CH657989A5

CH657989A5 - Biologisch aktive substanz, verfahren zur herstellung der substanz, sowie die substanz enthaltende, immunoaktive zusammensetzung.

Info

Publication number: CH657989A5
Application number: CH1161/82A
Authority: CH
Inventors: Naoyoshi Suzuki; Tsuneo Hirose; Humio Osaki
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1981-02-27
Filing date: 1982-02-25
Publication date: 1986-10-15
Also published as: AR232003A1; AU549856B2; DE3207019A1; GB2095260A; NZ199752A; US4482543A; NL8200797A; FR2500753A1; GB2095260B; AU8053582A; CA1186629A; FR2500753B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, biologisch aktive Substanz, ein Verfahren zur Herstellung der genannten Substanz sowie immunoaktive Zusammensetzungen, welche die genannte Substanz enthalten.

Es ist kürzlich festgestellt worden, dass im umlaufenden Blut von toxoplasma-hyperimmunen Tieren ein Mediator vorliegt, welcher die Vermehrung von Toxoplasma in Normalzellen desselben Tieres inhibiert. Es ist ebenso festgestellt worden, dass wenn Milzzellen von toxoplasma-hyperimmunen Tieren in Gegenwart eines spezifischen Antigens wie beispielsweise Toxoplasmalysatantigen (im folgenden «TLA» genannt) oder in Gegenwart eines nicht spezifischen Mitogen, wie beispielsweise Concanavalin A (im folgenden «Con A» genannt) oder Phytohämoglutinin (im folgenden «PHA» genannt) kultiviert wird, die überliegende Flüssigkeit der erhaltenen Kultur Faktoren enthält, welche die Vermehrung von Toxoplasma in homologen Zellen inhibiert (Igarashi I., Zbl. Bakt. Hyg., J. Abt. Orig. A244,374-382,1979; Shira-hata T., et al., Z. Parasiteik., 53, 31—40,1977; und Nagasa-waetal., Immunobiology, 157, 307—319,1980).

Der die Toxoplasmavermehrung inhibierende Faktor ist ein Protein, welches eine Substanz zu sein scheint, die ein T-Lymphocyt produziert und welche eine Molmasse von etwa 30 000 bis etwa 40 000 hat. Der Faktor, welcher mit «Toxo-GIF» bezeichnet wird, inhibiert nur die Toxoplasmavermehrung in homologen Zellen. Der Faktor ist nicht imstande, wesentliche Inhibierungsaktivität in heterologen Zellen zu entwickeln. Er zeigt daher Spezifität hinsichtlich der Species. Demgemäss kann der Faktor nicht verwendet werden, um Toxoplasmosis in Menschen oder anderen Tieren als dem angesteckten Tier zu verhüten oder zu heilen.

Ein Ziel dieser Erfindung ist es, eine neue, biologisch aktive Substanz bereitzustellen, die unspezifisch ist hinsichtlich der Species, die aber Immunoaktivität zeigt hinsichtlich der Inhibierung von Toxoplasmavermehrung und zwar auch in heterologen Zellen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, eine biologisch aktive Substanz bereitzustellen, welche die Immunoaktivität zur Inhibierung der Vermehrung von nicht nur Toxoplasma, aber auch anderer Protozoen, Virus, Bakterien und ähnlicher Mikroorganismen wie auch von Tumorzellen, zeigt.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, um die neue, biologisch aktive Substanz zu erhalten.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, immunoaktive Zusammensetzungen bereitzustellen, die protozoacidal, bak-tericidal, virucidal und antitumoral wirken, wobei die genannten Zusammensetzungen die oben erwähnte biologisch aktive Substanz enthalten.

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Diese und weitere Ziele dieser Erfindung werden in der nun folgenden Beschreibung erläutert.

Die erfindungsgemässe, biologisch aktive Substanz ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert; das Verfahren zur Herstellung der genannten Substanz im ebenfalls vorangehenden Patentanspruch 2. Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens, dessen Ergebnis und eine Verwendung der erfmdungsgemässen Substanz ergeben sich aus den Ansprüchen 3 bis 10.

Die biologisch aktive Substanz gemäss dieser Erfindung zeigt unter anderen die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften und strukturellen Eigenheiten:

1) Molmasse

Die Substanz gemäss dieser Erfindung zeigt eine Molmasse von 3000 bis 5000, bestimmt mittels der Gelfiltrationsmethode. Die genannte Methode wird ausgeführt an Sepha-dex G-100 (vernetztes Dextrangel, Produkt der Pharmacia Co., Uppsala, Schweden), an Toyopearl HW-40 oder HW-50 (Polyvinyl-Typgel, Produkt der Toyo Soda So., Ltd. Japan) und an Sephacryl S-200 (vernetztes Allyl-Dextrangel; Produkt der Pharmacia Co., Uppsala, Schweden). Die Molmasse wird bestimmt anhand des Eluierungsdiagrammes, wobei dieses mit demjenigen von bekannten Substanzen verglichen wird. Die Molmasse, die mittels einer anderen Gel-filtrationsmethode an Sephacryl S-200 und Sephadex G-15 (vernetzte Dextrangele, Produkt der Pharmacia Co., Uppsala, Schweden), erhalten werden, liegen ebenfalls zwischen 3000 und 5000.

2) Löslichkeit in Wasser

Die Substanz ist frei in Wasser löslich (gemäss Jap. Phar-macopoeia, 10. Auflage, Regel 22).

3) Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln

Ebenfalls gemäss Jap. Pharmacopeia, 10. Auflage, Regel 22, ist die Substanz praktisch unlöslich in Methanol, Äthanol, Äther, Benzol, Chloroform und Aceton.

4) Verhältnis von Kohlehydrate- und Protein-Gehalten

Die Substanz umfasst Glycide, die hauptsächlich Hexose und Hexosamin enthält. Der Hexosegehalt wird bestimmt durch die Phenol-Schwefelsäurereaktion, der Hexosaminge-halt mittels der Elson-Morgan-Methode. Der Proteingehalt wird bestimmt mittels einer Gesamtstickstoffmessung und zwar mittels der Messanlage Modell MCI TN-02 (Produkt der Mitsubishi Kasei Co., Ltd., Japan). Die derart erhaltenen Resultate in Gewichtsprozenten sind die folgenden:

Protein 85 bis 90 Gew.-%

Hexosamin 9 bis 13 Gew.-%

Hexose (als Glucose berechnet) lbis2Gew.-%.

5) pH-Wert

Eine wässrige Lösung der erfmdungsgemässen, biologisch aktiven Substanz mit der Konzentration von 1 Gew./ Vol.-% weist einen pH-Wert von 7,0 bis 7,2 auf.

6) Thermische Stabilität

Eine 1 G/V-%-ige wässrige Lösung der erfmdungsgemässen Substanz zeigt, auch wenn sie 30 Minuten lang auf eine Temperatur von 60 + 0,1 °C erwärmt wird, die Immunoaktivität und die Aktivität, Toxoplasmavermehrung in homologen Zellen und heterologen Zellen zu inhibieren.

7) IR-Absorptionsspektroskopie

Die beigelegte Figur 1 zeigt ein IR-Analysendiagramm unter Verwendung von KBr. Das Diagramm zeigt die folgenden charakteristischen Absorptionswerte (in cm-1):

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3600 bis 2900 (stark), 1700 bis 1500 (stark), 1440 bis 1380 (mittel), 1160 bis 1080 (mittel), 550 (mittel).

8) UV-Absorptionsspektroskopie s Die beigelegte Figur 2 stellt ein UV-Analysendiagramm dar, welches in einer 1 cm Cuvette für eine 0,1 G/V-%-ige wässrige Lösung der erfmdungsgemässen Substanz erhalten wird. Das Diagramm zeigt eine maximale Absorption bei 274 bis 276 nm.

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9) Farbreaktionen

Eine 0,1 G/V-%-ige wässrige Lösung der erfmdungsgemässen Substanz wird auf Farbreaktionen untersucht und zwar mit den folgenden Resultaten:

15 Lowry-Folin Prozess (Peptid-Bindung): positiv

Ninhydrin-Reaktion (Aminosäure): positiv

Phenol-Schwefelsäurereaktion

(Saccharide): positiv

Elson-Morgan's Reaktion (Amino-Zucker): positiv

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10) Farbe und Aussehen

Weiss und amorph.

11) Konstituierende Aminosäuren

25 Der Proteinanteil der erfmdungsgemässen Substanz umfasst: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Cystin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Ty-rosin, Phenylalanin, Lysin, Tryptophan, Histidin, Arginin und Prolin. Diese Aminosäuren werden analytisch bestimmt 30 mittels eines handelsüblichen Aminosäure-Analysators. Zur Bestimmung von Tryptophan wird die Neubauer-Rhode-Reaktionsmethode (Jap. Phamacopoeia, 10. Ausgabe, C-1108 (1981)) verwendet.

Unter den genannten konstituierenden Aminosäuren lie-35 gen vor allem vor: Asparaginsäure, Glutaminsäure und Ly-sin. Die Analyse mittels des obengenannten Aminosäureana-lysators hat gezeigt, dass die Gehalte dieser drei Komponenten 45 bis 65% des Gesamt-Aminosäureanteils ausmachen.

Die erfindungsgemässe Substanz weist unter anderen 40 eine einzigartige Aktivität zur Inhibierung von Toxoplasmavermehrung sowohl in heterologen wie auch in homologen . Zellen auf. Die Aktivität zur Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in heterologen Zellen bedeutet die Aktivität, Toxoplasmavermehrung auch in Zellen zu inhibieren, welche 45 nicht vom gleichen Säuger stammen, wie die Ausgangsmaterie zur Herstellung der genannten aktiven Substanz. Diese Aktivität wird weiter unten anhand von Untersuchungen erläutert werden.

Proteine, welche die Toxoplasmavermehrung in homolo-50 gen Zellen inhibieren, sind schon bekannt; ein Beispiel dafür ist das Toxo-GIF. Diese bekannten Inhibitoren zeigen also, defmitionsgemäss, Spezifität in der Species. Sie sind also nicht imstande, Toxoplasmavermehrung in heterologen Zellen zu inhibieren. Zudem zeigen die genannten bekannten 55 Proteine Molmassen zwischen 30 000 und 40 000. Die bekannten Substanzen unterscheiden sich daher ganz klar von denjenigen gemäss dieser Erfindung. Tatsächlich ist die Anwesenheit irgendeiner Substanz, die die Toxoplasmavermehrung in heterologen Zellen inhibiert, nicht bekannt. Das ge-60 nannte, neue Glycoprotein mit der oben definierten Aktivität und einer Molmasse zwischen 3000 und 5000 ist in dieser Erfindung zum ersten Mal dargestellt und beschrieben worden.

Die Substanz gemäss der vorliegenden Erfindung hat die 65 obengenannten physikalisch-chemischen Eigenschaften, die ebenfalls obengenannten strukturellen Eigenheiten und als biologische Eigenschaft die Aktivität, Toxoplasmavermeh-rungen auch in heterologen Zellen zu inhibieren. Die Sub-

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stanz ist daher nützlich als toxoplasmacidale Wirksubstanz zur Anwendung bei Menschen und anderen Säugern. Die zu dieser Erfindung gehörenden Untersuchungen haben ferner gezeigt, dass die erfindungsgemässe Substanz nicht nur gegenüber Toxoplasma aktiv ist, sondern auch noch die Vermehrung anderer Protozoen, sowie verschiedener Bakterien, Bazillen, Virus und anderer Mikroorganismen inhibiert. Beispiele solcher Bakterien sind gram-positive Bakterien der Species Micrococcus, Bacillus, usw., gram-negative Bakterien der.Species Escherichia, Proteus, usw. Die erfindungsgemässe Substanz zeigt weiter auch Immunoaktivität zur Inhibierung der Vermehrung von Tumorzellen. Daher ist die erfindungsgemässe Substanz auch nützlich als Wirkstoff für die Verhinderung und Heilung von Infektionen von gesunden Säugern mit den obengenannten Mikroorganismen; d. h. sie zeigt toxoplasmacidale, baktericidale und virucidale Aktivität. Die Substanz ist auch nützlich als Antitumor-Wirk-stoff.

Das Verfahren zur Herstellung der erfmdungsgemässen aktiven Substanz wird im folgenden detailliert beschrieben.

Die Substanz wird erhalten durch Einwirkung eines Enzyms auf Substrate, die vom Blut oder von den Zellen von verschiedenen Säugern erhalten werden, nämlich durch Einwirkung eines proteolytischen Enzyms auf mindestens eines der folgenden Substrate:

(A) Blutplasma oder Serum von einem Säuger, welcher mittels Protozoa wie beispielsweise Toxoplasma, hyperim-munisiert ist.

(B) Kulturlösung über eine Kultur von Milzzellen eines Säugers, der mit Protozoa wie Toxoplasma hyperimmuni-siert ist und

(C) Kulturlösung über eine Kultur von Milzzellen eines gesunden Säugers, welche Zellen in Anwesenheit von einer Kulturlösung (B) und/oder von einem spezifischen Antigen inkubiert sind.

Das so erhaltene Gemisch wird erwärmt zur Inaktivie-rung des Enzyms, woraüf die biologische aktive Substanz aus dem Gemisch gewonnen werden kann. Bevorzugterweise wird das Zwischenprodukt nach der Proteolyse vor der Erhitzung hydrolysiert.

Das Blutplasma oder Serum (A) als Substrat wird mittels bekannter Methoden erhalten. Beispielsweise durch das Auffangen des Bluts eines Säugers, der zuvor gemäss einer in der weiter oben angegebenen Literatur beschriebenen Methode mit Protozoa hyperimmunisiert worden ist. Beispiele für Säuger, die dafür verwendet werden können, sind: Mäuse, Hunde, Ochsen oder Kühe, Pferde, Ziegen, Schafe, Kaninchen, Schweine und verschiedene andere Säuger. Unter den genannten Säugern sind Mäuse, Hunde und Rinder die bevorzugten Tiere. Die einzusetzenden Protozoen sind nicht speziell kritisch. Es werden aber bevorzugt Sporozoen verwendet, speziell Toxoplasma wie Toxoplasma Gondii, Hae-mosporidia wie Plasmodium Berghei (NK-Gattung) und Pi-roplasmea wie Babesia Gibsoni, Babesia Rhodhaini, Babesia Ovata und Babesia Sergenti.

Wenn nun einer der obengenannten Species von Säugern irgendein Protozoon inokuliert wird, bildet sich die erfindungsgemässe Substanz, die später, nach deren Isolierung, die Vermehrung von anderen Protozoen und zugleich noch bei anderen Species, inhibiert. Beispielsweise wird eine Substanz, welche gemäss dieser Erfindung durch Inokulierung von Toxoplasma Gondii in Mäusen gewonnen wird, immu-noaktiv sein und die Toxoplasmavermehrung, die Vermehrung von Plasmodium und anderen Protozoen in Zellen von Mäusen, Hunde, Rinder und verschiedenen anderen Säugern, inhibieren.

Der Säuger kann mit dem Protozoon hyperimmunisiert werden einfach durch Inokulierung des Säugers mit dem

Protozoon. Die Inokulierung kann intraperitoneal, intravenös oder oral geschehen. Die Menge der Protozoen für die Inokulierung ist nicht speziell kritisch und variiert mit der Art des Säugers. Sie hängt auch ab von Protozoon und von der Inokulationsmethode. Es ist normalerweise günstig, zwischen 102 bis etwa 108 Protozoen pro Säuger zu inokulieren. Die Inokulation kann in verschiedenen Etappen, beispielsweise zwei oder drei Impfungen, geschehen. Bevorzugterweise kann der Säuger wie folgt inokuliert werden: Etwa 10 2 bis etwa 108 Protozoen zum ersten mal und etwa 104 bis etwa 108 Protozoen eine gewisse Zeit später, normalerweise 3 bis 10 Wochen nach der ersten Impfung.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfmdungsgemässen Verfahrens wird der Säuger vorerst mittels Inokulierung mit Protozoen hyperimmunisiert und anschliessend mit einem spezifischen Antigen und/oder mit einem nicht spezifischen Mitogen inokuliert. Der Ausdruck «spezifisches Antigen» bezieht sich auf ein Antigen, das gegenüber dem eingesetzten Protozoon Spezifität aufweist. Spezifische Antigene, die im erfmdungsgemässen Verfahren eingesetzt werden können, sind verschieden, je nach eingesetztem Protozoon. Beispielsweise wird für Toxoplasma als Protozoon TLA als spezifisches Antigen verwendet. Im Falle von Plasmodium und Babesia sind nützliche, spezifische Antigene Plasmodium Lysat-Antigen (im folgenden «MLA» genannt) und Babesia Lysat-Antigen (im folgenden «BLA» genannt.) Diese spezifischen Antigene sind bekannt und beispielsweise wie folgt erhältlich: Das Protozoon wird mit Ultraschall-Energie behandelt und die so erhaltene Mischung so wird zentrifugiert, um so wässrige Fragmente davon abzutrennen (siehe dazu Jacobs, L. und M.N. Lunde, J. Parasi-tol., 43, 308—314 (1957), und Ishimine, T., et al., Jap. J. vet. Sei., 41,487 —493 (1979)). Der Ausdruck «nicht spezifisches Mitogen» wird hier verwendet zur Bezeichnung eines Lectin, welches die Blastoid-Transformation von Lymphocyten bewirkt. Typische solche nicht spezifische Mitogene sind: Con A, PHA, usw. Das spezifische Antigen oder das nicht spezifische Mitogen werden normalerweise einige Wochen nach der Inkubation mit den Protozoen verabreicht. Es ist von Vorteil, die Inokulation der Protozoen in zwei oder mehr Schritten auszuführen und das spezifische Antigen oder das nicht spezifische Mitogen in den Wochen 1 bis 5 nach der Inokulierung, bevorzugterweise in der zweiten Woche nach der letzten Inokulierung mit dem Protozoon, zu verabreichen. Das spezifische Antigen oder das nicht spezifische Mitogen wird intravenös verabreicht und zwar in einer Menge von ungefähr 5 bis ungefähr 150 |ig/kg Lebendgewicht des Säugers. Die Methode, die Menge und die Zeit der Inokulation werden selbstverständlich angepasst werden an die Art des spezifischen Antigens und/oder des nicht spezifischen Mitogens, an die Species des Säugers usw. Die Hyperimmunisie-rung mit Protozoen geschieht im Säuger normalerweise im Zeitraum von etwa 10 bis 100 Tagen nach der letzten Inokulierung mit den Protozoen, d.h. mindestens 24 Stunden nachdem das spezifische Antigen oder das nicht spezifische Mitogen verabreicht worden ist. Das Blutplasma oder das Serum kann nun vom derart inokulierten Säuger gewonnen werden.

Die Kulturlösung (B), die ebenfalls für die Herstellung der erfmdungsgemässen Substanz verwendet werden kann, kann wie folgt gewonnen werden:

Vorerst wird ein Säuger wiederum mittels Protozoen hyperimmunisiert. Dies geschieht analog dem Vorgehen zur Gewinnung der Ausgangssubstanz (A). Anschliessend wird die Milz des derart vorbehandelten Säugers entfernt. Die Milzzellen werden zubereitet gemäss der Methode nach Con-ray-Ficoll, Immunol. Cell., 1,265—268 (1971). Die Milzzellen werden durch Zentrifugierung in heparinisierter Hanks-

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Lösung gewaschen. Die genannte Lösung enthält 10 Einheiten Heparin pro ml. (Modern Biology Series 23, «Method of Incubating Animal Cells», von Yukiaki Kuroda, Kyoritsu Shuppan, Japan, 1974, nachfolgend als «heparinisierte HBSS» genannt). Das erhaltene Präcipitat wird nun in TC-199 suspendiert (siehe dazu Igaku no Ayumi (Progress of Medicine), 62, No. 6, August 5,1967). Nun wird die Mischung eingestellt, dass sie ungefähr 104 bis ungefähr 108 Zellen pro ml enthält. Zum genannten TC-199 Medium mit den Milzzellen werden nun 5 bis 20 G/V-% von hitzeinaktiviertem Kalbserum (im folgenden «HICS> genannt) und Antibiotika (bevorzugterweise 100 Einheiten Penicillin G und 100 (ig Dihydrostreptomycin pro ml Medium) gegeben. Weiter werden zum Medium gegeben: etwa 5 bis etwa 150 |j.g/l

— bevorzugterweise etwa 80 [ig bis ungefähr 120 (xg/ml — eines spezifischen Antigens und/oder eines nicht spezifischen Mitogens. Das Medium wird nun ein bis zwei Tage lang bei 37 °C inkubiert. Bevorzugterweise dauert die Inkubation etwa 48 Stunden und zwar in Anwesenheit von Kohlendi-oxydgas. Das spezifische Antigen und das nicht spezifische Mitogen, das in dieser Methode eingesetzt werden, sind die gleichen, wie diejenigen, die bei der Herstellung des Blutplasma oder des Serums (A) weiter oben verwendet werden. Das Medium wird anschliessend zentrifugiert, um die überstehende Lösung zu gewinnen. So wird die Kulturlösung über den Milzkulturen von hyperimmunisierten Säugern gewonnen und dient dann zur Herstellung der erfmdungsgemässen Substanz.

Die überliegende Kulturlösung (C) wird beispielsweise wie folgt erhalten:

Wie für (B) werden Milzzellen von entsprechend vorbehandelten Säugern bereitgestellt und weiterbehandelt. Zum so erhaltenen Medium werden nun die überstehende Lösung (B) in einem Verhältnis von 60 bis 70 Vol.-% oder ein spezifisches Antigen in der Menge von 5 bis ungefähr 150 (ig/ml

— bevorzugterweise in der Menge von 80 bis ungefähr 120 |ig/ml — gegeben. In dieser Methode können die gleichen spezifischen Antigene eingesetzt werden, wie weiter oben bei der Herstellung des Substrats (A). Die überstehende Lösung kann auch zusammen mit den spezifischen Antigenen eingesetzt werden. Die Zellen werden anschliessend 3 Wochen lang bei 37 °C kultiviert. In der Zwischenzeit wird etwa '/a des Mediums durch frisches Medium ersetzt, bevorzugterweise alle 3 Tage. Nach Abschluss der Inkubation wird das Medium mit heparinisiertem HBSS gewaschen. Ein spezifisches Antigen und/oder nicht spezifisches Mitogen wird anschliessend zum Medium gegeben und zwar in einer Menge von ungefähr 5 bis ungefähr 150 (ig/ml, bevorzugterweise in einer Menge von ungefähr 80 bis ungefähr 120 [ig/ ml. Das Medium wird nochmals inkubiert bei 37 °C und zwar ein bis zwei Tage lang, bevorzugterweise etwa 48 Stunden lang, immer in Anwesenheit von Kohlenstoffdioxydgas. Die überstehende Lösung von Milzzellkulturen von gesunden Säugern wird dann gleich erhalten wie die entsprechende Lösung (B) weiter oben.

Die erfindungsgemässe Substanz wird nun erhalten durch Einwirkung eines proteolytischen Enzyms auf eines der obengenannten Substrate (A), (B) oder (C). Das erhaltene Produkt wird, falls gewünscht, hydrolysiert. Anschliessend wird es erhitzt, um so das Enzym zu inaktivieren. Schliesslich wird aus der Lösung oder aus der Mischung nach bekannten Trenn- und Reinigungsmethoden die gewünschte Substanz isoliert.

Beispiele für nützliche proteolytische Enzyme sind gewöhnliche Proteinasen, wie Endopeptidasen, Exopeptidasen und Endo- und Exo-Peptidasen, umfassend Pronase, Papain und Chymotrypsin, Trypsin, Aminopeptidase, Carboxypep-tidase, usw. Diese Enzyme werden einzeln oder gemeinsam

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eingesetzt. Bevorzugte proteolytische Enzyme sind dabei Pronase, Papain und Chymotrypsin. Speziell bevorzugt ist Pronase. Für die enzymatische Behandlung des Substrats werden normalerweise 0,01 bis etwa 0,1 G/V-% des Enzyms 5 eingesetzt. Die Behandlung wird bei denjenigen Temperaturen, pH-Werten, usw. ausgeführt, welche für das eingesetzte Enzym geeignet sind. Beispielsweise wird, bei Einsatz von Pronase, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und bei einem pH von 7 bis 8 gearbeitet. Die Behandlung ist abge-io schlössen, wenn die gesuchte Substanz mit einer maximalen Ausbeute vorliegt. Dies ist normalerweise in 6 bis 24 Stunden der Fall.

Das von der Proteolyse resultierende Gemisch wird nun wärmebehandelt, wodurch das Enzym inaktiviert wird. Die-15 se Wärmebehandlung kann beispielsweise wie folgt geschehen: Das Gemisch wird etwa 1 Stunde lang auf eine Temperatur von 95 bis 100 °C erwärmt. Die gleiche Wärmebehandlung dient auch zur Sterilisierung des Gemischs und zur Aktivierung der gesuchten Substanz. Ebenso werden dadurch 20 wegen Zersetzung andere unerwünschte Substanzen entfernt. Das von der Proteolyse herstammende Produkt kann, vor der genannten Wärmebehandlung, auch hydrolysiert werden. Die Hydrolyse wird bevorzugterweise dann ausgeführt, wenn eine Zersetzung von nicht enzymolysierter Substanzen 25 gewünscht wird. Die Hydrolyse wird ausgeführt unter Einsatz von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder ähnlicher Alkalien bei pH-Werten von mindestens 12. Die gleiche Hydrolyse kann aber auch unter Einsatz von gewöhnlichen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure oder ähnlicher ausge-30 führt werden. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die Hydrolyse durch tropfenweise Zugabe von 10 N Natriumhydroxid zum enzymbehandelten Produkt ausgeführt. Die Zugabe geschieht sehr langsam über Perioden bis 15 Minuten. Das Medium wird gerührt und, nach Erreichen 35 des pH von mindestens 12, etwa 60 Minuten lang auf 95 bis 100 °C erwärmt. Die erhaltene Mischung wird dann mit Eis abgekühlt und mit einem geeigneten Mittel neutralisiert.

Die gesuchte Substanz wird aus der so erhaltenen Mischung mittels bekannter Methoden isoliert. Beispiele sol-40 eher Methoden sind Filtration, Zentrifugation, Gelfiltration, Entsalzung oder eine Kombination der genannten Methoden. Bevorzugterweise wird die Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100, Toyopearl HW-40 und Sephacryl S-200 ausgeführt. Die Entsalzung kann ebenfalls mit-45 tels Gelfiltration an Sephadex G-15 oder mittels Membranfiltration durch Millipore NMWL 103 (Produkt der Nippon Millipore Ltd., Japan), ausgeführt werden.

Die erfindungsgemässe Substanz, die derart isoliert worden ist, wird normalerweise gefriergetrocknet und bei Tem-50 peraturen von 2 bis 7 °C aufbewahrt. Die Substanz ist vorteilhafterweise sterilisiert.

Die erfindungsgemässe Substanz wird zu Medizinalzwek-ken in folgenden Anwendungen eingesetzt. Wie schon beschrieben, zeigt sie Immunoaktivität, speziell Aktivität in der 55 Inhibierung der Vermehrung von verschiedenen Mikroorganismen wie Protozoen, Bakterien, Virus, usw. Die Substanz zeigt aber auch Antitumoraktivität. Sie ist von niederer Toxizität und effizient in Zusammensetzungen sowohl für Menschen wie auch für Säugetiere.

60 Beim Einsatz der erfmdungsgemässen Substanz in Medizinalanwendungen für Menschen und Säugetiere wird die Substanz in verschiedene pharmazeutische Kompositionen formuliert. Dazu werden verwendet: nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe und verschiedene Verdün-65 ner und Exzipientien. Geeignet sind pharmazeutisch annehmbare nicht toxische Trägerstoffe, umfassen — sind aber nicht beschränkt auf — destilliertes Wasser, Salzlösungen wie Natriumchloridlösung, Alkohole, Polyäthylenglykole,

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äthoxylierter Isostearylalkohol, Polyoxyisostearylalkohol, Polyoxyäthylensorbit, Sorbitanester, Gelatine, Lactose, Amylose und ähnliche. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert und, falls gewünscht, mit Hilfsmitteln gemischt werden wie Solubilisierungsmittel, Puffersubstanzen, Analgesika, präservierende Mittel, Stabilisatoren, Emulsifi-katoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Farbstoffe, Geruchsstoffe, usw. Auch können andere, pharmazeutisch wirksame Verbindungen in die Zusammensetzung eingebaut werden.

Solche Zusammensetzungen sind, wenn auch nicht im Sinne einer Einschränkung, parenteral zu verabreichende Präparate. Vor allem ist gedacht an Injektionslösungen, aber auch an Suspensionen und Emulsionen. Die Injektion kann wie üblich intravenös, und zwar einzeln oder in mehreren Portionen verabreicht werden. Die Lösung enthält, ebenfalls wie üblich, Hilfsstoffe wie Glukose, Aminosäuren oder ähnliche. Die Injektion kann aber auch intramuskulär, subkutan, intrakutanös oder intraperitoneal verabreicht werden. Die erfmdungsgemässen Substanz können aber auch in Präparate eingebaut werden, die für die orale Einnahme oder für die topische Verabreichung geeignet sind.

Die Menge der aktiven Substanz in der Zusammensetzung sowie die Dosierung derselben werden je nach Methode und Form der Verabreichung, nach Zweck und nach Symptomen des Patienten festgelegt werden. Im Falle von Injektionen mit etwa 1 bis etwa 8 G/V-% an aktiver Komponente, werden soviele Einspritzungen gemacht, um auf etwa 1 bis etwa 1000 mg/kg Lebendgewicht und Tag zu kommen. Die erfindungsgemässe Zusammensetzung muss nicht einmal täglich verabreicht werden; sie kann auch in drei oder vier Dosierungen pro Tag eingenommen werden. Zusammensetzungen in anderen Formen können in den dabei üblichen Dosierungen verabreicht werden.

Die erfindungsgemässe Substanz wurde pharmakologisch getestet und die entsprechenden Testresultate werden nun im Detail beschrieben.

I. T oxoplasmavermehrungs-Inhibierungstest

Der Test wird gemäss den Methoden ausgeführt, wie sie in den folgenden Literaturstellen beschrieben sind:

Jap. J. vet. Sei., 37,235-243 (1975) und Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt Örig. A244,374-382 (1979).

Die erfindungsgemässe Substanz, welche gemäss den Verfahren der weiter unten beschriebenen Beispiele erhalten wird, wird untersucht und zwar anhand von Monocyten aus Hunde- oder Rinderblut, anhand von Zellen aus dem menschlichen Herz, anhand von Zellen aus Mäusenieren und anhand von peritonealen Macrophagen der Maus. Die genannten Zellen sind vorbereitet worden gemäss den Methoden der oben angegebenen Literaturstellen. Die folgenden Tabellen 1 bis 5 zeigen die Prozente der Toxoplasmavermeh-rungs-Inhibierung, die in den genannten Zellen erreicht werden. Das ist der Prozentsatz derjenigen Zellen, in denen die Anzahl von Toxoplasmen 0,1 bis 5 oder 2: 6 ist. Verglichen wird immer zu der totalen Anzahl von Testzellen. Die entsprechenden Inhibierungsprozente sind gemäss den folgenden Symbolen bezeichnet:

<10

A

10 bis <20

B

20 bis <30

C

30 bis <40

D

40 bis < 50

E

50 bis <60

F

60 bis <70

G

70 bis <80

H

80 bis <90

I

90 bis ^100

J

Tabelle 1

Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in Monocyten aus Hundeblut j Untersu- Probe chungs Nr.

Konzentration an erfindungs-gemässer Substanz (%)

Anzahl von Toxoplasmen in einzelnen Zellen

1-5

>6

io 1

Beispiel 2

0,25

I

B

A

2

Beispiel 2

0,50

J

A

3

Beispiel 2

0,75

J

A

4

Beispiel 2

1,00

J

A

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Beispiel 6

0,75

I

B

A

15 6

Beispiel 8

0,50

J

A

7

Beispiel 5

1,00

H

B

8

Beispiel 7

0,75

F

C

B

9

Beispiel 9

0,75

G

C

B

10

Beispiel 10

0,75

G

C

B

20 il

Vergleichs

10

D

C

D

beispiel*

*Normales Plasma von Hundeblut

Tabelle 2

Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in Monocyten aus Rinderblut

30 Untersu-chungs Nr.

Probe

Konzentration an erfmdungs-gemässer Substanz (%)

Anzahl von Toxoplasmen in einzelnen Zellen

1-5

>6

35

1

Beispiel 2

0,25

I

A

2

Beispiel 6

0,25

J

A

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Beispiel 8

0,50

J

B

A

4

Beispiel 5

0,50

E

D

B

5

Beispiel 7

1,00

J

A

6

Beispiel 9

0,75

J

C

B

7

Beispiel 10

0,75

G

C

B

8

Vergleichs

10

E

D

E

beispiel*

*NormaIes Serum aus Rinderblut

Tabelle 3

so Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in Zellen des menschlichen Herzens

Untersu- Probe Konzentration Anzahl von Toxoplas-

chungs an erfmdungs- men in einzelnen Zellen

Nr. gemässer Sub-

stanz (%) 0 1-5 ^6

55

1

Beispiel 2

0,75

I

B

A

2

Beispiel 6

1,00

J

A

60 3

Beispiel 8

0,50

I

B

A

4

Beispiel 5

0,50

G

C

B

5

Beispiel 7

0,50

H

B

A

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Beispiel 9

0,75

G

C

B

7

Beispiel 10

0,75

G

C

B

65 8

Vergleichsbeispiel*

10

F

D

B

*Normales Serum von Rinderblut

Tabelle 4

Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in Zellen von Mäusenieren

Untersu- Probe Konzentration Anzahl von Toxoplas-

chungs an erfindungs- men in einzelnen Zellen

Nr. gemässer Sub-

stanz (%) 0 1-5 Sï6

1

Beispiel 2

0,50

J

A

2

Beispiel 6

0,25

J

A

3

Beispiel 8

0,50

J

A

4

Beispiel 9

0,50

I

B

5

Beispiel 5

0,50

G

C

B

6

Beispiel 10

0,75

I

B

A

7

Beispiel 7

0,50

G

C

B

8

Vergleichs

10

E

D

E

beispiel*

*Normales Serum von Mäuseblut

Tabelle 5

Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in peritonealen Macrophagen der Maus

Untersu- Probe Konzentration Anzahl von Toxoplas-

chungs an erfindungs- men in einzelnen Zellen

Nr. gemässer Sub-

stanz (%) 0 1-5 ^6

1

Beispiel 2

0,25

I

B

A

2

Beispiel 5

0,50

E

D

C

3

Beispiel 7

0,50

F

C

4

Beispiel 6

1,00

J

A

5

Vergleichs

10

D

E

D

beispiel*

*Normales Serum von Mäuseblut

Die Tabellen 1 bis 5 zeigen, dass die erfindungsgemässe Substanz die Toxoplasmavermehrung sowohl in homologen wie auch in heterologen Zellen effektiv inhibiert.

II. Chemotherapie von akuter, experimenteller Toxoplasmo-

sis

BALB/c Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 18 bis 20 g werden in 3 Gruppen von je 10 aufgeteilt. Sie bilden die Untersuchungsgruppen für die Chemotherapie von experimenteller Toxoplasmosis. Jede Maus wird nun intraperitoneal mit einer isotonischen Natriumchloridlösung, welche zusätzlich 5 x 102 pro 0,25 ml eines virulenten Toxoplasmas Strain S273 enthält, inokuliert. 24 Stunden später wird der Gruppe 1 (Vergleichsgruppe) einmal täglich 4 Wochen lang 0,25 ml Salzlösung gegeben. Der Gruppe 2 wurde Acetylspi-ramycin in Lösung oral zum Vergleich verabreicht und zwar mit einer Dosierung von 0,2 g/kg Lebendgewicht und Tag, täglich während 4 Wochen. Die erfindungsgemässe Substanz, wie sie im weiter unten beschriebenen Beispiel 6 erhalten wird, wird der Gruppe 3 intraperitoneal verabreicht. Die Verabreichung erfolgt einmal täglich 4 Wochen lang und zwar bei einer Dosierung von 1 mg/Tier und zusammen mit der oralen Verabreichung von 0,2 g/kg Lebendgewicht und Tag Acetylspiramycin.

Am 30. Tag nach der Infektion wird einmal der Antikörpergehalt im Serum (nach der Latex-Methode) bestimmt, sowie die Anzahl von Gehirnzysten (mittels des Plankton Cy-

7 657 989

tometers) gemessen. Die Reduktion der Zystenzahl wird gemäss der folgenden Gleichung berechnet:

Verringerung in % = —— — x 100

A steht in der obigen Formel für die Anzahl von Gehirnzysten aus der Gruppe I (Vergleichsgruppe) und B ist die Anzahl Gehirnzysten aus den Gruppen II oder III. io Mäuse vom Typ BALB/c werden mit Gehirnhomogenat aus den Mäusen der Gruppen I, II und III inokuliert und auf ihr Überleben untersucht. Die folgende Tabelle 6 zeigt eine Zusammenstellung aller Resultate der obengenannten Untersuchungen.

15

Tabelle 6

Gruppe Anzahl Zysten +HA-Anti- Anzahl toter

(Reduktion, %) körper Titer Mäuse 20 (Wert) %

I

(Vergleich ohne 4302 - 10/10 100 16/16 Wirkstoff)

25 II

(Vergleich mit 26 (99,4) 7/8 87,5 14/14 Acetylspiramycin III

30 (erfindungsge- 0 (100) 0/10 0 0/13 mässe Substanz)

Tabelle 6 zeigt, dass akut mit Toxoplasma infektierte 35 Mäuse nur unvollständig geheilt werden durch die Verabreichung von Acetylspiramycin (Gruppe II).

Wenn auch die Anzahl Gehirnzysten in der Gruppe II beinahe so tiefliegt wie in der Gruppe III, sind doch alle 14 Sekundär-Mäuse, die mit eben diesem Hirnhomogenat ino-40 kuliert worden sind, gestorben. Im Gegensatz dazu zeigt die Gruppe III erstens eine Zystenanzahl von 0 und keine toten Mäuse, wenn entsprechendes Hirnhomogenat inokuliert wird. Dieses deutet auf totale Abwesenheit von Toxoplasma hin, währenddem in den Hirnsubstanzen der Mäuse aus der 45 Gruppe II Toxoplasmaaktivität immer noch, wenn auch in latentem Zustand, vorhanden ist.

Die Toxoplasmosis kann somit derart vollständig geheilt werden.

so III. Chemotherapie von experimenteller chronischer Toxoplasmosis

Es werden vier Gruppen von je 10 BALB/c-Mäusen gebildet. Jedes Tier enthält intraperitoneal 0,5 ml einer Salzlösung, die 102 schwach virulente Toxoplasmen des Stammes 55 S-273 enthalten. Vier Wochen nach der Infektion werden die Mäuse nochmals mit 0,5 ml der gleichen, das Toxoplasma enthaltenden Salzlösung inokuliert. Vier Wochen später wird einer Gruppe die erfindungsgemässe Substanz verabreicht, wie sie im weiter unten beschriebenen Beispiel 6 erhal-60 ten wird. Eine weitere Gruppe enthält Acetylspiramycin alleine und eine dritte Gruppe erfindungsgemässe Substanz plus Acetylspiramycin. Die letzte Gruppe schliesslich, die vierte, erhält gar nichts, sie stellt also die eigentliche Kontrollgruppe dar. Bei Verabreichung der erfmdungsgemässen 65 Substanz alleine werden jedem Tier täglich 0,5 ml einer Salzlösung intraperitoneal verabreicht, wobei diese Dosis 20 mg der erfmdungsgemässen Substanz enthält. Wenn Acetylspiramycin verabreicht wird, enthalten die 0,5 ml Salzlösung

657 989

8

8 mg des genannten Wirkstoffes. Diese Salzlösung wird oral verabreicht. Bei der Verabreichung der beiden Stoffe zusammen gelten die gleichen Quantitäten und die gleichen Lösungen sowie auch die gleiche Verabreichungsmethode.

Die erhaltenen Effekte werden anhand der Anzahl Gehirnzysten, anhand der Verringerung davon und anhand des Antikörpertiters im Serum bestimmt. Die entsprechenden Resultate sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt.

Gruppe

Tabelle 7

Gehirnzysten

Antikörpertiter

Anzahl

Reduktion (%)

I

(Vergleichsgruppe) 1608,90 - 1:128-1:512

II

(nur Acetylspira- 1052,15 34,61 1:128—> 1:512 mycin)

III

(nur erfindungs- 1061,43 32,91 1:256—> 1:512 gemässe Substanz)

IV

(Kombination von 765,79 52,40 ^1:512 Acetylspiramycin und erfindungsgemässe Substanz)

dium, aber in Anwesenheit von 0,75 mg/ml der erfmdungsgemässen Substanz aus dem Beispiel 6 behandelt wurden.

Tabelle 8

Anzahl Bakterien

Experiment A

Experiment B

Experiment C

in Macrophagen

(0 Std.)

(nach 2 Std.)

10 E. coli 0

0 (%)

1,3 (%)

2,7 (%)

1-10

9,7

33,6

56,9

11-20

29,7

36,0

28,8

21-30

24,6

17,3

7,7

>31

15 =J1

36,0

11,7

4,0

P. vulgaris

0

32,0 (%)

36,2 (%)

50,5 (%)

1-10

59,3

57,3

41,8

11-20

4,2

3,0

5,0

20 21-30

2,7

2,2

1,3

^31

1,8

1,3

B. subtilis

0

0 (%)

1,2 (%)

3,2 (%)

25 WO

11-20

9,5

29,2

34,7

18,5

37,2

33,5

21-30

22,8

21,2

19,3

>31

49,2

11,3

9,3

Tabelle 7 zeigt, dass die mittlere Anzahl Zysten von ungefähr 1609 bei der Kontrollgruppe I auf eine durchschnittliche Anzahl von 1061 reduziert werden kann, wenn nur erfindungsgemässe Substanz verabreicht wird (Gruppe III). Die entsprechende Reduktion geht bis auf 766 bei der Verabreichung von erfindungsgemässer Substanz plus Acetylspiramycin (Gruppe IV). Die derart erreichte Verringerung liegt bei über 50%. Dies zeigt, dass die erfindungsgemässe Substanz Immunoaktivität hinsichtlich therapeutischer Effekte hat, um Gehirnzysten von mit Toxoplasma chronisch infizierter Mäuse zu verringern.

IV. Antibakterielle Aktivität in Macrophagen

1) Gram-positive Bakterien (Bacillus subtilis HIAM 1521) oder gram-negative Bakterien (Escherichia coli B wilder Stamm oder Proteus vulgaris HX 19) werden 30 Minuten lang auf peritoneale Macrophagen von normalen Mäusen einwirken gelassen. Dann wird die Mischung 24 Stunden lang in TC-199 Medium mit 10%-igem fötalem Kälberserum inkubiert. Die Bakterien der genannten Typen werden dabei in etwa 50 mal der Menge der vorliegenden Macrophagen eingesetzt (Experiment A). Die Macrophagen werden nun weiter inkubiert und zwar 2 Stunden lang im gleichen Medium, einmal in Anwesenheit von 0,75 mg/ml an erfindungsgemässer Substanz aus dem Beispiel 6 (Experiment C) und einmal ohne erfindungsgemässer Substanz (Experiment B). Die Anzahl Bakterien, welche nach der zweiten Inkubation in den Macrophagen zurückbleiben, wird gezählt und zwar anhand von Referenzfarbmustern. In der folgenden Tabelle 8 sind die entsprechenden Resultate zusammengestellt.

Die Tabelle 8 zeigt, dass die erfindungsgemässe Substanz effektiv die Vermehrung von gram-positiven und gram-nega-tiven Bakterien in peritonealen Macrophagen von gesunden Mäusen inhibiert.

2) Durch Wiederholen des Vorgehens gemäss Experiment C wurden nochmals Macrophagen inkubiert mit der Ausnahme, dass dieselben 4 Stunden lang im gleichen Me- -

Die Macrophagen werden daher in destilliertem Wasser aufgenommen und anschliessend auf einer flachen Unterlage inkubiert. Die Anzahl der lebenden E. coli-Zellen in den Macrophagen wird anschliessend bestimmt. Das gleiche Verfah-35 ren wird an einer Kontrollsubstanz in Abwesenheit von erfindungsgemässer Substanz ausgeführt.

Die Figur 3 zeigt die Resultate. Kurve 1 stellt die Resultate mit erfindungsgemässer Substanz, Kurve 2 die Resultate ohne erfindungsgemässe Substanz dar. Wie schon Tabelle 8 40 zeigt auch diese Untersuchung, dass die erfindungsgemässe Substanz die Vermehrung von E. coli in peritonealen Macrophagen von gesunden Mäusen auffällig zu inhibieren vermag.

45 V. Inhibierung der Vermehrung von Viren

Die erfindungsgemässe Substanz aus Beispiel 6 wird in Eagle's Minimum Essential Medium (siehe dazu <Igaku no Ayumi, Progress of Medicine, 62, No. 6,5. August 1967) aufgelöst.

so Die verschiedenen Konzentrationen der beigegebenen Substanz sind in der folgenden Tabelle 9 zusammengestellt. Die Lösung wird nun mittels einer 0,45 fim Membrane filtriert (Produkt von Nippon Millipore Ltd), um dieselbe zu sterilisieren. Zu je einem ml der Lösung werden nun HEP-2 55 Zellen (106-Zellen pro Platte) gegeben, welche von humanen epithelialem Laryngal-Tumor stammen und das Ganze wird 2 Tage lang inkubiert. Anschliessend werden die Zellen mit 2 PFU (Plaque Formation Unit / Zellen von Herpes Simplex Virus, Type II, Stamm 186) infektiert und 18 Stunden lang 6o bei 37 °C inkubiert. Dann werden die Platten auf —80 °C abgekühlt, um die Reaktion abzubrechen. Die Anzahl der Viren wird anschliessend gezählt. Das gleiche Verfahren wird ausgeführt mit der Ausnahme, dass die HEP-2 Zellen mit 0,2 PFU/Zelle des Herpes Simplex Virus Typ II (Stamm 186) 65 infektiert werden und das Ganze dann 25 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wird. Kontrolluntersuchungen werden auch ausgeführt, bei denen dann die erfindungsgemässe Substanz eingesetzt wird.

9

657 989

Die folgende Tabelle 9 zeigt die entsprechenden Resultate:

Tabelle 9

Konzentration Vermehrung der Viren der erfindungs- (PFU x 104/10s-Zellen gem. Substanz

(mg/ml) 2 PFU/Zellen 0,2 PFU/Zellen

0

(Vergleich)

1 5

10

196,0 + 9,5

192,0 + 36,0

157,0+3,0 (P<0,001) 121,0+2,0 (P<0,001) 94,0+9,0 (P < 0,001) 38,0+2,0 (P < 0,001) 9,8 + 0,7 (P < 0,001 ) 9,7 ± 1,7 (P < 0,001)

Die signifikante Differenz P in Tabelle 9 wird mittels des Student's- t-Testes berechnet. Die Tabelle zeigt, dass die erfindungsgemässe Substanz die Vermehrung von Viren signifikant inhibiert und zwar bei einer Konzentration von 1 bis 10 mg/ml.

VI. Antitumor-Effekt

0,1 ml einer Salzlösung mit 106-Zellen von Mäuse-Leuke-mie P-388 wird intraperitoneal in männliche 10 Wochen alte BDFi Mäuse transplantiert und zwar im mittleren Teil des s Magens und auf der rechten Seite davon.

Während der folgenden 9 Tage wird erfindungsgemässe Substanz aus dem Beispiel 6 und l-(2-Tetrahydro)-5-fluoru-racil (Ftorafur, FT207, Produkt der TAIHO Pharm. Co., Ltd., Japan) intraperitoneal in das Organ der Tiere injiziert, io Die Verabreichung erfolgt entweder getrennt oder im Gemisch.

Die erfindungsgemässe Substanz wird dabei täglich verabreicht und zwar in einer Menge von 3,0 mg in 0,1 ml Salzlösung auf 10 g Lebendgewicht. Tforafur 207 wird ebenfalls 15 täglich verabreicht und zwar in einer Menge von 1,0 mg/ 0,1 ml Salzlösung auf 10 g Lebendgewicht.

Einer entsprechenden Kontrollgruppe werden gar keine Antitumor-Wirkstoffe verabreicht.

Der Antitumor-Effekt wird in Funktion der Überlebens-20 zahl berechnet und zwar zu jenem Zeitpunkt, da alle Tiere der Kontrollgruppe gestorben sind. Die folgende Tabelle 10 zeigt die entsprechenden Resultate.

Tabelle 10

Untersuchungsgruppe Anzahl Anzahl der Überlebens- Durchschnittl. Überlebens- Mittleres Gewicht Mäuse tage jeder Maus Überlebenstage zahl in (g) vor der

(%) Transplantation

Vergleichsgruppe

7

9,

10,

10

9,86 ±0,69

0

25,86

(keine Wirkstoffe)

10,

11

Erfindungsgemässe

7

11,

12,

11,86 ±0,69

20,29

26,14

Substanz 300 mg/kg

12,

13

Ftorafur 100 mg/kg

7

12,

13,

13,57 ±1,51

37,68

26,14

14,

15,

16

Ftorafur 100 mg/kg

7

16,

17,

18,

18,00 ±1,29

82,61

25,86

+erfindungsgemässe

18,

19,

20

Substanz 300 mg/kg

Die obige Tabelle zeigt, dass die erfindungsgemässe Substanz einen gewissen Antitumoreffekt zeigt, sogar wenn sie alleine verabreicht wird. Zusammen mit bekannten Antitu-mor-Wirkstoffen zeigt sie einen synergistischen Antitumoreffekt.

VII. Akute Toxizität

Die erfindungsgemässe Substanz wird auf ihre akute Toxizität untersucht und zwar gemäss der Methode von Litchfield and Wilcoxon (J. Pharmacol. Exp. Ther., 90,99, 1949) unter Verwendung von weiblichen BALB/c Mäusen.

Es wurden keine Sterbefälle beobachtet, bei der Verabreichung von erfindungsgemässer Substanz bis zu 4000 mg/ kg Lebendgewicht intraperitoneal oder bis zu 2000 mg/kg intravenös. Dementsprechend liegt der LD50 Wert der erfmdungsgemässen Substanz über 4000 mg/kg bei intraperitonealer Verabreichung und bei über 2000 mg/kg bei intravenöser Verabreichung.

Im folgenden werden nun Beispiele beschrieben, in denen vorerst die Herstellung der Ausgangssubstrate für die Herstellung der erfmdungsgemässen Substanz erläutert wird.

Referenzbeispiel 1 5 Beagles-Hunden von je etwa 10 kg Lebendgewicht wurden 106 Toxoplasma (Toxoplasma gondii) intraperitoneal inokuliert. 5 Wochen nach der Inokulation wurden die Tiere 45 nochmals mit 106 Toxoplasmen des gleichen Stamms inokuliert. Die Hunde waren nachher toxoplasmahyperimmun.

2 Wochen nach der zweiten Inokulation wurden jedem Hund intravenös 10 ng/kg Lebendgewicht TLA injiziert. 24 Stunden nach der Injektion wurde das Blut der. Tiere gewon-50 nen.

Das daraus gewonnene Blutplasma zeigt einen Antikör-pertiter von mindestens 1:1000 gemäss dem Sabin-Feldman-Farbtiter oder von mindestens 1:4000 gemäss der indirekten Immunofluorescenz-Methode. Nur Immunoglobulin G (Ig 55 G) Antikörper wird festgestellt.

Referenzbeispiele 2 und 3 Gemäss dem Vorgehen von Referenzbeispiel 1 wird Sub-6o strat gewonnen, in dem jedoch TLA ersetzt wird durch Con A oder PHA.

Die entsprechend gewonnenen Blutplasmen zeigen die folgenden Antikörpertiter:

65 Färb ti ter: mindestens 1:1000

Indirekte Immuno-

fluorescenzmethode: mindestens 1:4000

(nur Ig G Antikörper wird festgestellt).

657 989

Referenzbeispiel 4 Das Vorgehen gemäss Referenzbeispiel 1 wird wiederholt mit der Massnahme, dass Toxoplasma gondii und TLA ersetzt werden durch Piroplasmea (Babesia gibsoni) und BLA. Erhalten werden schliesslich Blutplasmen von Piroplasmea hyperimmunen Hunden. Der Anükörpertiter dieses Blutplasmas beträgt ebenfalls 1:1000, wenn er mittels der indirekten Immunofluorescenzmethode bestimmt wird.

Referenzbeispiel 5 6 Monate alten Kälbern werden 2,5 x 108 Toxoplasmen (Toxoplasma gondii) cervical intramuskulär inokuliert. 5 Wochen nach der Inokulation werden die Tiere nochmals mit 5 x 108 Toxoplasmen des gleichen Stammes inokuliert. 2 Wochen nach der zweiten Inokulation wird TLA intravenös injiziert und zwar bei jedem Tier mit einer Dosierung von 1 (im/kg Lebendgewicht. 24 Stunden nach der letzten Injektion wird das Blut der Tiere gewonnen und daraus das Serum abgetrennt. Das Serum hat einen Latexagglunitierungs-titer von mindestens 1:2048.

Referenzbeispiel 6 Das Vorgehen gemäss Referenzbeispiel 5 wird wiederholt mit der Ausnahme, dass Toxoplasma gondii und TLA ersetzt werden durch Piroplasmea (Babesia spp) resp. BLA. Erhalten werden so Sera von Piroplasmea hyperimmunen Kälbern. Diese Sera haben Antikörpertiter von 1:256 bis 1:1000 (Messung mittels Immunofluorescenz-Methode).

Referenzbeispiel 7 Mäusen werden je 1 x 106 Toxoplasmen (Toxoplasma gondii, schwach virulenter Stamm) intraperitoneal inokuliert. 5 Wochen nach der Infektion werden die Tiere nochmals je mit 1 x 106 Toxoplasmen des gleichen Stammes inokuliert. Während der zweiten Woche nach der zweiten Inokulation wird den Tieren intraperitoneal TLA injiziert und zwar mit einer Dosierung von 10 jxg/kg Lebendgewicht. 24 Stunden nach der genannten Injektion wird das Blut der Tiere gewonnen und daraus das Serum abgetrennt. Dieses zeigt einen Antikörpertiter von mindestens 1 r4000 (Bestimmung mittels Immunofluorescenz-Methode).

Referenzbeispiel 8 Das Vorgehen gemäss Referenzbeispiel 7 wird wiederholt mit der Ausnahme, dass Toxoplasma und TLA ersetzt werden durch Piroplasmea (Babesia rhodhaini), resp. BLA. Erhalten werden so Sera von Piroplasmea-hyperimmunen Mäusen. Das Serum weist einen Antikörpertiter von mindestens 1:4000 auf; Bestimmung mittels Immunofluorescenzmethode.

Referenzbeispiel 9 Das Vorgehen gemäss Referenzbeispiel 7 wird wiederholt mit der Änderung, dass Toxoplasma und TLA ersetzt werden durch Haemosporidia (Plasmodium berghei NK-Stamm), resp. MLA. Erhalten wird so das Serum von Hae-mosporidia-hyperimmunen Mäusen. Das Serum weist einen Antikörpertiter von mindestens 1:1000 auf (Bestimmung mittels indirekter Immunofluorescenz-Methode).

Referenzbeispiel 10 Milzzellen von Toxoplasma-hyperimmunen Mäusen werden zweimal mit heparinisierter HBSS (10 Einheiten Heparin pro ml) gewaschen und zwar mittels Zentrifugierung. Die Sedimente werden anschliessend in TC-199 Medium suspendiert, welches zusätzlich 20% wärmeinaktiviertes Kälberserum (HICS) und 100 Einheiten Penicillin G und 100 |xg Dihydrostreptomycin pro ml als Antibiotika enthält. Erhal10

ten wird so ein Medium mit 1 x 107 Zellen pro ml. Nach Zugabe von 50 ng/ml TLA werden die Zellen 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Dann wird die überliegende Flüssigkeit abgetrennt und zwar mittels Zentrifugierung bei 4 °C. Die s Zentrifugierung erfolgte bei 3000 Umdrehungen pro Minute und dauerte 30 Minuten.

Referenzbeispiel 11

Aus einer gesunden Maus wird die Milz entfernt. Die io Milzzellen werden aufgetrennt und zwar mittels der Conray-Ficoll Methode und zweimal mit heparinisiertem HBSS mit 10 Einheiten Heparin pro ml mittels Zentrifugierung zweimal gewaschen. Das Sediment wird anschliessend in TC-199 Medium mit 20% HICS und dem gleichen Antibiotika wie 15 im Referenzbeispiel 10 suspendiert. Erhalten wird ein Medium mitungefahr 107 Zellen pro ml. Nach Zugabe von 66 Vol.-% der im Referenzbeispiel 10 gewonnenen Kulturlösung werden diese Zellen 3 Wochen lang inkubiert. Ein Drittel des Mediums wird alle 3 Tage erneuert. Nach Abschluss 20 der Inkubation wird die Kultur mit heparinisiertem HBSS (10 Einheiten Heparin pro ml) gewaschen und mit 10 (ig/ml TLA versetzt. Die Zellen werden nochmals 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die überliegende Lösung wird abgetrennt und zwar wiederum mittels Zentrifugierung bei 4 °C. 25 Die Zentrifugierung geschah auch hier bei 3000 Umdrehungen pro Minute und dauerte 30 Minuten.

Referenzbeispiel 12

Analog dem Verfahren gemäss Referenzbeispiel 11 wird 30 eine überliegende Kulturlösung gewonnen mit der Ausnahme, dass 100 (ig/ml TLA anstelle der Kulturlösung aus Referenzbeispiel 10 ersetzt wird.

Im folgenden werden nun Beispiele der Herstellung der erfmdungsgemässen Substanz beschrieben.

35

Beispiel 1

0,1 g Pronase (Pronase P, Produkt der Kaken Chemical Co., Ltd., Japan) werden zu 100 ml Blutplasma aus Referenzbeispiel 1 gegeben. Das Plasma mit dem Enzym werden 40 nun 12 Stunden lang unter Rühren bei 37 °C inkubiert. Anschliessend wird die Mischung erhitzt, um so das Enzym zu inaktivieren. Die Mischung wird darauf mit Eiswasser abgekühlt.

Das enzymbehandelte Plasma wird nun der Gelfiltration 45 an Sephacryl S-200 unterzogen. Verwendet werden 18,6 ml/ Stunde einer 0,01 M Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7,2. Erhalten wird so die Fraktion, die Toxoplasma inhibitorisch aktiv ist.

Die Roh-Fraktion wird nochmals der Gelfiltration un-50 terzogen und zwar am Toyopearl HW-40, wobei die resultierende aktive Fraktion am Sephadex G-15 (Kolonne 40 cm hoch, 1,2 cm Durchmesser) mittels zweifach destilliertem Wasser entsalzt wird. Erhalten werden so 0,6 g der erfmdungsgemässen Substanz mit den oben beschriebenen physi-55 kalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften.

Die Substanz wird nun mittels Filtration sterilisiert, gefriergetrocknet und bei 4 °C aufbewahrt.

Beispiel 2

60 Eine weitere Portion des Blutplasmas aus Referenzbeispiel 1 wird mit einem Enzym behandelt und zwar gleich wie im Beispiel 1.

Dann wird zu 100 ml erhaltenem Plasma 10 ml einer 10 N Natriumhydroxidlösung gegeben und dies unter Rüh-65 ren. Die Lösung wird nun auf 90 bis 100 °C erwärmt und bei dieser Temperatur 60 Minuten lang gerührt und dann wieder abgekühlt. Der pH der Lösung wird nun durch Zugabe von 10 N HCl-Lösung auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wird

11

657 989

nun über Toyo Filter Papier No. 5C (Produkt der Toyo Roshi Co., Ltd. Japan) filtriert. Das Filtrat wird bei 10 000 Umdrehungen pro Minute 20 Minuten lang filtriert und die überstehende Lösung wird gewonnen.

Die so gewonnene überstehende Lösung wird der Gelfiltration an Sephacryl S-200 (Kolonne 90 cm hoch, Durchmesser 0,9 cm) unterzogen, wobei mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung von pH 7,2 eluiert wird. Die Eluationsrate beträgt 18,6 ml/Stunde. Erhalten wird so eine rohe Fraktion.

Die Roh-Fraktion wird noch einmal der Gelfiltration unterzogen und zwar diesmal am Toyopearl HW-40. Die resultierende aktive Fraktion wird an Sephadex G-15 (Kolonne 40 cm hoch, Durchmesser 1,2 cm) entsalzt und zwar unter Verwendung von doppelt destilliertem Wasser. Erhalten werden so 0,54 g der erfmdungsgemässen Substanz mit den oben angegebenen physico-chemischen und biologischen Eigenschaften. Die Substanz wird mittels Filtration sterilisiert, gefriergetrocknet und bei 4 °C aufbewahrt.

Beispiele 3 bis 13

Die erfindungsgemässe Substanz wird in den folgenden Beispielen analog hergestellt wie im Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass als Blutplasma, Serum oder überstehende Kulturlösung (je 100 ml) diejenigen der Referenzbeispiele 2 bis 12 verwendet werden.

Bsp. No. Referenz-Beispiel Nr. (Substrat)

3 2 (Toxoplasma-hyperimmuner Beagle-Hund)

4 3 (Toxoplasma-hyperimmuner Beagle-Hund)

5 4 (Piroplasmea-hyperimmuner Beagle-Hund)

6 5 (Toxoplasma-hyperimmunes Kalb)

7 6 (Piroplasmea-hyperimmunes Kalb)

8 7 (Toxoplasma-hyperimmuneMaus)

9 8 (Piroplasma-hyperimmune Maus)

10 9 (Haemosporidia-hyperimmune Maus)

11 10 (Milzzellen von T oxoplasma-hyperimmuner

Maus)

12 11 (Milzzellen von gesunder Maus)

13 12 (Milzzellen von gesunder Maus)

Die erfindungsgemässe Substanz aus all diesen Beispielen ist die gleiche, wie sie im Beispiel 2 erhalten wird und zwar hinsichtlich physikalischer, chemischer und biologischer Ei- • genschaften.

Die erfindungsgemässe Substanz gemäss Beispiel 6 wird weiter untersucht und zwar hinsichtlich ihrer Löslichkeit in 5 organischen Lösungsmitteln gemäss der folgenden Methode: 100 mg der Substanz werden zu je 5 ml eines organischen Lösungsmittels gegeben und dann 30 Minuten lang darin gerührt. Die Mischungen werden dann 10 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um sie so in io überliegende Lösung und ausgefallene Feststoffe aufzutrennen. Jene der Fraktionen werden nun getrocknet, in 1 ml reinem Wasser aufgenommen und auf den Gesamtstickstoffgehalt hin untersucht. Die entsprechenden Resultate sind die folgenden:

15

Überliegende

Unlösliche

Gehalt in

Fraktion

überliegender

(Mg)

(ng)

Lösung (%)

Äthanol

2,10

56,06

3,6

Methanol

49,41

6,72

88,0

Äther

0,01

59,75

0

Benzol

0,02

58,75

0

Chloroform

1,72

63,79

2,6

Aceton

0,14

66,91

0,2

30 Beispiel 14

Die erfindungsgemässe Substanz wird gleich zubereitet wie im Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass anstelle von Pronase die gleiche Menge Papain (Produkt der Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) eingesetzt wird. Die erhal-35 tene Substanz ist identisch mit derjenigen, wie sie in Beispiel 2 erhalten wird.

Beispiel 15

Die erfindungsgemässe Substanz wird gleich zubereitet 40 wie im Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass anstelle von Pronase Chymotrypsin (Produkt der Miles Feravac. Ltd.) in gleicher Menge eingesetzt wird. Die erhaltene Substanz ist die gleiche wie diejenige, die im Beispiel 2 erhalten wird.

50

55

60

65

3 Blatt Zeichnungen

Claims

657 989

PATENTANSPRÜCHE

1. Biologisch aktive Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Glycoprotein ist, das eine Molmasse von 3000 bis 5000, bestimmt mittels einer Gelfiltrationsmethode, hat und Aktivität zur Inhibierung der Toxoplasma-vermehrung in homologen und heterologen Zellen zeigt und die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist:

a) Löslichkeit: frei löslich in Wasser und praktisch unlöslich in Methanol, Äthanol, Äther, Benzol, Chloroform und Aceton;

b) Verhältnis von Zucker- und Proteingehalte: Protein 85 bis 90%, Hexosamin 9 bis 13% und Hexose als Glucose berechnet 1 bis 2%;

c) konstituierende Aminosäuren des Proteinanteils: Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Cystin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyro-sin, Phenylalanin, Lysin, Tryptophan, Histidin, Arginin und Prolin;

d) Gehalte an Asparaginsäure, Glutaminsäure und Lysin in der Summe aller Aminosäuren: 45 bis 65 Gew.-%;

e) pH einer 1 G/V %-igen, wässrigen Lösung: 7,0 bis 7,2;

f) thermische Stabilität: wenn eine 1 G/V %-ige wässrige Lösung der Substanz während 30 Minuten auf 60+0,1 °C gehalten wird, behält die Lösung die Immunoaktivität zur Inhibierung von Toxoplasmavermehrung in homologen und heterologen Zellen bei;

g) IR-Absorption: charakteristische Absorption erfolgt bei den folgenden Wellenzahlen (cm-1): 3600 bis 2900 (stark), 1700 bis 1500 (stark), 1440 bis 1380 (mittel), 1160 bis 1080 (mittel), und 550 (mittel);

h) UV-Absorption: maximale Absorption wurde gefunden bei 274 bis 276 nm für eine 0,1 G/V %-ige wässrige Lösung;

i) Farbreaktionen: positiver Lowry-Folin Prozess, Nin-hydrinreaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und Elson-Morgan's Reaktion;

j) Farbe und Aussehen: weiss und amorph.
2. Verfahren zur Herstellung der biologisch aktiven Substanz gemäss Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte des Einwirkenlassens eines proteolytischen Enzyms auf mindestens eines der Substrate aus der folgenden Gruppe:

(A) Blutplasma oder Serum eines mit Protozoen hyper-immunisierten Säugers,

(B) Kulturflüssigkeit über Milzzellen eines mit Protozoen hyperimmunisierten Säugers und

(C) Kulturflüssigkeit über Milzzellen eines Säugers im Normalzustand, die in Gegenwart von einer Kulturflüssigkeit gemäss (B) und/oder von einem spezifischen Antigen inkubiert ist, und der Erhitzung der erhaltenen Mischung zur Inaktivierung des Enzyms und Abtrennung der gesuchten Substanz.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, in dem nach der Einwirkung des Enzyms auf das Substrat eine Hydrolyse der erhaltenen Mischung erfolgt.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 3, in dem das Protozoon aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Toxoplasma, Plasmodium und Babesia und in dem das proteolytische Enzym aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Pronase, Papain, Chymotrypsin, Trypsin, Aminopeptidase und Car-boxypeptidase.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 4, in dem das Protozoon Toxoplasma ist.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, in dem das Ausgangsmaterial (A) ist, d.h. Blutplasma oder Serum eines mit Protozoon hyperimmunisierten Säugers ist.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, in dem das Ausgangsmaterial (B) ist, d. h. die Kulturflüssigkeit über Milzzellen eines mit Protozoon hyperimmunisierten Säugers ist.
8. Verfahren gemäss Patentanspruch 2, in dem das Ausgangsmaterial (C) ist, d.h. die Kulturflüssigkeit über Milzzellen eines Säugers im Normalzustand, die in Gegenwart von einer Kulturflüssigkeit (B) und/oder von einem spezifischen Antigen inkubiert ist.
9. Biologisch aktive Substanz, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 2 bis 8.
10. Immunoaktive Zusammensetzung, umfassend als eine aktive Komponente die biologisch aktive Substanz gemäss Patentanspruch 1, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Träger.