DE69013350T2

DE69013350T2 - Von casein-beta ausgehendes verfahren zur herstellung von fraktionen, die mit biologisch aktiven peptiden angereichert sind sowie die so erhaltenen peptidfraktionen.

Info

Publication number: DE69013350T2
Application number: DE69013350T
Authority: DE
Inventors: Joelle Leonil; Jean Maubois; Daniel Molle; Francoise Nau
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1989-08-16
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2010-08-17
Also published as: ATE112683T1; WO1991002539A1; EP0487619A1; ES2064759T3; FR2650955A1; FR2650955B1; DK0487619T3; EP0487619B1; DE69013350D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, ausgehend von Casein β, zur Herstellung von Peptidfraktionen, die physiologische Aktivitäten beinhalten.
Casein β stellt etwa 34 Gew.-% des Gesamtcaseins der Kuhmilch, das sind etwa 8,5 g/l, und 60 bis 65% des Gesamtcaseins der Ziegenmilch dar. Das Casein β der Kuhmilch besteht aus einer einzigen Peptidkette und enthält weder Cystein noch Kohlenhydrate, ist aber prolinreich (ALAIS, Science du Lait, 1984, 107-199). Casein β kann ausgehend von Milch, von Caseinat oder von nativem Phosphocaseinat nach dem im französischen Patent FRk 2592769 beschriebenen Verfahren oder durch andere Technologien hergestellt werden: Chromatographie auf Ionenaustauscherharzen (MERCIER et al., Bull. Soc. Chim. Biol. 50, 521-530) oder Solubilisierung in der Kälte am isoelektrischen pH-Punkt (MANSON und ANNAN, Biochem. Biophys., 1971, 145, 16-26)
Die Peptidfraktionen, die gemäß der Erfindung ins Auge gefaßt werden, sind:
(A) die Fraktion 1-25,
(B) Vorstufenfraktionen von β-Casomorphin, das die Fraktion 60- 66 darstellt, wobei diese Vorstufen Fragmente sind, die dem Bereich 33-97 des Casein-β-Moleküls entsprechen, sowie
(C) die Fraktion 177-183,
wobei das Auftreten dieser Fraktionen mit Hochleistungsflüssigchromatographie in umgekehrter Phase (RP-HPLC) auf einer C18- Säule mit 20 mM Natriumphosphatpuf fer und Acetonitrilgradient von 0 bis 60% als Eluent und Nachweis bei 214 nm verfolgt wird (LEONIL J. et al., Le Lait, 1988, 68(3), 281-294).
(A) Das Peptid 1-25 enthält eine ursprüngliche Abfolge von phosphorylierten Serinresten (Positionen 15, 17, 18 und 19 der Peptidkette) und wird daher als Phosphopeptid bezeichnet. Dieses Phosphopeptid besitzt wie die anderen Phosphopeptide, die in den anderen Milchcaseinen enthalten sind, die Eigenschaft, die Resorption von Spurenelementen, insbesondere Calcium, durch die Darmwand zu erhöhen, indem es sie innerhalb des Darmlumens im löslichen Zustand hält. Diese Wirkung der von Casein herrührenden Phospholipide auf die Calciumresorption ist seit 1950 bekannt (MELLANDER, Acta Soc. Med. Upsal., 1950, 55, 247-255).
Die Milch und ihre Produkte werden in der Tat als Hauptquelle des Eintrags von Calcium in den menschlichen Organismus angesehen.
Dieser Begriff beruht tatsächlich auf zwei Vorstellungen, der eines quantitativen Eintrags (1200 mg Ca pro Liter Milch) und der einer erhöhten Assimilierbarkeit (85% des in Milchpulver enthaltenen Calciums werden resorbiert im Vergleich zu 22 bis 72% des in der täglichen Pflanzennahrung enthaltenen Calciums - RENNER in Milk and Dairy Products in Human Nutrition, Seite 190-233). Die Effizienz der Darmresorption von Milchcalcium wurde lange nach einem Mechanismus, der in den ersten Darmabschnitten (Zwölffingerdarm und Leerdarm) stattfindet, nur der Lactose zugeschrieben: Die Biotransformation dieses Zuckers in Milchsäure würde die Energiebarriere der Epithelialzellen senken und zu einem Eindringen des Calciums in Form von Lactat oder von löslichen Komplexsalzen führen. Die kürzlich erzielten Ergebnisse zeigen im Gegenteil eher, daß ein nicht vernachlässigbarer Teil der Darmresorption des Milchcalciums nach einem anderen Mechanismus erfolgt, bei dem Peptidsegmente eine Rolle spielen, die von Caseinen stammen: die Phosphopeptide.
Die Caseine αs, B und K enthalten in der Tat Abfolgen von phosphorylierten Serinresten, die diesen Proteinen ein sehr ausgeprägtes Chelatisierungsvermögen gegenüber Erdalkalielementen (Ca²&spplus; und Mg²&spplus;) und Spurenelementen verleihen. Diese Fähigkeit wächst in gleichem Maße wie der Phosphorylierungsgrad, d.h. die sequestrierende Fähigkeit der verschiedenen Caseine verhält sich wie folgt αs2 > αs1 > β > K. Die Verteilung der Phosphoserinpositionen ist nicht gleichmäßig; so befindet sich der Hauptteil dieser Positionen bei den Caseinen αs und β zwischen den Resten 46 bis 68 bzw. zwischen den Resten 1 bis 20. Wegen des hohen Chelatisierungsvermögens dieser Phosphopeptide (CPP) ist der gesamte Phosphor und das gesamte Calcium der Micellen an sie gebunden. Daraus folgt, daß diese Abfolgen eine wesentliche Rolle für die Stabilität der Caseinmicellen und für die Mechanismen, die die Gelbildung bei der Gerinnung der Milch beherrschen, spielen. Jedoch führten die ganz besonderen physikochemischen Merkmale dieser CPP gleichermaßen zu der Annahme, daß sie bei der Darmresorption der Mineralstoffe und Spurenelemente eine Rolle spielen könnten.
Diese CPP findet man in der Tat bei Ratten, die auf Caseinbasis ernährt wurden, im Darmlumen in einer Form wieder, die mit der identisch ist, die man beim enzymatischen Abbau desselben Caseins in vitro erhält. Ausgehend von Experimenten, die sie an abgebundenen Zwölffingerdarmschlingen ausführten, bestätigten LEE et al. (Agric. Biol. Chem., 1979, 43, 2009-2011) nicht nur, daß die CPP die intraluminale Löslichkeit des Calciums erhöhen, sondern wiesen auch eine Erhöhung der Darmresorption dieses Elements nach. Es wurde übrigens nachgewiesen, daß diese Resorption nicht die Beteiligung von Vitamin D erfordert. Obwohl diese Ergebnisse beim Huhn erhalten wurden, präzisierten sie die Beobachtungen, die MELLANDER und OLSON (Bol. Med. Hosp. Infanc. Mex., 1956, 13, 243- 246) zuvor an zwei Gruppen von rachitischen und nichtrachitischen Kindern gemacht hatten, welche mit Trypsin gewonnene Hydrolysate von Casein erhielten. In jüngerer Zeit wurde diese Erhöhung der Bioverfügbarkeit des Calciums durch die CPP ganz besonders von GERBER und JOST (Calcif. Tissue Int., 1986, 38, 350-357) veranschaulicht. Das in-Kontakt-Bringen dieser Caseinsegmente mit embryonalen Knochenextrakten (Oberschenkelknochen, Schienbein und Mittelfuß) induzierte die Mineralisation dieser Organe. Diese Eigenschaft ging verloren, wenn man eine enzymatische Dephosphorylierung der CPP vornahm. Was den biochemischen Mechanismus betrifft, in den die CPP bei der Darmresorption des Calciums eingriffen, wäre nach SATO et al. (J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1986, 32, 67-76) die wahrscheinlichste Hypothese, daß die CPP das Ausfallen der Calciumsalze im Dünndarm hemmten und so eine passive Resorption im Krummdarm begünstigten.
Die Isolierung der Phosphopeptide kann entweder ausgehend von Milch, von Caseinaten oder von einem der Caseine, am häufigsten von Casein β,erfolgen. Nach der Hydrolyse durch Trypsin werden die Phosphopeptidsequenzen durch Kontaktieren mft Calcium und mineralischem Phosphat aggregiert. Die Auftrennung und die Reinigung des Aggregats erfolgt durch Ultrafiltration auf Membran oder durch Gelfiltration oder auch durch Ionenaustauschchromatographie. Die kommerziellen Zubereitungen sind durch einen hohen Gehalt an Glutaminsäure (28 Gew.-%), Serin < 9 Gew.-%), Calcium (7 Gew.-%) und Phosphor (3,6 Gew.-%) sowie eine sehr große Löslichkeit (200 g/l) gekennzeichnet. Sie können in großer Menge Spurenelemente chelatisieren, ohne daß ihre Löslichkeit dadurch verändert wird.
(B) Die Fraktionen, die in ihrer Sequenz das Fragmant 60-66, das man β-Casomorphin nennt, enthalten, können als Vorstufe des β- Casomorphins angesehen und als Pro-β-Casomorphine bezeichnet werden. β-Casomorphin wird als ein Exorphin beschrieben, ein exogenes Äquivalent der Endorphine (endogene opiatartige Stoffe, deren bekannteste die Met- und die Leu-Enkephaline sind), deren gesamte Eigenschaften der Regulierung des Elektrolytdurchgangs (antidiarrhetische Wirkung), der Schlafinduktion, der Schmerzunterdrückung oder der Immunomodulation es besitzt (E. PAROLI, Wld Rev. Nutr. Diet., Vol. 55, Seite 58-97; KARGER, BASEL, 1988).
Die Freisetzung von Peptiden mit opiatähnlicher Wirkung bei der digestiven Hydrolyse von Nahrungsproteinen wurde bei Forschungen über die Kausalitätsbeziehungen zwischen der schizophrenen Psychose und der Art der Nahrung nachgewiesen. Tatsächlich hatten zahlreiche Beobachtungen bis zum Ende der 60er Jahre die enge Korrelation zwischen einer auf Getreide basierenden Nahrung und dem Syndrom der Bauchhöhlenkrankheit, eines Darmleidens, das Patienten betrifft, die Gliadin (eines der Proteine des Glutens) verzehren, bei Personen, die für Schizophrenie prädisponiert sind, gezeigt. Das Verschwinden der Symptome, das mit dem Ausschluß von Gliadin aus der Nahrung verbunden ist, und andererseits ihr Wiederauftreten, wenn den Patienten Proteine des Glutens, von Soja oder der Milch verabreicht wurden, das Auslösen von Verhaltensänderungen bei Tieren, die oral oder durch intracerebrale Injektion Glutenproteine erhalten haben, bildeten eine Gesamtheit von Tatsachen, die die Forscher dazu veranlaßten, eine direkte psychotoxische Wirkung eines Glutenpeptids zu vermuten.
Die Ähnlichkeit der beobachteten Symptome mit denen, die mit der Sekretion von Peptiden mit opiatähnlicher Wirkung durch das Gehirn und die Hirnanhangdrüse (Enkephaline und Endorphine) verknüpft ist, führte zur Suche nach diesenopiatartigen Stoffen in den Proteinen der Nahrung. Diese Exorphine wurden in den mit Pepsin erhaltenen Hydrolysaten von Weizengluten, von Casein αs und von Casein β nachgewiesen. Die Tatsache, daß die gesamten Primärsequenzen der Caseine aufgeklärt wurde, erlaubte einen sehr raschen Fortschritt der Forschungen über die in den Milchproteinen vorhandenen exorphinartigen Aktivitäten. So konnten BRANTL et al. bald der Abfolge 60-66 des Caseins β (Tyr - Pro - Phe - Pro - Gly - Pro - Ile) die in einem kommerziellen Peptoncasein nachgewiesene morphinomimetische Wirkung zuschreiben. Diese Sequenz wurde β-Casomorphin 1-7 genannt. Die Notwendigkeit der Gegenwart der Verknüpfung Tyr - X - Phe oder Tyr - X&sub1; - X&sub2; - Phe in Peptiden mit opiatähnlicher Wirkung endogener oder exogener Herkunft erlaubte zu zeigen, daß es in der Sequenz der Proteine der Milch, die von den verschiedenen Säugerarten erzeugt wird, zahlreiche Exorphine gibt. Die Caseine αs und β scheinen die Hauptquellen dieses Peptidtyps zu sein, sei es in der Muttermilch oder in der Kuhmilch (sehr ähnliche und sogar identische Sequenzen wurden auch in den Caseinen des Schafes, des Büffels und des Kamels gefunden), obwohl sie auch in der Sequenz der beiden Hauptproteine des Lactoserums, α-Lactalbumin und β-Lactoglobulin, vorhanden sind (CHIBA H. et al., 1986, in "Protein tailoring for food and medical uses", Seite 123-153 (Hrsg. Freeney R.E. und Whitaker J.R.); Marcel Dekker, N.Y.").
Der Tyr-Rest in N-terminaler Position würde die bevorzugte Wechselwirkung mit den u-Rezeptoren des Gehirns, die überwiegend im Hypothalamus und Thalamus vorhanden sind, erlauben. Diese Rezeptoren spielen bei der supraspinalen Analgesie, der Prolactinfreisetzung, der Regulierung der Darmbewegungen und des Acetylcholinspiegels eine Rolle. Die Gegenwart eines Arg-Restes in N-termjnaler Position vor einem Tyr würde im Gegenteil die Wechselwirkungen mit den δ-Rezeptoren begünstigen, die sich im Rückenmark und im limbischen System, den Sitzen der gefühlsmäßigen Empfindungen und der Lernreflexe (Belohnung und Strafe), befinden.
Die Gegenwart von Exorphinen, die von Casein αs herstammen, und von β-Casomorphinen wurde durch Immunochemie im Zwölffingerdarm von Minischweinen, die Casein aufgenommen hatten, und im Dünndarm erwachsener Menschen, die Milch zu sich genommen hatten, nachgewiesen. Bisher wurde im Blutplasma erwachsener Säuger keine Verbindung gefunden, die mit Antiexorphinen reagiert. Dagegen wurde im Plasma neugeborener Kälber eine Vorstufe des β-Casomorphins 7 nachgewiesen. Ebenso fand man in Blutplasmaproben, die schwangeren und stillenden Frauen entnommen wurden, positive Reaktionen mit Anti-β-Casomorphinen 7 und 8, während diese Reaktionen bei Plasma, das Männern und nicht schwangeren Frauen entnommen wurde, die zur Kontrolle dienten, negativ war.
Schließlich wurde im Blutplasma mehrerer Frauen, die unter Psychose nach der Niederkunft litten, eine Verbindung nachgewiesen, die dem β-Casomorphin sehr ähnlich ist.
Eine Übersicht über diese verschiedenen Wirkungen gibt der Artikel von E. Paroli, Wld Rev. Nutr. Diet., Vol. 55, Seite 58- 97, Karger, Basel, 1988.
Ausgehend von dieser Gruppe von Beobachtungen postulierte TESCHEMACHER (Human Lactation 3. Goldman ed., Plenum Press, New York, 1987, 213-225; und Adv. Biosci, 1987, 65 41-48) , daß sich die β-Casomorphine an der endokrinen Regulierung der Schwangerschaft und der sekretorischen Aktivität der Brustdrüse beteiligen, indem sie die Freisetzung von Octocin und Prolactin modulieren. Diese Hypothese nimmt offensichtlich an, daß das von den Brustdrüsenzellen erzeugte Casein β oder ein Fragment dieses Moleküls, das β-Casomorphin enthält, während der Milchbildung in den Blutkreislauf übertragen wird. Nun wurden aber solche Übertragungen aus Brustdrüsenzellen ins Blut bereits für α-Lactalbumin und Casein κ nachgewiesen. Die Hypothese von TESCHEMACHER berücksichtigt auch die Erhöhung des Prolactinspiegels im Plasma, die man bei Ratten festgestellt hat, denen auf systemischem Weg β-Casomorphin injiziert wurde. Es scheint also, daß es bei den physiologischen Veränderungen des Organismus, die mit der Schwangerschaft und im weiteren Sinne der Fortpflanzung der Säuger einhergehen, in irgendeiner Weise eine Vertretung oder Verstärkung der endogenen Opiate des Gehirns durch Verbindungen mit morphinomimetischer Wirkung, die von der Brustdrüse ausgeschüttet werden, gibt.
Ausgehend von Experimenten, die mit den verschiedenen β-Casomorphinen bei Hunden durchgeführt wurden, wurde ein komplexer Mechanismus der Regulierung des Appetits und der Nahrungsaufnahme nachgewiesen, bei dem diese Exorphine im Gegenspiel mit den Endorphinen eine Rolle spielen. Die Aufnahme einer Testmahlzeit, die Saccharose enthielt und der β-Casomorphine oder nur Caseopepton zugesetzt wurden, erhöhte tatsächlich den Plasmainsulinspiegel um das 6- oder 7-fache (NIETER et al., Diabetologia, 1981, 21, 309). Die Aufnahme ähnlicher Mahlzeiten oder solcher, bei denen das Caseopepton durch frische Milch ersetzt war, rief im Blutplasma das Auftreten einer Komponente hervor, die mit einem Antistomatostatin reagierte. Die postprandiale Erhöhung des Insulin - und Somatostatinspiegels wurde unterdrückt, wenn der Mahlzeit Naloxon, ein spezifischer Inhibitor der opiatartigen Stoffe, zugesetzt wurde oder auch wenn intravenös Endorphine, wie Leu- und Met-Enkephalin, injiziert wurden.
Die analgetische Wirkung der von Casein β herstammenden Exorphine wurde sehr eingehend untersucht. Auf der Grundlage des "dit"- Tests des Wegziehens des Schwanzes der Maus nach Zwicken erlaubte die intracerebroventrikulare Injektion verschiedener β-Casomorphine, ihre Antischmerzwirkung nicht nur untereinander sondern auch im Vergleich zu Morphin zu quantifizieren. Zum Beispiel ist das β-Casomorphin 1-5 10- bis 20-mal weniger aktiv als Morphin, obwohl 0,06 bis 2 umol pro Ratte ausreichen, um eine erhebliche analgetische Wirkung zu erzielen; dagegen wären Analoge wie das NH&sub2;-β-Casomorphin 1-4, das auch Morphiceptin genannt wird, die durch Substitution der L-Aminosäuren in Position 2 und 4 durch D-Aminosäuren oder durch Pipecolinsäure modifiziert wurden, 10-mal aktiver als Morphin. Die Bildung von Morphiceptin im Dünndarm erscheint sehr wahrscheinlich, da mit einem spezifischen Antikörper eine positive Reaktion beobachtet wird und da im Magen-Darm-Trakt und im Bauchspeichel Amidierungsenzyme vorhanden sind. Die Übertragung der bei der Ratte gemachten Beobachtungen auf den Menschen ist bei weitem nicht offensichtlich, aber es ist erlaubt, die analgetische Wirkung der Milchexorphine mit den Beobachtungen in Verbindung zu bringen, die täglich in bezug auf das Verhalten Neugeborener nach der Still- oder Fläschchenmahlzeit gemacht werden. Die Ruhe und die Schlafinduktion nach der Mahlzeit können ohne weiteres von der Bildung von Exorphinen im Darm herrühren. Eine ähnliche Schlußfolgerung formulieren STURNER und CHANG (Pediatr. Res., 1988, 23, 4), die den sehr hohen Gehalt infantiler vorverdauter Milch an β-Casomorphin (9500 nmol/g) und Morphiceptin (1,4 nmol/g) mit der signifikanten Reduktion des Schreiens und mit dem ausgedehnteren Schlaf bei Kindern, die diese Milch erhielten, in Zusammenhang brachten.
Außerdem bewiesen die Arbeiten von HAUTEFEUILLE et al. (Am. J. Physiol.; Gastrointes. Liver Physiol., 250 G 92 - G 97, 1986) und TOME et al., daß die β-Casomorphine 1 - 7 und Morphiceptin bei in-vitro-Tests, die in Ussing-Kammern durchgeführt wurden, wie die Endorphine die Absorption der Elektrolyte erhöhten. Infolgedessen hätten sie eine potentielle antidiarrhetische Wirkung.
(C) Das Peptid 177-183 wird als Inhibitor des Enzyms für die Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II (Angiotensin umsetzendes Enzym oder ACE) beschrieben. Wie alle Inhibitoren dieses Enzyms wäre dieses Peptid ein potentielles Antihypertonikum, da es erlauben würde, den Arteriendruck zu senken.
Da die systematische Untersuchung der Sequenzen der ACE-inhibitorischen Peptide gezeigt hat, daß sie alle am COOH-Terminus die Verknüpfung Pro-Pro, Ala-Pro oder Ala-Hyp aufweisen, hat man in den Peptiden, die von der Hydrolyse des Caseins durch Trypsin herstammen, nach einer solchen Verknüpfung gesucht. Mit Hilfe von zwei in-vitro-Tests, die auf der Inaktivierung von Bradykinin (gefäßerweiternde-blutdrucksenkende Verbindung, die auch Kontraktionen des Uterus der Ratte und des Krummdarms der Ratte hervorruft) durch ACE beruhen, hat man drei ACE-inhibitorische Peptidsequenzen identifiziert, von denen eine, die als CEI B&sub7; bezeichnet wird, die Verknüpfung Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg besitzt und den Abschnitt 177-183 von Casein β bildet.
Eine weitere mögliche Wirkung des Peptids 177-183 wäre nach MIGLIORE-SAMOUR und JOLLES (Experimenta, 1988, 44, 158-163) eine immunomodulierende Wirkung, die die Erzeugung von Antikörpern begünstigt.
Wegen der Analogie mit den immunomodulierenden Wirkungen von Peptiden, die von Bakterien erzeugt werden, stellten sich PARKER et al. (Eur. J. Biochem., 1984, 145, 677-682) die Frage nach der Möglichkeit der Existenz von Fraktionen mit ähnlicher Wirkung in der ersten Nahrung des Menschen, also in der Milch. Ihr sehr finalistischer Ansatz stützte sich auf die Feststellung der Widerstandsfähigkeit des an der Brust ernährten Neugeborenen gegenüber bakteriellen Infektionen, die er schon seit jeher vor jeder Entwicklung der Pharmakotherapie besitzt. Mit Hilfe zweier in-vitro-Tests, der Sekretion hämolytischer Antikörper gegen rote Blutkörperchen des Schafs durch die Milzzellen der Maus und der Phagocytose von roten Blutkörperchen des Schafs durch Makrophagen der peritonealen Zellen der Maus, wiesen sie eine immunostimulierende Aktivität im mit Trypsin erhaltenen Hydrolysat menschlichen Caseins nach. Das verantwortliche Peptid wurde gereinigt und identifiziert. Es handelte sich um die Sequenz Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr, die dem Segment 54-59 des menschlichen Casein β entspricht. Diese Sequenz wurde synthetisiert und parallel mit dem natürlichen Peptid erwachsenen Mäusen intravenös in Dosen der Größenordnung 0,5 mg/kg verabreicht. Die beiden Peptide erhöhten die Resistenz gegen eine Infektion mit Klebsiella pneumoniae erheblich, aber das natürliche Peptid war sehr viel effektiver. Zu bemerken ist, daß sich die Sequenz 54-59 großenteils in der Sequenz der Exorphinaktivität des menschlichen Casein β wiederfindet (β-Casomorphin 1-7). Außerdem wurde dieselbe immunostimulierende Wirkung für die Sequenz 63-68 des Casein β des Rindes, nämlich Pro-Gly- Pro-Ile-Pro-Asn, nachgewiesen (MIGLIORE-SAMOUR und JOLLES, 1988, gemäß der oben zitierten Veröffentlichung).
Das Ziel der Erfindung wird dadurch erreicht, daß man die Hydrolyse von Casein β durch ein proteolytisches Enzym (Hydrolyse durch Trypsin) in salzigem Medium durchführt, wobei diese Hydrolyse eine schonende Hydrolyse ist, die in diesem Medium das Auftreten eines Niederschlags hervorruft, der sich leicht von der löslichen Phase trennen läßt.
Das Interesse an dieser Trennung beruht auf der Tatsache, daß die lösliche Phase fast nur das Phosphopeptid (Peptid 1-25) enthält und die Sequenzen, die β-Casomorphin enthalten, die Fraktion, die mit Peptid mit antihypertensiver Wirkung angereichert ist (Fraktion 177-183), durch eine erneute Hydrolyse des Niederschlags durch ein proteolytisches Enzym (Hydrolyse durch Trypsin) erhalten wird.
Das Verfahren der Erfindung verwirklicht die unerwarteten und gleichzeitigen Eigenschaften der spezifischen Freisetzung des Peptids 1-25 und der partiellen Insolubilisierung des "Restes" des Casein-β-Moleküls bei der Hydrolyse von Casein β durch Trypsin in salzigem Medium, insbesondere mit hoher Ionenstärke.
Die Hydrolyse von Casein β durch Trypsin ist in der Literatur von Forschern beschrieben, die die Primärsequenz (Abfolge der Aminosäuren) dieses Proteins bestimmt haben (RIBADEAU, DUMAS et al., 1970, Eur. J. Biochem., 14 451-459) - Die Bildung der Peptide 1- 25 und 177-183, die mit der Spezifität des Trypsins zusammenhängt, wird angegeben, aber es wird keine Bildung eines Niederschlags beim pH-Wert der Hydrolyse (8,5) erwähnt, und diese Hydrolyse wird nicht in einem Medium mit hoher Ionenstärke durchgeführt. Dasselbe gilt für die jüngsten Arbeiten über die analytische Charakterisierung der Peptide, die sich bei der Hydrolyse von Casein β durch Trypsin bilden: CARLES et al. (J. Dairy Res., 1986, 595-600); LEADBEATER und WARD (J. of Chromatography, 1987, 397, 435-443); PETRILLI et al. (Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 29, 504-508). Dagegen beschreiben diese Autoren die Bildung eines Niederschlags, wenn der pH des Hydrolysats auf 4,6 abgesenkt wird. Da dieses Ausfallen nach der vollständigen Hydrolyse des Casein β erfolgt, ist offensichtlich, daß sich die Zusammensetzung des Niederschlags und die der überstehenden Lösung an Peptiden von den Produkten der vorliegenden Erfindung sehr unterscheiden. Die Originalität der vorliegenden Erfindung liegt in der Tatsache, daß die Gegenwart eines Mediums mit hoher Ionenstärke es erlaubt, in der ersten Phase der Hydrolyse eine beschränkte Proteolyse mit gleichzeitiger Insolubilisierung bestimmter Hydrolyseprodukte durchzuführen.
Auf die Bildung eines Niederschlags bei der Hydrolyse von Casein β durch Trypsin weist CHRISTENSEN hin (Arch. Biochem. Biophys., 1954, 128-137), aber diese Hydrolyse wird nicht in salzigem Medium durchgeführt, und der Autor formuliert die Hypothese, daß der Niederschlag ein Polymer sei, was den Fachmann dazu bringt, sich nicht mehr für diesen Niederschlag, dessen Zusammensetzung unbekannt ist, zu interessieren. PETERSON et al. (J. Amer. Chem. Soc., 1958, 80, 95) erwähnen ebenfalls die Bildung eines Niederschlags während der Hydrolyse von Casein β durch Trypsin. Diese Hydrolyse erfolgt im Gegensatz zu der der vorliegenden Erfindung in Abwesenheit von Salz.
LEONIL et al. (Lait, 1988, 68 (3), 281-294, und Colloque INSERM "Second Forum on Peptides" Vol. 174, S. 65-68, John Libbey Eurotext Ltd, 1988> haben die Kinetik der Hydrolyse von Casein β durch Trypsin beschrieben und weisen darauf hin, daß die Bildung des Niederschlags von der Anfangskonzentration von Casein β und vom Verhältnis E/S abhängt. Dieser Niederschlag wäre aus den Fragmenten 29-209, 106-209, 108-209 zusammengesetzt, aber ihre Untersuchung wird nicht in salzigem Medium durchgeführt.
CARLES et al. (FEBS Letters, 1988, 229, Nr. 2, 265-272) beschreiben die Hydrolyse von Casein β durch Chymotrypsin und Thermolysin in Gegenwart von Salz, insbesondere KCl. Sie haben nachgewiesen, daß die Gegenwart von Salz die Hydrolyse beschränkt, aber sie haben kein Trypsin verwendet, das eine andere Wirkungsspezifität hat als Chymotrypsin und Thermolysin. Überdies beschreiben diese Autoren nicht die Bildung eines Niederschlags. Die Hydrolyse von Gesamtcasein in salzigem Medium durch Neutrase, Alcalase, Papain und Chymosin wurde gleichfalls durch SANOGO et al. beschrieben (Science des Aliments, 1987 7 385-398), aber sie betrifft weder Casein β noch Trypsin.
Die Herstellung der Peptide nach dem Verfahren der Erfindung ist industriell extrapolierbar. Tatsächlich verwendet dieses Verfahren Trenntechniken, mit denen sich auch größere Mengen Lösung behandeln lassen.
Man kennt mehrere Verfahren, die eine Herstellung der genannten biologischen Peptide im Labor erlauben. Zur Veranschaulichung der Herstellung der Fraktion 1-25 kann man die von PETERSON et al. veröffentlichte zitieren (J. Am. Chem. Soc., 1958, 80, 95-99), bei der der im Reaktionsmedium gebildete Niederschlag nach einem Abbau von Casein β durch Trypsin durch Zentrifugieren entfernt wird. Die resultierende überstehende Lösung, die das Phosphopeptid 1-25 enthält, wird auf pH = 4,7 angesäuert und erneut von einem Niederschlag befreit, der sich bei diesem pH-Wert bildet. Die phosphopeptidreiche überstehende Lösung wird durch aufeinanderfolgende Zugabe von Bariumchlorid und Fällung unter der Einwirkung von Ethanol in Form eines Bariumsalzes gereinigt.
Dieses Verfahren wird in folgendem Schema zusammengefaßt: 3%ige Lösung von Casein β pH = 7,2 + 0,01% Trypsin 20 min bei 25ºC (I) Fällung 25% des Gesamtstickstoffs 0% des Gesamtphosphors überstehende Lösung auf pH = 4,7 eingestellt (II) Niederschlag 22% des Gesamtstickstoffs 18% des Gesamtphosphors überstehende Lösung Zugabe von BaCl&sub2; mit zu einer Konzentration von 0,25%; Zugabe eines Vol.-Äquivalents Ethanol (III) Niederschlag 15% des Gesamtstickstoffs 74% des Gesamtphosphors überstehende Lösung auf 1/4 des Volumens konz. Dialyse bei 5ºC (IV) Niederschlag 5% des Gesamtstickstoffs 5% des Gesamtphosphors (V) überstehende Lösung zur Trockne eingedampt 31% des Gesamtstickstoffs 5% des Gesamtphosphors
Um das Phosphopeptid 1-25 zu extrahieren, nehmen diese Autoren den Weg über das Zwischenprodukt eines Bariumsalzes, unter welcher Form sich das Phosphopeptid wegen seiner Unlöslichkeit in Ethanol leichter isolieren läßt. Die endgültige Reinigung des Phosphopeptids verläuft über zwei chromatographische Schritte, von denen der erste auf die Entfernung des Bariums abzielt und der zweite die Gewinnung des Phosphopeptids in reiner Form erlaubt. Dieses Verfahren, das verschiedene Schritte der Fällung des Phosphopeptids in Form des Bariumsalzes (schwieriges Verfahren, dessen Ausbeute nicht sehr hoch ist) sowie chromatographische Verfahren beinhaltet, erweist sich als langwierig und wenig rentabel. Verfahren, die sich von dem vorstehenden nur wenig unterscheiden, wurden von MANSON et al. beschrieben (Arch. Biochem. Biophys., 1971, 145, 16-26), MIKKANENet al. (J. Nutr. 1980, 110, 2141-2148)
Eine Modifikation dieses Verfahrens, bei der die Fällung mit Bariumchlorid durch eine Chromatographie am Ionenaustauscher ersetzt ist, wurde von GERBER et al. eingeführt (Calcif. Tissu Int., 1986 38 350-357). Derselbe methodische Ansatz wird von SATO et al. verfolgt (J. Nutri. Sci. Vitaminol., 1986, 32, 67- 76); diese Autoren fügen einen zusätzlichen Chromatographieschritt durch Gelpermeation hinzu. Man kennt auch das französische Patent Nr. 80-02281, in dem die Herstellung der Phosphopeptide, die sich durch Hydrolyse von Gesamtcasein durch Pancreatin ergeben, beschrieben ist.
Bei keinem dieser Verfahren wird die Verwendung von Salz während der Hydrolyse von Casein β durch Trypsin erwähnt, die die Basis der vorliegenden Erfindung bildet. Die Wirkung des Salzes besteht in der Einleitung eines sehr beschränkten Abbaus des Ausgangs-Casein-β-Moleküls mit rascher Freisetzung des Phosphopeptids 1-25, und zwar mit wenig Verunreinigungen. Die Gewinnung des Phosphopeptids 1-25 wird durch die Fällung erleichtert, die im Reaktionsmedium aufgrund der Unlöslichkeit des oder der Reste des Casein-β-Moleküls erfolgt.
Dieser beschränkte Abbau, dessen Fortdauer eine Funktion der verwendeten Salzkonzentration ist, ist mit einer technischen Verwertung verträglich. Er erlaubt es, auf einfache Weise eine überstehende Lösung zu erhalten, in der das Phosphopeptid ungefähr 20% des gesamten Peptidmaterials darstellt. Das Phosphopeptid kann anschließend mit den chromatographischen Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, bis zur Homogenität gereinigt werden. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von anderen bekannten Verfahren durch das Ausmaß, in dem man dank der beschränkten Proteolyse eine Anreicherung der löslichen Fraktion an Phosphopeptid erhält, die den Schritt der Extraktion mit Bariumchlorid nicht erfordert.
Gleichzeitig mit der Bildung des Phosphopeptids werden Vorstufen des Fragments 60-66 des Casein β freigesetzt, das man β-Casomorphin nennt. Einige Arbeiten der Literatur erwähnen die mögliche Bildung von Vorstufen von β-Casomorphin, ohne jedoch Reinigungsverfahren vorzuschlagen. Zur Veranschaulichung kann man die Untersuchungen von RIBADEAU, DUMAS et al. (Eur. J. Biochem., 1970, 14, 451-459), REIMERDES (J. Dairy Research, 1979, 46, 223-226), LEONIL et al. (Le lait, 1988, 68 (3), 281-294), PETRILLI et al. (Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 29, 504-508) anführen. In der vorliegenden Erfindung wird die Mehrzahl der Vorstufen von β-Casomorphin bei der beschränkten Proteolyse von Casein β mit Trypsin in Gegenwart von Salzen in das Medium freigesetzt.
Das Peptid 177-183 wird von MARUYAMA et al. (Agric. Biol. Chem., 1985 45 (5), 1405-1409) ausgehend von einer Hydrolyse von Gesamtcasein durch Trypsin gereinigt. Für die Reinigung des Peptids 177-183 werden drei chromatographische Schritte verwendet, die nacheinander auf Gelfiltration, Ionenaustausch und erneut Gelfiltration beruhen.
Das Peptid 177-183, wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, wird während einer erneuten Hydrolyse des zuvor erwähnten Niederschlags, der sich aus der beschränkten Proteolyse des Ausgangs-Casein-β-Moleküls ergibt, mit Trypsin erhalten. Dieser Niederschlag hat den Vorteil, eine Fraktion zu sein, die weniger von bestimmten Sequenzen des anfänglichen Casein-β-Moleküls enthält.
Die Herstellung aller in der Erfindung genannten Peptide kann leicht in industriellem Maßstab durchgeführt werden, und alle beobachteten Fraktionen können aufgewertet werden. Überdies verwendet dieses Verfahren, das von einer als natürlich geltenden Substanz ausgeht (Casein aus der Milch von Säugern), physikalische Trennungstechniken nach der Verwendung eines physiologischen Enzyms (Trypsin), was zur Gewinnung von als natürlich geltenden Peptiden führt, wobei dieses Adjektiv im Gegensatz zu Peptiden, die durch organische Synthese oder Gentechnik erhalten wurden, verwendet wird. Diese beiden letzten Wege erfordern aufgrund der Toxizitätsrisiken, die mit der möglichen Anwesenheit chemischer oder organischer Verunreinigungen verbunden sind, daß die hergestellten Peptide sehr ausgefeilten und daher sehr teuren Reinigungsoperationen unterzogen werden. Dies ist bei den gemäß der Erfindung hergestellten Peptiden nicht der Fall, da die Verunreinigungen (Peptide, die vom Casein-β-Molekül herstammen) schlimmstenfalls eine Rolle als Nährstoff spielen. Eine weitere Unzweckmäßigkeit der Vorgehensweise durch chemische Synthese sind die für eine Verwendung bei der Ernährung zu hohen Produktionskosten der Peptide.
Es ist auch anzumerken, daß sich Sequenzen, die den im vorliegenden Verfahren beschriebenen ähneln, im Casein β der Kuh-, Ziegen - und Schafsmilch wiederfinden. Man kann daher ins Auge fassen, diese drei Casein-β-Quellen für das Verfahren gemäß der Erfindung zu verwenden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist also zunächst ein Verfahren, ausgehend von Casein β, zur Gewinnung eines Hydrolysats, das partiell angereichert ist an einerseits Phosphopeptid oder der Peptidfraktion 1-25 und andererseits an Vorstufen von β-Casomorphin 60-66 (wobei diese Vorstufen Fragmente sind, die dem Bereich 33- 97 des Casein-β-Moleküls entsprechen), durch Hydrolyse von Casein β mittels eines proteolytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse in einer Salzlösung als Medium durchführt, dessen Ionenstärke zu derjenigen der Lösung eines einwertigen Salzes mit einer Konzentration zwischen 0.5 und 4 M (insbesondere zwischen 1 und 2 M) äquivalent ist, was in dem Milieu die Erscheinung eines Niederschlags hervorruft, den man von der löslichen Phase abtrennt, welche das gesuchte partielle Hydrolysat bildet.
Die Salzkonzentration des Mediums hat einen bestimmenden Einfluß auf die Schnelligkeit und die Durchführbarkeit des Verfahrens. Als Salz kann man ein einwertiges Salz, zum Beispiel Natrium - oder Kaliumchlorid, oder ein zweiwertiges Salz, zum Beispiel Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, verwenden. Na&sub2;SO&sub4; wurde zwischen 0 und 0,5 M getestet, wobei man als Optimum 0,35 M gefunden hat (in Ionenstärke ausgedrückt erweist sich, daß die Ionenstärke bei 0,35 M Na&sub2;SO&sub4; der einer 1 M NaCl-Lösung äquivalent ist).
Die Abtrennung des Niederschlags kann entweder durch Zentrifugieren (zum Beispiel mit 15000 g während 20 min) oder durch tangentielle Mikrofiltration (zum Beispiel auf Zirkoniumoxidmembran auf Kohlenstoff-M14-Träger, was einen Porendurchmesser von 0,14 bis 0,2 um darstellt, vertrieben von Tech-Sep) erfolgen. Der Mikrofiltration kann eine Diafiltration folgen, um zurückgehaltenes Phosphopeptid 1-25 und Vorstufen von β-Casomorphin auszuwaschen.
Dieses Verfahren ist für Casein-β-Konzentrationen von 0,5 g/l bis 80 g/l durchführbar, wobei die Trennung der löslichen von der unlöslichen Phase um so effektiver und schneller erfolgt, je höher die anfängliche Konzentration an Casein β ist.
Als proteolytisches Enzym verwendet man insbesondere Trypsin und zum Beispiel das von NOVO INDUSTRIE unter der Bezeichnung "Crystalline Porcine Trypsin 4500 K" oder "5000 K" vertriebene Trypsin oder jede andere Trypsinzubereitung mit äquivalenter Reinheit. Auch Plasmin, dessen Spezifität der des Trypsins sehr ähnlich ist, kann im Verfahren der Erfindung mit Vorteil verwendet werden. Das Verhältnis Enzym/Substrat (w/w) kann in weiten Grenzen variieren; es kann zum Beispiel im Bereich von 1/100 bis 1/10000 liegen. Die obere Grenze hängt mit den Kosten des Enzyms zusammen, und die untere Grenze mit der Reaktionsdauer.
Die enzymatische Hydrolyse kann sich in einem pH-Bereich von 6 bis 9 (vorzugsweise 7,5) und bei einer Tempeartur von 25 bis 45ºC (vorzugsweise 40ºC) abspielen. Die optimale Hydrolysezeit wird eine Funktion der Hydrolysebedingungen sein; bei einer NaCl-Konzentration von 2 M, pH = 8 und 40ºC, mit SERVA-Trypsin, das mit TPCK, L-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (Inhibitor des Trypsins), behandelt wurde (31 E/mg), im Verhältnis Enzym/Substrat von 1/1000 wird das Optimum zum Beispiel in 40 Minuten erreicht; es ist jedoch möglich, mit kleineren Verhältnissen Enzym/Substrat zu arbeiten.
Am Ende der Hydrolyse wird das Enzym durch thermische Behandlung (20 Minuten bei 85ºC) zerstört oder durch Ultrafiltration der löslichen Phase auf organischen oder mineralischen Membranen mit einer Trennschwelle in der Größenordnung von 10000 zurückgewonnen. Diese lösliche Phase ist ein partielles Hydrolysat, das an Phosphopeptid 1-25 und Vorstufen des β-Casomorphins angereichert ist.
Von der löslichen Phase ausgehend kann man das Phosphopeptid anschließend durch Ionenaustauschchromatographie reinigen, nachdem man diese lösliche Phase zuvor durch Elektrodialyse entmineralisiert hat.
Man erhält so eine Fraktion, die stark an Vorstufen des β-Casomorphins angereichert ist, und eine Fraktion, die stark an Phosphopeptid 1-25 angereichert ist.
Man kann auch eine Fällung der zuvor genannten löslichen Phase durch Calcium durchführen, wobei man eine Zentrifugation oder eine Dekantierung folgen läßt; man erhält so das Phosphopeptid oder die Peptidfraktion 1-25 praktisch rein.
Ausgehend vom Niederschlag muß man diesen wieder in Lösung bringen, die so erhaltene Lösung auf einen pH-Wert zwischen 6 und 9 bringen und eine zweite Hydrolyse durch ein proteolytisches Enzym (Hydrolyse durch Trypsin) bei einer Temperatur von 25 bis 45ºC durchführen. Die zum Erreichen der vollständigen Hydrolyse notwendige Zeit wird eine Funktion der Hydrolysebedingungen sein; mit Trypsin SERVA, das mit TPCK behandelt wurde (31 E/mg), im Verhältnis 1/1000 bei pH 8 und 40 ºC wird die vollständige Hydrolyse zum Beispiel in 1 Stunde erreicht sein.
Man kann das Peptid anschließend von diesem Hydrolysat ausgehend nach drei Verfahren auf die antihypertensive und immunostimulante Aktivität (Fraktion 177-183) konzentrieren:
Durch Ultrafiltration auf organischen oder mineralischen Membranen mit einer Trennschwelle unter 5000, insbesondere in der Größenordnung von 1000 oder 3000, erhält man Permeate, die je nach der Natur der verwendeten Membran 20 bis 40% des gesuchten Peptids enthalten (die Prozentzahlen sind dabei ausgehend vom Flächeninhalt der Peaks (äquivalent zu OD bei 214 nm) berechnet gemäß dem Ausdruck: Prozentsatz = (100 x Fläche des betrachteten Peptids)/Gesamtfläche der Peptide des Chromatogramms, woraus folgt, daß man annehmen kann, daß die Prozentzahlen ungefähr Gewichtsprozenten Peptid entsprechen, wenn man vorausschickt, daß für jedes betrachtete Peptid eine Eichgerade erstellt wurde);
Durch Ionenaustauschchromatographie, in der Säule oder diskontinuierlich, auf Anionenaustauscherharz (Sp-Sephadex C- 25, vertrieben von PHARMACIA-LKB) mit einem Gradienten Wasser/Ammoniumformiat bei pH = 7 erhält man eine Lösung, die je nach dem Ausgangsprodukt (vollständiges Hydrolysat, Permeat 1000 oder Permeat 3000) mehr oder weniger an der Fraktion 177-183 angereichert ist; wenn man von Permeat 1000 ausgeht, kann die Reinheit in die Nähe von 100% kommen;
Durch aufeinanderfolgende Kombination dieser beiden Techniken kann man also die Reinheit der erhaltenen Lösung des antihypertensiven und immunostimulanten Peptids verbessern und die Kapazität des Harzes besser ausnutzen.
Die gesuchten Peptide werden also nach den oben beschriebenen Verfahren in Form von angereicherten Fraktionen erhalten, deren globale Peptidzusammensetzung durch Hochleistungschromatographie mit umgekehrter Phase auf C18-Säule mit 20 mM Natriumphosphatpuffer und Acetonitrilgradient von 0 bis 60% und Nachweis bei 214 nm charakterisiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Peptidfraktion, die an Peptiden mit biologischer Aktivität angereichert ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Peptidfraktion 1-25 mit einer Reinheit zwischen etwa 18% und etwa 27% beinhaltet und die Vorstufen von β-Casomorphin eine Reinheit zwischen etwa 40% und etwa 60% besitzen.
Die Erfindung betrifft auch eine Peptidfraktion, die aus Vorstufen von β-Casomorphin mit einer Reinheit von wenigstens 92% bestehen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sind in Verbindung mit den Figuren der beigefügten Zeichnung, die die HPLC-Profile der auf RP-C18-PEP-RPC (Pharmacia) mit linearem Gradienten von A- und B-Puffer und einem Durchsatz von 1 ml/min erhaltenen Fraktionen darstellen, angegeben.

Legenden:

Puffer A = Natriumphosphat (20 mM), pH = 6,75
Puffer B = Natriumphosphat (29 mM), pH = 7,5, im Gemisch mit 60% Acetonitril.
Der Gradient verläuft von 0 bis 80% Puffer B in 25 min.
I : Peptid 1-25
II : Vorstufen von β-Casomorphin 60-66
III : Peptid 177-183

Beispiel 1

12,7 g lyophilisiertes Casein β des Rindes (nach dem im französischen Patent Nr. 86-00325 beschriebenen Verfahren erhalten) werden in einem TRIS-HCl-Puffervolumen gelöst (0,1 M; pH = 8), das 2 M NaCl enthält, so daß das gesamte Endgewicht 3022,3 g beträgt. Die Lösung wird auf 40ºC erwärmt.
Diese Lösung wird der Einwirkung von Trypsin unterworfen (Trypsin SERVA, behandelt mit TPCK, 31 E/mg, so daß das Verhältnis E/S in der Nähe von 1/10000 liegt. Dies bedeutet, daß man 1,2 ml einer Trypsinlösung mit 1 mg/ml hinzufügt). Die Entwicklung der Hydrolyse wird durch HPLC auf RP-C18-PEP-RPC (Pharmacia) mit einem Gradienten 20 mM Phosphatpuf fer (pH = 6,75)/Acetonitril (0 bis 60% Acetonitril) verfolgt. Die Hydrolyse wird 4 h 45 min fortgesetzt; in dieser Zeit bildet sich ein reichlicher Niederschlag.
Die enzymatische Reaktion wird durch thermische Behandlung in einem röhrenförmigen Tauscher aus rostfreiem Stahl, der in ein Wasserbad von 88ºC getaucht wird, abgebrochen, die Lösung wird so 4 Minuten auf 85ºC gebracht und 25 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Diese Inaktivierung kann auch diskontinuierlich erfolgen.
Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei 20ºC mit 15000 g zentrifugiert. Wenn man von 2747 g Hydrolysat ausgeht, hat die gewonnene überstehende Lösung ein Gewicht von 2517,9 g, worin das Phosphopeptid 1-25 etwa 20% des Peptidmaterials ausmacht (siehe HPLC-Profil, Fig. 1).

Legende der Fig. 1:

Überstehende Lösung der Zentrifugation des mit Trypsin in 2 M NaCl erhaltenen Hydrolysats von Casein β,auf 1/8 verdünnt - 200 u1 injiziert.
Der bei dieser Zentrifugation erhaltene Bodensatz hat das in Fig. 2 gezeigte Peptidprofil.

Legende der Fig. 2:

Bodensatz der Zentrifugation des mit Trypsin in 2 M NaCl erhaltenen Hydrolysats von Casein β, wieder in Lösung gebracht und auf 1/10 verdünnt - 200 ul injiziert.
Der wieder in Lösung gebrachte Bodensatz wird einer erneuten Hydrolyse durch Trypsin unterworfen. Beispielhaft werden 840 ml des wieder suspendierten Bodensatzes durch Trypsin mit einem Verhältnis E/S in der Nähe von 1/1000 Gewichtsteilen hydrolysiert. Die Lösung wird sehr rasch klar, und die Entwicklung der Hydrolyse wird durch RP-HPLC auf C18-PEP-RPC (Pharmacia) mit einem Gradienten 20 mM Phosphatpuf fer (pH = 6,75)/Acetonitril (0 bis 60% Acetonitril) verfolgt. Die Reaktion wird abgebrochen, wenn die Bildung des Peptids 177-183 maximal ist, d.h. nach 3 h 30 min. Das Reaktionsgemisch wird dann 25 Minuten auf 85ºC erwärmt (die Vorschrift für die Inaktivierung des Enzyms ist die gleiche wie oben beschrieben).
Das erhaltene klare Reaktionsmedium wird anschließend auf einem Modul AMICON CH2A, das mit einer Hohlfasermembran H1P3-20 (Trennschwelle 3000) ausgestattet ist, ultrafiltriert. Die Ultrafiltration wird 4 Stunden mit einem mittleren Permeationsdurchsatz von 132 ml/Stunde fortgesetzt, was einen Konzentrationsfaktor von 3 erlaubt. Durch Analyse mit RP-HPLC auf einer Säule C18-PEP-RPC (Pharmacia) erhält man eine Auftrennung der verschiedenen Peptide des Gemischs, die es erlaubt, die Gewinnung des Peptids 177-183 in den folgenden Verhältnissen zu definieren: Das Fragment 177-183 stellt 3,3% des Casein-β-Moleküls (bezogen auf die Zahl der Aminosäuren), 5,75% des im Hydrolysat des Bodensatzes der Zentrifugation vorhandenen Peptidmaterials und 20,3% des im Permeat der Ultrafiltration, das wie oben beschrieben erhalten wurde, vorhandenen Peptidmaterials dar (Fig. 3).

Legende der Fig. 3:

Permeat auf einer Membran mit einer Trennschwelle von 3000 des Bodensatzes der Zentrifugation nach Hydrolyse durch Trypsin, auf 1/8 verdünnt - 200 ul injiziert. Stoffbilanz von Beispiel 1 % Verbrennungsrückstand Phosphat ppm anfängliche Casein-β-Lösung überstehende Lösung der Zentrifugation wieder verdünnter Bodensatz der Zentrifugation N/P (mol/mol) des Phosphopeptids 1-25 = 8,00

Beispiel 2

13,2 g lyophilisiertes Casein β des Rindes, zu denen 350,6 g NaCl hinzugefügt wurden, werden in destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert des Gemischs wird mit Hilfe einer NaOH-Lösung auf 8 gebracht. Das Gemisch (Gesamtendgewicht 3208,5 g> wird durch Thermostatisierung des Gefäßes auf 40ºC gebracht.
Diese Lösung wird der Einwirkung von Trypsin unterworfen (Trypsin TPCK SERVA, 31 E/mg), mit einem Verhältnis E/S in der Nähe von 1/10000. Die Änderung des pH-Werts des Reaktionsmediums wird mit Hilfe eines pH-Staten durch Zugabe von 0,5 M NaOH kontrolliert und reguliert. Die Reaktion wird 5 Stunden fortgesetzt; in dieser Zeit bildet sich ein reichlicher Niederschlag. Das Trypsin wird durch thermische Behandlung in einem röhrenförmigen Tauscher gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift inaktiviert.
Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei 20ºC mit 7000 g zentrifugiert (ausgehend von 2785,3 g Reaktionsgemisch gewinnt man 2764,3 g überstehende Lösung); die durch HPLC RP-C18-PEP-RPC analysierte überstehende Lösung, Fig. 4, enthält hauptsächlich die Fragmente 1-25 (20,25% des vorhandenen Peptidmaterials) und die Vorstufen des β-Casomorphins, und der erhaltene Bodensatz hat dasselbe analytische Profil wie das in Fig. 2 gezeigte.

Legende der Fig. 4:

Überstehende Lösung der Zentrifugation des mit Trypsin in 2 M NaCl erhaltenen Hydrolysats von Casein β, auf 1/10 verdünnt - 200 ul injiziert.
Der Bodensatz wird, nachdem er in destilliertem Wasser wieder suspendiert wurde, die auf pH 8 und 40ºC eingestellt wurde, der Hydrolyse durch Trypsin unterworfen. Zum Beispiel werden 14,54 g Bodensatz (Feuchtgewicht) in einem Endvolumen von destilliertem Wasser (1970 g), dessen pH mit Hilfe eines pH-Staten auf 8 eingestellt wurde, gelöst, und die Temperatur wird auf 40ºC gebracht. Die Lösung wird mit 8 mg Trypsin hydrolysiert (Verhältnis E/S in der Nähe von 1/1000, Trockengewicht). Während der Hydrolyse, die fortgesetzt wird, bis das Peptid 177-183 sein Freisetzungsmaximum erreicht, wird das Reaktionsmedium klar. Die Entwicklung der Hydrolyse wird durch RP-HPLC (C18-PEP-RPC) verfolgt. Nach etwa 4 Stunden wird das Trypsin durch thermische Behandlung gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift inaktiviert.

Das resultierende Gemisch kann:

1) entweder auf einem ebenen Modul FILTRON mit tangentiellem Fluß (Pharmacia-LKB), das mit einer Polysulfonmembran (700 cm² mit einer Trennschwelle von 1000 ausgestattet ist, ultrafiltriert werden. Zum Beispiel geht man von 484 ml (483,8 g) eines Hydrolysats aus, wie es zuvor beschrieben wurde, die Ultrafiltration hat einen Durchsatz zwischen 180 und 240 ml/Stunde und wird bis zu einem Konzentrationsfaktor gleich 2,26 fortgesetzt. In den 234 ml des erhaltenen Permeats stellt das Fragment 177-183 von Casein β 39,5% des Peptidmaterials (Fig. 5), aber nur 30% des ursprünglich eingesetzten Peptids 177-183 dar; die Ausbeute kann durch Diafiltration 100% erreichen.

Legende der Fig. 5:

Permeat auf einer Membran mit einer Trennschwelle von 1000 des Bodensatzes der Zentrifugation nach Hydrolyse durch Trypsin, auf 1/5 verdünnt - 200 ul injiziert.
2) oder auf demselben ebenen Modul FILTRON, das mit einer Membran mit einer Trennschwelle von 3000 ausgestattet ist, ultrafiltriert werden. Die Ultrafiltration eines Hydrolysats von 500 ml (505,25 g) wird mit einem Durchsatz von 600 ml/h bis zu einem Konzentrationsfaktor gleich 2,63 fortgesetzt. Unter diesen Bedingungen erhält man 300 ml (302,7 g) Permeat, in denen das Fragment 177-183 32,3% des Peptidmaterials (Fig. 6), aber nur 45,5% des ursprünglich eingesetzten Fragments 177-183 darstellt; die Ausbeute kann durch Diafiltration 100% erreichen.

Legende der Fig. 6:

Permeat auf einer Membran mit einer Trennschwelle von 3000 des Bodensatzes der Zentrifugation nach Hydrolyse durch Trypsin, auf 1/5 verdünnt - 200 ul injiziert.

Beispiel 3

50,7 g lyophilisiertes Casein β des Rindes werden in 5 l 0,1 M Phosphatpuf fer, der 2M NaCl enthält, bei pH = 7,5 verdünnt. Diese Lösung wird auf 40ºC gebracht und der Hydrolyse durch 5,5 mg Trypsin (TPCK SERVA) mit einem Verhältnis E/S in der Nähe von 1/10000 unterworfen.
Die Hydrolyse wird nach 5 h 00, während deren sich ein Niederschlag entwickelt hat, durch thermische Behandlung abgebrochen:
die Lösung wird in ein kochendes Wasserbad eingetaucht und bei 85ºC 20 Minuten darin gelassen.
Das Hydrolysat wird einer Mikrofiltration auf einem Modul SFEC, das mit einer Röhrenmembran CARBOSEP M14 der Oberfläche 0,1 m², deren Wasserdurchfluß vor der Verwendung 618 l/h m² entsprach, ausgestattet ist, mit einem Eingangsdruck von 4 bar und einer Temperatur von 25ºC unterworfen.
Eine Mikrofiltration wird 25 Minuten lang durchgeführt. Auf diese Mikrofiltration folgt eine Diafiltration, um den Rückstand auszuwaschen. Die bei diesen beiden Operationen erzielten Leistungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Zum Beispiel erhält man, wenn man von 5 Liter Hydrolysat ausgeht, 2,5 Liter Mikrofiltrat, das 46% des ursprünglich vorhandenen Phosphopeptids 1-25 enthält, mit einem Reinheitsgrad von 18,4% (Fig. 7). Die anschließende Diafiltration erlaubt es, das zurückgehaltene Phosphopeptid 1-25 vollständig auszuwaschen.

Legende der Fig. 7:

Mikrofiltrat auf einer Membran M14 des mit Trypsin in 2 M NaCl erhaltenen Hydrolysats von Casein β, auf 1/20 verdünnt - 100 ul injiziert. Tabelle 1 Zeit nach Beginn der Mikrofiltration (Minuten) p Eingang (bar) p Ausgang (bar) Durchsatz (l/h/m²)
Das Schema der Fig. 8 insgesamt (auf zwei Blättern der beigefügten Zeichnung) faßt die möglichen Wege zur Gewinnung der an Peptiden mit biologischer Aktivität angereicherten Fraktionen gemäß der Erfindung zusammen; auf diesem Schema sind die chromatographischen Profile dargestellt, die den verschiedenen Stadien des Verfahrens entsprechen.
. : Phosphopeptid β-CN (f 1-25)
.. : Vorstufen von β-Casomorphin
... : Peptid β-CN (f 177-183)
Die Analysen wurden auf einer Säule PEP RPC-C18 (Pharmacia) mit Elutionspuffer Phosphat/Acetonitril durchgeführt:
Puffer A = 20 mM Natriumphosphat, pH = 6,75
Puffer B = 20 mM Natriumphosphat, pH = 7,5, im Gemisch mit 60% Acetonitril.
Der Gradient verläuft von 0 bis 80% Puffer B in 25 min.
Der Nachweis erfolgt bei 214 nm, was bedeutet, das man im wesentlichen die Peptidbindungen verfolgt; man kann also zugeben, daß das Verhältnis (Fläche des Proteins oder des gesuchten Peptids x 100/Gesamtfläche des Chromatogramms) eine Annäherung an den Prozentsatz der Reinheit des Proteins oder des betrachteten Peptids darstellt.
Auf der Basis dieser Formel kann man für die in dem beigefügten Schema vorgelegten Chromatogramme die folgenden Reinheitsgrade angeben: ursprüngliches Casein β = 97% Mikrofiltrat 1-25 = 18% - 25% Pro-β-Casomorphine: 46% - 60% überstehende Lösung der Zentrifugation 1-25: 20% - 27% Pro-β-Casomorphine 40% - 60% Hydrolysat des Bodensatzes 177-183 = 6% Ionenaustauschchromatographie 1-25 = 93% Pro-β-Casomorphine = 92% Komplexierung des Phosphopeptids durch Calcium und Zentrifugation 1-25 = 99% Ansäuern auf pH = 4,0 Dekantieren Pro-β-Casomorphine = 63% Ionenaustauschchromatographie 177-183 = 100%

Claims

1. Verfahren, ausgehend von Casein β, zur Gewinnung eines Hydrolysats, das partiell angereichert ist an einerseits Phosphopeptid oder der Peptidfraktion 1-25 und andererseits an Vorstufen von β-Casomorphin 60-66 (wobei diese Vorstufen Fragmente sind, die dem Bereich 33-97 des Casein-β-Moleküls entsprechen), durch Hydrolyse von Casein β mittels eines proteolytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse in einer konzentrierten Salzlösung als Medium durchführt, dessen Ionenstärke zu derjenigen der Lösung eines einwertigen Salzes mit einer Konzentration zwischen 0.5 und 4 M äquivalent ist, was in dem Milieu die Erscheinung eines Niederschlags hervorruft, den man von der löslichen Phase abtrennt, welche das gesuchte partielle Hydrolysat bildet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse in einem Medium durchführt, dessen Ionenstärke zu derjenigen der Lösung eines einwertigen Salzes mit einer Konzentration zwischen 1 und 2 M äquivalent ist.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz ein einwertiges Salz, zum Beispiel Natrium- oder Kaliumchlorid, oder ein zweiwertiges Salz, zum Beispiel Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, verwendet.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff ein Produkt auf Caseinbasis verwendet, dessen Reinheit an Casein β zwischen 85 und 90% liegt, insbesondere aus Kuh-, Ziegen - oder Schafsmilch.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse mit einer Ausgangskonzentration an Casein β zwischen 0.5 g/l und 80 g/l durchführt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als proteolytisches Enzym Trypsin oder Plasmin, und insbesondere Trypsin, verwendet.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein gewichtsbezogenes Enzym/Substrat-Verhältnis im Bereich von 1/100 bis 1/10000 verwendet.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9, und insbesondere bei pH 7.5, und bei einer Temperatur von 25 bis 45ºC, insbesondere bei 40ºC durchführt.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym am Ende der Hydrolyse durch thermische Behandlung zerstört oder es durch Ultrafiltration der löslichen Phase auf organischer oder mineralischer Membran mit einer Trennschwelle von 10000 zurückgewinnt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den erhaltenen Niederschlag durch Zentrifugieren oder durch tangentielle Mikrofiltration abtrennt, wobei die Mikrofiltration von einer Diafiltration gefolgt sein kann, um zurückgehaltenes Phosphopeptid 1-25 und Vorstufen von β-Casomorphin auszuwaschen.

11. Verfahren zur Gewinnung von einerseits Phosphopeptid oder Peptidfraktion 1-25 und andererseits von Vorstufen von β- Casomorphin 60-66, dadurch gekennzeichnet, daß man an der durch das Verfahren, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, erhaltenen löslichen Phase eine Ionenaustauschchromatographie durchführt, nachdem man diese lösliche Phase zuvor entmineralisiert hat.

12. Verfahren zur Gewinnung von Phosphopeptid oder Peptidfraktion 1-25, dadurch gekennzeichnet, daß man an der durch das Verfahren, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, erhaltenen löslichen Phase eine Fällung durch Calcium und anschließend eine Zentrifugation oder Dekantierung durchführt.

13. Verfahren zur Gewinnung der Peptidfraktion 177-183 mit antihypertensiver und immunostimulanter Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man von dem Niederschlag ausgeht, wie er nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 erhalten wurde, ihn wieder in Lösung bringt, die so erhaltene Lösung auf einen pH-Wert zwischen 6 und 9 bringt und eine Hydrolyse durch ein proteolytisches Enzym durchführt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse bei einer Temperatur zwischen 25 und 45ºC durchführt.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als proteolytisches Enzym Trypsin verwendet.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigung des Hydrolysats durch Ultrafiltration auf organischen oder mineralischen Membranen mit einer Trennschwelle von unter 5000 durchführt, wobei das Permeat mit dem gesuchten Peptid angereichert wird.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigung des Hydrolysats durch Ionenaustauschchromatographie durchführt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigung des Permeats durch Ionenaustauschchromatographie durchführt.

19. Mit biologisch aktiven Peptiden angereicherte Peptidfraktion, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Peptidfraktion 1-25 mit einer Reinheit zwischen etwa 18% und etwa 27% sowie die Vorstufen von β-Casomorphin mit einer Reinheit zwischen etwa 40% und etwa 60% enthält.

20. Peptidfraktion, die aus Vorstufen von β-Casomorphin mit einer Reinheit von wenigstens 92% besteht.

21. Fraktion, die aus dem Ultrafiltrationspermeat besteht, wie man es nach dem in Anspruch 16 definierten Verfahren auf einer Ultrafiltrationsmembran mit ungefähr 1000 D erhalten hat.

22. Peptidfraktion, die aus dem Ultrafiltrationspermeat besteht, wie man es nach dem in Anspruch 16 definierten Verfahren auf einer Ultrafiltrationsmembran mit ungefähr 3000 D erhalten hat.