DE3786173T2 - Menschlicher monoklonaler antikörper und arzneimittel zur prophylaxe und behandlung von infektiösen krankheiten. - Google Patents
Menschlicher monoklonaler antikörper und arzneimittel zur prophylaxe und behandlung von infektiösen krankheiten.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft Zellen, die menschliche monoklonale Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa produzieren, wobei je der davon ein einzelner monoklonaler Antikörper ist, aber Affinität zeigt gegenüber den O-Antigenen von mehreren Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen, und die genannten Antikörper und prophylaktischen und therapeutischen Mittel gegen infektiöse Pseudomonas aeruginosa-Krankeiten, die denselben sowie Präparationen davon als wirksamen Bestandteil enthalten.
- Pseudomonas aeruginosa ist in der Natur weit verbreitet und kann gefunden werden in der Kanalisation und außerdem in den Mundhöhlen oder Eingeweiden von Mensch und Tieren in großer Zahl. Dieses Bakterium zeigt seine Pathogenität bei Patienten mit allgemeinen Infektionskrankheiten, die verursacht worden sind durch die Virulenz diese Bakteriums per se, jedoch häufiger bei Patienten mit einer verringerten Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion, nämlich bei einem Krebspatienten, einem Patienten während einer immunsuppressiven Therapie, einem Transplantatempfänger, einem Patienten mit einer Verbrennung, einem Neugeborenen und dergleichen.
- Infektiöse Pseudomonas aeruginosa-Krankheiten sind Infektionskrankheiten, die derzeit als die am schwierigsten zu behandelnden gelten. Das heißt, Pseudomonas aeruginosa zeigt nicht nur Resistenz gegenüber fast allen Antibiotika, die bisher üblicherweise verwendet worden sind, sondern neigt auch dazu, schnell eine Resistenz gegenüber den Antibiotika zu entwickeln, die in den letzten Jahren entwickelt worden sind. Unter Berücksichtigung der Grenze einer antibiotischen Therapie sind darum eine Prophylaxe und Therapie erforscht worden, die die Verstärkung einer Fähigkeit zum Ziel haben, die zu einer Behandlung von Pseudomonas aeruginosa in einem Wirt in der Lage ist. Die Forschung über die Entwicklung eines Impfstoffes ist eine Sache; jedoch ist es schwierig, eine sofortige Wirkung bei einem Patienten zu erwarten, der schon infiziert worden ist. Andererseits wurden in den letzten Jahren zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten bereits häufig Präparationen verwendet, die menschliches Immunglobulin, welches aus Seren oder Plasma von gesunden Spendern gereinigt worden ist, und sein chemisch modifiziertes Produkt enthalten. Bei den in diesen Präparationen enthaltenen Antikörpern ist jedoch die Menge eines Antikörpers mit Affinität gegenüber Pseudomonas aeruginosa, der für die Behandlung wirksam ist, nicht konstant, und seine Menge ist klein, so daß viele Forscher an der prophylaktischen und therapeutischen Wirkung dieser Präparationen Zweifel haben. Aus diesem Grund ist die Entwicklung menschlicher monoklonaler Antikörper, die in kleiner Dosis wirksam sind, bereits dringend gewünscht worden.
- Andererseits ist bekannt, daß als Oberflächenantigene von Pseudomonas aeruginosa ein äußeres Membranprotein (OMP), ein Polysaccharidantigen, welches sich ableitet von Flagellum oder Schleim, und ein Lipopolysaccharid- (im folgenden einfach als LPS bezeichnet) Antigen vorhanden sind. Unter ihnen besteht das LPS aus O-Polysaccharid (im folgenden manchmal als O-Antigen bezeichnet), welches ein spezifisches Serotyp-Epitop ist, und aus Lipid A sowie einer Kernregion, die eine Grundstruktur darstellen, die dem gramnegativen Bakterien gemeinsam ist. Die O-spezifische Polysaccharidkette besteht aus sich wiederholenden Einheiten von Oligosacchariden. Die serologische Klassifizierung von Pseudomonas aeruginosa wird vorgenommen aufgrund der immunologischen Eigenschaft dieser O-spezifischen Polysaccharidkette. Es wird jedoch sogar jetzt noch viel über die serologische Klassifizierung von Pseudomonas aeruginosa gestritten. In Japan wurde bereits die serologische Klassifizierung von Serotyping committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society, gemäß der Pseudomonas aeruginosa in 13 Arten von Gruppe A bis Gruppe M eingeteilt worden ist, verwendet [Homma, Japan J. Exp. Med., 46, 329- 336 (1976)]. Die serologische Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society wird, wie unten beschrieben, mit weiteren Klassifizierungen verglichen. Vergleich der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society mit anderen Klassifizierungen Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society Homma Lanyi Fisher
- In den letzten Jahren wurde die Primärstruktur der O-spezifischen Polysaccharidkette in der richtigen Reihenfolge aufgeklärt [beispielsweise, Kropinski et al., Antibiot. Chemother. 36, S. 58-73 (1985)], und es gibt die Möglichkeit, daß künftig eine neue Klassifizierung herangezogen wird. Bekanntlich besitzt ein Antikörper gegen die O-spezifische Polysaccharidkette von LPS von Pseudomonas aeruginosa, nämlich ein Antikörper gegen das Pseudomonas aeruginosa O-Antigen, eine starke bakteriolytische oder opsonische Aktivität auf dem Wege des Komplementsystems. Während danach gestrebt wurde, menschliche monoklonale Antikörper zu erhalten, die wirksam sind zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa- Infektionskrankheiten, wurde gezeigt, daß menschliche monoklonale Antikörper gegen Serotyp-Antigene von Pseudomonas aeruginosa, nämlich monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, Serotyp-spezifisch mit Pseudomonas aeruginosa zu reagieren, eine sehr starke schützende Aktivität gegen eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion desselben Serotyps besitzen; siehe JP-A- 248 626/1985. Wie jedoch beschrieben in der JP-A-152 280/1986 und der JP-A-155 398/1986, die nacheinander veröffentlicht worden sind und den Schutz der menschlichen monoklonalen Antikörper vor einer Infektion mit den O-spezifischen Polysaccharidketten von LPS von Pseudomonas aeruginosa betreffen, reagieren serotyp-spezifische menschliche monoklonale Antikörper, die mit Pseudomonas aeruginosa reagieren, nur spezifisch mit Pseudomonas aeruginosa eines einzigen Serotyps und besitzen eine schützende Wirkung gegen eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion desselben Serotyps, haben jedoch keine schützende Wirkung gegen eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion mit anderen Serotypen.
- Andererseits sind monoklonale Antikörper gegen das äußere Membranprotein von Pseudomonas aeruginosa [Sawada et al., J. Infect. Dis., 150, 570 - 576 (1985), Yoshiaki NAKAMURA et al., Jpn. J. Bacteriol., 39, 337 (1984)] oder menschliche monoklonale Antikörper gegen gewöhnliche Polysaccharide von Pseudomonas aeruginosa [Sawada et al., J. Infect. Dis., 150, 1290-1299 (1985)] alle hinsichtlich ihrer schützenden Wirkung gegen eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion gering.
- In Antibiot. Chemother. 36, Seiten 134-146 (1985) berichten Sadoff et al. über "Characterization of Mouse Monoklonal Antibiodies Directed against Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharides". Monoklonale Maus-Antikörper, die mit der O-Seitenkette spezifisch, mit der O-Seitenkette kreuzreaktiv reagieren und die Determinaten für das P. aeruginosa Lipopolysaccharid herausschneiden, wurden isoliert. Die monoklonalen Antikörper, die auf die O-Seitenkettendeterminanten gerichtet sind, sind im allgemeinen opsonophagozytisch mit menschlichen Neutrophilen und menschlichen Komplementen. Sie schützen außerdem Mäuse vor einer intraperitoenalen und intravenösen Provokation und schützen in dem Modell mit einer verbrannten Ratte vor einer Infektion. Genauer gesagt wird Bezug genommen auf den monoklonalen Maus-Antikörper 19.22.1, der mit den Fisher-Serotypen 3, 7, 6, 5 und 2 (entsprechend den Gruppen B, C, H und E gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society) reagiert, und den monoklonalen Maus-Antikörper 2.67.9.8, der mit den Fisher-Serotypen 3, 5 und 2 (entsprechend den Gruppen B, H und E) reagiert.
- Des weiteren beschreibt die EP-256 713-A2 menschliche Lymphoblastoid-Zellinien und Hybridzellen, die Antikörper sezernieren, die mit dem Lipopolysaccharid spezifisch reaktiv sind, welches auf der Oberfläche von Pseudomonas aeruginosa vorhanden ist. Die einzelnen monoklonalen Antikörper sind immunspezifisch für einen oder mehreren der Fisher-Immuntypen von P. aeruginosa. Die monoklonalen Anti-Pseudomonas- Antikörper werden einzeln oder in Kombination verwendet, um P. aeruginosa-Infektionen therapeutisch oder prophylaktisch zu behandeln. Es werden einer oder mehrere der monoklonalen Antikörper zusammen mit einem oder mehreren Antibiotika verabreicht, um Individuen therapeutisch oder prophylaktisch zu behandeln, die hinsichtlich der Immunität Einschränkungen und eine verringerte Immunität aufweisen. Genauer gesagt wird der menschliche monoklonale Anti-Pseudomonas aeruginosa-Antikörper Mab-9H10 beschrieben, der erhalten wurde aus der virustransformierten EB-Zellinie CF-9H10. Er reagiert nur mit dem Lipopolysaccharid der Ps. aeruginosa-Fisher-Immuntypen 3, 6 und 7; das bedeutet, daß er mit den Gruppen B und C der Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Ps. aeruginosa Society reagiert. Die Zellinie CF-9H10 wurde mit Unsterblichkeitszellen (KR4) verschmolzen, und die aktivsten Hybridzellen, welche den mit den Ps. aeruginosa-Fisher- Immuntypen 3, 6 und 7 reaktiven MAb sezernieren, wurden als CK-1G11-18 bezeichnet.
- Wie oben beschrieben, besitzen die menschlichen monoklonalen Antikörper für das O-Antigen von Pseudomonas aeruginosa eine sehr hohe Aktivität als schützende Antikörper, im Vergleich zu menschlichen monoklonalen Antikörpern für andere Pseudomonas aeruginosa-Antigene. Sie sind jedoch nur für eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion des entsprechenden Serotyps wirksam. Gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society wird das O-Antigen in 13 Gruppen eingeteilt. Der klinisch isolierte Serotyp von Pseudomonas aeruginosa schließt all diese Serotyp- Bakterien ein, obwohl es einen Unterschied in der Häufigkeit gibt. Darum ist es erforderlich, um im allgemeinen menschliche monoklonale Antikörper für das O-Antigen als prophylaktisches und therapeutisches Mittel gegen Pseudomonas aeruginosa- Infektionskrankheiten zu verwenden, eine Präparation herzustellen, indem möglichst verschiedene Arten von Antikörpern kombiniert werden. Da jedoch die Zahl der in der Kombination zu verwendenden monoklonalen Antikörper in Kombination zunimmt, nimmt die Kompliziertheit in der Qualitätskontrolle der Präparation zu. Um eine solche Kompliziertheit zu verringern, ist es wünschenswert, menschliche monoklonale Antikörper für die O-Antigene zu erhalten, die eine Kreuzreaktivität mit Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl verschiedener Serotypen zeigen und eine wirksame schützende Aktivität gegen Infektionskrankheiten aufweisen, die von Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von verschiedenen Serotypen verursacht worden sind. Jedoch gibt es in der Literatur keinen Vorschlag dafür und keinen erfolgreichen Bericht darüber, während es ferner ein wichtiger Gesichtspunkt ist, eine Zellinie herzustellen, die in der Lage ist, die zuvor genannten menschlichen monoklonalen Antikörper, die dem Menschen sicher injiziert werden können, in großer Zahl stabil zu produzieren. Somit betrifft die Aufgabe der Erfindung diese Probleme.
- Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Patentansprüche gelöst.
- Somit wird beabsichtigt, eine Zellinie zu erhalten, die in der Lage ist, einen einzigen menschlichen monoklonalen Antikörper zu sezernieren, der eine hohe schützende Aktivität aufweist und in der Lage ist, Pseudomonas aeruginosa zu erkennen, die eine Vielzahl von Serotypen gemeinsam haben. Es wird eine selbstreproduzierende Zellinie erhalten, die in der Lage ist, kontinuierlich einen menschlichen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, mit einer Vielzahl von verschiedenen O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa gemeinsam zu reagieren, nämlich einem menschlichen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, mehrfach mit O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa zu reagieren und eine Prophylaxe und Therapie für Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier zu erreichen, indem der menschliche monoklonale Antikörper, der von dieser Zellinie produziert wird, einzeln oder in Kombination als prophylaktisches und therapeutisches Mittel gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten verwendet wird. Die menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen (B-Zellen) werden mit dem Epstein-Barr-Virus (im folgenden einfach als EB-Virus bezeichnet) infiziert, um eine Transformation (im folgenden als EB-Virus-Transformation bezeichnet) zu bewirken. Alternativ werden die menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen mit Zellen verschmolzen, die sich vom Menschen oder Tier ableiten und zu einem uneingeschränkten Wachstum in der Lage sind, beispielsweise mit Tumorzellen, um Kolonien zu erhalten, die zu einem uneingeschränkten Wachstum in der Lage sind. Aus den Kolonien wird eine Zellinie ausgewählt, die in der Lage ist, einen einzigen menschlichen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der eine Reaktivität gegenüber einer Vielzahl von Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen aufweist, indem ein Screening durchgeführt wird unter Anwendung eines enzymatischen Immuntests und eines Klonierungsverfahrens. Als nächstes wird diese Zelle gezüchtet, und ein einziger menschlicher monoklonaler Antikörper, der eine Reaktivität mit Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen aufweist, wird aus der Kulturlösung auf herkömmliche Weise isoliert, beispielsweise durch Säulenchromatographie, Elektrophorese, Ausfällen, Extrahieren etc. Der gereinigte menschliche monoklonale Antikörper kann einzeln oder nach Zugabe eines optionalen Zusatzstoffes dazu als Flüssigpräparationen oder lyophilisierte Präparationen zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten bereitgestellt werden.
- Die Zeichnungen in Fig. 1 bis 7 zeigen die Ergebnisse, die erhalten wurden durch Prüfen der Kreuzreaktivität der menschlichen monoklonalen Antikörper mit den O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa durch Hemmtests mit LPSs einer Vielzahl von Serotyp-Pseudomonas aeruginosa im Hinblick auf das Binden eines menschlichen monoklonalen Antikörpers an LPS. Fig. 1 zeigt LPSs von Pseudomonas aeruginosa der Gruppen D und I, die das Binden von HPs1 hemmen. Fig. 2 zeigt LPSs der Gruppen E und F von Pseudomonas aeruginosa, die das Binden von HPs2 hemmen. Fig. 3 zeigt LPSs der Gruppen A und L von Pseudomonas aeruginosa, die das Binden von HPs4 hemmen. Fig. 4 zeigt LPSs der Gruppen G und H von Pseudomonas aeruginosa, die das Binden von HPs5 hemmen. Fig. 5 zeigt LPSs der Gruppen E und F von Pseudomonas aeruginosa, die das Binden von HPs6 hemmen. Fig. 6 zeigt LPSs der Gruppen A und F von Pseudomonas aeruginosa, die das Binden von HPs7 hemmen. Fig. 7 zeigt LPSs der Gruppen E und F von Pseudomonas aeruginosa, die das Binden von HPs8 hemmen.
- Zweckmäßigkeitshalber gehorcht bei der vorliegenden Erfindung die Klassifizierung der verwendeten Pseudomonas aeruginosa der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan aeruginosa Society. Stämme, die zu den Gruppen A bis M gehören, die in Tabelle 1 gezeigt sind, werden verwendet.
- Die meisten Stämme, die zu den Gruppen A bis M gehören, können erhalten werden von American Type Culture Collection (ATCC) und University of Tokyo, Institute of Medical Science
- Die menschlichen monoklonalen Antikörper, die in der Lage sind, mehrfach mit O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa zu reagieren, nämlich die menschlichen monoklonalen Antikörper für die O-spezifische Polysaccharidkette von LPS von Pseudomonas aeruginosa können erfindungsgemäß hergestellt werden gemäß dem EB-Virus-Transformationsverfahren, dem Zellverschmelzungsverfahren etc.
- Die erfindungsgemäße Herstellung der menschlichen monoklonalen Antikörper gemäß dem EB-Virus-Transformationsverfahren kann durchgeführt werden durch (1) Herstellen von menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen (menschlichen B-Zellen), (2) Infizieren von menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen mit dem EB-Virus, um die Transformation zu bewirken, (3) Detektieren der Sekretion von Antikörpern, die in der Lage sind, mit mehreren Pseudomonas aeruginosa unterschiedlicher Serotypen zu reagieren, (4). Auswählen einer einzigen Zellinie aus der transformierten Zellkolonie (dieser Vorgang wird manchmal einfach im folgenden als Klonieren bezeichnet), (5) Züchten der Zellinie und (6) Reinigen des menschlichen monoklonalen Antikörpers aus der Kultur.
- Als nächstes wird jede Stufe ausführlich beschrieben.
- Menschliche Antikörper-produzierende Zellen (B-Zellen), die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, können durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden aus peripherem Blut, einem Lymphknoten, einer Mandel oder der Milz, welche gesammelt worden sind von gesunden Spendern, die in der Lage waren, Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa zu produzieren oder von Patienten, die in der Vergangenheit eine Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheit aufwiesen oder aus dem Blut der Nabelschnur bei einer Entbindung etc . . Die Isolierung und Konzentration menschlicher Antikörperproduzierender Zellen (B-Zellen), die erhalten werden beispielsweise aus Blut, Geweben, die oben beschrieben worden sind, etc., können wirksam durchgeführt werden durch Kombinieren des Verfahrens der Dichtegradienten- Zentrifugation, wobei Zelltrennungsmedien verwendet werden, beispielsweise Ficoll-Conray, etc., und des Rosettenbildungsverfahrens, des Schwenkverfahrens, etc.
- Die Transformation der menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen (B-Zellen) mit dem EB-Virus kann durchgeführt werden in einer Weise, die den bekannten Verfahren ähnlich ist [beispielsweise, Nature, 269, 420- 422 (1977)]
- B95-8 Zellen (Zellen, die von dem Leukozyten eines Krallenaffen stammen und in der Lage sind, den infektiösen EB-Virus zu produzieren) werden kultiviert in 20% fetales Kalbserum-haltigem (im folgenden hauptsächlich als FCS bezeichnet) RPMI 1640-Medium (im folgenden manchmal hauptsächlich als Kulturlösung bezeichnet) kultiviert. Der Kulturüberstand wird nahe an der stationären Phase am 7. Tag zentrifugiert, um eine virale Lösung zu erhalten [Proc. Jap. Soc. Immunol., 4, 399-401 (1974)]. Als nächstes werden die menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen (B- Zellen), die in (1) erhalten worden sind, zentrifugiert, und der Überstand wird durch Absaugen entfernt. Die virale Lösung wird zu den so erhaltenen Pellets gegeben, um sie zu dispergieren, worauf sich eine einstündige Inkubation bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Nach dem Entfernen des Überstandes durch Absaugen wird die Kulturlösung zu den Pellets in einer Zelldichte von 1·10&sup5; bis 5·10&sup5;/ml gegeben, um die Zellen zu dispergieren. Die Zelldispersion wird getrennt in jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen oder einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, worauf sich eine Inkubation bei 37ºC für 2 bis 4 Wochen in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Während des Verlauf der Inkubation ist es wünschenswert, eine Hälfte der Kulturlösung durch eine frische Kulturlösung aufzufüllen.
- Die Detektion von Antikörpern, die eine Reaktivität mit mehreren Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen aufweisen, kann durchgeführt werden durch einen einfachen Radioimmuntest, Enzymimmuntest etc. [Buch mit dem Titel "Monoklonal Antibody", Seite 144, veröffentlicht von Kodansha Publishing Co., Ltd. (1983) und anderen]. Erfindungsgemäß wird der Enzymtest angewendet. Das heißt, es wird ein einfaches Verfahren angewendet, der Tüpfelimmunbindungstest [im folgenden einfach als DIBA bezeichnet, Anal. Biochem., 119, 142-147 (1982)], welcher umfaßt zuvor das Fixieren von 0,3% formalinisierter Bakterienzellen oder von LPS verschiedener Pseudomonas aeruginosa mit verschiedenen Serotypen auf Membranfilter, Umsetzen des Zellkulturüberstandes in einem Behälter für eine bestimmte Zeitdauer, dann das Umsetzen mit einem enzymkonjugierten Anti-Human- Kaninchen-Antikörper und Bestimmen des Vorliegens oder Fehlens einer Produktion und ihrer produzierten Antikörpermenge durch den Grad einer Farbbildung des Substrats durch eine enzymatische Reaktion. Wenn nötig kann der Immunglobulintyp bestimmt werden, indem ein Enzym-konjugierter Anti-Human-Antikörper verwendet wird, der spezifisch ist für den menschlichen Immunglobulintyp.
- Eine Vertiefung, in der der betreffende Antikörper vorliegt, wird ausgewählt, indem der Kulturüberstand einer jeden Vertiefung getestet wird, in der Zellwachstumskolonien beobachtet worden sind. Es wird mit einem enzymverknüpften Immunsorptionstest (im folgenden einfach als ELISA-Verfahren bezeichnet) etc., wie oben beschrieben, getestet. Dann werden die Zellen in dieser Vertiefung einer Klonierung mit dem weichen Agar- Verfahren [Buch mit dem Titel "Advanced Tissue Cultures", Seite 289, veröffentlicht von Soft Science Publishing Co. (1985) und anderen] oder gemäß dem Grenzverdünnungsverfahren [Buch mit dem Titel "Monoklonal Antibody", Seite 73, veröffentlicht von Kodansha Publishing Co., Ltd. (1983) und andere] einer Klonierung unterworfen. Weiterhin wird, nachdem ein Wachstum der Zellen durch das Klonieren beobachtet worden ist, wiederum der oben beschriebene Test gemäß ELISA durchgeführt. Durch Klonieren ein bis mehrere Male kann eine monoklonale Zellinie erhalten werden, die in der Lage ist, den betreffenden Antikörper allein zu sezernieren.
- Die gemäß dem Verfahren von (4) erhaltene Zellinie kann unter Verwendung eines herkömmlichen Mediums gezüchtet werden. Beispielsweise können die oben beschriebene Kulturlösung, ein herkömmliches Medium mit geringem Serumgehalt oder ein serumfreies Medium geeigneterweise verwendet werden.
- Die erfindungsgemäße Reinigung der menschlichen monoklonalen Antikörper aus der Kulturlösung kann durchgeführt werden mit herkömmlichen Verfahren in Kombination beispielsweise mit nichtspezifischen Reinigungsverfahren, wie dem Ammonsulfatfällungsverfahren, dem Gelfiltrationsverfahren, dem Ionenaustauschharz- Chromatographieverfahren etc., dem Affinitätschromatographieverfahren, welches einen Trägerstoff verwendet, der daran befestigt ein Antigen oder eine Substanz (beispielsweise Protein A, einen Anti-Human-Immunglobulin-Antikörper etc.) aufweist, die gegenüber menschlichen monoklonalen Antikörpern eine Affinität zeigen, oder dergleichen.
- Die Herstellung der erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper gemäß dem Zellverschmelzungsverfahren kann durchgeführt werden in einer Weise, die den bekannten Verfahren ähnlich ist [Buch mit dem Titel "MONOKLONAL ANTIBODIES", Seite 363, veröffentlicht von Plenum Press und andere]. Das heißt, die menschlichen monoklonalen Antikörper können hergestellt werden durch (1) Herstellen menschlicher Antikörper-produzierender Zellen (menschlicher B-Zellen etc.), (2) Zellverschmelzung der menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen mit Zellen, die in der Lage sind, uneingeschränkt zu wachsen, (3) Detektieren der Sekretion von Antikörpern, die in der Lage sind, mit einer Vielzahl von Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen zu reagieren, (4) Auswählen einer einzigen Zellinie aus den Hybridzellenkolonien, (5) Züchten der Zellinie und dann (6) Reinigen der menschlichen monoklonalen Antikörper aus der Kultur.
- Als Antikörper-produzierende Zellen, die für die Zellverschmelzung verwendet werden, können Antikörperproduzierende Zellen, die denen ähnlich sind, die bei dem Verfahren der EB-Virus-Transformation verwendet worden sind. Darüber hinaus können auch EB-Virustransformierte Zellkolonien verwendet werden, die erhalten worden sind gemäß dem EB-Virus-Transformationsverfahren, welches oben beschrieben worden ist, und die in der Lage sind, den betreffenden Antikörper vor dem Klonieren zu sezernieren, oder eine einzige EB- Virus-transformierte Zellinie, die durch Klonierung erhalten worden ist, verwendet werden. Weiterhin werden menschliche Antikörper-produzierende Zellen (B-Zellen) in einer Kulturlösung mehrere Tage lang kultiviert, die angereichert ist mit Kermesbeeren-Mitogen (PWM), um die Antikörper-produzierenden Zellen zu vermehren, die auch für die Zellverschmelzung bereitgestellt werden können.
- Bei der Produktion von menschlichen B-Zellen-Hybriden werden vorzugsweise Myelomzellen, die sich vom Menschen ableiten, myelomartige Zellen, Lymphoblastzellen oder lymphoblastartige Zellen verwendet, die in der Lage sind, unbegrenzt zu wachsen und empfindlich gegenüber einer Kulturlösung zu reagieren, die Hypoxanthin, Aminopterin und Tymidin enthält (HAT-Medium) oder gegenüber einer Kulturlösung, die Hypoxanthin und Azaserin (HA-Medium) als Partnerzellen enthält. Maus- Myelomzellen etc., die empfindlich sind gegenüber dem HAT-Medium, können ebenfalls als Partnerzellen verwendet werden.
- Beispielsweise werden die Maus-Myelomzellen P3-NS1/1- Ag4.1 (Abkürzung NS-1) als Partnerzellen in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 bis 1 : 10 mit den Zellen aus einer Vertiefung vermischt, in der die Produktion des betreffenden Antikörpers nach der Transformation mit dem EB-Virus beobachtet worden ist, oder mit Antikörperproduzierenden Zellen, die aus peripherem Blut etc. isoliert worden sind. Ein Medium (RPMI 16.40-Medium, welches 50% Polyethylenglycol und 10% Dimethylsulfoxid oder dergleichen enthält) für die Zellverschmelzung wird zu dem Gemisch gegeben, worauf sich die Verschmelzung der Zellen durch bekannte Verfahren anschließt. Dann werden die Zellen in einer HAT-Ouabain Kulturlösung (Kulturlösung enthält außerdem Ouabain in dem zuvor genannten HAT-Medium, HAT-O- Medium) dispergiert, welche geeignet ist für das Wachstum der verschmolzenen Hybridzellen allein in einer Zelldichte von 1·10&sup5; bis 5·10&sup6;/ml. Die Zelldispersion wird separat auf eine Kulturplatte mit 24 oder 96 Vertiefungen gegeben, worauf sich eine Inkubation bei 37ºC für etwa 2 bis etwa 4 Wochen in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschließt. Während der Inkubation ist es wünschenswert, alle 3 bis 5 Tage eine Hälfte des HAT-O-Mediums durch frisches HAT-O-Medium aufzufüllen. In dem Falle, wenn peritoneale Maus- Exudatzellen etc. als Feeder-Zellen gleichzeitig vorhanden sind, kann das Wachstum der Hybridzellen beschleunigt werden.
- Weiterhin können die Hybridzellen produziert werden durch Vermischen von menschlichen lymphoblastartigen Zellen MHP-315 als Partner, in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 bis 1 : 10, mit einer EB-Virus-transformierten Zellinie, oder Antikörper-produzierenden Zellen, die aus peripherem Blut etc. isoliert worden sind, Durchführen einer Zellverschmelzung wie oben beschrieben und dann Dispergieren der Zellen in einer HA- Ouabain-Kulturlösung (Kulturlösung, die ferner Ouabain in dem zuvor genannten HA-Medium, HA-O-Medium, enthält) und durch Züchten.
- Als Partnerzellen können verwendet werden Zellen, die von der Maus abstammen, X63, P3 U1, X63.653, SP2/0 etc. und Zellen, die vom Mensch abstammen, SKO-007, GM1500 etc.
- In der Vertiefung, in der somit ein klares Wachstum der Hybridzellen beobachtet wurde, werden durch einen Enzymtest in einer Weise, die dem EB-Virus- Transformationsverfahren ähnlich ist, welches oben beschrieben worden ist, Antikörper detektiert, die eine Reaktivität mit einer Vielzahl von Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen zeigen.
- Wie bei dem oben beschriebenen EB-Virus- Transformationsverfahren erläutert wurde, wird die Klonierung wiederholt, um eine einzige Zellinie zu erhalten.
- In einer Weise, ähnlich dem EB-Virus-Transformationsverfahren, welches oben beschrieben worden ist, kann die einzelne Zellinie in einer geeigneten Kulturlösung gezüchtet werden.
- In einer Weise, ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren für die EB-Virus-Transformation, können die erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper aus der Kulturlösung gereinigt werden.
- Die menschlichen monoklonalen Antikörper, die in der Lage sind, mit O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa mehrfach zu reagieren, können als flüssige Präparationen oder lyophilisierte Präparationen einzeln oder als Gemische mit herkömmlich verwendeten Zusätzen oder Hilfsstoffen verwendet werden. Gemäß der derzeitigen Anwendung zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten können die erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper einzeln oder als Gemisch von 2 oder mehreren monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Alternativ können die menschlichen monoklonalen Antikörper ferner verwendet werden als Gemisch mit anderen menschlichen monoklonalen Antikörpern gegen Pseudomonas aeruginosa und/oder menschlichen Globulinpräparationen. Insbesondere im Falle der Herstellung gemischter Präparationen führt die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zu einer Verbreiterung des Schutzspektrums der Antikörper, und darum kann die Zahl der Arten von menschlichen monoklonalen Antikörpern, die gemischt werden müssen, verringert werden.
- Dosis und Weg zur Injektion der erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper können in geeigneter Weise gewählt werden, jedoch wird es bevorzugt, daß die Dosis 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht beträgt, und der Weg für die Injektion intradermal, subkutan, intramuskulär, intravenös etc. sein kann.
- Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele unten ausführlicher beschrieben.
- Unter Befolgen der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society (Gruppe A bis Gruppe M) wurden die für den Antikörpertest verwendeten Bakterienzellen und die LPSs aus den in Tabelle 1 unten gezeigten Stämmen hergestellt. Tabelle 1 serologische Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society Stamm * Unter den Stämmen von Pseudomonas aeruginosa von Gruppe A bis Gruppe M, die in Tabelle 1 angeführt sind, wurden die ATCC-Stämme, in Klammern, und die IID-Stämme aufbewahrt bei American Type Culture Collection bzw. University of Tokyo, Institute of Medical Science und werden einer dritten Person frei übertragen.
- Jeder Pseudomonas aeruginosa-Stamm wurde in Nähragar (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) bei 37ºC über Nacht gezüchtet. Die vermehrten Kolonien wurden gesammelt und in einer physiologischen Salzlösung suspendiert, um eine Zellsuspension herzustellen. 0,5 ml der Zellsuspension wurden in Sakaguti-Kolben überimpft, die mit 150 ml synthetischem Medium von Homma et al. [Tanamoto et al., J. Biochem., 83, 711-718 (1978)] pro Kolben gefüllt waren, worauf sich eine Züchtung unter Schütteln bei 37ºC für 16 Stunden anschloß. Nach dem Inkubieren wurde in den Kolben Formalin bis zu einer Endkonzentration von 0,3% gegeben, und das System wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Schließlich wurden die Zellen durch Zentrifugieren (12 000· g, 30 Minuten) gesammelt. Nach dem Waschen mit physiologischer Salzlösung und dann mit destilliertem Wasser, in dieser Reihenfolge, wurden die Zellen lyophilisiert, um formalinisierte, trockene Zellen zu ergeben. Jedes Serotyp Pseudomonas aeruginosa-LPS wurde erhalten unter Verwendung von 20 g formalinisierten, nassen Zellen als Ausgangsmaterialien vor dem Lyophilisieren und gemäß dem Verfahren der Extraktion mit heißem Phenol gereinigt [Buch mit dem Titel "Meneki Jikken Sosaho" (Method for Immunological Experiments), Seite 2037, herausgegeben von Japanese Society of Immunology (1978)]. Die Ausbeuten (Trockengewicht) an LPSs aus den formalinisierten Zellen des entsprechenden Serotyps von Pseudomonas aeruginosa betrugen 25 bis 75 mg.
- B95-8-Zellen, die den EB-Virus produzierten und freisetzten, wurden in einer Dichte von 3·10&sup5;/ml in RPMI 1640-Medium suspendiert, welches 20% FCS enthielt (im folgenden hier manchmal als Kulturlösung bezeichnet), worauf sich die statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Der Kulturüberstand am 7. Tag, nahe der stationären Phase, wurde durch Zentrifugieren (800· g, 10 Minuten) gesammelt. Nach dem Filtrieren über einen Membranfilter (Millipore) einer Porengröße von 0,45 um wurde das Filtrat als virale EB-Lösung für das Transformationsexperiment verwendet.
- Eine gleiche Menge RPMI 1640-Medium wurde zu 50 ml heparinisiertem, peripherem Blut gegeben, welches einem gesunden Spender abgenommen worden war, um eine zweifache Verdünnung zu erzielen. Dann wurde die Verdünnung auf Ficoll-Pague (Pharmacia) von der halben Menge der Verdünnung aufgelegt, so daß die Grenzschicht nicht beeinträchtigt wurde, worauf sich eine Zentrifugation (400· g , 30 Minuten) bei Raumtemperatur anschloß. Nach dem Zentrifugieren wurde die Grenzschichtphase unter Verwendung einer Pasteur-Pipette abgenommen, und eine gleiche Menge 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium wurde dazugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur zentrifugiert (250· g, 10 Minuten). Die ausgefällten Zellen wurden in 20% FCS-haltigem RPMI 1640-Medium suspendiert. Der Vorgang des Zentrifugierens wurde noch einmal wiederholt, um ein Pellet (Zellanzahl 5·10&sup7;) aus menschlichem Antikörper-produzierenden Zellen (Lymphozyten) zu erhalten.
- Zu 5·10&sup7; menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen, wurden 50 ml der in (2) hergestellten viralen Lösung gegeben, worauf sich die Inkubation bei 37ºC 1 Stunde lang anschloß. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugieren (250 x g, 10 Minuten) gesammelt. Die Zellen wurden in 20% FCS-haltigem RPMI 1640-Medium dispergiert. Nach dem Einstellen der Dichte auf 5·10&sup5;/ml wurde jeweils 0,1 ml Suspension auf eine flachbödige Kulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. 4 Tage danach wurde 0,1 ml 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium zu der Kultur gegeben, und danach wurde die Hälfte der Kulturlösung alle 4 bis 5 Tage durch frische Kulturlösung aufgefüllt. Gemäß dem in (5) gezeigten Antikörperdetektionsverfahren wurden Zellen aus einer Vertiefung, in der eine Reaktivität mit Pseudomonas aeruginosa festgestellt worden war, auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen in größerem Maßstab gezüchtet.
- In der Vertiefung, in der ein Zellwachstum beobachtet worden war, wurde das Vorliegen oder Fehlen menschlicher, monoklonaler Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren bestimmt, welches zur Klasse des enzymverknüpften Immunsorptionstests gehört. Im Falle des Kulturüberstandes auf der flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen wurde 0,1 ml Kulturüberstand aus jeder Vertiefung auf einer U-Boden-Mehrfach-Platte mit 96 Vertiefungen umgesetzt mit einem gitterförmig bedruckten Nitrocellulosemembranfilter (3, 1 mm Seitenlänge), an welchen eine Mischung von formalinisierten, trockenen Zellen von Pseudomonas aeruginosa der 13 Serotypen in einer Konzentration von 0,4 ug/ Punkt gebunden war. Im Falle des Kulturüberstandes in der Kulturplatte mit 24 Vertiefungen, wurde 0,2 ml des Kulturüberstandes aus jeder Vertiefung in einer Kulturplatte mit 48 Vertiefungen umgesetzt mit gitterförmig bedruckten Nitrocellulosemembranfiltern (6,2 mm ·9,3 mm Seitenlänge), an die formalinisierte, trockene Zellen von Pseudomonas aeruginosa von 6 Arten der Gruppe A bis Gruppe F und 7 Arten der Gruppe G bis Gruppe M an verschiedenen Stellen gebunden waren. Nach dem Umsetzen bei Raumtemperatur für 2 Stunden und dann dem Umsetzen mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Human- Kaninchen-Immunglobulin (DAKO) für 2 Stunden bildete sich unter Verwendung von 4-Chlor-1-naphthol als Substrat eine Farbe. Die Antikörperproduktion wurde dort als positiv bewertet, wo die Farbbildung auf dem Antigen-gebundenen Nitrocellulosemembranfilter durch Beobachten mit dem bloßen Auge festgestellt wurde.
- Die Zellen einer Vertiefung, in der eine Reaktivität mit verschiedenen Pseudomonas aeruginosa unterschiedlicher Serotypen gemäß dem Antikörperdetektionsverfahren festgestellt worden war, wurden in eine 6 cm- Schale übergeführt. Die auf der 6 cm-Schale vermehrten Zellen wurden gemäß dem Verfahren mit weichem Agar kloniert. Zunächst wurden die Zellen nach dem genauen Zählen der Zellen mit einem Hemazytometer zu einer Zellsuspension einer Dichte von 1·10&sup6;/ml verarbeitet. 0,1 ml der Zellsuspension wurde zu 30 ml einer Kulturlösung gegeben, die 0,3% Agarose (Sea Plaque agarose, FMC) enthielt, worauf sich das Vermischen anschloß. Als nächstes wurden 3 ml der Kulturlösung, welche die Zellen enthielt, und 0,3% Agarose getrennt in eine 6 cm-Schale gegeben, die verfestigt worden war, indem sie zuvor getrennt mit 4 ml Kulturlösung, die 0,5 % Agarose zum Festwerden (10 Schalen für jeweils Vertiefung) enthielt, beschickt worden war. Die 6 cm- Schale, in die Zellen getrennt hineingegeben worden waren, wurde einer statischen Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid unterzogen. Drei bis fünf Wochen danach wuchsen die Zellen in dem weichen Agar, und es wurden mit bloßem Auge Kolonien erkannt. In diesem Stadium wurde jede Kolonie mit einer Pasteur- Pipette in jede Vertiefung einer flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen, in die getrennt Kulturlösung in einer Konzentration von 0,1 ml/Vertiefung gegeben worden war, übergeführt und darin gezüchtet. Zwei Tage später wurde 0,1 ml Kulturlösung zugegeben, und weitere 2 Tage später wurde das Vorliegen oder Fehlen von menschlichen monoklonalen Antikörpern gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren in der Vertiefung bestimmt, in der das Zellwachstum beobachtet worden war. Zellen in einer Vertiefung, in der die Antikörperproduktion als positiv beurteilt worden war, wurden auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen in vergrößertem Maßstab gezüchtet. Drei Tage danach wurde das Vorliegen oder Fehlen von menschlichen monoklonalen Antikörpern gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren in den Vertiefungen der Kulturplatte mit 24 Vertiefungen bestimmt. Die Vorgänge, ähnlich wie oben, wurden nochmals, wie oben beschrieben, mit den Zellen in einer Vertiefung wiederholt, von denen festgestellt worden war, daß sie einen Antikörper produzieren, der in der Lage ist, mit Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von Serotypen zu reagieren, um die Klonierung durchzuführen. Somit wurden erhalten die EB-Virus-transformierte Zellinie MP 5035, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs1 (IgM) zu produzieren, welcher eine Kreuzreaktivität aufweist mit Gruppe I und Gruppe D des Serotyps gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society, und die EB-Virustransformierte Zellinie MP 5038, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs2 (IgM) zu produzieren, der eine Kreuzreaktivität aufweist mit den Gruppen E und F des Serotyps gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee of the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. MP 5035 und MP 5038 wurden hinterlegt unter FERM BP-1598 und FERM BP-1596 bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan.
- Zwei EB-Virus-transformierte Zellinien, die in der Lage sind, die menschlichen monoklonalen Antikörper HPs1 bzw. HPs2 zu produzieren, wurden unter Verwendung eines Kolbens (Bodenfläche von 175 cm²) in RITC 55-9-Medium gezüchtet [Exp. Cell Res., 138, 127-134 (1982)], welches 0,5% Rinderserumalbumin (in folgenden hier hauptsächlich als RSA bezeichnet) enthielt. Die Kultur wurde zentrifugiert (400 x g, 30 Minuten), um den Überstand zu ergeben. Die Antikörper wurden gereinigt gemäß dem Verfahren, bei dem mit 50% Ammoniumsulfat gefällt wurde, und gemäß dem Fraktionierungsverfahren unter Verwendung einer Sephacryl 5-300 (Pharmacia)- Säule. Von den 250 ml der Kulturlösung, die erhalten worden waren durch Züchten der EB-Virus-transformierten Zellinie, die in der Lage ist, HPs1 zu produzieren, wurden 2,5 mg IgM-Fraktion erhalten, und 76 mg IgM- Fraktion wurden aus 2 Litern der Kulturlösung erhalten, welche erhalten worden war durch Züchten der EB-Virustransformierten Zellinie, die in der Lage ist, HPs2 zu produzieren.
- Die Transformation mit dem EB-Virus wurde in einer Weise durchgeführt, die ähnlich war wie die in Beispiel 1, außer daß peripheres Blut verwendet wurde, welches Patienten mit einer Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheit abgenommen worden war. Es wurde ein Pellet (Zellanzahl 1,4·10&sup7;) aus menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen aus 25 ml heparinisiertem, peripherem Blut erhalten. Klonieren auf weichem Agar wurde zweimal durchgeführt, um die EB-Virustransformierte Zellinie MP 4091, die in der Lage ist, den menschlichen, monoklonalen Antikörper Hps4 (IgM) zu produzieren, welcher eine Kreuzreaktivität mit der Gruppe A und der Gruppe L des Serotyps gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee of the Japan Pseudomonas aeruginosa Society aufweist und die EB-Virustransformierte Zellinie MP 5050, die in der Lage ist, den menschlichen, monoklonalen Antikörper HPs5 (IgM) zu produzieren, welcher eine Kreuzreaktivität aufweist mit der Gruppe G und der Gruppe H des Serotyps gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee of the Japan Pseudomonas aeruginosa Society, zu ergeben. MP 5050 wurde hinterlegt bei Fermentation Research Institute of the Agency of the Industrial Science and Technology of Japan unter FERM BP-1600. Die Zellen wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (7) gezüchtet. Aus 250 ml Kulturlösung, erhalten durch Züchten der EB-Virus-transformierten Zellinie MP 4091, die in der Lage ist, HPs4 zu produzieren, wurden 2,5 mg IgM-Fraktion erhalten. Aus 450 ml der Kulturlösung, erhalten durch Züchten der EB-Virus-transformierten Zellinie MP 5050, die in der Lage ist, HPs5 zu produzieren, wurden 8,6 mg IgM-Fraktion erhalten.
- Die Transformation mit dem EB-Virus wurde auf ähnliche Weise durchgeführt wie in Beispiel 1, außer daß peripheres Blut verwendet wurde, welches einem anderen gesunden Spender abgenommen worden war. Das Pellet (Zellanzahl 2,8· 10&sup7;) aus den Zellen, die den menschlichen Antikörper produzieren, wurden erhalten aus 25 ml heparinisiertem, peripheren Blut. Klonieren auf weichem Agar wurde zweimal durchgeführt, um die EB-Virus-transformierte Zellinie MP 5046 zu erhalten, die in der Lage ist, den menschlichen, monoklonalen Antikörper HPs7 (IgM) zu produzieren, welcher eine Kreuzreaktivität aufweist mit der Gruppe A und Gruppe F des Serotyps gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. MP 5046 wurde hinterlegt bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan unter FERM BP-1599. Die Zellen wurden auf ähnliche Weise kultiviert wie in Beispiel 1 (7). Aus 300 ml Kulturlösung, erhalten durch Züchten der EB-Virustransformierten Zellinie MP 5046, die in der Lage ist, HPs7 zu produzieren, wurden 4,1 mg IgM-Fraktion erhalten.
- Es wurde ein Pellet (Zellanzahl 4,6·10&sup7;) erhalten aus menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen aus 50 ml heparinisiertem, peripherem Blut, welches von einem gesunden Spender in einer Weise ähnlich wie in Beispiel 1 (3) erhalten worden war. Zu dem Pellet wurden 46 ml der viralen Lösung, hergestellt in Beispiel 1 (2), gegeben, worauf sich eine Inkubation bei 37ºC für eine Stunde anschloß. Nach der Inkubation wurde eine Kulturlösung zu den Zellen gegeben, die durch Zentrifugieren (250· g, 10 Minuten) gesammelt worden waren, um die Zellen in einer Dichte von 1·10&sup5;/ml zu suspendieren. Die Suspension wurde getrennt in zwei Kolben (Bodenfläche 175 cm²) gegeben, worauf sich die statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. 5 Tage danach wurden 50 ml einer jeden Kulturlösung hinzugegeben und weitere 5 Tage später wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt.
- Die EB-Virus-transformierten Zellen bzw. die Maus- Myelomzellinie Ns-l wurden mit RPMI 1640-Medium gewaschen. In einem Kunststoffzentrifugenröhrchen von 50 ml Volumen wurden 1,3·10&sup8; EB-Virus-transformierte Zellen und 1,3·10 Maus-Myelomzellen miteinander vermischt. Die vermischten Zellen wurden zentrifugiert (175 x g, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden durch ein sanftes Vibrieren aufgelockert. Zu dem Zentrifugenröhrchen, welches die Zellen enthielt, wurde 0,5 ml RPMI 1640-Medium, angereichert mit 50% Polyethylenglycol (M. W. 1500, Wako Junyaku) und 10% Dimethylsulfoxid, vorsichtig hinzugegeben. Während das Zentrifugenröhrchen langsam rotierte, wurden die Zellen verschmolzen. Zwei Minuten später wurden 10 ml RPMI 1640-Medium hinzugegeben. Nach vorsichtigem Schütteln wurde die Zentrifugation (175· g, 10 Minuten) durchgeführt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand verworfen und das RPMI 1640-Medium hinzugegeben, welches 2·10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 0,176 ug/ml Aminopterin, 13 ug/ml Thymidin, 5 uM Ouabain und 20% FCS (im folgenden hauptsächlich als HAT-O- Kulturlösung bezeichnet) enthielt, um eine Zellsuspension einer Dichte von 1·10&sup6;/ml herzustellen. Jeweils 0,1 ml pro Vertiefung der Suspension wurde in eine flachbödige Kulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Vier Tage nachdem 0,1 ml der HAT-O-Kulturlösung hinzugegeben worden war, wurde alle 4 bis 5 Tage die Hälfte der Kulturlösung durch frische HAT-O-Kulturlösung aufgefüllt.
- In der Vertiefung, in der das Zellwachstum beobachtet worden war, wurde das Vorliegen oder Fehlen der menschlichen, monoklonalen Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren in einer Weise ähnlich wie in Beispiel 1 (5) bestimmt. Der Kulturüberstand, 0,1 ml, auf einer flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit RPMI 164 O- Medium zweifach verdünnt und auf einer Kulturplatte mit 48 Vertiefungen mit zwei gitterförmig bedruckten Nitrocellulosemembranfiltern (6,2 mm·9,3 mm Seitenlänge) umgesetzt, die an verschiedenen Stellen gebundene, formalinisierte, trockene Zellen von Pseudomonas aeruginosa von 6 Arten der Gruppe A bis Gruppe F und 7 Arten der Gruppe E bis Gruppe M aufwiesen.
- 3% Glycogen (Tokyo Kasei Kogyo)-haltige, Phosphat-gepufferte Salzlösung (im folgenden einfach als PBS bezeichnet) wurde zuvor an Mäuse (Balb/c) intraperitoneal injiziert, und die peritonealen Exudatzellen wurden 4 Tage danach gesammelt, um eine Zellsuspension in einer Dichte von 1·10&sup5;/ml Zellen herzustellen. Es wurde eine flachbödige Kulturplatte mit 96 Vertiefungen, die jeweils mit 0,1 ml/Vertiefung der Zellsuspension beschickt worden waren, hergestellt. Als nächstes wurden die Zellen in den Vertiefungen gesammelt, in denen eine Reaktivität mit pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von Serotypen gemäß dem Antikörperdetektionsverfahren beobachtet worden war. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Hemazytometers genau gezählt und in HAT-O-Kulturlösung dispergiert, um Zellsuspensionen von 20/ml und 200/ml herzustellen.
- Nachdem der Überstand aus jeder Vertiefung der flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen, die mit den oben beschriebenen peritonealen Exudatzellen der Maus beschickt worden waren, entfernt war, wurde jeweils 0,1 ml hinzugegeben, gefolgt von einer statischen Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid. 4 Tage nachdem 0,1 ml HAT-O-Kulturlösung hinzugegeben worden war, wurde die Hälfte der Kulturlösung alle 4 bis 5 Tage durch eine frische HAT-O-Kulturlösung aufgefüllt. In den Vertiefungen, in denen ein Zellwachstum 7 bis 14 Tage danach beobachtet wurde, wurde das Vorliegen oder Fehlen des menschlichen monoklonalen Antikörpers gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren bestimmt. Zellen in einer Vertiefung, von denen festgestellt worden war, daß sie einen Antikörper produzieren, der in der Lage ist, mit Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von Serotypen zu reagieren, wurden nochmals wiederholt den Vorgängen unterworfen, ähnlich wie oben, um so die Klonierung zu erzielen. Somit wurde die Hybridzellinie MP 4092 erhalten, die in der Lage ist, den menschlichen, monoklonalen Antikörper HPs6 (IgG) zu produzieren, der jeweils kreuzreaktiv ist mit der Gruppe E und Gruppe F gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas Aeruginosa Society.
- Die Hybridzellen, die sorgfältig auf einer flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen gezüchtet worden waren, wurden in leicht vergrößertem Maßstab kultiviert. Die Züchtung wurde in einem rührenden System von 1 Liter durchgeführt unter Verwendung von 500 ml 20% FCS-haltigem RPMI 1640-Medium. Die Kultur wurde zentrifugiert (400· g, 30 Minuten), um den Überstand zu ergeben. Der Antikörper wurde gemäß dem Verfahren der 50%igen Ammoniumsulfatfällung und dem Fraktionierungsverfahren unter Verwendung einer Protein A-Sepharose 4B (Pharmacia)-Säule gereinigt, um 5 mg IgG zu ergeben.
- behandelten roten Blutkörperchen aus Schafen. In ein Kunststoffzentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 50 ml wurden 5 ml einer Suspension von roten Blutkörperchen aus Schafen gegeben (Nihon Biotest Laboratory, im folgenden einfach als SRBC bezeichnet), und 20 ml Gelatine-Veronalpuffer (im folgenden einfach als GVB bezeichnet) wurden zu der Suspension gegeben. Nach sorgfältigem Rühren wurde das Gemisch zentrifugiert (1600· g, 10 Minuten). Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, und das ausgefällte SRBC wurde in 20 ml GVB suspendiert. Der Vorgang des Zentrifugierens wurde noch dreimal wiederholt. Zu etwa 1 ml des erhaltenen SRBC-Pellets wurden 4 ml 0,143 M wäßrige AET-Lösung hinzugegeben, um die Pellets zu suspendieren. Während von zu Zeit zu Zeit geschüttelt wurde, wurde die Suspension bei 37ºC 15 Minuten lang umgesetzt. Unmittelbar nach Beendigung der Reaktion wurden 20 ml eiskalter GVB zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nach sorgfältigem Schütteln wurde eine Zentrifugation durchgeführt (1600· g, 10 Minuten). Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, und die Niederschläge wurden in 20 ml GVB suspendiert. Der Vorgang des Zentrifugierens wurde noch zweimal wiederholt. Die AET-behandelten SRBC wurden in GVB in einer Dichte von 2·10&sup8;/ml suspendiert und unter Eiskühlung aufbewahrt, bis sie für die Verwendung bereitgestellt wurden.
- Auf eine gleiche Menge mono-poly-auflösendes Medium (Flow) wurden 25 ml heparinisiertes, peripheres Blut aufgegeben, welches einem gesunden Spender abgenommen worden war, der einen hohen Titer gegen Pseudomonas aeruginosa besaß und aufgrund eines Autounfalls im Krankenhaus war und bei dem etwa 3 Monate nach der Wundheilung vergangen waren, so daß die Grenzschicht nicht beeinträchtigt wurde, worauf sich eine Zentrifugation (350· g, 30 Minuten) bei Raumtemperatur anschloß. Nach dem Zentrifugieren wurde die Flüssigkeit an der Grenzfläche, die die Zellen enthielt, unter Verwendung einer Pasteur-Pipette herausgenommen, und eine gleiche Menge 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium wurde dazugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur zentrifugiert (350· g, 10 Minuten). Die ausgefällten Zellen wurden wiederum in 20% FCS-haltigem RPMI 1640- Medium suspendiert. Der Vorgang des Zentrifugierens wurde nochmals wiederholt, um ein Pellet (Zellanzahl 5 · 10&sup7;) einer menschlichen Lymphozytenfraktion zu erhalten.
- Als nächstes wurde die erhaltene Fraktion der menschlichen Lymphozyten in 4 ml 20% FCS-haltigem RPMI 164 0- Medium suspendiert, um eine Suspension in einer Dichte von 5·10&sup6;/ml herzustellen. In 8 Kunststoffzentrifugenröhrchen von jeweils 50 ml Volumen wurde getrennt jeweils 0,5 ml Suspension gegeben, und jeweils 1 ml der AET-behandelten SRBC-Suspension, hergestellt in (1), wurde zu jedem Zentrifugenröhrchen gegeben. Nach sorgfältigem Schütteln wurde das Gemisch zentrifugiert (20 · g, 2 Minuten). Nach dem Zentrifugieren wurde das System bei 4ºC 2 Stunden lang ruhen gelassen, um die Rosettenbildung durchzuführen. Nach Beendigung der Reaktion wurden 1,5 ml 20% FCS-haltiges RPMI 1640- Medium hinzugegeben. Das Pellet wurde vorsichtig unter Verwendung einer Pasteur-Pipette zerstört. Die Zellsuspensionen, die eine Rosette bildete, wurden gesammelt und auf 20 ml mono-poly-auflösendes Medium aufgegeben, welches in ein Kunststoffzentrifugenröhrchen von 50 ml Volumen gefüllt worden war, so daß die Grenzfläche nicht beeinträchtigt wurde, worauf sich eine Zentrifugation (350· g, 30 Minuten) anschloß. Nach dem Zentrifugieren wurde die Flüssigkeit an der Grenzfläche, die die Zellen enthielt, unter Verwendung einer Pasteur-Pipette herausgenommen, und eine gleiche Menge 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium wurde hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur (250· g, 10 Minuten) zentrifugiert. Die ausgefällten Zellen wurden erneut in 20% FCS-haltigem RPMI 1640-Medium suspendiert. Der Vorgang des Zentrifugierens wurde noch zweimal wiederholt, um das Pellet (Zellanzahl 1,0· 10&sup7;) der Antikörper-produzierenden Zellen (B-Zellen) zu erhalten.
- Das Pellet aus Antikörper-produzierenden Zellen (B-Zellen) wurde in 20 ml 20% FCS-haltigem RPMI 1640- Medium suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Dichte von 5·10&sup5;/ml eingestellt. Kermesbeeren-Mitogen (PWM) (Gibco) wurde in einem Volumen von 1/200 zu der Suspension hinzugegeben. Das Gemisch wurde in einen Kolben gefüllt (Bodenfläche 75 cm²), worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC für 6 Tage in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß.
- 2,5% Glycogen-haltiges PBS wurde zuvor intraperitoneal an Mäuse (Balb/c) in einer Konzentration von 0,5 ml/Maus injiziert. Die peritonealen Exudatzellen wurden 4 Tage später gesammelt. Die Zellen wurden in 20% FCS- haltigem RPMI 1640-Medium zusammen mit Maus-Milzzellen, die getrennt hergestellt worden waren, suspendiert, um Zellsuspensionen einer Dichte von 5·10&sup5;/ml bzw. 1· 10&sup6;/ml herzustellen. Eine flachbödige Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (im folgenden einfach als Feeder-Platte bezeichnet), die getrennt mit jeweils 0,1 ml/Vertiefung einer jeden Zellsuspension beschickt worden war, wurde hergestellt.
- PWM-behandelte, menschliche Antikörper-produzierende Zellen (B-Zellen) bzw. die menschlichen lymphoblastartigen Zellen MHP-315 wurden mit RPMI 1640-Medium gewaschen. In einem Kunststoffzentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 50 ml wurden 5·10&sup7; menschliche Antikörper-produzierende Zellen (B-Zellen) und dieselbe Anzahl von menschlichen lymphoblastartigen Zellen miteinander vermischt. Die vermischten Zellen wurden zentrifugiert (175· g, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in FCS-freiem RPMI 1640-Medium suspendiert. Der Vorgang des Zentrifugierens wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand unter Verwendung einer Pasteur-Pipette so weit wie möglich entfernt, um ein Zellpellet herzustellen. Das Pellet wurde einer leichten Vibration unterworfen, um die Zellen ein wenig aufzulockern. Dann wurde 0,3 ml eines Verschmelzungsreagens (PBS, enthaltend 50% Polyethylenglycol 4000 und 10% Dimethylsulfoxid) hinzugegeben. Das Zentrifugenröhrchen wurde langsam 90 Sekunden lang rotieren gelassen. 90 Sekunden danach wurden 20 ml 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium schrittweise hinzugegeben. Weitere 2 Minuten später wurden 20 ml desselben Mediums hinzugegeben, um die Zellen vorsichtig zu dispergieren. Nach der Zellverschmelzung wurden die Zellen durch Zentrifugieren (175·g, 10 Minuten) pelletisiert. Das Pellet wurde in 20% FCS-haltigem RPMI 1640-Medium dispergiert, um eine Dichte von 1· 10&sup6;/ml einzustellen. Nachdem der Überstand aus jeder Vertiefung der Feeder-Platte entfernt worden war, wurde jeweils 0,1 ml/Vertiefung der Zelldispersion hinzugegeben, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß.
- 24 Stunden später wurde jeweils 0,1 ml/Vertiefung 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium, welches 4·10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 2 ug/ml Azaserin und 10 uM Ouabain enthielt, zu der Kultur gegeben. Danach wurde die Hälfte der Kulturlösung alle 4 bis 5 Tage durch 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium aufgefüllt, welches 2·10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 1 ug/ml Azaserin und 5 uM Ouabain enthielt (im folgenden einfach als HA-O-Kulturlösung bezeichnet).
- In der Vertiefung, in der etwa 4 bis 5 Wochen später ein Zellwachstum beobachtet wurde, wurde das Vorliegen oder Fehlen des menschlichen monoklonalen Antikörpers gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren in einer Weise ähnlich wie in Beispiel 1 (5) bestimmt.
- Zellen in den Vertiefungen, in denen die Reaktivität mit Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von Serotypen gemäß dem Antikörperdetektionsverfahren beobachtet worden war, wurden gesammelt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Hemazytometers genau gezählt und in HA-O-Kulturlösung dispergiert, um Zellsuspensionen von 20/ml und 200/ml herzustellen. Nachdem der Überstand einer jeden Vertiefung in der oben beschriebenen Feeder-Platte entfernt worden war, wurde jeweils 0,1 ml hinzugegeben, worauf sich die statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. 4 Tage nachdem 0,1 ml der HA-O-Kulturlösung hinzugegeben worden war und danach, wurde die Hälfte der Kulturlösung alle 3 bis 4 Tage mit einer frischen HA-O- Kulturlösung aufgefüllt. In der Vertiefung, in der das Zellwachstum etwa 2 bis 4 Wochen danach beobachtet wurde, wurde das Vorhandensein oder Fehlen des menschlichen monoklonalen Antikörpers gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren bestimmt. Zellen, die so bewertet wurden, daß sie einen Antikörper produzierten, der gegen Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von Serotypen reaktiv war, wurden erneut den Vorgängen unterworfen, die ähnlich waren wie die oben erwähnten, wodurch die Klonierung erzielt wurde. Somit wurde die Hybridzellinie MP 4095 erhalten, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs8 (IgM) zu produzieren, der kreuzreaktiv ist mit jeweils der Gruppe E und der Gruppe F gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee of the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. MP 4095 wurde hinterlegt unter FERM P-9750 bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan.
- Die Hybridzellinie MP 4095, die in einer flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen sorgfältig angezogen worden war, wurde in einem leicht vergrößerten Maßstab gezüchtet. Sie wurde in 4 Kolben (Bodenfläche 175 cm²) unter Verwendung von 200 ml NYSF 404-Medium ohne Serum [Yabe, Tissue Culture, 11, 458 (1985)] gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert (400· g, 30 Minuten), um 190 ml Überstand zu ergeben. Der Überstand wurde über einen Membranfilter einer Porengröße von 0,22 um filtriert. Das Filtrat wurde auf einer Mono Q-Säule (Pharmacia) bei einer Flußrate von 2 ml/min. adsorbiert, wobei die Säule zuvor mit 0,025 M Phosphatpuffer (pH 6,8) equilibriert worden war. Nach der Adsorption wurde die Säule mit einem Gemisch derselben Mengen des genannten Puffers und 0,3 M Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen. Nach dem Waschen wurde die IgM-Fraktion mit 0,3 M Phosphatpuffer (pH 6,5) eluiert. Von 190 ml des Kulturüberstandes wurden 1 mg IgM Antikörper erhalten.
- Als menschliche Antikörper-produzierende Zellen, wurde die EB-Virus-transformierte Zellinie MP 5035 verwendet, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs1 (IgM) zu produzieren, welcher in Beispiel 1 erhalten worden war und eine Kreuzreaktivität mit der Gruppe I und Gruppe D gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society besaß. MP 5035 wurde in einem Kolben (Bodenfläche 175 cm²) unter Verwendung von 20% FCS-haltigem RPMI 1640- Medium kultiviert. Die Zellen in der logarithmischen Phase wurden durch Zentrifugieren gesammelt und zur Herstellung von Hybridzellen bereitgestellt.
- Die transformierte Zellinie MP 5035 und die menschliche lymphoblastartige Zellinie MHP-315 wurden mit FCS- freiem RPMI 1640-Medium gewaschen. In einem Kunststoffzentrifugenröhrchen von 50 ml Volumen wurden 1,3·10&sup8; der transformierten Zellen und dieselbe Menge menschlicher lymphoblastartiger Zellen miteinander vermischt. Die vermischten Zellen wurden zentrifugiert (175· g, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen, und die ausgefällten Zellen wurden in FCS-freiem RPMI 1640-Medium suspendiert. Der Vorgang der Zentrifugation wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt, wobei soweit wie möglich eine Pasteur-Pipette verwendet wurde, um das Zellpellet herzustellen. Das Pellet wurde vorsichtig einer Vibration ausgesetzt, um die Zellen ein wenig auf zulokkern. Dann wurde 0,3 ml eines Verschmelzungsreagens (PBS, enthaltend 50% Polyethylenglycol 4000 und 10% Dimethylsulfoxid) hinzugegeben. Das Zentrifugenröhrchen wurde langsam 90 Sekunden lang bei Raumtemperatur rotieren gelassen. 90 Sekunden danach wurden 20 ml 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium stufenweise hinzugegeben. Weitere 2 Minuten danach wurden 20 ml desselben Mediums hinzugegeben, um die Zellen vorsichtig zu dispergieren. Nach der Zellverschmelzung wurden die Zellen durch Zentrifugieren (175· g, 10 Minuten) pelletisiert. Das Pellet wurde in 20% FCS- haltigem RPMI 1640-Medium dispergiert, um eine Dichte von 1·10&sup6;/ml einzustellen. Nachdem der Überstand aus jeder Vertiefung der Feeder-Platte entfernt worden war, wurden jeweils 0,1 ml/Vertiefung Zelldispersion hinzugegeben, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß.
- 24 Stunden später wurde jeweils 0,1 ml/Vertiefung 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium, welches 4·10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 2 ug/ml Azaserin und 10 uM Ouabain enthielt, zu der Kultur hinzugegeben. Danach wurde die Hälfte der Kulturlösung alle 3 bis 4 Tage durch 20% FCS-haltiges RPMI 1640-Medium aufgefüllt, welches 2· 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 1 ug/ml Azaserin und 5 uM Ouabain (HA-O-Kulturlösung) enthielt.
- In der Vertiefung, in der das Zellwachstum etwa 4 bis 5 Wochen später beobachtet wurde, wurde das. Vorliegen oder Fehlen des menschlichen monoklonalen Antikörpers gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren in einer Weise ähnlich wie in Beispiel 1 (5) bestimmt.
- Die Zellen in den Vertiefungen, in denen das Vorliegen eines Antikörpers mit einer Reaktivität gegenüber Pseudomonas aeruginosa der Serotypen der Gruppe D und Gruppe I gemäß dem Antikörperdetektionsverfahren beobachtet worden war, wurden gesammelt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Hemazytometers genau gezählt und in einer HA-O-Kulturlösung dispergiert, um Zellsuspensionen von 20/ml und 200/ml herzustellen. Nachdem der Überstand von jeder Vertiefung in der Feeder-Platte (jeder eine Platte) entfernt worden war, wurde jeweils 0,1 ml pro Vertiefung überimpft, worauf eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid folgte. 4 Tage nachdem 0,1 ml der HA-O- Kulturlösung hinzugegeben worden war, wurde danach die Hälfte der Kulturlösung alle 3 bis 4 Tage durch eine frische HA-O-Kulturlösung aufgefüllt. In der Vertiefung, in der ein Zellwachstum etwa 2 bis 4 Wochen später beobachtet wurde, wurde das Vorliegen oder die Abwesenheit des menschlichen monoklonalen Antikörpers gegen Pseudomonas aeruginosa in dem Kulturüberstand gemäß dem DIBA-Verfahren bestimmt. Die Zellen, die als einen Antikörper produzierend beurteilt wurden, der mit Pseudomonas aeruginosa der Serotypen der Gruppe D und Gruppe 1 reaktiv ist, wurden erneut den Vorgängen ähnlich wie oben unterworfen, um so die Klonierung zu erzielen. Somit wurde die Hybridzellinie MP 5082, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs9 (IgM) zu produzieren, der kreuzreaktiv ist mit jeweils der Gruppe D und Gruppe I gemäß der serologischen Klassifizierung of the Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society, durch zweimaliges Klonieren erhalten. Die Zellen, die in einer flachbödigen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen sorgfältig gezüchtet worden waren, wurden in einem leicht vergrößerten Maßstab gezüchtet. MP 5082 wurde unter FERM P-9745 bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan hinterlegt.
- Die Hybridzellinie MP 5082 wurde in 200 ml serumfreiem NYSF 404-Medium in einer Zelldichte von 3·10&sup5;/ml dispergiert. Die Suspension wurde getrennt in 4 Kolben (Bodenfläche 175 cm²) gefüllt, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Am vierten Tag nach Beginn der Züchtung wurde die Kulturlösung zentrifugiert (400· g, 20 Minuten), um 190 ml Überstand zu ergeben. Aus dem Kulturüberstand wurde der Antikörper über eine Mono Q- Säule auf eine Weise ähnlich wie in Beispiel 5 (6) gereinigt. Von 190 ml Kulturüberstand wurden 1,7 mg IgM Antikörper erhalten.
- Die Zellverschmelzung wurde durchgeführt zwischen den menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen und der lymphoblastartigen Zellinie MHP-315, die sich vom Menschen ableitete, in einer Weise, ähnlich wie in Beispiel 6, außer daß als menschliche Antikörper-produzierende Zellen die EB- Virus-transformierte Zellinie MP 5038 verwendet wurde, die in Beispiel 1 verwendet worden war und in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs2 (IgM) zu produzieren und kreuzreaktiv ist mit der Gruppe E und der Gruppe F gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. Zunächst wurde MP 5038 in einem Kolben (Bodenfläche 175 cm²) und unter Verwendung von 20% FCS-haltigem RPMI 1640- Medium gezüchtet. Die Zellen in der logarithmischen Phase wurden durch Zentrifugieren gesammelt und bereitgestellt, um Hybridzellen herzustellen. Die Zellverschmelzung wurde durchgeführt zwischen 1,0·10&sup8; der EB-Virus-transformierten Zellen und derselben Anzahl menschlicher lymphoblastartiger Zellen, worauf sich die Klonierung in einer Weise ähnlich wie in Beispiel 6 anschloß. Somit wurde die Hybridzellinie MP 5064 erhalten, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs10 (IgM) zu produzieren, der kreuzreaktiv ist mit jeweils der Gruppe E und der Gruppe F gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. MP 5064 wurde unter FERM P-19751 hinterlegt bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan. Die Hybridzellinie MP 5064 wurde in 350 ml serumfreiem NYSF 404-Medium in einer Konzentration von 3·10&sup5;/ml dispergiert. Die Suspension wurde getrennt in 7 Kolben (Bodenfläche 175 cm²) gefüllt, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Am vierten Tag nach Beginn der Züchtung wurde die Kulturlösung zentrifugiert (400· g, 20 Minuten), um 330 ml Überstand zu ergeben. Aus dem Kulturüberstand wurde der Antikörper mit einer Mono Q-Säule gereinigt, ähnlich wie in Beispiel 5 (6). Von 300 ml Kulturüberstand wurden 7,7 mg IgM erhalten.
- Die Zellverschmelzung wurde durchgeführt zwischen den menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen und der lymphoblastartigen Zellinie MHP-315, die sich vom Menschen ableitete, auf eine Weise ähnlich wie in Beispiel 6, außer daß als menschliche Antikörper-produzierende Zellen die EB- Virus-transformierte Zellinie MP 5050 aus Beispiel 2 verwendet wurde, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs5 (IgM) zu produzieren und eine Kreuzreaktivität aufweist mit der Gruppe G und Gruppe H gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. Zunächst wurde MP 5050 in einem Kolben (Bodenfläche 175 cm²) unter Verwendung von 20% FCS-haltigem RPMI 1640- Medium kultiviert. Die Zellen wurden in der logarithmischen Phase durch Zentrifugieren gesammelt und bereitgestellt, um die Hybridzellen zu produzieren. Die Zellverschmelzung wurde durchgeführt zwischen 1,3·10&sup8; der EB-Virus-transformierten Zellen und derselben Menge menschlicher lymphoblastartiger Zellen auf ähnliche Weise wie in Beispiel 6. Somit wurde die Hybridzellinie MP 5104 erhalten, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs11 (IgM) zu produzieren, der kreuzreaktiv ist mit jeweils der Gruppe G und der Gruppe H gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. MP 5104 wurde unter FERM BP-9753 hinterlegt bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan. Die Hybridzellinie MP 5104 wurde in 500 ml serumfreiem NYSF 404-Medium in einer Konzentration von 3·10&sup5;/ml dispergiert. Die Suspension wurde getrennt in 10 Kolben (Bodenfläche 175 cm²) eingefüllt, worauf eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid folgte. Am vierten Tag nach Beginn der Züchtung wurde die Kulturlösung zentrifugiert (400· g, 20 Minuten), um 470 ml Überstand zu ergeben. Aus dem Kulturüberstand wurde der Antikörper mit einer Mono Q-Säule auf ähnliche Weise wie in Beispiel 5 (6) gereinigt. Aus 450 ml Kulturüberstand wurden 9,8 mg IgM Antikörper erhalten.
- Die Zellverschmelzung wurde durchgeführt zwischen den menschlichen Antikörper-produzierenden Zellen und der lymphoblastartigen Zellinie MHP-315, die sich vom Menschen ableitete, auf eine Weise ähnlich wie in Beispiel 6, außer daß als menschliche Antikörper-produzierende Zellen, die EB-Virus-transformierte Zellinie MP 5046 verwendet wurde, die in Beispiel 3 hergestellt worden war, die in der Lage ist, den menschlichen, monoklonalen Antikörper HPs7 (IgM) zu produzieren und die kreuzreaktiv ist mit der Gruppe A und Gruppe F gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas Aeruginosa Society. Zunächst wurde MP 5046 in einem Kolben (Bodenfläche 175 cm²) unter Verwendung von 20% FCS- haltigem RPMI 1640-Medium kultiviert. Die Zellen wurden in der logarithmischen Phase durch Zentrifugieren gesammelt und zur Herstellung der Hybridzellen bereitgestellt. Die Zellverschmelzung wurde zwischen 1,3·10&sup8; EB-Virustransformierten Zellen und derselben Menge menschlicher lymphoblastartiger Zellen auf ähnliche Weise wie in Beispiel 6 durchgeführt. Somit wurde die Hybridzellinie MP 5075 erhalten, die in der Lage ist, den menschlichen monoklonalen Antikörper HPs12 (IgM) zu produzieren, der kreuzreaktiv ist mit jeweils der Gruppe A und der Gruppe F gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society. MP 5075 wurde unter FERM P-9752 hinterlegt bei Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan. Die Hybridzellinie MP 5075 wurde in 5550 ml serumfreiem NYSF 404-Medium in einer Konzentration von 3·10&sup5;/ml dispergiert. Die Suspension wurde getrennt in 11 Kolben (Bodenfläche 175 cm²) gegeben, worauf sich eine statische Züchtung bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid anschloß. Am vierten Tag nach Beginn der Züchtung wurde die Kulturlösung zentrifugiert (400· g, 20 Minuten), um 530 ml Überstand zu ergeben. Aus dem Kulturüberstand wurde der Antikörper über eine Mono Q-Säule auf ähnliche Weise wie in Beispiel 5 (69 gereinigt. Aus 530 ml Kulturüberstand wurden 13,4 mg IgM erhalten
- Die Reaktivitäten der menschliche monoklonalen Antikörper, die in den Beispielen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 erhalten worden waren, mit LPS eines jeden Serotyps von Pseudomonas aeruginosa, mit LPS, welches sich ableitet vom Ra-Stamm, und Lipid A, welches nur eine gemeinsame Strukturregion von LPS aufweist, wurden gemäß dem DIBA-Verfahren, beschrieben in Beispiel 1, getestet. Als Serotyp Pseudomonas aeruginosa-LPS wurde jeweils eines verwendet, das in Beispiel 1 hergestellt worden war. Als LPS, das sich vom Ra-Stamm (Salmonella minnesota R60) ableitete, und Lipid A wurden die verwendet, die käuflich erhältlich sind (List Biological Laboratories Inc.). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der menschliche monoklonale Antikörper reagierte jeweils nicht mit Ra oder Lipid A, welches eine gemeinsame Strukturregion von LPS darstellt, sondern reagierte jeweils spezifisch mit dem Serotyp-Pseudomonas aeruginosa-LPS. Darum wurde deutlich, daß es sich um menschliche monoklonale Antikörper handelte, die die O- spezifische Polysaccharidkette von LPS erkennen. Tabelle 2 Reaktivität von Antikörpern gegenüber jedem Serotyp-LPS [Serotyp] monklonaler Antikörper Lipid
- Die Kreuzreaktivitäten der menschlichen monoklonalen Antikörper HPs1 und HPs2, erhalten in Beispiel 1, mit der O-spezifischen Polysaccharidkette von Pseudomonas aeruginosa, nämlich den O-Antigenen, wurden durch den enyzmverknüpften Immnosorptionstest (ELISA) unter Verwendung einer Platte getestet, die mit LPS beschichtet war. Pseudomonas aeruginosa-LPS, hergestellt in Beispiel 1, wurde in Carbonatpuffer (pH 9,6) aufgelöst, um eine Konzentration von 2 ug/ml zu ergeben. In jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner) für ELISA wurden 50 ul LPS-Lösung getrennt in die Vertiefung gegeben, die bei 37ºC 2 Stunden lang stehen gelassen wurde. Nach dem Fixieren wurde die Lösung verworfen und mit 2% RSA-haltigem Carbonatpuffer blockiert. Jede Antikörperlösung (25 ug/ml), die in 0,05% Tween 20-haltigem PBS aufgelöst worden war, wurde mit einer gleichen Menge einer 2fachen Reihenverdünnung einer jeden Pseudomonas aeruginosa LPS-Lösung (50 ug/ml) vermischt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt. 15 ul der Reaktionslösung wurden für den ELISA-Test getrennt in jede Vertiefung der obigen LPS-fixierten Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang umgesetzt. Nach dem Waschen der Vertiefung mit 0,05% Tween 20-haltigem PBS, wurde eine Reaktion mit 50 ul Peroxidase-konjugiertem Antihuman-Kaninchen-Immunglobulin (500fach verdünnt) bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang durchgeführt. Nach dem Waschen mit 0,05% Tween 20-haltigen PBS wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang eine Umsetzung mit 50 ul Citratpuffer-haltigem 10 mg/ml 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS) und 0,03% Wasserstoffperoxid durchgeführt. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 414 nm gemessen, und die inhibitorische Geschwindigkeit des Bindens eines jeden Antikörpers an LPS, welches auf der Platte fixiert war, durch jedes Pseudomonas aeruginosa-LPS wurde aus der Absorption bestimmt.
- Wie in Fig. 1 gezeigt, wurde das Binden von HPs1 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe I beschichtet war, durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe I und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe D gehemmt, wurde jedoch nicht gehemmt durch LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A. Somit wurde bestätigt, daß HPs1 ein monoklonaler Antikörper ist, der zwei O-Antigene aus Gruppe I und Gruppe D gemeinsam erkennt. Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde das Binden von HPs2 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F beschichtet war, gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F, aber nicht gehemmt durch LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe D. Somit wurde bestätigt, daß HPs2 ein monoklonaler Antikörper war, der zwei O-Antigene der Gruppe E und Gruppe F gemeinsam erkennt.
- Die Kreuzreaktivitäten der menschlichen monoklonalen Antikörper Hps4, HPs5, HPs6, HPs7 und HPs8, erhalten in den Beispielen 2,3,4 und 5, mit O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa, wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 11 durch ELISA unter Verwendung einer Platte getestet, die mit LPS beschichtet war. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde das Binden von HPs4 an die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A beschichtete Platte gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe L. Wie in Fig. 4 gezeigt, wurde das Binden von HPs4 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe H beschichtet war, gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe G und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe H. Wie in Fig. 5 gezeigt, wurde das Binden von HPs6 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E beschichtet war, gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurde das Binden von HPs7 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A beschichtet war, gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F. Wie in Fig. 7 gezeigt, wurde das Binden von HPs8 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E beschichtet war, gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F. Durch diese Ergebnisse wurde bestätigt, daß HPs4, HPs5, HPs6, HPs7 und HPs8 menschliche monoklonale Antikörper sind, die zwei O-Antigene der Gruppen A und L, der Gruppen G und H, der Gruppen E und F, der Gruppen A und F bzw. der Gruppen E und F gemeinsam erkennen.
- Die Kreuzreaktivitäten der menschlichen monoklonalen Antikörper HPs9, HPs10, HPs11 und HPs12, erhalten in den Beispielen 6, 7, 8 und 9 mit O-Antigenen von Pseudomonas aeruginosa wurden ähnlich wie in Beispiel 11 mittels ELISA unter Verwendung einer Platte, die mit LPS beschichtet war, getestet. Das Binden von HPs9 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe 1 beschichtet war, wurde gehemmt durch jedes LPS Pseudomonas aeruginosa der Gruppe D und Gruppe I. Das Binden von Hps10 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E beschichtet war, wurde gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F. Das Binden von HPs11 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe H beschichtet war, wurde gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe G und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe H. Das Binden von HPs12 an die Platte, die mit LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A beschichtet war, wurde gehemmt durch jedes LPS von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe A und Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F. Durch diese Ergebnisse wurde bestätigt, daß HPs9, HPs10, HPs11 und HPs12 menschliche monoklonale Antikörper sind, die zwei O-Antigene der Gruppen D und I, der Gruppen E und F, der Gruppen G und H bzw. der Gruppen A und F gemeinsam erkennen.
- Die fördernde Wirkung des menschlichen monoklonalen Antikörpers HPs2, erhalten in Beispiel 1, auf die bakterizide Aktivität von polymorphonuclearen Maus-Zellen gegen Pseudomonas aeruginosa wurde getestet. PBS, das 2,5% (Gew./Vol.) Glycogen enthielt, wurde intraperitoneal an Mäuse (Balb/c, weiblich) im Alter von 8 bis 12 Wochen nach der Geburt in einer Konzentration von 2 ml/Maus injiziert. 5 Stunden danach wurden die peritonealen Exudatzellen (gesammelt von 14 Mäusen), welche die polymorphonuclearen Zellen enthalten, gesammelt. Die peritonealen Exudatzellen, welche die polymorphonuclearen Zellen enthalten, wurden zweimal mit Hank's Lösung unter Eiskühlung gewaschen und in einer Zelldichte von 1·10&sup7;/ml in 10 mM HEPES-haltiger Hank's ausgeglichener Salzlösung (im folgenden als HBSS bezeichnet) dispergiert, die unter Eiskühlung aufbewahrt wurde, bis sie zur Verwendung bereitgestellt wurde. Pseudomonas aeruginosa PA103 der Gruppe E und Pseudomonas aeruginosa IID 1006 der Gruppe F, wurden auf Nähragar überimpft, worauf sich eine Inkubation bei 37 &sup0;c für 20 Stunden anschloß. Die gewachsenen Kolonien wurden abgekratzt und in physiologischer Salzlösung suspendiert. Nach zweimaligem Waschen mit derselben Lösung wurden die Bakterienzellen in HBSS suspendiert, um eine Absorption von 0,12 bei einer Wellenlänge von 540 nm zu erhalten. Die hergestellten bakteriellen Zellsuspensionen wurden unter Eiskühlung aufbewahrt, bis sie für die Verwendung bereitgestellt wurden. Als Komplement wurde eine 5fache Verdünnung von normalem Meerschweinchenserum (lyophilisiertes Komplement, Nihon Biotest Laboratories) mit HBSS verwendet.
- Unter Eiskühlung wurden jeweils 10 ul der bakteriellen Zellsuspension getrennt in ein Kunststoffteströhrchen (Falcon) gegeben, und 40 ul HPs2, welches zuvor auf Konzentration von 25 ug/ml, 2,5 ug/ml und 0,25 ug/ml mit HBSS eingestellt worden war, und 10 ul Komplementlösung wurden hinzugegeben. Das Gemisch wurde sorgfältig vermischt. Als nächstes wurden 40 ul peritoneale Exudatzellsuspensionen, welche die polymorphonuclearen Zellen enthielt, zu dem Gemisch gegeben. Nach sorgfältigem Vermischen wurde bei 37ºC eine Rotationsschüttelkultur (200 Upm) 2 Stunden lang durchgeführt. Nach dem Beenden der Inkubation wurden 900 ul eisgekühltes Wasser zu jedem Teströhrchen gegeben, um die polymorphonuclearen Zellen osmotisch auf zubrechen. Es wurden jeweils 100 ul eines jeden Teströhrchens herausgenommen und 10fach, 100fach und 1000fach mit HBSS verdünnt. Jede Verdünnung wurde auf Nähragarplatten (3 Schalen ) mit jeweils 100 ul überimpft, worauf sich die Inkubation bei 37ºC für 18 Stunden anschloß. Die Zahl der auf der Nähragarplatte gebildeten Kolonien wurde gezählt, um den Rest der bakteriellen Zellanzahl zu bestimmen. Bei der Kontrollgruppe wurde HBSS anstelle einer jeden Zugabelösung hinzugegeben. Wie in den Tabellen 3 und 4 gezeigt, machen die Ergebnisse deutlich, daß HPs2 die bakterizide Aktivität der polymorphonuclearen Zellen gegen verschiedene Serotypen von Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E und F in Gegenwart des Komplements förderte. Tabelle 3 Bakterizide Aktivität gegen Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E (PA103) Antikörper polymorphe Zellen Komplement Anzahl der verbliebenen lebenden Zellen * Beim Start = 6·10&sup5; koloniebildende Einheiten (CFU/ml) Tabelle 4 Bakterizide Aktivität gegen Pseudomonas aeruginosa der Gruppe F (IID 1006) Antikörper polymorphe Zellen Komplement Anzahl der verbliebenen lebenden Zellen * Beim Start = 2,5·10&sup5; koloniebildende Einheiten CFU/ml)
- Die schützende Aktivität der menschlichen monoklonalen Antikörper HPs1, HPs2, HPs4, HPs5, HPs6, HPs7 und HPs8, erhalten in den Beispielen 1, 2, 3, 4, und 5, gegen eine Infektion mit Pseudomonas aeruginosa wurde getestet. Der menschliche monoklonale Antikörper wurde intraperitoneal an Mäuse (Balb/c, weiblich) im Alter von 8 bis 12 Wochen nach der Geburt in 0,2 ml einer Lösung, die 50 ng, 500 ng, 5 ug und 50 ug eines jeden menschlichen monoklonalen Antikörpers enthielt, pro Maus injiziert, wobei eine Gruppe 5 bis 10 Mäuse umfaßte. 2 Stunden danach wurde die bakterielle Suspension eines jeden Stammes (IID 1001 (Gruppe A), IID 1004 (Gruppe D), PA 103 (Gruppe E), F7 (Gruppe F), P 28 (Gruppe G), IID 1009 (Gruppe H), IID 1010 (Gruppe I) und IID 1014 (Gruppe L) intraperitoneal für eine Provokation verwendet. Bei der Kontrollgruppe wurde eine physiologische Salzlösung allein anstelle des menschlichen monoklonalen Antikörpers injiziert. Jeder Serotyp von Pseudomonas aeruginosa wurde auf ein Herzinfusions-Agarplattenmedium überimpft, worauf sich eine Inkubation bei 37ºC über Nacht anschloß. Die gewachsenen, bakteriellen Zellkolonien wurden abgekratzt. Nach dem Verdünnen mit physiologischer Salzlösung wurde 5% Mucin hinzugegeben und eingestellt, um eine, provozierende Bakterienmenge von 3 bis 15 mal der 50%igen letalen Dosis (LD&sub5;&sub0;-Wert) pro Maus zu ergeben. Nach der Provokation mit Pseudomonas aeruginosa wurde die 50%-wirksame Dosis (ED&sub5;&sub0;-Wert) bestimmt auf der Grundlage der Überlebensrate der Mäuse in jeder Injektionsgruppe am 7. Tag. Wie in Tabelle 5 gezeigt, machen die Ergebnisse deutlich, daß jeder menschliche monoklonale Antikörper eine hohe schützende Aktivität gegen Infektionen mit Pseudomoas aeruginosa zweier verschiedener Serotypen aufwies, wobei sie jeweils eine Reaktionsspezifität zeigten. Tabelle 5 ED&sub5;&sub0;-Wert (ug/Maus) [Serotyp der Provokationsbakterien] Monoklonale Antikörper
- Die schützende Aktivität des menschlichen monoklonalen Antikörpers HPs2, erhalten in Beispiel 1, gegen eine Infektion mit pseudomonas aeruginosa wurde getestet durch Verändern des Zeitpunktes der Injektion des Antikörpers. Der menschliche monoklonale Antikörper HPs2 wurde Mäusen (Balb/c, weiblich) 8 Wochen nach der Geburt intraperitoneal in 0,2 ml einer Lösung, die 0,2 ug HPs2 pro Maus enthielt, injiziert, wobei ein Gruppe 10 Mäuse umfaßte. Die bakterielle Suspension von PA 103 (Gruppe E) wurde intraperitoneal 24 Stunden und 2 Stunden vor der Injektion des Antikörpers und zur selben Zeit und 1 Stunde und 4 Stunden danach zur Provokation verwendet. In der Kontrollgruppe wurde eine physiologische Salzlösung allein anstelle des menschlichen monoklonalen Antikörpers injiziert. Die bakterielle Suspension wurde hergestellt auf eine Weise ähnlich wie in Beispiel 15, d. h. nach dem Verdünnen mit einer physiologischen Salzlösung wurde 5% Mucin hinzugegeben und eingestellt, so daß die provozierende, bakterielle Menge 8 mal die LD&sub5;&sub0; pro Maus beträgt. Die Überlebensrate der Mäuse am 3. Tag nach der Provokation mit Pseudomonas aeruginosa wurde beobachtet. Wie in Tabelle 6 gezeigt, machen die Ergebnisse deutlich, daß HPs2 eine schützende Aktivität gegen eine Infektion mit Pseudomonas aeruginosa der Gruppe E zeigte, die eine Reaktionspezifität aufwies, außer für die Injektion mit der bakteriellen Lösung 4 Stunden nach der Provokation. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß HPs2 nicht nur eine prophylaktische Wirkung, sondern auch eine therapeutische Wirkung gegen eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion aufwies. Tabelle 6 Antikörper Zeit der Injektion überlebende Anzahl nach 3 Tagen Überlebensrate gleichzeitig 24 Stunden zuvor 1 Stunde danach
- HPs2, erhalten in Beispiel 1, wurde aufgelöst in PBS, welcher 0,2% (Gew./Vol.) menschliches Serumalbumin (Calbio) in einer Konzentration von 1 mg/ml enthielt. Die Lösung wurde zur Sterilisation über einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 um filtriert. Das Filtrat wurde aseptisch in ein Röhrchen von jeweils 1 ml gegeben und lyophilisiert, um eine lyophilisierte Präparation herzustellen. Die Präparation wurde in destilliertem Wasser wieder aufgelöst und der Titer gegen Pseudomonas aeruginosa gemessen. Ihre Aktivität wurde beibehalten.
- Durch Verwendung der erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren oder in Kombination mit anderen menschlichen Antikörpern können ausgezeichnete prophylaktische und therapeutische Wirkungen gegen Pseudomonas aeruginosa- Infektionskrankheiten erzielt werden. Bemerkenswert bei der Erfindung ist, daß die Erfinder zum ersten Mal gefunden haben, daß Antigene, die von den einzelnen menschlichen monoklonalen Antikörpern erkannt werden, die eine Kreuzreaktivität zwischen Pseudomonas aeruginosa verschiedener Serotypen aufweisen, auf einer O-spezifischen Polysacccharidkette vorhanden sind, die eine Serotyp-spezifische Antigenstelle darstellt, und daß die menschlichen monoklonalen Antikörper prophylaktische und therapeutische Wirkungen gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten in einer extrem niedrigen Konzentration und Dosis aufweisen. Die Erfinder haben weiterhin gefunden, daß das Schutzspektrum erweitert werden kann durch Einzelverwendung und daß es eine solche daher ermöglicht, die Art der menschlichen monoklonalen Antikörper, die bei der Herstellung von Präparationen, die die menschlichen monoklonalen Antikörper für die O-Antigene von Pseudomonas aeruginosa enthalten, vermischt werden müssen, zu verringern.
- In der veröffentlichten, ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 155398/1986 wird der menschlichen monoklonale Antikörper beschrieben, der Reaktivität zeigt gegenüber Bakterien des Serotyps 2, 7 und 13 gemäß der Klassifizierung von Homma, jedoch werden alle Bakterien, die von dem monoklonalen Antikörper erkannt werden, gemäß der serologischen Klassifizierung von Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society und der Klassifizierung von Lanyi als zum selben Serotyp gehörig klassifiziert. Der menschliche monoklonale Antikörper wird als Antikörper betrachtet, der hauptsächlich den Unterstamm in demselben Serotyp erkennt, sich jedoch in der Eigenschaft von dem einzelnen menschlichen monoklonalen Antikörper unterscheidet, der Pseudomonas aeruginosa einer Vielzahl von verschiedenen Serotypen erkennt, auf die in der Erfindung Bezug genommen wird.
- Die Bezeichnung, zeigt Kreuzreaktivität zwischen Serotypen von Pseudomonas aeruginosa, wie gemäß der Erfindung verwendet, bezieht sich auf einen Fall, bei dem eine Vielzahl von Pseudomonas aeruginosa, mit denen ein menschlicher monoklonaler Antikörper Reaktivität zeigt, gemäß irgendeiner der bisher bekannten serologischen Klassifizierungen nicht zu nur einem Serotyp gehörig klassifiziert wird. Im Falle, daß eine Vielzahl von Pseudomonas aeruginosa, mit der ein menschlicher monoklonaler Antikörper Reaktivität zeigt, nur gemäß einer bestimmten serologischen Klassifizierung als zu einer Vielzahl von Serotypen gehörig klassifiziert wird, wird von einem solche Fall nicht behauptet, daß er eine Kreuzreaktivität zeigt zwischen den Serotypen von Pseudomonas aeruginosa, sondern dies zeigt, daß der menschliche monoklonale Antikörper hauptsächlich reaktiv ist mit Unterstämmen desselben Serotyps.
- Weiterhin versteht es sich von selbst, daß bei den erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörpern der Immunglobulintyp IgM oder IgG ist, aber auch IgA sein kann. Mikroorganismen (hinterlegt bei Fermentation Research Institute) wie erfindungsgemäß verwendet sind folgende:
- 1. FERM P-9745
- 2. FERM P-9750
- 3. FERM P-9751
- 4. FERM P-9752
- 5. FERM P-9753
- 6. FERM BP-1596
- 7. FERM BP-1598
- 8. FERM BP-1599
- 9. FERM BP-1600
Claims (14)
1. Menschlicher monoklonaler Antikörper, der in der Lage
ist, jeweils das O-Antigen zweier Serotypen von
Pseudomonas aeruginosa zu erkennen und gleichzeitig
damit zu reagieren, wobei die genannten zwei Serotypen
die Gruppen A und F, A und L, D und I sowie E und F
oder die Gruppen G und H darstellen.
2. Menschlicher monoklonaler Antikörper, der produziert
wird von FERM BP-1598, BP-1596, BP-1600, BP-1599,
P-9750, P-9745, P-9751, P-9753 oder P-9752.
3. Selbstreproduzierende Zelle, die in der Lage ist, einen
menschlichen monoklonalen Antikörper nach den
Ansprüchen 1 und 2 zu produzieren sowie eine Zellinie,
die sich von der genannten Zelle ableitet.
4. Selbstreproduzierende Zelle nach Anspruch 3 und eine
Zellinie, die sich von der genannten Zelle ableitet,
worin die genannte selbstreproduzierende Zelle eine
Epstein-Barr Virus-transformierte Zelle ist.
5. Selbsreproduzierende Zelle nach Anspruch 3 und eine
Zellinie, die sich von der genannten Zelle ableitet,
worin die selbstreproduzierende Zelle eine
Hybridomzelle ist.
6. Hybridomzelle nach Anspruch 5 und eine Zellinie, die
sich von der genannten Hybridomzelle ableitet, worin
die genannte Hybridomzelle ein Hybridom einer Zelle
ist, die die Fähigkeit zu unbegrenztem Wachstum
besitzt, und eine Antikörper-produzierende Zelle, die
sich vom Menschen ableitet.
7. Hybridom nach Anspruch 6 und eine von dem genannten
Hybridom abgeleitete Zellinie, worin die genannte zu
unbegrenztem Wachstum fähige Zelle eine Zelle ist, die
sich vom Menschen ableitet.
8. Hybridom nach Anspruch 6 und eine Zellinie, die sich
von dem genannten Hybridom ableitet, worin die genannte
zu unbegrenztem Wachstum fähige Zelle eine Zelle ist,
die sich vom Tier ableitet.
9. Hybridom nach den Ansprüchen 6 bis 8 und eine Zellinie,
die sich von dem genannten Hybridom ableitet, worin die
genannte Antiköper-produzierende Zelle ein normaler
Lymphocyt ist.
10. Hybridom nach den Ansprüchen 6 bis 8 und eine Zellinie,
die sich von dem genannten Hybridom ableitet, worin die
genannte Antikörper-produzierende Zelle eine
Virustransformierte Zelle ist.
11. Selbstreproduzierende Zelle von FERM BP-1598,
BP-1596, BP-1600, BP-1599, P-9750, P-9745, P-9751,
P-9753 oder P-9752 und eine sich davon ableitende
Zellinie.
12. Prophylaktisches und therapeutisches Präparat gegen
Pseudomonas aeruginosa-Infektionskrankheiten, umfassend
mindestens einen menschlichen monoklonalen Antikörper
nach den Ansprüchen 1 und 2.
13. Flüssige Zubereitung, umfassend mindestens einen
menschlichen monoklonalen Antikörper nach den
Ansprüchen 1 und 2.
14. Lyophilisierte Zubereitung, umfassend mindestens einen
menschlichen monoklonalen Antikörper nach den
Ansprüchen 1 und 2.
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