DE2039990C2

DE2039990C2 - Neue Antibiotika B-5050 A bis F (Maridomycin I bis VI), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Zubereitung

Info

Publication number: DE2039990C2
Application number: DE19702039990
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Takatsuki Osaka Asai; Toru Kawanishi Hyogo Hasegawa; Eiji Takarazuka Hyogo Higashide; Toyokazu Nara Kishi; Masayuki Suita Osaka Muroi; Hideo Kobe Osaka Ono
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-08-13
Filing date: 1970-08-12
Publication date: 1981-10-29
Also published as: NO130362B; YU34907B; NL154782B; FI46261B; CH565861A5; ES382680A1; NL7011997A; GB1273643A; DE2039990A1; FR2068492A1; AT302526B; FI46261C; SE362263B; CA928237A; BE754819A; FR2068492B1; YU206170A; MY7500012A; CS181204B2; DK124557B

Description

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika B-5050 A bis F (Maridomycin 1 bis Vl), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Zubereitung.

Es wurde nun gefunden, daß eine Gruppe von neuen antihintKrhen Substanzen von einem zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus gebildet und in der Kulturbrühe angehäuft wird, und daß die einzelnen Mitglieder oder Komponenten der neuen Antibiotika in ihren Eigenschaften sowie in ihren chemischen Strukturen eng verwandt sind, daß sie jedoch aus der Kulturbrühe getrennt als Einzelverbindungen oder als Gemische in jedem gewünschten Reinheitsgrad isoliert werden können. Die Gruppe der neuen Antibiotika ist mit dem Sammelbegriff »Antibiotikum B-5050« bezeichnet worden. Es wurde ferner gefunden, daß das Antibiotikum B-5050 als aktive Bestaf Steile die Antibiotika enthält, die als Antibiotika B-5050-A, B-5050-B. B-5O5O-C, B-5O5O-D, B-5050-E und B-5050-F bezeichnet worden sind. Diese Antibiotika gehören zum Macrolid-Typ und werden auch als Maridomycine I bis Vl bezeichnet

Gegenstand der Erfindung sind demnach die in den Ansprüchen 1 bis 6 gekennzeichneten Antibiotika B-5O5O-A bis -F (Maridomycine I bis VI), der durch Anspruch 7 gekennzeichnete, diese Antibiotika enthaltende Komplex, ferner das durch die Ansprüche 8 bis 10 gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika sowie die durch Anspruch 11 gekennzeichneten pharmazeutischen Zubereitungen, die diese Antibiotika enthalten.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird der zur Gattung Streptomyces gehörige Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus B-5050, der von den Erfindern aus einer Bodenprobe in Chichibu, Saitama (Japan) isoliert wurde, verwendet Die mikrobioiogisehen Eigenschaften dieses Mikroorganismus sind nachstehend wiedergegeben. In der folgenden Beschreibung bedeutet »Rdg.« die entsprechende Farbbezeichnung aus Ridgway »Color Standards and Color Nomenclature«. Die Beobachtungen wurden an Kultivierungen bei 28° C für 14 Tage gemacht, falls nicht anders angegeben. Die Abkürzungen »W«, »L«, »R« und »LP« haben folgende Bedeutungen: W = Wachstum, L = Luftmycel, R = Rückseite und LP = lösliches Pigment

Morphologische Eigenschaften

Die sporentragenden Hyphen sind schleifenförmig &5 oder spiralförmig. Jede Spore ist elliptisch oder zylindrisch und hat eine Größe von etwa 0,7 bis 1,7 μ x etwa O^ bis 1,4 μ und eine glatte Oberfläche.

Kultureigenschaften

1) Czapek-Agar

W: gut, farblos bis blaßgelblich-braun

L: gut. samtartig, weiß bis Pale Olive Gray (Rdg.

Ll, 23""-f) oder Light Olive Gray (Rdg. Ll,

23""-d) mit schwarzen Flecken
R: Smoke Gray (Rdg. XLVI, 2 l""-d)
LP: nicht vorhanden

2) Glucose-Czapek-Agar
W: mäßig, farblos

L: mäßig, weiß bis Pale Drab Gray (Rdg. XLVf, 17""-f)

R: farblos bis Pale Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-f) LP: Pale Vinaceous-Fawn (Rdg. XL, 13"'-f)

3) Glyccrin-Czapek-Agar
W: mäßig, farblos

L: mäßig, pulverförmig, weiß bis Pale Drab Gray

(Rdg. XLVI, 17""-f)
R: Cream Color (Rdg. XVI, 19'-f)
LP: nicht vorhanden

4) Glucose-Asparagin-Agar

W: mäßig, farblos bis blaßgelb

L: mäßig, weiß bis gräulich-braun mit schwarzen

Flecken
R: Cream Color (Rdg. XVI, 19'-f) bis Smoke Gray

(Rdg. XLVI21 ""-d)
LP: nicht vorhanden oder blaß-gelblichbraun

5) Nähragar

W: mäßig, sich ausbreitend, farblos bis schwachgelb

L: mäßig, weiß

R: Cream CoIor(Rdg. XVI, 19'-f)
LP: schwachgelb

6) Nährbrühe

W: schlecht bis mäßig, farblos, sinkt zu Boden
L: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden

7) Glycerin-Nähragar

W: gut faltig, farblos bis schwachgeib
L: gut, weiß

R: Cream Buff (Rdg. XXX, 19"-f)
LP: gelb bis goldgelb

8) GIucose-Nähragar

W: gut faltig, farblos bis schwachgeib

L: gut weiß bis Pallid Mouse Gray (Rdg. LI, 15""'-f)

R: Sorghum Brown (Rdg. XXXIX, 19"'-i)
LP: Fawn Color (Rdg. XL, 13'")

	20	9	Stärke-Agar	39	990	10	Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
	W: schlecht, farblos		L: mäßig, pulverförmig, weiß	Die Beobachtungen nach der Methode von Pridham
	L: nicht vorhanden oder schlecht, weiß		R: Buff Pink (Rdg. XXVIiI, ll"-d)	und Gottlieb (Journal of Bacteriology, Band 59 (1948),
	R: blaßgelb LP: nicht Vorhanden		LP: Vinaceous-Cinharhon(Rdg.XXIX, l3"-b)	Seite 107) an Kulturen, die 10 Tage bei 28° C bebrütet
	Hefeextrakt-Agaf		19) Tyrosirv-Agar W: mäßig, farblos	wurden, sind nachstehend in Tabelle 1 zusammenge
	W: gut, faltig, farblos bis schwachgelb	-.	L: schlecht, weiß bis Light Drab (Rdg. XLVt,	stellt.
10)	L: g*':l,weiß		17""-b)
	R: Cream Buff (Rdg. XXX, 19"-d)		R: Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""<d)bis Light Drab
	LP: gelb bis goldgelb		(Rdg. XLVI₁17""-b)	Kohlenstofiquelle Wachstum
	Ei (kultiviert bei 37^eC)		LP: nicht vorhanden	Maltose +++
	W: mäßig, sich ausbreitend	IO	20) Pepton-Agar	Saccharose +++
U)	L: mäßig, pulverförmig, weiß		W: schlecht, farblos	Lactose ++
	LP: nicht vorhanden		L: schlecht, weiß	Raffinose +++
	Kartoffel-Stichkultur		R: farblos	Trehalose -f~i-+
	W: gut. faltig, erhöht, blaßgelb	15	LP: nicht vorhanden	Salicin -
12)	L: schlecht, weiß bis Pallid Mouse Gray (Rdg. Ll		21) Nitratreduktion	Esculin -
	15 -f)		Positiv auf Czapek-Nährlösung und Peptomedium.	Inulin ± oder +
	LP: nicht vorhanden			D-Mannose +++
	Möhren-Stichkultur		£.£. J I IJVIi \JlJ-3\r «Vii tj tttt* nu Wachstumszone: 8 bis 10 mm	Stärke +++
	W: gut, faltig		Enzymatische Zone: 27 bis 30 mm	Glycerin +-H-
13)	L: mäßig, weiß			Natriumacetat +
	LP: nicht vorhanden		Wenn dieser Stamm auf einem synthetischen Medium
	Lackmusmilch (kultiviert bei 37° C) W: ringförmig, sinkt später zu Boden		kultiviert wird, ist das vegetative Mycel farblos oder
	Peptonisierungohne Koagulierung	25	blaßgelb bis blaßbraun. Lösliches Pigment wird nicht gebildet; wenn es gebildet wird, ist es Pale Vinaceous- Fawn (Rdg. XL, 13"'-f) oder blaß-purpur bis blaß-gelb-
14)	Löf f ler-Serum (kultiviert bei 37° C)		lichbraun. Das Luftmycel ist zuerst weiß, später Pale Olive Gray (Rdg. LI. 23"'"-d) bis Pale Drab Gray (Rdg.
	W: mäßig, glänzend, farblos	JO	XLVI, 17""-f) oder wird in einigen Fällen schwarz. Bei
15)	L: nicht oder schlecht, weiß		Kultivierung auf einem proteinhaltigen Medium ist
	LP: nicht vorhanden		dieser Stamm farblos oder gelb bis Fawn Color (Rdg.
	keine Verflüssigung		XL, 13'"), bildet jedoch kein melanoides Pigment Dies
	Gelatine-Stichkultur		bedeutet, daß dieser Stamm ein nicht-chromogener Typ
	(kultiviert 25 Tage bei 24° C)	35	ist.
K)	W: schlecht, begrenzt, blaßgelb L: schlecht, weiß
	keine Verflüssigung
	Cellulose:
	kein Wachstum	40
17)
	Calciummaleat-Agar
	W: mäßig, farblos
18)	Tabelle 1	45
	KohlenstofTqucIle Wachstum
	Erythrit ±
	Adonit +++
	D-Sorbit +++
	i-Inosit ++
	D-Mannit +++
	Dulcit ±
	D-Xylose +
	L-Arabinose +
	L-Sorbose ±
	D-Galactose +++
	D-Glucose +++
	D-Fructose +++

'*	11 Fortsetzung	20 39 990	12	Wachstum
	KohlcnslolTiiucllc	Wachstum KohlcnslolTquellc	++
	Rhiimnose Melibiosc	± NatriumsuGcinat +++ Kontrolle
1 i 4 9	+ + + : Reichliches Wachstum. ++: Gules Wachstum. + : MäUigcs Wachstum. ± Schlechtes Wachstum. Kein Wachstum.

Ein Vergleich dieser mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes B-5050 mit denen bekannter Mikroorganismen an Hand von S. A. Waksman »The Actinomyccles«, Band 2 (herausgegeben von The Williams & Wilkins Co. 1961) ergibt, daß dieser Stamm mit Stfeptdmyces hygroscopicus in den meisten Merkmalen mit Ausnahme der Fähigkeit zur Bildung von löslichem Pigment auf synthetischen Medien, der Cellulosezersetzung, Nitratreduklion usw. eine große Ähnlichkeit haL Aus diesen Beobachtungen wird geschlossen, daß der Stamm B-5050 zu Streptomyces hygroscopicus gehört Eine Probe dieses Stammes wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (Japan) unter der Nummer IFO-12995 hinterlegt, der nach Maßgabe der Rechtsvorschriften über den Umgang mit Mikroorganismen an Dritte zu den üblichen Bedingungen abgegeben wird. Im folgenden wird dieser Stamm als »Streptomyces hygrocopicus Nr. B-5050« oder einfach als »Stamm B-5050« bezeichnet. Es ist zu bemerken, daß »Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995)« eine hinterlegte Probe dieses Stammes

in bezeichnet

Das antibiotische Spektrum des Stammes B-5050, ermittelt nach der Kreuz-Strichmethode, ist in Tabelle 2 angegeben. Das Ergebnis wurde wie folgt erhalten: Der Stamm wurde auf eine Nähragarplatte (pH 7,0) oder

J5 eine Glycerin-Nähragarplatte (pH 7,0) aufgestrichen. Der Mikroorganismus wurde 4 Tage bei 28°C bebrütet. Der in Tabelle 2 genannte Testorganismus wurde quer über den Strich dieses Stammes auf der Platte aufgestrichen, wobei erneut 18 Stunden bei 37°C (im Falle gewöhnlicher Bakterien) oder 40 Stunden (im Falle von säurefesten Bakterien) kultiviert und anschließend die Länge der Hemmzone gemessen wurde. Das Ergebnis zeigt, daß der Stamm B-5050 das Wachstum von grampositiven Bakterien stark hemmt und auch das Wachstum von Mycobacterium avium hemmt.

Tabelle 2

Testorganismus

Länge der Hemmzone, mm Nähragar

Glycerin-Nähragar

Escherichia coli	0	0	0	0
Proteus vulgaris	0	0	0	0
Staphylococcus aureus	30	32	29	30
dto. (*)	0	0	-	-
Bacillus subtilis	>40	>40	29	28
Bacillus cereus	26	30	27	27
Bacillus brevis	31	23	-	-
Sarcina lutea	35	39	34	35
Micrococcus flavus	34	36	34	36
Mycobacterium avium	—	_	20	23

(*): Dieser Stamm ist gegen Oleandomycin und Erythromycin resistent -: Nicht getestet

Die Beobachtung dieses Stammes nach der Kreuzstrich-Agar-Scheibenmethode (Motoo Shibata: Annual Reports of TheTakeda Research Laboratories, Band 20 (1956), Seite 222 ff.) unter Verwendung von Bacillus subtilis als Testorganismus und Nähragarplatten als Testrnedium hat ergeben, daß der Stamm B-5050 ein physiologisch basisches Antibiotikum bildet Das Ergebnis der Beobachtung ist in Tabelle 3 genannt

Tabelle 3

Tesiorganismus

Pii-Wert des
Testmediums

Länge der Hemmzone, mm

Bacillus subtilis

15 23

Die mikrobiologischen Eigenschaften der zur Familie Actinomycetaceae gehörenden Mikroorganismen, insbesondere der Gattung Streptomyces, liegen jedoch nicht immer fest und unterliegen Mutationen, gleichgültig, ob die Mutation spontan oder künstlich hervorgebracht wird, z. B. mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen oder durch Einwirkung mutagener chemischer Verbindengen wie Stickstofflost, Nitrosoguanidin oder Schwermetallsalzen. Streptomyces hygroscopicus B-5050 ist keine Ausnahme und kann Mutanten ergeben, die vom Ursprungsstamm etwas abweichen, beispielsweise in den Kijltiirpigpnsrhaften Von diesen Mutanten können alle diejenigen verwendet werden, die das Antibiotikum B-5050 bilden.

Gemäß der Erfindung werden die Mikroorganismen von Streptomyces hygroscopicus B-5050 in einem Medium kultiviert, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff. Quellen von verwertbarem Stickstoff und andere Nährstoffe enthält. Das Kulturmedium kann flüssig oder fest sein, jedoch ist ein flüssiges Medium vorteilhafter und zweckmäßiger.

Im Medium werden e·™? oder mehrere Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff wie Glucose. Saccharose, Maltose. Dextrin. Glycerin und Stärkesirup und eine oder mehrere Quellen von verwertbarem Stickstoff, z. B Pepton. Sojabohnenmehl, Maisquellwasser. Fleischextrakt. Reiskleie. Weizenkleie, Harnstoff und verschiedene Ammoniumsalze (z.B. NH4CI. NH4NOJ und (NHj);SOi) sowie geringe Mengen anorganischer Salze, die üblicherweise fur die Kultivierung von Mikroorganismen verwendet werden, z. B. Natriumchlorid. Phosphate oder bestimmte Metallsalze von Calcium, Magnesium. Zink. Mangan und Eisen verwendet. Außerdem werden zweckmäßig ein wachstumsfördernder Stoff und ein Antischaummittel, z. B. Fett. Öl oder Mineralöl, nach Bedarf zugesetzt

Der das Antibiotikum B-5050 bildende Stamm bildet häufig unter üblichen Bedingungen auch andere Antibiotika zusammen mit dem Antibiotikum B-5050. Zur vorteilhaften Herstellung von Antibiotikum B-5050 ist eine sorgfältige Wahl des Kulturmediums zu empfehlen. Beispielsweise wird bei Verwendung des Stammes B-5050 vorzugsweise ein Kulturmedium verwendet, das etwa 3 bis 5% einer Kohlenstoffquelle und etwa 1 bis 2% einer Quelle von organischem Stickstoff enthält.

Die Kultivierung kann in stationärer Kultur erfolgen, jedoch ist im allgemeinen die Submerskultur mit Bewegung durch Belüftung vorteilhafter. Im letzteren Fall wird der pH-Wert des Kulturmediums vorzugsweise im neutralen Bereich, d. h. bei etwa 6 bis 8, vorzugsweise bei etwa 6,8 bis 7,4 gehalten. Die Kultivierungstemperatur liegt zwischen etwa 20 und 43°C, insbesondere im Bereich von 23 bis 32°C.

Die in der angegebenen Weise erhaltene Fermente^ tionsbrühe enthält die Komponenten von Antibiotikum B-5050. Die isolierung dieser Gruppe von Antibiotika kann nach den Methoden erfolgen, die bisher zur Gewinnung von Metaboliten eines Mikroorganismus aus seiner Fermentationsbrühe angewandt wurden. Beispielsweise kann unter Wahrnehmung des Vorteils, daß die Antibiotika dieser Klasse schwach basische und fettlösliche Substanzen sind, die Abtrennung nach Methoden, bei denen diese Eigenschaften ausgenutzt werden, erfolgen.

Da das Antibiotikum B-5050 vorwiegend in der flüssigen Phase der Fermentationsbrühe angehäufi wird, kann die Brühe zur Entfernung des Mycels zuerst filtriert werden, worauf die aktiven Bestandteile mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert im schwach basischen Bereich aus der Filtrierten Brühe extrahiert werden können. Beispielsweise wird die filtrierte Fermentationsbrühe auf einen pH-Wert von etwa 7 bis 10 eingestellt und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, das mit Wasser nicht mischbar oder nicht vollständig mischbar ist, z. B. mit einem Ester einer niederen Fettsäure (z. B. Äthylacetat und n-Butylacetat). einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff (z. B. Chloroform und AthylenrhloridY einem Keton (z. B. Methyläthylketon und ivlethylisobutylketon). einem aromatischen Kohlenwasserstoff (z. B. Benzol und Toluol), einem Alkohol (z. B. n-Butanol) oder einem Gemisch von zwei oder mehreren dieser Lösungsmittel. Der im Mycel enthaltene Anteil der Antibiotika kann nach Filtration der Kulturbrühe mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton oder Methanol oder einer verdünnten wäßrigen Säurelösung. aus dem Mycel extrahiert werden. Aus den Extrakten werden die aktiven Bestandteile durch Filtration. Einengung unter vermindertem Druck und Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel der obengenannten Art isoliert. Aus der wäßrigen Säurelösung können sie durch Filtration. Einstellung auf einen pH-Wert im neutralen oder schwach basischen Bereich und Extraktion mit einem der genannten mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert werden.

Die aktiven Bestandteile in der Fermentationsbrühe können an einem Adsorptionsmittel wie Aktivkohle oder kolloidales Siliciumdioxyd adsorbiert werden. Sie können dann mit einem geeigneten Entwickler oder Elutionsmittel, z. B. einem wäßrigen Alkohol (beispielsweise wäßriges Methanol und wäßriges Äthanol), wäßrigem Aceton oder einem Gemisch einer solchen wäßrigen Lösung mit einer Säure, einem organischen Lösungsmittel (z. B. Äthylacetat und Chloroform) eluiert werden.

Unter Ausnutzung des Vorteils der Tatsache, daß das Antibiotikum B-5050 basisch ist. können die aktiven Bestandteile auch an einem Kationenaustauscherharz adsorbiert werden, z. B. an den Produkten der Handelsbezeichnung »Amberlite lRC-50«. »Amberlite IR-120« (Hersteller Rohm & Haas Co., U.S.A.) oder »Dowex 50« (Hersteller Dow Chemical Co., U.S.A.). Die an einem solchen Harz adsorbierten aktiven Bestandteile können dann nit einem geeigneten Elutionsmittel, z.B. einer verdünnten wäßrigen Säurelösung, einer verdünnten wäßrigen basischen Lösung, einer wäßrigen sauren Methano !lösung, einer wäßrigen basischen Methanollösung, inner wäßrigen sauren Acetonlösung und einer wäßrigen basischen Acetonlösung, eluiert werden,

Der auf diese Weise erhaltene organische Extrakt wird, vorzugsweise nach einer Wäsche mit Wasser, weiter in eine wäßrige Säurelösung überführt. Die Säurelösung kann für diesen Zweck eine verdünnte

wäßrige Säurelösung oder eine saure Pufferlösung sein. Der hierbei erhaltene wäßrige Extrakt wird dann auf einen pH-Wert im neutralen oder schwach basischen Bereich eingestellt und kann erneut mit einem der obengenannten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden.

Wenn der Gehalt an aktiven Bestandteilen im hierbei erhaltenen Lösungsmittelextrakt verhältnismäßig hoch ist, kann das Antibiotikum B-5050 bereits durch Einengung des Extrakts unter vermindertem Druck auskristallisieren. Wenn dies nicht der Fall ist, wird ein nicht polares organisches Lösungsmittel, z. B. Petroläther oder η-Hexan, dem Konzentrat zugesetzt, wobei das rohe pulverförmige Antibiotikum B-5050 sich abscheidet Das pulverförmige Produkt kann aus einem organischen Lösungsmittel, z. B. Benzol, Diäthyläther, Äthylacetat, einem Äthylacetat-n-Hexan-Gemisch, einem Aceton-n-Hexan-Gemisch, einem Aceton-Wasser-Gemisch oder Äthanol-Wasser-Gemisch, kristallisiert werden.

Wenn das rohe Pulver farbige Verunreinigungen enthält, können diese mit Hilfe von Aktivkohle entfernt werden.

2) Elementaranalyse:

In dem besonderen Fall, in dem das Antibiotikum B-5050 selbst durch die oben angegebene Behandlung nicht kristallisierbar ist, kann eine weitere Reinigung mit Adsorptionsmitteln wie Kieselgel oder Aluminiumoxyd vorgenommen werden. Die adsorbierten Bestandteile können mit einem Fettsäureester (z. B. Methylacetat, Äthylacetat und n-Butylacetat) oder einem Lösungsmittelgemisch (ζ. Β. Benzol-Aceton, Benzol-Äthylacetat, Benzol-Methanol und Chloroform-Methanol) eluiert

ίο werden.

Das Antibiotikum-Gemisch B-5050 und seine einzelnen Komponenten sind basische Substanzen und können Salze mit wasserlöslichen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Weinsäure oder Nicotinsäure bilden.

Nachstehend sind die allgemeinen Eigenschaften des Gemisches der Antibiotika B-5050 benannt, jedoch ist zu bemerken, daß die genannten Werte an einer Probe des gemäß Beispiel 7 hergestellten Gemkches der Antibiotika B-5050 ermittelt wurden, und daß bei anderen Proben des Antibiotika B-5050-Komplexes Abweichungen auftreten können.

1) Schmelzpunkt: 137 bis 141°C

Umkristallisiert aus Benzol
Umkristallisiert aus Äthylacetat

Molekulargewicht, gemessen durch
Dampfdruckosmose:

880 + 90 (in Äthylacetat)

58,14 ±0,5
57,83 ± 0,5

7,88 ± 0.3
8,14 + 0,3

1,73 ±0,3
1,33 ±0.3

4) Spezifische Drehung:

(«)<': -76,4° ±8° (c= I.Äthanol)

5) Farbreaktionen:

Dragendorff-Reaktion: positiv

Erythromycintest: positiv mit Auftreten einer rötlichen Purpurfarbe, während die Chloroformschicht blaßblau sein kann.

Carbomycintest: negativ

6) Löslichkeit:

Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Methylethylketon, Chloroform und wäßrigen Säurelösungen; löslich in Benzol und Diäthyläther; schwerlöslich in η-Hexan und neutralem Wasser.

7) Ul'raviolettabsorption:

Kein ausgeprägtes Maximum in Methanol

8) Infrarotabsorption;

Wie Fig. 1 zeigt (KBr-Scheibe), enthält das Infrarotspektrum die folgenden hauptsächlichen Absorptionsbanden (cm *'):

3448 (stark), 2924 (mittel),

1736 (stark), 145.3 (mittel),

1376 (mittel), 1295 (mittel),

1239 (mittel), 1167 (stark),

1081 (stark), 1050(stark),

968 (mittel), 912 (mittel),

861 (schwach), 840 (schwach).

Wie bereits erwähnt, besteht das Antibiotikum gemäß der Erfindung aus mehreren Komponenten. Bisher wurden wenigstens sechs Komponenten bestätigt, die in ihren chemischen und biologischen Eigenschaften nahe verwandt sind. Dies läßt sich leicht bestätigen, indem das Antibiotikumgemisch der Papierchromatographie oder Dünnschichtchromatographie unterworfen wird. Beispielsweise wurden die jeweiligen Bestandteile wie folgt identifiziert:

1) Papierchromatographie

Papier: Toyoroshi Nr. 50, imprägniert mit einer 2%igen Lösung von Paraffin in Ligroin

Entwickler: M/15-Phosphatpufferlösung, pH 8,0, gesättigt mit n-Butylacetat (M = molar)

Nachweis: Bioautographie unter Verwendung von Bacillus subtilis als Testmikroorganismus.

Rf-Werte:

B-5050-A
B-5050-B
B-5050-C
ti-5050-D
B-5050-E
B-5050-F

0.32 ± 0,0 j
0.38 ± 0,05
0.66 ±0,05
0.72 ±0,05
0,74 ±0,05
0.82 ±0,05

2) Dünnschichtchromatographie

Dünnschicht:

ω a) Kieselgel (»Spotfilm f«. Hersteller Tokyo

Kasei K. K., Japan), 1 Stunde auf 105⁰C vorerhitzt
b) Kieselgel (»Kieselgel G«, Hersteller Merck AG, Darmstadt)
c) wie (b)

Entwickler;

a) Benzol-Acelon (Völumenvefhältriis 3 :2)

230 208/34

Rf-Werte

(a)

(b)

(O

B-5O5O-A
B-5O5O-B
B-5O50-C
B-5O5O-D
B-5O5O-E
B-5O5O-F

0,48 ± 0.05
0.42 ± 0.05
0.37 ± 0,05
0,32 ± 0.05
0/0 ± 0.05
0,27 ± 0.05

0,68 ± 0,05
0,63 ± 0,05
0,57 ± 0,05
0,53 ± 0,05
0,50 ± 0,05
0.43 ± 0.05

0,71 ±0,05 0,66 ± 0,05 0,61 ±0,05 0,55 ± 0.05 0,52 ± 0,05 0.48 ± 0,05

b) Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 3 :2)

c) Benzol-Methanol (Volumenverhältnis 10:1), jedoch mit dreimaliger Wiederholung der Entwicklung.

Nachweis:

a) Konzentrierte H2SO4 aufgesprüht

b) und c): Behandlung wie folgt:

1) Eine 5°/oige Lösung von Phosphormolybdat in Äthanol wurde aufgesprüht und 5 Minuten bei 110° C getrocknet

2) eine 5%ige Cersulfatlösung in 1 n-HbSC^ wurde aufgesprüht und 5 Minuten bei 110⁰C getrocknet

3) Eine 10%ige wäßrige H₂SO₄-Lösung wurde aufgesprüht und 5 Minuten bei 110° C getrocknet

15 Die Verteilungschromatographie ist eine weitere geeignete Methode. Als Träger der stationären Phase sind die üblicherweise verwendeten Materialien wie Cellulosepulver oder Diatomeenerde (z. B. die Produkte der Handelsbezeichnung »Gelite« oder »Hyflo Super Cel«. Hersteller Johns Manville Sales Corp., USA) geeignet

Die Eigenschaften und Kennzahlen der aktiven Bestandteile von Antibiotikum B-5050 sind nachstehend angegeben.

1) Schmelzpunkt (Zers.): gemessen an Proben, die aus einem Gemisch von Aceton und η-Hexan (Volumenverhältnis 1 :3) umkristallisiert worden sind:

Konzentrierte H2SO4 oder eine 5%ige Jodlösung in Chloroform wurde aufgesprüht

30

Zur Abtrennung oder Isoiierun dieser Bestandteile bei der Großherstellung werden Methoden der Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie oder Gegenstromverteilung empfohlen.

Als Adsorptionsmittel für die Adsorptionschromatographie eignen sich beispielsweise Kieselgel und Aluminiumoxyd. Wenn beispielsweise Kieselgel verwendet wird, kann die Elution mit einem Gemisch eines nichtpolaren organischen Lösungsmittels und eines polaren organischen Lösungsmittels erfolgen, wobei die einzelnen Bestandteile fraktionierend in der Reihenfolge der Affinität zum nichtpolaren Lösungsmittel eluiert werden, d. h. in der Reihenfolge Antibiotikum B-5050-A, -B, -C, -D, -E und -F. Als Elutionsmittel geeignete Lösungsmittelgemische sind beispielsweise

Benzol-Äthylacetat, Benzol-Aceton, n-Hexan-Methanol und Chloroform-Methanol.

Als Mittel zur Ausnutzung des Unterschiedes in der Verteilung zwischen zwei Flüssigphasen ist die Kombination eines lipophilen organischen Lösungsmittels (z. B. Äthylacetat) und einer wäßrigen Pufferlösung zu empfehlen.

Durch Verwendung einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 können die Antibiotika B-5050-D, B-5050-E und B-5050-F in den Puffer überführt werden, während B-5050-A. B-5050-B und B-5050-C in der organischen Lösungsmittelphase bleiben, Aus der letztgenannten Lösungsmittelphase kann B-5050-C mit einem Puffer, der einen pH-Wert von 4,9 hat, extrahiert werden, Mit einem Puffer vom pH-Wert 4,4 können B-5050-B und B-5050-C aus der obengenannten organischen Schicht extrahiert werden, während B-5050-A in der organischen Lösungsmittelphase bleibt. Auf diese Weise können die einzelnen Bestandteile endgültig isoliert werden,

40

45

B-5050-A:
B-5050-B:
B-5050-C:
B-5050-D:
B-5050-E:
B-5050-F:

129 bis 132° C

134 bis 136° C

135 bis 138° C
143bisl46°C
144 bis 149° C
!49bisl54°C

2) Elementaranalyse:

	C	H	±0,3	N
B-5O5O-A	59,40 ± 0,5	8,15	±0,5	1,40 + 0,3
B-5050-B	58,67 ±1,0	8,02	±0,5	1,86 ±0,5
B-5050-C	57,93 ±1,0	8,18	±0,5	1,69 ±0,5
B-5050-D	57,48 ±1,0	8,17	±0,5	1,64 + 0,5
B-5050-E	57,34 ±1,0	8,25	±0,3	1,34 + 0,5
B-5050-F	58,59 ± 0,5	7,82		1,62 ±0,3
3) Molekulargewicht:

Alle Komponenten haben ein Molekulargewicht von etwa 800 bis 900, gemessen durch Dampfdruckosmose in Äthylacetat.

4) Spezifische Drehung:

B-5O5O-A: a^: _n' -72,3° ± 7° (r = 1, Äthanol)

B:	ah -71,9° ±7°	U =	1,	Äthanol)
C:	a^:n -76,0° ± 8°	ic =	1,	Äthanol)
D:	ah -76.2° ± 8°	(C =	1,	Äthanol)
E:	ah' -73.6° ±7°	(C =	1.	Äthanol)
F:	ah' -77.7° ±8°	(f =	1,	Äthanol)
Farbreaktionen:

Alle Komponenten sind positiv in der Dragendorff-Reaktion und beim Erythromycintest, aber negativ im Carbomycintest.

6) Löslichkeit:

AUe Komponenten sind löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Methyläthylketon, Äthylacetat, Benzol, Diäthyläther, Chloroform und wäßrigen Säurelösungen, aber schwerlöslich in η-Hexan und neutralem Wasser.

7) Ultraviolettabsorption:

Alle Komponenten haben kein ausgeprägtes Absorptionsmaximum.

8) Infrarotspektrum (KBr-Scheibe):

B-5050-A: wie in Fig.2 dargestellt mit folgenden Hauptabsorptionsbanden in Wellenzahlen

3448 (mittel), 294) (mittel), 1739 (stark), 1458 (schwach), 1374 (mittel), 1295 (mittel), 1188_VJtark), 1167 (stark), 1120 (mittel), 1086 (stark), 1053 (stark), 1033 (stark),

971 (mittel), 91 / (schwach), 862 (mittel). B-5050-B: wie in Fig.3 dargestellt mit folgenden Hauptabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm-¹):

3500 (stark), 2990 (stark), 2960 (stark), 1740 (sehr stark),

1454 (mittel), 1370 (mittel), 1296 (mittel), 1233 (stark), 1188 (Schulter), 1166 (sehr stark), 1 i20(slark), lOSO(stark), 1052 (sehr stark), 1025 (sehr stark), 968 (mittel), 916 (schwach), 858 (schwach), 842 (schwach). B-5050-C: wie in Fig.4 dargestellt mit folgenden Hauptabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm-¹):

3460 (stark), 2980 (stark), 2940 (stark), 1735 (sehr stark),

1455 (mittel), 1375 (stark), 1357 (stark), 1295 (stark), 1270 (stark), 1240 (mittel), 1183 (Schulter), 1162 (sehr stark), 1080 (sehr stark), 1050 (sehr stark), 1028 (Schulter), 1018 (Schulter), 972(mittel),910(mitteI), 862 (schwach), 840 (schwach). B-5050-D: wie in Fig. 5 dargestellt und mit folgenden ausgeprägten Absorptionsbanden in iVellenzahlenicm-'): 3440 (stark), 2946 (mittel),

1735 (sehr stark), 1450 (mittel),

1373 (mittel), 1357 (Schulter),

1296 (mittel), 1274 (mittel),

1237 (stark), 1163 (stark),

1127 (mittel), 1083 (stark),

1047 (sehr stark), 1031 (Schulter),

1012 (Schulter), 972 (mittel),

913 (mittel), 862 (schwach), 843 (schwach). B-5050-E: wie in Fig.6 dargestellt mit folgenden

ausgeprägten Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm-¹):

3430 (stark), 2920 (mittel),

1732 (sehr stark), 1450 (mittel),

1373 (mittel), 1354 (mittel),

1296 (mittel), 1239 (stark),

1163 (stark), 1127 (mittel),

1084 (stark), 1048 (sehr stark),

1032 (Schulter), 1011 (Schulter),

970 (mittei), 914 (mittel),

862 (schwach), 840 (schwach \ B-5050-F: wie in Fig.7 dargestellt mit folgenden

ausgeprägten Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm-¹):

3425 (stark), 2994 (mittel),

1745 (stark), 1730 (stark),

1460 (schwach), 1379 (mittel),

1362 (mittel), 1300 (mittel),

1242 (stark), 1166 (stark),

1133 (mittel), 1089 (mittel),

1053 (stark), 1031 (mittel),

973 (schwach), 919 (schwach), 864 (schwach).

Die antibiotischen Spektren des auf die angegebene Weise hergestellten Gemisches der Antibiotika B-5050 und der einzelnen Komponenten (B-5050-A, -B, -C, -D, -E und -F) ergeben sich aus Tabelle 4. Für die Messungen vurden gewöhnliche Bakterien auf einem Nähragarmedium kultiviert, während die Micobacterium-Spezies auf einem Glycerin-Nähragar-Medium

w kultiviert wurden. Hefen und andere Kleinpilze wurden auf oinem Glucose-Nähragar-Medium kultiviert.

Tabelle 4

Hemmende Vlindestkon/entration (ug/ml)

Testmikroorgiinisnius	Antibiotikum B-5050	Λ	0.2	B	0.7	C	0.5	I)	I	I	-)	F	2
	Gemisch	0,5	0,5	I	2	5	5
Bacillus subtilts (FC I 219)	0.5	0.2	0.2	0.5	5	K)	10
Bacillus cercus (I^L'() 3466)	I	0.5	0,5	0.5	I	1	2
Bacillus brevis (IH) 3331)	0,5	0.5	0.5	I	2	5	5
Bacillus megiiterium (IFO 3003)	1
Staphylococcus aureus	I	20	20	50	>100	>1UO	> 100
(FDA 209P)		20	20	50	>100	> 100	>100
Staphylococcus aureus (*1)	50	0,1	0,1	0,2	0,5	0,5	0.5
Staphylococcus aureus (*2)	50	0,1	0,1	0,2	0,5	0,5	0,5
Sarcina lutea (IFO 3232)	0,2	>100	>100	>100	>100	>100	> 100
Micrococcus flavus (IFO 3242)	0,2	>100	>100	>100	>100	>100	> 100
Serratia marcescenn (IFO 3046)	>100	> 100	>I00	>I00	>100	>100	>100
Escherichia coli (NlHJJC-2)	>100
Proteus vulgaris (IFO 3045)	>100

	Fortsetzung	Antibiotikum	20 39	990	C	22	O	>100	■
21	Testmiknioigiinisniu·;	Gemisch			>100		>100
	>100						> 100	!
Pseudomonas aeruginosa		B-SOSO		>100	>100
(If O 3080)	50	A	B			> 100	F i
Mvcobacterium avium		>100	>100	>100	>100	>100	J >ioo I
([FO 3153)	50			>100	>100	>100	I
Mjcobacterium avium (*3)	50	50	100	>100	> 100		>ioo !
Mycobacterium avium (*4)	50					>100
Mycobacterium smegmatis		50 100	>100	>100	>I00		> 100
(IFO 3083)	50	50	100			> 100	>100
Mvcobacterium phlei		50	100	>100	>100	-	>100
(IFO 3158)	50			-	-	-
Mycobacterium 607	>100	50	100	-	-	>100
Candida albicans (IFO 0583)	>100
Saccharomvccs cerevisiae	50	100		>100
	-	-		-
	-	-		-

(IFO 0209)

Penicillium chrysogenum > 100

(IFO 4626)

Aspergillus niger (IFO 4066) > 100

Trichophyton mentagrophytes 100 - - - - -

(IFO 5809)

(*ll Gegen Oleandomycin und Erythromycin resistenter Stamm.

(*2): Gegen Streptomycin. Chloramphenicol, Tetracyclin, Oleandomycin und Erythromycin resisteiiier Stamm.

Bei *1 und *2 handeis es sich um in vitro-resistente Mulanten, die aus Staphylococcus aureus FDA 209P durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin als Mutagen erhalten worden sind.

(*3i Gegen Streptomycin resistenler Stamm.
(*4i Gegen Dextromycin resistenter Stamm.
- Nicht getestet.

Bei *3 und *4 handelt es sich um in vitro-resistente Mutanten, die aus Mycobacterium avium IFO 3153 mittels N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin als Mutagen erhalten worden sind.

Wie bereits erwähnt, gehört das Antibiotikum B-5050 auf Grund seiner Eigenschaften wie Farbreaktionen (z. B. Erythromycintest), Löslichkeit (z. B. lipophil und basisch), Infrarotspektrum (z. B. die Werte von K-.o oder V_r_o-), antibiotisches Spektrum (z. B. Unterschiede in den hemmenden Mindestkonzentrationen gegenüber einem gegen Erythromycin und Oleandomycin resistenten Stamm und einem empfindlichen Stamm von Staphylococcn; aureus) zu den »Makrolid-Antibiotika«.

Unter den Makrolid-Antibiotika unterscheidet sich der Antibiotika-Komplex B-5050 von den Antibiotika, die ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 225. 230. 240 oder 280 bis 290 πιμ zeigen. Erythromycin und Oleandomycin haben verhältnismäßig schwache Absorptionsmaxima im Bereich von 280 bis 290 mu, aber sie unterscheiden sich von Antibiotikum B-5050 in ihren Infrarotspektren, Molekulargewichten, Schmelzpunkten usw.

Bisher sind Carbomycin, Relomycin und Tylosin (vgL H. Umezawa, Index of Antibiotics from Actinomyces 1967, S. 194, 558 und 669) als Makrolid-Antibiotika bekannt, die durch Streptomyces hygroscopicus gebildet werden. Diese Antibiotika haben jedoch Absorptionsmaxima bei Weiieniängen von 238, 282 bzw.. 289 mu und unterscheiden sich deutlich von Antibiotikum B-5050. Hieraus ist zu folgern, daß das Antibiotikum B-5050 eine neue Gruppe von Antibiotika darstellt, von denen jedes ebenfalls neu ist Die Struktur der Antibiotika B-5050 A bis F war am Anmeldetag noch nicht aufgeklärt. Diese wurde erstmalig in Journal Antibiotics, Vol. XXVI (1973), S. 199-205, veröffentlicht, und zwar unter der Bezeichnung Mariclomycine.

Das Antibiotikum B-5050 (Mariclomycin) hat ohne Rücksicht darauf, ob es ein Gemisch der obengenannten aktiven Bestandteile oder ein isolierter aktiver Bestandteil ist, eine starke antimikrobische Wirkung, insbesondere gegen grampositive Bakterien, und zeichnet sich durch eine ungewöhnlich niedrige Toxizität für Warmblüter einschließlich des Menschen aus. Beispielsweise betrug die mittlere effektive Dosis (ED₅₀) des Gemisches von Antibiotikum B-5050 bei Mäusen, die mit Staphylococcus areus infiziert waren, 640 mg/kg bei oraler Verabreichung. Dagegen konnte seine mittlere Letaldosis (LD50) bei der Maus auf Grund der zu niedrigen Toxizität nicht bestimmt werden. Sie kann nur mit »über 10 000 mg/kg« bei oraler Verabreichung angegeben werden. Ferner erhielten Ratten täglich ί g/kg des Gemisches von Antibiotikum B-5050 oral über eine Zeit von ! Monat. Während der Beobachtung wurden keine wesentlichen Unterschiede gegenüber der

normalen Vergleichsgruppe festgestellt. Die anschließende Autopsie ergab keine wesentliche Veränderung in den Organen und Eingeweiden der Versuchstiere.

Staphylokokken sind pyogene oder eitefbildende b) Bakterien. Sie pflegen umschriebene Läsionen beispielsweise in Form von Abszessen u. dgl. hervorzurufen, die häufig in der Haut auftreten. Staphylokokken sind die Urs^She von Furunkeln und Karbunkeln und anderen üblichen Wundinfektionen. Die neuen Produkte gemäß der Erfindung sind wertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Art von Infektionen bei Warmblütern (Hunde, Katzen, Menschen). Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche Anwendung zur Behandlung einer auf Staphylococcus aureus zurückzuführenden Infektion hat beispielsweise die folgende Zusammensetzung:

In 1 g Wollfett wird eine der folgenden Komponenten gleichmäßig eingearbeitet: c)

Ϊ) 20 mg Antibiotikum B-5O5O-A

2) 20 mg Antibiotikum B-5O5O-B

3) 20 mg Antibiotikum B-5O5O-C

4) 50 mg Antibiotikum B-5050-D

5) 50 mg Antibiotikum B-5050-E

6) 50 mg Antibiotikum B-5050-F

7) 20 mg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen kristallinen

Gemisches von Antibiotikum B-5050 oder

8) 20 mg des gemäß Beispiel 2 hergestellten Kristall-

isolats II.

30

Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt, daß 10 g Salbe erhalten werden. Diese Salbe wird örtlich in einer Menge, die zur Bedeckung der behandelten Wunde genügt, unter leichtem Einreiben aufgebracht. Die Behandlung erfolgt wenigstens einmal täglich und wird, falls erforderlich oder erwünscht, mehrmals täglich wiederholt. a)

Infolge der obengenannten bakteriziden und baktereostatischen Eigenschaften eignen sich die neuen Produkte gemäß der Erfindung beispielsweise zur Desinfektion von Geräten in Krankenhäusern usw., die im allgemeinen pathogenen grampositiven Bakterien ausgesetzt sind, die empfindlich gegenüber den obengenannten Produkten sind. Die Desinfektion erfolgt durch Auftrag oder Aufsprühen einer Lösung (z. B. in Methanol oder Äthanol), die eine der folgenden Komponenten enthält:

1) 20μg/ml Antibiotikum B-5050-A

2) 20μg/mI Antibiotikum B-5050-B

3) 20μg/ml Antibiotikum B-5050-C

4) 50μg/ml Antibiotikum B-5050-D

5) 50μ§/ΐη1 Antibiotikum B-5050-E

6) 50μg/mI Antibiotikum B-5050-F T) 20 μg/mI des gemäß Beispiel 1 hergestellten kristallinen Gemisches von Antibiotikum B-5050

8) 20 μg/ml des gemäß Beispiel 2 hergestellten Kn-

stallisolats Π. ω

Vorteile der erfindungsgemäßen Antibiotika gegenüber bekannten Antibiotika:

1. Erythromycin

a) Die ernndungsgemäßen Antibiotika sind gegen klinisch isolierte, gegen Erythromycin resistente

a) fa)

65 Stämme wirksam (vgl. »Journal of Antibiotics«, Volume XXVI (1973), Seite 211, Tabelle 8, Stämme Nr. 44,25,75,68,1,33,4,10,28,65,89 und 90).
Sie sind weniger toxisch als Erythromycin (vgl. Tabelle 5).

Tabelle 5

LD₅o(an männlichen, 4 Wochen alten Mäusen
(ICR/JCL) intraperitoneal, mg/kg)

LD₅₀

B-5050	1750
Erythromycin	312,5-625
Oleandomycin	625-1250
Spiramycin	ungefähr 625

Die Schutzwirkung der erfindungsgemäßen Antibiotika gegen experimentelle Infektion bei subkutaner Verabfolgung ist wesentlich höher als die Von Erythromycin (vgl. Tabelle 6).

Tabelle 6

Schutzwirkung gegen experimentelle Infektion subkutane Verabfolgung (ED₅₀ mg/kg, Maus), gemessen nach der im »Journal of Antibiotics XXVI, (1973), 206, Seite 208« beschriebenen Methode.

B-5050 Erythromycin

Oleando- Spiramycin mycin

Streptococcus
pyogenes

1,4

50-140 15

100

2. Oleandomycin

Die minimale Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Antibiotika ist der von Oleandomycin überlegen (vgl. Tabelle 7).

Tabelle 7 Minimale Hemmkonzentration	B-5050	(mcg/ml)	Oleando mycin
	0,09 3,12	Spira mycin	1,56 6,25
Cory, diphtheriae Clost tetani (chemische Isolate)	0,1 12,5

Die Toxizität der erfindungsgemäßen Antibiotika ist geringer (vgl.Tabelle 5).
Die Schutzwirkung der erfindungsgemäßen Antibiotika gegen experimentelle Infektion durch subkutane Verabfolgung ist der von Oleandomycin überlegen (vgl. Tabelle 6).

3. Spiramycin

Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind hinsichtlich der minimalen Hemmwirkung überlegen (vgL Tabelle 7).

Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind ferner weniger toxisch (vgl. Tabelle 5).
Die Schutzwirkung der erfindungsgemäßen Antibiotika gegen experimenteüe Infektion ist bei subkutaner Verabfolgung größer (vgL Tabelle 6).

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze bei der Angabe der Zusammensetzung der Kulturmedien auf Gewicht/Volumen, d. h. g/100 ml. Im übrigen sind alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Je 500 ml eines Vorimpfkulturmediums (pH 7,0), bestehend aus 2,0% Glucose, 3,0% löslicher Stärke, 1,0% Sojabohnenmehl, 1,0% Maisquellwasser, 0,5% eines Caseinhydrolysats. Hersteller: Daigo Nutritive Chemicals. Ltd.. Osaka (Japan), 0,3% Natriumchlorid, 0,3% Calciumcarbonat und Wasser werden in 2000-ml-Sakaguchi-Kolben gegeben und sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit einer Ösenmenge (Ösendurchmesser 1,5 mm) Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995) aus einer wenigstens vier Tage alten Agarschrägkultur geimpft und bei 28⁰C 48 Stunden auf einer hin-Mnrl hergehenden Schüttelvorrichtung bei 115 Zyklen/ Minute und einer Ausschlaglänge von 10 cm bebrütet. Die erhaltene Kulturbrühe wird in einer Menge von 1000 ml als Vorimpfkultur verwendet.

Die Vorimpfkultur wird in 100 Liter eines Kulturmediums (pH 7,0) geimpft, das in einen 200-l-Tank aus nichtrostendem Stahl gegeben und sterilisiert wird und aus 3,0% Glucose. 0,5% Maisquellwasser, 1.0% tntfettetem Snjabohnenmehl, 0,5% Natriumchlorid. β,05% Magnesiumsulfat, 0,3% Calciumcarbonat und Wasser besteht. Die Bebrütung wird bei 28°C 24 Stunden durchgeführt, während 100 Liter Luft pro Minute zugeführt werden und mit 200 U/Minute gerührt wird.

100 Liter der erhaltenen Impfkultur werden in 100 Liter eines sterilisierten Hauptkulturmediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie das Kulturmedium für die Impfkultur hat und in einem 2000-1-Tank aus nichtrostendem Stahl enthalten ist. Die Bebrütung wird 66 Stunden bei 28° C durchgeführt, während 1000 Liter Luft/Minute zugeführt werden und mit einem Kreiselmischer bei 120 U/Minute gerührt wird. Während der Bebrütung wird ein Polyoxypropylengemisch, das eine OH-Zahl von 56 hat als Antischaummittel in einer Konzentration von etwa 0,05%, bezogen auf das Gesamtmedium, zugesetzt. Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe hat eine antimikrobische Wirkung von 350 Einheiten, gerechnet als Verdünnungseinheiten gegen Bacillus subtilis PCI 219 (PCI = Penicillin Control and Immunology Section FDA) als Testorganis mus.

Die Kulturbrühe wird filtriert Die filtrierte Brühe (9501) wird mit einer wäßrigen 2 n-NaOH-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und mit Äthylacetat (3001) extrahiert Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 701 0,005 n-HCl extrahiert Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt, mit verdünntem wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und erneut zweimal mit je 451 Äthylacetat extrahiert Die Extrakte werden mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck auf 50 ml eingeengt Dem Konzentrat werden 75OmI n-Hexan zugesetzt, wobei 95 g des rohen pulverförmigen Antibiotikums B-5050 erhalten werden.

Das pulverförmige Produkt wird in 450 ml Benzol gelöst, während erwärmt wird. Nach Zusatz von 2 g Aktivkohle zur erwärmten Lösung wird das Gemisch filtriert und das Filtrat zur Abkühlung stehen gelassen. Hierbei scheiden sich 19,0 g des Antibiotikußi 5050-Gemisches als farblose Nadeln ab.

10 g des Gemisches der kristallinen Antibiotika B-5050 werden m 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird der Säulenchrotnalographie an Kieselgel unterworfen (450 g, 'Hergestellt von Merck AG., Korngröße 0,05 bis 0,2 mm). Die eingesetzten Materialien werden mit einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 2:1) entwickelt und eluiert. Die ersten 600 ml des Eluats, das antibiotische Wirkung zeigt, werden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in heißem Benzol gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei sich 1 g farblose Kristalle abscheiden, die hauptsächlich aus dem Antibiotikum B-5O5O-A bestehen.

Nachdem die Säule mit 41 des Äthylacetat-Benzol-Gemisches eluiert worden ist, wird sie weiter mit 3 I Äthylacetat eluiert. Die Eluate werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in heißem Benzol gelöst. Die Lösung wird stehei, gelassen, wobei sich 550 mg farblose Kristalle abscheiden, die hauptsächlich aus dem Antibiotikum B-5050-F bestehen.

500 mg der hauptsächlich aus dem Antibiotikum B-5050-A bestehenden Kristalle werden in 1.5 ml Äthylacetat gelöst und erneut an einer Kieselgelsäule (50 g, siehe oben) Chromatographien. Das zugeführte Material wird mit einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 1 :1) eluiert, wobei mehrere Fraktionen abgenommen werden. Jede Fraktion wird auf die darin enthaltenen aktiven Bestandteile durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Handelsbezeichnung: »HF254«. Hersteller: Merck AG) analysiert, wobei ein Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 3 :2) als Entwickler verwendet wird. Die Fraktionen, die ausschließlich das Antibiotikum B-5050-A als aktiven Bestandteil enthalten, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei 88,5 mg Antibiotikum B-5050-A in Form von farblosen Prismen erhalten werden.

350 mg der hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-F bestehenden Kristalle werden der Säulenchromatographie an Kieselgel (50 g) in der oben angegebenen Weise unterworfen. Nachdem die Säule mit 700 ml eines Gemisches von Äthylacetat und Benzol (Volurnenverhältnis 2:1) eluiert worden ist. wird sie weiter mit einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 3:1) eluiert Anschließend werden durch Dünnschichtchromatographie die aktiven Bestandteile jeder Fraktion bestimmt. Die Fraktionen, die ausschließlich

so Antibiotikum B-5050-F als aktiven Bestandteil enthalten, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt Der Rückstand wird kristallisiert wobei 75,6 mg B-5050-F als farblose Prismen erhalten werden.

Beispiel 2

In 2-I-Sakaguchi-Kolben werden je 500 ml eines sterilisierten Vorimpfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 mit Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995) geimpft Die geimpften Kolben werden zur Herstellung einer Vorimpfkultur auf die in Beispiel 1 angegebene Weise bebrütet

In einem 500-1-Tank aus nichtrostendem Stahl werden 2001 eines Kulturmediums hergestellt, das die gleiche Zusammensetzung wie das gemäß Beispiel 1 für die Inipfku'.tur verwendete Medium hat. Nach Sterilisation bei 121°C für 20 Minuten wird die Kultur mit 21 der obengenannten Vorimpfkultur geimpft Die Bebrütung

zur Herstellung der Impfkultur für die Hauptfermentation wird 24 Stunden bei 28° C durchgeführt, während 200 I Luft/Minute zugeführt werden und mit 200 U/Minute gerührt wird.

200 I der so hergestellten Impfkultur werden 'ft 4000 1 eines Hauptkulturmediums überführt, das die obengenannte Zusammensetzung hat und in einem 6000-1-Tank aus nichtrostendem Stahl enthalten wird. Die Kultivierung wird 48 Stunden bei 28°C durchgeführt, während 2400 I Luft/Minute zugeführt werden und mit einem Kreiselmischer bei 180 U/Minute gerührt wird. Während der Bebrütung wird das in Beispiel i genannte Polyoxypropylen-Gemisch als Antischaummittel zugesetzt. Die Kulturbrühe wird filtriert. Die filtrierte Brühe (40001) wird .nit 2n-NaOH auf pH 9 eingestellt, mit 1330 1 Äthylacetat extrahiert und mit Wasser gewaschen, wobei 1052 I Äthylacetatextrakt erhalten werden. Die Äthylacetatlösuiig wird unter vermindertem Druck auf 1001 eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird zweimal mi· je 501 einer l.Smolaren wäßrigen KH2PO4-Lö"'ing extrahiert, die vorher mi* Phosphorsäure auf pH 4,0 eingestellt worden ist Die Extrakte werden vereinigt, mit einer verdünnten wäßrigen Ammoniaklösung auf pH 8,5 eingestellt und mit 501 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Sirup als Rückstand verbleibt. Durch Zusatz von 31 n-Hexan zum Sirup werden 330 g eines rohen Pulvers erhalten. 300 g dieses Pulvers werden in 1,1 1 Benzol bitter Erwärmung gelöst. ^fÖie Lösung wird zur Abkühlung stehen gelassen, wobei 117 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5O5O-C, B-5050-D und B-5050-E (Kristallisolat I) bestehen.

Die Äthylacetatschicht, die mit der Phosphatlösung extrahiert worden ist, wird weiterhin zweimal mit je 501 N/220 H₂SO₄ extrahiert. Die wäßrigen Schichten werden vereinigt, mit einer verdünnten wäßrigen Ammoniaklösung auf pH 8 eingestellt und dreimal mit je 301 Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt. Durch Zusatz von 1,5 1 η-Hexan zum Sirup werden 160 g eines rohen Pulvers gebildet 150 g dieses Pulvers werden aus heißem Benzol kristallisiert wobei 72,5 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-A und B-5050-B und einer geringen Menge Antibiotikum B-5050-C bestehen (Kristall II). Bei der Dünnschichtchromatographie unter den oben unter (a) oder (c) für ein B-5050-Gemisch mit 6 Bestandteilen genannten Bedingungen ergibt der Kristallisolat II zwei Flecken, nämlich bei Rf-Werten von 0,48 und 0,54 unter den Bedingungen (a) oder bei den Rf-Werten von 0.66 und 0,71 unter den Bedingungen (c).

2,0 g Kristallisolat II werden in 2OmI Äthylacetat gelöst Zur Lösung werden 14 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an Kieselgel (Merck AG, Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) unterworfen, das vorher mit einem Gemisch von Benzol und Äthylacetat (Volumenverhältnis I : 1) gefüllt worden ist Das Chromatogramm wird zuerst mit Äthyiacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1 :1) entwickelt, wobei 200 ml Eluat aufgefangen werden. Dann wird mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 3 :2) eluiert, wobei Fraktionen aufgefangen werden, die antimikrobische Wirkung gegen Bacillus subtilis aufweisen. Die Fraktionen, die den gleichen Bestandteil enthalten, werden vereinigt, eingeengt und aus Benzol kristallisiert, wobei 435 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-A einerseits und 185 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-B andererseits erhalten werden.

10 g Kristall I werden in 50 ml Äthylacetat gelöst. Zur Lösung werden 25 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird an Kieselgel (400 g) auf die oben angegebene Weise chromatographiert Die Säule wird zuerst mit 31 Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1 :1) und dann

ίο mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml geteilt. Die mit dem l:l-Gemisch erhaltenen Fraktionen enthalten die Antibiotika B-5050-A und B-5050-B. Die erste Fraktion, die mit dem 2 :1 -Gemisch erhalten wird, enthält die Antibiotika B-5050-B und B-5050-C. Die zweite Fraktion enthält die Antibiotika B-5050-C und B-5050-D und die dritte Fraktion die Antibiotika B-5050-D und B-5050-E. Die letzte Fraktion enthält die Antibiotika B-5050-E und B-5050-F.

2 g der Kristalle, die aus der die Antibiotika B-5050-B und B-5050-C enthaltenden Fraktion erhalten worden sind, werden erneut in 15 ml Äthylacetat gelöst Zur Lösung werden 10 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 250 g Kieselgel unter-

worfen. Die Säule wird mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 3 :2) unterworfen. Das Eluat wird in Fraktionen von je 20 ml abgenommen, die Fraktionen der gleichen Komponente werden vereinigt, eingeengt und aus Benzol oder einem Gemisch von Äthylacetat und η-Hexan kristallisiert, wobei 83 mg Kristalle vom Antibiotikum B-5050-B, 940 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-C und 75 mg Kristalle von Antibiotiku-n B-5050-D erhalten werden.

In der gleichen Weise werden 1,2 g der Fraktion, die die Antibiotika B-5050-D und B-5050-E enthält, der Säulenchromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei 600 ml Kristalle von Antibiotikum B-5050-E erhalten werden.

Die Fraktion, die anschließend an die Antibiotika B-5050-B und B-5050-C einhaltende Fraktion erhalten wird, enthält Antibiotikum B 5050-C als Hauptbestandteil. 770 mg der erhaltenen rohen Kristalle werden erneut in 5 ml Aceton gelöst Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 100 g Kieselgel auf < <e oben angegebene Weise unterworfen, wobei 220 mg Antibiotikum B-5050-C in Form von Kristallen erhalten werden.

Beispiel 3

40001 der filtrierten Kulturbrühe, die bei der in Beispiel 2 beschriebenen Hauptfermentation erhalten worden ist werden auf pH 8,0 eingestellt und mit '/ä ihres Volumens an Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird auf etwa 1001 eingeengt. Das Konzentrat wird mit 501 Wasser gewaschen und dreimal mit je 50 1 einer 3molaren wäßrigen KHiPO₄-Lösung extrahiert, die vorher mit Phosphorsäure auf pH 33 eingestellt worden ist Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt, mit wäßriger 8 n-Ammoniak-Lösung auf pH 9 bis 10 eingestellt und mit 751 Äthylacetat

extrahiert Der Äthylacetatextrakt wird dreimal mit je 251 Wasser gewaschen und dann auf etwa 1,51 eingeengt Durch Zusatz von etwa 301 η-Hexan zum Konzentrat werden 522 g eines rohen Pulvers gebildet Durch Kristallisation des Pulvers aus Benzol werden 272 g Kristalle des Antibiotikum B-5050-Gemisches erhalten.

Im wesentlichen das gleiche Ergebnis wird bei dem vorstehend angegebenen Verfahren erhalten, wenn eine

wäßrige 0,2 η-Essigsäurelösung anstelle der KH₂PO₄-Lösung verwendet wird.

19 g des so erhaltenen Antibiotikum B-5050-Gemisches werden in 75 ml Aceton gelöst Die Lösung wird der Säulenchromatographie mit 800 g Kieselgel (Merck A.G, s. o.) unte-worfen. Die Säule wird mit 3000 ml Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1:1) eluiert wobei 7,25 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-A und B-5050-B bestehen. Die Säule wird dann mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) eluiert. Die mit !100 ml des Entwicklers eluierte erste Fraktion wird in der gleichen Weise behandelt, wobei 222 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-B und B-5050-C bestehen. Die anschließende Fraktion aus 200 ml ergibt 030 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-C bestehen. Aus der folgenden Fraktion von 300 ml werden 1,4 g eines Gemisches erhalten, das hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-C und B-5O5O-D besteht Aus der letzten Fraktion von 600nl werden 139g Kristalle erhalten, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5Ö5Ö-D und B- 5050- E bestehen. Die Säule wird dann mit (,00 ml Äthylacet-Benzol (Volumenverhältnis 3:1) eluiert wobei 0,645 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-D und B-5050-E bestehen. Aus der letzten Fraktion, die mit 1600 ml Äthylacetat eluiert wird, werden 2.09 g Kristalle erhalten, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-F bestehen.

Die in der angegebenen Weise erhaltenen Kristalle der Antibiotika B-5050-A und B-5O5O-B (725 g) werden in 40 ml Aceton gelöst und der Säulenchromatographie mit 400 g Kieselgel unterworfen. Durch Elution mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1 :1) werden 1.5 g Kristalle vom Antibiotikum B-5O50-A und 0,65 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-B erhalten.

Die in der angegebener. Weise erhaltenen Kristalle der Antibiotika B-5050-B und B-5O5O-C (2,22 g) werden in 20 ml Aceton gelöst und der Säulenchromatographie an 300 g Kieselgel unterworfen. Durch Elution mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 3: 1) werden 0J98 g Kristalle vom Antibiotikum B-5O5O-B erhalten. Die weitere Elution mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 2:1) ergibt 0269 g Kristalle von Antibiotikum B-5O5O-C.

Die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-C bestehenden Kristalle (0.90 g) werden in 5 ml Aceton gelöst und dann an einer Säule von 100 g Kieselgel Chromatographie«. Die Elution mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) ergibt 0258 g Kristalle von Antibiotikum B-5O5O-C.

Die Kristalle der Antibiotika B-5O5O-C und B-5050-D (1.40 g) werden in 10 ml Aceton gelöst und dann an einer Säule von 150 g Kieselgel Chromatographie«. Durch Elution mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 2:1) werden 0.596 g Antibiotikum B-5050-C und 0.187 g Kristalle von Antibiotikum B-5050- D erhalten.

* ;e Kristalle der Antibiotika B-5O5O-D und B-5050-E (1.09 g) werden in 30ml Aceton gelöst und an einer Säule von 300 g Kieselgel Chromatographie«. Durch Elution mit BenzoUAceton (Volumenverhältnis 2:1) werden 0,304 g Kristalle von Antibiotikum B^5050^D und 0,187 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-E erhalten,

Die hauptsächlich aus AntibiotH um B-5050-F bestehenden Kristalle (2,09 g) werden in 15 ml Aceton gelöst und an einer Säule von 250 g Kieselgel Chromatographie«. Durch Elution mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 3:1) werden 0,585 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-F erhalten.

Beispiel 4

Ein Gemisch von 120 ml η-Hexan, 8OmI Äthylendichlorid, 30 ml Methanol und 6 ml Wasser wird gut gerührt und dann stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die untere Schicht wird von der

ίο oberen Schicht getrennt In 6 ml der unteren Schicht wird 1 mg Chlorphenolrot gelöst Zur Lösung werden 5 g einer verarbeiteten Diatomeenerde vom Typ »Celite« (Hersteller: Johns Manville Sales Corporation, USA) und 100 ml der vorher abgetrennten oberen Schicht gegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt worauf Chlorwasserstoff eingeleitet wird, bis die violette Farbe des Indikators nach gelb umgeschlagen ist Diese Suspension läßt man nach und nach in ein gläsernes Chroraatographierohr fließen, um eine gleichmäßige Säule au;; Diatomeenerde zu bilden.

25 mg Kristalle des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Gemisches de.· Antibiotika B-5050 werden in 0,4 mi der in der oben angegebenen Weise abgetrennten oberen Schicht gelöst. Die Lösung wird an der in der angegebenen Weise hergestellten Säule der Diatomeenerde Chromatographie«. Die Säule wird mit der oberen Schicht entwickelt, wodurch die aktiven Bestandteile angetrennt werden und jeweils als violette Banden zu beobachten sind Durch weitere Elution werden in getrennten Fraktionen die Antibiotika B-5O5O-A. B-5O5O-B. B-5050-C. B-5050-D. B-5050-E und B-5O5O-F in dieser Reihenfolge erhalten. Als Produkte werden hierbei 4 mg B-5050-A, 3 mg B-5050-B, 5 mg B-5050-C, 4 mg eines Gemisches von B-5050-D und B-5O5O-E und 2 mg B-5050-F in Form von Kristallen erhalten.

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 1 angegebene Weise wird eine Impfkultur von Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995) hergestellt. Je 2 ml der Impfkultur werden in je 50 ml eines Hauptkulturmediums geimpft, das in 200-ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und sterilisiert worden ist und aus 3,0% Glucose. 0,5% Maisquellwasser. 1.0% entfettetem Sojabohnenmehl, 0.5% Natriumchlorid, 0.05% Magnesiumsulfat. 0.1% Dikaliurnhydrogenphosphat 0.05% Kaliumchlorid. 0,3% Calcium· carbonat und Wasser besteht und auf pH 7.0 eingestellt ist Die Fermentation wird 96 Stunden bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt. Die hierbei erhaltene filtrierte Kulturbrühe zeigt eine antimikrobische Wirksamkeit von 350 Verdünnungseinheiten gegen Bacillus subtilis.

1.6 1 der filtrierten Kulturbrühe werden auf pH 7,8 eingestellt und mit 800 ml Äthylacetat und dann mit 600 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereidigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 600 ml wäßriger 0.005 n-HCl-Lösung extrahiert. Die wäßrigen Schichten werden vereinigt, mit wäßriger 0,1 n-NaOH-Lösung auf pH 7 bis 8 eingestellt und zweimal mit je 500 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratistert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand Werden 30 ml η-Hexan gegeben, wobei 59 mg eines rohen Pulvers erhalten werden. Das Pulver wird in heißem P -nzol gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei SiJi 15 mg eines Gemisches der Antibiotika 8^5050 als farblose Nadeln abscheiden.

Beispiel 6

2 ml einer Impfkultur, die auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt worden ist, werden in je 50 ml eines in 200-ml-Erlenmyerkolben enthaltenen Hauptkulturmediums geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das gemäß Beispiel 1 verwendete Hauptkulturmedium hat. Die Kultivierung wird 96 Stunden bei 28° C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt Die hierbei erhaltene filtrierte Kulturbrühe hat eine antimikrobische Wirksamkeit von 350 Verdünnungseinheiten gegen Bacillus subtilis.

1,81 der filtrierten Kulturbrühe werden auf pH 8,0 eingestellt und zweimal mit je 400 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand werden 30 ml n-Hexan gegeben, wobei 210 mg eines rohen Pulvers erhalten werden. Das Pulver wird in 15 ml Benzol unter Erwärmung gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei sich 59 mg eines Gemisches der Antibiotika B-5050 in Form von Kristallen abscheiden.

Beispiel 7

9001 einer filtrierten Kulturbrühe, die auf die in Beispiel 1 angegebene Weise erhalten worden ist. werden auf die in Beispiel 1 angegebene Weise behandelt, wobei 70 g eines rohen Gemisches der Antibiotika B-5050 erhalten werden. Die rohe Probe wird in einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol {Volumenverhältnis 2:1) gelöst und an einer mit 2.1 kg Kieselgel gefüllten Säule (Merck AG., siehe oben) Chromatographien. Die Säule wird mit Äthylacetat-Ben iol (Volumenverhältnis 2:1) eluiert. Farblose Fraktionen werden aufgefangen und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 350 ml heißem Benzol gelöst und die Lösung stehen gelassen, wobei 7.0 g farblose Nadeln des Gemisches der Antibiotika B-5050 erhalten werden.

Beispiel 8

800 ml einer filtrierten Kulturbrühe, die auf die in Beispiel 6 angegebene Weise erhalten worden ist. werden auf pH-Wert 7.6 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 40 ml eines Molekularsiebs (Hersteller: Rohm & Haas Co.. USA) gefüllt ist. Die Säule wird mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann mit 2'i0 ml einer 30%igen wäßrigen Methanollösung eluiert. wobei ein braunes Eluat erhalten wird, das im wesentlichen keine antimikrobische Wirksamkeit zeigt Die F.lution wird mit 500 ml 80%igem wäßrigem Methanol fortgesetzt, wobei die Fraktionen erhalten werden, die den größten Teil der aktiven Bestandteile enthalten. Die Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt, bis das Methanol entfernt ist. Das Konzentrat wird auf pH 7.5 bis 8.5 eingestellt und zweimal mit je 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylatetatextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird n-Hexan gegeben, wobei 53 mg eines rohen Pulvers des Gemisches der Antibiotika B-5050 erhalten werden. Das ί Pulver wird in heißem Benzol gelöst und die Lösung stehen gelassen, wobei 17 mg Kristalle abgeschieden werden.

Beispiel 9

ίο In 100 ml Äthyiacetat wird 1,0 g des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kristalls I gelöst Die Lösung wird dreimal mit je 100 ml Sorensen's-Pufferlösung, die bei der ersten Extraktion einen pH-Wert von 5,5, bei der zweiten Extraktion einen pH-Wert von 4,9 und bei der dritten

Ii Extraktion einen pH-Wert von 4,4 hat (und 0,1 molar an Dinatriumhydrogencitrat ist), in dieser Reihenfolge extrahiert Jede Fraktion wird mit verdünntem wäßrigem Ammoniak auf pH-Wert 9,5 eingestelli and mit dem halben Volumen an Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei sich Kristalle abscheiden. Aus der mit der Pufferlösung von pH-Wert 4,9 extrahierten Fraktion werden 365 mg Antibiotikum B-5050-C erhalten.

Die Äthylacetatschicht, die nach der Extraktion mit diesen Pufferlösungen zurückbleibt, ergibt 110 mg Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-A und B-5050-B bestehen. Die mit der Pufferlösung vom pH-Wert 4,4 extrahierte Fraktion

jo ergibt 165 mg Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5O5O-B und B-5O5O-C bestehen, die mit der Pufferlösung vom pH-Wert 5.5 extrahierte Fraktion ergibt 320 mg Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050D. B-5050-D, B-5050-E und

,s B-5050-Fbestehen.

Beispiel 10

In 1 Liter Äthylacetat werden 10 g des gemäß Beispiel 2 hei gestellten Kristalls II gelöst. Die Lösung wird

jn zweimal mit je 800 ml Sorensen-Pufferlösung vom pH-Wert 4,9 und viernal mit je 1 Liter Sorensen-Pufferlösung vom pH-Wert 4.4 in dieser Reihenfolge extrahiert. Jede Fraktion wird mit verdünntem wäßrigem Ammoniak auf pH 9,5 eingestellt und mit ihrem

₄-, halben Volumen an Äthylacetat extrahiert. Die Äthyl acetatschicht wird mit Wasser gewaschen, dehydratisieit und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei sich Kristalle abscheiden. Die jeweiligen Fraktionen werden auf die im Beispiel 9 angegebene Weise

ν, behandelt. Die nach der Extraktion mit ^°n Pufferlösungen zurückbleibende Äthylacetatschicht ergibt 4,2 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-A bestehen. Die m-t der Pufferlösung vom pH-Wert 4.4 extrahierten Fraktionen ergeben 3,8 g Kristalle, die

-,-, hauptsächlich aus Antibiotikum B-5O5O-B bestehen. Die mit der Pufferlösung vom pH-Wert 4.9 extrahierten Fraktionen ergeben 1.3 g Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B 5050-B und B-5O5O-C bestehen.

llicr/ii 1 Hl.itt /λ κ 'hnunyi n

Claims

Patentansprüche;

gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

i) einen Schmelzpunkt von etwa 129 bis 132°C der kristallinen Verbindung (umkristallisiert aus einem Acetcn-n-Hexan-Gemisch [Volumenverhältnis 1 : 3]),

b) spezifische Drehung [a]" : -72,3° ± 7° (c = 1, in Ethanol),

c) keine ausge{/rägter< Absorptionsmaxima im Uitraviolettspektrum.
2. Antibiotika B-5050-B (Maridomycin II) der Formel

CH, CFI₂CHO

OH

CH,

O—i-Valeryl

CH,

gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften;

a) Schmelzpunkt etwa 134 bis 136°C der kristallinen Verbindung nach Umkristallisation aus einem| Gemisch von Aceton und n-Hexan;

b) spezifische Drehung [a)'_D ^} : -7L9⁰ ± T (c = 1, in Ethanöi);

c) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Uüraviolettspektrum.
3, Antibiotikum B-5050-C (Maridomycin III) der Formel

CH, CII₃CHO

\— O — C — C₂H_S

gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Schmelzpunkt etwa 135 bis 138°C nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan;

b) spezifische Drehung [a]" : -76° :· 8° (c = 1; in Ethanol);

c) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Ultraviolettspektrum.
4. Antibiotika B-5050-D (Maridomycin IV) der Formel CH, C H-C H O

HO

O — C — C₂H₅

CH,

gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Schmelzpunkt etwa 143 bis 146°C der kristallinen Verbindung nach Umkristallisieren aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan;

b) spezifische Drehung [a]'i : -76,2° ± 8° (c =· 1; in Ethanol);

c) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Ultraviolettspektrum.
5. Antibiotikum B-5O5O-E (Maridomycin V) der Formel

CH, CH₂CHO

HO

O —C —CH,

CH₃

gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Schmelzpunkt etwa 144 bis 149⁰C der kristallinen Verbindung nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und η-Ί-Icxan;

b) spezifische Drehung [ct\^}j : -73,6° ± 7° (c = 1, Ethanol);

c) keine ausgeprägten Absorplionsmaxima im Ultraviolcttspektrum.
6. Antibiotikum B-5050-F (Maridomycin VI) der Formel GH₃ CH₂CHO

gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Schmelzpunkt etwa 149 bis 154°C der kristallinen Verbindung nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan;

b) spezifische Drehung [et] 'i: -77,7° ±8° (c= 1, in Ethanol);

c) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Ultraviolettspektrum. η
7. B-5050-Komplex der Antibiotika B-5050-A, B-5050-B, B-5050-C, B-5050-D, B-5050-E und B-5050-F, erhältlich durch Kultivierung von Streptomyces hygroscopicus IFO 12995 in einem Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff enthält, unter üblichen aeroben Bedingungen bei pH-Werten von etwa 6 — 8, Abtrennung der gebildeten Antibiotika aus der Kulturbrühe bei pH-Wert von etwa 8,5 durch Extraktion mit Äthylacetat, Einengen der gewaschenen Extrakte und Ausfällen mittels η-Hexan, Auflösen des ausgefällten Produkts in einem Gemisch von Äthylacetat/Benzol (Volumenverhäitnis 2 :1), Chromatographie an Kieselgel, Elution mit Äthylacetat/ Benzol (2:1), Auffangen der farblosen Frak'"?nen, Eindampfen zur Trockne und Umkristallisieren des Rückstandes aus Benzol.
8. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika B-5050-A bis -F gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß man Streptomyces hygroscopicus IFO-12995 in einem Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff enthält, unter üblichen aeroben Bedingungen kultiviert, die gebildeten Antibiotika

1. aus der Kulturbrühe im schwach basischen Bereich

a) durch Extraktion mit einem nat Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel.

b) durch Adsorption an üblichen Adsorptionsmittel oder an einem Kationenaustauscherharz und Eluierung,
2. aus dem Mycel

a) durch Extraktion mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, Einengen des Extrakts und Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel,

b) durch Extraktion mit einer verdünnten wäßrigen Säure, Einstellung auf einen pH-Wert im neutralen bis schwach basischen Bereich und Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel

abtrennt, als Gemisch aus den Extrakten bzw. Eluaten nach üblichen Methoden, durch Einengen der gewaschenen oder ungewaschenen Extrakte, erforderlichenfalls Zusatz eines unpolaren Lösungsmittels, Kristallisieren aus einem Lösungsmittel und/oder Reinigung durch Adsorption, isoliert und das erhaltene Gemisch anschließend

durch Adsorptionschromatographie
durch Verteilung zwischen einem lipophilen organischen Lösungsmittel und wäßrigen sauren Pufferlösungen,
durch Verteilungschromatographie
durch Gegenstromverteilung oder
papier- oder dünnschichtchromatographisch in die einzelnen Komponenten A-F auftrennt, wobei die Trennung durch mikrobiologische oder chemische Tests kontrolliert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei pH-Werten von etwa 6—8 vornimmt, die gebildeten Antibiotika bei pH-Werten von etwa 7 — 10 aus der Kulturbrühe abtrennt und das erhaltene Gemisch durch Adsorptionschromatographie an Kieselgel, und Eluierung mit einem Gemisch aus einem unpolaren organi-

sehen und einem polaren organischen Lösungsmittel (einem Gemisch aus Benzoi/Äthylacelal),oder durch Verteilung zwischen einem lipophilen Lösungsmittel (Äthylacetat) und wäßrigen sauren Pufferlösungen mit pH-WerteVi im Bereich von 4,0 — 5,6 in die einzelnen Komponenten A-F auftrennt,
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Gemisch aus Bej^ol/Äthylacetal eluiert und als lipophiles Lösungsmittel bei der Verteilung Athytacetat verwen- in

det.
11. Verfahren nach Anspruch 8 bis 10* dadurch gekennzeichnet, daß man die Anreicherung mittels Bacillus subtilis (PCI 219) als Testorganismus kontrolliert.
12. Pharmazeutische Zubereitung,- enthaltend ein oder mehrere Antibiotika nach Ansprüchen I —6 oder den Komplex nach Anspruch 7 in Verbindung mit pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoffen.