DE2902676C2 - Verfahren zur Analyse eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens im Serum mittels eines Immunoassays - Google Patents

Verfahren zur Analyse eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens im Serum mittels eines Immunoassays

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens im Serum mittels eines Immunoassays und insbesondere eines sol­ chen, bei dem von den Bindungseigenschaften von Immuno­ globulinen Gebrauch gemacht wird.
Bekanntlich verbinden sich Immunglobulinantikörper mit den entsprechenden spezifischen Antigenen oder Haptenen (Ag), wovon in vielen Immunoassay-Verfahren Gebrauch gemacht wird. Beispielsweise können menschliche Seren auf die Anwe­ senheit eines bestimmten Antigens unter Verwendung des ent­ sprechenden Immunglobulinantikörpers untersucht werden, bei­ spielsweise aufgrund der kompetitiven Bindung oder der Latex­ agglutinierung. Diese und andere Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Eine Schwierigkeit, die in derartigen Immunoassays auf­ treten kann, besteht darin, daß andere in dem zu untersuchen­ den Serum vorhandene Proteine stören können.
Insbesondere enthält das menschliche Serum den Rheumatoidfaktor (RF) und die Komponente C1q (eine Komplementkomponente), und diese beiden Substanzen binden sich gleichfalls an das Immunglobu­ lin. Außerdem können die Mengen an dem Rheumatoidfaktor und der Komponente C1q in menschlichen Seren in sehr weiten Gren­ zen variieren, weshalb es normalerweise erforderlich ist, die Seren vor der Durchführung des Assays einer Behandlung zur Inaktivierung oder Entfernung von endogenem Rheumatoidfaktor und der Komponente C1q zu behandeln. Wenn dies nicht getan wird, können die Assayergebnisse und insbesondere jegliche quantitativen Ergebnisse beträchtliche Fehler aufweisen.
Es wurde nun ein Verfahren zur Analyse eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens im Serum mittels eines Immunoassays gefunden, bei dem von der bindenden Eigen­ schaft der Immunglobuline für Antigene (immer ein­ schließlich Haptene) Gebrauch gemacht wird und das in Gegenwart des Rheumatoidfaktors und bzw. oder der Kom­ ponente C1q durchgeführt werden kann, ohne daß es durch deren Anwesenheit gestört wird. Dabei werden die F(ab′)₂-Untergruppen des Immunglobulins anstelle von Gesamtimmun­ globulin verwendet. Die F(ab′)₂-Untergruppen von bei­ spielsweise Immunglobulin G besitzen die Eigenschaft, sich spezifisch an Antigene, d. h. nicht an den Rheumatoid­ faktor oder die Komponente C1q zu binden. (Die F(c)-Unter­ gruppe der Immunglobuline ist für die Bindungsreaktion des Immunglobulins an den Rheumatoidfaktor oder die Kom­ ponente C1q, jedoch nicht für die Bindungsreaktion mit einem spezifischen Antigen verantwortlich). Daraus er­ gibt sich, daß bei diesem Vorgehen die Spezifität des Immunglobulins gegenüber einem bestimmten Antigen auf­ rechterhalten bleibt, jedoch ohne die damit einhergehende Eigenschaft der Bindung an den Rheumatoidfaktor und bzw. oder die Komponente C1q.
Aus der Literaturstelle S. Seil, Immunologie, Immun­ pathologie und Immunität, Weinheim und New York, 1977, Seiten 60-63, 91 und 92, ist es bekannt, daß F(ab′)₂-Fragmente mit Antigenen reagieren können. Aus der nicht vorveröffentlichten DE-OS 26 43 207 ist die Verwendung von F(ab′)₂-Fragmenten zur Durchführung von Immunoassays be­ kannt. Die F(ab′)₂-Fragmente sind dabei immunologisch an einen Träger gebunden. Aus der Literaturstelle Immuno­ chemistry 1972, 1203-1208 ist ein Latexagglunitationstest mit F(ab′)₂-Fragmenten von Rinderimmunglobulin gegenüber dem Rheumatoidfaktor RF bekannt. Somit mußte es als ausgeschlossen erscheinen, daß F(ab′)₂-Untergruppen von Immunglobulinen besser als die entsprechenden Gesamtglobuline zur von RF unge­ störten Analyse von Antigenen geeignet sein könnten.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse eines endogenes RF und/oder C1q in Lösung enthaltenden Serums mittels eines Immunoassays zum Nachweis oder zur Bestimmung eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens, bei dem man
  • (a) eine Probe des Serums, das eine flüssige Phase dar­ stellt, mit einer festen Phase aus wasserunlöslichem Material, ausgenommen eines Rinderimmunglobulins, die für das Antigen spezifisch sind, gebunden sind, zu einem Reaktionsgemisch ver­ mischt, wobei man das Reaktionsgemisch zur Vermeidung von Störungen durch endogenes RF und C1q von Gesamtimmunglobulin des eingesetzten Immunglobulins und den F(c)-Untergruppen davon praktisch freihält,
  • (b) das Reaktionsgemisch zur Ermöglichung der Umsetzung zwischen den F(ab′)₂-Untergruppen und jeglichem vorhandenen Antigen bebrütet und
  • (c) das Ausmaß, bis zu dem die Umsetzung in dem Gemisch erfolgt ist, bestimmt und dadurch die Anwesenheit oder die Menge des Antigens in der Probe direkt bestimmt.
Immunglobuline, wie IgG können in ihre Bestandteile F(ab′)₂ und F(c) auf bekannte Weise, beispielsweise durch enzymatische Behandlung mit Pepsin, gespalten werden. Die F(ab′)₂-Untergruppen können dann von den F(c)-Untergruppen abgetrennt werden. Ein Beispiel für die Herstellung von F(ab′)₂ besteht darin, daß man Gesamtimmunglobulin mit Pepsin (2 mg Pepsin je 100 mg Immunglobulin) in einem 0,1 m Acetatpuffer vom pH 4,5 vermischt. Das Gemisch wird bei 37°C 24 h lang bebrütet. Das gebildete F(ab′)₂ wird an­ schließend an einer Säule von Ultrogel AcA 4,4 abgetrennt, wobei man 80 bis 90% der theoretischen Ausbeute von F(ab′)₂ erhält.
Die F(ab′)₂-Untergruppen werden gemäß der Erfindung in unlöslichgemachter Form verwendet, d. h. an ein wasserunlösli­ ches Substrat gebunden (wobei darunter sowohl adsorbiert als auch mit kovalenter Bindung verknüpft zu verstehen ist). Die Art des Substrats kann in weiten Grenzen variieren: beispielsweise kann es in Folienform vorliegen oder in Form einer hohlen Röhre oder als teilchenförmiges Material. Eine bevorzugte Form von teilchenförmigem Material ist magnetisch anziehbar, so daß nach der Umsetzung zwischen dem zu be­ stimmenden Antigen und den Untergruppen das teilchenförmige Material unter Anwendung eines Magnetfelds abgetrennt werden kann. Assays dieser Art sind in der BE-PS 852 327 beschrie­ ben.
Eine weitere Form unlöslich gemachter F(ab′)₂-Untergruppen besteht in einer Latexsuspension, und derartige Suspensionen können anstelle von Gesamtimmunglo­ bulin bei Latexagglutinierungstests auf Antigene verwendet werden. Bei derartigen Tests wird eine Probe des auf ein Antigen zu untersuchenden Serums (beispielsweise menschliches Serum) mit Latexteilchen vermischt, die einen Überzug aus einem Antikörper für dieses Antigen aufweisen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden anstelle des Antikörpers aus Gesamtimmunglobulin in dem Überzug F(ab′)₂-Untergruppen verwendet. Die spezifische Bindung zwischen dem Überzug und dem Antigen verursacht, daß die Latexteil­ chen agglutiniert werden. Das Ausmaß der Agglutinierung kann visuell (für qualitative Ergebnisse) beobachtet wer­ den oder auch quantitativ durch Auszählen bestimmt werden, indem vorzugsweise die agglutinierten oder insbesondere die nicht agglutinierten Teilchen automatisch gezählt werden.
Es ist zu bemerken, daß bei den Latexagglutinierungs­ tests unter Verwendung von F(ab′)₂-Untergruppen kein Di­ thiothreit (DTT) vorhanden sein darf, da dieses die Agglu­ tinierung verhindert. Etwa vorhandenes Dithiothreit kann durch Oxydation mit Wasserstoffperoxid inaktiviert werden.
Die an wasserunlösliche Teilchen gebundenen F(ab′)₂-Immunglobulin-Untergruppen können erfin­ dungsgemäß anstelle des Gesamtimmunglobulins bei einer Viel­ zahl von Immunoassays verwendet werden, bei denen eine spezi­ fische Umsetzung zwischen dem Immunglobulin und einem Antigen erfolgt, wobei jedoch keine Umsetzung zwischen dem Immun­ globulin und dem Rheumatoidfaktor oder der Komponente C1q erforderlich ist. (Es gibt selbstverständlich Assays, bei denen der Rheumatoidfaktor oder die Komponente C1q als Rea­ genz zur Umsetzung mit dem Immunglobulin zugesetzt wird. Bei derartigen Assays können die F(ab′)₂-Untergruppen nicht ein­ fach als Ersatz für Gesamtimmunglobulin verwendet werden.)
Das Assayverfahren gemäß der Erfindung kann in geeig­ neten Fällen nach dem dem Fachmann bekannten Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses durchgeführt werden, wobei einzelne Abschnitte aus dem Reaktionsgemisch, getrennt durch einen Abschnitt aus inertem Material, wie beispielsweise Luft, und gewünschtenfalls durch einen Abschnitt aus Waschflüssig­ keit, entlang einer Leitung geführt werden. Dieses Verfah­ ren ist in der US-PS 2 797 149 beschrieben.
Unlöslichgemachte F(ab′)₂-Untergruppen können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Die Untergruppen können beispielsweise an die Oberfläche eines geeigneten Substrats adsorbiert werden. Alternativ kann Gesamtimmun­ globulin, beispielsweise IgG, an eine Substratoberfläche kovalent gebunden und anschließend zur Abtrennung der F(c)-Untergruppen behandelt werden, wobei die F(ab′)₂- Untergruppen an dem Substrat kovalent gebunden bleiben. Auf diese Weise kann mit F(ab′)₂ überzogener Latex auf eine dieser Weisen hergestellt werden, d. h. der Latex mit einem für eine Adsorption geeigneten Überzug auf den Latex­ teilchen kann mit F(ab′)₂-Untergruppen in einem Puffer ver­ mischt werden, worauf die F(ab′)₂-Untergruppen unmittelbar an den Latex adsorbiert werden, oder Gesamt-IgG-Antikörper kann an den Latex gekuppelt und davon die F(c)-Untergruppen abgespalten werden, die anschließend aus dem Gemisch ent­ fernt werden, wonach die F(ab′)₂-Untergruppen, an den Latex gebunden, zurückbleiben. In einem Beispiel für dieses Vor­ gehen wird das Immunglobulin an den Latex nach dem Verfah­ ren gemäß der DE 29 02 677 A1 gebunden. Dieses Verfahren besteht, kurz gesagt, daraus, daß man zunächst den Latex mit einem Protein be­ schichtet, das fest an dem Latex klebt und gegenüber Proteo­ lyse verhältnismäßig resistent ist. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist Lactoferrin. Die Immunglobulinantikör­ per werden dann an das Lactoferrin kovalent gebunden, indem man beispielsweise das Leuchs-Anhydrid von N-ε-Chloracetyl­ lysin (NCA) als Kupplungsmittel verwendet. Die Latex-Lacto­ ferrin-NCA-Antikörper werden anschließend mit Pepsin dige­ riert, beispielsweise unter den folgenden Bedingungen: 0,2 m Acetatpuffer, pH 3,2, Pepsin/Immunglobulin-Verhältnis = 1/10, 0,5%ige Latexsuspension, Bebrütung 60 min bei 37°C. Auf diese Weise werden Latexteilchen erhalten, die die F(ab′)₂-Untergruppe des Immunglobulins tragen.
Die Latexteilchen (oder andere F(ab′)₂-Unter­ gruppen tragenden Substrate), die auf diese Weise und nach dem Adsorptionsverfahren erhalten worden sind, werden durch die Rheumatoidfaktor-Konzentrationen, wie sie in Seren, die reich an dem Rheumatoidfaktor sind, vorkommen, nicht agglu­ tiniert. Die Latexteilchen können mit Erfolg bei den Latex­ agglutinierungstests für Antigene selbst in Gegenwart von Rheumatoidfaktor oder der Komponente C1q eingesetzt werden.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung von F(ab′)₂-Latexteilchen durch Adsorption
Eine 10%ige Suspension aus Latexteilchen (Dow, 0,794 µ Durchmesser, S.D.0,044 µ, No. 41943, Serva Feinbiochemica, D-6900 Heidelberg 1) wird auf das 20fache mit 0,02 m Glycin/0,035 m NaCl-Puffer vom pH 9,1 verdünnt und einmal mit diesem Puffer gewaschen. 1/10 Volumen der F(ab′)₂-Lösung, 2 bis 3 mg/ml, hergestellt wie oben, wird daraufhin zugesetzt, und nach 10 bis 15 min Bebrüten bei Raumtemperatur wird 1/10 Volumen von 10%igem menschlichen Serumalbumin (HSA) in dem gleichen Puffer wie der Latex zugesetzt, um eine Proteinsättigung sicherzustellen. Nach weiteren 20 bis 30 min Bebrüten wird der Latex zweimal mit dem ursprünglichen Puffer gewaschen, bevor er in dem ursprünglichen Volumen 0,10 m Glycin/0,17 m NaCl-Puffer vom pH 9,1 mit einem Gehalt von 1% HSA erneut suspendiert wird, wobei man eine Latexsuspension von 0,5%iger Konzentration erhält, die somit auf das 20fache im Verhältnis zur ur­ sprünglichen Konzentration verdünnt ist.
Antiserum
In Kaninchen wurde ein Antiserum gegenüber IgE erzeugt, wobei das Freund′sche vollständige Adjuvans verwendet wur­ de, und es wurde auf das 10fache im Cyclinpuffer verdünnt, der drei Tropfen "Tween 20" je Liter enthielt, und durch ein Milipore (GWSP 06700)-Filter von 0,22 µ filtriert, bevor es verwendet wurde.
Automatisierter Assay
Patientenserum wurde in einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/ min in ein kontinuierliches Durchflußsystem angesaugt, das aus einer peristaltischen Pumpe, einem verzweigten Lei­ tungssystem, einem Teilchenzähler und einem Registrierge­ rät bestand. Das Serum wurde mit 1,0 ml von mit Glycin ge­ pufferten Latexteilchen vermischt und das Ganze 10 min lang durch eine Bebrütungsschlange geleitet. Die Lösung wurde danach in einen Zellenzähler geleitet, wo die nicht agglu­ tinierten Teilchen gezählt und die agglutinierten Teilchen elektronisch ausgesondert wurden. Die Konzentration an IgE im Serum war direkt proportional der Abnahme an Teil­ chen im Bereich von 6 bis 100 internationalen Einheiten von IgE. Proben von dreizehn Patienten, die wie­ derholt analysiert wurden, ergaben einen Variationskoeffi­ zienten von 2% im mittleren Bereich (at mid-range) sowie einen Korrelationskoeffizienten von 0,95, verglichen mit einem Radioimmunoassay-Test.
Beispiel 2 Herstellung von F(ab′)₂, kovalent an Latex gebunden
12 mg N-ε-Chloracetyllysin-N-carboxyanhydrid (NCA) in 100 µl Dioxan gelöst, wurden zu 50 mg mit Eisen gesättig­ tem Lactoferrin in 1 ml mit Phosphat gepufferter Salz­ lösung vom pH 7,2 (PBS) hinzugegeben. Nach 24-stündiger Bebrütung im Dunklen bei 4°C wurde das Präparat zum Aufbewahren lyophilisiert. Danach wurden Polystyrollatex­ teilchen (0,8 µ Durchmesser, 10%ige Suspension) überzogen, indem man 500 µg NCA-Lactoferrin mit 0,4 ml PBS und 50 µl des 10%igen Latex vermischte. Nach 45 minütigem Bebrüten bei Raumtemperatur wurden die Teilchen zweimal mit 1 ml 0,2 m Carbonatpuffer vom pH 9,6 gewaschen. Um Hydrolyse der Chloracetylgruppen bei alkalischem pH-Wert zu vermei­ den, mußte der reduzierte IgG-Antikörper sofort zugesetzt werden. Das IgG wurde aus Antipferdemilzferritin vom Ka­ ninchen (rabbit anti-horse spleen ferritin) durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und nachfolgendem Chromatographieren an DEAE-Cellulose hergestellt. Das IgG wurde mit einer End­ konzentration von 8 mg/ml in 0,1 m Phosphatlösung vom pH 8,5 1 h lang bei 37°C mit 1,1 mM Dithiothreit (DTT) reduziert. Gemische mit einem Gehalt von 1 ml der 0,5%igen Suspension aus frisch hergestelltem NCA-Lactoferrin-Latex und verschie­ denen Volumina (15 bis 125 µl) Lösung aus reduziertem IgG-Antikörper wurden durch Hindurchblasen von Stickstoff während einiger Sekunden von Sauerstoff befreit; danach wurde das Rohr unter Vakuum verschlossen. Nach 24 h Stehen bei Raumtemperatur im Dunklen wurde der Latex zweimal mit 0,4 m Carbonatpuffer vom pH 9,6 mit einem Gehalt von 1% BSA (Rinderserumalbumin) und 0,1% Tween-20 gewaschen und erneut in GBS (mit Glycin gepufferte Salzlösung)/BSA suspendiert. Nicht kovalent gebundenes IgG wurde mit Tween-20 entfernt. Um den Antikörper (IgG), der an die Proteingrenzfläche ge­ kuppelt ist, zu digerieren, wurden die Teilchen in 0,1 m Acetatpuffer vom pH 3,2 suspendiert und 1 h bei 37°C mit Pepsin bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 : 10 (Gewicht/Gewicht) bebrütet. Nach Zentrifugieren und zwei­ maligem Waschen der Teilchen mit 0,1 m Glycin/HCl-Puffer vom pH 9,2 mit einem Gehalt von 0,17 m NaCl (GBS) und 1% Rinderserumalbumin (BSA) (GBS/BSA), wurde die Anwesenheit von nicht angegriffenem IgG auf den Teilchen durch Messung der Agglutinierung mit Rheumatoidsera überprüft, und Latexpräparate, die mit Rheumatoidsera reagierten, wurden erneut mit Pepsin digeriert, bis keine weitere derartige Agglutinierung beobachtet wurde. Latexagglutinierungstests auf Ferritin im Serum wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei das obengenannte Reagenz verwendet wurde, und es wurden sehr zufriedenstellende Ergebnisse erhalten.

Claims (7)

1. Verfahren zur Analyse eines endogenen RF und/oder C1q in Lösung enthaltenden Serums mittels eines Immuno­ assays zum Nachweis oder zur Bestimmung eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens, bei dem man
  • (a) eine Probe des Serums, das eine flüssige Phase darstellt, mit einer festen Phase aus wasserunlöslichem Material, an das F(ab′)₂-Untergruppen eines Immunglobu­ lins, ausgenommen eines Rinderimmunglobulins, die für das Antigen spezifisch sind, gebunden sind, zu einem Reaktionsgemisch vermischt, wobei man das Reaktions­ gemisch zur Vermeidung von Störungen durch endogenes RF und C1q von Gesamtimmunglobulin des eingesetzten Immunglobulins und den F(c)-Untergruppen davon praktisch freihält,
  • (b) das Reaktionsgemisch zur Ermöglichung der Um­ setzung zwischen den F(ab′)₂-Untergruppen und jeglichem vorhandenen Antigen bebrütet und
  • (c) das Ausmaß, bis zu dem die Umsetzung in dem Gemisch erfolgt ist, bestimmt und dadurch die Anwesenheit oder die Menge des Antigens in der Probe direkt bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausmaß der Umsetzung durch Bestimmung des Aus­ maßes der Agglutinierung der Teilchen bestimmt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserunlösliche Teilchen Latexteilchen einsetzt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausmaß der Agglutinierung durch selektives Aus­ zählen der agglutinierten oder der nicht agglutinierten Latexteilchen bestimmt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Teilchen solche verwendet, die magnetisch anziehbar sind, und daß man die Teilchen nach der Um­ setzung zwischen dem Antigen und den Untergruppen unter Anwendung eines Magnetfeldes abtrennt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu untersuchende Flüssigkeit menschliches Serum einsetzt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Methode des kontinuierlichen Durchflusses anwendet.
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