DE60004325T2

DE60004325T2 - Hypoallergene zubereitung enthaltend tolerogene petide, zur induzierung oraler toleranz

Info

Publication number: DE60004325T2
Application number: DE60004325T
Authority: DE
Inventors: Rodolphe Fritsche; Sophie Pecquet; Lionel Bovetto; Françoise MAYNARD
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1999-01-19
Filing date: 2000-01-17
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2020-01-18
Also published as: AU3421000A; ES2203435T3; AR028141A1; CA2358423C; AU781013B2; BR0007597A; US20020037357A1; EP1146794B1; DK1146794T3; IL144167A0; US6737076B2; DE60004325D1; EP1146794A1; ZA200106787B; ATE246454T1; TWI251468B; WO2000042863A1; MY129566A; NZ512866A; CA2358423A1

Description

Die Erfindung betrifft eine hypoallergene Zusammensetzung, die bestimmte tolerogene Peptide von Proteinen enthält, wobei die Zusammensetzung eine orale Toleranz gegenüber nativen Proteinen erzeugen kann. Sie betrifft auch die Verwendung tolerogener Peptide von Milchprotein für die Zubereitung einer Zusammensetzung, die eine immunologische Toleranz gegenüber Milchproteinen erzeugt.
Hintergrund der Erfindung
Während des üblichen Ernährungsvorgangs werden dem Immunsystem über den Darm Nahrungsproteine präsentiert, gefolgt von einem Ausbleiben einer Immunreaktion gegenüber der zu sich genommenen Nahrung. Dieses Vitalphänomen, das orale Toleranz genannt wird, funktioniert bei der großen Majorität der Menschen. Wenn die orale Toleranz versagt, tritt eine Lebensmittelallergie auf, die das strikte Vermeiden der belasteten Nahrung erfordert.
Das angestrebte Vermeiden der Nahrung stellt eine harte Aufgabe für erwachsene Patienten mit Lebensmittelallergie dar. Zum Beispiel kann das strikte Entfernen von Kuhmilch aus der Diät für allergische Babies sogar schwieriger sein, insbesondere, wenn Stillen nicht möglich oder gewünscht ist.
Die Allergien gegenüber Kuhmilch und Rezepten, die Kuhmilch enthalten und für die Bedürfnisse von Babies angepaßt sind, treten wegen der Tatsache auf, daß die Proteine von Kuhmilch sich von den Proteinen der Muttermilch unterscheiden und Allergene darstellen können. Unter Molkeproteinen ist β-Lactoglobulin der Hauptbestandteil und ein starkes Allergen.
Neben Stillen werden Neugeborenen "mit einem Risiko", nämlich asymptomtische Babies mit allergisch veranlagten Eltern, als Hauptempfehlung zur Prävention hypoallergene Rezepturen systematisch verschrieben.
Im Gegensatz zu adaptierten Rezepturen wurden Kuhmilchproteine in hypoallergenen Rezepturen hydrolysiert, um das Allergiepotential zu senken. Dieser Ansatz hat sich als wirksam erwiesen, um die Sensibilisierung durch native Proteine zu verhindern, die in den adaptierten Rezepturen vorhanden sind.
So wurde in der US 4 293 571 ein Proteinhydrolysat durch pankreatische Hydrolyse, Koagulation nicht hydrolysierter Proteine durch eine Wärmebehandlung und Ultrafiltration zubereitet, um die koagulierten Restproteine und die Makropeptide zu beseitigen, die Allergene darstellen könnten. Auch gibt die US 5 039 532 ein verbessertes Verfahren zur Zubereitung eines Hydrolysats von Tiermilchproteinen an, das wesentlich allergenreduziert ist, bei dem ein Molkeprodukt einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen wurde.
Zwei verschiedene Arten hypoallergener Rezepturen werden für Babies mit hohem Risiko vorgeschlagen: zum Teil und extensiv hydrolysierte Rezepturen, die sich durch das Ausmaß der Hydrolyse der nativen Proteine unterscheiden.
Aber, wie es aus dem oben angegebenen Stand der Technik klar ist, war es bis heute der Hauptfokus beim Umgehen mit Allergien gegenüber Kuhmilch, Zubereitungen zu finden, die keine allergische Reaktion erzeugen, d.h., nicht allergene Formulierungen zu schaffen. Während derartige Formulierungen es einer Person ermöglicht haben, die gegenüber Kuhmilch allergisch ist, eine allergische Reaktion zu vermeiden, lösen sie nichtsdestoweniger nicht das Problem, es einer Person zu ermöglichen, unveränderte Milchprodukte zu trinken.
In jüngerer Zeit hat man untersucht, daß zum Teil hydrolysierte Milchformulierungen nicht nur eine verminderte Allergenität aufweisen, sondern auch eine immunologische Toleranz gegenüber Milchproteinen erzeugen können ( EP 0 827 679 ). Extensiv hydrolysierte Rezepturen werden speziell zur Behandlung von Patienten entworfen, die gegenüber Kuhmilchproteinen allergisch sind, aber ihre Fähigkeit steht in Frage, eine orale Langzeittoleranz zu erzeugen.
So offenbart EP 0 629 350 die Verwendung nicht allergener Molkeproteinhydrolysate, von denen man sagt, daß sie fähig sind, eine Kuhmilchprotein-Toleranz zu erzeugen. Obwohl diese Patentanmeldung andeutet, daß Molkeproteinhydrolysate, die im wesentlichen frei von allergenen Proteinen sind, verwendet werden könnten, um eine Kuhmilchprotein-Toleranz bei Kindern mit einem Risiko von Kuhmilchallergie zu erzeugen, haben die vorliegenden Erfinder beim Analysieren anderer nicht allergener. Molkeproteinhydrolysate herausgefunden, daß eine Nicht-Allergenität nicht notwendigerweise auf die Fähigkeit übertragen werden kann, eine Kuhmilchprotein-Toleranz zu erzeugen. In der Tat, hat man von einigen der Formulierungen herausgefunden, die das höchste Maß an Nicht-Allergenität zeigen, daß sie für das Erzeugen einer Kuhmilchprotein-Toleranz ungeeignet sind.
Obwohl Lo, C.W. und Kleinuran, R. E. (American Journal of Clinical Nutrition 1996, 63(4), Seiten 646-650) vorschlägen, daß Baby-Rezepturen, die tolerogene Peptide enthalten, zur Behandlung allergischer Krankheiten oder zum Unterdrücken der Entwicklung von autoimmunen Störungen verwendet werden könnten, ist es klar, daß dem Stand der Technik die Information fehlte, Formulierungen anzugeben, die am besten für die Erzeugung einer Toleranz geeignet sein würden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung gibt eine hyperallergene Zusammensetzung zur Erzeugung einer Proteintoleranz bei Personen an, bei denen ein Risiko für eine Proteinallergie besteht, die enthält (i) eine Grundlage aus einem "nicht allergenen" umfassend hydrolysierten Proteinmaterial und/oder (ii) eine Grundlage aus freien Amino säuren, wobei die Zusammensetzung als Wirkbestandteil wenigstens ein tolerogenes Peptid des allergenen Proteins umfaßt, wobei die genannten tolerogenen Peptide vorliegen in Form von (i) isolierten tolerogenen peptidischen Fraktionen der Hydrolyse eines proteinischen Materials, daß das allergene Protein enthält, und/oder (ii) synthetisch hergestellten tolerogenen Peptiden, und zwar in einer solchen Menge, daß das Verhältnis von tolerogener Aktivität durch restliche Antigenität wenigstens 2 × 10^-2 beträgt.
Diese Zusammensetzung enthält eine Stickstoffquelle, die 7 bis 25% der Gesamtenergie liefern kann, eine Kohlenhydratquelle, die zumindest 28 bis 66% der Gesamtenergie liefern kann, eine Lipidquelle, die zumindest 25 bis 60% der Gesamtenergie liefern kann, und zumindest ein tolerogenes Peptid der verschiedenen Proteine.
Ein großer Vorteil dieser Zusammensetzung ist es, eine orale Toleranz bei Personen, bei denen "ein Risiko" besteht, zu erzeugen, um die etwaige Sensibilisierung durch die Verwendung nativer Tolerogene zu vermeiden. Überdies bieten die tolerogenen Peptide, die aus der Proteinhydrolyse abgeleitet wurden, sowohl hypoallergene als auch tolerogene Eigenschaften und erzeugen eine orale Toleranz auf der Stimmungs- und Zellebene.
Diese Zusammensetzung ist insbesondere für Personen gedacht, bei denen ein Risiko für eine Milchproteinallergie besteht.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung tolerogener Peptide von Milchproteinen für die Zubereitung einer hypoallergenen Zusammensetzung, die für Säugetiere gedacht ist, die gegenüber einer Kuhmilchallergie empfindlich sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung stammen tolerogener Peptide von Milch und insbesondere von β-Lactoglobulin (β-LG), α-, Lactalbumin, Rinderserumalbumin oder Casein.
Für die Zubereitung der Zusammensetzung können tolerogene Peptide in der Form einer peptidischen Fraktion verwendet werden, die die folgenden Peptide umfaßt: H₂N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH, H₂N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K-K-COOH oder H₂N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH aus β-Lactoglobulin.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt gibt die Erfindung ein Verfahren für die Zubereitung tolerogener Peptide an, das bei der Erzeugung einer Proteintoleranz bei Personen brauchbar ist, bei denen ein Risiko für eine Proteinallergie besteht, bei dem:

(i) ein proteinisches Material, daß das allergene Protein enthält, auf einen Hydrolysegrad von ungefähr 10 bis 50% hydrolysiert wird;
(ii) dann behandelt wird, um eine restliche Enzymaktivität zu inaktivieren;
(iii) die Proteinhydrolysatlösung gereinigt und einer Ausfällbehandlung unterworfen oder in eine Chromatographiesäule geleitet wird, die mit einem geeigneten Harz gefüllt ist, um tolerogene peptidische Fraktionen zu extrahieren.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bei der vorliegenden Erfindung ist der Begriff Toleranz als ein Zustand eines Ausbleibens eines bestimmten immunologischen Antwortverhaltens zu verstehen. Sowohl humorale (Antikörper) als auch zellgebundene (Lymphocyten...) Wege der Immunantwort können durch die Erzeugung von Toleranz unterdrückt werden. Ein Zusammenbruch oraler Toleranz wird als der zugrundeliegende Grund einer Lebensmittelallergie betrachtet.
Der Begriff Allergen ist als ein Protein oder Makropeptid zu verstehen, das fähig ist, allergische Reaktionen bei Menschen zu initiieren, insbesondere bei Babies oder Säuglingen mit einem Risiko. Kleinkinder werden beurteilt, daß "ein Risiko" für eine Proteinallergie besteht, wenn entweder ein oder beide Elternteile oder eines der Geschwister allergisch veranlagt sind.
Der Begriff tolerogene Peptide ist als proteinische Fragmente zu verstehen, die Teilen des nativen Proteins entsprechen, in der Größe von 200 bis 6000 Da (3 bis 50 Aminosäuren) und vor- zugsweise zwischen 500 bis 3000 Da, und fähig, eine bestimmte orale Toleranz gegenüber nativen Proteinen zu erzeugen.
Der Begriff "nicht allergene" Grundlage ist als eine Stickstoffquelle zu verstehen, die eine gut ausgewogene Zusammensetzung von Aminosäuren enthält. Die "Nicht-Allergenität" ist für Milchproteine als Restallergenität gegenüber einzelnen Molkeproteinen definiert, die nicht 1 ppm übersteigt und als Restallergenität gegenüber Gesamtcasein, die 10 ppm nicht übersteigt.
Die hypoallergene Zusammensetzung kann als eine Stickstoffquelle Peptide oder freie Aminosäuren und insbesondere von Milchprotein enthalten, wie z.B. Molkeproteine, α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin, Rinderserumalbumin, Caseinsäure, Caseinate oder α, β, κ-Casein. Die Stickstoffquelle kann zumindest 7 bis 25% der Gesamtenergie liefern.
Als Kohlenhydratquelle können Lactose, Saccharose, Stärke oder Maltodextrin verwendet werden. Kohlenhydrate können zumindest 28 bis 66% der Gesamtenergie liefern.
Speiseöle oder Butteröl werden vorzugsweise als Lipidquelle eingesetzt, die zumindest 25 bis 60% der Gesamtenergie liefern kann.
Vitamine, Spurenelemente und Materialien können in einer Menge zugefügt werden, die hinreichend ist, um den täglichen Bedarf zu decken.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt als den aktiven Bestandteil zumindest ein tolerogenes Peptid des allergenen Proteins, wobei das tolerogene Peptid wegen seiner Fähigkeit ausgewählt wurde, eine orale Toleranz zu erzeugen.
Die tolerogenen Peptide können durch enzymatische Hydrolyse proteinischen Materials erhalten werden, die die allergenen Proteine enthalten, die für Allergien bei Personen verantwortlich sind, bei denen ein Risiko besteht, gefolgt von der Isolierung tolerogener peptidischer Fraktionen. Diese peptidischen Fraktionen, die in den tolerogenen Peptiden angereichert sind, können durch Trennung der Proteinhydrolysate erhalten werden. Die tolerogenen Peptide können auch in der Zusammensetzung in der Form synthetisch zubereiteter tolerogener Peptide vorliegen.
Die Zusammensetzung enthält eine Menge, die hinreichend ist, eine orale Toleranz zu erzeugen, die vorzugsweise die ist, die eine vollständige Erzeugung oraler Toleranz ermöglicht, nämlich die eine, die jede Reaktion nach DBPCFC (Doppel-Blind-Placebo-kontrollierte Nahrungsherausforderung), die mit Kuhmilch durchführt wird. Dementsprechend können tolerogene Peptide in einer Menge von 0,01 bis 10% (Stickstoffquelle des Proteins) vorhanden sein, z.B. und vorzugsweise 0,1 bis 0,2% der Gesamtpeptide.
In dem besonderen Fall von Toleranz gegenüber Milchproteinen kann die Zusammensetzung tolerogene Peptide vom Milchursprung, wie z.B. β-Lactoglobulin oder Caseine enthalten. Tolerogene Peptide können somit in der Form einer peptidischen Fraktion mit zumindest einem der folgenden Peptide vorliegen: H₂N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH, H₂N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K-K-COOH oder H₂N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH aus β-Lactoglobulin.
In einer bevorzugten Ausführung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung tolerogener Peptide die folgenden Schritte:

(i) ein proteinisches Material, das das allergene Protein enthält, wird bis zu einem Hydrolysegrad von 10 bis 50% hydrolysiert;
(ii) dann wird es behandelt, um eine restliche Enzymaktivät zu inaktivieren;
(iii) die Proteinhydrolysatlösung wird gereinigt und einer Ausfällbehandlung unterworfen oder in eine Chromatographiesäule geleitet, die mit passendem Harz gefüllt ist, und tolerogene peptidische Fraktionen werden gewonnen.

Dieses bevorzugte Verfahren ist zur Behandlung von Hydrolysaten gut geeignet, die von verschiedenen Proteinkonzentrationen (Ntot % = N * 6,38) hergestellt wurden, um das Verhältnis der tolerogenen Aktivität durch restliche Antigenität von proteinischem Material zu modifizieren. Wenn man arbiträr die Antigenität eines nativen Proteins auf 10⁶ (als 10⁶ μg/g des Proteins) definiert, und die tolerogene Antwort auf 1, dann ist für ein natives Protein dieses Verhältnis 10^-6. Daher sollte das Verhältnis, das die Tolerogenaktivität einer gegebenen Fraktion oder eines tolerogenen Peptids wenigstens 2 × 10^-2 betragen.
Das proteinische Material, das zu behandeln ist, kann irgendeine Zusammensetzung sein, die Proteinmaterial enthält und insbesondere eine Lösung oder Dispersion von Milchproteinen: z.B. Molke-Proteine, saures Molkeprotein, Süßsahne-Proteine, Molkeprotein-Konzentrate, Molkeprotein-Isolate, demineralisiertes Molkepulver oder Caseinate.
Im großen und ganzen kann der Proteingehalt innerhalb des Bereiches von 70 bis 95 Gew.-% variieren, aber das Ausgangsmaterial ist vorzugsweise so reich an Protein wie möglich.
Die in dem Proteinmaterial vorliegenden Proteine können mit proteolytischen Enzymen in dem Proteinhydrolysat modifiziert werden, das einen Grad der Hydrolyse (α-Amino-N/Ntot) von vorzugsweise ungefähr 10–50% aufweist.
Die proteolytischen Enzyme können zum Beispiel tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein (Pepsin, Chymotrypsin, Trypsin, Darmschleimhautextrakt, Pankreasextrakte, Chymosin, Papain, Bromelain, Ficin), bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs (Serin und Metalloprotease von Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Aspergillus orysae, Aspegillus wentii und saure Proteasen von Aspergillus orizae, Aspergillus wentii, Mucor miehei, Mucor pusillus, Endothia parasitica) oder eine Kombination von diesen.
Während der Hydrolyse liegt die Konzentration proteinischen Material in Lösung oder in Suspension vorzugsweise um 5–20 Gew.-% und könnte vor dem Einleiten der Proteasen pasteurisiert werden. Das Verhältnis Enzym/Protein kann 0,1–10 Gew.-%/Gewicht betragen und liegt vorzugsweise um 0,25 bis 4%.
Hydrolyse kann bei einer Temperatur von ungefähr 35° bis 65°C durchgeführt werden, über 30 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise 30 min bis 4 Stunden bei pH-Werten in dem Bereich von 2,5 bis 11, vorzugsweise 4,5, 7,0, 8,0 und 8,5. Wenn gewünscht, kann der pH der Lösung eingestellt und mit Zitronensäure, lebensmittelverträglicher HCl oder NaOH, NH₄OH, KOH, Ca(OH)₂ zum Beispiel bei einer Konzentration von 2N rein oder in Mischung reguliert werden.
Dann kann das Protein-Hydrolysat einer Wärmebehandlung für ungefähr 0,1 bis 10 min bei einer Temperatur von ungefähr 70 bis 110°C unterworfen werden, um restliche Enzyme (d.h. Proteasen) zu inaktivieren.
Die so erhaltene Proteinhydrolysatlösung kann durch Zentrifugation und/oder Ultrafiltration gereinigt werden, um unlösliche bzw. intakte Proteine zu entfernen, und die klare Lösung wird gewonnen. Es ist möglich, im industriellen Maßstab ver schiedene Membranarten (Spiral-, Rohr-, Flach-Verbundfasern) zu verwenden, die mit verschiedenen Materialien (Mineralien, Polysulfone, ...) und mit verschiedenen Abschneidegrenzen zwischen 1.000 und 100.000 Dalton gemacht sind. In Abhängigkeit von der Enzymart, den Hydrolysebedingungen und den Membranarten kann die Modifikation der tolerogenen Fraktionen in dieser Stufe hinreichend sein.
Die gewonnene klare Hydrolysatlösung kann, wenn gewünscht, durch Verdampfung auf einen Trockenfeststoffgehalt von 10 bis 50% für eine nachfolgende Behandlung oder Sprühtrocknung konzentriert werden; wenn die Anreicherung in tolerogenen Peptiden hinreichend ist.
Die so erhaltene Protein-Hydrolysatlösung kann einer Ausfällbehandlung durch z.B. Lösungsmittel, Säure oder Salze unterworfen werden, gefolgt von einer Zentrifugation. Bei der Ausfällbehandlung erhöht die Konzentration der Hydrolysatlösung die Ausbeute und vermindert die Mengen an Lösungsmittel. Zum Beispiel kann Ethanol zugefügt werden, um eine endgültige Konzentration innerhalb von 15–60% Volumen/Volumen bei einer Temperatur von ungefähr 4°C bis 25°C zu erhalten. Nach einer Stunde Inkubation kann es eine Zentrifugation (30 min bei 4500 g) ermöglichen, lösliche und nicht lösliche Peptide zu trennen. In Abhängigkeit von dem Proteolysat können wir Säure (z.B. phosphorische oder chlorsaure) verwenden, oder phosphorkalkige Ausfällung. Dann können z.B. Lösungsmittel durch Verdampfung und Salze durch Elektrodialyse entfernt werden.
Die klare Lösung und die unlösliche Fraktion werden vorzugsweise gewonnen.
Die so erhaltene Proteinhydrolysatlösung kann in eine Säule geleitet werden, die mit Adsorptions-, Innenaustausch- oder hydrophobischen Harzen gefüllt ist, mit einer Fließrate von 0,1–4 Säulenvolumen pro Stunde bei einer Temperatur von ungefähr 4°C bis 60°C. Vor der Chromatographiebehandlung kann das Proteinhydrolysat konzentriert werden, um eine Lösung mit einem Trockenfeststoffgehalt von 8–35 Gew.-% zu liefern.
Während der Chromatographie wird eine Peptidfraktion in dem Harz absorbiert, indem die Hydrolysatlösung in eine Säule geleitet wird, die mit dem zweckmäßigen Träger gefüllt ist, bei einer Rate von 0,1–4 Säulenvolumen pro Stunde. Es ist möglich, im Industriemaßstab die verschiedenen Chromatographiearten zu verwenden, wie z.B.: Innenaustausch, hydrophobe Wechselwirkungen, Umkehrphasen, Adsorption (Hydroxyapatit, Aktivkohle, hydrophobe Harze auf Polystyrenbasis...) oder kovalente Chromatographie.
Bei der Chromatographiebehandlung kann die Menge der Hydrolysatlösung pro Liter Harz, das in die Säule gefüllt ist, bis zu 5 Liter bezüglich der Trockenfeststoffe von 10% betragen. Vorzugsweise wird eine Hydrolysatlösung mit 20–1000 g Trockenfeststoffe pro Liter Harz in die mit Harz gefüllte Säule geleitet. Die Chromatographiebehandlung kann bei einem pH von ungefähr 2 bis 10, vorzugsweise 6–8, für die gereinigte Hydrolysatlösung ausgeführt werden. Die Chromatographiebehandlung kann bei einer Temperatur von ungefähr 4°C bis 60°C durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann die Chromatographiebehandlung, um tolerogene Fraktionen von β-Lactoglobulin auszuwählen, bestehen in dem Verwenden von:

– einem starken kationischen Harz, der mit 0,1 N HCl bei einer Fließrate von 1 Volumen/Stunde equilibriert ist. Die nicht zurückgehaltene Fraktion wurde mit 3 Volumen Wasser eluiert, die zweite Fraktion (Fraktion, die tolerogene Peptide enthält), wurde mit 0–0,5 N NaOH eluiert und die dritte Fraktion wurde mit 0,1 N HCl eluiert.
– ein Umkehrphasen (C18)-Harz wurde mit reinem Wasser equilibriert. Die nicht zurückgehaltene Fraktion wurde mit Wasser eluiert, dann wurde Schritt für Schritt (20% und 40% Ethanol) die zweite und die dritte gewonnen.
– ein stark anionischer Harz wurde mit 0,1 N NaOH equilibriert. Die nicht zurückgehaltene Fraktion wurde mit 3 Volumen Wasser eluiert. Die zweite Fraktion wurde mit 0,5 N HCl und die dritte mit 0,1 N NaOH eluiert.

Das am meisten bevorzugte Verfahren ist es, eine neutrale Lösung mit Harz zu behandeln, wobei in diesem Fall keine pH-Einstellung nach dem Hydrolyseschritt erforderlich ist, und der Salzgehalt des Produkts niedriger sein wird.
Um die Chromatographiebehandlung zu beenden, kann die Säule mit reinem Wasser und dann mit Wasser, das Salz, Puffer, Säuren, Basen oder organische Lösungsmittel enthält, bei einer Temperatur von 4–60°C eluiert werden. Die Eluierung wird Schritt für Schritt oder mit einem Gradienten der Konzentration realisiert. Die Lösungen, die durch die Säule geleitet wurden, werden wiedergewonnen. Wenn notwendig, werden Salze, Lösungsmittel, Säuren, Basen aus der wiedergewonnenen Lösung entfernt, und die wiedergewonnenen Lösungen können auf einen Trockenfeststoffgehalt von 35 bis 65% konzentriert und sprühgetrocknet werden.
Diese Peptide sind dann bestimmte Fragmente, die einem Teil der nativen Proteinsequenz oder einem Teil der bestimmten tryptischen Peptide des hydrolysierten Proteins entsprechen.
Diese tolerogenen Peptide können für die Zubereitung einer Zusammensetzung verwendet werden, die eine orale Toleranz gegenüber nativen Proteinen erzeugt, wobei die Zusammensetzung für Säugetiere gedacht ist, die gegenüber Proteinallergien empfindlich sind, und insbesondere für Menschen und Haustiere.
Die folgenden Beispiele sind nur zur Erläuterung angegeben und sollten auf keinen Fall angesehen werden, daß sie den Gegenstand der vorliegenden Anmeldung beschränken.
Figuren
1 stellt die Erzeugung einer spezifischen oralen Toleranz bei Mäusen dar, die einmal mit entweder TTHβ-LG, F2 oder F(7+9) gefüttert wurden. A: humorale (dunkle Balken) und mucosale (graue Balken) anti-β-LG IgE-Antwort. B: β-LG-spezifische DTH-Antwort, (•) sind individuelle Fußballeninkremente und (-) sind Mittelwerte von 10 Mäusen/Gruppe. C: Spezifische (β-LG) und nicht spezifische (PHA) proliferierte Antworten von Milzzellen. Milzlymphocyten von Mäusen, die entweder mit Salin (♝), TTHβ-LG (
), F2 (
), oder F (7+9) (•) gefüttert wurden, wurden isoliert und anschließend mit abnehmenden Konzentrationen von Antigenen stimmuliert. ³H-Thymidin-Einbettung wurde nach 120 Stunden Kultur gemessen. (³H)Tdr-Einbettungs-Ergebnisse wurden in cpm ausgedrückt, als ein Mittelwert dreifacher Kulturen, wobei der völlig substrahierte Mittelwert dann jeweils gegen die β-LG- oder OHA-Konzentration aufgetragen wurde.
2 stellt Primär-Sequenzen dar, die tryptischen Peptiden zugewiesen sind, die in β-Lactoglobinhydrolysat identifiziert sind. Vertikale Balken stellen Disulfid-Bindungen dar.
Beispiele
Beispiel 1
Auswahl und Charakterisierung der tolerogenen Peptide von β-Lactoglobin
In dem folgenden ersten Beispiel wurden Experimente durchgeführt, um die tolerogenen Peptide von β-LG auszuwählen.
β-LG wurde durch TPCK-behandeltes Trypsin bei Bedingungen digeriert, die ausgewählt wurden, um seine milde Digerierung her vorzurufen. Die Größen- und Molekulargewichtsverteilung der sich ergebenden Peptiden von unserem β-LG-Hydrolysemodell bewegten sich jeweils im Bereich von 2 bis 23 Aminosäuren und von 247 bis 2719 Da. Die tolerogenen Eigenschaften der sich ergebenden Peptide wurden in einem Experimental-Maus-Modell für orale Toleranz untersucht.
Methoden
a) Tiere
Weibliche Balb/c-Mäuse wurden von IFFA-Credo (L'Abresle, Frankreich) erhalten. Sie wurden mit einer milchfreien Diät gezüchtet und aufgezogen. Die Mäuse waren bei dem Start der Experimente 3 Wochen alt.
b) Zubereitung tolerogener Fraktionen
Um digeriert zu werden, wurde β-LG (220 g) in bi-distilliertem Wasser mit 5% Wasser (w/w) Endkonzentration gelöst. Das β-LG wurde durch TPCK-behandeltes Tryptosin unter Verwendung eines Enzym/Substrats (E/S)-Verhältnisses von 1/100 (w/w) bei 40°C und einem pH von 7,6 unter konstantem Rühren digeriert. Nach einer Stunde Hydrolyse wurde die gleiche Menge Enzym zugegeben, damit sich ein 2/100 (w/w) E/S-Endverhältnis ergibt. Nach 4 Stunden Hydrolyse wurde die Reaktion durch Inaktivieren von Tryptosin bei 85°C für 5 min gestoppt. Das gesamte tryptische Hydrolysat von β-Lactoglobulin (TTH β-LG) wurde dann lyophilisiert. Die digerierten β-LG-Produkte wurden durch präparative Chromatographie an einem kationischen Harz getrennt.
15 verschiedene Fraktionen wurden erhalten, individuell nanofiltriert, um zu konzentrieren und Salze zu eliminieren, diafilteriert, dialysiert, lophilisiert und bei Raumtemperatur bis zu in vivo-Experimenten trockengelagert.
Jede Fraktion wurde durch seinen Peptidgehalt unter Verwendung von Umkehrphasen von High Performance Liquid Chromatography weiter charakterisiert. Unter Berücksichtigung von TTH β-LG als Referenz wurde die Zunahme und Verarmung von Peptiden in jeder Fraktion pro Fläche geschätzt, die bei 214 nm unter Verwendung von Iso-Stickstoffinjektionen detektiert wurde.
c) Erzeugung oraler Toleranz und Immunisierungsverfahren
Künstliche Sondenernährungen wurden an den Mäusen im Alter von 22 Tagen oral angewendet, indem natives β-LG (5 mg/g Körpergewicht), verschiedene Mengen von TTH β-LG- oder verschiedene Mengen verschiedener peptidischer β-LG-Fraktionen gastrisch gefüttert wurden. Kontroll-Mäuse wurden mit Salzlösungswasser gefüttert. 5 Tage später wurden alle Mäuse mit β-LG und OVA (Ovalbumin, gradeV, Sigma) immunisiert, als ein nicht betroffenes Antigen zum Testen der Spezifität der Immun-Antwort, wobei 21 Tage nach der systemischen Herausforderung eine Art verzögerte Hypersensivität (DTH)-Beurteilung durch doppelte Dickemessungen des linken hinteren Fußballens vor und nach der Immunisierung mit β-LG gemacht wurde.
d) Beurteilung des Immun-Antwortverhaltens
24 Stunden nach der DTH-Immunisierung wurden individuelle Zunahmen in der Fußballendicke von denen gemessen, die den Tag davor injiziert wurden. Unterschiede zwischen diesen beiden Messungen wurden in Δ-Dicken (Millimetern) ausgedrückt und bei Gruppenvergleichen verwendet. Dann wurden von allen Mäusen Blutproben genommen, die Milz gemessen und gemäß der Behandlungsgruppe angesammelt. Splenocytspezifische Proliferationsassays wurden für jede Gruppe durchgeführt. Darminhalte wurden individuell gesammelt. Serum- und Darmproben wurden schnell bei –80°C gefroren, bis sie untersucht wurden. Spezifische IgE's gegen β-LG und gegen OVA wurden sowohl bei Serum- als auch bei Darmproben bestimmt.
e) Spezifische IgE-Antikörperassays
Serum- und Darmfluidlösungen wurden doppelt für anti-β-LG- und anti-OVA IgE-Antikörper durch ELISA untersucht. Gesammelte Proben von zwanzig nicht immunisierten weiblichen Mäusen wurden als Negativkontrollen bei jeder Platte verwendet. Titer wurden bestimmt, indem die Lösung der Probe berechnet wurde, die das Doppelte der Absorption der negativen Kontrolle ergab. Titer wurden als der log₁₀ des Reziproken der Lösung ausgedrückt.
f) Zellkulturen
Milz-Zelllösungen wurden homogenisiert und gereinigt. Zellen wurden in der Gegenwart von β-LG oder von Phytohämagglutinin A zusammen kultiviert. (³H)Tdr (Amersham, Zürich) wurde in den letzten 6 Stunden der Kultur zugegeben und die Platten wurden geerntet und durch Szintillationszählen analysiert. Die Stimmulationsanzeigen wurden als das Verhältnis von leer subtrahierten Test- und Kontrollwerten berechnet, die als die mittlere cpm (³H)Tdr-Einbettung von dreifachen Kulturen ausgedrückt werden.
g) Bestimmung der β-LG IgG-Bindungskapazität
Eine ELISA-Hemmung wurde verwendet, um β-LG-Epitope in β-LG-Hydrolysaten und in β-LG-Fraktionen zu bestimmen. β-Lactoglobulin-Titer wurden aus einer β-LG-Standardkurve einer 5-fachen Lösung berechnet, die für jede Platte gefahren wurde.
DTH-Antworten, Serum und Darm-IgE-Antworten wurden verglichen unter Verwendung von ANOVA-Ein-Faktor-Tests.
Ergebnisse
a) Charakterisierung von Fraktionen, die von TTH β-LG erhalten wurden
Um die tolerogenen Peptide aus dem TTH β-LG zu isolieren, wurden große Mengen an β-LG-tryptischen Fraktionen durch präparative Chromatographie erzeugt. Für jedes von ihnen wurden 15 Fraktionen (F1-F15) gesammelt und jeweils angesammelt. Die zugehörigen Sequenzen von β-LG-tryptischen Peptiden wurden vorher bestimmt (2).

– Keine spezifische Peptidanreicherung konnte in den Fraktionen F1, F5 und F15 festgestellt werden.
– 3 verschiedene Peptide T6, T17 und T18, die in Fraktion F2 vorliegen, wurden angereichert, aber sie waren in keiner der anderen Fraktionen konzentriert.
– Entsprechend war T7 speziell in Fraktion F6 angereichert.

Abgesehen von diesen Peptiden, die nur in einer gegebenen Fraktion konzentriert waren, waren einige andere in verschiedenen Fraktionen angereichert. Das war zum Beispiel der Fall für T21, was klar mit höheren Raten in den Fraktionen F7, F9 und F10 detektiert wurde (Tabelle 1).
Tabelle 1 β-LG-Fraktionsmassen und signifikante Peptidanreicherung in den Fraktionen
b) Zwei verschiedene Fraktionen des tryptischen β-LG Hydrolysats zeigen tolerogene Eigenschaften:
Fraktionen wurden gemäß ihren Ähnlichkeiten der angereicherten Peptide und in Anteilen ihrer jeweiligen Massen angesammelt, und dann in vivo getestet.

– F1, F2, F5 und F15 wurden berücksichtigt, um individuell gefüttert zu werden, weil sie keine Peptidanreicherung mit den anderen Fraktionen teilten.
– F3 und F4 wurden angesammelt aufgrund ihrer hohen Konzentration von T23;
– F8 und F9 wurden gemischt, um die tolerogene Aktivität von T12 zu testen;
– F7 und F9 wurden angesammelt gemäß der Anreicherung von T20 und T21;
– F6, F11, F12, F13 und F14 wurden zusammen angesammelt, jeweils angereichert in T9, T10 und T11.

Qualitative Antwortverhalten der tolerogenen Eigenschaften, die vom Füttern der verschiedenen Fraktionsgruppen bei zwei ver schiedenen Konzentrationen (0,5 oder 0,125 mg/g Körpergewicht) gefüttert wurden, wurden ausgewertet. Die Erzeugung oder Abwesenheit der Erzeugung eines tolerogenen Antwortverhaltens gegenüber β-LG wurde durch die statische Signifikanz des Immun-Antwortverhaltens bestimmt.
Zwei der acht getesteten Fraktionen erschienen aktiv zu sein, sowohl beim Vermindern des serischen anti-β-LG IgE-Antwortverhaltens als auch bei der spezifischen β-LG splenocytischen Proliferation:

– F2, wenn es oral mit 0,125 mg/g Körpergewicht gegeben wurde,
– F(7+9) bei beiden getesteten Dosierungen.

c) Humorale, mucosale und zellulare Toleranz, die durch die orale Verabreichung von tryptischen β-LG Fraktionen F2 und F(7+9) erzeugt wird
Gemäß unseren quantitativen Kriterien, dem serischen und intestinalen anti-β-LG IgE-Antwortverhalten, DTH und der spezifischen splenocytischen Proliferation wurde orale Toleranz bei Mäusen erzeugt, die entweder mit F2 oder mit F(7+9) gefüttert wurden (1).
Für die zwei mit Fraktionen gefütterten Gruppen waren die serischen anti-β-LG IgE Titer, 3,58 +/– 0,18 und 3,21 +/– 0,29 für F2 bzw. F(7+9) nicht so niedrig, wie wenn sie durch TTH β-LG Fütterung (2,68 +/– 0,05) (1A) erzeugt wurden. Jedoch waren bestimmte Werte von IgE erheblich niedriger als Titer von Kontrollmäusen (4,16 +/– 0,05) (p<0,05). Bestimmte intestinale IgE's waren auch bei Mäusen vermindert, die mit TTH β-LG (1,66 +/– 0,32) oder mit den beiden tryptischen β-LG Fraktionen (1,1 +/– 0,34 und 1,9 +/– 0,21 für F2 bzw. F (7+9)) gefüttert wurden, wodurch die oral erzeugte Herunterregulierung im Vergleich zu der Kontrollgruppe (2,32 +/– 0,64) abgeschätzt wird. 1B zeigt, daß bestimmte DTH eindeutig bei Mäusen reduziert war, die mit entweder TTHβ-LG (0,074 mm) oder jeder der beiden tolerogenen Fraktionen (0,063 mm und 0,062 mm für F2 bzw. F(7+9)) gefüttert wurden im Vergleich zur lokalen Hypersensibilisierung,gemessen bei Kontrollmäusen, die nur mit Salzlösung gefüttert wurden (0,164 mm).
Um die erreichte Erzeugung oraler Toleranz auf zellularer Immunität zu bestätigen, wurden spezifische und nicht spezifische splenocyte Proiliferationassays durchgeführt. 1C und D zeigen, daß das Füttern von Mäusen entweder mit den beiden ausgewählten β-LG Fraktionen ebenso wie mit TTH β-LG eine deutliche Abnahme des proliferativen Antwortverhaltens gegenüber β-LG im Vergleich zudem einen hervorruft, daß für Splenocyte beobachtet wurde, die von mit Salzlösung gefütterten Kontrollmäusen isoliert wurden. In der Tat waren die Stimmulationsindizes 0,225, 0,174 und 0,341 für mit TTH β-LG, F2 bzw. F(7+9) gefütterte Mäuse. Wie erwartet, wurde das nicht spezifische prolifeative Antwortverhalten aufgrund der PHA-Stimmulation nicht durch die verschiedenen Fütterungsverabreichungen beeinflußt .
d) Antigenität des β-LG-Hydrolysats und der β-LG-Fraktion
Messungen der restlichen β-LG-Epitopen, die für die verschiedenen Fraktionen durch ELISA-Inhibition durchgeführt wurden, zeigten, daß sich die Mengen von β-LG-Epitopen, die pro Gramm Protein vorlagen, stark von einer Fraktion zu einer anderen unterschieden, im Bereich von 15 μg/g Protein für F1 bis zu 9240 μg/g Protein für F13. Diese Ergebnisse zeigen auch an, daß antigene und tolerogene Stellen unterschiedlich angeordnet sein können, was nahelegt, daß Allergenität und Tolerogenität ungekoppelt sein könnten. Schematisch können drei verschiedene Arten von Fraktionen beschrieben werden:

– eine erste Art, die durch Fraktion F2 repräsentiert wird, umfassend Grundpeptide mit einem hohen tolero genen Potential, das mit einer sehr niedrigen Antigenität verbunden ist,
– andererseits eine F13-artige Fraktion, die saure Peptide enthält, stark antigen ist und der eine tolerogene Aktivität fehlt, und schließlich,
– in einer Mittelstellung, die Peptide, die in den Fraktionen F7 und F9 vorhanden sind, Erzeuger von Toleranz sind, aber noch eine merkliche Antigenität haben.

Die Fraktionen F2 und die Mischung F(7+9) waren beide tolerogen. Die Antigenität von den tolerogenen Fraktionen F2, F7 und F9 waren niedriger als die des gesamten Hydrolysats. Bemerkenswerterweise wurde die Antigenität der tolerogenen F2 als 53 mal niedriger als die Antigenität von TTHβ-LG befunden. Bei diesen beiden tolerogenen Fraktionen waren die Größen der potentiell tolerogenen Peptide zwischen 8 Aminosäuren für T6 und 23 Aminosäuren für T21 verteilt, entsprechend in Molekulargewichten angegeben zwischen 915 und 2719 Da.
Um tolerogen zu sein, scheinen Peptide eine genaue Ausgewogenheit zwischen Dosis, Größe, Sequenz und Struktur zu erfordern. Jedoch wurde bis jetzt eine Korrelation zwischen Peptid-Struktur und tolerogenen Eigenschaften in der Literatur nicht beschrieben.
Beispiel 2
Erhalt von tolerogenen Peptiden aus Molkeprotein
Um tolerogene Peptide zu erhalten, wurden 1 kg Molkeproteinisolat in 7 Liter Wasser bei 50°C gelöst. Der pH wurde auf 7,5 mit 2N KOH eingestellt. Das Volumen wurde auf 14 Liter mit Wasser bei 50°C eingestellt, um eine 7%-ige Lösung bezüglich des Pulvers zu erhalten.
10 g Enzym Trypsin+Chymotrypsin wurde zugefügt, und der Lösung wurde für 120 min Hydrolyse ermöglicht. Der pH wurde mit einer alkalischen Lösung aus 2N KOH und 2N NaOH beibehalten. Nach der Hydrolyse wurde die Lösung für 10 min auf 80°C erhitzt. Die Lösung wurde auf 40°C gekühlt und mit 40.000 Da Abschneidemembranen ultrafiltriert.
Das klare Permeat wurde durch kationisches Harz behandelt, das wie folgt in ein Endharzvolumen von ungefähr 180 ml geleitet wurde. Der Harz wurde gewaschen und mit 0,1N NaOH bei einer Fließrate von 300 ml/h equilibriert. 100 ml klares Permeat mit 40.000 Da wurde in die Säule geleitet. Die nicht erhaltene Fraktion wurde mit 540 ml reinem Wasser eluisert. Die Zweite und die Dritte wurde mit 900 ml 0,5N HCl bzw. 540 ml 0,1N NaOH eluiert.
Die tolerogenen Peptide liegen in Fraktion F2 zum Beispiel in einer Menge vor, die hinreichend ist, um jede Reaktion zu verhindern, nachdem DBPCFC mit Kuhmilch durchgeführt wurde.
Beispiel 3
Erhalt tolerogener Peptide aus Caseinaten
1 kg Natriumcaseinat wurde in 7 Liter Wasser bei 50°C gelöst. Der pH wurde auf 7,5 mit 2N KOH eingestellt. Das Volumen wurde auf 10 Liter mit Wasser bei 50°C eingestellt, um eine 10%-ige Lösung bezüglich des Pulvers zu erhalten.
40 g Alcalase-Enzym wurde zugefügt, und der Lösung wurde für 120 min Hydrolyse ermöglicht. Der pH wurde mit einer alkalischen Lösung aus 2N KOH und 2N NaOH beibehalten. Nach der Hydrolyse wurde die Lösung für 10 min auf 80°C erhitzt. Die Lösung wurde auf 40°C gekühlt und mit Polyethylsulfonmembranen, die bei 10.000 Da abschneiden, ultrafiltriert.
Umkehrphasen-Chromatographie: 300 ml des klaren Permeats wurden in die Säule geleitet, die bei einer Fließrate von 3 ml/min equilibriert war. Die nicht erhaltene Fraktion wurde mit 300 ml Wasser eluiert, und dann wurde die zweite Fraktion mit 200 ml Ethanol mit einem Gradienten von 0–20% eluiert. Schließlich wurde die dritte Fraktion mit 200 ml Ethanol mit einem Gradienten von 20–40% eluiert. Die Säule wurde mit 400 ml Ethanol mit einem Gradienten von 40–80% V/V regeneriert und mit 500 ml reinem Wasser equilibriert.
Beispiel 4
Das Verfahren war wie in Beispiel 3 beschrieben, außer daß die Enzymmenge und das Abschneiden der Membran auf Alcalase 20g bzw. 40.000 Da geändert wurde. Die anschließende Chromatographie an kationischem Harz wurde wie folgt durchgeführt: 150 ml Harz wurde 3 mal mit 500 ml reinem Wasser gewaschen, dann in eine Säule gegossen, deren Endharzvolumen 180 ml war. Der Harz wurde gewaschen und mit 0,1N NaOH bei einer Fließrate von 300 ml/h equilibriert. 100 ml des klaren Permeats mit 40.000 Da wurde in die Säule mit einer Fließrate von 300 ml/h geleitet. Die nicht zurückerhaltene Fraktion wurde mit 540 ml reinem Wasser eluiert. Die Zweite und die Dritte wurde mit 900 ml 0,5N HCl bzw. 540 ml 0,1N NaOH eluiert.
Beispiel 5
Das Verfahren, wie im Beispiel 3 beschrieben, außer daß die Umkehrphasenbehandlung durch eine Chromatographie an einem stark anionischen Harz wie folgt geändert wurde: 150 g Harz wurde 3 mal mit 500 ml reinem Wasser gewaschen, dann in eine Säule gegossen, wo der Harz gewaschen und mit 0,1N HCl bei einer Fließrate von 180 ml/h equilibriert wurde. 100 ml klares Ultrafiltrat wurde in die Säule bei einer Fließrate von 180 ml/h geleitet. Die nicht zurückerhaltene Fraktion wurde mit 540 ml Wasser eluiert. Die Zweite und die Dritte wurde durch drei Säulenvolumen 0,5N NaOH bzw. 5 Säulenvolumen 0,1N HCl eluiert.
Beispiel 6
Tolerogene Säuglingsnahrung
Die tolerogenen Peptide T6 und T17, die in der tolerogenen Fraktion F2 enthalten waren, wurden synthetisch zubereitet. T13, die in der nicht tolerogenen Fraktion enthalten war, wurde auch als eine negative Kontrolle synthetisiert. Die Erzeugung oraler Toleranz gegenüber diesen Peptiden wurde an Mäusen, wie in Beispiel 1c) beschrieben, getestet, außer daß die Dosis 20 mcg/g Körpergewicht war. Ergebnisse
Die orale Verabreichung von T6 oder T17 erzeugt eine zellulare Toleranz (spezifische Inhibition von lymphozytischer Proliferation). T17 erzeugte auch eine humorale Toleranz durch erhebliche Abnahme spezifischer Anti-β-LG IgE.
Die orale Verabreichung von T13 (negative Kontrolle) erzeugte keine Toleranz.
Diese beiden Peptide T6 H₂N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH und T17 H₂N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K-K-COOH haben ein hohes tolerogenes Potential, verbunden mit einer sehr niedrigen Antigenität. Sie können in Lebensmittel oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Erzeugen einer Proteintoleranz bei Personen verwendet werden, bei denen ein Risiko für eine Proteinallergie besteht.
Beispiel 7
Tolerogene Säuglingsnahrung
Die Zusammensetzung für 100 g Pulver enthält 12,5% Peptide (synthetisierte Peptide T6 oder T17 oder tolerogene Peptide, wie in Beispiel 2 zubereitet, die ungefähr 0,1 bis 0,2% der Gesamtpeptide darstellen), 26% Fett, 56% Kohlenhydrate (einschließlich 39% Lactose, 11% Maltodextrin, 6% Stärke), Spuren von Vitaminen und Spurenelemente, um den täglichen Bedarf abzudecken, 2,5% Mineralien und 3% Feuchtigkeit.
13 g dieses Pulvers wird in 100 ml Wasser gemischt. Die erhaltene Zusammensetzung ist eine Säuglingsnahrung, die insbesondere für Säuglinge gedacht ist, bei denen ein Risiko für eine Kuhmilch-Allergie besteht.
Beispiel 8
Tolerogene Säuglingsnahrung
Um eine tolerogene Säuglingsnahrung zu erhalten, präparieren wir die folgende Mischung, die für 100 ml Nahrung 1,6% Peptide (tolerogene Peptide, wie in Beispiel 2 zubereitet, die ungefähr 0,1 bis 0,2% der Gesamt-Peptide darstellen), 3,4% Fett, 7,4% Kohlenhydrate (einschließlich 5,2% Lactose, 1,4% Maltodextrin, 0,8% Stärke), Spuren von Vitaminen und Spurenelemente, um den täglichen Bedarf abzudecken, 0,3% Mineralien und 79,9% Wasser enthält.
Beispiel 9
Um eine tolerogene Zubereitung eines kleinen Volumens zu erhalten, bereiten wir die folgende Mischung zu, die für 30 ml Zubereitung von ungefähr 0,003% bis ungefähr 0,015% tolerogene Peptide (tolerogene Peptide, wie in Beispiel 2 zubereitet, die 100 der Gesamt-Peptide darstellen), 7,4% Kohlenhydrate (einschließlich 1,4% Maltodextrin und 6% Saccharose), 92,5% Wasser und Aroma enthält. Um eine orale Toleranz zu erzeugen, wird diese Zubereitung 1 bis 5 mal pro Tag Neugeborenen verabreicht, bei denen "ein Risiko" für eine Kuhmilch-Allergie besteht, und die entweder mit hypoallergener Nahrung gefüttert oder gestillt werden.

Claims

Hypoallergene Zusammensetzung zur Erzeugung einer . Proteintoleranz bei Personen, bei denen ein Risiko für eine Proteinallergie besteht, die enthält (i) eine Grundlage aus einem "nicht allergenen" umfassend hydrolysierten Proteinmaterial und/oder (ii) eine Grundlage aus freien Aminosäuren, wobei die Zusammensetzung als Wirkbestandteil wenigstens ein tolerogenes Peptid des allergenen Proteins umfaßt, wobei die genannten tolerogenen Peptide vorliegen in Form von (i) isolierten tolerogenen peptidischen Fraktionen der Hydrolyse eines proteinischen Materials, das das allergene Protein enthält, und/oder (ii) synthetisch hergestellten tolerogenen Peptiden, und zwar in einer solchen Menge, daß das Verhältnis von tolerogener Aktivität durch restliche Antigenität wenigstens 2 × 10^-2 beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die eine Menge an tolerogenem Peptid von 0,01 bis 10%, vorzugsweise 0,1% bis 0,2% der gesamten Stickstoffquelle der Proteine in der Zusammensetzung enthält.
Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 2, die für Säugetiere bestimmt ist, die gegenüber einer Kuhmilchallergie empfindlich sind, die eine peptidische Fraktion enthält, die H₂N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH, H₂N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K-K-COOH oder H₂N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-KCOOH aus β-Lactoglobulin umfaßt.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, die eine Stickstoffquelle enthält, die 7 bis 25% der Gesamtenergie liefert, eine Kohlenhydratquelle, die 28 bis 66% der Gesamtenergie liefert, eine Lipidquelle, die 25 bis 60% der Gesamtenergie liefert, Mineralien und Vitamine, um den täglichen Bedarf zu decken, sowie wenigstens eines der genannten tolerogenen Peptide, das in einer für eine Erzeugung einer oralen Toleranz wirksame Menge zugesetzt ist.
Tolerogenes Peptid H₂N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH aus β-Lactoglobulin, das die Fähigkeit hat, eine orale Toleranz gegenüber Milchproteinen zu erzeugen.
Tolerogenes Peptid H₂N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K-K-COOH aus β-Lactoglobulin, das die Fähigkeit aufweist, eine orale Toleranz gegenüber Milchproteinen zu erzeugen.
Tolerogenes Peptid H₂N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH aus β-Lactoglobulin, das die Fähigkeit hat, eine orale Toleranz gegenüber Milchproteinen zu erzeugen.