DE3722098C2 - Monoklonale Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Flagellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Anwendung immunologischer Techniken zur Bereitstellung neuer Materialien, die für die Diagnose und zur Behandlung bakterieller Infektionen brauchbar sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Produktion und die Anwendung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, Pseudomonas aeruginosa-Flagellen zu erkennen.

Erkrankungen durch gram-negative Bakterien und Komplikationen davon, beispielsweise Bakteriämie und Endotoxikose, sind die Ursache signifikanter Morbidität und Mortalität bei Humanpatienten. Dies gilt insbesondere für den gram-negativen Organismus Pseudomonas aeruginosa, von dem während der letzten 50 Jahre immer deutlicher erkannt wurde, daß er mit bakteriellen Infektionen, insbesondere Hospitalismus-Infektionen, im Zusammenhang steht.

Während der vergangenen Jahrzehnte waren Antibiotika die Therapie der Wahl, um gram-negative Erkrankungen unter Kontrolle zu bringen. Die andauernde hohe Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit gram-negativen bakteriellen Erkrankungen zeigt die Grenzen einer Antibiotikatherapie, insbesondere bei P. aeruginosa auf (siehe beispielsweise Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94: 196-199). Dies hat zur Suche nach alternativen Methoden, zur Verhütung und zur Behandlung derartiger Erkrankungen ge­ führt.

Eine in Betracht gezogene Methode ist die Stärkung des Immunsystems des Wirts durch aktive oder passive Immunisierung. Es wurde beispielsweise beobachtet, daß die aktive Immunisierung bei Menschen oder in Tierversuchen mit bakteriellen Gesamtzellvakzinen oder gereinigten Bakterien­ endotoxinen von P. aeruginosa zur Entwicklung spezifischer opsonisierender Antikörper führt, die hauptsächlich gegen die Determinanten auf den sich wiederholenden Oligosaccharid­ einheiten der Lipopolysaccharid (LPS)-Moleküle gerichtet sind, welche sich auf der äußeren Zellmembran von P. aeruginosa befinden (siehe Pollack M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B.M. and Finlayson, H.S., Hrsg., S. 73-79 U.S. Department of Health and Human Services, 1979). Es hat sich gezeigt, daß derartige Antikörper, gleich ob aktiv produziert oder passiv übertragen, schützend gegen die lethalen Effekte einer P. aeruginosa-Infektionen in vielen Tiermodellen (siehe oben Pollack) und in einigen vorläufigen Untersuchungen an Menschen wirken (siehe Young, L.S. und Pollack M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath L., Hrsg., S. 119-132, Hans Huber, 1980).

Die obigen Berichte zeigen, daß die Immuntherapie zur Ver­ hütung und Behandlung von durch P. aeruginosa verur­ sachten bakteriellen Erkrankungen verwendet werden kann, bei­ spielsweise durch Verabreichung von gepoolten Humanimmun­ globulinen, die Antikörper gegen den Infektionsstamm oder die Infektionsstämme enthalten. Humanimmunglobuline sind hier als derjenige Teil des fraktionieren Humanplasmas definiert, der auf Antikörper angereichert ist, unter denen sich spezifische Antikörper gegen P. aeruginosa-Stämme be­ finden. Aufgrund bestimmter inhärenter Grenzen bei der An­ wendung von Humanimmunglobulin-Komponenten befindet sich diese Art der Behandlung von durch P. aeruginosa verur­ sachten Erkrankungen noch im Stadium der Untersuchung (siehe beispielsweise Collins M.S. und Roby R.F., Am. J. Med., 76(3A): 168-174, (1984). Bisher gibt es noch keine Handels­ produkte auf der Basis derartiger Komponenten.

Eine Beschränkung für die Anwendung von Immunglobulin-Zusammen­ setzungen besteht darin, daß sie aus Pools von Proben von tausenden oder mehreren Spendern bestehen, wobei bei diesen Proben eine Vorauswahl im Hinblick auf die Anwesenheit be­ stimmter Anti-Pseudomonas-Antikörper getroffen wurde. Das Poolen führt zu einem gemittelten individuellen Antikörper­ titer, was bestenfalls zu einer mäßigen Erhöhung des Titers an gewünschten Antikörpern führt.

Eine weitere Beschränkung besteht darin, daß diese Voraus­ wahl ein teures, kontinuierliches Screening des Spender-Pools erfordert, um eine Konsistenz des Produktes sicher­ zustellen. Trotz aller Bemühungen können die Immunglobulin-Produkte von Probe zu Probe und unter den Produkten aus verschiedenen geographischen Zonen beträchtliche Unterschiede aufweisen.

Eine weitere Immunglobulin-Zusammensetzungen eigene Be­ schränkung besteht darin, daß ihre Anwendung die gleich­ zeitige Verabreichung großer Mengen fremder Proteinsub­ stanzen (die Viren enthalten können, beispielsweise die­ jenigen, die mit dem Acquired Immune Deficiency Syndrome oder AIDS im Zusammenhang stehen) zur Folge haben, welche nachteilige biologische Effekte auslösen können. Die ge­ ringen Titer an gewünschten Antikörpern und der hohe Gehalt von Fremdsubstanzen beschränken häufig die Menge an spezifischen und damit brauchbarem(n) Immunglobulin(en), die an Patienten verabreicht werden können, auf suboptimale Mengen.

1975 berichteten Kohler und Milstein ihre grundlegende Ent­ deckung, daß bestimmte Mäuse-Zellinien mit Mäusemilzzellen unter Bildung von Hybridomen fusioniert werden können, die alle Antikörper bestimmter Spezifität, d. h. monoklonale Antikörper, sekretieren (Kohler G. und Milstein C., Nature, 256: 495-497 (1975)). Mit dieser Technologie wurde es in einigen Fällen möglich, größere Mengen an Murin- Antikörpern zu produzieren, die hochspezifisch gegen eine bestimmte Determinante oder gegen bestimmte Determinanten auf Antigene sind. Anschließend wurde es unter Anwendung später entwickelter Technologien möglich, monoklonale Humanantikörper zu erzeugen (siehe z. B. US 4 464 465, auf die hiermit Bezug genommen wird).

In bestimmten Fällen können monoklonale Mäuse-Antikörper oder Zusammensetzungen derartiger Antikörper Probleme bei der Anwendung an Menschen mit sich bringen. Beispielsweise wurde berichtet, daß die Anwendung monoklonaler Mäuse-Anti­ körper bei Untersuchungen zur Behandlung bestimmter Human­ erkrankungen eine Immunantwort auslösen kann, die sie un­ wirksam macht (Levy R.L. und Miller R.A., Ann. Rev. Med., 34: 107-116 (1983)). Durch die kürzlich erzielten Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie, wie die Produktion von chimeren monoklonalen Mäuse/Human-Antikörpern, können diese Probleme verringert werden. Es stehen nun auch Methoden zur Produktion von monoklonalen Human-Antikörpern zur Verfügung (siehe Human Hybridomas und Monoclonal Antibodies, Engleman E.G., et al., Hrsg. Plenum Publishing Corp. (1985), auf die hiermit Bezug genommen wird).

Unter Verwendung der Hybridom- und/oder Zelltransformations- Technologie haben zahlreiche Arbeitsgruppen über die Produktion monoklonaler Antikörper berichtet, die gegen P. aeruginosa-Infektionen wirksam sind. Es wurden monoklonale Antikörper hergestellt, die mit verschiedenen Epitopen von P. aeruginosa reagieren, einschließlich einzel- und multiserotypischer, spezifischer Oberflächenepitope, wie die in LPS-Molekülen der Bakterien gefundenen (siehe bei­ spielsweise die USSN 734,624 und 807 394, auf die hiermit Bezug genommen wird). Es wurden auch monoklonale Antikörper hergestellt, die spezifisch gegen P. aeruginosa-Exotoxin A wirken (siehe beispielsweise USSN 742 170, auf die hiermit Bezug genommen wird).

Auch wenn die Anwendung monoklonaler Antikörper, die spezifisch auf den LPS-Bereich von P. aeruginosa oder gegen die Exotoxine der Bakterien wirken, in einigen Fällen aus­ reichenden Schutz bietet, ist es dennoch bevorzugt, ein breiteres Schutzspektrum zur Verfügung zu haben. Beispiels­ weise bei der prophylaktischen Behandlung potentieller In­ fektionen bei Menschen wäre es bevorzugt, einen Antikörper oder Antikörper zu verabreichen, die gegen mehrere P. aeruginosa-Stämme schützen. In ähnlicher Weise wäre es bei therapeutischen Anwendungen, wenn der (die) Serotyp(en) des (der) infizierenden Stammes (Stämme) nicht bekannt ist (sind), be­ vorzugt einen Antikörper oder eine Antikörperkombination zu verabreichen, die gegen die meisten, wenn nicht alle, der klinisch wichtigen P. aeruginosa-Serotypen wirksam sind, idealerweise in dem Antikörper zur Verfügung gestellt werden, die gemäß traditionellen Serotypenschemata reagieren.

Es wurde gezeigt, daß ein Aspekt der Physiologie von P. aeruginosa, der zur Virulenz des Organismus beiträgt, dessen Motilität ist, eine Fähigkeit, die hauptsächlich von der Anwesenheit eines Flagellums herrührt (siehe Montie T. et al (1982), Infect. and Immun., 38: 1296-1298). P. aeruginosa ist durch ein einzelnes Flagellum an einem Ende seiner stäbchenförmigen Struktur charakterisiert. Burned Mouse-Modelluntersuchungen haben ergeben, daß ein größerer Prozentsatz an Mäusen überlebt, wenn nicht-motile P. aeruginosa-Stämme in experimentell erzeugte Verbrennungen inokuliert werden als wenn motile Stämme verwendet werden (McManus A. et al (1980), Burns, 6: 235-239 und Montie T. et al (1982), Infect. and Immun., 38: 1296-1298). Weitere Untersuchungen über die Pathogenese von P. aeruginosa haben erbracht, daß Tiere, die mit Flagellen-Antigenpräparationen immunisiert wurden, geschützt wurden, wenn sie verbrannt und mit motilen Stämmen der Bakterien infiziert wurden (Holder I. et al., (1982), Infect. and Immun. 35: 276-280).

P. aeruginosa-Flagellen wurden mittels serologischer Methoden untersucht und es wurde gezeigt, daß sie in zwei Hauptantigen­ gruppen fallen, die von B. Lanyi (1970, Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung, 17: 34-48) als H1 und H2 und von R. Ansorg (1978, Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A, 242: 228-238) als Typ a und Typ b bezeichnet werden. Die serologische Typisierung der Flagellen durch beide Laboratorien zeigte, daß die H1-Flagellen (siehe B. Lanyi oben) oder die Flagellen vom Typ b (siehe Ansorg R. oben) serologisch einheitlich waren, d. h. es wurden keine Untergruppen identifiziert. Auf diesen serologisch ein­ heitlichen Flagellentyp wird als Typ b Bezug genommen. Die anderen Hauptantigene, die H2-Flagellen (siehe B. Lanyi oben) oder die Flagellen vom Typ a (siehe Ansorg R. oben) enthalten fünf Untergruppen. Auf dieses Antigen wird als Flagellen vom Typ a Bezug genommen und auf die fünf Untergruppen als a₀, a₁, a₂, a₃ und a₄. Die fünf Untergruppen vom Typ a werden in unter­ schiedlichen Kombinationen an unterschiedlichen Stämmen P. aeruginosa, die den Typ a aufweisen, mit Ausnahme des Anti­ gens a₀ exprimiert. Das a₀-Antigen wurde auf allen Flagellen vom Typ a gefunden, allerdings war das Ausmaß der Expression unter den Stämmen verschieden. Ein Serotypenschema, das auf den hitzestabilen, somatischen Hauptantigenen von P. aeruginosa basiert, wird als Habs-Schema bezeichnet, das kürzlich in das International Antigenic Typing System-Schema aufge­ nommen wurde (siehe Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33: 256 (1983)). Die Flagellentypen der P. aeruginosa-Habs-Re­ ferenzstämme wurden durch Immunfluoreszenz mit polyklonalen Sera (R. Ansorg (1978, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Orig. A, 242: 228-238) oder durch Slide-Koagglutination (Ansorg R. et al, 1984, J. Clin. Microbiol., 20: 84-88) charakterisiert. Die Habs-Stämme 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 und 12 sind Stämme, die Flagellen vom Typ b aufweisen und die Habs-Stämme 1, 6, 8 und 9 solche, die Flagellen vom Typ a aufweisen. Demnach könnte eine große Zahl von P. aeruginosa-Stämmen durch eine kleine Zahl an monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen Flagellenproteine sind, erkannt werden.

Harrison, J. S., et al. beschreiben in Infect. and Immun. 49: 770-774, 1985, Flagellen-Antigenpräparationen des a- und des b-Typs und ihre Schutzwirkung gegen P. aeruginosa-Infektionen in einem Burnt-Mouse-Modell.

Aus der EP-A-211 352 ist bekannt, ein Antikörper gegen P. aeruginosa Flagellin b in Form eines Kulturüberstandes bereitzustellen. Die Herstellung des Antikörpers wird nicht beschrieben; die Hinterlegungsnummer für diesen Antikörper wird nicht genannt.

Es besteht deshalb ein Bedürfnis nach monoklonalen Anti­ körpern, die in der Lage sind, mit Epitopen auf Flagellen­ proteinen zu reagieren und die in einigen Fällen auch einen Schutz gegen multiple Serotypen von P. aeruginosa schaffen. Darüber hinaus sollen diese Antikörper zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen sowie zur Diagnose derartiger Infektionen brauchbar sein. Diese Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Erfindungsgemäß werden neue Zellinien zur Verfügung gestellt, die monoklonale Antikörper produzieren können, welche in der Lage sind, an Flagellen zu binden, die bei den meisten Stämmen von P. aeruginosa-Bakterien vorhanden sind. Die monoklonalen Antikörper reagieren spezifisch mit Epitopen auf P. aeruginosa- Flagellen-Proteinen und können zwischen Bakterien Flagellen vom Typ a und Typ b unterscheiden. Das Verfahren zur Behandlung eines Menschen, bei dem die Gefahr einer P. aeruginosa-Infektion besteht oder der bereits damit in­ fiziert ist, besteht darin, daß man ihm eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge eines Mittels verabreicht, das wenigstens einen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon enthält, welche in der Lage sind, mit den Flagellen von P. aeruginosa-Stämmen zu reagieren, wobei das Mittel vorzugsweise auch einen physiologisch verträglichen Träger enthält. Das Mittel kann auch einen oder mehrere der folgenden Bestandteile enthalten: weitere monoklonale Anti­ körper, die in der Lage sind mit P. aeruginosa-Exotoxin A zu reagieren, monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, mit Serotyp-Determinanten auf dem LPS von P. aeruginosa zu reagieren, eine γ-Globulinfraktion aus Humanblutplasma, eine γ-Globulinfraktion aus Humanblutplasma, wobei das Plasma von Menschen erhalten wurde, die erhöhte Spiegel an Immunoglobulinen aufweisen, welche mit P. aeruginosa reagieren, und ein oder mehrere anti-mikrobielle Mittel. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die klinische An­ wendung der monoklonalen Antikörper sowie die Herstellung von Diagnose-Kits.

Erfindungsgemäß werden neue Zellinien, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu produzieren, und Mittel zur Ver­ fügung gestellt, die diese Antikörper enthalten, wobei die Mittel in der Lage sind, die bei vielen P. aeruginosa- Stämmen vorhandenen Flagellen selektiv zu erkennen und wo­ bei die jeweiligen Antikörper einen P. aeruginosa-Flagellen-Typ erkennen. Die erfindungsgemäßen Zellinien haben identifizierbare Chromosomen, bei denen die Keimbahn DNA da­ von oder von Prekursor-Zellen rearrangiert ist, so daß sie für einen Antikörper mit einer Bindungsstelle für ein Epitop auf einem Flagellenprotein, das bei bestimmten P. aeruginosa-Stämmen auftritt, kodiert. Für Flagellen­ proteine vom Typ a können pan-reaktive monoklonale Anti­ körper produziert werden, und bei Flagellenproteinen vom Typ b zählen zu den Antikörpern solche, die pan-reaktiv sind oder mit wenigstens ungefähr 70% der Flagellen auf­ weisenden Stämme reagieren. Diese monoklonalen Antikörper können auf vielfältige Weise verwendet werden, einschließ­ lich der Diagnose und Therapie.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind insbe­ sondere brauchbar für die Behandlung oder Propylaxe von schweren durch P. aeruginosa verursachten Erkrankungen. Die Oberflächenproteine bei den Flagellen von P. aeruginosa dürften in direkten Kontakt mit den Antikörpermolekülen kommen, so daß wahrscheinlich die Motilität der Organismen inhibiert und/oder weitere für den infizierten Wirt nützliche Effekte ermöglicht werden.

Die Herstellung der monoklonalen Antikörper kann dadurch er­ folgen, daß man eine Zellinie immortalisiert, die in der Lage ist, Nukleinsäuresequenzen zu exprimieren, die für Antikörper kodieren, welche spezifisch für ein Epitop auf den Flagellenproteinen vieler P. aeruginosa-Stämme sind. Die immortalisierte Zellinie kann eine Säugetierzellinie sein, die durch Onkogenese, Transfektion, Mutation oder der­ gleichen transformiert wurde. Dazu zählen Myelomlinien, Lymphomlinien und weitere Zellinien, die in der Lage sind, die Expression und Sekretion von Immunglobulin oder einem Bindungsfragment davon in vitro zu fördern. Das Immun­ globulin oder das Fragment davon kann ein natürlich vor­ kommendes Immunglobulin eines Säugetiers sein, das nicht die üblicherweise bevorzugte Herkunft von Maus oder Mensch hat, hergestellt durch Transformation eines Lymphozyten, insbe­ sondere eines Splenozyten, mit Hilfe eines Virus oder durch Fusion des Lymphozyten mit einer neoplastischen Zelle, z. B. einem Myelom, die eine Hybridzellinie erzeugt.

Typischerweise erhält man den Splenozyten aus einem Tier, das gegen Flagellen-Antigene oder Fragmente davon, die ein Epitop aufweisen, immunisiert ist. Immuni­ sierungsvorschriften sind bekannt, sie können beträchtlich variieren, aber dennoch wirksam bleiben (siehe Golding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, N.Y. (1983), worauf hiermit Bezug genommen wird).

Die Hybridzellinien können gemäß üblicher Techniken kloniert und gescreent sein. In den Zellüberständen sind Antikörper nachweisbar, die in der Lage sind, an P. aeruginosa-Flagellen-Determinanten zu binden. Die be­ treffenden Hybridzellinien können dann in großem Maßstab kultiviert oder in die Peritonealkavität eines Wirtes zur Produktion von Ascitesflüssigkeit injiziert werden.

Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Zellen transformierte Humanlymphozyten, die monoklonale Humanantikörper produzieren, die vorzugsweise in vivo Schutzwirkung gegen zugängliche Epitope besitzen, welche gegen wenigstens ein Flagellenprotein spezifisch sind. Die Lymphozyten können von Humanspendern erhalten werden, die den entsprechenden P. aeruginosa-Stämmen mit Flagellen ausgesetzt sind oder ausgesetzt wurden. Das bevor­ zugte Zell-Transformationsverfahren ist detailliert in der US-PS 4,464,465 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper, die gegen Flagellen-Proteinespezifisch sind, können in manchen Fällen die Überstände nachfolgender Experimente in einem Competition-Assay einem Screening mit anderen monoklonalen Antikörpern unterzogen werden, um weitere Beispiele für monoklonale Anti-Flagellen-Antikörper zu identifizieren. Die Hybridzellinien können somit leicht aus einer Vielzahl von Quellen hergestellt werden, weil die erfindungsgemäßen, gegen bestimmte Flagellen-Antigene spezifischen Antikörper zur Verfügung stehen.

Soweit Hybridzellinien zur Verfügung stehen, die Antikörper produzieren, welche spezifisch gegen die betreffenden Epitopbereiche sind, können diese Hybridzellinien in alternativer Weise mit anderen neoplastischen B-Zellen fusioniert werden, wobei die anderen B-Zellen als Empfänger für die Genom-DNA dienen, die für die Rezeptoren kodiert. Neoplastische B-Zellen von Nagetieren, insbesondere Murin­ zellen, werden am häufigsten verwendet, es können jedoch auch Zellen von anderen Säugetierarten, beispielsweise Lagomorpha, Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Affe oder der­ gleichen verwendet werden.

Die monoklonalen Antikörper können aus jeder Immun­ globulinklasse oder -unterklasse sein, beispielsweise IgM, IgD, IgA, IgE oder Unterklassen von IgG, welche für jede Tierart bekannt sind. Die monoklonalen Antikörper können im allgemeinen intakt oder als Bindungsfragmente, wie Fv, Fab, F(ab')₂, üblicherweise jedoch intakt ver­ wendet werden.

Die erfindungsgemäßen Zellinien können nicht nur für die direkte Produktion monoklonaler Antikörper verwendet werden. Die Zellinien können mit anderen Zellinien (wie in ge­ eigneter Weise mit Wirkstoffen markierte Humanmyelom-, Mausmyelom- oder Humanlymphoplastoidzellen) zur Herstellung von Hybridomen fusioniert werden. Sie sorgen somit für den Transfer der für die monoklonalen Antikörper kodierenden Gene. Alternativ kann man die Zellinien als Quelle für die für Immunglobuline kodierenden Chromasomen verwenden, welche isoliert und mittels anderer Techniken als Diffusionstechnik, auf Zellen transferiert werden können. Darüber hinaus können die für die monoklonalen Antikörper kodierenden Gene isoliert und anhand rekombinanter DNA-Techniken zur Produktion der spezifischen Immunglobuline in verschiedenen Wirten eingesetzt werden. Insbesondere kann durch Herstellung von cDNA-Libraries aus Messenger-RNA ein einzelner cDNA-Klone, der für das Immunglobulin kodiert und frei von Intronen ist, isoliert und in geeignete prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren ge­ bracht und anschließend zur Herstellung in größeren Mengen in einen Wirt transformiert werden (siehe allgemein US-Nrn. 4,172,124, 4,350,683, 4,363,799, 4,381,292 und 4,423,147, siehe auch Kennett et al., Monoclonal Anti­ bodies, Plenum, New York (1980), sowie die darin zitierten Referenzen, auf die hiermit alle Bezug genommen wird).

Gemäß der Hybrid-DNA-Technologie können die erfindungsge­ mäßen Immunglobuline oder die Fragmente davon insbesondere in Bakterien oder Hefen produziert werden (siehe Boss et al., Nucl. Acid. Res., 12: 3791 und Wood, worauf hiermit Bezug genommen wird). Beispielsweise die Messenger-RNA, die transkribiert wurde aus den Genen, die für die leichten und schweren Ketten der monoklonalen Antikörper kodieren, welche mit Hilfe einer erfindungsgemäßen Zellinie produziert wurden, kann man mittels differentieller cDNA-Hybridisierung unter Anwendung von cDNA aus BALB/c-Lymphozyten, die sich von dem in Rede stehenden Klone unterscheiden, isolieren. Die mRNA, die nicht hybridisiert, ist reich an Messages, die für die gewünschten Immunglobulinketten kodieren. Falls erforderlich, kann dieses Verfahren wiederholt werden, um die gewünschten mRNA-Spiegel zusätzlich zu erhöhen. Die subtrahierte mRNA-Zusammensetzung kann dann zur Bereit­ stellung einer cDNA-Mischung, die reich an den gewünschten Sequenzen ist, revers transkribiert werden. Die RNA kann mit einer geeigneten RNase hydrolysiert und ssDNA mit DNA-Polymerase I und Random Primers, z. B. random-fragmentierte Kalbsthymus-DNA, doppelsträngig gemacht werden. Die er­ haltene dsDNA kann dann durch Insertion in einen geeigneten Vektor, z. B. Virusvektoren, wie Lambdavektoren oder Plasmid­ vektoren (wie pBR322, pACYC184 und dergleichen) kloniert werden. Mit Hilfe von Sonden auf Basis bekannter Sequenzen für die konstanten Bereiche der leichten und schweren Ketten können diejenigen cDNA-Klone durch Hybridi­ sierung identifiziert werden, welche das für die ge­ wünschten leichten und schweren Ketten kodierende Gen be­ sitzen. Danach kann man die Gene aus den Plasmiden ausschneiden, zur Entfernung überflüssiger DNA upstream vom Initiationscodon oder der DNA konstanter Bereiche manipulieren und schließlich in einen geeigneten Vektor für die Transformation in einen Wirt und die Expression des Gens einführen.

Zweckmäßigerweise verwendet man Säugetierwirte, beispiels­ weise Mäusezellen, um die Ketten zur Produktion eines intakten Immunglobulins zu prozessieren (z. B. die schweren und leichten Ketten zu verbinden), und um darüber hinaus ge­ wünschtenfalls das Immunglobulin zu sekretieren, das frei an Leader-Sequenz ist. Alternativ kann man einzellige Mikroorganismen zur Produktion der beiden Ketten ver­ wenden, wobei eine weitere Manipulation erforderlich sein kann, um die DNA-Sequenzen zu entfernen, die für die sekretorischen Leader-und Processing-Signale kodieren und wobei man eine Initiationscodon am 5'-Terminus der für die schwere Kette kodierenden Sequenz vorsieht. Auf diese Weise können die Immunglobuline hergestellt und prozessiert werden, um in andere als Säugetierzellen ge­ bracht und glykosiliert zu werden. Falls gewünscht, kann jede der Ketten gekürzt werden, so daß wenigstens die variablen Bereiche erhalten bleiben. Diese Bereiche können dann zur Herstellung anderer Immunglobuline oder Fragmente davon, welche für die Flagellenepitope spezifisch sind, manipuliert werden.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind be­ sonders nützlich, weil sie für Antigene beinahe aller gegenwärtig bekannten P. aeruginosa Varianten spezifisch sind. Einige der monoklonalen Antikörper besitzen auch in vivo Schutzwirkung, so daß sie pharmazeutischen Produkten inkorporiert werden können, beispielsweise Antikörperkombinationen gegen bakterielle Infektionen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können auch in vitro vielfältig angewandt werden. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur Typisierung von Mikro­ organismen, zur Isolierung spezifischer P. aeruginosa- Stämme, zur selektiven Entfernung von P. aeruginosa-Zellen in einer heterogenen Zellmischung und dergleichen Anwendung finden.

Für Diagnosezwecke kann man die monoklonalen Antikörper entweder markiert oder unmarkiert einsetzen. Diagnose-Assays umfassen den Nachweis einer Komplexbildung durch die Bindung eines monoklonalen Antikörpers an das Flagellum eines P. aeruginosa-Organismus. Wenn die Anti­ körper unmarkiert vorliegen, finden sie im Agglutinations- Assay Anwendung. Darüber hinaus kann man unmarkierte Anti­ körper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern einsetzen (Sekundärantikörper), die mitten monoklonalen Antikörpern reagieren, beispielsweise für Immunglobulin spezifische Antikörper. Alternativ können die monoklonalen Antikörper direkt markiert werden. Man kann eine große Zahl an Produkten zur Markierung (Labels) verwenden, beispiels­ weise Radionuklide, fluoreszierende Verbindungen, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymkofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) und dergleichen. Zahlreiche Immuno-Assay-Typen stehen zur Verfügung, beispielsweise sind einige in den US-PSen 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 und 4,098,876 beschrieben. Auf diese Patentschriften wird hiermit Bezug genommen.

Üblicherweise werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in Enzym-Immunoassays verwendet, wobei die frag­ lichen Antikörper oder Sekundärantikörper ver­ schiedener Art an ein Enzym konjugiert sind. Wenn man eine Probe, die P. aeruginosa eines bestimmten Serotyps, wie Humanblut oder ein Lysat davon enthält, mit den be­ treffenden Antikörpern kombiniert, erfolgt eine Bindung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen, die das gewünschte Epitop aufweisen. Derartige Zellen kann man dann von den ungebundenen Reagenzien abtrennen und einen Sekundärantikörper (mit einem Enzym markiert) zugeben. Anschließend wird die Anwesenheit des Antikörper-Enzym­ konjugats, das spezifisch an die Zellen gebunden ist, be­ stimmt. Man kann jedoch auch andere übliche, dem Fachmann bekannte Techniken verwenden.

Man kann Kits unter Anwendung der fraglichen Antikörper zum Nachweis von P. aeruginosa in Lösung oder zum Nachweis der Anwesenheit von P. aeruginosa-Flagellen-Antigene zur Verfügung stellen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Anti­ körperzusammensetzungen können, üblicherweise in Lyophilisier­ ter Form, entweder allein oder zusammen mit weiteren Anti­ körpern, die spezifisch für andere gram-negative Bakterien sind, vorliegen. Die Antikörper, die an ein Label konjugiert oder unkonjugiert sein können, sind in den Kits zusammen mit Puffern, wie Tris-, Phosphat-, Carbonat­ puffer und dergleichen, Stabilisierungsmitteln, Bioziden, inerten Proteinen, z. B. Rinderserumalbumin oder dergleichen enthalten. Im allgemeinen liegen diese Materialien in einer Menge von weniger als ungefähr 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge an aktiven Antikörpern und üblicherweise in einer Gesamtmenge von wenigstens ungefähr 0,001 Gew.-%, ebenfalls bezogen auf die Antikörperkonzentration,vor. Es ist häufig wünschenswert, einen inerten Extender oder Excipienten mit einzubeziehen, um die Wirkstoffe zu verdünnen, wobei der Excipient ungefähr 1 bis 99 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung ausmachen kann. Wenn ein Sekundärantikörper zur Anwendung kommt, der in der Lage ist, an die monoklonalen Antikörper zu binden, so wird dieser üblicherweise in einem separaten Vial vorliegen. Der Sekundärantikörper (zweiter Antikörper) ist typischerweise an ein Label konjugiert und analog wie die oben beschriebene Antikörperzusammensetzungen formuliert.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, insbesondere die monoklonalen Humanantikörper, kann man auch als Komponenten pharmazeutischen Mitteln einverleiben, die dann eine therapeutische oder prophylaktische Menge wenigstens eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers mit einem pharmazeutisch effektiven Träger enthalten. Als pharma­ zeutischer Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische Substanz dienen, die geeignet ist, die monoklonalen Anti­ körper an den Patienten weiterzugeben. Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe kann man als Träger verwenden. Man kann den pharmazeutischen Mitteln auch pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien (Puffer, Dispergier­ mittel) einverleiben. Die Mittel können einen einzelnen monoklonalen Antikörper enthalten, so daß sie spezifisch für Stämme eines Flagellentyps von P. aeruginosa sind. Alter­ nativ können die pharmazeutischen Mittel zwei oder mehrere monoklonale Antikörper enthalten und einen "Cocktail" bilden. Ein Cocktail, der monoklonale Antikörper gegen beiden Flagellentypen oder gegen Gruppen verschiedener P. aeruginosa- Stämme (z. B. verschiedene Serotypen) enthält, ist ein uni­ versell einsetzbares Produkt mit Aktivität gegen die meisten klinischen Isolate dieses Bakteriums.

Das Molverhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörper­ komponenten unterscheidet sich üblicherweise nicht stärker als um den Faktor 10, insbesondere um nicht mehr als den Faktor 5. Es beträgt üblicherweise ungefähr 1 : 1-2 auf jede der anderen Antikörperkomponenten.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kann man auch in Kombination mit bereits vorhandenen Blutplasmaprodukten, wie im Handel erhältliche γ-Globulin- und Immunglobulin­ produkte, welche man zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von P. aeruginosa-Erkrankungen beim Menschen ver­ wendet, einsetzen. Für Immunglobuline erhält man das Plasma vorzugsweise von Humanspendern, die erhöhte Spiegel an Immunglobulinen aufweisen, welche mit P. aeruginosa reagieren (siehe allgemein das Compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med. 76(3a), 30.03.1984, S. 1-231, auf das hiermit Bezug genommen wird).

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kann man als separat zu verabreichende Zusammensetzung verwenden, welche man zusammen mit Antibiotika oder anti-mikrobiellen Mittel gibt. Die anti-mikrobiellen Mittel können typischerweise ein anti­ pseudomonal wirkendes Penicillin (z. B. Carbenicillin) zu­ sammen mit einem Aminoglykosid (z. B. Gentamycin, Tobramycin oder dergleichen) enthalten, man kann jedoch auch zahlreiche andere Produkte (z. B. Cephalosporine), die dem Fachmann be­ kannt sind, verwenden.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und pharma­ zeutischen Mittel sind insbesondere zur oralen oder par­ enteralen Verabreichung geeignet. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Mittel parenteral, d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös, verabreicht. Die Erfindung stellt deshalb auch Mittel zur parenteralen Verabreichung zur Verfügung, die eine Lösung der monoklonalen Antikörper oder eines Cocktails davon in einem verträglichen Träger, vorzugsweise einem wäßrigen Träger, enthalten. Zahlreiche wäßrige Träger können Anwendung finden, z. B. Wasser, ge­ puffertes Wasser, 0,4%-ige Kochsalzlösung, 0,3%-iges Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von Teilchen. Man kann die Mittel anhand üblicher bekannter Sterilisationsverfahren sterilisieren. Die Mittel können übliche pharmazeutische Hilfsstoffe ent­ halten, um sie annähernd den physiologischen Bedingungen anzupassen, beispielsweise pH regulierende Mittel und Puffer, die Toxizität regulierende Mittel und dergleichen, z. B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calcium­ chlorid, Natriumlactat usw. Die Menge an Antikörper in diesen Formulierungen kann stark variieren, d. h. von weniger als ungefähr 0,5%, üblicherweise 1% oder mindestens etwa 1%, bis 15 oder 20 Gew.-%. Die Menge wird ausgewählt, hauptsächlich in Abhängigkeit von den Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten und dergleichen und vorzugsweise von der jeweiligen Verabreichungsart.

Ein typisches pharmazeutisches Mittel zur intramuskulären Injektion wird so formuliert, daß es 1 ml steriles ge­ puffertes Wasser und 50 mg an monoklonalen Antikörpern enthält. Ein typisches Mittel zur intravenösen, Infusion wird so formuliert, daß es 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg monoklonale Antikörper enthält. Methoden zur Herstellung parenteral verabreichbarer Mittel sind be­ kannt oder dem Fachmann geläufig und sind näher beispiels­ weise in Remington's Pharmaceutical Science, 15 th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) be­ schrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können zur Lagerung lyophilisiert und vor Gebrauch in einem geeigneten Träger rekonstituiert werden. Dieses Verfahren ist bei üblichen Immunglobulinen effektiv, wobei bekannte Lyophiliserungs- und Rekonstitutionsmethoden verwendet werden können. Der Fachmann ist sich darüber im klaren, daß die Lyophilisierung und Rekonstitution zu einem unter­ schiedlichen Verlust an Antikörperaktivität führen kann (bei üblichen Immunglobulinen neigen die IgM-Antikörper zu einem größeren Aktivitätsverlust als die IgG-Anti­ körper) und daß die zur Anwendung kommenden Mengen ange­ paßt werden müssen, um den Verlust zu kompensieren.

Die Mittel, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Anti­ körper oder einem Cocktail enthalten, können zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen verabreicht werden. Bei der therapeutischen Verabreichung werden die Mittel einem bereits mit einem oder mehreren P. aeruginosa-Serotypen infizierten Patienten in einer Menge verabreicht, die aus­ reicht, um die Infektion und die damit verbundenen Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zu stoppen. Eine Menge, die diesem Zweck genügt, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Die für diesen Zweck geeigneten Mengen hängen ab von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten, sie liegen im allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 200 mg Antikörper pro kg Körpergewicht, wobei man üblicherweise Dosierungen von 5 bis 25 mg pro kg ver­ wendet. Es ist zu beachten, daß die erfindungsgemäßen Produkte im allgemeinen bei schweren Krankheitszuständen verwendet werden, d. h. in durch P. aeruginosa-hervorge­ rufenen lebensbedrohenden oder potentiell lebensbe­ drohenden Situationen, insbesondere bei Bakteriämie und Endotoxikose.

Zur prophylaktischen Verabreichung werden die Mittel, die die erfindungsgemäßen Antikörper oder einen Cocktail davon ent­ halten, einem Patienten verabreicht, der noch nicht mit P. aeruginosa infiziert ist, um die Widerstandskraft des Patienten gegen derartige potentielle Infektionen zu stärken. Eine für diese Zwecke entsprechende Menge ist als "prophylaktisch wirksame Dosis" bezeichnet. Auch bei diesem Anwendungszweck hängen die genauen Mengen ab vom Gesund­ heitszustand des Patienten und der allgemeinen Verfassung des Immunsystems, sie liegen im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 25 mg pro kg, insbesondere 0,5 bis 2,5 mg pro kg.

Man kann Einzel- oder Mehrfachverabreichungen der Mittel vor­ nehmen, wobei die Dosierung und der Verabreichungsplan vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge an er­ findungsgemäßen Antikörper(n) zur Verfügung stellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln oder um eine wirksame Prophylaxe vorzunehmen.

Beispiel 1

Beispiel 1 erläutert die zur Herstellung eines monoklonalen, spezifisch an P. aeruginosa-Flagellen bindenden Murinanti­ körpers verwendete Methode.

3 Monate alte BALB/c-Mäuse immunisiert man intraperitonial 8 × mit lebensfähigen P. aeruginosa-Fisher-Immuntyp 1 und Fisher-Immuntyp 2-Bakterien (ATCC, Hinterlegungsnrn. #27312 und #27313) alle 1 bis 2 Wochen für einen Zeitraum von insgesamt 9 Wochen. Die Bakterien-Anfangsdosis ist 8 × 10⁶ und 1 × 10⁷ Organismen pro Maus an P. aeruginosa-Fisher-Immuntyp 1 bzw. Fisher-Immuntyp 2. Die Dosierung erhöht man um das 30- bis 60-fache im Laufe der Immunisierung. 3 Tage nach der letzten Injektion entfernt man die Milz einer Maus aseptisch und bereitet eine einzelne Zellsuspension durch leichtes Rotieren des Organs zwischen den Enden von zwei sterilen Glasobjektträgern. Mononukleare Milzzellen kombiniert man in einem Verhältnis von 4 : 1 mit Log-Phasen-Mausmyelomzellen (NSI-1, erhalten von Dr. C. Milstein, Molecular Research Council, Cambridge, England) und fusioniert sie zur Herstellung von Hybridomen gemäß dem von Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36: 1042-1053) be­ schriebenen Verfahren. Die endgültige Hybridzellsuspension verdünnt man auf eine Konzentration von 1,5 × 10⁶ Zellen pro ml in RPMI-Hybrid-HAT [RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY), das 15% hitzeinaktivertes, fötales Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 100 µg/ml Penicillin und Streptomycin, 1 × 10^-4 Hypoxanthin, 4,0 × 10^-7 Aminopterin und 1,6 × 10^-5 M Thymidin enthält], das 2,0 × 10^-6 pro ml frisch herge­ stellter BALB/C-Thymocyten als Feederzellen enthält.

Die Mischung wurde auf 96-Well-Platten (Nr. 3596, Costar, Cambridge, MA) gegeben (200 µl pro Well). Die Kulturen versorgt man, indem man 50% des Volumens jeder Vertiefung entfernt und mit frischem RPMI-Hybrid-HAT alle 2 bis 3 Tage ersetzt. Die Kulturüberstände werden auf die An­ wesenheit von Anti-P-aeruginosa-Antikörpern mittels des Enzym-linked Immunosorbant-Assays (ELISA) untersucht, wenn das Zellwachstum ungefähr 40% Konfluenz in den Vertiefungen erreicht hat, was üblicherweise innerhalb von 7-10 Tagen der Fall ist.

Die Kulturüberstände der Hybridzellen werden gleichzeitig einem Assay auf Außenmembranpräparationen von jedem der beiden Immunisierungsbakterien unterzogen. Die Außen­ membranpräparationen isoliert man mittels einer Modifizierung der Methode von Tam et al (1982, Infect. Immun., 36: 1042-1053), auf die hiermit Bezug genommen wird. Die Bakterien (P. aeruginosa Fisher-Immuntyp 1 und Fisher-Immuntyp 2) inokuliert man in Trypticase-Soyabrühe (TSB) und läßt sie 16 bis 18 h bei 34°C aerobisch in einer Wirbelbad­ vorrichtung (gyratory shaker bath) wachsen. Die Bakterien erntet man durch Zentrifugieren und wäscht sie 2 × mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄.7 H₂O, 1,5 mM KH₂PO₄, PH 7,2), die 150 Trypsin inhibierende Einheiten (T.I.U.) Aprotinin (Sigma, St. Louis, MO) enthält.

Die Pellets aus dem abschließenden Zentrifugieren sus­ pendiert man erneut in 0,17 M Triethanolamin, 20 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und homo­ genisiert dann 10 Min. auf Eis. Das Debris wird aus dem Homogenat bei 14.900 × g pelletisiert und verworfen. Der Überstand wird erneut wie oben beschrieben zentri­ fugiert. Der Rückstand wird erneut verworfen und die Membranen werden aus dem Überstand durch einstündiges Zentrifugieren bei 141.000 × g pelletisiert. Der Überstand wird verworfen und die Membranpellets werden über Nacht bei 4°C in 10 ml PBS, die 75 T.I.U. Aprotinin pro ml enthält, aufbewahrt. Am nächsten Tag werden die Pellets durch Ver­ wirbeln erneut suspendiert und anschließend in aliquote Teile aufgeteilt und bei -70°C aufbewahrt. Der Protein­ gehalt wurde jeweils anhand der Methode von Lowry et al. (1951, J. Biol. Chem., 193: 265-275) bestimmt.

Die Antigenplatten für den ELISA werden folgendermaßen her­ gestellt: Die Außenmembranpräparationen werden auf 5 µg pro ml Protein in PBS verdünnt und 50 µl der Lösungen werden in jede Vertiefung von 96-Well-Platten (Linbro Nr. 76-031-05, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA) gegeben, verschlossen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Man nimmt ungebundenes Antigen aus den Platten heraus und gibt 100 µl 5%-iges Rinderserumalbumin (G/V; BSA) in PBS in jede Vertiefung und inkubiert die Platten 1 h bei 37°C.

Nach Herausnehmen von unadsorbiertem BSA führt man mit den Kulturüberständen (50 µl) aus jeder Vertiefung der Fusions­ platten eine Replica-Plattierung in die entsprechenden Ver­ tiefungen von Antigenplatten durch und inkubiert 30 Min. bei 37°C. Man nimmt ungebundene Antikörper aus den Vertiefungen und wäscht die Platten 3 × mit 100 µl 1%-igem (G/V) BSA-PBS pro Vertiefung. Anschließend gibt man 50 µl pro Ver­ tiefung an geeignet verdünntem, biotinyliertem Ziege-Anti-Maus-IgG (Tago, Inc., Burlingame, CA) in jede Vertiefung und inkubiert 30 Min. bei 37°C. Man wäscht die Platten 3 × wie oben beschrieben und gibt dann 50 µl eines vorbe­ reiteten Avidin: biotinylierten Meerettich-Peroxidase-komplexes (Vectastain ABC Kit, Vector Laboritories, Inc., Burlingame, CA), hergestellt nach den Spezifikationen des Herstellers, zu jeder Vertiefung. Nach 30 Min. bei Raum­ temperatur nimmt man das Vectastain-Reagenz aus den Vertiefungen, wäscht die Vertiefungen wie oben beschrieben und gibt dann 100 µl pro Vertiefung eines Substrates, o-Phenylendiamin (0,8 mg/ml in 0,1 M Citratpuffer, pH 5,0, gemischt mit dem gleichen Volumen 0,03% (V/V) H₂O₂) zu. Das Substrat in­ kubiert man 30 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln, die Reaktion beendet man dann durch Zugabe von 50 µl pro Ver­ tiefung 3N H₂SO₄.

Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper sekretieren, welche an die beiden Antigenpräparationen binden, ermittelt man durch Bestimmung der Adsorption bei 490 nm für die colorimetrischen Reaktionen in jeder Vertiefung an einem Dynatech Model 580 MikroELISA-Reader (Alexandria, VA). Die Zellen in einer Vertiefung, bezeichnet als Pa3 IVC2, produzieren Antikörper, die nur an das Fisher-Immuntyp 2-Antigen binden. Diese Vertiefung wird wie nachfolgend be­ schrieben noch näher untersucht. Die monoklonalen Anti­ körper und die klonale Zellinie aus dieser Vertiefung werden im folgenden beide anhand der Bezeichnung Pa3 IVC2 identifi­ ziert. Pa3 IVC2-Zellen aus der Master well werden mini­ kloniert und kloniert mittels Grenzverdünnungsmethode, die von Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36: 1042-1053) beschrieben wurde.

Ascitesflüssigkeit, die einen hohen Titer an monoklonalen Antikörpern enthält, stellt man in CB6F₁-Mäusen (BALB/c (weibl.) × C57BL/6 (männl.) F₁) gemäß dem von Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36: 1042-1053) beschriebenen Ver­ fahren her. 2 bis 3 Monate alten männlichen CB6 F₁-Mäusen injiziert man intraperitoneal 0,5 ml Pristan (2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) 10 bis 21 Tage vor einer intraperitonealen Injektion mit Log-Phasen-Pa3 IVC2-Zellen in RPMI. Jeder Maus injiziert man dann 0,5 bis 1 × 10^-7 Zellen in 0,5 ml. Nach ungefähr 2 Wochen entfernt man die angesammelte Flüssigkeit alle 2 bis 3 Tage von jeder Maus. Die Antikörperkonzentration in der Ascitesflüssigkeit bestimmt man mittels Agarose-Gel-Elektrophorese (Paragon, Beckmann, Instruments, Inc., Brea, CA). Alle Asciten, die 5 mg/ml oder mehr an Antikörpern enthalten, vereinigt man zu einem Pool, stellt aliquote Teile her und gefriert sie bei -70°C.

Charakterisierung des Molekulartargets, das durch die monoklonalen Antikörper gebunden ist

Der Kulturüberstand aus der klonierten Pa3 IVC2-Zell­ linie wird mittels ELISA einem Assay, wie oben beschrieben, an Außenmembranpräparationen von allen sieben P. aeruginosa-Fisher-Immuntyp-Stämmen (ATCC 27312 bis 27318), P. aerofaciens (ATCC 13985) und Klebsiella pneumoniae (ATCC 8047), die alle wie oben beschrieben hergestellt wurden, unterzogen. Die Antikörper Pa3 IVC2 binden an die Außenmembranpräparationen von P. aeruginosa- Fisher-Immuntypen 2, 6 und 7, nicht aber an die anderen Fisher-Immuntypen, P. aureofaciens oder K. pneumoniae.

Die durch die Antikörper Pa3 IVC2 identifizierten spezifischen Antigene wurden mittels Radioimmunpräzipitation identifiziert. Diese Analysemethode umfaßt das Inkubieren radiomarkierter Antigene mit Pa3 IVC2-Antikörper und einer bestimmten Protein-A-Quelle,was zur Bildung unlöslicher Antikörper:Antigenkomplexe führt. Diese Komplexe wäscht man, um nicht-spezifisch gebundene Antigene zu entfernen. Anschließend werden die Komplexe dissoziiert und an einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die vorherrschende, in dem Gel gefundene radioaktive Spezies wird dabei als das ent­ sprechende Antigen (die entsprechenden Antigene) identifiziert, an das (die) der Antikörper Pa3 IVC2 bindet.

Aliquote Teile (25 µg) von Außenmembranpräparationen lös­ licher P. aeruginosa-Fisher-Immuntypen 2, 3, 4 und 5 werden in fester Phase mit 125 J unter Verwendung von Iodo-gen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker und Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 849-857; Markwell und Fox, 1978, Biochemistry, 17: 4807-4817) radiomarkiert. Dieses Verfahren führt zur Iodierung exponierter Tyrosin­ reste der meisten, wenn nicht aller Proteine, die in den Außenmembranpräparationen vorhanden sind.

Um die nicht-spezifische Bindung der Außenmembran-Antigene an die Antikörper Pa3 IVC2 zu verringern, werden die radio­ markierten Präparationen (5 × 10⁶ Counts pro Min. pro Assay) zunächst 1 h bei 4°C mit BALB/c normalem Mäuseserum (1 : 40 endgültiger Verdünnung) inkubiert. Pa3 IVC2 Kulturüberstand (0,5 ml), der die Pa3 IVC2-Antikörper enthält, wird an­ schließend zu jeder Außenmembranprobe gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation des Antigens und des Antikörpers bei 4°C gibt man die Protein A-Quelle, IgGSORB (0,095 ml pro Probe) (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) zu und inkubiert weitere 30 Min. bei 4°C (Kessler, S.W., 19875, J. Immunol., 115: 1617-1622). IgGSORB stellt man her gemäß den Spezifikationen des Herstellers und unmittelbar vor Ge­ brauch verhindert man nicht-spezifische Reaktionen durch Blockieren potentiell reaktiver Bereiche mit Kulturmedium, indem man das IgGSORB zweimal mit RPMI-Hybrid (RPMI-Hybrid- HAT-Medium unter Ausschluß von HAT) wäscht.

Die Antigen-Antikörper-IgGSORB-Komplexe pelletiert man 10 Min. bei 4°C und bei 1500 × g, wäscht 2 × mit Phosphat- RIPA-Puffer (10 mM Phosphat, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 1,0% (V/V) Triton X-100, 1,0% (W/V) Natriumdeoxycholat, 0,1% (W/V) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1,0% (V/V) Aprotinin, 2 × mit Puffer mit hohem Salzgehalt (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 M LiCl, 1% (V/V) β-Mercapto­ ethanol), und 1 × mit Lysepuffer (0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,05 M NaCl, 0,05% (V/V) Nonidet P-40 (Rohrschneider et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4479-4483. Das an den Komplex gebundene Antigen setzt man durch 10-minütiges Inkubieren bei 95°C mit Probenpuffer (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% (W/V) SDS, 2% (V/V) β-Mercapto­ ehtanol und 20% (V/V) Glycerin) frei und sammelt sie im Überstand nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 1500 × g.

Die Überstände wurden dann auf 14%-iges Polyacrylamidgel gegeben, das SDS enthält, welches gemäß dem von B.

Lugtenberg et al (1978, FEBS Lett. 58: 254-258) beschriebenen und von Hancock und Carey (1979, J. Bacteriol., 140: 902-910, worauf hiermit Bezug genommen wird) beschriebenen Ver­ fahren hergestellt wird. Die Antigene trennt man im Gel durch Elektrophorese über Nacht bei 50 V konstanter Spannung. Man fixiert das Gel in 40%(V/V)Methanol, 10%(V/V) Essigsäure und 5% (V/V) Glycerin über Nacht und trocknet anschließend an Whatman 3 MM Papier mit Hilfe eines Biorad-Geltrockners (Richmond, CA). Das getrocknete Gel wird mit einer Plastik­ folie bedeckt und 18 h bei Raumtemperatur einem Kodak-XAR-Film ausgesetzt.

Die Ergebnisse dieses Versuches zeigen, daß Pa3 IVC2 nur an ein Antigen in der Außenmembranpräparation von P. aeruginosa- Fisher-Immuntyp 2, nicht aber an ein Antigen in den anderen Außenmembranpräparationen bindet. Das Molekulargewicht (MW) des Antigens im Gel beträgt ungefähr 53 000 Daltons, bestimmt anhand ihrer Mobilität im Vergleich zu derjenigen von ¹⁴C-markierten Proteinstandardprodukten (Phosphorylase B, 92 500 MW, BSA, 69 000 MW, Ovalbumin, 46 000 MW, Kohlen­ säureanhydrase, 30 000 MW, Cytochrom C, 12 000 MW) (New England Nuclear, Boston MA), die im gleichen Gel aufgetrennt wurden. Das Molekulargewicht dieses Antigens korreliert mit dem Molekulargewicht von Flagellin, wobei das Protein die Flagellen von P. aeruginosa umfaßt, wie beschrieben von Montie et al. (1982, Infect. Immun., 35: 281-288), worauf hiermit Bezug genommen wird.

Ferner untersucht man Pa3 IVC2 mittels ELISA unter Verwendung von P. aeruginosa-Habs-Stämme 1 bis 12 (ATCC 33348-33359) die mit Ethanol an 96-Well-Mikrotiterplatten fixiert werden. Die Antigenplatten werden folgendermaßen hergestellt.

Man pelletiert über Nacht Brühenkulturen jedes Organismus, wäscht 2 × mit PBS und resuspendiert anschließend in PBS auf A₆₆₀ von 0,2 O.D.-Einheiten. Man gibt die verdünnten Bakterien in Vertiefungen (50 µl pro Vertiefung) und zentrifugiert anschließend 15 Min. bei Raumtemperatur und bei 1500 × g. Man zieht das PBS ab und gibt dann Ethanol (95%) 15 Min. bei Raumtemperatur in die Vertiefungen. Nach Entfernen des Ethanols aus den Vertiefungen, trocknet man die Platten an der Luft, bedeckt sie und bewahrt sie bis zum Gebrauch bei 4°C auf.

Die Ergebnisse des ELISA-Tests, der wie oben beschrieben durchgeführt wird, zeigen, daß Pa3 IVC2 an die Ethanol fixierten Habs-Stämme 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 und 12 bindet. Dieses Spezifitätsmuster zeigt, daß Pa3 IVC2 an Typ b-Flagellen von P. aeruginosa bindet. (Ansorg R., 1978, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Orig. A. 242: 228-238, Ansorg R. et al, 1984, J. Clin. Microbiol., 20: 84-88, auf die hiermit Bezug genommen wird. Auf Basis dieser Spezifität gegen monoklonales Pa3 IVC2 tragen die P. aeruginosa- Referenzstämme, Fisher-Immuntyp 2, Fisher-Immuntyp 6 und Fisher-Immuntyp 7 Flagellen vom Typ b. Aus den vor­ stehenden Versuchsdaten wurde geschlossen, daß Pa3 IVC2 spezifisch an P. aeruginosa-Flagellin vom Typ b bindet.

In vivo Schutzwirkung von Pa3 IVC2

Man führt Tierversuche durch, um zu bestimmen, ob der monoklonale Antikörper Pa3 IVC2 eine Maus schützt, die einem Challenge mit mehreren LD₅₀-Dosen lebender P. aeruginosa-Bakterien unterworfen wurden. Als Modell wurde das Burned-Mouse-Modell (Collins M.S. und Roby R.E., 1983, J. Trauma, 23: 530-534, worauf hiermit Bezug ge­ nommen wird) gewählt. Gruppen von Mäusen wird eine schwere Verbrennung gemäß der Vorschrift der Autoren zugefügt. Unmittelbar anschließend werden sie einem Challenge mit 5 bis 10 LD₅₀ vom Fisher-Immuntyp 7 unterzogen. Der mono­ klonale Antikörper wird intraperitoneal als Ascites von hohem Titer (0,2 ml intraperitoneal) vor dem Zufügen der Verbrennung und vor Verabreichung des Challenge verabreicht. Eine Erhöhung der Zahl der überlebenden Tiere, die mit Pa3 IVC2 behandelt wurden, wird im Vergleich zu den Tieren, die keinen Antikörper verabreicht erhielten, nicht beob­ achtet.

Beispiel 2

Beispiel 2 erläutert die Methode zur Herstellung einer Murin-Hybridom-Zellinie, die einen monoklonalen Murinanti­ körper gegen P. aeruginosa-Flagellin vom Typ b, der in vivo Schutzwirkung besitzt, produziert.

Erwachsenen weiblichen BALB/c-Mäusen injiziert man zunächst intraperitoneal P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 6 (ATCC Nr. 27317) (8 × 10⁶ Organismen) und zwei Wochen später lebensfähige P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 5 (ATCC Nr. 27316) (4 × 10⁶ Organismen). Während des darauffolgenden 2-Wochen-Zeitraums verabreicht man lebensfähige P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 5 und Fisher-Immuntyp 6 zusammen in zwei wöchentlichen Injektionen. Man erhöht die Dosierung jedes Organismus derart, daß die abschließende Dosierung 10-fach größer war als die Anfangsdosierung. 4 Tage nach der letzten Injektion an lebensfähigen Bakterien verabreicht man eine abschließende Injektion an P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 6-Außenmembranpräparationen (50 µg Protein), her­ gestellt gemäß der Methode von R.E.W. Hancock und H. Nikaido (1978, J. Bacteriol., 136: 381-390). 3 Tage nach der letzten Immunisierung entfernt man die Milz aus einer Maus und bereitet die Milzzellen für die Hybridisierung wie im Beispiel 1 beschrieben.

Die Kulturüberstände der Hybridomzellen untersucht man auf Anwesenheit von Anti-P. aeruginosa-Antikörper mittels ELISA am Tag 10 nach der Fusion gemäß den im Beispiel 1 an­ gegebenen Verfahren, wobei jedoch das Antigen für die ELISA-Platten aus lebensfähigen Bakterien besteht, welche in den Vertiefungen der 96-Well-Mikrotiterplatten immobilisiert sind. Die Platten werden folgendermaßen hergestellt.

50 µl Poly-L-lysin (PLL) (1 µg/ml in PBS) (Sigma Nr. P-1524, St. Louis, MO) gibt man zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platten (Linbro) und inkubiert 30 Min. bei Raumtemperatur. Man nimmt nichtadsorbiertes PLL heraus und wäscht die Ver­ tiefungen 3 × mit PBS. Die über Nacht in TSB gewachsenen Bakterienkulturen wäscht man 1 × mit PBS und resuspendiert anschließend in PBS auf O.D._{660 nm} = 0,2. 50 µl der Bakteriensuspension gibt man in jede Vertiefung der Platte und läßt 1 h bei 37°C binden. Die ungebundenen Bakterien nimmt man aus den Platten und wäscht die Vertiefungen 3 × mit Kochsalzlösung-Tween (0,9 (W/V) NaCl, 0,05% (V/V) Tween-20).

Eine nicht-spezifische Bindung der Antikörper wird durch Zu­ gabe von 200 µl/pro Vertiefung an Blockierungspuffer (PBS) enthaltend 5% (G/V) nicht-fetter Trockenmilch, 0,01% (V/V) Antifoam A (Sigma, St. Louis, MO) und 0,01% (W/V) Thimerosal in die Vertiefungen und 1-stündiger Inkubation bei Raum­ temperatur. Man entfernt überschüssigen Blockierungspuffer und wäscht die Vertiefungen 3 × mit Kochsalzlösung-Tween wie oben beschrieben.

Man führt eine Replikaplattierung der Kulturüberstände (50 µl) in die entsprechenden Vertiefungen der Assay-Platten durch und inkubiert 30 Min. bei Raumtemperatur. Die Kulturüber­ stände entfernt man von den Platten und wäscht die Platten 5 × mit Kochsalzlösung-Tween.

Einen Enzym-konjugierten Second-Step-Antikörper (Meerettich- Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG+IgM) (Tago, Inc., Burlingame, CA) verdünnt man in PBS, das 0,1% (V/V) Tween 20 und 0,2% (G/V) BSA enthält, gemäß vorherigen Titrationen und gibt anschließend 50 µl des Reagenz zu jeder Vertiefung und inkubiert 30 Min. bei Raumtemperatur. Man ent­ fernt überschüssiges Reagenz, wäscht die Vertiefungen 5 × mit Kochsalzlösung-Tween und gibt 100 µl pro Vertiefung o-Phenylen­ diaminsubstrat zu und inkubiert 30 Min. wie im Beispiel 1 be­ schrieben. Die Reaktionen werden wie im Beispiel 1 ange­ geben beendet und anschließend bei A₄₉₀ nm an einem Bio-Tek EL-310 Automated EIA Plate Reader abgelesen.

Anhand der oben beschriebenen Methoden werden die aus der Fusion erhaltenen Kulturüberstände einem Assay auf die An­ wesenheit von Antikörpern unterzogen, welche an P. aeruginosa der Fisher-Immuntypen 1, 2, 3 oder 4, nicht aber an Kontroll­ platten binden, die mittels des gleichen PLL und des gleichen Blockierungsverfahrens, aber ohne Bakterien hergestellt wurden. Diejenigen Überstände, die Antikörper enthalten, welche an einen der vier Fisher-Immuntypen binden, werden ein zweites Mal einem Assay unter separater Anwendung aller sieben Bakterien vom Fisher-Immuntyp unterzogen. Antikörper, die im überstand aus einer Vertiefung, PaF4 IVE8 vorliegen, binden nur an P. aeruginosa der Fisher-Immuntypen 2, 6 und 7. Die Zellen aus der Vertiefung PaF4 IVE8 werden mittels Grenzverdünnungsmethode wie im Beispiel 1 beschrieben kloniert. Die monoklonalen Antikörper und die klonale Zell­ linie aus dieser Vertiefung werden nachfolgend mit PaF4 IVE8 bezeichnet. Ascitesflüssigkeit mit einem hohen Titer an monoklonalen Antikörpern gewinnt man wie im Beispiel 1 be­ schrieben, wobei man jedoch BALB/c-Mäuse anstelle von CB6F₁-Mäusen verwendet.

Spezifität von PaF4 IVE8

Ein Assay zur Identifizierung des durch den monoklonalen Anti­ körper PaF4 IVE8 gebundenen Antigens ist die indirekte Immunofluoreszenz an bakteriellen Organismen. Jeden der sieben Referenz-Fisher-Immuntypen von P. aeruginosa und einem nicht flagellierten P. aeruginosa (PA103, ATCC 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62: 377-389) und Escherichia coli-Stamm (G.S.C. A25) läßt man über Nacht bei 37°C in TSB wachsen. Die Bakterien pelletisiert man durch Zentrifugieren und wäscht sie anschließend 2 × in PBS. Jeden Stamm resuspendiert man in PBS auf eine O.D.₆₆₀ nm = 2,2.

Die Bakteriensuspension verdünnt man weiter auf 1 : 150. 20 µl-Proben gibt man in die einzelnen Vertiefungen von Carlson-Objektträgern (Carlson Scientific Inc., Peotone, IL) und trocknet sie auf den Objektträgern bei 40°C. Die Kulturüberstände (25 µl) von PaF4 IVE8 inkubiert man auf den getrockneten Bakterienproben auf den Objektträgern in einer Feuchtigkeitskammer 30 Min. bei Raumtemperatur. Unge­ bundene Antikörper wäscht man von den Objektträgern durch Eintauchen der Objektträger in destilliertes Wasser.

Nach dem Trocknen der Objektträger inkubiert Fluoreszein­ isothiocyanat (FITC)-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IgG+IgM (25 µl pro Vertiefung einer 1 : 40 Verdünnung in PBS) (Tago, Burlingame, CA) auf den Objektträgern 30 Min. bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer im Dunklen. Die Objektträger wäscht man erneut in destilliertem Wasser, trocknet sie und bringt ein mit Glycerinin PBS (9 : 1) be­ schichtetes Deckglas auf (mounted). Die Objektträger be­ trachtet man mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Eine fluoreszierende Färbung ist nur bei P. aeruginosa der Fisher-Immuntypen 2, 6 und 7 zu beobachten. Es handelt sich um ein sinusförmiges Muster (Linie), das von nur einem Ende des Organismus ausgeht. Dies ist konistent mit der Morphologie und dem Platz des einzelnen polaren Flagellums dieser Bakterien.

Die Reaktion von PaF4 IVE8 mit Flagellen wird bestätigt durch eine Immunoblotanalyse. Außenmembranantigene von P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 6 (siehe Beispiel 1) trennt man mittels Elektrophorese an einem SDS enthaltenden 14%-igen Polyacrylamidgel wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei man die Elektrophorese jedoch 5 h bei 80 mAmps konstanter Amperzahl durchführt. Vorher gefärbte Molekular­ gewichtsmarker (Lysozym, 14 300 NW; β-Lactoglobulin, 18 400 MW, α-Chymotrypsinogen, 25 700 MW, Ovalbumin, 43 000 MW, Rinderserumalbumin, 68 000 MW, Phosphorylase B, 97 400 MW und Myosin, 200 000 MW) (BRL, Gaithersburg, MD) sind im gleichen Polyacrylamidgel enthalten.

Die Antigene transferiert man von dem Polyacrylamidgel auf eine Nitrocellulosemembran (NCM), (0,45 um, Schleicher & Schuell, Inc., Keen, NH) in einem Tris-Glycinmethanolpuffer (Towbin et al (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354), der 0,05% (W/V) SDS enthält, über Nacht bei 4°C und bei einer konstanten Amperzahl von 200 mA. Nach dem Transfer inkubiert man die NCM in 0,05% (V/V) Tween-20 in PBS (PBS-Tween) (Batteiger B. et al., 1982, J. Immunol. Meth., 55: 297-307) 1 h bei Raumtemperatur. Bei dieser Stufe und bei allen darauffolgenden Stufen stellt man das die NCM enthaltende Gefäß auf eine Schaukelplattform, um die Verteilung der Lösung über die gesamte NCM sicherzustellen.

Nach 1 h gießt man die PBS-Tween-Lösung ab, gibt PaF4 IVE8-Ascites (1 : 1000 in PBS-Tween verdünnt) zu und inkubiert mit NCM 1 h bei Raumtemperatur. Die NCM wäscht man dann 5 × jeweils 5 Min. mit PBS-Tween, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Alkalische Phosphatase-konjugiertes Ziege- Anti-Maus-IgG+IgM (Tago, Inc.) verdünnt man gemäß den Spezifikationen des Herstellers und inkubiert mit NCM 1 h bei Raumtemperatur. Die NCM wäscht man 5 × wie oben be­ schrieben, gibt das Substrat zu, das Bromchlorindolyl­ phosphat und Nitroblautetrazolium (Sigma, St. Louis, MO) enthält, hergestellt wie von Leary et al. (1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 4045-4049) beschrieben, und inkubiert 10 bis 20 Min. bei Raumtemperatur. Man beendet die Reaktion durch Abwaschen des Substrates mit destilliertem Wasser.

Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigen, daß PaF4 IVE8 spezifisch an ein einzelnes Antigen mit einem Molekular­ gewicht von 53 000 Dalton in der Außenmembranpräparation bindet. Die Ergebnisse des indirekten Immunofluoreszenz-Assays und des Immunoblots zeigen, daß PaF4 IVE8 an die Flagellen von P. aeruginosa bindet.

Der Flagellen-Typ, den PaF4 IVE8 erkennt, wird mittels ELISA bestimmt. Die Habs-Stämme 1 bis 12 (ATCC 33348-33359) werden jeweils an die Vertiefungen von 96-Well-Mikro­ titerplatten (Linbro) mit PLL gebunden. Der ELISA-Test wird wie vorher in diesem Beispiel beschrieben durchgeführt. Die Quelle für PaF4 IVE8-Antikörper ist der Kulturüber­ stand. Man stellt positive Reaktionen in den Vertiefungen fest, die die Habs-Stämme 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 und 12 ent­ halten. Dies zeigt an, daß PaF4 IVE8 an die Flagellen vom Typ b bindet. Daten für die in vivo Schutzwirkung werden im Beispiel 4 angegeben.

Beispiel 3

Beispiel 3 erläutert die Methode zur Herstellung einer Murinhybridzellinie, die monoklonale Antikörper produziert, welche mit Anti-P. aeruginosa-Flagellen vom Typ a reagieren, und die in vivo Schutzwirkung besitzen.

Die Quelle für die Lymphoidzellen für die Fusion ist die Milz aus immunisierten BALB/C-Mäusen, denen 4 × intra­ peritoneal während eines 6-wöchigen Zeitraums gereinigte Flagellen vom Typ a (10 bis 20 µg Protein) aus den Habs-Stämmen 6 und 8 (ATCC Nr. 33353 und 33355) injiziert werden. Die Flagellen werden gemäß der Methode von T.C. Montie et al (1982, Infect. Immun. 35: 281-288, worauf hier­ mit Bezug genommen wird) gereinigt, wobei jedoch die ab­ schließende Zentrifugierung der Flagellen 1 h bei 100 000 × g statt 3 h bei 40 000 × g durchgeführt wird. Eine zweite für einige Versuche vorgenommene Modifikation besteht darin, daß man die Flagellen von den Bakterien in einem Mischer 30 Sek. statt 3 Min. abschert. (Allison et al., 1985, Infect. Immun. 49: 770-774).

Die Proteinkonzentrationen jeder Präparation bestimmt man mit Hilfe des Bio-Rad-Protein-Assays (Bio-Rad, Richmond, CA) und die Anwesenheit kontaminierender Lipopolysaccharide (LPS) wird durch Bestimmung des KDO-Gehaltes (Karkhanis, Y.D. et al., 1978, Anal. Biochem., 85: 595-601) bewertet. Die Molekulargewichte der Flagellenproteine bestimmt man durch Vergleich ihrer Migration an einem SDS-Polyacrylamidgel mit der Migration von Standardproteinmarkern (BRL) (siehe Beispiel 2). Das Molekulargewicht von Habs-6-Flagellin be­ trägt 51 700 Daltons und das von Habs-8-Flagellin 47 200 Daltons. Diese Werte stimmen mit denjenigen überein, die von J.S. Allison et al. (1985, Infect. Immun., 49: 770-774, worauf hiermit Bezug genommen wird) erhalten wurden.

Die Fusion der Splenocyten aus Flagellin-immunisierten Mäusen und NS-1-Myelomzellen erfolgt 3 Tage nach der letzten Immunisierung wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Wenn die Hybridomzellen eine Konfluenz von etwa 40% (am Tag 7) erreicht haben, nimmt man eine Replikaplattierung der Kulturüberstände in die entsprechenden Vertiefungen von 3 unterschiedlichen Antigenplatten, PLL-gebundenes P. aeruginosa-Fisher-Immuntyp 1 (für die Herstellung siehe Beispiel 2) und Formalin-fixierte Habs 6 und Habs 9, vor.

Man läßt die Bakterien für die Formal in-fixierten Antigen- Platten wachsen, wäscht und verdünnt wie für die PLL-ge­ bundenen Antigenplatten beschrieben. Man gibt verdünnte Bakterien (0,2 O.D. Einheiten bei A₆₆₀) zu den einzelnen Vertiefungen (50 µl pro Vertiefung) von Linbro 96-Well-Mikro­ titerplatten und zentrifugiert die Platten dann bei 1200 × g 20 Min. bei Raumtemperatur. Man nimmt die Über­ stände aus den Vertiefungen und gibt 75 µl 0,2%-iges (V/V) Formalin in PBS zu jeder Vertiefung und inkubiert 15 Min. bei Raumtemperatur. Nach Herausnehmen des Formalins aus den Platten trocknet man die Platten an der Luft und bewahrt sie bis zum Gebrauch bei 4°C auf. Das Formalin ändert die Antigenität der Flagellen nicht, wie durch die Fähigkeit der Anti-Flagellen-Antisera die Formalin-be­ handelten Organismen zu agglutinieren (Lanyi B., 1970, Acta Microbiol. Acad. Sci., Hung, 17: 35-48) gezeigt wird. P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 1 wird als Kontrolle mit einbezogen, weil dieser Stamm nicht-flagelliert ist, wie durch Färben mit einem Beizenfarbstoff gezeigt wird. (Manual of Clin. Microbio., 1985, Lennette, ed. Amer. Soc. Microbiol., Wash., D.C., S. 1099). Die Hybridzellen in den mit FA6 IIG5 bezeichneten Vertiefungen produzieren einen Antikörper, der an Habs 6 und Habs 9 (beides Stämme mit Flagellen vom Typ a), nicht aber an Fisher-Immuntyp 1 binden.

Man bereitet eine Subkultur mit Zellen aus den Vertiefungen FA6 IIG5 und kloniert wie in den vorherigen Beispielen be­ schrieben. Der monoklonale Antikörper und die klonale Zellinie aus dieser Vertiefung werden nachfolgend als FA6 IIG5 bezeichnet. Man stellt in BALB/c-Mäusen Ascites her, wie im Beispiel 2 beschrieben.

Spezifität von FA6 IIG5

Man bestimmt die Spezifität des Antikörpers FA6 IIG5 mittels indirekter Immunofluoreszenz-Analyse und Immunoblotting.

Indirekte Immunofluoreszenz führt man wie im Beispiel 2 beschrieben, aber mit folgenden Modifikationen durch.

Bakterienkulturen, die über Nacht an Trypticase-Sojaagar bei 30° gewachsen waren, entfernt man von den Platten mit Wattestäbchen und resuspendiert in PBS auf A₆₆₀ von 0,2 O.D.-Einheiten. Zu der Suspension gibt man unter Verwirbelung Formalin (0,37% (V/V) in PBS Endkonzentration). Nach 15-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur verdünnt man die Bakterien 1 : 12 in PBS und 20 µl dieser Suspension gibt man in die einzelnen Vertiefungen von Carlson-Objektträgern. Nach dem Trocknen behandelt man die Objektträger wie im Beispiel 2 beschrieben weiter. Die Antikörperquelle ist der Kulturüberstand aus der FA6 IIG5-Zellinie.

Eine fluoreszierende Färbung durch den FA6 IIG5-Antikörper beobachtet man nur mit P. aeruginosa-Stämmen, die Flagellen vom Typ a aufweisen, nicht aber mit solchen mit Flagellen vom Typ b. Das beobachtete Fluoreszenzsmuster ist ein sinusförmiges Linienmuster, was anzeigt, daß FA6 IIG5 an die Flagellen gebunden ist. Durch Behandlung der Bakterien mit Formalin wird das Fluoreszenzsignal verstärkt, die Be­ handlung ist aber nicht erforderlich, um die Flagellenfärbung mit dem Antikörper sichtbar zu machen.

Das Immunblotting wird wie im Beispiel 2 beschrieben durch­ geführt. Die Quelle für Typ a-Flagellen-Antigene sind ge­ reinigte Flagellenpräparationen (siehe dieses Beispiel). Die Antigene werden an 10%-igem, SDS-enthaltendem Polyacrylamid­ gel (Laemmli, U.K., 1979, Nature (London), 227: 680-685) aufgetrennt und an NCM transferiert. FA6 IIG5-Präparationen, entweder Kulturüberstände oder Ascites verdünnt auf 1 : 1000, läßt man mit NCM reagieren und weist die Reaktion mit einem geeigneten Enzym-konjugierten Reagenz und Enzymsubstrat wie im Beispiel 2 beschrieben nach. Der Immunoblot zeigt, daß FA6 IIG5 spezifisch an das 51 000 MW Flagellin von Habs 6 und das 47 200 MW Flagellin von Habs 8 bindet.

Eine Bestätigung dafür, daß FA6 IIG5 nur mit Flagellen vom Typ a und nicht mit Flagellen vom Typ b reagiert, erhält man mittels ELISA, bei dem die Habs-Stämme 1 bis 12 individuell mit PLL an die Vertiefungen von Linbro 96-Well-Mikrotiter­ platten gebunden werden. Der Antikörper bindet nur an die Habs-Stämme 1, 6, 8 und 9. Bei diesen Stämmen handelt es sich um diejenige der 12 Stämme, die Flagellen vom Typ a aufweisen (siehe Ansorg R. et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20: 84-88, worauf hiermit Bezug genommen wird). Im nachfolgenden Beispiel 4 werden in vivo Untersuchungen zur Schutzwirkung beschrieben.

Beispiel 4

Beispiel 4 zeigt die Schutzwirkung bei Mäusen, welche passiv gegen die Antikörper PaF4 IVE8 und FA6 IIG5 immunisiert wurden, gegen einen Challenge mit P. aeruginosa am Burned-Mouse-Modell.

Die monoklonalen Anti-Flagellen-Antikörper werden am Burned-Mouse-Modell gemäß der Methode von M.S. Collins und R.E. Roby (1983, J. Trauma, 23: 530-534, worauf hiermit Bezug genommen wird) getestet. Für die Untersuchungen auf Schutz­ wirkung werden alle Antikörper mittels Protein A-Sepharose-Chromatographie (Ey P.L. et al., 1978, Immunochemistry, 15: 429-436, worauf hiermit Bezug genommen wird) gereinigt und in PBS-Puffer dialysiert. Der in den Tierversuchen ver­ wendete Stamm mit Flagellen vom Typ a ist P. aeruginosa PA220 (von Dr. James Pennington, Boston, MA) und der Stamm mit Flagellen vom Typ b ist der Referenzstamm P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 2 (ATCC Nr. 27313).

40 µg gereinigter monoklonaler Antikörper verabreicht man pro Maus intravenös 1 bis 2 h vor Anbringung der Verbrennung und Verabreichung des Challenges. Unmittelbar nach der Ver­ brennung erhalten die Tiere subeschar 0,5 ml kalte PBS, der die Challenge-Bakterien enthält. Die Challengedosis ist ungefähr 10 LD₅₀-Dosen für jeden Organismus. Die Ergebnisse der Tierversuche sind in den Tabellen I und II zusammen­ gestellt.

Untersuchung auf Schutzwirkung monoklonaler Anti- Flagellen-Typ a-Antikörper am Burned-Mouse-Modell¹

Untersuchung auf Schutzwirkung monoklonaler Anti- Flagellen-Typ a-Antikörper am Burned-Mouse-Modell¹

Untersuchung auf Schutzwirkung monoklonaler Anti- Flagellen-Typ b-Antikörper am Burned-Mouse-Modell¹

Untersuchung auf Schutzwirkung monoklonaler Anti- Flagellen-Typ b-Antikörper am Burned-Mouse-Modell¹

Man beobachtet eine signifikante Überlebensrate bei den Mäusen, die mit dem Anti-a-Antikörper oder dem Anti-b-Antikörper behandelt und anschließend mit dem entsprechenden Antigen einem Challenge ausgesetzt wurden. Dagegen starben 80 bis 90% der unbehandelten, aber einem Challenge ausge­ setzten Mäuse oder der mit einem nicht-entsprechenden mono­ klonalen Anti-Flagellen-Antikörper oder nicht-spezifischen Anti-LPS-Antikörper behandelten Tiere. Die Unfähigkeit des Anti-Flagellen-Typ a-Antikörpers Mäuse gegen einen letalen Challenge an P. aeruginosa vom Fisher-Immuntyp 2 mit Flagellen vom Typ b zu schützen und die Unfähigkeit des Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers Mäuse gegen eine letale Challenge an P. aeruginosa PA220 vom Typ a zu schützen be­ stätigt in vivo die in vitro beobachtete Spezifität der Antikörper. Die Überlebensrate der einer Verbrennung ausge­ setzten, aber nicht infizierten Mäuse zeigt, daß die Ver­ brennung selbst nicht letal war.

Beispiel 5

Beispiel 5 zeigt die extensive Kreuzreaktivität von PaF4 IVE8 und FA6 IIG5 mit klinischen P. aeruginosa Isolaten. Dies zeigt die klinische Brauchbarkeit dieser Antikörper für eine Immuntherapie von P. aeruginosa-Infektionen.

Klinische Isolate sind von Krankenhäusern und Kliniken erhältlich. Die Isolate stammen von vielen Seiten, ein­ schließlich Blut, Wunden, Atemwege, Urin und Ohren. Insge­ samt wurden 157 Isolate untersucht.

PaF4 IVE8 bindet spezifisch an 34 klinische Isolate (22%), wohingegen der Flagellen-Typ a-Antikörper FA6 IIG5 an 102 klinische Isolate (65%) bindet, d. h. es binden ins­ gesamt 136 von 157 Isolaten (87%). Von den 21 Stämmen, die von keinem der Antikörper erkannt werden, besitzen 19 keine Flagellen, wie durch Färben mit Beizenfarbstoff gezeigt werden kann. Beide Antikörper zusammen binden daher an 136 von 138 (98%) der klinischen Flagellen-Isolate, was frühere Berichte bestätigt (R. Ansorg, 1978, Zbl. Bakt. Hyg., I Abt. Orig. A, 242: 228-238, worauf hiermit Bezug genommen wird).

Beispiel 6

Beispiel 6 zeigt die Methoden zur Produktion monoklonaler Humanantikörper, die an P. aeruginosa-Flagellen vom Typ b binden.

Eine Probe peripheren Blutes von einer Person, die mit einem Polysaccharidpräparat mit hohem Molekulargewicht (Pier et al., 1984, Infect. Immun. 45: 309) immunisiert wurde, dient als Quelle für B-Zellen. Mononuklearzellen werden aus dem Blut mittels Standardzentrifugationstechniken an Ficoll-Paque (Boyum (1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21: 77) abge­ trennt und 2 × in Calcium/Magnesium-freier, Phosphat-ge­ pufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.

Die Mononuklearzellen werden von T-Zellen unter Anwendung eines modifizierten E-Rosettenverfahrens befreit. Die Zellen resuspendiert man bei 4°C auf eine Konzentration von 1 × 10⁷-Zellen/ml in PBS, der 20% fötales Kälberserum (FCS) ent­ hält. 1 ml dieser Suspension gibt man dann in ein 17 × 100 mm Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und anschließend gibt man 1 × 10⁹ 2-Aminoisothiouroniumbromid (AET) behandelte rote Blutzellen vom Schaf aus einer 10%igen (V/V)-Lösung in Iscove's modifizierten Dulbecco's Medium zu (Iscove's Medium) (Madsen und Johnson (1979) J. Immun. Methods, 27: 61). Man vermischt die Suspension leicht 5 bis 10 Min. bei 40°C und entfernt die E-Rosettenzellen anschließend durch 8-minütiges Zentrifugieren an Ficoll-Paque bei 2500 × g und bei 4°C. Die Bande der E-Rosetten negativen mononuklearen Blut (peripher)-Zellen (E⁻PBMC) an der Grenzfläche wird ge­ sammelt und 1 × in Iscove's Medium gewaschen und re­ suspendiert in dem gleichen Medium, das 15% (V/V) FCS, L-Glutamin (2 mMol/l), Penicillin (100 IU/ml), Amino­ pterin (4 × 10^-7 M) und Thymidin (1,6 × 10^-5M) enthält. Dieses Medium wird im folgenden als HAT-Medium bezeichnet.

Die Zelltransformation von E⁻PBMC erfolgt durch Kokultivieren dieser Zellen mit einer transformierenden Zell­ linie. Die transformierende Zellinie ist eine Epstein-Barr-Nuklearantigen (EBNA) positive Humanlymphoblastoidzellinie, die aus der GM 1500 Lymphoblastoidzellinie durch Ethyl­ methan-sulfonat (EMS)-Mutagenese und anschließende Selektion in Gegenwart von 30 µg/ml 6-Thioguanin erhalten wird, um die Zellen Hypoxanthinguaninphosporibosyl-Transferase (HGPRT)-defektiv und somit HAT-sensitiv zu machen. Diese Zellinie wird als 1A2-Zellinie bezeichnet, sie wurde am 29. März 1982 bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC Nr. CRL 8119 hinterlegt. Die 1A2-Zellen in der logarithmischen Wachstums­ phase werden in HAT-Medium suspendiert und anschließend mit E⁻PBMC im Verhältnis von 15 1A2-Zellen pro PBMC-Zellen kombiniert. Die Zellmischung wird auf 30 96-Well-Mikro­ titerplatten mit rundem Boden (Costar 3799) in einer Konzentration von 32 000 Zellen/pro Vertiefung und in einem Volumen von 200 µl pro Vertiefung gegeben und bei 37°C in feuchter Atmosphäre, die 6% CO₂ enthält, inkubiert. Die Kulturen werden an den Tagen 5 und 8 nach dem Plattieren durch Ersatz der Hälfte des Überstandes mit frischem HAT-Medium versorgt. 16 Tage nach Plattieren enthalten 100% der Vertiefungen proliferierende Zellen und in den meisten der Vertiefungen liegen die Zellen in ausreichender Dichte vor, um die Entfernung und die Testung der Überstände auf Anti-P. aeruginosa-Antikörper zu ermöglichen.

Die Überstände unterzieht man einem Screening auf Anwesen­ heit von Anti-P. aeruginosa-Antikörper unter Anwendung der ELISA-Methode wie im Beispiel 2 beschrieben, jedoch mit folgenden Modifikationen. Ein Pool aus den sieben Referenz­ stämmen vom Fisher-Immuntyp (ATCC Nrn. 27312-27318) (A₆₆₀ = 0,2 O.D.-Einheiten) wird an 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Immulon 11, Dynatech), die mit Poly- L-Lysin vorbehandelt wurden, gebunden, inkubiert und wie im Beispiel 2 beschrieben gewaschen. Nach Blockieren der nicht-spezifischen Bindungsstellen und Waschen der Platten werden 50 µl PBS, das 0,1% (V/V) Tween-20 und 0,2% (W/V) BSA enthält, pro Vertiefung zugegeben. Mit den Kulturüber­ ständen (50 µl) führt man dann eine Replikaplattierung in die entsprechenden Vertiefungen der Assay-Platten und in die Kontrollplatten durch, die mit PLL behandelt und blockiert worden waren, die aber keine Bakterien enthalten. Nach Inkubieren und Waschen gibt man Enzym-konjugierte-Secondstep- Antikörper (50 ml pro Vertiefung), Meerettichperoxydase- konjugiertes Ziege-Antihuman-IgG und Ziege-Antihuman-IgM, in geeigneter Weise mit PBS verdünnt, das 0,1% (V/V) Tween-20 und 0,2% (W/V) BSA enthält, zu den Vertiefungen und führt den Assay wie im Beispiel 2 beschrieben zuende. Diejenigen Überstände, die Antikörper enthalten, welche an den Pool aus den Fisher-Immuntypen, nicht jedoch an die Kontrollplatten binden, werden ein zweites Mal unter An­ wendung von jedem der sieben Bakterienstämme vom Fisher-Immuntyp separat einem Assay unterzogen. Die im Überstand einer Vertiefung, nämlich 20H11, vorhandenen Antikörper binden lediglich an die P. aeruginosa der Fisher-Immun­ typen 2, 6 und 7. Die Zellen werden wiederholt bei ab­ nehmender Zelldichte subkultiviert, bis alle Vertiefungen, die Wachstum enthalten, den Antikörper sekretieren. Die Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgM-Isotyp) werden im folgenden Beispiel mit 20H11 bezeichnet.

Man führt eine zweite Transformation durch, bei der die Quelle für B-Zellen das periphere Blut eines Patienten mit cystischer Fibrose war, von dem bekannt war, daß er eine chronische P. aeruginosa-Infektion hatte. Man stellt E⁻PBMC wie oben beschrieben her und kokultiviert mit der transformierenden Zellinie 1A2 im Verhältnis von 72 1A2-Zellen pro E⁻PBMC. Die Zellmischung gibt man auf 15 96-Well- Mikrotiterplatten mit rundem Boden in einer Konzentration von 7,4 × 10⁴-Zellen pro Vertiefung und kultiviert wie oben beschrieben.

Die Überstände werden mittels ELISA auf die Anwesenheit von Anti-P. aeruginosa-Antikörpern 16 Tage nachdem die Transformation auf die Platten gegeben wurde, untersucht. Den Assay führt man durch wie für die vorherige Transformation beschrieben, wobei jedoch der Pool aus P. aeruginosa- Stämmen, der für das anfängliche Screening verwendet wird, aus den Referenzstämmen der Fisher-Immuntypen F2, F4, F6 und F7 (ATCC Nrn. 27313, 27315, 27316 und 27317) und drei klinischen Isolaten der Genetic Systems Corporation Organism Bank (GSCOB) besteht, welche unterschiedliche LPS-Immunotypen und Flagellen-Typen aufweisen. Das klinische 7 Isolat PSA 1277 (GSCOB) weist Flagellen vom Typ a und LPS des Fisher-Immuntyps 1 auf, das zweite Isolat PSA G98 (GSCOB) weist Flagellen vom Typ a und LPS des Fisher-Immun­ typs 3 auf, und das dritte Isolat PSA F625 (GSCOB) weist Flagellen vom Typ b und LPS des Fisher-Immuntyps 5 auf. Diese Mischung an Referenzstämmen und klinischen Isolaten wird als P. aeruginosa-Flagellen-Pool bezeichnet. Diejenigen Über­ stände, die den Antikörper enthalten, der an die Platten mit dem P. aeruginosa-Flagellen-Pool, nicht aber an die mit PLL beschichteten Kontrollplatten bindet, werden ein zweites Mal mittels ELISA an den einzelnen Stämmen des Pools einem Assay unterzogen. Eine Vertiefung 3Cl bindet an die Referenzstämme F2, F6 und F7 und das klinische Isolat F625.

Das Klonieren der 3C1-Zellinie erfolgt, indem man zunächst die Zellen 2 × bei niedriger Dichte subkultiviert, zuerst mit 20 Zellen pro Vertiefung der 96-Wellplatten und anschließend bei 2 Zellen pro Vertiefung. Das formale/Klonieren der die spezifischen Antikörper produzierenden Zellen erfolgt durch Plattieren der Zellen bei einer Dichte von ungefähr 1 Zelle/Vertiefung in 72-Well-Terasakiplatten (Nunc Nr. 36538) in einem Volumen von 10 µl/pro Vertiefung an HAT-Medium ohne die Aminopterinkomponente (HT-Medium). Die Platten gibt man 2 bis 3 h in einen Inkubator und läßt die Zellen am Boden der Vertiefungen absetzen. Die Platten werden dann mikroskopisch durch 2 Personen auf Vertiefungen hin ausgewertet, die eine Einzelzelle enthalten. Die Ver­ tiefungen werden täglich mit HT-Medium versorgt und sobald das Wachstum ausreichend ist, werden die Zellen auf eine 96-Wellplatte mit rundem Boden transferiert. Alle Ver­ tiefungen mit Auswuchs werden einem ELISA-Assay an P. aeruginosa-Stämmen mit Flagellen vom Typ b unterzogen. Es hat sich gezeigt, daß alle den entsprechenden Antikörper produzieren. Die Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgM-Isotyp) werden im folgenden als 3C1 bezeichnet.

Das mittels 20H11 und 3C1 identifizierte Antigen ist ein Flagellen-Antigen, wie durch indirekte Immunofluoreszenz und Immunoblotting gezeigt werden kann. Diese Methoden werden im Prinzip wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben durchgeführt. Für den indirekten Immunofluoreszenz-Assay stellt man die P. aeruginosa-Stämme mit Flagellen vom Typ b, die Referenzstämme der Fisher-Immuntypen F2, F6 und F7 (ATCC Nr. 27313, 27317 und 27318) und einen Stamm mit Flagellen vom Typ a, Referenzstamm des Fisher-Immuntyps 4 (ATCC Nr. 27315) wie im Beispiel 3 beschrieben her. Der Flagellen-Typ der Referenzstämme wird bestimmt durch Typisieren mit den monoklonalen Murinantikörpern PaF4 IVE8 und FA6 IIG5. Die Objektträger werden wie im Beispiel 2 be­ schrieben zum Betrachten präpariert. Die Quellen für beide Antikörper sind Kulturüberstände, das FITC-konjugierte Reagenz ist FITC-konjugiertes Ziege-Antihuman-IgG (poly­ valent) (Tago, Burlingame, CA), verdünnt 1 : 100 in PBS, die 0,5% (G/V) Rindergammaglobuline (Miles Scientific Cat. Nr. 82-041-2, Naperville, IL) und 0,1% (G/V) Natriumazid als Konservierungsmittel enthält.

Eine Fluoreszenzfärbung durch 20H11 und 3C1-Antikörper be­ obachtet man nur mit P. aeruginosa-Stämmen mit Flagellen vom Typ b und nicht mit Stämmen mit Flagellen vom Typ a, Referenzstamm des Fisher-Immuntyps 4. Das beobachtete Fluoreszenzmuster ist ein sinusförmiges Linienmuster, das von einem Ende der Bakterien ausgeht. Dies zeigt, daß die Antikörper an die Flagellen der Bakterien binden.

Das Immunoblotting wird durchgeführt wie im Beispiel 2 be­ schrieben. Gereinigte Flagellen vom Typ b der P. aeruginosa Referenzstämme des Fisher-Immuntyps 2 (ATCC Nr. 27313) und gereinigte Flagellen vom Typ a der Referenzstämme Habs 6 und Habs 8 (ATCC Nrn. 33353 und 33355) werden wie im Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Antigene werden an einem 10%-igen Polyacrylamidgel (siehe Beispiel 3) aufgetrennt und an NCM transferiert. Die Kulturüberstände, die die 20H11 oder 3C1-Antikörper enthalten, Kulturüberstand ent­ haltend einen nicht-spezifischen Humanantikörper und Kulturmedia werden mit NCM inkubiert. Die Reaktion wird mit einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Ziege-Anti­ human-Ig (polyvalent) (Tago, Burlingame, CA), verdünnt in PBS, die 0,05% (V/V) Tween-20 enthält, nachgewiesen. Das Enzymsubstrat wird wie im Beispiel 2 beschrieben herge­ stellt. Der Immunoblot zeigt, daß beide Antikörper an das 53 000 MW Flagellinprotein des Fisher-Immuntyps 2 und weder an das 51 700 MW Flagellinprotein von Habs 6 noch an das 47 200 MW Flagellin von Habs 8 bindet. Weder mit dem nicht-spezifischen Humanantikörper noch mit dem Kultur­ medium wird eine Reaktion beobachtet. Eine weitere Bestätigung dafür, daß die Antikörper 20H11 und 3C1 nur an Flagellen vom Typ b und nicht an Flagellen vom Typ a binden, erhält man durch ELISA, wobei die Habs-Stämme 1 bis 12 individuell mit PLL an die Vertiefungen von Immulon 96-Well-Mikrotiter­ platten binden. Die Antikörper binden lediglich an die Habs-Stämme 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 und 12, die Stämme mit Flagellen vom Typ b sind (Ansorg et al. (1984) J. Clin. Microbiol., 20: 84).

Beispiel 7

Beispiel 7 erläutert die Methoden zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der an P. aeruginosa-Flagellen vom Typ a bindet.

Eine Probe peripheren Blutes einer Person, die mit einem Polysaccharidpräparat mit hohem Molekulargewicht (Pier et al. (1981) Infect. Immun., 34: 461) immunisiert wurde, diente als Quelle für B-Zellen. Die Mononuklearzellen wurden aus dem Blut abgetrennt und von T-Zellen wie im Beispiel 6 beschrieben befreit. Die Zellen wurden dann in FCS, das 10% Dimethylsulfoxid enthält, in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Zellen wurden später bei 37°C aufgetaut, einmal in Iscove-Medium gewaschen und in HAT-Medium resuspendiert. Eine zellgesteuerte Transformation erfolgte durch Kokultivierung von E⁻PBMC mit 1A2-Zellen im Verhältnis 30 1A2-Zellen pro E⁻PBMC. Die Zellmischung wurde in 30 96-Wellgewebekulturplatten in einer Konzentration von 62.00 Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Kulturen wurden am 7. Tag nach dem Plattieren versorgt, indem die Hälfte des Volumens mit HAT-Medium ersetzt wurde. Man be­ obachtete in 100% der Vertiefungen am 14. Tag nach dem Plattieren Zellproliferation. Die Überstände wurden aus den Vertiefungen entfernt und dann untersucht.

Die Überstände wurden mittels ELISA auf die Anwesenheit von Anti-P. aeruginosa-Antikörper unter Anwendung eines P. aeruginosa-Flagellen-Pools und PLL-behandelter Platten als Kontrolle wie im Beispiel 6 beschrieben einem Assay unterzogen. Diejenigen Überstände, die Antikörper ent­ halten, welche an den Flagellen-Pool binden, nicht aber an die PLL-Kontrollplatten, wurden erneut auf die einzelnen Bakterienstämme des Flagellen-Pools einem Assay unter­ zogen. Eine Vertiefung, 21B8, enthielt Antikörper, die an PSA 1277, PSA G98 und an den Referenzstamm des Fisher-Immuntyps 4 binden. Diese drei Stämme sind diejenigen Stämme des Flagellen-Pools, die Flagellen vom Typ a aufweisen.

Das Klonieren der 21B8-Zellinie erfolgte wie im Beispiel 6 für die 3C1-Zellinie beschrieben, jedoch mit folgenden Modifikationen bei der formalen Klonierungsstufe. Nach Be­ wertung der Wells der Terasaki-Platten auf die Anwesenheit von nur einer Einzelzelle wurde jede Zelle von der Terasaki- Platte in eine Vertiefung einer 96 Well-Kulturplatte mit rundem Boden in einem Volumen von 100 µl HAT-Medium ohne die Aminopterinkomponente (HT-Medium) gegeben. Nicht­ transformierende HAT-sensitive Lymphoblastoidzellen waren in allen Vertiefungen in einer Dichte 500 Zellen/Ver­ tiefung als Feederzellen vorhanden. 5 Tage nach dem Plattieren wurden 100 µl HAT-Medium zu den Vertiefungen ge­ geben, um die Feederzellen selektiv abzutöten. Die Ver­ tiefungen wurden am 7. und 9. Tag nach der Plattierung er­ neut gefüttert, indem die Hälfte des Überstandes mit HAT-Medium ersetzt wurde. Die Zellen wurden dann mit HT-Medium gefüttert, bis die Dichte ausreichend war, um die Anwesen­ heit von Antikörpern mittels ELISA nachzuweisen. Alle Ver­ tiefungen mit Auswuchs produzierten Antikörper, die an P. aeruginosa-Stämme mit Flagellen vom Typ a binden. Die Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgG₁-Isotop) werden im folgenden beide als 21B8 bezeichnet.

Das durch 21B8 identifizierte Antigen war ein Flagellen-Antigen, wie mittels indirektem Immunofluoreszenz-Assay und Immunoblotting gezeigt werden konnte (siehe Beispiel 6, in dem die beiden Methoden beschrieben sind). Eine fluoreszierende Färbung durch den 21B8-Antikörper wurde nur mit P. aeruginosa-Referenzstämmen des Fisher-Immuntyps 4 (ATCC Nr. 27315), der Flagellen vom Typ a aufweist, nicht aber mit dem P. aeruginosa-Referenzstamm des Immuntyps 2 (ATCC Nr. 27313), der Flagellen vom Typ b aufweist, zu be­ obachten. Das beobachtete Fluoreszenzmuster war ein sinus­ förmiges Linienmuster, das von einem Ende der Bakterien ausgeht. Dies zeigt, daß die Antikörper an die Flagellen der Bakterien binden.

Ein Immunoblotting wurde wie im Beispiel 2 beschrieben durch­ geführt. Gereinigte Flagellen vom Typ a der P. aeruginosa- Referenzstämme Habs 6 (ATCC Nr. 33353) und gereinigte Flagellen vom Typ b des P. aeruginosa-Referenzstammes des Fisher-Immuntyps 2 (ATCC Nr. 27313) wurden wie im Bei­ spiel 3 beschrieben hergestellt. Die Antigene wurden an 10%-igem Polyacrylamidgel (siehe Beispiel 3) aufgetrennt und an NCM transferiert. Die Kulturüberstände, die entweder 21B8 oder einen nicht-spezifischen Humanantikörper und Kulturmedium enthielten, wurden mit NCM zur Reaktion ge­ bracht. Die Reaktion wurde mit einem alkalischen Phosphatase konjugierten Ziege-Antihuman-Ig (polyvalent) und Enzym­ substrat wie in den Beispielen 2 und 6 beschrieben, nachge­ wiesen. Der Immunoblot zeigt, daß der 21B8-Antikörper nur an das 51 700 MW Flagellinprotein von Habs 6, nicht aber an das 53 000 MW Flagellinprotein des Fisher-Immuntyps 2 bindet. Weder mit dem nicht-spezifischen Humanantikörper noch mit dem Kulturmedium wurde eine Reaktion beobachtet.

Beispiel 8

Beispiel 8 zeigt die Schutzwirkung bei Mäusen, die mit den Human-anti-Flagellen-Antikörpern 20H11, 3C1 und 21B8 immunisiert wurden, gegen eine Challenge mit P. aeruginosa am Burned- Mouse-Modell.

Die monoklonalen Human-anti-Flagellen-Antikörper wurden am Burned-Mouse-Modell getestet (siehe Beispiel 4). Die 21B8 und 20H11-Antikörper wurden durch Präzipitatio 12157 00070 552 001000280000000200012000285911204600040 0002003722098 00004 12038n aus den Kulturüberständen hergestellt, welche aus den jeweiligen Zellinien mit Ammoniumsulfat (50% Endkonzentration) (Good et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. und Shiigi S.M., Hrsg. W.J. Freemann & Co., San Francisco, CA, 1980, 279-286) erzeugt wurden. Das Präzipitat wurde in PBS solubilisiert, gegen PBS über Nacht bei 4∘ dialysiert und anschließend vor Verabreichung an die Tiere steril filtriert. Die Quelle für den Antikörper 3C1 und den nicht-spezifischen Anti-LPS-Antikörper, der als negative Kontrolle verwendet wurde, war bei dieser Unter­ suchung Kulturüberstand. Als positive Kontrolle wurden für jede Untersuchung die entsprechenden gereinigten, mono­ klonalen Murinantikörper PaF4 IVE8 oder FA6 IIG5 verwendet.

Der in den Tierversuchen verwendete Stamm mit Flagellen vom Typ a war das klinische Isolat PSA A522 (GSCOB), das LPS vom Fisher-Immuntyp 1 exprimiert. Der Stamm mit Flagellen vom Typ b war das klinische Isolat PSA A447 (GSCOB), das LPS des Fisher-Immuntyps 6 exprimiert. Die Humanantikörper (0,45 ml) wurden mit den Bakterien vermischt (mehr als 5 LD₁₀₀ Dosen in 0,05 ml) und subeschar unmittelbar nach der Ver­ brennung inokuliert. Die Ergebnisse der Tierversuche sind in den Tabellen III, IV und V zusammengestellt.

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ a-Antikörpers 21B8 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ a-Antikörpers 21B8 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 20H11 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 20H11 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 3C1 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 3C1 am Burned-Mouse-Modell¹

Es wurde eine signifikante Überlebensrate bei den Mäusen beobachtet, die mit dem Anti-Flagellen-Typ a-Antikörper oder mit einem der beiden Anti-Flagellen-Typ b-Antikörper be­ handelt und anschließend mit dem entsprechenden Antigen einem Challenge ausgesetzt wurden. Dagegen starben 88 bis 100% der unbehandelten, aber einem Challenge ausgesetzten Mäuse oder diejenigen Mäuse, die mit einem nicht-ent­ sprechenden monoklonalen Anti-Flagellen-Antikörper oder nicht-spezifischen LPS-Antikörper behandelt wurden. Wie bei den monoklonalen Murin-Antiköpern beobachtet (siehe Bei­ spiel 4), üben die Human-Anti-Flagellen-Antikörper eine spezifische Schutzwirkung nur gegen einen letalen Challenge mit den Organismen aus, die die Flagellen vom entsprechenden Typ aufweisen, d. h. die Human-Anti-Flagellen-Typ a-Anti­ körper bieten Schutz gegen einen letalen Challenge mit Organismen, die Flagellen vom Typ a, nicht aber vom Typ b aufweisen. Die Anti-Flagellen-Typ b-Antikörper schützen Mäuse, die einem Challenge mit Stämmen ausgesetzt waren, welche Flagellen vom Typ b, nicht aber Flagellen vom Typ a aufweisen.

Beispiel 9

Beispiel 9 zeigt die Kreuzreaktivität der Human-Anti- Flagellen-Antikörper 20H11, 3C1 und 21B8 mit klinischen P. aerugindsa-Isolaten.

Klinische P. aeruginosa-Isolate (115), die von Kranken­ häusern und Kliniken erhalten wurden und hauptsächlich aus Verbrennungswunden und Blut isoliert wurden, wurden durch Typisieren mit den monoklonalen Murin-Antikörpern FA6 IIG5 oder PaF4 IVE8 (siehe Beispiele 2, 3 und 5) als Stämme mit Flagellen vom Typ a oder b nachgewiesen. Durch Reaktion mit dem monoklonalen Murin-Antikörper FA6 IIG5 wurde gezeigt, daß 55 der klinischen Isolate Flagellen vom Typ a aufweisen und durch Reaktion mit dem monoklonalen Murin-Antikörper PaF4 IVE8 wurde gezeigt, daß 59 der Isolate Flagellen vom Typ b aufweisen.

Die Kreuzreaktivität der monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ a-Antikörper 21B8 waren extensiv, da der Antikörper 54 der 56 klinischen Isolate mit Flagellen vom Typ a erkannte (96%). Die Kreuzreaktivität von 20H11 mit den Flagellen vom Typ b aufweisenden Isolate war ebenfalls extensiv, da 20H11 alle 59 Isolate erkannte (100%). Im Gegensatz dazu hat der monoklonale Anti-Flagellen-Typ b-Antikörper 3C1 nur an 43 der 59 Isolate (73%) gebunden. Diese Ergebnisse zeigen, daß 20H11 an ein pan-reaktives Epitop bindet (d. h. ein Epitop, das auf wenigstens ungefähr 95% der P. aeruginosa-Stämme mit Flagellen vorhanden ist), wohingegen 3Cl an ein Epitop bindet, das nicht an allen Flagellin­ molekülen vom Typ b vorhanden ist. Obwohl das Flagellen-Typ b-Antigen serologisch einheitlich ist, wie anhand der poly­ klonalen Antisera analysiert wurde (Lanvi, B. siehe oben, und Ansorg R., siehe oben), zeigen die Kreuzreaktivitäts­ muster von 20H11 und 3C1 überraschenderweise, daß die Flagellen vom Typ b wenigstens zwei separate Epitope auf­ weisen, die durch monoklonale Antikörper identifiziert werden können.

Die extensive Kreuzreaktivität der Antikörper 21B8 und 20H11 mit klinischen P. aeruginosa-Isolaten zeigt die klinische Brauchbarkeit dieser Antikörper für die Immun­ therapie von P. aeruginosa-Infektionen.

Beispiel 10

Beispiel 10 zeigt die Methoden zur Produktion eines weiteren beispielhaften monoklonalen Humanantikörpers, der an P. aeruginosa-Flagellen vom Typ b bindet sowie die Schutzwirkung des Antikörpers gegen einen Challenge mit P. aeruginosa am Burned-Mouse-Modell.

Eine transformierte Zellinie wurde hergestellt und kloniert im wesentlichen wie im Beispiel 7 beschrieben, wobei jedoch die transformierte Zellmischung auf 20 96-Well-Gewebe kulturplatten in einer Konzentration von ungefähr 2250 E⁻PBMC pro Vertiefung plattiert wurde. Die Überstände wurden anfangs mittels ELISA an dem Flagellen-Pool wie im Beispiel 6 be­ schrieben einem Assay unterzogen, wobei jedoch die Referenz­ stämme der Fisher-Immuntypen 2 und 4 nicht in dem Pool vor­ handen waren. Die positiven Vertiefungen wurden an­ schließend gegen jeden der Stämme in dem Flagellen-Pool ein­ schließlich der Fisher-Immuntypen 2 und 4 einem Assay unter­ zogen. Die schließlich isolierte Zellinie und der mono­ klonale Antikörper (IgG-Isotyp) werden im folgenden beide als 12D7 bezeichnet.

Der 12D7 monoklonale Humanantikörper zeigt extensive Kreuz­ reaktivität mit Anti-Flagellen-Typ a-Isolaten, wobei 54 der 56 getesteten klinischen Isolate mit Flagellen vom Typ a (96%) erkannt werden. Die Schutzwirkung des 12D7 mono­ klonalen Antikörpers ist in Tabelle VI gezeigt. Diese Unter­ suchungen wurden im wesentlichen wie im Beispiel 4 be­ schrieben durchgeführt, wobei die Challengedosis jedoch eine LD₁₀₀-Dosis betrug und der Challenge-Stamm 1624, ein klinisches Isolat, das Fisher-Immuntyp 2 LPS und Flagellen vom Typ a exprimiert war.

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ a-Antikörpers 12D7 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ a-Antikörpers 12D7 am Burned-Mouse-Modell¹

Beispiel 11

Beispiel 11 zeigt die Produktion eines monoklonalen Human­ antikörpers, der mit P. aeruginosa mit Flagellen vom Typ b reaktiv ist sowie die Schutzwirkung bei Mäusen, die mit diesem Antikörper passiv immunisiert wurden, gegen einen Challenge mit P. aeruginosa am Burned-Mouse-Modell.

Eine transformierte Zellinie wurde hergestellt und kloniert im wesentlichen wie im Beispiel 10 beschrieben, wobei jedoch das Transformationsverhältnis von 1A2 zu B-Zellen ungefähr 60 : 1 betrug und die transformierte Zellmischung auf 15 Platten in einer Konzentration von ungefähr 1930 E⁻PBMC pro Ver­ tiefung plattiert wurde. Die Zellen wurden ebenfalls an einem Pool aus P. aeruginosa-Stämmen, die G98 (Fisher-Immuntyp 3, Flagellen-Typ a) und I739 (ein klinisches Isolat des Fisher-Immuntyps 5, Flagellen-Typ b) umfaßt, einem Assay unter­ zogen und an einem anderen Pool aus den P. aeruginosa-Stämmen I277, G98, I739 und Fisher-Immuntypen F2, F4, F6 und F7 bestätigt. Die schließlich isolierte Zellinie und der sekretierte monoklonale Antikörper (IgG₁-Isotyp) werden im folgenden beide als 2B8 bezeichnet.

Ein mit 2B8 durchgeführter Immunofluoreszenz-Assay war an einem Fisher-Immuntyp-Stamm 2 mit Flagellen vom Typ b positiv, an einem Fisher-Immuntyp 4 Referenzstamm mit Flagellen vom Typ a, jedoch negativ. Bei Tests mit klinischen Isolaten waren 59/59 (100%) der Isolate vom Flagellen-Typ b positiv.

Die Schutzwirkung von 2B8 ist in Tabelle VII gezeigt. Diese Untersuchungen wurden wie im Beispiel 10 beschrieben durch­ geführt, wobei jedoch das klinische Isolat F164 (Fisher-Immuntyp 4, Flagellen-Typ b) als Challenge verwendet wurde.

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 2B8 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 2B8 am Burned-Mouse-Modell¹

Beispiel 12

Beispiel 12 zeigt die Produktion eines weiteren monoklonalen Humanantikörpers, der mit P. aeruginosa-Flagellen vom Typ b reaktiv ist sowie die Schutzwirkung bei Mäusen, die mit diesem Antikörper passiv immunisiert wurden, gegen einen Challenge mit P. aeruginosa am Burned-Mouse-Modell.

Eine transformierte Zellinie wurde hergestellt und kloniert im wesentlichen wie im Beispiel 7 beschrieben, jedoch mit folgenden Änderungen. Eine andere Person wurde immunisiert (Pier et al. (1984) 45: 309) und diente als Quelle für B-Zellen. Der Plattierungsspiegel an E⁻PBMC war ungefähr 2000 Zellen pro Vertiefung. Das Screening erfolgte an einem Pool der Fisher-Immuntypen 1 bis 7. Die schließlich isolierte Zellinie und der sekretierte mono­ klonale Antikörper (IgG₁-Isotyp) werden im folgenden mit 14C1 bezeichnet.

In klinischen Tests waren 59/59 (100%) der Isolate mit Flagellen vom Typ b mit 14C1 positiv. Die Untersuchungen hinsichtlich der Schutzwirkung wurden wie im Beispiel 11 beschrieben durchgeführt und sind in Tabelle VIII zu­ sammengestellt.

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 14C1 am Burned-Mouse-Modell¹

Schutzwirkung des monoklonalen Human-Anti-Flagellen-Typ b-Antikörpers 14C1 am Burned-Mouse-Modell¹

Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Zellinien monoklonale Antikörper und Fragmente davon produzieren, welche mit P. aeruginosa-Flagellen reagieren und Schutz­ wirkung gegen verschiedene P. aeruginosa-Stämme besitzen. Überraschenderweise wurden eine Reihe von monoklonalen Anti­ körpern isoliert, die mit verschiedenen Epitopen auf jeden Flagellen-Typ reaktiv waren. Die erfindungsgemäßen Antikörper ergeben leicht und wirtschaftlich herstellbare Mittel zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von In­ fektionen, die von den meisten P. aeruginosa-Stämmen her­ rühren. Darüber hinaus führen die Zellinien zu Antikörpern, die in Immunoassays und anderen bekannten Methoden Anwendung finden.

Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen, kontinuier­ lich transformierten Zellinien PaF4 VIE8, FA6 IIG5, 20H11 und 21B8 wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt und haben die Hinterlegungs-Nrn. HB9129, HB9130, CRL 9300 und CRL 9301 erhalten.

Claims (33)

1. Zusammensetzung, enthaltend in Kombination mit einem Träger oder Exzipienten wenigstens einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch mit einem Flagellen-Proteinepitop von Pseudomonas aeruginosa zu reagieren, oder ein bindendes Fragment dieses Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper in der Lage ist, die Epitop-Bindung von monoklonalen Antikörpern zu inhibieren, die durch Zellinien mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9129, HB 9130, CRL 9300, CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423 und CRL 9424 produziert werden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper oder das bindende Fragment davon die Motilität der Bakterien inhibiert.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, enthaltend einen oder mehrere monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster dieser monoklonalen Antikörper in der Lage ist, mit einem Epitop von Pseudomonas aeruginosa Flagellen vom Typ a oder Typ b zu reagieren.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter dieser monoklonalen Antikörper in der Lage ist mit einem Flagellentyp zu reagieren, welcher mit dem ersten monoklonalen Antikörper nicht reagiert.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Antikörper monoklonale Humanantikörper sind.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer dieser monoklonalen Antikörper in vivo Schutzwirkung besitzt.

7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich eine γ-Globulinfraktion aus Humanblutplasma und/oder ein Antibiotikum enthält.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich einen pharmazeutischen, physiologisch verträglichen Träger, umfaßt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, enthaltend wenigstens einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, mit einem Flagellen-Protein von Pseudomonas aeruginosa zu reagieren und der in vivo Schutzwirkung besitzt, sowie ein antimikrobielles Mittel, eine γ-Globulinfraktion von Humanblutplasma und einen physiologisch verträglichen Träger.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Humanantikörper ist und daß die γ-Globulinfraktion von Humanblutplasma von Menschen mit einem erhöhten Spiegel an Immunoglobulinen, die in der Lage sind, mit Pseudomonas aeruginosa-Bakterien und/oder Produkten davon zu reagieren, erhalten worden ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 8, enthaltend wenigstens zwei monoklonale Antikörper, die beide spezifisch mit einem unterschiedlichen Pseudomonas aeruginosa-Flagellen-Proteintyp reagieren und die zur Behandlung oder Verhütung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen geeignet sind.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der monoklonalen Antikörper ein monoklonaler Humanantikörper ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich wenigstens einen monoklonalen Humanantikörper, der in der Lage ist, mit wenigstens einer serotypischen Determinante auf einem Lipopolysaccharidmolekül von Pseudomonas aeruginosa zu reagieren und/oder einen mit Exotoxin A reagierenden monoklonalen Antikörper enthält.

14. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Bakteriämie und Septikämie.

15. Zellinien, die monoklonale Antikörper produzieren, welche in der Lage sind, spezifisch mit Pseudomonas aeruginosa- Flagellen vom Typ a oder b zu reagieren, und ausgewählt sind unter Zellinien mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9129, HB 9130, CRL 9300, CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423 und CRL 9424.

16. Zellinien nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper in vivo Schutzwirkung gegen Pseudomonas aeruginosa besitzt.

17. Zellinien nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Hybridomzellinien handelt

18. Zellinien nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonale Humanantikörper produzieren.

19. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch gegen Flagellen-Proteine von Pseudomonas aeruginosa sind und die zur Behandlung oder Verhütung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens eine der Zellinien nach den Ansprüchen 15 bis 18 kultiviert und die Antikörper gewinnt.

20. Verwendung der nach Anspruch 19 erhältlichen monoklonalen Antikörper zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Menschen mit Bakteriämie und/oder Septikämie.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, enthaltend wenigstens einen Antikörper oder ein Fragment davon, welche mit einem Epitop reagieren, das in der Lage ist, an einen monoklonalen Antikörper zu binden, der nach Anspruch 19 erhalten wurde.

22. Monoklonale Antikörper oder ein Fragment davon, die mit einem Epitop reagieren, welches in der Lage ist, an einen monoklonalen Antikörper zu binden, der nach Anspruch 19 erhalten wurde.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 1, enthaltend einen monoklonalen Humanantikörper, der spezifisch mit einem Epitop auf Pseudomonas aeruginosa-Flagella reagiert.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop auf einem Flagella vom Typ a oder Typ b, nicht jedoch auf beiden vorhanden ist.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 70% der Flagella vom Typ b das Epitop aufweisen.

26. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper pan-reaktiv ist.

27. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß der Definition in einem der vorhergehenden Ansprüche, in Kombination mit:
einem monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, mit Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A zu reagieren;
einem monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, mit wenigstens einer serotypischen Determinante auf einem Lipopolysaccharidmolekül von Pseudomonas aeruginosa zu reagieren;
einer Globulinfraktion aus Humanblutplasma;
einer γ-Globulinfraktion aus dem Blutplasma von Menschen mit erhöhten Spiegeln an Immunoglobulinen,
welche mit Pseudomonas aeruginosa und/oder Produkten davon reagieren und/oder
einem antimikrobiellen Mittel zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von bakteriellen Infektionen.

28. Monoklonaler Antikörper oder ein bindendes Fragment davon, der in der Lage ist, die Epitop-Bindung von monoklonalen Antikörpern zu inhibieren, die durch Zellinien mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9129, HB 9130, CRL 9300, CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423 und CRL 9424 produziert werden.

29. Monoklonaler Antikörper mit der gleichen Bindungsspezifität wie einer der monoklonalen Antikörper FA6 II G5 (ATCC HB 9130), PaF4 IVE8 (ATCC HB 9129), 20H11 (ATCC CRL 9300) oder 21B8 (ATCC CRL 9301).

30. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 29, die an ein Label konjugiert sind, das in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.

31. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Label eine fluoreszierende Substanz oder ein Enzym ist.

32. Verwendung eines Antikörpers gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6, 9 bis 13, 15, 16, 19, 22 bis 31 zur Bestimmung der Anwesenheit von Pseudomonas aeruginosa in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit dem monoklonalen Antikörper kombiniert und die Komplexbildung nachweist.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in Form eines Kits zum Nachweis der Anwesenheit von Pseudomonas aeruginosa-Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß er eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, die wenigstens einen monoklonalen Antikörper enthält, wobei der Antikörper mit einem Typ­ spezifischen Flagellaprotein der Bakterien reagiert, und Labels für ein nachweisbares Signal umfaßt, welche kovalent an den Antikörper oder an zweite Antikörper, die mit jedem der monoklonalen Antikörper reagieren, gebunden sind.