DE2537902C2

DE2537902C2 - Als Rifamycin P, Q, R und U bezeichnete Antibiotika und Verfahren zu deren Herstellung

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Publication number: DE2537902C2
Application number: DE2537902A
Authority: DE
Inventors: Piero Arluno-Milano Antonini; Giancarlo Pavia Lancini; Richard Wooburn Green High Wycombe Buckinghamshire White
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1974-08-30
Filing date: 1975-08-26
Publication date: 1982-09-02
Also published as: BE832921A; FI54327C; JPS5151590A; IN140843B; CA1054959A; DK137866B; NZ178519A; FR2282878A1; CS188235B2; YU207475A; NO142446C; AU8392675A; JPS5910798B2; DD119818A5; NO142446B; IE42605L; SE7509571L; SU578014A3; GB1470426A; US4042683A

Description

■ s i:

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen definierten Gegenstand.

Es wurde berichtet, daß Streptomyces mediterranei während der Fermentation in normalem Wachstumsmedium eine Gruppe von Antibiotika erzeugt, die gemeinsam als Rifamycin-Komplex bezeichnet werden (P. Sensi et al„ Antibiotics Annual, 1959-1960, S. 262). Anschließende Arbeiten ergaben, daß bei Zusatz von Natriumdiäthylbarbiturat zum Kulturmedium im wesentlichen ein einziges Fermentationsprodukt entsteht, nämlich Rifamycin B (Margalith P. und Pagani H, Applied Microbiology, 9, 325, 1961). Ferner wurde ein Mutantenstamm von Streptomyces mediterranei gefunden, der im wesentlichen nur Rifamycin B erzeugt, unabhängig von An- oder Abwesenheit von Natriumdiäthylbarbiturat im Fermentationsmedium, so daß ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B resultierte. Der Rifamycin B produzierende Stamm wurde als Streptomyces mediterranei ATCC 21789 bezeichnet (vergleiche US-PS 38 71 965).

Weitere Mutantenstämme wurden erhalten, wenn nisr. einen Stamm von ATCC 13685 mit üblichen chemischen Mutagenen wie salpetriger Säure oder Nitrosoguanidinderivaten oder physikalischen Mutagenen wie Röntgen- oder UV-Strahlung behandelt Die Mutantenstämme sind eher der Gattung Nocardia als der Gattung Streptomyces mediterranei zuzuordnen, was auch gemäß den Vorschlägen von J. E. Thiemann et al. Arch. MikrobioL, 67,147 -155 (1969) für den Stamm Streptomyces mediterranei ATCC13685 zutrifft.

Isolierung der Rifamycine produzierenden Stämme: Eine Sporensuspension von Streptomyces mediterranei ATCC13685 wird mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Menge von 1 mg/ml in einem Tris(hydrcxymethyl)aminomethan-puffer vom pH 9,0 60 Minuten lang bei 28° C behandelt Die mit Mutagen behandelten Sporen werden dann gewaschen und auf Petrischalen, die Bennet-Agar enthalten, ausgebreitet Nach 14tägiger Inkubation bei 28⁰C werden die überlebenden Kolonien herausgenommen und auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung des Wachstums von Bacillus subtilis in folgender Weise untersucht: Eine Agar-Scheibe (Durchmesser 4 bis 8 mm), welche eine einzige Kolonie trägt wird auf eine Petrischale übertragen, die Penassay-Agar bei pH 7,2 enthält und vorgängig in 2%iger Konzentration (Volumen/Volumen) mit Bacillus subtilis angeimpft worden ist

Unter diesen Bedingungen ist Rifamycin B praktisch unwirksam und eine normale, Rifamycin B produzierende Kolonie verursacht keine Inhibierung des Wachstums von Bacillus subtilis auf der Agar-Unterschicht; jede, ein neues Rifamycin mit antimikrobieller Wirkung erzeugende Kolonie hingegen verursacht eine klargeschnittene Zone der Wachstumsinhibierung um die Agar-Scheibe. Auf diese Weise wurden 3 Stämme isoliert denen ursprünglich die internen Bezeichnungen D-2, MM18-6 und M-36 gegeben wurden. Proben dieser Mikroorganismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert und sind dort unter den Bezeichnungen Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia mediterranea ATCC 31065 und Nocardia mediterranea ATCC 31066 registriert Die Kulturen können von dort unter Beachtung der einschlägigen Rechtsvorschriften bezogen werden.

Es wurde nun gefunden, daß sich aus diesen 3 Stämmen als Rifamycin P, Q, R und U bezeichnete neue Antibiotika herstellen lassen.

Die folgende Tabelle 1 berichtet über die makroskopische und mikroskopische Untersuchung der Nocardia mediterranea-Stämme ATCC Nr. 31064, 31065 und 31066. Tabelle 2 berichtet über die Kultureigenschaften dieser Stämme. Auch die Eigenschaften des Ausgangsstammes Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83) werden wiedergegeben:

Tabelle 1

Kolonien

Luftmycel

Sporen

N. mediterranea
ATCC 31064
(D-2)

N. mediterränea
ATCC 31065
(MM 18-6)

N. mediterranea
ATCC 31066
(M-36)

Streptomyces
mediterranei
ATCC 13685
ME/83

Kolonien konisch-kraterförmig und ringelförmig, 2-3 mm Durchmesser, rötl.-braun mit ockergelbem löslichem Pigment

Kolonien konisch-kraterförmig und ringeiförmig, 2-3 mm Durchmesser, tief orange mit tief orange-gelbem löslichem Pigment

Kolonien konisch-kraterförmig und ringeiförmig, 2-3 mm Durchmesser, orange-braun mit bernsteinfarbenem löslichem Pigment

Kolonien konisch-kraterförmig und ringeiförmig, 2,3 mm Durchmesser, orange-gelb mit hell bernsteinfarbenem löslichem Pigment

gräulich bis rosa, verzweigt, 0,6-0,8 μιτι Durchmesser

rosa bis hell orange verzweigt, 0,6-0,8 μιη Durchmesser

rosa bis rosa-orange, verzweigt, 0,6-0,8 μηι Durchmesser

rosa, verzweigt, 0,6-0,8 μιη Durchmesser

zylindrisch

(0,8- μιη χ 3,0-5,0 μ)

zylindrisch

(0,8- μιη χ 3,0-5,0 μ)

zylindrisch

(0,8- μιη χ 3,0-5,0 μ)

zylindrisch

(0,8- μιη χ 3,0-5,0 μ)

Tabelle 2

Medium

N. mediterranea ATCC 31064 (D-2)

N. mediterranea ATCC 31065 (MM.18-61

N. mediterranea
ATCC 31066
(M-36)

Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83)

Hafermehl- Üppiges Wachst um mit Agar etwas runzeliger Ober

fläche, haselbraun mit orangefarbenen Kanten; rosa-beiges lösliches Pigment.

Hefeextrakt- Üppiges Wachstum mit Glucose-Agar sehr runzeliger Ober-(Medium Nr.2, fläche, bernsteinfarben; Shirling und gräuliches Luftmycel, Gottlieb) tief-rostfarbenes lös

liches Pigment.

Emerson's
Glucose-Agar

Bennett's
Agar

Penassay-Agar

Üppiges Wachstum mit sehr runzeliger und krustiger Oberfläche, backsteinrot; bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum, sehr runzelig, rötlichbraun; Spuren von gräulichem LuftmyceL ockergelbes lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum, etwas runzlig, hell orange; kein lösliches Pinment.

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange. Spuren von rosafarbenem Luftmycel, einige Sporen; rosa-beiges lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit sehr runzeliger Oberfläche, backsteinrot; tief-rostfarbenes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit sehr runzeliger Oberfläche, tief orange: tief gelbes lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum, etwas runzlig, hell orange; kein lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
tief bernsteinfarben;
Spuren von rosa Luftmycel; dunkel bernsteinfarbenes lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum mit
runzeliger Oberfläche;
vegetatives Mycel,
dunkel-bernsteinfarben.
Dunkel-bernsteinfarbenes lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum mit
runzeliger Oberfläche,
dunkel-bersteinfarben;
dunkel-bernsteinfarbenes lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum mit
runzeliger Oberfläche,
orange-braun; bernsteinfarbenes lösliches
Pigment.

Mäßiges Wachstum mit
glatter und dünner
Oberfläche, hell
orange: kein lösliches
Pigment.

Mittleres Wachstum mit glatter Oberfläche, gelblich mit rosa Unterseite. Weißliches Luftmycel mit rosa Tönung; Spuren von gelblichem löslichem Pigment.

Üppiges Wachstum mit rauher Oberfläche, gelblich bis rosa; wenig Luftmycel.

Üppiges Wachstum mit rauher Oberfläche, gelblich bis rosa-orange; rosa Luftmycel, blaß bernstein-farbenes lösliches Pigment.

Gutes Wachstum, gelblich nach orangegelb gehend; rosa Luftmycel, hell bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Schlechtes Wachstum.

ίο

Fortsetzung

Medium

N. medilerranea ATCC 31064
(D-2)

N. medilerranea ATCC 31065
(MM 18-6)

N. mcditerranea
ATCC 31066
(M-36)

Streptoniyces niediterranei
ATCC 13685 (ME/83)

Hefeextrakt-Melasse-Agar

Czapek-Dox-

Saccharose-

Agar

Kartoffel-Agar

Glucose-

Asparagin-

Agar

Glycerin-Asparagin-
Agar (Medium
Nr. 5 Shirling
und Gottlieb)

Nähr-Agar

Pridham's-Agar

Stärke-Agar
(Medium Nr. 4
Shirling und
Gottlieb)

Dextrose-Tripton-Agar

Üppiges Wachstum, sehr runzlig, backsteinrot. Tief rostfarbenes lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, hell orange; blaßrosa Luftmycel, einige Sporen, tief zitronengelbes lösliches Pigment.

Spärliches Wachstum, hell orange; hell haselbraunes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange; hellgelbes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, tief orange; Spuren eines gelblichen löslichen Pigments.

Mäßiges Wachstum mit mit dünner und glatter Oberfläche, blaßorange; kein lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, bernsteinfarben; hell rosa/ oranges Luftmycel; rosafarbenes lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange; üppiges rosa Luftmycel, üppige Sporenproduktion; gelbes lösliches Pigment; Stärkehydrolyse negativ.

Üppiges Wachstum mit runzliger Oberfläche, melonenfarbig; orange/ melonenfarbiges lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit sehr runzliger Oberfläche, backsteinrot; tief rostfarbenes lösliches Pigment.

Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche, orange; hell orange^ farbenes Luftmycel.

Kein Wachstum.

Spärliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell orange; kein lösliches Pigment.

Spärliches Wachstum, tief orange; kein lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit runzliger und dünner Oberfläche, blaßorange; kein lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, backsteinrot; rosa Luftmycel, gelbes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
krustiger Oberfläche,
dunkel bernsteinfarben;
dunkel-bersteinfarbenes
lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
lachsfarben; üppiges
Luftmycel rosa-orange;
Spuren eines hellgelben
löslichen Pigments.

Mäßiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
hell orange; kein lösliches Pigment.

Mittleres Wachstum,
goldfarben; kein
lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit
schwach gerunzelter
Oberfläche, tief
orange; Spuren eines
gelben löslichen
Pigments.

Mittleres Wachstum
dünner und glatter
Oberfläche, orange;
kein lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, tief orange; Spuren eines strohfarbenen löslichen Pigments; Stärkehydrolyse negativ.

Mäßiges Wachstum, gerunzelt, orange; orange/gelbes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum,
etwas krustig, bernsteinfarben/braun ;
Spuren eines rosa Luftmycels, bernsteinfarbcn/brauaes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
orange; Spuren von
rosa Luftmycel, hellgelbes lösliches Pigment; Stärkehydrolyse
negativ.

Üppiges Wachstum mit
gerunzelter Oberfläche,
rosenfarben/melonenfarbenes lösliches
Pigment-

Üppiges Wachstum mit rauher Oberfläche, farblos bis gelblich; weißliches Luftmycel, tief bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Schlechtes Wachstum mit dünner Oberfläche, farblos bis hell melonenfarbig; Spuren eines rosaweißen Luftmycels.

Schlechtes Wachstum mit dünner Oberfläche, farblos; Spuren eines weißlichen Luftmycels, kein lösliches Pigment.

Miitleres Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, hell orange/rosa; etwas hellgelbes lösliches Pigment.

mittleres Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, hell orange/rosa; etwa hellgelbes lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, melonenfarben bis orange; rosa/weißes Luftmycel.

Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, farblos mit hummerroten Flecken; rosa Luftjnyce!.

Schlechtes Wachstum, farbig bis hell orange/rosa; spärliches weißes Luftmycel, Stärkehydrolyse zweifelhaft

Üppiges Wachstum, rosa/orange; rosa Luftmycel, hell gold-' gelbes lösliches Pigment.

Fortsetzung

12

Medium

N. mediterranea ATCC 31064
(D-2)

N. mediterranea
ATCC 31065
(MM 18-6)

N. mediterranea ATCC 31066
(M-36)

Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83)

Hickey's und

Tresner's

Kobalt-Agar

Mäßiges Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, farblos; weißliches Luftmycel, beiges lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar Üppiges Wachstum, (Medium Nr. 7 sehr runzlig und Shirling und krustig, backsteinrot; Gottlieb) tiefgelbes lösliches

Pigment; Tyrosinreaktion positiv (gut).

Ca-Malat- Spärliches Wachstum

Agar mit glatter und dünner

Oberfläche, hellorangegelb; Chromgelbes lösliches Pigment nahe dem Wachstum und korallenfarben/rosa in der Mitte, Hydrolyse positiv.

Eialbumin- Üppiges Wachstum mit Agar glatter Oberfläche, hell

orange; hellgelbes lösliches Pigment.

Pepton- Üppiges Wachstum,

Glucose- schwach gerunzelt.

Agar tief orange; rosa

Luftmycel, gelbes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
rosa/melonenfarben;
hell beige/rosa lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum,
sehr runzlig und
krustig, tief orange;
rosa/lederfarbenes
lösliches Pigment,
Tyrosinreaktion stark
positiv.

Spärliches Wachstum,
hell orange; Hydrolyse
des Ca-Malats negativ.

Mäßiges Wachstum mit schwach gerunzelter Oberfläche, rosa/melonenfarben; hellbeiges lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum, hellrosa/orange; etwas rosa Luftmycel, gelbliches lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit Schlechtes Wachstum.

krustiger Oberfläche,

tief gebräunt/orange;

gelb/ ockerfarbenes

lösliches Pigment;

Tyrosinreaktion stark

positiv.

Schlechtes Wachstum, hell orange; kein lösliches Pigment, Ca-Malat-Verwertung negativ.

Mittleres Wachstum farblos, weißlich/rosa Luftmycel; teilweise Verwertung des Ca-Malats.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
orange; kein lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum,
gerunzelt, tief orange;
goldgelbes lösliches
Pigment.

Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche, orange/gelb; hellgelbes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit gerunzelter Oberfläche, gebräunt bernsteinfarben; gebräunt bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Mittleres Wachstum, rosafarben.

Gelatine Hydrolyse positiv. Hydrolyse positiv. Hydrolyse positiv. Hydrolyse positiv.

Nitrat-Brühe Reduktion negativ. Reduktion negativ. Reduktion negativ. Reduktion negativ.

Lackmusmilch Keine Koagulierung keine Peptonisierung.

Keine Koagulierung
keine Peptonisierung.

Keine Koagulierung keine Peptonisierung.

Pepton-Hefeextrakt-
Eisen-Aear
(Medium Nr. 6
Shirling und
Gottlieb)

Kartoffelbrei

Mäßiges Wachstum mit Mäßiges Wachstum mit Schlechtes Wachstum glatter Oberfläche, glatter Oberfläche, mit glatter Oberfläche,

blaßorange: H ,S-

Produktion negativ.

blaßorange: H₂S-Produktion negativ.

farblos; kein lösliches Pigment, H,S-Produktion negativ.

LoeffJers
Blutserum

N₂O+Agar
Difco2%

Spärliches Wachstum, orangefarben.

Kein Wachstum.

Spärliches Wachstum, farblos, Spuren von weißem Luftmycel; üppige SporenproduktioE.

Sehr spärliches Wachs- Schlechtes Wachstum, tum, orangefarben. hellorange.

Schlechtes Wachstum, farblos.

Kein Wachstum.

Spärliches Wachstum,
farblos, Spuren von
weißem Luftmycel;
üppige Sporenprodufctkm.

Kein Wachstum.

Spärliches Wachstum, farblos, Spuren von weißem Luftmycel; üppige Sporenproduktion.

	13	25 37 902	* 14	• ι
Fortsetzung				i
Medium	N. mediterranea ATC<~ 31064 (D-2)	N. mediterranea ATCC 31065 iMMlS-6)	N. mediterranea ATCC 31066 (M-36)	Streptomyces φ mediterranei p ATCC 13685 jg (ME/83) I
Magermilch- Agar	Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange; Cadmiumgelbes lösliches Pigment, Caseinhydrolyse gut.	Gutes Wachstum, schwach gerunzelt, orange mit braunem Schatten; haselnuß braunes lösliches Pigment, Caseinhydro lyse gut.	Üppiges Wachstum mit gerunzelter Oberfläche, orange; goldbraunes lösliches Pigment, Caseinhydrolyse stark positiv.	f I 1

Shilling und Gottlieb: "Methode for characterization of Slreptomyces species". Intern. J. Syst. Bact., Bd. 16, (1966) 313-338.

Folgende Tabelle 3 macht Angaben über die physiologischen unter Vergleich mit den Eigenschaften des Ausgangsstammes.

Tabelle 3

Eigenschaften der neuen Nocardia-Stämme

N. mediterranea (D-2)

N. mediterranea (MM 18-6)

N. nWiterranea
(M-36)

Streptomyces

mediterranei

(ME/83)

Stärkehydrolyse Tyrosinhydrolyse Caseinhydrolyse Ca-Malat-hydrolyse Nitratreduktion Lackmusmilch

Gelalineverflüssigung

keine Koagulierung keine Peptonisierung

keine Koagulierung
keine Peptonisierung

keine Koagulierung keine Peptonisierung

Tabelle 4 berichtet über die Verwertung von Kohlenstoffquellen, wobei die folgenden Methode, von Friedham und Gottlieb (J. Bact. Bd. 56,(1948) S. 107) erhalten wurden.

Tabelle 4

Daten nach der

N. mediterranea (D-2)

N. mediterranea (MM 18-6)

N. mediterranea
(M-36)

Streptomyces mediterranei (ME/83)

Arabinose Xylose Glucose Mannose Fructose Lactose Sucrose Inosit

Rhamnose Raffinose Salicin Mannit Glycin Sorbit Na-Succinat Na-citrat Na-acetat Inulin Dulcit Cellulose Maltose Galactose Glycerin

Das Fermentationsverfahren zur Herstellung von Rifamycin, P, Q, R und U besteht darin, daß man einen der Nocardia mediterranei-Stämme ATCC Nr. 31064, 31065 oder 31066 in einem Nährmedium züchtet, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und essentielle Mineralsalze enthält, bis das Medium eine wesentliche antibiotische Wirkung erreicht hat, worauf man die Rifamycine aus dem Medium extrahiert Man züchtet die Stämme unter Rühren und Belüftung bei submersen Bedingungen und Temperaturen von 25 bis 37 und vorzugsweise 28⁰C Als Kohlenstoffquellen können folgende Kohlehydrate und Kohlenstoffverbindungen eingesetzt werden: Glucose, Galactose, Lactose, Rohrzucker, Maltose, Glycerin oder Mannit Brauchbare Stickstoffquellen sind zum Beispiel Aminosäuren und deren Gemische, Peptide, Proteine und deren Hydrolyseprodukte, zum Beispiel Pepton, Hefeextrakt Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, gelöste Fischbestandteile, Fleischextrakte, wäßrige Fraktionen aus Getreidesamen. Die Fermentation kann während 180 bis 220 Stunden durchgeführt werden. Der Ausgangs-pH-Wert, der im allgemeinen auf etwa 6,4 bis 6,6 eingestellt wird, steigt am Ende der Fermentation auf 7,0 bis 8,5 an. Im allgemeinen beobachtet man die besten Ergebnisse nach 200 Stunden Fermentation. Nach beendeter Fermentation werden die Rifamycine auf folgende Weise isoliert: Das Fermentationsmedium wird beim End-pH-Wert von 7,0 bis 8,5 filtriert. Das Filtrat wird rasch angesäuert auf einen pH-Wert unterhalb etwa 5, um die beste Stabilität der Antibiotika sicherzustellen. Die aktiven Substanzen werden durch mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel wie Chloroform, Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylacetat extrahiert. Das Volumenverhältnis zwischen Medium und Lösungsmittel hängt vom jeweiligen Lösungsmittel ab. Im allgemeinen arbeitet man mit einem Volumenverhältnis von 2 : 1 bis 10 :1.

Das Mycel enthält daraufhin noch mikrobiologisch wirksame Bestandteile, die durch ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel extrahiert werden können, worauf die organischen Phasen, die bereits die Hauptmenge der Rifamycine enthalten, vereinigt werden. Die Extraktion aktiver Substanzen aus dem Mycel kann auch mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Aceton erfolgen. In diesem Fall wird die Flüssigkeit filtriert, das Aceton wird im Vakuum abdestilliert, und die Rifamycine werden mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, worauf das Verfahren wie vorstehend angegeben weitergeführt wird.

Sobald die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanzen in das Lösungsmittel überführt worden ist, wird dieses im Vakuum zur Trockne eingeengt, vorzugsweise bei einer unterhalb 30⁰C liegenden Temperatur.

Der Rohextrakt der Rifamycine kann chromatographisch an einer Kieselgel-Säule gereinigt werden. Vor dem Chromatographieren wird der Rohextrakt in einem Phosphatpuffer vom pH 7,0 bis 8,0 gelöst und mit einem milden Oxidationsmittel behandelt. Die Pufferlösung wird dann mil einem mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmittel extrahiert, und dieser organische Extrakt enthält die erfindungsgemäße als Rifamycin R bezeichnete Verbindung. Die extrahierte Pufferlösung wird auf pH 2 bis 4 angesäuert und erneut mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Dieser Extrakt enthält drei erfindungsgemäße als Rifamycine P, Q und U bezeichnete Verbindungen.

Die v/eitere Reinigung des Rifamycin R erfolgt durch Chromatographieren an einer mit Kieselgel gefüllten Säule unter Eluieren mit einem passenden Gemisch organischer Lösungsmittel.

Der zweiie, die Rifamycine P, O und U enthaltende organische Extrakt wird in ähnlicher Weise gereinigt

Beispiel 1

Der Stamm Nocardia mediterranea ATCC 31064 wird 6 bis 8 Tage auf Bennetts-Agar vermehrt und bei 28° C inkubiert

Mit der vom Agar-Schrägnährboden erhaltenen Kultur werden 2 500-m-l-Erlenmeyerkolben uater sterilen Bedingungen inokuliert Die Kolben enthalten 100 ml Vegetationsmedium folgender Zusammensetzung:

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,3 eingestellt.

Die so inokulierten Kolben werden 72 Stunden bei 28° C in einer Schüttelmaschine mit Hin- und Herbewegung gehalten. Der Inhalt der beiden Erlenmeyer-Kolben wird als Inokulum verwendet, wobei man ihn in einen 10 Liter-Vorfermenter schüttet, der 4 Liter des obigen Vegetationsmediums enthält. Die Inkubierung erfolgt bei 28° C unter Bewegung mit 300 Umdrehungen pro Minute und Belüftung mit 1 Vol./Vo]./Min. Nach einer Wachstumszeit von 48 Stunden erhält man ein Volumen von 7 bis 10% gepackter Zellen. In der nächsten Stufe wird ein 10 Liter-Glasfermenter verwendet, der 4 Liter des nachstehenden Fermentationsmediums enthält:

Erdnußmehl

Soyabohnenmehl

(NH₄)₂SO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

Glucose

Glycerin

KH₂PO₄

Propylenglycol

CaCO₃

Na-diäthylbarbiturat

CuSO₄ · 5 H₂O

FeSO₄ · 7 H₂O

ZnSO₄ · 7 H₂O

MnSO₄ · 4 H₂O

CaCl₂ · 6 H₂O

(NH₄J₆Mo₇O₂₄ · 4 H₂O

H₂O auf

25 g

5g

9,5 g

0,85 g
95 g
40 g

Ig

5g

8,5 g

1.7 g

2.8 mg
8.5 mg

42,5 mg
3,4 mg
1.7 mg
0,85 mg
1 Liter

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt, dann wird 60 Minuten bei 120°C sterilisiert, worauf der pH-Wert 6,4 beträgt. Als Inokulum verwendet man den Inhalt des Vorfermenters in einer Menge, die 5% des Fermenterinhalts entsprich*.

Die Fermentation erfolgt bei 28° C unter Bewegung mit 750 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 VoI./VoL/Min. Als Antischaummittel wird Silicon A verwendet. Während der

230 235/182

Rindfleischextrakt	5g Ϊ
Hefeextrakt	5g 1
Pepton	5g 1
Caseinhydrolysat	3g Pf
Glucose	20 g I
NaCl	1,5 g jj
H₂O auf	1 Liter I

Fermentation schlägt die Farbe des Mediums um in ein charakteristisches Rotbraun. Nach 200 Stunden Wachstumszeit erhält man das Gesamtvolumen gepackter

Zellen. Der pH-Wert der Brühe beträgt dann 7,5, und zu diesem Zeitpunkt wird das Medium aufgearbeitet

Beispiel 2

Eine nach der Vorschrift von Beispiel 1 erhaltene Kultur von Nocardia mediterranea ATCC 31064 wird in einem Kolben unter Rühren zubereitet Zur Vorkultur wird sie in einen 10 Liter-GIasfermenter gegossen, der 4 Liter folgenden Mediums enthält:

Glucose
Erdnußmehl
CaCO₃

MgSO< · 7 H₂O
KH₂PO₄
FeSO₄ · 7 H₂O
ZnSO₄ · 7 H₂O
MnSO₄ · 4 H₂O
H₂O auf

5g
7,5 g
1,65 g
033 g
033 g
33 mg
16,5 mg
U mg
1 Liter

Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt, dann wird 50 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert worauf der pH 6,4 beträgt. Nach 48 Stunden Wachstumszeit beträgt das Volumen gepackter Zellen 6 bis 8% des Gesamtvolumens. Ein 10% entsprechendes Inokulum wird für einen 20 Liter-GIasfermenter verwendet, der 10 Liter folgenden Fermentationsmediums enthält:

Maisquellwasser	20 g
Soyabohnenmehl	15 g
(NH₄)₂SO₄	6g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,85 g
Glucose	100g
KH₂PO₄	ig
CaCO₃	6g
FeSO₄ · 7 H₂O	8,5 mg
ZnSO₄ · 7 H₂O	42,5 mg
MnSO₄ · 4 H₂O	3,4 mg
CuSO₄ · 5 H₂O	2,8 mg
CoCl₂ · 6 H₂O	1,7 mg
H₂O auf	1 Liter

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt, dann wird 50 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, worauf der pH 6,4 beträgt. Die Fermentation erfolgt bei 28° C 200 Stunden lang. Bei der Aufarbeitung beträgt der pH der Fermentationsbrühe 7,5.

Die gemäß den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Fermentationsbrühen werden wie folgt gereinigt: Das Mycel wird abfiltriert und verworfen, das Filtrat wird mit 10%iger (Volumen/Volumen) Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dreimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Dieser organische Extrakt wird im Vakuum bei 35° C zur Trockene eingeengt und der Rückstand (4 g bei Beispiel 1 und 11 g bei Beispiel 2) wird in 0,05molarer Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 unter Zusatz von Natriumnitrit gelöst, wobei man eine Endkonzentration von 0,2% (Gewicht/Volumen) erhält. Nach '/2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Pufferlösung dreimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden im Vakuum bei 35° C zur Trockene eingeengt (erster Äthylacetat-Extrakt).

ίο Die extrahierte Pufferlösung wird mit 10%iger Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dreimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert Die vereinigten organischen Extrakte werden im Vakuum bei 35° C zur Trockene eingeengt (2. Äthylacetat-Extrakt).

Das aus dem 1. Äthylacetat-Extrakt erhaltene Trockenpulver (1,4 g bei Beispiel 1 und 4,2 g bei Beispiel 2) wird in Chloroform gelöst und an einer mit Kieselgel (0,21 —0,063 mm ASTM) gepackten Säule Chromatographien, wobei man 2% Methylalkohol (Volumen/Volumen) enthaltendes Chloroform als Eluierungsmittel verwendet Als erstes Hauptprodukt wird Rifamycin R aus der Säule eluiert das man an seiner orange/braunen Farbe erkennt

Bei der Dünnschichtenchromatographie auf Kieselgel-Platten (Merck 60 F₂S₄) mit Chloroform/Methylacetat (95 :5) als Lösungsmittelsystem ergibt Rifamycin R den Rf-Wert 0,5S- Die Rifamycin R enthaltenden Fraktionen werden vereinigt im Vakuum bei 35° C zur Trockene eingeengt und erneut in Äthylacetat gelöst, worauf die Lösung mit 0,01 η-Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen wird. Der organische Extrakt wird auf ein kleines Volumen eingeengt und das Rifamycin R kristallisiert dann bei 4⁰C aus der Lösung (Ausbeute 600 mg bei Beispiel 1 und 1,6 g bei Beispiel 2). Der

zweite Äthylacetatextrakt wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel in ähnlicher Weise gereinigt Der trockene Rückstand (2,4 g bei Beispiel 1 und 4,2 g bei Beispiel 2) wird in Chloroform gelöst und einer Kieselgelsäule zugeführt Die Säule wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (98 :2) eluiert Die zunächst austretende Verbindung ist Rifamycin U, dann folgt Rifamycin P und schließlich Rifamycin Q. Sämtliche 3 Verbindungen zeigen in der Eluierungslösung eine gelb-orange Farbe und können auf Grund ihrer Mobilität im Dünnschichtenchromatogramm identifiziert werden. Auf Kieselgelplatten (Merck 60 F₂S₄) besitzen diese Rifamycine bei Verwendung von Chloroform: Methanol (95 :5) als Losungsmittelsystem folgende Rf- Werte:

50

55

Rifamycin U
Rifamycin P
Rifamycin Q

Rf = 0,63
Rf = 0,57
Rf = 032

Die die Rifamycine U, P bzw. Q enthaltenden Fraktionen werden jeweils vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingeengt, der Rückstand wird aus Äthylacetat kristallisiert. Bei Beispiel 1 erhält man 80 mg Rifamycin U, 400 mg Rifamycin P und 280 mg Rifamycin Q, bei Beispiel 2 190 mg Rifamycin U, 900 mg Rifamycin P und 750 mg Rifamycin Q.

Wiederholt man die Verfahren der obigen Beispiele, jedoch unter Verwendung von Nocardia mediterranea ATCC 31065 oder Nocardia mediterranea ATCC 31066 als produzierende Stämme, so erhält man Ausbeuten gleicher Größenordnung.

19 20

Physikalische und chemische Eigenschaften sowie Formeln der erhaltenen Rifamycine
Rifamycin P

CH₃ CH₃

HO

CH₃

CH₃ Ö

Vorstehende Formel war am Anmeldetag noch nicht festgestellt, sondern wurde erst nachträglich ermittelt.

Elementaranalyse (%):

gefunden: C = 60,6; H = 6,2; N = 3,8; 0 = 25,2; S =4,1.

Absorptionsbanden im UV und sichtbaren Licht:

Methanol ₍ _y

Kmx (ηιμ) E_x _c°_m

0,1 n-HCl

-ι cm

406	197	416	183
350	(Schulter)	300	319
297	344	225	521
257	423
224	550

Das gesamte Spektrum zeigt Fig. 1. Das Spektrum wurde mit einem Perkin Eimer Spectracord 4000 A aufgenommen.

Infrarot-Spektrum:

Die wichtigsten Absorptions-Peaks in Nujol liegen 1070 (m, br) 1030 (w); 982 (m); 960 (m); 925 (w); 890

bei folgenden Frequenzen (cm-¹): (m); 818 (w); 770 (w); 735 (w).

3700-3150 (m, br); 3100 (w); 3060-2800 (vs); 1465 (s); Das vollständige Spektrum zeigt F i g. 2, es wurde mit

1380 (b): Nujol; 1722 (m); 1645 (m, br); 1580 (m); einem Spektrometer Perkin Eimer Modell 421 aufge-

1510 (m); 1325 (m); 1250 (s, br); 1160 (m); 1130 (w); 55 nommen.

Massenspektrum:

Das bei 7OeV erhaltene Massenspektrum zeigt den Peak für das Molekülion M⁺ bei/*7/e738. Das Spektrum wurde mit einem Hitachi Perkin Eimer RMU-6L-Spektrometer aufgenommen.

Kernmagnetisches Reson^nzspektrum:

Das vollständige Spektrum bei 100 MH* in CDCl₃ polarographische Verhalten der Rifamycine, die ein zeigt F i g. 3. Chromophor mit Chinonstruktur besitzen.

Die Verbindung zeigt nicht das charakteristische

Rifamycin Q	HO-	21 (	\	CH₃ i	25 37	/	902	I
	CH₃- r	/		\	/\	1-CH₃
CH₃COO	T¹	:h₃	{	OH	0 / \/
CH₃	CH₃-	\	DH		NH
CH₃O-/	J ( OH		\
	J	/
/

CH₃

N== C —

Elementaranalyse: gefunden:

= 6_>3;N=3,60;O=25,3;S=4,2

Absorptionsbanden im UV und sichtbaren Licht (in Methanol):

λ,_ιιαχ (ηιμ) e\ ^_n

178

(Schuiier)

305

405

518

30

35

40 Infrarot-Spektrum:

Die wichtigsten Absorptions-Peaks in Nujol liegen bei folgenden Frequenzen (cm-¹):

3700-3300 (s, br); 3300-3080 (m, br); 3040-2780 (vs); 1460 (s); 1378 (s); Nujol; 1740 (m); 1700 (m); 1650 (s, br); 1605 (s, br); 1555 (s); 1510 (m, br); 1315 (w); 1275 (m); 1240 (m); 1220 (m); 1160 (m); 1090 (m); 1050 (m, br); 1020 (w); 970 (m); 945 (w); 910 (m); 808 (m): 765 (w); 720 (w).

Das vollständige IR-Spektrum zeigt F i g. 4.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Das vollständige Spektrum bei 60MHz in CDCI3 zeigt F ig. 7.

Rifamycin R

CH₃COO

CH₃O

CH, CH₃ CH

CH₂OH

Elementaranalyse (%):

gefunden: C = 62,0; H = 6,4; N = 2,2; O = 29,6.

Absorptionsbanden im UVundsichtbarenLicht(in0.1 η HCL in Methanol):

	Infrarot-Spektrum:	**1 cm
		444
219	415
"281	114
340	72
410

3700-3100 (s, br); 3040-2780 (vs); 1465 (s); 1380 (s); Nujol; 1745 (s); 1710 (m); 1640 (s); 1600 (s); 1505 (s); 1415 (m); 1325 (s); 1260 (s, br); 1220-1130 (s, br);

1120 (w); 1075 (s); 1020 (w); 975 (s); 950 (w); 920 (w);

888 (m); 823 (m); 785 (w, br); 735 (w, br); 650 (w, br). Das vollständige IR-Spektrum zeigt F i g. 5.

Massenspektrum:

Das bei 70 eV erhaltene Massenspektrum zeigt den Peak für das Molekülion M+ m/e 711.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Das vollständige Spektrum bei 60MHz in CDCl₃ zeigt F ig. 6.

Die Verbindung zeigt das charakteristische polarographische Verhalten der Rifamycine mit einem Chromophor mit Chinonstruktur.

Rifamycin U
Elementaranalyse:

C = 58,4%; H=5,92%; N = 4,02% und
S=3,48%.

Absorptionsbanden im UV und sichtbaren Licht
(in Methanol):

Kiax l^mu) -El cm

163

(Schulter)
265
389

451

Infrarot-Spektrum:

Die wichtigsten Abs.orptions-Peaks in Nujol liegen bei folgenden Frequenzen (cm-·):

3700-3100 (m, br); 3060 (vw); 3040-2740 (vs); 2720 (vw); 1460 (s); 1378 (m); Nujol; .1750-1705 (m, br); 1680-1620 (m, br); 1600 (s); 1558 (s); 1490 (w, Schulter); 1308 (w); 1270 (w, Schulter); 1245 (m, Schulter); 1225 (m); 1160 (m); 1120 (w); 1090 (vw); 1070 (w); 1030 (vw); 1020 (vw); 1000 (vw); 975 (w); 960 (ty, Schulter); 905 (m); 850 (m); 800 (vw, Schulter); 777 (vw); 802 (w); 760 (vw); 720 (vw); 685 (vw);670(vw).

(s = stark, m = mittel, w = schwach, br = breit, vs = sehr stark, vw = sehr schwach).

Rf-Wert 0,63 (Kieselgelplatte, Chloroform, Methanol 95:5).

Von den folgenden bekannten mikrobiologisch erzeugten Rifamycinen:

DE-PS 10 89 513 Rifamycin A, B, C, D, E; DE-PS 17 92 019 Rifamycin SV, DE-PS 19 29 114 Rifamycin L, DE-OS 20 36 799 a) 27-Desmethoxy-27-hydroxyrifamycin SV, b) 27-Desmethoxy-27-hydroxyrifamycin B und c) 25-Desacetyl-27-desmetnoxy-27-hydroxyΓifamycin SV unterscheidet sich Rifamycin U dadurch, daß es Schwefel enthält, während sämtliche vorstehend aufgeführten bekannten Rifamycine keinen Schwefel enthalten.

Die nachträglich ermittelten Analysenwerte sind an den ursprünglich mit dem R[-Wert 0,63 im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol 95 :5 offenbarten Rifamycin U feststellbar. Von einigen der vorstehend genannten bekannten Rifamycine wurde außerdem der Rf-Wert unter den gleichen Bedingungen wie beim Rifamycin U ermittelt und betrug in sämtlichen Fällen 0,00. Somit stellt auch der R₍-Wert von Rifamycin U gegenüber diesen Verbindungen einen unterscheidungskräftigen Parameter dar.

Biologische Wirkung der Verbindungen:

Das Wirkungsspektrum der Rifamycine P, Q und R in vitro zeigt folgende Tabelle:

Tabelle 5

Stämme

Kleinste inhibierende Konzentration (μ§/ηι1)

Rifamycin H Rifamycin y Rifamycin R Rifamycin U

Staphylococcus aiireus A ι CC 6538
Staphylococcus aureus ATCC 6538

(20 % Rinderserum)
Staphylococcus aureus Tour
Staphylococcus aureus Tour Rifampicin-resistent
Streptococcus hemolyticus C 203
Streptococcus faecalis ATCC 10541
Diplococcus pneumoniae UC 41
Proteus vulgaris X19 H ATCC 881
Escherichia coli ATCC 10536
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Mycobacterium tub. H 37 Rv ATCC 9360
-: Aktivität nicht ermittelt

0,00235	0,039	0,019
0,00235	0,078	0,0047
0,0035	0,06	0,00235
25-50	>100	100
0,0047	0,019	0.00312
0,0035	0,312	0,19
0,0047	0,039	0,00625
0,78	12,5	12,5
3,12	12.5	50
12,5	50	-
12^5	50	100
1	2,5	0.1

0,05-0,1

>50

2*5

Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden bezüglich ihrer Wirksamkeit und ihrer Toxizität mit bekannten Rifamycinen, nämlich Rifamycin-SV, und Rifampicin verglichen. Folgende Tabelle gibt die Ergebnisse repräsentativer Versuche an Mäusen, denen Staphylococcus aureus oder Escherichia coli injiziert worden war, wieder.

Verbindung

infiz. Stamm

ED₅₀ mg/kg bei Mäusen

Rifamycin P Staphylococcus aureus 0,3 0,8

Rifamycin P Escherichia coli 40

Rifamycin Q Staphylococcus aureus 8

Rifamycin SV Staphylococcus aureus 17 74

Rifampicin Escherichia coli 40

Rifamycin P
Rifamycin SV
Rifampicin

Mäusen i.p.

mg/kg
850
625
416

Zum weiteren Nachweis des technischen Fortschritts der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde ein Vertreter derselben mit Bezug auf IvJindesthemmkonzentration sowie Toxizität mit einer Reihe an Antibiotika verglichen, die gegenüber dem Testerreger wirksam waren und denen gegenüber dieser Erreger 26

nunmehr praktisch resistent ist. Die Ergebnisse sind aus nachstehenden Tabellen ersichtlich:

Stamm Mindesthemmkonzentration

andere Antibiotika Rifamycin P

Staphylococcus

aureus

ATCC 6538

desgl.

des"!.

desgl.

Penicillin

Kanamycin

Tetracyclin

Neomycin

Erythromycin

Chloramfenicol

Cephaloridin

Lincomycin

Bacitracin

400 100 200 100 100 200 200 100

0,0078

0,004

0,007

0,0078

0,007

0,015

0,007

>400 0,015

Antibiotika

LD₅₀ bei Mäusen i.p.

Kanamycin

Lincomycin

Neomycin

Tetracyclin

Erythromycin

Novobiocin

Rifamycin P

530 810 115 250 490 480 850

Die antibakteriellen in vivo und in vitro Wirksamkeiten wurden gemäß V. Arioli et al., Arzneimittel-Forschung 17, 523 (1967) bestimmt.

Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Rifamycin P der Formel

CH₃ CH₃

CH₃ Ö

und durch Absorptionsbanden im UV und sichtbarem Licht (F*g. 1):

Methanol

-1 cm

0,1 nHCl Κ,αχ (ηιμ)

406 197 416 183 350 (Schulter) 300 319 297 344 225 521 257 423 224 550

sowie charakteristischen Infrarot-Absorptionspeaks in Nujol bei den Frequenzen (cm-¹):

3700-3150 (m, br); 3100 (w); 3060-2800 (vs); 1465 (s); 1380 (b); Nujol; 1722 (m); 1645 (m, br); 1580 (m); 1510 (m); 1325 (m); 1250 (s, br); 1160 (m); 1130 (w); 1070 (m, br); 1030 (w); 982 (m); 960 (m); 925 (w); 890 (m); 818 (w); 770 (w); 735 (w) gemäß Fig. 2,

Molekülionen-Peak M⁺ im Massenspektrum bei 70 eVbeim/e738,

NMR-Spektrum bei 100 MH_Z in CDCl₃ gemäß Fig.3 und R₍-Wert 0,57 (Kieselgelplatte, Chloroform/Methanol 95:5), gekennzeichnet
2. Rifamycin R der Formel

CH₃ CH₃ CH₃

CH₃COO

CH₃O

CH₂OH

und durch Absorptionsbanden im UV und sichtbarem Licht (0,1 n-HCl in Methanol):

_Ι (πιμ)

219

281 340 410 444 415 114 72

10

sowie charakteristischen Infrarot-Absorptions-Peaks in Nujol bei Frequenzen (cm- ·):

3700-3100 (s, br); 3040-2780 (vs); 1465 (s); 1380 (s); Nujol; 1745 (s); 1710 (m); 1640 (s); 1600 (s);

(s); 1415 (rn); 1325 (s); 1260 (s, br);

1220-1130 (s, br); 1120 (w); 1075 (s); 1020 (w); 975(s);950(w);920(w);888(m); 823 (m); 785 (w, ,5

CH₃

CH₃

CH₃COO

br); 735 (W₁ br); 650 (w, br)

Molekülionen-Peak M⁺ im Massenspektrum bei 7OeV bei m/e 711, NMR-Spektrum bei 60MHz in CDCI3 gemäß Fig.6 und Rf-Wert 0,59 (Kieselgelplatte, Chloroform/Methanol (95 :5) gekennzeichnet
3. Rifamycin Q der Formel

CH₃

CHjO —{ CH₃

C-CH₂OH CH₃

und durch Absorptionsbanden im UV und sichtbarem Licht (in Methanol):

1% l cm

406 350 297 257 224 178 (Schulter) 305 405 518

sowie charakteristischen Infrarot-Absorptionspeaks in Nujol bei den Frequenzen (cm-·):

3700-3300 (s, br); 3300-3080 (m, br); 3040-2780 (vs); 1460 (s); 1378 (s); Nujol; 1740 (m); 1700 (m); (s, br); 1605 (s, br); 1555 (s); 1510 (in. br); (w); 1275 (m); 1240 (m); 1220 (m); 1160 (m); (m); 1050 (m, br); 1020 (w); 970 (m); 945 (w); (m); 808 (m); 765 (w); 720 (w) gemäß F i g. 4,

NMR-Spektrum bei 60 MHz in CDCl₃ gemäß F i g.

und den Rf-Wert 0,32 (Kieselgelplatte, Chloroform/ Methanol 95 :5) gekennzeichnet. 4. Rifamycin U, gekennzeichnet durch:

Elementaranalyse: C=58,4%; H=5,92%; N = 4,02% und S = 3,48%

Absorptionsbanden im UV und sichtbaren Licht (in Methanol):

_:(ηιμ)

412 353 299 258 220 163 (Schulter) 265 389 451

sowie charakteristische IR-Absorptionspeaks in Nujol bei den Frequenzen (cm-¹):

3700-3100 (m, br); 3060 (vw); 3040-2740 (vs); 2720 (vw); 1460 (s), 1378 (m): Nujol; 1750-1705 (m,br); 1680-1620 (m, br); 1600 (s); 1558 (s); 1490 (w, Schulter); 1308 (w); 1270 (w, Schulter); 1245 (m, Schulter); 1225 (m); 1160 (m); 1120 (w); 1090 (vw); 1070 (w); 1030 (vw); 1020 (vw); 1000 (vw); 975 (w); 960 (w, Schulter); 905 (m); 850 (m); 802 (w); 800 (vw, Schulter); 777 (vw); 760 (vw); 720 (vw); 685 (vw); 670)

und den R_f-Wert 0,63 (Kieselgelplatte, Chloroform/ Methanol 95:5).

5. Verfahren zur Herstellung der neuen Rifamycine Rifamycin P, Rifamycin Q, Rifamycin R und Rifamycin U gemäß Anspruch 1 -4, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und essentieller Mineralsalze Nocardia mediterranea ATCC 31064 (D-2), Nocardia mediterranea ATCC 31065 (MM 18-6) oder Nocardia mediterranea ATCC 31066 (M 36) bei einer Temperatur von 25 bis 37° C und einem pH-Wert von etwa 6,4 bis etwa 8,5 fermentiert, die Rifamycine P, Q, R und U aus dem Fermentationsmedium durch Extraktion der Fermentationsbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei einem unterhalb 5 liegenden pH-Wert gewinnt, aus dem Extrakt in Gegenwart eines wäßrigen Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 bis 8,0 und eines milden Oxidationsmittels zunächst das Rifamycin R mittels eines mif Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels abtrennt, das abgetrennte Rifamycin R auf übliche Weise durch Säulen-.und Dünnschichtchromatographie an Kieselgel reinigt, die extrahierte wäßrige Pufferlösung auf pH-Wert 2 bis 4 ansäuert, erneut mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel extrahiert und das Gemisch der Rifamycine P, Q und U durch Säulenchromatographie an Kieselgel auf übliche Weise in die Einzelkomponenten zerlegt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Rifamycin R aus der Säule mit 2% Methanol enthaltendem Chloroform eluiert

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rifamycine U, P und R nacheinander mit Chloroform/Methanol 98:2 eluiert und die einzelnen Fraktionen aus Äthylacetat umkristallisiert.