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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Auf dem Gebiet der Reproduktion von
Säugetieren
sind viele Diagnoseverfahren vorhanden, um den Reproduktionsmedizinern
beim Erstellen einer Diagnose und der Auswahl eines geeigneten Behandlungsweges
zu helfen.
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Derzeit wird bei Menschen Unfruchtbarkeit als
ein Jahr ohne Empfängnis
bei ungeschütztem
Koitus definiert. Ungefähr
10–15%
aller Paare sind von Unfruchtbarkeit betroffen. Das Risiko für Unfruchtbarkeit
bei Frauen im Alter zwischen 35 und 44 ist doppelt so hoch im Vergleich
zu Frauen im Alter zwischen 30 und 34. Näherungsweise 600000 Paare suchten
während
des Jahres 1968 professionelle Hilfe. In den frühen 80'er Jahren erhöhte sich diese Zahl auf über 2 Millionen
Arztbesuche aufgrund Unfruchtbarkeit pro Jahr. Die Veränderungen
in den Fruchtbarkeitsmustern wird eine signifikante Auswirkung auf
die Zusammensetzung von Bevölkerungen
haben. Es wurde berechnet, dass bis um die Mitte des nächsten Jahrhunderts
die Bevölkerung
in den Vereinigten Staaten ohne Einwanderung zurückgehen wird. Weiterhin wird
der Prozentsatz der Bevölkerung mit
einem Alter von über
65 auf über
mehr als 23% in den nächsten
100 Jahren zunehmen, was zu einem gealterten und geringeren Arbeitskräftepotential führt.
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In den Vereinigten Staaten wird der
Hauptanteil der Unfruchtbarkeit durch Probleme bei Frauen erklärt. Den
Grund für
Unfruchtbarkeit in einer Frau zu finden kann komplex sein. Die Untersuchung
der Eileiter ist ein wichtiger früher Schritt bei der Fruchtbarkeitsbewertung
von Säugetieren
aufgrund der zunehmenden Anzeichen für eine Beckenentzündungskrankheit.
Derzeit ist ein Hysterosalpinogramm (HSG) das Verfahren der Wahl
zur Untersuchung der Durchlässigkeit
der Eileiter. Zusätzlich
zum HSG ist die Hysteroskopie, die die direkte Untersuchung der Gebärmutter
durch eine faseroptische Vorrichtung ist, wichtig zur Bestimmung
des Vorhandenseins von Korpuspolypen, submukösen Leiomyomen und anderen
Abnormalitäten
innerhalb der eigentlichen Gebärmutter.
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Eine andere Kategorie diagnostischer
Verfahren umfaßt
die Untersuchung der Eierstockfunktion, einschließlich des
Eisprungs und der Progestronabsonderung während der lutealen Phase des
Menstruationszyklus. Die Eierstockfunktion kann grob durch Messung
der Grundkörpertemperaturen
während
des Menstruationszyklus und durch Testen des Gebärmutterhalsschleims um die
Zeit des Eisprungs bewertet werden. Ein genauerer Test kann durchgeführt werden,
indem das luteinisierende Hormon, ein Hormon der Hirnanhangdrüse, gemessen
wird, das einen Eisprung nach einem Anstieg in der Mitte des Zyklus
hervorruft. Schließlich
können
die Progesterongehalte im Serum gemessen werden, um die normale
luteale Phase des Menstruationszyklus zu bewerten.
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Die Gebärmutterschleimhaut selbst kann
direkt durch Durchführung
einer Gebärmutterschleimhautbiopsie
drei Tage vor dem vermuteten Beginn Menstruation bewertet werden.
Zur Bewertung der Gebärmutterschleimhaut
eines Säugers
hängen
derzeit Gynäkologen
und Ärzte
zur Behandlung der Unfruchtbarkeit vom Fachpersonal in der Pathologie
ab, das die Gebärmutterschleimhautbiopsien
durch Hämatoxylin-
und Esosinfärben
von in Paraffin eingebetteten Proben untersucht. Für unfruchtbare
Patienten liefert das Auslesen dieser Biopsien Informationen über den
Tag des Zyklus nach dem Eisprung, die Angemessenheit der lutealen
Phase und andere möglichen
Daten, wie zum Beispiel das Vorliegen einer Infektion, einer Entzündung oder
einer Neoplasie der Gebärmutterschleimhaut.
In den meisten Fällen jedoch
gibt es keine Ausweitung der funktionellen und biochemischen Qualität der Gebärmutterschleimhaut
und oftmals kein histologisches Auslesen, um das Unfruchtbarkeitsproblem
der Patientin zu erklären.
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Schließlich kann sich die unfruchtbare
Patientin einer endoskopischen Untersuchung durch einen Schnitt
in den Unterleib zur direkten Sichtbarmachung der äußeren Oberflächen des
Eierstocks, der Eileiter und der Gebärmutter unterziehen, um einen schweren
pathologischen Befund sichtbar zumachen, der durch vorhergehende
Untersuchungen nicht entdeckt wurde.
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Ein hoher Prozentsatz der Frauen,
die nicht in der Lage sind, eine Schwangerschaft vollständig auszutragen,
erleben im allgemeinen innerhalb der ersten sechs Wochen einen spontanen
Schwangerschaftsabbruch. Es wurde gezeigt, dass ein Verlust der
Schwangerschaft in den ersten sechs Wochen bei einem Wert in der
Größenordnung
von zwischen 15 bis 20 % liegt. Weiterhin liegt die Wahrscheinlichkeit
für eine
erfolgreiche Lebendgeburt nach aufeinanderfolgenden Fehlgeburten
ohne eineLebendgeburt nur bei 40 bis 50%.
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Die in vitro Befruchtung (IVF) erfordert
die Entfernung von Eiern aus einem Eierstock eines Säugetiers
und das Aussetzen dieser Eier gegenüber dem Sperma außerhalb
des Körpers.
Die Befruchtung von jedem Ei erfordert, dass mindestens ein lebendes
Spermium die Eihülle
(äußere Hülle) des
Eis durchdringt und mit dem Pronukleus verschmilzt. Sobald dies
stattgefunden hat und die Eier befruchtet sind, können sie
in eine Gebärmutter übertragen
werden, in der sie sich an der Gebärmutterwand einnisten können. Falls
die Einnistung stattfindet, kann die Schwangerschaft weiter verlaufen,
als ob sich die Befruchtung innerhalb des Körpers ereignet hätte. Die
in vitro Befruchtung hat eine weitreichende professionelle und öffentliche
Akzeptanz erreicht. Trotz der immer zunehmenden Anwendungshäufigkeit
und Verfeinerung dieses Verfahrens führen jedoch die Befruchtungsversuche
meistens nicht zu einer Schwangerschaft. Die in vitro Schwangerschaftsquoten
liegen derzeit nur bei ungefähr
15 bis 20 Prozent. Aus vielfältigen
Gründen
führt die
Aussetzung der Eier gegenüber
Sperma nicht notwendigerweise zu einer Befruchtung. Weiterhin resultiert
normalerweise nicht einmal bei einer Befruchtung der Eier das Einsetzen der
Eier in die Gebärmutter
zu einer normalen Einnistung. Die niedrige Erfolgsquote der IVF
führt oftmals zu
einer übermäßigen finanziellen
und psychologischen Belastung für
das unfruchtbare Paar.
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Andere unterstützte Reproduktionstechnologien
umfassen zwei Modifikationen des NF-Verfahrens. Die erste ist der Gamettransfer
in den Eileiter (GIFT), die zweite ist der Zygotentransfer in den
Eileiter (ZIFT). In dem GIFT-Verfahren wird die gewonnene Eizelle
und Sperma zusammengemischt und in den Eileiter zurückgebracht,
in dem die Befruchtung stattfindet. Die befruchtete Zygote wandert
dann durch den Eileiter hindurch hinunter in die Gebärmutterhöhle, in
der die Einnistung stattfinden kann oder auch nicht. Das ZIFT-Verfahren gestattet
wie das Standard-NF-Verfahren eine Befruchtung in vitro und dann
wird die befruchtete Zygote in den Eileiter zurück eingesetzt, von wo aus sie
dann hinunter in die Gebärmutter
zur Einnistung wandert. Schließlich
ist erkannt worden, dass die Hyperstimulationsprotokolle, die zum
Gewinnen vieler Eizellen von der Spenderfrau notwendig sind, auf
die Gebärmutterschleimhaut
selbst schädliche
Wirkungen haben können
und die Einnistungsquoten verringern. Zwei grundlegende Verfahren
wurden verwendet, um bei der Überwindung
dieses Problems zu helfen. Das erste wird als nicht-stimulierte
Eizellengewinnung betrachtet. Ein einzelnes Ei wird gewonnen, man
gestattet seine Befruchtung und setzt es zurück in den Eileiter oder die Gebärmutter
zur Einnistung. Die andere Technik betrifft den Hyperstimulierungsanteil
des NF-Verfahrens zur Gewinnung der Eier und gestattet die in vitro
Befruchtung. Die Zygoten werden dann eingefroren, um in die Patientin
nach mehreren normalen Zyklen zurück eingesetzt zu werden, in
der Hoffnung, dass die Gebärmutterschleimhaut
für eine
Einnistung empfänglicher
sein wird. All diese Verfahren versuchen die Qualität der Eier,
der nach der Befruchtung erzeugten Zygoten und die Empfänglichkeit
der Gebärmutterschleimhaut
zu maximieren. Jedes Verfahren, das die Einnistungsquote über den
Standardwert von 15 bis 20 % vergrößern würde, würde auf jede dieser Technologien
eine deutlich positive Wirkung ausüben.
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Daher ist es offensichtlich, dass
Verfahren zur Verbesserung der Erfolgsquote der unterstützten Reproduktionstechniken
bei Säugetieren
hoch erwünscht
sind. Mittel zur Bestimmung der Fähigkeit spezieller befruchteter
Eier, Empfängnisprodukten für eine Gebärmuttereinpflanzung
sind besonders erwünscht,
da solche Mittel zu einer unmittelbaren Verbesserung der Erfolgsquote
der unterstützten
Reproduktion führen.
Verfahren zur Verbesserung der Fähigkeit
von Empfängnisprodukten
für eine
Einnistung sind ebenso hoch erwünscht.
Zusätzlich
sind ebenfalls Verfahren zur Bestimmung der Unfruchtbarkeit von
Frauen erwünscht.
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Schwangerschaftsverhütung oder
post-koitale Empfängnisverhütung wird
derzeit über
zwei grundlegenden Verfahren praktiziert: chirurgisch und medizinisch.
In den 70'er Jahren,
war der „Morgen nach
der Pille" (Diethylstilbestrol)
als eine post-koitale Empfängnisverhütungsmethode
populär.
In letzter Zeit hat die Verwendung des Anti-Progesterons R-486 eine weitreichende
Akzeptanz in Europa zur Beendigung der Schwangerschaft kurz nach
der Befruchtung und Einnistung erreicht. Während des ersten Trimesters
ist die häufigste
Technik zur Beendigung einer Schwangerschaft der operative Schwangerschaftsabbruch.
Operative Schwangerschaftsabbrüche
betreffen im allgemeinen die Gebärmutterhalsdilatation
und Ausschabung oder die Absaugung unter Vakuum. Schließlich können nach
dem ersten Trimester weheneinleitende Medikamente, wie zum Beispiel
Oxytocin und Prostaglandine zur Einleitung einer vorzeitigen Entbindung
und somit zur Beendigung der Schwangerschaft verwendet werden. Von den
vorstehend beschriebenen medizinischen Techniken ist bekannt, dass
sie eine Anzahl nachteiliger Wirkungen und möglicher Komplikationen aufweisen. Die
operative Technik kann zu Gebärmutterruptur, Blutung
und Infektion führen.
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In den Vereinigten Staaten umfassen
die am häufigsten
angewandten Empfängnisverhütungstechniken
die oralen steroidalen Empfängnisverhütungsmittel, injizierte
oder eingepflanzte steroidale Empfängnisverhütungsmittel, Vorrichtungen
innerhalb der Gebärmutter,
physikalische, chemische oder physikochemische Barrieretechniken,
coitus interruptus, sexuelle Enthaltsamkeit um die Zeit des Eisprungs,
Stillen und dauerhafte Sterilisation. Zusätzlich zu den hohen Versagensquoten
von einigen dieser Verfahren, weisen eine Anzahl dieser Verfahren ernsthafte
mögliche
Komplikationen für
die Anwender auf. Zum Beispiel gibt es zusätzlich zu Stoffwechselveränderungen,
die durch orale Empfängnisverhütungsmittel
verursacht werden, möglicherweise
ein erhöhtes
Risiko für
Neoplasie, Ernährungsstörungen, Herz
und Gefäße betreffende
Auswirkungen, Thromboembolie und sogar Tod.
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Verfahren zur Bewirkung einer Empfängnisverhütung und
Schwangerschaftsverhütung
sind hoch erwünscht,
besonders Verfahren, die wenig oder keine Nebenwirkungen bei der
Patientin zeigen. Verfahren, die die Schwangerschaftsverhütung in
einem frühen
Stadium in der Kette reproduktiver Ereignisse hemmen, sind besonders
erwünscht
und wurden seit langem von Fachleuten auf dem Gebiet der Reproduktionswissenschaft
gesucht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein in vitro Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit eines Empfängnisproduktes
für eine
Gebärmutterimplantation zur
Verfügung,
wobei das Verfahren umfaßt:
das
Inkontaktbringen von Trophoblastenzellen, die aus dem Empfängnisprodukt
isoliert wurden, mit transformierendem Wachstumsfaktor-β; und
das
Auswerten des Erzeugungsspiegels von Fibronectin durch die Trophoblastenzellen,
wobei die Fibronectinerzeugung ein Indikator für die Fähigkeit des Empfängnisproduktes
ist.
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Die Anmelder haben erkannt, dass
die Ansprechempfindlichkeit des Embryos auf TGFβ mit dessen gesamter Implantationswahrscheinlichkeit zusammenhängt, wodurch
dies bei der Auswahl des optimalen Embryos für die Einpflanzung hilft. Roberts et
al., (J. Biol. Chem. 1988, 263(10): 4586–4592) untersuchte menschliche
Lungen-Fibroblasten und bemerkte, dass TGFβ die Fibronectinrezeptorsynthese stimuliert.
Diese Folgerungen haben jedoch für
die vorliegende Erfindung keine Bedeutung.
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Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren
zur Bestimmung weiblicher Unfruchtbarkeit in einer Patientin zur
Verfügung,
von der vermutet wird, dass sie unfruchtbar ist, welches das Untersuchen
des Gewebes oder der Körperflüssigkeit
der Patientin auf das Vorhandensein von transformierendem Wachstumsfaktor-β umfaßt. Somit
stellen die Verfahren dieser Erfindung ein Werkzeug zur Diagnose
von Säugern mit
Unfruchtbarkeit aufgrund ungenügendem
TGFβ Gehalt
zur Verfügung.
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Die Anmelder haben entdeckt, dass
während der
normalen Schwangerschaft bei Säugern,
das Trophoblasten-Fibronectin, das sich in der Plazenta-Gebärmutter-Verbindungstelle
befindet, für
die Implantation wichtig ist. Somit verbessert TGFβ, von dem
festgestellt wurde, dass es (1) zusammen mit der Stimulation der
Erzeugung von Trophoblasten-Fibronectin (2) die Haftungsfähigkeit
von Trophoblast an die extrazelluläre Matrix fördert und wirkungsvoll die
Implantation des Eis oder des Empfängnisproduktes verbessert.
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Die Anmelder haben die Bedeutung
von Trophoblasten-Fibronectin in der Fortpflanzung von Säugern erkannt
und sie haben entdeckt, dass die Erhöhung der Trophoblasten-Fibronectinerzeugung ein
wichtiges Verfahren in der Fruchtbarkeitstherapie ist. Es wurde
festgestellt, dass eine solche Erhöhung durch den transformierenden
Wachstumsfaktor-β bewirkt
wird.
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TGFβ-Antagonisten verringern die
Menge an verfügbarem
TGFβ, zum
Beispiel zur Stimulation der TUN-Synthese Dies macht folglich den
Erhalt einer Schwangerschaft unmöglich
und bewirkt, dass eine Empfängnis
unwahrscheinlich wird.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Kürzlich
haben die Anmelder festgestellt, dass Trophoblasten-Fibronectine,
hauptsächlich
das Tropho-Uteronectin (TUN) durch Trophoblasten über die
Schwangerschaft hinweg an Anlagerungsstellen sowohl in vivo als
auch in vitro synthetisiert werden. Es wurde festgestellt, dass
Tropho-Uteronectin an der Plazenta-Gebärmutterverbindungsstelle vorkommt.
Es wird angenommen, dass Trophoblasten-Fibronectine und besonders
Tropho-Uteronectin eine
entscheidende Funktion bei der Modulierung der Trophoblastenhaftung
an die extrazelluläre
Gebärmuttermatrix
ausübt.
Feinberg, et al., 1991, American Journal of Pathology, 138 (3):
537–543.
Zusätzlich wurde über viele
Jahre hindurch festgestellt, dass Trophoblastenzellen des Empfängnisproduktes
einen Kontakt mit der Gebärmutter
als einen entscheidenden Teil des Implantationsprozesses herstellen. Hertig,
A. T. und Rock, J., 1956, American Journal of Anatomy, 98, 435–494.
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Die Anmelder haben nun festgestellt,
dass der transformierende Wachstumsfaktor-β, (TGFβ), die Produktion von Trophoblasten-Fibronectin,
einschließlich
Tropho-Uteronectin, stimuliert. Der transformierende Wachstumsfaktor-β (TGFβ), wie er
hier verwendet wird, ist ein Protein, dass von α-Granulae oder Blutplättchen abgegeben
wird. TGFβ wurde kürzlich an
der menschlichen Plazenta-Gebärmutter-Grenzfläche von
Einpflanzungsorten lokalisiert, die von schwangeren Menschen operativ
entfernt worden waren. Graham, et al., 1992, Biol. Reprod., 46:
561–572.
TGFβ ist
zum Beispiel von Sigma, St. Louis, MO, R & D Systems, Minneapolis, MN und Collaborative
Research, New Bedford, MA. kommerziell erhältlich. TGFβ bezieht sich auf alle Isoformen von
TGFβ. Somit
können
TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 und TGFβ4 von einigen
oder allen Aspekten der Erfindung umfaßt werden.
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Trophoblasten-Fibronectin umfaßt alle
Fibronectinproteine, die durch Trophoblasten produziert werden.
Es wurde festgestellt, dass ein Trophoblasten-Fibronectin, Tropho-Uteronectin (TUN)
für die Ausübung der
vorliegenden Erfindung besonders wichtig ist, jedoch wird ebenfalls
von anderen Trophoblasten-Fibronectinen angenommen, dass sie wichtig
sind.
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Ein erfindungsgemäßes in vitro Verfahren zur
Bestimmung der Fähigkeit
eines Empfängnisproduktes
für eine
Gebärmutterimplantation
wird zur Verfügung
gestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
das Inkontaktbringen
von Trophoblastenzellen, die aus dem Empfängnisprodukt isoliert wurden,
mit transformierendem Wachstumsfaktor-β; und
das Auswerten des
Erzeugungsspiegels von Fibronectin durch die Trophoblastenzellen,
wobei die Fibronectinerzeugung ein Indikator für die Fähigkeit des Empfängnisproduktes
ist.
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Mit dem Ausdruck Fähigkeit
für eine
Gebärmutterimplantation
sind die für
eine Implantation wichtigen Merkmale gemeint. Zum Beispiel ist die
Erzeugung von Fibronectin durch Trophoblasten für die Implantation wichtig.
Es wird daher angenommen, dass die Fähigkeit, eine solche Reaktion
in vitro hervorzurufen, ein Anzeichen dafür ist, dass das Empfängnisprodukt
wirksam Fibronectin und andere Faktoren, die für die in vivo Entwicklung des
Fötus nach dessen
Einführung
in die Gebärmutter
wichtig sind, erzeugen wird.
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Der Ausdruck „Empfängnisprodukt", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf die Summe der Derivate eines befruchteten
Eis in jedem beliebigen Entwicklungsstadium von der Befruchtung
bis zum Tod, einschließlich
außerembryonalen
Membranen, Plazenta und Trophoblasten, so wie auch den Embryo oder
den Fötus.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind allgemein auf Säugetiere
anwendbar. Zum Beispiel können
die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter anderem auf Rinder,
Pferde, Schweine, Hunde-, katzenartige und menschliche Säugetiere
angewandt werden.
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Der Gehalt des Trophoblasten-Fibronectins, das
durch das Empfängnisprodukt
erzeugt wird, kann durch jedes Verfahren ausgewertet werden, das
das Protein nachweist, jedoch aber das Empfängnisproduktes unversehrt läßt. Diese
Auswertung kann somit durch Inkontaktbringen des Empfängnisproduktes
oder des das Empfängnisprodukt
umgebenden Kulturmediums mit einem nachweisbar markierten Antikörper ausgeführt werden,
der für
Trophoblasten-Fibronectin
spezifisch ist. Die Anmelder haben früher die Fähigkeit kultivierter Trophoblasten
zur Absonderung von Fibronectin und insbesondere TUN in die Kulturmedien
gezeigt. Feinberg, et al., 1991, American J. Pathology, 138 (3):
537–543.
Zum Beispiel ist FDC-6 ein geeigneter Antikörper, der Trophoblasten-Fibronectine,
wie zum Beispiel Tropho-Uteronectin,
erkennt, wie es in dem US Patent Nr. 4,894,326 offenbart ist. Dem
Fachmann ist klar, dass ebenfalls andere Antikörper verwendet werden können, die
spezifisch eines oder mehrere Trophoblasten-Fibronectine erkennen.
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Die nachweisbare Markierung wird
praktischerweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Enzymen, Chromophoren,
Fluorophoren, Coenzymen, Chemoluminescenzmaterialien, Enzymhemmstoffen und
paramagnetischen Metallen und Radionukleotiden besteht.
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Ein Assay, von dem angenommen wird,
dass er zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist,
ist ein in situ Hybridisierungsasssay, der die Schritte des Inkontaktbringens
des Empfängnisproduktes
mit einem nachweisbar markierten Oligonucleotid oder einer cDNA-Sonde,
die mit der für
Trophoblasten-Fibronectin kodierenden mRNA hybridisierbar ist, und
des Nachweisens des markierten Oligonucleotids umfaßt. Allgemeine
Verfahren für
die in situ Hybridisierung sind zum Beispiel in Stroop, et al., 1984,
Lab. Invest. 51: 27–38
beschrieben.
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Die Verfahren dieser Erfindung können ebenfalls
zur Bestimmung weiblicher Unfruchtbarkeit in einem weiblichen Säugetier
nützlich
sein, von dem angenommen wird, dass es unfruchtbar ist. Dementsprechend
kann Gewebe oder Körperflüssigkeit,
die von einer Patientin isoliert wurde, auf das Vorhandensein von
aktivem und/oder immunologischem transformierenden Wachstumsfaktor-β mit einem
Gehalt, der gleich derjenigen einer fruchtbaren Kontrolle ist, untersucht
werden. Das Vorhandensein des Wachstumsfaktor-β weist auf eine Fruchtbarkeit
hin. Das Fehlen des Wachstumsfaktor-β weist auf ein Fehlen der Empfänglichkeit
für die
Implantation und folglich auf eine Unfruchtbarkeit hin. Körperflüssigkeiten,
von denen angenommen wird, dass sie nützlich sind, umfassen zum Beispiel
Plasma, Serum und cervicouterine Aspirate. Beispiele von Zellarten,
von denen angenommen wird, dass sie in solchen Assays verwendbar
sind, umfassen eine endometriale Biopsie. Im allgemeinen wird angenommen,
daß jede reproduktive
Körperflüssigkeit
oder Zellart verwendbar ist, die mit der Implantation und der Fähigkeit
zur Stimulierung einer Trophoblasten-Fibronectinsynthese in einer
fruchtbaren Kontrolle zusammenhängt. Praktischerweise
sind Assays für
die immunologisch reaktive Menge und Aktivität des funktionellen TGFβ handelsüblich und
sind vom Fachmann einfach zu verwenden.
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TGFβ kann vor der Einführung des
Eis, Spermas oder Empfängnisproduktes
in den reproduktiven Bereich eines weiblichen Säugers entweder natürlich oder
durch unterstützte
reproduktive Techniken verabreicht werden. Zum Beispiel kann eine
interuterinäre
Infusion, ein Gel oder eine physiologische Lösung, die TGFβ enthält, zur
Einführung
von TFGβ in die
Vagina, den Gebärmutterhalskanal,
die Gebärmutter
und in die Eileiter verwendet werden. Weiterhin kann in Fällen von
unterstützten
reproduktiven Techniken TGFβ mit
dem Ei oder dem Empfängnisprodukt
vor Einführung
in den reproduktiven Bereich in vitro in Kontakt gebracht werden.
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TGFβ kann ebenfalls gleichzeitig
mit der Einführung
des Eis, des Spermas oder des Empfängnisproduktes in den reproduktiven
Bereich eines weiblichen Säugers
verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein TGFβ-enthaltendes Gel hergestellt
werden, in dem ein Empfängnisprodukt
während
der in vitro Befruchtung suspendiert ist, in dem Ei und Sperma während des
Gamettransfers im Eileiter suspendiert sind oder in dem die Zygote
während
des Transfers im Eileiter suspendiert ist. Es können ebenfalls TGFβ-enthaltende
physiologische Lösungen
gleichzeitig mit unterstützten
reproduktiven Verfahren, die solche wie diese sind, verabreicht
werden.
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TGFβ kann nach der Einführung des
Eis, Spermas oder des Empfängnisproduktes
in den Reproduktionsbereich eines weiblichen Säugers verabreicht werden. Zum
Beispiel kann eine intravenöse Injektion
einer physiologischen TGFβ-Lösung nach der
Einführung
eines Eis, Spermas oder Empfängisproduktes
in die Gebärmutter
als ein vorbeugendes Verfahren verabreicht werden, um die Chancen
für eine
Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zu stärken. Dem Fachmann ist natürlich klar,
dass die Dosierung und die Verfähren
für die
Verabreichung mit der Größe, dem
Gewicht und dem Zustand des zu behandelnden Patienten variieren
werden, wobei das Ziel die Erhöhung
der Trophoblasten-Fibronectinsynthese auf die Niveaus einer normalen
fruchtbaren Kontrolle ist.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung
wird die Verwendung eines transformierenden Wachstumsfaktor-β-Antagonisten
oder eines transformierenden Wachstumsfaktor-β-Rezeptorantagonisten bei der Herstellung
eines Medikaments zur Empfängnisverhütung zur
Verfügung
gestellt. Zum Beispiel können
Antisense-Oligonucleotide zur Hemmung der TGFβ-Synthese durch Säuger-Trophoblasten
oder durch die Gebärmutterschleimhaut
verwendet werden. Vor kurzem wurde gezeigt, dass die Zugabe von Oligonucleotid-Antisense-DNA-Sonden
zu Zellen bewirkt, dass sie spezifisch mit der Erzeugung des entsprechenden
Proteins aufhören.
Siehe, zum Beispiel Tortora, et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 87, 705–708.
Ein Antisense-Oligonucleotid kann leicht hergestellt werden und
auf einer Anzahl von Wegen verabreicht werden, die dem Fachmann
bekannt sind. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 5,098,890 erteilt
am 24. März
1992.
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Die Hemmung der TGFβ-Synthese
in einem Säugetier
weist eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten auf. Zum Beispiel
kann ein Säugetier,
bei dem ein TGFβ-Gehalt
festgestellt wurde, der dem Gehalt einer normalen fruchtbaren Kontrolle
entspricht oder darüber
liegt, ein Kandidat für
die TGFβ-Hemmung
sein, wobei die Hemmung so ausgelegt ist, daß die die TGFβ-Gehalte
in den Bereich einer normalen fruchtbaren Kontrolle bringt. Die TGFβ-Hemmung
kann ebenfalls als ein Verfahren zur Empfängnisverhütung dazu angewandt werden, einen
im Vergleich zu einer normalen fruchtbaren Kontrolle unzureichenden
Betrag der TGFβ-Konzentration
beizubehalten. Zusätzlich
kann eine TGF-β-Hemmung auf einen
Gehalt, der geringer ist als derjenige in einem normalen fruchtbaren
Frau, zur Beendigung einer Schwangerschaft verwendet werden und
stellt somit ein Verfahren zur Schwangerschaftsverhütung zur
Verfügung.
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Zum Beispiel können Antikörper gegen TGFβ oder TGFβ-Rezeptoren
verabreicht werden. Solche Antikörper
können
durch Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt
sind. Alternativ sind solche Antikörper zum Beispiel von R & D Systems, Minneapolis,
MN kommerziell erhältlich und
sie können
durch gut bekannte Verfahren verabreicht werden.
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Die immunologische Unterbrechung
einer Schwangerschaft kann erreicht werden. Es wurde zum Beispiel
gezeigt, dass bei einer Injektion von 5 bis 25 mg von gereinigtem
Anti-hCG in drei Patientinnen mit ektopischen Schwangerschaften,
sich die Eileiterschwangerschaft bei einer der Patientinnen vollständig auflöste, während die
zwei anderen deutlich verringerte Progesteron- und Östrogengehalte
aufwiesen, was auf eine deutliche Abnahme der Lebensfähigkeit
der Schwangerschaft hinweist. Frydman et al., „Phase I Clinical Trial of
Monoclonal anti-human Chorionic Gonadotropin Antibody in Women with
an ectopic Pregnancy",
Fertil Steril 152: 734–8
(1989). Diese Autoren verwendeten monoklonale Maus-Antikörper. In
einem neueren Artikel, bei dem menschliche monoklonale Antikörper verwendet
wurden, wurde gezeigt, dass humanisierte Antikörper in der CMV-Behandlung
nach einer Nierentransplantation verwendet werden konnten. Skarp
et al., "Use of
a human monoclonal anti-cytomegalovirus antibody for the treatment
of severe cytomegalovirus alter renal transplantation", Transplant Proc
22: 234 (1990).
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Zusätzlich zu einer systemischen
Verabreichung können
diese speziellen monoklonalen Antikörper ebenfalls direkt innerhalb
der Gebärmutterhöhle und
möglicherweise
innerhalb des Eileiters, wie vorstehend beschrieben ist, angewandt
werden.
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Die Verabreichung von TGFβ und Hemmstoffen
und deren Antagonisten kann wie vorstehend beschrieben, zum Beispiel
parenteral, durch intravenöse
Injektion, durch interuterine Infusionen, Gele oder Schwämme oder
auf anderen Wegen, die für den
Fachmann offensichtlich sind, ausgeführt werden. Literatur, die
die Verwendung dieser Verfahren zur Behandlung einer Vielfalt von
Krankheitszuständen
beschreibt ist bekannt. Es wurde gezeigt, dass die endokrine Funktion
eines Eierstocks durch eine intrauterine Infusion deutlich verändert werden
kann. Helmer, et al., 1989, J. Reprod. Fertil., 87: 89–101. Es wurde
gezeigt, dass Ratten-Gebärmütter, die
eine intrauterine Injektion des Hormons bekamen, das das Luteinisierung-
Hormon freisetzt, eine signifikant erhöhte Implantationsquote im Vergleich
zu Gebärmütter ohne
Injektion aufwiesen. Jones, R. C. „Blastocyst attachment in
the ovariectomized rat treated with an intrauterine injection of
luteinizing hormone-releasing hormone (LRH)", Acta Endocrinol (Copenh) 103: 266–8 (1983).
Zusätzlich
zur Verwendung von Lösungen
ist die Verwendung von Gelen bekannt, die intracervikal zur Erleichterung
der Wehen und der Entbindung eingeträufelt werden. Siehe zum Beispiel Ekman
et al., „Intracervical
instillation of PGE2-gel in patients with missed abortion or intrauterine
fetal death", Arch
Gynecol 233: 241–5
(1983). Zusätzlich kann
ein intrauterines Vehikel, das entweder zu den derzeit auf dem Markt
vorhandenen ähnlich
ist oder modifiziert ist, zur Erleichterung einer langsameren Abgabe
eines pharmakologischen Wirkstoffes verwendet werden, der entweder
die TGFβ-
oder TUN-Synthese erhöht
oder vermindert. Ein Beispiel für
ein solches intrauterines Vehikel zur langsamen Abgabe kann in Zhu
et al. „The
effect of intrauterine devices, the stainless steel ring, the copper
T220, and releasing levonorgestrel, on the bleeding profile and
the morphological structure of the human endometrium- -a comparative
study of three IUDs. A morphometric study of 96 cases" Contraception 40: 425-38 (1989) gefunden
werden.
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Erfindungsgemäße Kits zur Bestimmung der Fibronectinerzeugung,
die den transformierenden Wachstumsfaktor-β in einer physiologisch verträglichen
Lösung
und einen Assay zum (1) selektiven Trophoblasten-Fibronectinnachweis
umfassen, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Herkömmliche Kitkomponenten,
wie zum Beispiel Puffermittel, antibakterielle Mittel, Stabilisatoren
und Arzneimittelträger
werden ebenfalls von den Kits der vorliegenden Erfindung umfaßt. Solche
Komponenten sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und werden
zum Beispiel in The United States Pharmacopeia – The National Formulare, 22te überarbeitete
Ausgabe, 1. Januar 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, Remington's Pharmaceutical
Sciences, Gennaro, A. R., Herausgeber, Mack Publishing Company,
Easton, PA (1985) erörtert,
auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
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Die folgenden Beispiele sollen die
vorliegende Erfindung nur erläutern
und sollen in keiner Weise derart ausgelegt werden, dass sie den
Umfang der Erfindung auf eine beliebige Art beschränken. Diese Beispiel
und deren Äquivalente
werden dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung und der
beigefügten
Ansprüche
klarer werden.
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BEISPIEL 1
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Zellkultur
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Zytotrophoblasten wurden von einem
Plazenta im normalen Zustand durch das Verfahren von Kliman et al.,
1986, Endocrinology, 118: 1567–1582 hergestellt.
Isolierte Trophoblasten wurden wie in Kliman, vorstehend beschrieben
ist, gezählt.
Vor der Zellenbeschichtung wurden die Trophoblasten in Dulbeccos
minimalen essentiellen Medien (DMEM) mit hinzugefügten Glutamin
und Gentamicin mit oder ohne Serum suspendiert. Vor der Beschichtung
betrug die Konzentration dieser Zellsuspension 2 × 106/ml.
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BEISPIEL 2
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Identifikation
eines von einem Blutplättchen
abstammenden TUN-Stimulierungsfaktor im Serum
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Trophoblastenzellkulturen wurden
auf Glas- oder Kunststoffsubstraten, wie in Beispiel 1 beschrieben
ist, hergestellt. Die Erzeugung von TUN durch Trophoblasten in einem
Serumenthaltenden Medium wurde durch die Kultivierung von Trophoblasten
in verschiedenen Serumkonzentrationen beobachtet. Es wurde festgestellt,
dass die TUN-Erzeugung Dosisabhängig
ist, wobei die Konzentrationen des nachweisbaren TUN in den Medien
schrittweise von 1 bis 20 μg/ml
zunahm als die Serummenge in den Medien schrittweise von 1 bis 10%
erhöht
wurde. Ein Prozent bis 10% der Serum-enthaltenden Medien erzeugten Zellen,
die morphologisch identisch erschienen, mit einem deutlichen Anzeichen
für eine
Ausbreitung und Bildung von Aggregaten und Synzytia. Bei einer Kultivierung
von Trophoblasten in Serum-freien Medien und in Abwesenheit von
TGFβ wurde
keine TUN-Erzeugung beobachtet.
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Die Verwendung einer Nabelschnurserumprobe
von einem Baby mit schwerer alloimmuner Thrombozytopenie (schwerer
Blutplättchenmangel) führte zu
einer sehr geringen TUN- Stimulation,
was vermuten läßt, dass
ein entscheidender TUN-Stimulierungsfaktor von Blutplättchen abstammt.
Zum Nachweis, dass der TUN-Stimulierungsfaktor tatsächlich von
Blutplättchen
abstammt, wurde Blut aus einem gesunden Donor gezogen und in zwei
Zentrifugenröhrchen
eingeteilt, denen ein Anti-Koagulans zugegeben worden war. Ein Röhrchen wurde
bei einer hohen Geschwindigkeit geschleudert (2000 rpm × 10 min).
das andere Röhrchen
wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit geschleudert (500 rpm × 10 min).
Das Röhrchen
bei der hohen Geschwindigkeit wies keine Blutplättchen in der überstehenden Flüssigkeit
auf und bei dem Röhrchen
bei der geringen Geschwindigkeit waren so gut wie alle Blutplättchen in
der überstehenden
Flüssigkeit
geblieben. Bei beiden Plasmen wurde eine Gerinnung herbeigeführt und
das resultierende Serum wurde als Blutplättchen-reich (niedrige Umdrehungsgeschwindigkeit) und
als Blutplättchen-arm
(hohe Umdrehungsgeschwindigkeit) markiert. Nur das Blutplättchen-reiche Serum
veranlasste die Trophoblasten zunehmende Menge an TUN herzustellen.
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BEISPIEL 3
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TUN-Stimulierung
durch Zugabe von TGFβ
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Trophoblasten, die nach der Beschreibung
in Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden in 2% Blutplättchen-armem
Serum oder in Serum, das von dem Neugeborenen mit alloimmuner Thrombozytopenie
abstammt, in Gegenwart von exogen zugegebenem TGFβ1 kultiviert.
50 bis 200 pM TGFβ riefen nach
48 Stunden eine Reaktion der 3 bis 4-fachen Induktion an TUN hervor,
wobei die TUN-Gehalte in den Medien von näherungsweise 1 μg/ml auf
4 μg/ml zunahmen.
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BEISPIEL 4
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TGFβ-Antagonist
hemmt die TUN-Erzeugung
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Blutplättchen-reiches Serum wurde
getrennt während
6 Stunden mit zwei verschiedenen handelsüblichen TGFβ neutralisierenden Antikörpern (R & D Systems, Minneapolis,
MN) mit Konzentrationen von 50 bis 100 μl vorinkubiert. Trophoblasten,
die nach der Beschreibung in Beispiel 1 unter Verwendung des mit
TGFβ neutralisierenden
Antikörpern
vorinkubierten Serums hergestellt worden waren, zeigten nicht nachweisbare
Mengen der TUN-Synthese durch Western Immunoblots. (Die Zugabe von
1 ng/ml während
48 Stunden von entweder nur dem von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor zu
den Trophoblastenkulturen oder in Kombination mit 1 ng/ml TGFβ, wies auf
die TUN-Produktion keine zusätzliche
Wirkung auf). Diese Feststellung bestätigt weiterhin, dass TGFβ in der TUN-Stimulation
eine signifikante Rolle einnimmt.
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BEISPIEL 5
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Herstellung
von Platten
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Kunststoffplatten mit sechs Vertiefungen wurde
mit einer Lösung
aus Plasma-Fibronectin (Boehringer) vorbeschichtet, die mit einer
Konzentration von 10 μg/ml
in einer Phosphatgepufferten Salzlösung hergestellt worden war.
Ein ml dieser Lösung wurde
auf jede der Platten mit den sechs Vertiefungen aufgetragen. Die
Platten wurden bei Raumtemperatur während 8 bis 10 Stunden inkubiert.
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BEISPIEL 6
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Wirkung des
zugegebenen TGFβ auf
die Trophoblastenanlagerung
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Es wurde die Wirkung von TGFβ auf die
Trophoblastenanlagerung an Plasma-Fibronectinoberflächen untersucht. Zu jeder Platte,
der nach der Beschreibung in Beispiel 5 hergestellten Platten mit sechs
Vertiefungen, wurde ein ml einer Zellsuspension in Serumfreien Medien
zugegeben, die nach der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt worden
sind. Nach dem Aufbringen der Zellen wurde eine Stammlösung (1
ng/μl) des
transformierenden Wachstumsfaktor-β (R & D Systems, Minneapolis, MN) zu der Zellkultur
gegeben, woraus sich eine Endkonzentration von 1 ng/ml in den Trophoblastenkulturen
ergab, die TGFβ erhielten.
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Die Zellen wurden während 48
Stunden kultiviert. Danach wurde das Medium entfernt, die Kulturen
vorsichtig mit PBS gewaschen und mit 10% neutral gepuffertem Formalin
während
10 Minuten fixiert. Eine genaue Untersuchung der Zellen durch Lichtmikroskopie
zeigte einen deutlichen quantitativen Unterschied zwischen den Zellen,
die mit TGFβ behandelt
worden waren und denjenigen, die nicht mit TGFβ behandelt worden waren. In
Abwesenheit von vorbeschichtetem Plasma-Fibronectin waren ungefähr 97% der
Zellen rund. Mit zugegebenem Plasma-Fibronectin, das mit 10 μg/ml aufgetragen
worden war, waren ungefähr 70%
der Zellen rund während
die restlichen als flach und dazwischenliegend eingeteilt wurden.
Mit der Zugabe von lng/ml Säure-aktiviertem
TGFβ waren
weniger als 25% der Zellen rund, beinahe 40% lagen dazwischen und
ungefähr
35% der Zellen waren flach. Diese Ergebnisse weisen darauf hin,
dass die Kombination von sowohl vorbeschichtetem Plasma-Fibronectin
als auch zugegebenem TGFβ,
das die Trophoblastenabsonderung von TUN stimuliert, in der Lage
ist, die Trophoblastenanlagerung an Kulturoberflächen unter Serum-freien Bedingungen
zu erhöhen.
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Es wurde weiterhin festgestellt,
dass das vorbeschichtete Fibronectin leicht durch die Trophoblasten
abgebaut wird, wobei mehrere proteolytische Fragmente in die Medien
freigesetzt werden. Umgekehrt dazu waren vorbeschichtete amniotische
Flüssigkeiten
und Trophoblasten-Fibronectin sehr beständig gegenüber Verdauung durch die Trophoblasten
und es wurden geringe proteolytische Fragmentgehalte gefunden. Dies
könnte
erklären,
wie Trophoblasten gleichzeitig eindringen und die mütterliche uterine
extrazelluläre
Matrix verdauen können,
und noch neue TUN-enthaltende, Protease-beständige extrazelluläre Matrixkomponenten
während
der Implantation synthetisieren und abscheiden können.