DE69430789T2

DE69430789T2 - Verfahren zur Bestimmung von Protein und Kreatinin in Harn

Info

Publication number: DE69430789T2
Application number: DE69430789T
Authority: DE
Inventors: Amy H. Chu; Brenda Tudor; Kin-Fai Yip
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-11-21
Publication date: 2002-10-24
Anticipated expiration: 2014-11-22
Also published as: BR9404242A; IL110220A0; AU677106B2; US5385847A; ES2177560T3; JPH07198719A; NZ264209A; CA2131146A1; DE69430789D1; EP0656541A3; EP0656541A2; NO315957B1; ZA945837B; NO942987D0; NO942987L; ATE219248T1; CA2131146C; AU7915094A; FI114342B; IL110220A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Humanserumalbumin (HSA), eines der in Urin messbaren Proteine, hat klinische Bedeutung zum Nachweis der frühen Stufen von Nephropathie, d. h. eines abnormen Zustands der Niere. Ein hoher Prozentsatz von Personen, die unter Insulin-Abhängiger Diabetes Mellitus (IDDM) und Nicht-Insulin- Abhängiger Diabetes Mellitus (NIDDM) leiden, scheiden eventuell HSA in Gehaltsmengen über der Obergrenze der normalen Bevölkerung aus. Dieses Stadium von "Mikroalbuminurie" wird zunehmend schlechter und führt zu Nephropathie. Da der Nierenschaden im Stadium der Mikroalbuminurie durch Verabreichung einer entsprechenden Therapie gesteuert oder gar umgekehrt werden kann, ist es allgemein anerkannt, dass eine Messung der Mikroalbuminurie Teil einer umfassenden Vorsorge und Behandlung von IDDM und NIDDM ist.
Weitere in Urin vorkommende Proteine, z. B. IgG, α-1-Mikroglobulin, Bence-Jones-Protein und N-Acetyl-β-D-glucosaminidase, eignen sich als Marker, um prärenale, glomeruläre und postrenale Formen von Proteinurie nachzuweisen und zu unterscheiden. Proteinurie, die angezeigt wird, wenn die Protein-Konzentration in Urin mehr als 30 mg/dL beträgt, stellt das allgemeine Symptom für eine Vielzahl unterschiedlicher Nierenkrankheiten dar. Demzufolge besteht ein Bedarf auf Seiten der Nephrologen, Diabetologen und Kardiologen für Testverfahren, die empfindlich, spezifisch und quantitativ für die Bestimmung dieser Proteine in Urin sind.
Zur Erhöhung der Empfindlichkeit und Spezifität von Protein- Assayverfahren für Urin und zur Minimierung des Problems einer hohen Urin- Durchflussrate mit dem Ergebnis einer Urinverdünnung werden Protein/Kreatinin-Verhältniswerte bei Urin-Protein-Assayergebnissen angewandt, um die Urin-Konzentration zu normalisieren. Typische Analyseverfahren von Protein in Urin betreffen Immunoassayverfahren wie einen Radioimmunoassay, Enzym-Immunoassay, Latex-gestützten Immunoassay und einen immunoturbidimetrischen Assay. Übliche Kreatinin-Assayverfahren, wie die alkalischen Jaffe- und Benedict-Behre-Verfahren, werden bei einem hohen pH-Wert durchgeführt, und zwar in typischer Weise im Bereich von 11,5 bis 12,5. Die übliche Praxis in heutigen klinischen Laboratorien ist es, die Protein- und Kreatinin-Assayverfahren getrennt durchzuführen und dann die aus diesen Assayverfahren erhaltenen Werte in Beziehung zu setzen, um das Protein/Kreatinin-Verhältnis zu ergeben. Da Patienten mit hohen Urin- Durchflussraten künstlich niedrige Protein-Werte wegen der Verdünnung des Urins aufweisen würden und Kreatinin ein guter Marker für die Verdünnung von Urin ist, eliminiert daher das Protein/Kreatinin-Verhältnis das Problem der Urin-Verdünnung und ergibt eine genauerere Wiedergabe der wahren Protein-Ausscheidungsrate.
In Clin. Chem. 32/8, 1544-1548 (1986) diskutieren Watts et al vier immunochemische Verfahren (einen Radioimmunoassay, eine radiale Immunodiffusion, Immunoturbidimetrie und einen Enzym-gebundenen Immunosorbensassay) zur Messung von Albumin in Urin bei niedrigen Konzentrationen. Sie legen dar, dass diabetische Nephropathie eine Haupt-Todesursache bei Insulinabhängigen Diabetikern ist und die klinische Laborchemie eine technische Verfahrensweise benötigt, die empfindlich und spezifisch für Albumin und praktikabel ist. Watts et al fahren fort, um in Practical Diabetes Vol. 9, Nr. 3, S. 84-86, herauszustellen, dass Mikroalbuminurie eine supranormale Quantität von urinärem Albumin ist, die sich einem Nachweis durch Indikatorfarbstoff-Bindungstests entzieht, und dass sie einen wirkungsvollen Marker sowohl von früher Nephropathie als auch von Herzkranzgefäßkrankheiten bei Patienten mit Diabetes mellitus darstellt. I. S. Ross, R. E. Stroud und J. Scheymans beschreiben einen immunoturbidimetrischen Assay für Mikroalbuminurie in normalem und diabetischem Urin (Transplantation Proceedings, Vol. XVIII, Nr. 6 (Dezember), 1986, 1654-1655).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Protein und Kreatinin in Urin in einem Einzelreaktionsgefäss unter Anwendung derselben Anteilsmenge einer Urinprobe. Das Verfahren beinhaltet die Stufen, in denen man:
a) eine Urinprobe bereitstellt, bei der der Verdacht besteht, dass sie Protein und Kreatinin enthält, und man in der einen oder anderen Reihenfolge
b) den pH-Wert der Urinprobe auf ein Niveau einstellt, das sich zur Durchführung eines Immunoassay für die Protein-Konzentration eignet, worauf die Protein-Konzentration mit einem Immunoassayverfahren bestimmt wird, und
c) den pH-Wert der Urinprobe auf ein Niveau einstellt, das sich zur Durchführung eines Assay für Kreatinin eignet, worauf die Kreatinin- Konzentration in der Urinprobe bestimmt wird.
Nach Bestimmung der individuellen Protein- und Kreatinin- Konzentrationen wird deren Verhältnis berechnet.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist es möglich, entweder Option A, wobei Kreatinin vor dem Protein bestimmt wird, oder Option B anzuwenden, wobei die Protein-Konzentration anfänglich bestimmt wird und dann die Bestimmung der Kreatinin-Konzentration in der zu testenden Urinprobe erfolgt. Unabhängig von der Reihenfolge, in welcher die Bestimmung durchgeführt wird, ist es notwendig, den pH-Wert der Urinprobe einzustellen, um die erforderlichen Bedingungen für den Protein-Immunoassay zu ergeben, der bei einem pH-Wert von ca. 7 bis 9 durchgeführt wird, welcher den optimalen pH-Bereich für diesen Assay darstellt. Der Kreatinin-Assay wird bei einem pH-Wert von ca. 11,5 bis 12,5 durchgeführt, um das Kreatinin zu entprotonieren, so dass das Assaysystem sauber arbeiten kann. Der erste Test in der Praxis zur Bestimmung von Kreatinin in Urin, der als das Jaffe-Verfahren bekannt ist, beinhaltet die Bildung des rot-gelblich braun gefärbten Kreatininpikrats durch die Bindung von Pikrinsäure und Kreatinin in der alkalischen Lösung. Ein neueres Verfahren zur Kreatinin-Bestimmung, das als das Benedict-Behre-Verfahren bekannt ist, beinhaltet die Reaktion des weiteren Kreatinin-reaktiven Reagens 3,5-Dinitrobenzoesäure mit Kreatinin im alkalischen Medium. Jedes entsprechende Reagens, das eine Farbreaktion ergibt, wenn es mit Kreatinin bei dem zur Entprotonierung erforderlichen pH-Wert in Kontakt gebracht wird, eignet sich zur Verwendung in dieser Stufe.
Das analytische Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in jeder der beiden Reihenfolgen der Protein- und Kreatinin-Bestimmung durchgeführt werden. Gemäß Option A wird eine Urinprobe mit einem geeigneten Reagens zur Kreatinin-Bestimmung und einem starken Alkali vermischt, um eine Farbe für die Kreatinin-Konzentrationsmessung zu erzeugen, die in typischer Weise mit spektrofotometrischen Mitteln erfolgt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird dann mit einem entsprechenden Ansäuerungsmittel erniedrigt, worauf das Ganze mit dem Antikörper-Reagens vermischt wird, um eine Trübung für die Protein-Konzentrationsmessung zu erzeugen.
Bei Option B wird die Urinprobe mit dem Antikörper-Reagens vermischt, um eine Trübung für die Protein-Konzentrationsmessung zu erzeugen. Ein alkalisches Reagens und ein geeigneter Kreatinin-Indikator werden dann zugefügt, um den pH-Wert anzuheben und eine Farbe für die Kreatinin- Konzentrationsmessung zu erzeugen.
Während die Volumina von Urinprobe und Reagens-Lösungen beliebig angepasst für eine besondere analytische Umgebung sein können, reichen eher kleine Volumina, z. B. 1 bis 50 uL Urin und 20 bis 1000 uL Puffer-Lösung, enthaltend das Kreatinin-Reagens und das Immunoreagens für das Protein, hin.
Wird die Bestimmung unter Anwendung der Option A durchgeführt, tritt eine Verzögerung zwischen dem Kreatinin- und dem Protein-Assay ein, da das gefärbte Kreatinin-Reaktionsprodukt den turbidimetrischen Bestimmungsassay für das Protein in der nächsten Stufe stört. Demzufolge ist die Option B das bevorzugte Verfahren, da herausgefunden worden ist, dass sich die Agglutinationsprodukte der Antikörper/Protein-Reaktion fasst unmittelbar bei Zugabe des Alkali- und Kreatinin-Reagens auflösen, so dass dieser Teil des Assay innerhalb ca. 1 s der Protein-Bestimmung durchgeführt werden kann. Diesbezüglich ist eine Protein-Assayverfahrensweise mit Lichtstreuung wie bei nephelometrischen oder turbidimetrischen Assayverfahren mit Immunoagglutination zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet. Dies kann ein Agglutinationsassay zwischen Antikörpern und dem Protein oder ein Verfahren vom Latex-gebundenen Antikörper-Agglutinationstyp sein, wobei ein Antikörper oder ein Fragment davon, die spezifisch für besondere Epitope des Proteins sind, an ein in Wasser suspendierbares Teilchen (z. B. an Polystyrol oder einen anderen Latex) und an das Protein gebunden sind. Durch Verbindung einer großen Anzahl epitoper Bindungsstellen für die Antikörper oder des Antikörper-Latex und der Vielzahl von Epitopen am Protein kann ein großes Aggregat zwischen den Antikörpern oder dem Antikörper-Latex und dem Protein gebildet werden. Dieses Aggregat erzeugt die Trübung, die spektrofotometrisch messbar ist, wobei der Trübungsgrad mit der Protein- Konzentration in der Testprobe korreliert. Das folgende Beispiel veranschaulicht eine Analyse für HSA und Kreatinin unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.

Beispiel I

Messung von HSA und Kreatinin mit Option A

Zu 1,08 mL einer 5%-igen Polyethylenglycol-Lösung wurden 60 uL einer Probe aus HSA, Kreatinin oder einer Mischung aus HSA und Kreatinin gegeben. Dann erfolgte die Zugabe von 30 uL alkalischem Reagens (Kaliumphosphat, pH = 13,5) und von 30 uL DNBR (Dinitrobenzoesäure), um den Kreatinin-Assay zu initiieren, worauf die Absorption bei 531 nm 200 s lang gemessen wurde. Die Rate des Anstiegs der Absorption ist proportional zur Konzentration des Kreatinins in der Probe, dargestellt in Fig. 1. Aus Fig. 1 ist bestimmbar, dass die Konzentration von Kreatinin in einer Probe in einem Bereich von 20 bis 500 mg/dL genau gemessen werden kann. Gleich nach der Messung werden 50 uL Tris · HCl (Tris-Puffer ist Tris(hydroxymethylaminomethan)) zugegeben. Nach Zerstörung des gefärbten Kreatinin-Reaktionsprodukts durch den Puffer (nach einigen Minuten) werden 60 uL Antiserum (Ziege-Antikörper für HSA) zugefügt. Die Absorption bei 531 nm wurde 150 s lang erneut gemessen. Die Rate des Anstiegs der Absorption ist proportional zur Konzentration von HSA in der Probe, wie dargestellt in Fig. 2. Aus Fig. 2 ist bestimmbar, dass die Konzentration von HSA im Bereich von 5 bis 500 mg/L genau gemessen werden kann.

Messung von HSA und Kreatinin mit Option B

Zu 1,08 mL Proben-Assaypuffer (pH = 8,5) aus 4%-igem Polyetehylenglycol, 10 mM Tris, 10 mM EDTA und 0,02% Natriumazid wurden 60 uL Probe (HSA, Kreatinin oder eine Mischung aus HSA und Kreatinin) gegeben. Dann erfolgte die Zugabe von 60 uL Antiserum-Reagens, um den HSA-Assay zu initiieren. Die Absorption bei 531 nm wurde 200 s lang gemessen. Die Rate des Anstiegs der Absorption ist proportional zur Konzentration von HSA in der Probe. Nach der turbidimetrischen HSA-Messung wurden 30 ul des alkalischen Reagens zugegeben, worauf 30 uL 3,5-Dinitrobenzoesäure (DNBA)-Reagens zugefügt wurden. Die Trübung klärte sich sofort nach Zugabe des Alkali, so dass keine Verzögerung beim Beginn des Kreatinin-Assay eintrat. Die Absorption bei 531 nm wurde 3 min lang erneut gemessen. Die Rate des Anstiegs der Absorption ist proportional zur Konzentration des Kreatinins in der Probe. Die verbundenen HSA- und Kreatinin-Assayverfahren sind in Fig. 3 dargestellt. Aus Fig. 3 ist bestimmbar, dass die Konzentration von HSA in einer Probe im Bereich von 5 bis 1000 mg/L und anschließend das Kreatinin (150 mg/dL) in den Proben genau gemessen werden können.
Während die verbundene Analyse von Protein und Kratinin in Urin im oben beschriebenen Nassanalyse-Format gut funktioniert, ist herausgefunden worden, dass sie sich zur Anpassung an ein Reaktionsgefäß zur Durchführung nacheinander ablaufender Analyse-Assayverfahren wie an das in US 4,990,075 offenbarte eignet. In diesem Patent sind ein Reaktionsgefäß mit einer im wesentlichen horizontalen Drehachse und ein Reaktionskanal für ein analytisches Reagens offenbart, der erste und zweite Reaktionszonen enthält, die mit ersten und zweiten analytischen Reagenzien beaufschlagt sind, die mit einem Analyt in einer flüssigen Testprobe wechselwirken, um eine nachweisbare Reaktion als Funktion des Analyt zu ergeben. Die zweite Reaktionszone ist in einem vorbestimmten Abstand von der ersten Reaktionszone und in fluider Verbindung damit angeordnet, wodurch eine flüssige Testprobe, die im Reaktionskanal vorliegt, dazu befähigt wird, durch Schwerkraft entlang dem Reaktionskanal zwischen den Reaktionszonen durch Drehung des Reaktionsgefäßes um die Drehachse transportiert zu werden. Das Reaktionsgefäß weist ein Abgabe-Element für die flüssige Testprobe zum unidirektionalen Fluss der flüssigen Testprobe in das Reaktionsgefäß und ein Einlass-Element in Flüssig-Verbindung mit dem Abgabe-Element zur Einbringung der flüssigen Testprobe in das Abgabe-Element auf.
Der Protein/Kreatinin-Assay kann in diesem Raktionsgefäß unter Anwendung von entweder der Konfiguration A oder B durchgeführt werden, die nun beschrieben werden. Betreffend Fig. 4, wird, unter Anwendung von Konfiguration A, eine Mischung aus dem Antikörper und einem Additiv wie einem Mono-, Di- oder Oligosaccharid auf der ersten Reagens-Stelle 28 in der ersten Reaktionskammer 24 des Reaktionsgefäßes 10 getrocknet. Das Additiv ist erwünscht, da es dazu beiträgt, den Antikörper bei der Trocknung und während seiner langzeitigen Lagerung nach der Trocknung zu stabilisieren. Die Additive ergeben auch eine physikalische Stabilität, um ein Abschälen und Abbrechen des getrockneten Reagens zu verhindern. Die Vorrichtung weist innere Wände 14 auf, die eine Abgabekammer 23 bilden, die die Einbringung einer flüssigen Testprobe wie einer kleinen Menge von zu analysierendem Urin in die Vorrichtung ermöglichen, und da die Abgabekammer in fluider Verbindung mit dem Reaktionskanal 21 steht, kann die flüssige Testprobe in den Reaktionskanal durch die Abgabekammer eintreten und dazu gebracht werden, entlang dem Reaktionskanal durch Drehung der Vorrichtung entlang ihrer horizontalen Drehachse im Uhrzeigersinn zu fließen. Die Testprobe wird in einfacher Weise durch den Kapillardispenser 12 ausgegeben, wie in Fig. 4 dargestellt. Da nur eine kleine Menge Urin durch den Abgabekanal eingeführt wird, kann zusätzliche Reaktionsflüssigkeit, die geeignete Puffermittel enthält, entweder durch den Abgabekanal oder aus einer anderen Quelle wie einem Flüssigkeitsabgabereservoir 26 eingeleitet werden, das angepasst ist, um einen Puffer und/oder ein flüssiges Reagens zur Durchführung der analytischen Assayverfahren der vorliegenden Erfindung zu enthalten. Das Flüssigkeitsabgabereservoir umfasst einen Reservoirkörper 27 mit einer darin ausgebildeten Vertiefung 26, um als Flüssigkeitsreservoir zur Aufnahme der Flüssigkeit bis zu ihrem Gebrauch zu fungieren, welches durch eine Membran (nicht gezeigt) bedeckt ist, die entfernt werden kann, um die Flüssigkeit im Reservoir 26 in den Reaktionskanal 21 fließen zu lassen. Einfache Manipulation der Vorrichtung lässt die von der Flüssigkeit getragene Testprobe aus dem Flüssigkeitsreservoir 26 in eine Position zur Inaugenscheinnahme durch eine Sichtkammer 42 fließen. Fig. 5 stellt das in den Ansprüchen beschriebene Reaktionsgefäß nach Zugabe der Reaktionsflüssigkeit dar.
Das Reaktionsgefäß weist eine erste Reaktionszone 24 auf, die in typischer Weise im Reaktionskanal 21 angeordnet ist. Die erste Reaktionszone enthält getrocknetes Antikörper-Reagens an der ersten Reagens-Stelle 28, die in typischer Weise an einer der in Fig. 8 dargestellten Seitenwände 18a und b oder an der Innenwand des Reaktionsgefäßes 16 von Fig. 8 angebracht ist. Die entsprechende Drehung der Vorrichtung bringt die Reaktionsflüssigkeit in Kontakt mit dem getrockneten Antikörper-Reagens bei Stelle 28, um dessen Auflösung zu erleichtern. Wird das Antikörper-Reagens in der Reaktionsflüssigkeit, die die Urin-Testprobe aufweist, angemessen aufgelöst, wird die Vorrichtung 10 45º nach rechts gedreht, um die Flüssigkeit eine Sichtöffnung 42 bedecken zu lassen, wo spektrofotometrische Ablesungen aufgenommen und die Änderung der Trübung als Funktion der Zeit ermittelt werden. Durch Vergleich dieser Ablesungen mit Kurven, die mit Urinproben erstellt sind, die bekannte Mengen von Protein enthalten, wird die Protein- Konzentration in der Testprobe ermittelt und bestimmt.
Das System ist nun fertig für die zweite Stufe des Analyseverfahrens, die die Bestimmung der Kreatinin-Konzentration darstellt. Eine Mischung aus einem geeigneten Kreatinin-Reagens wie DNBA und einem entsprechenden Additiv und einem wasserlöslichen Polymer wie einem nicht-reaktiven Proetin, Polyethylenglycol, Polyether oder Polyvinylalkohol zur Bereitstellung der gleichen Funktion wie der des Zucker-Additivs wird auf der zweiten Reagens- Stelle 32a getrocknet, die in der zweiten Reaktionszone 34 angeordnet ist. Eine Mischung aus alkalischem Reagens und Additiv, zusammen mit einem wasserlöslichen Polymer, wird auf der dritten Reagens-Stelle 32b getrocknet, die sich auf der der Reagens-Stelle 32a gegenüberliegenden Gefässwand befindet, so dass sie physikalisch getrennt voneinander vorliegen. Ein flüssiges Puffer-Reagens, das in typischer Weise Polyethylenglycol zur Steigerung der Agglutination, Tris, EDTA und Natriumazid als Konservierungsmittel, Kaliuimchlorid als Stabilisiermittel für den Antikörper und zur Verhinderung der Bildung unerwünschter Reaktionsprodukte und ein nicht- reaktives Protein wie Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Ovalbumin und Kasein zur Verhinderung nicht-spezifischer Absorption von Proteinen am Reaktionsgefäss bei einem pH-Wert von 7 bis 9 umfasst, wird in das Gefäss zusammen mit der Urinprobe eingebracht, die das zu analysierende Protein und Kreatinin enthält.
Nach Beendigung des Protein-Assay wird das Gefäss um weitere 135º nach rechts gedreht, um es aus seiner Ausgangsposition zu bewegen und die Puffer-Lösung in Kontakt mit dem getrockneten Kreatinin-Nachweisreagens bei Reagens-Stelle 32a und dem alkalischen Reagens bei Stelle 32b zu bringen, wodurch deren Solubilisierung herbeigeführt wird, wie in Fig. 7 dargestellt. Dies führt zu einer Erhöhung des pH-Wertes der Puffer-Lösung auf das Niveau von 11,5 bis 12,5, das für die Kreatinin-Bestimmungsreaktion notwendig ist. In unerwarteter Weise lässt sich die Kreatinin-Konzentration spektrofotometrisch kurz nach dieser Solubilisierungsstufe, d. h. in 1 s oder mehr, in typischer Weise in einer Zeit, die erforderlich ist, um die Probe zu vermischen und die Messung zu starten (ca. 5 s), bestimmen, und zwar auf Grund der Erkenntnis, dass die durch die Protein/Antikörper- Agglutination verursachte Trübheit der Puffer-Lösung rasch geklärt wird, wenn die Lösung in Kontakt mit dem Kreatinin-Bestimmungsagens und dem starken Alkali gelangt. Dies beschleunigt das Assaysystem deutlich, da die trübe Puffer-Lösung normalerweise Tage brauchen würde, um für eine erfolgreich auszuführende kolorimetrische Kreatinin-Analyse hinreichend klar zu werden. In typischer Weise würde eine Bedienungsperson in einem geschäftigen klinischen Labor nicht mehr als ca. 30 und vorzugsweise nicht mehr als 5 oder gar nur 1 min lang nach der Beendigung des Protein-Assay vor dem Beginn des Assay für Kreatinin warten. Gegebenenfalls kann der Kreatinin-Assay unmittelbar nach Durchführung der spektrofotometrischen Messung des Proteins vorgenommen werden. Nach Auflösung des Kreatinin-Nachweisreagens und des alkalischen Reagens wird die Vorrichtung in die in Fig. 6 dargestellte Position zurückgedreht, wo spektrofotometrische Ablesungen durch eine Sichtöffnung 42 eine Zeit lang aufgenommen werden, um die Farbbildung als Funktion der Zeit zu erhalten, die mit Kreatinin-Bestimmungen verglichen werden können, die an einer Probe mit bekannten Konzentrationen von Kreatinin durchgeführt worden sind, um die unbekannten Kreatinin-Konzentrationen sicher zu bestimmen.
Betreffend Konfiguration B, wird eine Mischung aus Antikörper und Additiv auf der ersten Reagens-Stelle 28 getrocknet, und die Mischung aus Alkali-Reagens und Additiv wird auf der zweiten Reagens-Stelle von entweder 32a oder b getrocknet. Das flüssige Puffermittel, umfassend das Kreatinin- Reagens, Polyethylenglycol, Tris, EDTA, Natriumazid, Kaliumchlorid und ein nicht-reaktives Protein bei einem pH-Wert von 7 bis 9, wird in das Reaktionsgefäss zusammen mit einer Urinprobe eingebracht, die das Protein und Kreatinin enthält. Die Puffer-Lösung solubilisiert das Antikörper-Reagens wie vorher und die Protein-Konzentration wird spektrofotometrisch durch die Sichtöffnung 42 bestimmt. Nach Bestimmung der Protein-Konzentration wird die Puffer-Lösung in Kontakt mit dem getrockneten alkalischen Reagens an der zweiten Reagens-Stelle gebracht, um dadurch das Alkali zu solubilisieren und den pH-Wert auf das Niveau anzuheben, das zur Durchführung des Kreatinin-Assay notwendig ist. Jede der beiden Konfigurationen kann im Zusammenwirken mit dem vorher beschriebenen Reaktionsgefäss angewandt werden, um äquivalente Ergebnisse zu erzielen.
In einer besonderen Ausführungsform wurde Ziege-Antiserum gegen HSA als das Antikörper-Reagens eingesetzt, wobei es auf der ersten Reagens- Stelle getrocknet wurde. Dieses Material ist im Handel erhältlich und kann ohne weitere Behandlung verwendet werden. Vorzugsweise wird das Antiserum 2-fach eingeengt und mit einer Sucrose/Trehalose-Mischung einer Gehaltsmenge von 2 bis 5% als Stabilisiermittel zusammengebracht. Eine 15 uL Probe des Reagens wird auf der Reaktionsstelle in einem bei 60ºC gehaltenen Trockner-Tunnel mit einer Trocknungszeit von 15 min getrocknet.
Das alkalische Reagens für Kreatinin umfasst entweder eine Alkalihydroxid-Lösung (z. B. 2,5 M KOH) oder eine Mischung aus alkalischen Puffermaterialien wie aus Phosphat-, Borat- oder Guanidin-Derivaten, um den sauberen pH-Wert einzuhalten, und aus dem Alkalihydroxid. In typischer Weise werden 15 uL einer Mischung aus 1 M Phosphat und 4 M Kaliumhydroxid, zusammen mit der Sucrose/Trehalose-Mischung, auf der zweiten Reagens-Stelle in einem bei 60ºC gehaltenen Trockner-Tunnel mit einer Trocknungszeit von 15 min getrocknet.
Das bevorzugte Kreatinin-Reagens DNBA wird in typischer Weise auf die zweite Reagens-Stelle aus seiner 1,4 M wässrigen Lösung aufgebracht, die 10% von entweder dem Zucker- oder dem Polymer-Additiv enthält, wobei eine 15 uL Probe der Lösung eingesetzt und wie vorher getrocknet wird.
Zur Durchführung wurden, unter Anwendung von Konfiguration A, eine 0,57 mL Probe der Puffer-Lösung (4% Polyethylenglycol, 25 mM Tris, 5 mM ED- TA, 0,1% Natriumazid und 0,1% Gelatine als das nicht-reaktive Protein; pH = 8,5) und 30 uL Probe (HSA plus Kreatinin in Urin) in die Kartusche eingebracht, um die Reaktion zu initiieren. Nach Messung der Leerprobe wurde das Antikörper-Reagens aufgelöst, und es wurde die Absorption bei 531 nm 120 s lang gemessen. Die Anstiegsrate der Absorption wurde herangezogen, um die HSA-Konzentration zu ermitteln und zu bestimmen. Das alkalische Reagens und das DNBA-Reagens wurden dann aufgelöst und die Kreatinin-Konzentration durch die Rate des Anstiegs der Absorption ermittelt und bestimmt. Es wurde ermöglicht, diese Stufe in einer so kurzen Zeit wie von 1 und gewöhnlich von 1 bis 5 s der HSA-Bestimmung durchzuführen, da sich die Lösung nach der Auflösung der Kreatinin-Reagenzien rasch klärte.
Eine Analyse, unter Anwendung von Konfiguration B, wurde durchgeführt, und es wurden 0,57 mL einer Lösung von DNBA in Puffer (4% Polyethylenglycol, 25 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid, 100 mM KCl und 10 mg/mL DNBA; pH = 8,5) und 30 uL HSA und Kreatinin in Urin in die Kartusche eingebracht, um die Reaktion zu initiieren. Nach Messung der Leerprobe wurden das Antikörper-Reagens gelöst und die Absorption bei 531 nm 1 bis 2 min lang gemessen. Die HSA-Konzentration wurde als Funktion der Rate des Absorptionsanstiegs ermittelt und bestimmt. Das Alkali-Reagens wurde dann aufgelöst, und es wurde die Absorption bei 531 nm 3 min lang erneut gemessen, wobei die Kreatinin-Konzentration aus der Rate des Absorptionsanstiegs ermittelt und bestimmt wird.
In Fig. 9 sind das Reaktionsablauf-Profil von Proben, enthaltend unterschiedliche Konzentrationen von HSA und 148 mg/dL Kreatinin, dargestellt, gemessen mit dem vorliegenden Verfahren. Aus Fig. 9 ist bestimmbar, dass die Konzentration von HSA in einer Urinprobe in einem Bereich von 5 bis 500 mg/L und anschließend das Kreatinin (148 mg/dL) in der Probe genau messbar sind.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Protein und Kreatinin in wässriger Lösung in einem Einzelreaktionsgefäß (10), welches die Stufen umfasst, in denen man:

a) ein Reaktionsgefäß (10) bereitstellt, das eine im wesentlichen horizontale Drehachse und einen Analysereagens-Kanal (23) aufweist, der eine erste (24) und eine zweite (34) Reaktionszone enthält, wobei die genannte erste Reaktionszone (24) mit einem für das Protein (28) spezifischen trockenen Immunoreagens und die genannte zweite Reaktionszone (34) mit einem trockenen basischen Reagens (32b) beaufschlagt sind, das dazu befähigt ist, den pH-Wert einer Reaktionsflüssigkeit, die in den Reaktionskanal (23) eingebracht wird, auf ein zur Bestimmung von Kreatinin geeignetes Niveau anzuheben,

b) eine Probe einer wässrigen Flüssigkeit, die unter dem Verdacht steht, Protein und Kreatinin zu enthalten, und eine Reaktionsflüssigkeit (21), die auf einen pH-Wert gepuffert ist, der sich zur Bestimmung der Protein- Konzentration durch immunoturbimetrische Mittel eignet, in das Reaktionsgefäß (10) einbringt und das Ganze in Kontakt mit dem getrockneten Immunoreagens (28) bringt, um dadurch das Immunoreagens aufzulösen und einen Anstieg der Trübung der Reaktionsflüssigkeit durch Wechselwirkung des Immunoreagens mit dem Protein zu verursachen,

c) die Konzentration des Proteins auf Basis der Änderung der Trübung als Funktion der Zeit bestimmt,

d) die Reaktionsflüssigkeit (21) und ein Reagens zur Bestimmung von Kreatinin (32a) in Kontakt mit dem trockenen basischen Reagens (32b) in der zweiten Reaktionszone (34) bringt, um dadurch das basische Reagens aufzulösen und den pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit auf das Niveau anzuheben, das zur kolorimetrischen Bestimmung von Kreatinin notwendig ist, und man

e) die Konzentration von Kreatinin in der flüssigen Probe durch spektrofotometrische Mittel bestimmt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der pH-Wert auf ein Niveau von 7 bis 9 vor Durchführung des Immunoassay eingestellt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der pH-Wert auf ein Niveau von 11,5 bis 12,5 vor Durchführung des Kreatinin-Assay eingestellt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Reagens zur kolorimetrischen Bestimmung von Kreatinin Pikrinsäure oder 3,5-Dinitrobenzoesäure ist.

5. Verfahren gemäß Ansprüch 1, worin das wässrige Lösungsmittel Urin ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Urinassay vom Agglutinationstyp ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Protein-Konzentration zuerst bei einem geeigneten pH-Wert bestimmt und dann der pH-Wert auf ein Niveau angehoben werden, das sich zur Bestimmung von Kreatinin eignet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Bestimmung von Kreatinin innerhalb von ca. 30 min der Zeit bis zur Anhebung des pH-Wertes initiiert wird.