert; höhere Konzentrationen an Ang II erhöhten die CBF nicht weiter (Fig. 1). Wenn die Daten von allen Experimenten unter Verwendung unterschiedlicher Ang-II- Konzentrationen miteinander kombiniert wurden (Tabelle 1), gab es nach der Zugabe von Ang II zu dem Kulturmedium eine signifikante Erhöhung der CBF (durch ANOVA, p = 0,0046), die durch die Anwesenheit von Losartan gehemmt wurde (durch ANOVA, p = 0,1176, Ang II plus Losartan gegenüber Kontrolle). CGP42112B hat keine inhibitorische Wirkung (durch ANOVA, p = 0,0186, Ang II plus CGP42112B gegenüber Kontrolle). Tabelle 1. Kontroll- und stimulierte Werte für CBF
Die Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler
Losartan: AT&sub1;-Rezeptor-spezifischer Antagonist
CGP42112B: Typ-2-spezifischer Ang-II-Rezeptor-Antagonist

Schlussfolgerung

Die Daten zeigen eindeutig, dass Ang II eine stimulierende Wirkung auf die Eileiter-CBF hat. Diese Wirkung wurde in nanomolaren Konzentrationen von Ang II erreicht, und weitere Erhöhungen der Konzentration von Ang II waren ohne zusätzliche Wirkung.

Beispiel 2

Nasale und bronchiale Gewebeproben wurden aus Operationspatienten unter der Obhut des E. N. T. Department bzw. des Cardiothoracic Department am St Bartholomew Hospital erhalten.
Unmittelbar nach der Resektion wurden die Gewebeproben in 20 ml kaltes basisches Medium in einem Universalröhrchen gegeben und innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme zum Labor zurückgeschickt. Dann wurden die Proben wie folgt verarbeitet:
1. Gewebeproben wurden sterilisiert, indem man 2-3 Waschungen in frischem basischem Medium durchführt.
2. Die Proben wurden nach dem Waschen in Falcon-Primeria-Kulturschalen (Becton-Dickinson Ltd., Oxford) gelegt, die 5 ml basisches Medium enthielten und das Epithelgewebe wurde unter Verwendung einer sterilen Pinzette und eines sterilen Einwegskalpells (Swann Morton, Sheffield) abgeschnitten. Als die Gewebeschnitte abgeschnitten wurden, wurden sie in Kulturschalen gelegt, die frisches basisches Medium enthielten.
3. Diese Gewebestücke wurden dann weiter in kleinere Stücke von 1-2 mm³ Größe unterteilt.
4. Primäre Zellkulturen wurden angelegt, indem man drei der kleinen Gewebestücke aus dem vorigen Schritt in Falcon-Primeria-Kulturschalen (60 · 15 mm Style, Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey), die 1,5 ml Kulturmedium mit fetalem Kälberserum enthielten, ausstrich.
5. Die Kulturen wurden in einem CO&sub2; Incubator 220, Flow Laboratories (UK), bei 37 = A7C inkubiert und mit einem Gasgemisch von 5% CO&sub2; in Luft belüftet.
Messungen von CBF wurden unter Verwendung einer Modifikation der Analogkontrast-Verstärkungstechnik (ACET) durchgeführt. Bei dieser Technik wurde eine COHU-Feststoffkamera an ein umgekehrten Mikroskop des Typs Olympus IMT-2 (Olympus Optical Co., UK) gekoppelt, in die das optische system Hoffman Modulation Contrast (Modulation Optics Inc., Greenvale, New York) eingebaut war und zur Beobachtung der Zellen verwendet wurde. Bilder von dem Mikroskop wurde über die COHU-Feststoff-Videokamera und einen CE-1-Kontrastverstärker einem Monitor zugeführt. Bei dem Verfahren erfährt das Bild eine elektronische Dehnung, die den Kontrast erhöht, so dass die Cilien beobachtet werden können. Der Cilienschlag führt zu Fluktuationen in der Lichtintensität, die durch eine mausbetätigte Kreuzhaar-Lichtsensorsonde nachgewiesen werden, welche über ausgewählten Flimmerzellen positioniert ist. Ein online mitlaufender Computer mit einer PCX-Video-Digitiser-Karte (Brian Reece Scientific Instruments, Newbury) berechnet dann die CBF unter Verwendung der Daten aus der Sonde.
Als CBF-Messungen durchgeführt wurden, wurden sechs Bereiche aus jeder Kultur (die in zwei Parallelansätzen durchgeführt wurden) zufällig ausgewählt, und die CBF von gesunden Zellen wurde gemessen. Die CBF-Werte von 30- Sekunden-Scans wurden über jedem der ausgewählten Bereiche gemessen. Für experimentelle Zwecke wurden die Explantate vor dem Beginn der Experimente aseptisch mit einer Pinzette entfernt. Das Medium aller Kulturen wurde gewechselt, und vorläufige CBF-Messungen wurden vorgenommen. Nach diesen Messungen wurden die Medien wiederum gegen Kulturmedien ausgewechselt, die Captopril und/oder Angiotensin II enthielten. Bei Kontrollkulturen wurden die Medien ohne Zusätze gewechselt. Dann wurden die Kulturen 5 bis 10 Minuten lang inkubiert, bevor erneut CBF-Messungen begonnen wurden.

Ergebnisse

Kulturen von bronchialen Epithelzellen wurden verwendet. Captopril, 10 Mikromol pro Liter, wurde zu der angegebenen Gruppe gegeben. Bis eine Stunde nach der Zugabe des Captoprils verstrichen war, gab es einen klaren Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Die CBF der Gruppe, die Captopril ausgesetzt worden war, fiel unter ihre Grundlinienmessung, was durch die prozentuale Änderung der CBF angezeigt wurde (siehe Fig. 2). Die Gruppe, die nicht mit Captoprildosen versorgt wurde, zeigte dagegen einen Anstieg der CBF (Fig. 2). Der Unterschied zwischen den Gruppen blieb bis zum Beginn des nächsten Stadiums des Experiments bestehen.
Nach der Zugabe von Angiotensin II nahmen die CBF-Werte der Gruppe, die mit Captoprildosen versorgt wurde, zu (siehe Fig. 3).

Schlussfolgerung

Die Ergebnisse zeigen, dass bronchiale Epithelzellen wie in anderen Geweben in der Lage sind, Angiotensin II endogen zu erzeugen.
Die Zugabe eines Inhibitors des Angiotensin-konvertierenden Enzyms schränkt die endogene Produktion des aktiven Hormons ein. Infolgedessen wird die Cilienschlagfrequenz gehemmt und kehrt nur bei Zugabe von endogenem Angiotensin II wieder zum Ausgangswert zurück.

Claims

1. Verwendung von Angiotensin II (Ang II) oder eines Salzes oder eines Analogons desselben zur Herstellung eines Medikaments zur Cilienstimulierung.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament die Cilienschlagfrequenz erhöht.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Medikament die Eileiter-Cilienschlagfrequenz erhöht.

4. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Medikament die Bronchial- Epithelzellen-Cilienschlagfrequenz erhöht.

5. Verwendung von Angiotensin II oder eines Salzes oder eines Analogons desselben zur Herstellung eines Medikaments zur Unterstützung eines Eitransports in einem Eileiter.

6. Verwendung von Angiotensin II oder eines Salzes oder eines Analogons desselben zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Bronchialkrankheit.

7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Bronchialkrankheit Asthma, Bronchitis oder Lungenentzündung ist.

8. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ang- II-Analogon aus Ang-II-amid, Angiotensin III und Angiotensin IV gewählt ist.

9. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament als Tablette, Kapsel, Sirup, injizierbare Lösung, Zäpfchen, Pessar, Spray, Inhalationsmittel, Implantat mit langsamer Freigabe oder Creme vorliegt.