DE68911619T2

DE68911619T2 - Reagenz und verfahren zum nachweis von rheumatoiden faktoren.

Info

Publication number: DE68911619T2
Application number: DE89902982T
Authority: DE
Inventors: Caron Thrasher
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-01-27
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2009-01-28
Also published as: JPH02500032U; EP0354954B1; US4914041A; WO1989007765A1; CA1339932C; DE68911619D1; AU608731B2; EP0354954A1; AU3195689A

Description

Hintergrund der Erfindung

Rheumatoide Arthritis ist eine systemische Erkrankung, die durch Muskelschmerz und -steife sowie durch Gelenkentzündung und -zerstörung gekennzeichnet ist. Diese Symptome sind in erster Linie das Ergebnis von Antikörpern, die häufig als Autoantikörper bezeichnet werden, die mit den eigenen Immunglobulin-Antikörpern eines Individuums reagieren. Die genaue Ursache der rheumatoiden Arthritis ist unbekannt, jedoch gibt es Nachweise dafür, daß drei verschiedene Faktoren eine Rolle spielen, nämlich: (1) genetische Veranlagung bzw. Prädisposition für rheumatoide Arthritis; (2) Umweltfaktoren, wie beispielsweise Virusinfektion; sowie (3) ein funktionaler Defekt in T-Lymphocyten. Die Beziehung zwischen dem genetischen, dem Umgebungs- und dem immunologischen Faktor ist nicht bekannt.
Hinweise und Anzeichen für veränderte Immunfunktionen, die Symptome von rheumatoider Arthritis mit sich bringen, sind unter anderem Hypergammaglobulinemia, verringerte invivo- und in vitro-T-Lymphocyten-Reaktivität, sowie das Vorliegen von Autoantikörpern gegen Immunglobulin G (IgG). Diese "Antiantikörper" oder "Antiimmunglobuline" sind wegen ihrer Verbindung mit rheumatoider Arthritis als Rheumatoidfaktoren (RF) bezeichnet worden. RF wurde mit wechselnder Häufigkeit auch in Patienten mit den meisten Bindegewebserkrankungen, vielen chronischen und subakuten Infektionen und einer Reihe verschiedenartiger Störungen gefunden. Außerdem wurde RF auch in vielen anscheinend gesunden Personen, insbesondere älteren Personen, gefunden.
Trotz seines Mangels an Spezifizität für die Diagnose von rheumatoider Arthritis ist RF noch von Wert als ein prognostischer Indikator. Beispielsweise haben Untersuchungen gezeigt, daß hohe Mengen oder Titer an RF mit destruktiver Gelenkserkrankung, dem Vorliegen von rheumatoiden Knoten und der Wahrscheinlichkeit zur Bildung zahlreicher systemischer Komplikationen in Verbindung stehen. Änderungen im Titer von RF im Verlauf der Erkrankung sind für die Abschätzung des Krankheitsverlaufs in einem gegebenen Individuum nicht sehr hilfreich. Nichtsdestoweniger nehmen in Untersuchungen von mit pharmakologischen Agentien behandelten Patientengruppen die mittleren Titer von RF im allgemeinen ab, falls eine Besserung eintritt. Über die Hälfte von Patienten mit seropositiver rheumatoider Arthritis, die rückfällig werden, werden seronegativ. Jedoch haben etwa 25 % derartiger Individuen trotz klinischer Erholung hohe Titer in ihren Seren.
Der mehrwertige RF-Autoantikörper bindet spezifisch mit dem monovalenten Fc-Teil oder Schwanz der IgG-Klasse von Immunglobulin-Antikörpern. RF vermag somit mit dem IgG-Antikörper zu binden, während einer oder mehrere der Bindungsarme des IgG-Antikörpers an sein entsprechendes Antigen gebunden ist/sind. Tatsächlich wird angenommen, daß RF mehr durch den IgG-Antikörper in seiner gebundenen Form angezogen wird, infolge von Kanformationsänderungen, die in dem IgG-Antikörper stattfinden und den Fc-Teil des Antikörpers zugänglicher machen.
Der gebräuchlichste Test auf RF ist das Latex-Agglutinationsverfahren nach Singer und Plotz, das manchmal als Latex-Fixiertest bezeichnet wird. J. M. Singer und C. M. Plotz, "The latex fixation test. I. Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis", Am. J. Med., 21, 888-892 (1956). In diesem Test werden mit menschlichem IgG überzogene Latexteilchen auf einem Objektträgerglas agglutiniert, üblicherweise in einer Verdünnung 1:20 der Testprobe. Die Testprobe ist typischerweise menschliches Serum, wenngleich gelegentlich auch (aus einem vermutet arthritischen Gelenk entnommene) Synovialflüssigkeit analysiert wird. Dieser Test wird allgemein als ein Screening- oder Reihenuntersuchungsverfahren betrachtet, aus welchem ein Ja/Nein-Ergebnis erhalten werden kann. Eine grobe Abschätzung des Titers kann durch weitere Verdünnungsreihen des Serums unter Verwendung des ursprünglichen Latex- Röhrchentests erlangt werden. Bei dem Latex-Röhrchentest werden die Teilchen in Lösung agglutiniert, wobei die resultierende Agglutination visuell nach verschiedenen Standards und Vergleichskontrollen interpretiert wird. Der Röhrchen- Verdünnungstest hat den Vorteil, daß er wesentlich empfindlicher als der Objektträgerglas-Test ist, aber er ist in der Durchführung komplizierter.
Der Latex-Agglutinationstest, der visuell und nicht instrumentell (wie beispielsweise nephelometrisch) durchgeführt wird, bildet das Prinzip hinter den meisten im weiteren Verlauf entwickelten Verfahren zum Nachweis von RF. Diese Verfahren sehen sämtlich die Verwendung eines Indikatorsystems, beispielsweise Latex, Bentonit oder Erythrocyten, an das menschliches IgG befestigt ist, vor. Das Vorhandensein von RF wird durch Agglutination, Ausflockung oder Präzipitation der verschiedenen Indikatorsysteme erkannt.
Mittels Wärme aggregiertes IgG kann auch direkt als das Antigen oder Indikatorsystem in dem Assay verwendet werden. Von einigen wird angenommen, daß der Wärmeaggregations- Schritt dem IgG eine Konformationsänderung erteilt, die zu einem besseren Nachweis führt. Es wird angenommen, daß die Konformationsänderung diejenige Konformationsänderung simuliert, die auftritt, wenn das IgM durch einen oder mehrere seiner Bindungsarme an sein entsprechendes Antigen gebunden ist.
Ein früherer Test, der als sensibilisierter Schafzellen- Agglutinationstest (Waaler-Rose-Test) bekannt ist, wird in manchen klinischen Laboratorien noch angewendet. Schafzellen, die mit Kaninchen-Antikörper bezüglich dieser Erythrocyten überzogen sind, werden durch bestimmte RF agglutiniert. Jedoch ist es wichtig, daß zuerst jegliche Anti-Schafzellen-Antikörper aus der Testprobe durch geeignete Absorption entfernt werden, um keine falsch-positiven Testreaktionen hervorzurufen. Ferner muß man frische Schafzellen verwenden, die jeden Tag vor Gebrauch standardisiert werden. Die Notwendigkeit frischer Zellen macht dieses Assay-Testverfahren für die Durchführung auf einer Routinebasis etwas unbequem, obwohl manche annehmen, daß der Schafzellen-Agglutinationstest größere Spezifizität für das RF von rheumatoider Arthritis besitzt.
Andere derzeit verfügbare Verfahren sind eine direktere Abwandlung des ursprünglichen Latex-Agglutinationstests. Beispielsweise wird in manchen Laboratorien ein Flockungstest verwendet, bei dem mit aggregiertem Human-IgG überzogene Bentonitteilchen statt Latex als Indikatorsystem verwendet werden. Formalinisierte und "gebeizte", Schafzellen, d. h. Zellen, die konserviert wurden, können mit aggregiertem Human-IgG als Indikatorsystem überzogen werden. Diese Zellen werden sodann durch RF agglutiniert. Dieser Test ist sehr empfindlich, jedoch ist das Testverfahren etwas schwieriger durchzuführen als die Latex-Tests und führt möglicherweise zu keinem praktischen Vorteil in Routineuntersuchungen. Ein Radioimmunassay für IgM RF wurde ebenfalls entwickelt, bei welchem insolubilisiertes IgG als ein Immunabsorbens verwendet wird, von welchem RF eluiert und charakterisiert werden kann. Immundiffusionstests, bei welchen Doppel- und Einfachdiffusionsverfahren verwendet werden, wurden ebenfalls entwickelt.
Automatisierte nephelometrische oder turbidimetrische Verfahren können im allgemeinen unter Verwendung einer beliebigen Reihe von Indikatorsystemen Anwendung finden. Bei der Turbidimetrie wird die Schwächung von durch die Teilchen- oder Aggregat-Suspension durchgelassenem Licht gemessen. Die Schwächung wird durch Reflexion, Streuung und Absorption des Lichts durch die Aggregate verursacht. In der Nephelometrie wird das zu einem nicht im direkten Lichtweg liegenden Detektor gestreute oder reflektierte Licht gemessen. In Fällen, wo eine Automatisierung nicht verfügbar ist oder unpraktisch wäre, steht eine einfachere Version von Nephelometrie und Turbidimetrie zur Verfügung, bei welcher die Menge der in einer Testprobe beobachteten Aggregatbildung visuell mit einem einzigen Standard oder mit einer Reihe von Kontrollstandards verglichen wird.
Zusätzlich zu den vorstehend bezeichneten Indikatorsystemen kann wärmeaggregiertes IgG direkt als das Indikatorsystem verwendet werden. Der Hauptnachteil der Verwendung von wärmeaggregiertem IgG als Indikatorsystem ist die unkontrollierte, zufällige Orientierung des Fc-Fragments von IgG, die man in dem Wärmeaggregationsprozeß erhält. Wo Latex, Bentonit oder ähnliche Teilchen als Kern des Indikatorsystems verwendet werden, können entweder intakte IgG- Antikörper oder Fc-Fragmente verwendet werden, wobei die Anzahl und die Orientierung von Fc-Bindungsstellen leichter kontrollierbar sind, je nach dem jeweils verwendeten speziellen Befestigungs- bzw. Kupplungsverfahren. Unabhängig von dem jeweils gewählten Typ von Indikatorsystem erbringen nephelometrische und turbidimetrische Verfahren insofern einen wichtigen Vorteil, als sie eine objektive Analyse mittels eines Instruments von etwas darstellen, was traditionell nur eine visuelle, hochgradig subjektive Abschätzung von in Titrationsschritten ausgedrückter Teilchenagglutination darstellte.
Auf RF zu untersuchendes Serum oder Synovialflüssigkeit muß gewöhnlich vor dem Assay auf 56 C erhitzt werden, um die labile Komplementkomponente C1q zu inaktivieren. Die in Serumproben häufig vorliegende C1q-Komponente wurde als mehrwertiger "Tulpenstrauß" beschrieben, bei welchem jeweils jede "Tulpe" mit dem gleichen Fc-Bereich des IgG- Antikörpers wie RF zu binden vermag. Somit vermag jegliches in einer Testprobe vorhandenes C1q auch mit IgG überzogene Teilchen zu agglutinieren, was falsch-positive Reaktionen zur Folge hat.
Der ganze Erwärmungs-Inaktivierungs-Schritt dauert ca. 45 Minuten. Jede Probe muß jeweils zuerst einer Inkubation bei 56 C 1 C während 30 Minuten 1 Minute unterzogen werden. Die Proben werden sodann 5 Minuten lang mikrozentrifugiert. Die weitere Probenhandhabung nimmt die verbleibenden ca. 10 Minuten in Anspruch. Diese erforderliche Probenvorbehandlung bedingt damit ein zusätzliches zeitaufwendiges Verfahren in dem RF-Assay, das im allgemeinen in jeden Test einbezogen werden muß.
In einigen Fällen wurde der Vorbehandlungs- oder Wärmeinaktivierungsschritt bei Anwendung des Latex-Objektträgerglas-Agglutinationstests und/oder des Latex-Rohrtests vermieden. Die Vermeidung des Wärmeinaktivierungsschrittes in diesen Tests macht im allgemeinen die Verwendung eines Standard-Glycin-Puffers und große Verdünnungen von C1q erforderlich. Beispielsweise finden in dem Standard-Latex- Rohrtest Reihenverdünnungen von 1:20 bis 1:10240 Anwendung. Es wird angenommen, daß die Glycin-Verbindung einen gewissen inhibitorischen Effekt auf C1q besitzt.
Jedoch hat jeder RF-Assay unterschiedliche Erfordernisse hinsichtlich Eigenschaften wie beispielsweise Präzision des Assaytests. Beispielsweise ergeben die meisten nephelometrischen und turbidimetrischen Assays objektive numerische Daten, im Gegensatz zu visueller Interpretation innerhalb eines gegebenen Konzentrationsbereichs. Für diese automatisierten Arten nephelometrischer und turbidimetrischer Assays können die hochgradigen Verdünnungen der Serumprobe nicht in Kauf genommen werden, wie sie in dem visuellen Latex- Agglutinationstest und im Latex-Rohrtest erforderlich sind, um das störende C1q aus einer Testprobe durch hinreichende Verdünnung auszuschalten. Eine Einstellung dieses Parameters ist daher in typischen nephelometrischen und turbidimetrischen RF-Assays nicht verfügbar.
Die Verwendung eines Glycin-Puffers allein hat sich als unwirksam zur universellen Anwendung auf automatisierte nephelometrische und turbidimetrische RF-Assays erwiesen. Andere bekannte C1q-Inhibitoren, wie beispielsweise Diaminobutan oder Deoxyribonucleinsäure (DNA) gemäß US-Patentschrift 4 153 417, haben sich in diesen Arten nephelometrischer und turbidimetrischer Assays ebenfalls als nicht zufriedenstellend erwiesen. Diese Verbindungen sind entweder unwirksam hinsichtlich der Inhibition der C1q-Aktivität, oder sie inhibieren gleichzeitig die RF-Aktivität, und beeinträchtigen so den Assay.
Die Inhibition von C1q wurde von Renata Allan etal., "Int. Archs. Allergy appl. Immun." 58:140-148 (1979), untersucht, wobei eine Reihe von Materialien, gewählt aus Polyanionen einschließlich Heparin, aliphatischen Aminen und Diaminen, Verbindungen mit Vitamin-B6-Aktivität, bestimmten Aminosäuren, Human- und Rinder-Collagen und von Kaninchen-IgG abgeleitete Peptide, hinsichtlich ihrem Inhibitionsvermögen verglichen wurden. Diese Arbeit deutet auch an, daß Pyridoxyl-5-phosphat von Wert ist. Heparin wurde ebenfalls als ein Inhibitor in einer Untersuchung der Bindungseigenschaften von Humankomplementkomponente von Sheri Almede et al., veröffentlicht in "Journal of Biological Chemistry" Vol 258, Nr. 2, S. 785-791 (Jan. 25, 1983), diskutiert.
Wegen der Kosten des Latex-Rohrtests, hinsichtlich Glasgeräten, Reagentien und Techniker-Zeitaufwand, und wegen der Mängel des Objektträger-Agglutinationstests sind automatisierte nephelometrische und turbidimetrische Tests dringlich erwünscht geworden. Die Schaffung eines derartigen Tests ohne das Erfordernis eines gesonderten Vorbehandlungsschritts zur Inaktivierung von C1q wäre vorteilhaft.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Puffer zur Verwendung beim Nachweis von RF in Serum- und Synovialflüssigkeitsproben geschaffen. Der neue Puffer enthält Heparin. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß Heparin als Inhibitor des störenden C1q ohne nennenswerte Inhibierung der Aktivität von RF wirkt, wodurch die Notwendigkeit für den umständlichen und zeitraubenden Verfahrensschritt der Wärme-Inaktivierungsvorbehandlung erübrigt wird, die in den Verfahren nach dem Stande der Technik erforderlich ist. Der Puffer gemäß der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft in nephelometrischen und turbidimetrischen Assays; überraschenderweise wurde gefunden, daß er dem RF- Assay größere Temperaturstabilität und verbesserte Genauigkeit verleiht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein graphischer Vergleich von Daten aus einem nephelometrischen RF-Assay unter Verwendung des Heparin-Puffers der vorliegenden Erfindung ohne Wärme- Inaktivierung, und dem gleichen Assay unter Verwendung des Borat-Puffers nach dem Stande der Technik mit Wärme- Inaktivierung.
Fig. 2 zeigt graphisch die Temperaturstabilität eines nephelometrischen RF-Assays unter Verwendung des Heparin- Puffers der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 veranschaulicht graphisch die Temperaturstabilität eines nephelometrischen RF-Assays bei Verwendung des Borat-Puffers nach dem Stande der Technik.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Heparin ist ein Mucopolysaccharid-Schwefelsäure-Ester, der die Gerinnungszeit von Blut verlängert. Natriumheparin als die kommerziell verfügbare Form ist ein Gemisch aktiver Bestandteile mit der Eigenschaft, die Gerinnungszeit von Blut zu verlängern. Natriumheparin wird gewöhnlich aus den Lungen, Darmschleimhäuten oder anderen geeigneten Geweben von Rindern, Schafen, Schweinen und anderen für menschliche Nahrungszwecke verwendeten domestizierten Säugetieren gewonnen.
Die Aktivität von Heparin wird herkömmlicherweise in den Vereinigten Staaten auf der Basis von U. S. Pharmacopeia- (USP)-Einheiten gemessen, die von den International Units (IU) unterschieden werden müssen. Die auf Trockenbasis berechnete Potenz von Natriumheparin beträgt üblicherweise nicht weniger als 120 USP Heparin-Einheiten je mg, wenn es sich um aus Lungen gewonnenes Heparin handelt, und gewöhnlich nicht weniger als 140 USP Heparin-Einheiten je mg bei Gewinnung aus anderen Geweben; typischerweise beträgt sie nicht weniger als 90,0 % und nicht mehr als 110,0 % der auf den Packungen angegebenen Potenz.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden wenigstens 750.000 USP-Einheiten Natriumheparin pro Liter Pufferlösung zugegeben, um C1q in einem RF-Assay zu unterdrücken. Optimal werden wenigstens 1.000.000 USP-Einheiten pro Liter zugegeben, wenn der bevorzugte Phosphat-Puffer der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Natriumheparin kann praktisch jedem zur Verwendung in einem RF-Assay geeigneten Puffer wirksam zugesetzt werden. Die optimale Heparinmenge variiert jedoch in Abhängigkeit von dem jeweils gewählten speziellen Puffer. So wird beispielsweise in einem Glycin-Puffer eine geringere optimale Menge Natriumheparin verwendet, infolge der Tatsache, daß Glycin vorgeblich eine gewisse eigene Inhibitorwirkung bezüglich C1q besitzt. Die obere Grenze der einem speziellen Puffer zugesetzten Natriumheparinmenge wird im allgemeinen durch Wirtschaftlichkeitsüberlegungen vorgegeben.
Die zur Verwendung in einem RF-Assay geeigneten Puffer sind im allgemeinen Puffer mit einer Pufferkapazität im pH-Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,5. Herkömmliche Puffer dieses Typs sind unter anderem Phosphat, Glycin, Borat und TRIS (Tri-(hydroxymethyl)aminomethan) sowie Derivate hiervon, wie beispielsweise Glycylglycin. Ebenfalls geeignet sind gewisse neuere biologische Puffer, unter anderem MOPS (3-(N-morpholino)propansulfonsäure), TES (N-tris-(Hydroxymethyl)methyl- 2-aminoäthansulfonsäure), HEPES (N-2-Hydroxyäthylpiperazin- N'-2-äthansulfonsäure), DIPSO (3-(N-bis-(Hydroxyäthyl)- amino)-2-hydroxypropansulfonsäure), TAPSO (3-(N-(tris- Hydroxymethyl)methylamino)-2-hydroxypropansulfonsäure), POPSO (Piperazin-N,N1-bis-(2-hydroxypropansulfonsäure)), HEPPSO (N-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-hydroxypropansulfonsäure), TRICINE (N-tris-(Hydroxymethyl)methylglycin), BICINE (N,N-bis-(2-Hydroxyäthyl)glycin) und TAPS (N-tris-(Hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure).
Die Bildung von Streuzentren oder Agglomeration kann durch Verwendung hydrophiler nicht-ionischer Polymere, wie beispielsweise Dextran oder Polyäthylenglycol (PEG), beschleunigt werden, welche die Wahrscheinlichkeit der Protein- Protein-Wechselwirkung durch Ausschluß einer nennenswerten Wasserfraktion erhöhen. Die Verwendung von Polymeren in einem nephelometrischen Assay erbringt auch die Vorteile erhöhter Empfindlichkeit und eines geringen Antiserumverbrauchs.
Heparin hat sich überraschenderweise als ein idealer C1q- Inhibitor zur Verwendung in RF-Assay-Puffern erwiesen, infolge seiner größeren Spezifizität für C1q als einige der nach dem Stande der Technik vorgeschlagenen Verbindungen, wie beispielsweise Diaminobutan und DNA. Insbesondere wurde gefunden, daß Heparin eine wesentlich geringere Inhibitorwirkung auf RF besitzt bei Anwendung von Konzentrationen, die eine C1q-Inhibition bewirken können. Ferner zeigte der Phosphat-Puffer mit Heparin-Zusatz die gleiche Kurvenanpassung wie der Borat-Puffer nach dem Stande der Technik mit Anwendung von Wärme-Inaktivierungs-Vorbehandlung, als Anzeige einer ausgezeichneten Korrelation mit dem Verfahren nach dem Stande der Technik.

Beispiel 1

Herstellung von Heparin-Puffer

200 1 eines Heparin enthaltenden RF-Puffers wurden wie folgt hergestellt: Tabelle I Bestandteil Menge Verwendete Menge Natriumheparin (aus Schweinedärmen) Kaliumphosphat monobasisch Kaliumphosphat dibasisch Natriumchlorid Natriumazid Polyäthylenglycol Äthylendiamintetressigsäure Entionisiertes Wasser Einheiten
Die Bestandteile wurden in einem Überschuß entionisiertem Wasser unter Verwendung eines Magnetrührwerks aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde sodann mit weiterem entionisiertem Wasser auf das Volumen eingestellt. Das Heparin war nicht leicht löslich, zur Erzielung einer vollen Auflösung war eine Mischdauer von 30 Minuten erforderlich.

Beispiel 2

Es wurde ein typischer nephelometrischer Immun-Assay bezüglich RF durchgeführt, unter Verwendung von Verdünnungen eines RF-Standards, von wärmeaggregierten IgG und dem Heparin-Puffer aus Beispiel 1. Die Ergebnisse wurden mit dem gleichen Assay unter Verwendung des Borat-Puffers nach dem Stande der Technik in Verbindung mit einem gesonderten Wärme-Inaktivierungs-Schritt verglichen.
RF-Konzentrat war von der Firma Aalto Scientific, Ltd., San Marcos, Kalifornien, erhältlich und wurde als innerer Standard verwendet. Das Konzentrat wurde auf die in Spalte 1 von Tabelle II angegebenen Konzentrationen verdünnt. Die nephelometrischen Messungen wurden an einem ICS -Nephelometer (Beckman Instruments) durchgeführt, indem man 500 ul Heparin-Puffer in ein ICS -Vial (Beckman Instruments) einbrachte und 100 ul sauberer Probe jeweils aus jeder RF- Standardverdünnung injizierte. Es wurde eine Instrumentverstärkungseinstellung gemäß manual Mode M33 verwendet. Nach dem Abklingen des durch die Injektion verursachten Übergangszustands und Erreichen der Basislinie wurden 42 ul wärmeaggregiertes IgG (RF-Antigen , Beckman Instruments) zugegeben und das Instrument zur Aufzeichnung des Spitzenwertsignals betätigt. Die Ergebnisse sind in Spalte 2 von Tabelle II zusammengestellt.
Die verdünnten Proben von RF-Standard wurden sodann 30 Minuten (1 Minute) lang bei 56 C ( 1 C) mittels Wärme inaktiviert und anschließend 5 Minuten lang mit 11.000 U/min zentrifugiert. Sodann wurden wiederum die nephelometrischen Messungen in der zuvor beschriebenen Weise vorgenommen, mit dem Unterschied, daß anstelle des Heparin-Puffers der Borat- Puffer nach dem Stande der Technik verwendet wurde. Tabelle II RF-Standard Heparin-Puffer Borat-Puffer
Die in Tabelle II angegebenen Ergebnisse sind in Fig. 1 graphisch dargestellt, woraus man ersehen kann, daß der Heparin-Puffer gemäß der vorliegenden Erfindung Meßwerte mit derselben Kurvenanpassung liefert wie die Meßdaten aus dem Verfahren nach dem Stande der Technik mit Wärme-Inaktivierung unter Verwendung eines Standard-Borat-Puffers.

Beispiel 3

Temperaturempfindlichkeit

Die nephelometrischen RF-Assays aus Beispiel 2 wurden bei drei verschiedenen Temperaturen wiederholt, nämlich bei 18 C, 25 C und 32 C, unter Verwendung der gleichen inneren Standards. Die Rohergebnisse aus diesen Assays wurden gegen einen Target-Wert normalisiert, der durch Inbezug-Setzung des internen Standards zu einem äußeren Kontrollsystem, wie beispielsweise dem von dem College of American Pathologists, Reference Preparation for RF (CAP RPRF) oder vom Center for Disease Control (CDC) aufgestellten etabliert wurde. Das CAP RPRF Control System ist auf die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zurückführbar. Die CAP-RPRF-Aktivitätseinheiten sind auf eine Skala standardisiert, die von etwa 20 bis etwa 125 Einheiten reicht. Die CDC-Aktivitäts- Einheiten werden als Internationale Einheiten (IU) angegeben und sind auf eine Skala standardisiert, die von etwa 60 bis etwa 400 IU reicht.
Die für den nephelometrischen RF-Immuntest unter Verwendung des Heparin-Puffers gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Standards wurden auf CAP-RPRF-Einheiten standardisiert. Ein Target-Signalwert von 2084 wurde für die Konzentration von 85,3 Einheiten/ml auf dem Beckman-ICS -Nephelometer eingestellt, unter Bezugnahme auf CAP-RPRF-Einheiten. Die Ergebnisse dieser Temperaturempfindlichkeitsuntersuchungen sind in Tabelle III gezeigt. Die gleichen Ergebnisse sind in Fig. 2 graphisch dargestellt. Tabelle III Heparin-Puffer (Target) Einheiten/ml Diff. gegen
Dieselben inneren RF-Standards wurden für den nephelometrischen RF-Immuntest mit Wärmeinaktivierung und dem Borat- Puffer nach dem Stande der Technik verwendet, jedoch in CDCInternationalen Einheiten standardisiert. Hinsichtlich aller anderen Aspekte war das Verfahren das gleiche wie für den Heparin-Puffer, ausgenommen wie in Beispiel 2 angegeben. Ein Target-Rate-Wert von 1470 wurde für die Konzentration von 223,0 IU/ml auf dem Beckman-ICS -Nephelometer eingestellt, mit Referenzierung zu dem CDC-System. Die Ergebnisse der Temperaturempfindlichkeitsuntersuchungen an dem Verfahren nach dem Stande der Technik sind in Tabelle IV gezeigt und in Fig. 3 graphisch dargestellt. Tabelle IV Borat-Puffer/Wärme-Inaktivierung Gegen
Ein Vergleich der in Fig. 2 und Fig. 3 dargestellten Kurven zeigt die überraschende Beständigkeit des Heparin-Puffers gemäß der vorliegenden Erfindung gegenüber Temperaturempfindlichkeit. Im einzelnen zeigte der nephelometrische RF-Assay unter Verwendung des Heparin-Puffers gemäß der vorliegenden Erfindung eine Zunahme von ca. 29 % in Rate- Einheiten von 18 C bis 32 C, während bei dem Verfahren nach dem Stande der Technik unter Verwendung des Borat- Puf fers und Anwendung von Wärme-Inaktivierung ein Anstieg von ca. 75 % beobachtet wurde.

Beispiel 4

Genauigkeit

Eine Aliquot-Menge RF-Standard wurde in einen Bereich niedriger Konzentration herab verdünnt, und es wurden nephelometrische RF-Assay-Meßablesungen jeweils zwanzigmal für den Heparin-Puffer bzw. für den Borat-Puffer mit Wärme-Inaktivierung wiederholt. Die Messungen wurden an der gleichen Probe bei 18 c und bei 25 C wie zuvor in den Beispielen 2 und 3 beschrieben vorgenommen. Das ICS -Nephelometer (Beckman Instruments) wurde für Angabe der Heparin-Puffer- Ergebnisse in CAP-RPRF-Einheiten und die Borat-Puffer- Ergebnisse in CDC-International-Units-Einheiten programmiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. Tabelle V Genauigkeit bei niedriger Konzentration Heparin-Puffer Borat-Puffer Temperatur Mittel Standard-Abweichung % Variationskoeffizient
Eine Aliguot-Menge des gleichen RF-Standards wurde danach auf einen als RF-positiv angenommenen mäßigen Bereich herab verdünnt. Für die gleiche Probe wurden aufeinanderfolgend 6 Messungen vorgenommen, unter Verwendung des Heparin- Puffers bzw. der Wärme-Inaktivierungs-Methode nach dem Stande der Technik mit Standard-Borat-Puffer, bei 18 C, 25 C und 32 C. Die Ergebnisse für die Heparin-Puffer- Proben wurden in CAP-RPRF-Einheiten angegeben, die Ergebnisse mit dem Borat-Puffer in CDC Internationalen Einheiten. Die Vergleichsergebnisse erscheinen in Tabelle VI. Tabelle VI RF-positiv-Genauigkeit Heparin-Puffer Borat-Puffer Temperatur Mittel Standard-Abweichung % Variationskoeffizient
In den meisten Fällen zeigten die Proben mit Heparin-Puffer einen signifikant niedrigeren Variationskoeffizienten (Streuung). Die Daten bestätigen die ungewöhnliche Feststellung verbesserter Genauigkeit bei Verwendung des Heparin-Puffers gemäß der vorliegenden Erfindung.

Claims

1. Reagenz zur Verwendung in einem Immuntest für Rheumatoidfaktor RF, umfassend eine Mehrzahl van IgG-Antikörpern, deren Fc-Teile freigelegt sind, einen Puffer und eine -Heparin-Menge, welche die Interferenz von menschlichem Komplement C1q während der Verwendung in dem Immuntest wirksam inhibiert.

2. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem das genannte Heparin in einer Konzentration von wenigstens etwa 750.000 USP- Einheiten/l vorliegt.

3. Reagenz nach Anspruch 1, bei welchem der genannte Puffer eine Pufferkapazität im pH-Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,5 besitzt.

4. Reagenz nach Anspruch 3, bei welchem das genannte Heparin in einer Konzentration von wenigstens etwa 750.000 USP- Einheiten/l vorliegt.

5. Reagenz nach Anspruch 3, bei welchem der genannte Puffer aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Phosphat, Glyzin, Borat, TRIS, MCPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, TRICIN, BICIN, TAPS sowie Gemischen hiervon besteht.

6. Reagenz nach Anspruch 5, bei welchem der genannte Heparin- puffer in einer Konzentration von etwa 1.000.000 USP- Einheiten/l vorliegt.

- 7. Reagenz nach Anspruch 6, bei welchem der genannte Puffer ein Phosphatpuffer ist.

8. Reagenz nach Anspruch 7, des weiteren umfassend eine wirksame Menge Polyäthylenglykol.

9. Reagenz nach Anspruch 8, bei welchem das genannte Polyäthylenglykol in einer Konzentration von wenigstens etwa 7,5 g/l vorliegt.

10. Immuntest zur Messung von RF in einer Testprobe, umfassend:

a) Kontaktieren der genannten Testprobe mit dem Reagenz gemäß Anspruch 1; sowie

b) Nachweisen des Vorliegens von Agglutinierung.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem der genannte Nachweis instrumentell durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem der genannte Nachweis mittels Nephelometrie oder Turbidimetrie vorgenommen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem das genannte Heparin in einer Konzentration von wenigstens etwa 750.000 USP- Einheiten/l vorliegt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem die genannte Testprobe des weiteren mit einem Standardpuffer kontaktiert wird, der eine Pufferkapazität im pH-Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,5 besitzt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem der genannte Standardpuffer aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Phosphat, Glyzin, Borat, TRIS, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, TRICIN, BICIN, TAPS sowie Gemischen hiervon besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei-welchem das genannte Reagenz mittels Wärme aggregieften IgG Antikörper enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei welchem das genannte Heparin in einer Konzentration von etwa 1.000.000 USP-Einheiten/l vorliegt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem der genannte Standardpuffer ein Phosphatpuffer ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem die genannte Testprobe des weiteren mit einer wirksamen Menge Polyäthylenglykol kontaktiert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem der genannte Polyäthylenglykol in einer Konzentration von wenigstens etwa 7,5 g/1 vorliegt.