CZ300737B6 - Molekula protilátky specifická pro humánní TNFalfa, sloucenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití mo - Google Patents

Molekula protilátky specifická pro humánní TNFalfa, sloucenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití mo Download PDF

Info

Publication number
CZ300737B6
CZ300737B6 CZ20020837A CZ2002837A CZ300737B6 CZ 300737 B6 CZ300737 B6 CZ 300737B6 CZ 20020837 A CZ20020837 A CZ 20020837A CZ 2002837 A CZ2002837 A CZ 2002837A CZ 300737 B6 CZ300737 B6 CZ 300737B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
antibody molecule
artificial sequence
ser
dna
Prior art date
Application number
CZ20020837A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2002837A3 (cs
Inventor
Singh Athwal@Diljeet
Thomas Brown@Derek
Neil Charles Weir@Andrew
George Popplewell@Andrew
Paul Chapman@Andrew
John King@David
Original Assignee
Ucb Pharma S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ300737(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma S.A. filed Critical Ucb Pharma S.A.
Publication of CZ2002837A3 publication Critical patent/CZ2002837A3/cs
Publication of CZ300737B6 publication Critical patent/CZ300737B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Abstract

Molekula protilátky specifická pro humánní TNF.alfa., která obsahuje lehký retezec a težký retezec, kde tento lehký retezec obsahuje variabilní úsek lehkého retezce hTNF40-gL1 (SEKV. ID. C. 8) a težký retezec obsahuje variabilní úsek težkého retezce gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. C. 11), a zpusob její prípravy. Sloucenina obsahující tuto molekulu protilátky, která obsahuje lehký retezec tvorený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. C. 113 a težký retezec tvorený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. C. 115, mající na jednom ze svých cysteinových zbytku na C-konci težkého retezce navázanou skupinu odvozenou z lysyl-maleinimidové skupiny, kde každá ze dvou aminových skupin lysylových zbytku má kovalentne navázaný methoxypoly(ethylenglykol)ový zbytek o molekulové hmotnosti asi 20 000 Da, každý v aminoskupine lysylu, pricemž celková molekulová hmotnost methoxypoly(ethylenglykol)ových zbytku je asi 40 000 Da. Sekvence DNA kódující težký a/nebo lehký retezec molekuly protilátky, klonovací nebo expresní vektor a hostitelský bunka transformovaná tímto vektorem. Terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití molekuly protilátky pro lécení revmatoidní artritidy, osteoartritidy, Crohnovy nemoci nebo psoriázy.

Description

Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, sloučenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská buňka, způsob přípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití molekuly protilátky
Oblast techniky
Vynález se týká molekul protilátky, které jsou specifické pro antigenní determinanty nádorového nekrotického faktoru alfa (TNFa, „tumour necrosis factor alpha“), sloučeniny obsahující molekulu této protilátky, sekvence DNA kódující těžký a/nebo lehký řetězec této molekuly protilátky, klonovacího nebo expresního vektoru obsahujícího uvedenou sekvenci DNA, hostitelské buňky transformované uvedeným vektorem, způsobu přípravy této molekuly protilátky, terapeutické nebo diagnostické kompozice a terapeutického použití této molekuly protilátky pro výrobu léčiva pro léčení nemoci zprostředkovaných TNF-alfa, konkrétně revmatoidní artritidy, osteoartritidy, Crohnovy nemoci nebo psoriázy.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká proti látkových molekul. V molekule protilátky jsou dva těžké řetězce a dva lehké řetězce. Každý těžký řetězec a každý lehký řetězec má ve svém N-koncovém úseku variabilní doménu. Každá variabilní doména je složena ze čtyř rámcových úseků (FR, „framework region“), které jsou střídány se třemi úseky určujícími komplementaritu (CDR, „complementarity determining region“). Zbýtky ve variabilní doméně jsou dohodou číslovány podle systému navrženého autory Kabat a kol. Tento systém je uveden v práci autorů Kabat a kol., 1987, Sequences of Proteins of Umnunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIEI, USA (dále „Kabat a kol. (viz výše)“). Tento systém číslování byl také použit v předkládaném popisu, pokud není uvedeno jinak.
Kabatovo označení zbytků neodpovídá vždy přímo lineárnímu číslování aminokyselinových zbytků. Aktuální lineární aminokyselinová sekvence může obsahovat méně aminokyselin nebo další aminokyseliny, než v přesném Kabátově Číslování, což odpovídá zkrácení strukturální složky nebo vložení (inzerci) do strukturální složky, ať už do úseku rámce nebo do CDR, základní struktury variabilní domény. Správné Kabatovo Číslování zbytků může být pro danou protilátku zjištěno porovnáním homoíogie zbytků v sekvenci protilátky se „standardní“ sekvencí číslovanou dle Kabata.
CDR variabilních domén těžkého řetězce jsou lokalizovány ve zbytcích 31 až 35 (CDRH1), zbytcích 50 až 65 (CDRH2) a zbytcích 95 až 102 (CDRH3) podle Kabátová číslování.
CDR variabilních domén lehkého řetězce jsou lokalizovány ve zbytcích 24 až 34 (CDRL1), zbytcích 50 až 56 (CDRL2) a zbytcích 89 až 97 (CDRL3) podle Kabátová číslování.
Konstrukce CDR-roubovaných protilátek je popsána v evropské patentové přihlášce EP A 0239400, která popisuje postup, kterým jsou CDR myší monoklonální protilátky jsou roubovány do úseků rámce variabilních domén humánního imunoglobulinu místně cílenou mutagenezí s použitím dlouhých oligonukleotidu. CDR určují specifičnost vazby antigenu protilátkami a jsou to relativně krátké peptidové sekvence nesené v úsecích rámce variabilních domén.
Rané práce týkající se humanizace monoklonálních protilátek prostřednictvím CDR-roubování byly prováděny na monoklonálních protilátkách rozpoznávajících syntetické antigeny, jako je například NP. Ale byly popsány příklady, ve kterých myší monoklonální protilátka rozpoznávající lysozym a monoklonální protilátka laboratorního potkana rozpoznávající antigen na humán55 nich T lymfocytech byly humanizovány pomocí CDR-roubování, a to autory Verhoeyen a kol.
-1 CZ 300737 B6 (Science, 239, 1534-1536, 1988} a Riechmann a kol. (Naiure, 332, 323-324, 198), vdaném pořadí.
Riechmann a kol, zjistili, že transfer samotných CDR (jak definovány Kabatem (Kabat a kol.
(výše) a Wu a kol., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) nebyl postačující pro vznik uspokojivé aktivity vázající antigen u CDR-roubovaného produktu. Bylo zjištěno, že musí být změněn velký počet zbytků rámce tak, aby odpovídaly zbytkům úseku rámce dárce. Navrhovaná kritéria pro výběr, které zbytky rámce potřebuji být změněny, jsou popsána v mezinárodní patentové přihlášce WO 90/07861.
io
Publikován byl velký počet přehledů pojednávajících o CDR-roubovaných protilátkách, včetně Vaughan a kol. (Nátuře Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
TNFa je pro-zánětlívý cytokin, který je uvolňován buňkami imunitního systému a interaguje snimi. Tedy, TNFa je uvolňován makrofágy, které byly aktivovány lipopolysacharidy (LPS) z gram-negativních bakterií. Ukazuje se, že TNFa je endogenní mediátor ústředního významu zapojený do rozvoje a patogeneze endotoxického šoku spojeného s bakteriální sepsí. Bylo také zjištěno, že se zvyšuje počet receptorů pro TNFa u velkého počtu nemocí člověka, včetně chronických nemocí, jako je například revmatoidní artritida, Crohnova nemoc, ulcerativní
2o kolitida a scierosis multiplex. Myši transgenní pro humánní TNFa produkují konstitutivně vysokou hladinu TNFa a vyvíjí se u nich spontánní, destruktivní polyarthritida připomínající revmatoidní arthritidu (Kaffer a kol., EMBO J., 10, 4025—4031, 1991). TNFa je tudíž nazýván pro-zánětlivý cytokin.
Ve stavu techniky byl popsány monoklonální protilátky proti TNFa. Meager a kol., (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) popsali myší monoklonální protilátky proti rekombinantnímu TNFa. Fendly a kol., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) popsali použití myších monoklonálních protilátek proti rekombinantnímu TNFa pri definování neutralizaci epitopů na TNF. Shimamoto a kol., (Imunology Letters, 17, 311-318, 1988) popsali použití myších monoklonálních protilátek proti
TNFy a jejich použití pri prevenci endotoxického šoku u myší. Dále, v mezinárodní publikované patentové přihlášce WO 92/11383, jsou popsány rekombinantní protilátky, včetně CDRroubovaných protilátek, specifických pro TNFa,. Rankin a kol., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) popsali použití těchto CDR- roubovaných protilátek v léčení revmatoidní artritidy. V patentu Spojených států amerických US A 5 919 452 popisuje anti-TNF chimérické protilátky a jejich použití v léčení patologických stavů spojených s výskytem TNF.
Protilátky k TNFa byly navrženy pro profylaxi a léčení endotoxického šoku (Beutler a kol.. Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer a kol., (Critical Care Medicine, 21, S44US446, 1993) a Wherry a kol., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) pojednávají terapeutický potenciál anti-TNFa protilátek v léčení septického šoku. Použití anti-TNFa protilátek v léčení septického šokuje také projednáváno autory Kirschenbaum a kol., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Arthritida vyvolaná kolagenem může být účinně léčena použitím anti-TNFa monoklonálních protilátek (Wiliam a kol. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)),
U pacientů trpících revmatoidní artritidou byly zjištěny zvýšené hladiny TNFa jak v synoviální tekutině, tak v periferní krvi. Když jsou pacientovi trpícímu revmatoidní artritidou podávána agens blokující TNFa, zmírňují zánět, zlepšují symptomy a oddalují poškození kloubu (McKown a kol. (Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).
Použití anti-TNFa protilátek v léčení revmatoidní arthritidy a Crohnovy nemoci je diskutováno v práci autorů Feldman a kol., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini a kol., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) a v Feldman a kol., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Protilátky k TNFa použité v těchto léčebných postupech jsou obecně chimérické protilátky, jako například ty popsané v US A 5 919 452.
. 2
CL JUU/J/ HO
V současnosti jsou schváleny dva produkty blokující TNFa pro léčení revmatoídní artritidy. První, nazvaný etanercept, je dodáván na trh firmou Immunex Corporation jako Enbrel™. Je to rekombinantní fuzní protein obsahující dva p75 rozpustné domény TNF-receptoru spojené k Fc části humánního imunoglobulinu. Druhý, nazvaný infliximab, je dodáván na trh firmou Centocor
Corporation Remicade™. Je to chimérická protilátka mající myší anti-TNFa variabilní domény a humánní IgGl konstantní domény,
Rekombinantní anti-TNFa protilátkové molekuly podle dosavadního stavu techniky obecně mají redukovanou afinitu pro TNFa ve srovnání s protilátkami, ze kterých variabilní úseky nebo CDR io pocházejí, obecně musí být tvořeny v savčích buňkách ajsou pro výrobu nákladné. anti-TNFa protilátky podle dosavadního stavu techniky jsou popsány v práci autorů Stefen a kol., (fnmtmo/ogy, 85, 668-674,1995), dokumentech GB-A-2 246 570 a GB-A-2 297 145.
Existuje trvalá potřeba protilátkových molekul k léčení chronických zánětlivých onemocnění, 15 které mohou být používány opakovaně a vyrábí se snadno a účinně. Existuje také potřeba protilátkových molekul, které mají vysokou afinitu pro TNFa a pro člověka jsou málo imunogenní.
Podstata vynálezu
Předmětný vynález se týká molekuly protilátky specifické pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec a těžký řetězec, kde tento lehký řetězec obsahuje variabilní úsek lehkého řetězce hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č. 8) a těžký řetězec obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11).
Dalším aspektem předmětného vynálezu je molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV, ID. Č. 115.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž cb
11U1VZ4 JIVUV čenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, mající na jednom ze svých cysteinových zbytků na C-konci těžkého řetězce navázanou skupinu odvozenou z lysyl-maleinimidové skupiny, kde každá ze dvou aminových skupin lysylových zbytků má kovalentně navázaný methoxypoly(ethylenglykol)ový zbytek o molekulové hmotnosti asi 20 000 DA, každý v aminoskupině lysylu, přičemž celková molekulová hmotnost methoxypoly(ethylenglykol)ových zbytků je asi 40 000 DA.
Výhodná je podle předmětného vynálezu výše specifikovaná sloučenina, kde skupinou odvoze40 nou od lysyl-maleinimidové skupiny je [l-[[[2-[[3-{2,5-dioxo-l-pyrrolidynyl}-l-oxopropyl]amino]-ethyl]amino] karbonyl]-l,5-pentandiyl] bis(iminokarbonyl).
Výhodná je podle předmětného vynálezu rovněž sloučenina obsahující molekulu protilátky mající vzorec:
-3QZ 300737 B6 kde nje asi 420,
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží sekvence DNA kódující těžký a/nebo lehký řetězec molekuly protilátky specifikované výše.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží klonovací nebo expresní vektor obsahující sekvenci DNA specifikovanou výše.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží hostitelská buňka transformovaná vektorem io specifikovaným výše.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy molekuly protilátky specifikované výše, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje hostitelská buňka specifikovaná výše a izoluje se molekula protilátky,
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží terapeutická nebo diagnostická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje molekulu protilátky specifikované výše nebo sloučeninu obsahující molekulu protilátky specifikovanou výše se spojení s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží molekula protilátky specifikovaná výše nebo sloučenina obsahující molekulu protilátky specifikovaná výše pro použití v terapii.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití molekuly protilátky specifikované výše nebo sloučeniny obsahující molekulu protilátky specifikované výše pro výrobu léčiva pro léčení revmatoidní artritidy, osteoartritidy, Crohnovy nemoci nebo psoriázy.
Vynález popisuje protílátkovou molekulu, kteráje specifická pro TNFa, obsahující těžký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak definováno Kabatem a kol., (viz výše)) mající sekvenci označenou jako HI na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 1) pro CDRH1, H2' na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 2) nebo H2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 7) pro CDRH2 nebo H3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 3) pro CDRH3.
Tato protilátková molekula podle prvního aspektu obsahuje alespoň jeden CDR vybraný z Hl,
H2' nebo H2 a H3 (SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 7 a SEKV. ID. Č. 3) pro variabilní doménu těžkého řetězce. Výhodně, protilátková molekula obsahuje alespoň dva a výhodněji všechny tři CDR ve variabilní doméně těžkého řetězce.
Vynález dále popisuje protilátkové molekuly specifické pro humánní TNFa podle druhého aspek40 tu, obsahující lehký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak definováno Kabatem a kok, (výše)) mající sekvenci označenou jako Ll na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 4) pro CDRL1, L2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. S) pro CDRL2 nebo L3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 6) pro CDRL3.
Tato protilátková molekula obsahuje alespoň jeden CDR vybraný z Ll, L2 a L3 (SEKV. ID. C. 4 až SEKV. ID. Č. 6) pro variabilní doménu lehkého řetězce. Výhodně, protilátková molekula obsahuje alespoň dva a výhodněji všechny tri CDR ve variabilní doméně lehkého řetězce.
Protilátkové molekuly podle prvního a druhého aspektu podle předkládaného vynálezu výhodně mají komplementární lehký řetězec nebo komplementární těžký řetězec, v daném pořadí.
Protilátková molekula podle prvního nebo druhého aspektu předkládaného vynálezu obsahuje výhodně těžký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR (jak je definováno Kabatem a kol., (viz výše)) mající sekvenci označenou jako Hl na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 1) pro CDRH1, H2' nebo H2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 7) pro CDRH2 nebo H3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 3) pro CDRH3 a lehký řetězec, kde variabilní doména obsahuje CDR
-4UW/Ut DU (jak definováno Kabatem a kol., (viz výše)) mající sekvenci označenou jako LI na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 4) pro CDRLI, L2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 5) pro CDRL2 nebo L3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 6) pro CDRL3,
CDR označené v SEKV. ID. Č. 1 a 3 až 7 a na obrázku 3, uvedené výše, pocházejí z myší monoklonální protilátky hTNF40. Ale SEKV. ID. Č. 2 se skládá z hybridního CDR. Hybridní CDR obsahuje část těžkého řetězce CDR2 z myší monoklonální protilátky hTNF40 (SEKV. ID. Č. 7) a Část těžkého řetězce CDR2 z humánní skupiny 3 zárodečné linie sekvence úseku V.
io Kompletní sekvence variabilních domén myší hTNF40 protilátky jsou ukázány na obrázku 6 (lehký řetězec) (SEKV. ID. Č. 99) a obrázku 7 (těžký řetězec) (SEKV. ID. Č. 100). Myší protilátka je nazývána níže „dárcovská protilátka“.
První výhodné provedení prvního nebo druhého aspektu zahrnuje myší monoklonální protilátku is hTNF40 mající sekvence variabilní domény lehkého a těžkého řetězce ukázané na obrázku 6 (SEKV. ID. Č. 99) a obrázku 7 (SEKV. ID. Č. 100), v daném poradí. Konstantní úsek lehkého řetězce hTNF40 je kappa a konstantní úsek těžkého řetězce je IgG2a.
V druhém výhodném provedení je protilátka podle prvního a druhého aspektu chimérická myší/humánní protilátkové molekula, nazývaná v tomto textu chimérická hTNF40 proti látková molekula. Chimérická protilátková molekula obsahuje variabilní domény myší monoklonální protilátky hTNF40 (SEKV. ID. Č. 99 a 100) a humánní konstantní domény. Výhodně, chimérická hTNF40 protilátková molekula obsahuje humánní C kappa doménu (Hieter a kol.. Cell, 22, 197-207, 1980, Genebank přístupové číslo J00241) v lehkém řetězci a humánní gama 4 domény (Flanagan a kol., Nátuře, 300, 709-713, 1982) v těžkém řetězci.
Ve třetím výhodném provedení je protilátka podle prvního a druhého aspektu CDR-roubovaná protilátková molekula. Termín „CDR-roubovaná protilátková molekula“, použitý v tomto textu, se týká protilátkové molekuly, kde těžký a/nebo lehký řetězec obsahují jeden nebo více CDR (včetně, je-li to žádoucí, hybridního CDR) z donorové (dárcovské) protilátky (například myší monoklonální protilátky) naroubované na variabilní úsek rámce těžkého a/nebo lehkého řetězce akceptorové (příjemcovské) protilátky (například humánní protilátky).
Výhodně má tato CDR-roubovaná protilátka variabilní doménu obsahující úseky rámce humán35 ního příjemce, a také jeden nebo více dárcovských CDR uvedených výše.
V případě, že jsou CDR roubovány, může být použita každá vhodná sekvence příjemce variabilního úseku rámce s ohledem na trídu/typ dárcovské protilátky, ze které CDR pocházejí, včetně úseků rámce myši, primáta a člověka. Příklady humánních rámců (rámcových úseků protilátky), které mohou být použity v předkládaném vynálezu, jsou KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY a POM (Kabat a kol. (viz výše)). Například, KOL a NEWM mohou být použity pro těžký řetězec, REI může být použit pro lehký řetězec a EU, LAY a POM mohou být použity pro oba těžký i lehký řetězec. Výhodné úseky rámce pro lehký řetězec jsou humánní skupina 1 úseků rámce ukázaná na obrázku 1 (SEKV. ID. Č. 83, 85, 87 a 89). Výhodné úseky rámce pro těžký řetězec jsou humánní skupina 1 a skupina 3 úseků rámce ukázané na obrázku 2 (SEKV. ID. C. 91, 93, 95 a 97 a SEKV. ID. Č. 106, 107,108 a 109), v daném pořadí.
U CDR-roubovaných protilátek je výhodné použít jako príjemcovskou protilátku takovou, která má řetězce, které jsou homologní k řetězcům dárcovské protilátky. Příjemcovské těžké a lehké řetězce nemusí nezbytně pocházet ze stejné protilátky a mohou, je-li žádoucí, obsahovat složené řetězce mající úseky rámce pocházející z odlišných řetězců.
V CDR-roubovaných protilátkách podle předkládaného vynálezu nemusí mít také úseky rámce přesně tutéž sekvenci, jako je sekvence příjemcovské protilátky. Například, neobvyklé zbytky mohou být změněny na častěji se vyskytující zbytky pro danou třídu nebo typ příjemcovského
-5CZ 300737 B6 řetězce. Alternativně, vybrané zbytky v příjemcovských úsecích rámce mohou být změněny tak, že odpovídají zbytku nalezenému ve stejné poloze v dárcovské protilátce. Takové změny by měly být udržovány na minimu nezbytném k obnovení afinity dárcovské protilátky. Protokol pro selekci zbytků v příjemcovských úsecích rámce, které mohou potřebovat změnu, je uveden ve
WO 91/09967.
Ve výhodném provedení, v CDR-roubované protilátkové molekule podle předkládaného vynálezu, jestliže příjemcovský těžký řetězec má úseky rámce z humánní skupiny 1 (ukázáno na obrázku 2) (SEKV. ID. Č. 91, 93, 95 a 97), pak příjemcovské úseky rámce těžkého řetězce io obsahují, navíc k jednomu nebo více dárcovským CDR, dárcovské zbytky v polohách 28, 69 a 71 (podle Kabat a kol. (víz výše)).
Alternativně, jestliže příjemcovský těžký řetězec má úseky rámce ze skupin 1, pak příjemcovské úseky rámce těžkého řetězce obsahují, navíc k jednomu nebo více dárcovským CDR, dárcovské zbytky v polohách 28, 38, 46, 67, 69 a 71 (podle Kabat a kol. (viz výše).
Ve výhodném provedení, v CDR-roubované protilátkové molekule podle předkládaného vynálezu, jestliže příjemcovský těžký řetězec má úseky rámce humánní skupiny 3 (ukázána na obrázku 2) (SEKV. ID. Č. 106, 107, 108 a 109), pak příjemcovské úseky rámce těžkého řetězce obsahují, navíc k jednomu nebo více dárcovským CDR, dárcovské zbytky v polohách 27, 28, 30, 48, 49,
69, 71, 73, 76 a 78 (podle Kabat a kol. (viz výše)).
Ve výhodném provedení, v CDR-roubované protilátkové molekule podle předkládaného vynálezu, jestliže příjemcovský lehký řetězec má úseky rámce humánní skupiny 1 (ukázána na obrázku 1) (SEKV. ID. Č. 83, 85, 87 a 89), pak příjemcovské úseky rámce lehkého řetězce obsahují dárcovské zbytky v polohách 46 a 60 (podle Kabat a kol. (viz výše)).
Dárcovské zbytky jsou zbytky z dárcovské protilátky, tj. protilátky, ze které původně pocházejí
CDR.
Protilátková molekula může obsahovat: kompletní protilátkovou molekulu, mající kompletní těžké a lehké řetězce, její fragment, jako například Bab, modifikovaný Fab, Fab', F(ab')2 nebo Fv fragment, monomer nebo dimer lehkého řetězce nebo těžkého řetězce, protilátka s jedním řetězcem, např. jednoretězcová Fv, ve kteréjsou variabilní domény těžkého a lehkého řetězce spojeny peptidovou spojkou. Podobně, variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce mohou být spojeny s další protilátkovou doménou, jak je to vhodné.
Ve výhodném provedeni je protilátková molekula podle předkládaného vynálezu Fab fragment. Výhodně Fab fragment má těžký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 111 a lehký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID, Č. 113. Aminokyselinové sekvence uvedené v SEKV. ID. Č. 111 a SEKV. ID. Č. 113 jsou výhodně kódovány nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEKV. ID. Č. 110 a SEKV. ID. Č. 112, v daném pořadí.
Alternativně je výhodné, jestliže protilátkovou molekulou podle předkládaného vynálezu je modifikovaný Fab fragment, kde modifikace je připojena na C-koncovou část jeho těžkého řetězce jedné nebo více aminokyselin, aby se umožnilo připojení efektorové nebo reportérové molekuly. Výhodně, další aminokyseliny tvoří modifikovaný kloubový úsek obsahující jeden nebo dva cysteinové zbytky, ke kterým může být připojena efektorová nebo reportérova molekula. Takto modifikovaný Fab fragment má výhodně těžký řetězec mající sekvenci označe50 nou jako SEKV. ID. Č. 115 a lehký řetězec mající sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 113.
sekvencí uvedenou v SEKV. ID. Č. 114.
Výhodná efektorová skupina je molekula polymeru, která může být připojena k modifikovanému 55 Fab fragmentu, aby se zvýšil jeho biologický poločas in vivo.
CZ 5WW BO
Polymerové molekuly mohou být obecně syntetické nebo v přírodě se vyskytující polymery, například případně substituovaný polyalkylenový polymer, polyalkenylenový polymer nebo póly oxyalky lenový polymer s přímým nebo rozvětveným řetězcem, nebo póly sacharid s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem, například homo- nebo hetero- polysacharid.
Mezi konkrétní případné substituenty, které mohou být přítomny na výše uvedených syntetických polymerech, patří jedna nebo více hydroxyskupin, methylových skupin nebo methoxyskupin. Konkrétní příklady syntetických polymerů zahrnují případně substituovaný poly(ethylenglykol), io poiy(propylenglykol), poly(vinylaikohol) nebo jejich deriváty s přímými nebo rozvětvenými řetězci, zejména případně substituovaný poly(ethy lengly kol), jako je například methoxypoly(ethylenglykol) nebo jejich deriváty. Konkrétní v přírodě se vyskytující polymery zahrnují laktózu, amylózu, dextran, glykogen nebo jejich deriváty. Termín „deriváty“, použitý v tomto textu, zahrnuje reaktivní deriváty, například thiol-selektivní reaktivní skupiny, jako jsou napří15 klad maleimidy, apod. Reaktivní skupina může být připojena k polymeru přímo nebo přes spojovací segment. Je nutné uvést, že zbytek takové skupiny v některých případech tvoří část produktu jako spojovací skupina mezi proti látkovým fragmentem a polymerem.
Velikost polymeru může být variabilní podle dané potřeby, ale obecně odpovídá průměrnému rozmezí molekulových hmotností od 500 (Da) do 50000 (Da), výhodně 5000 až 40000 (Da) a výhodněji 25000 až 40000 (Da). Velikost polymeru může být konkrétně vybrána na základě zamýšleného použití produktu. Tedy například, v případě, kdy je cílem to, aby produkt opustil cirkulaci a pronikl do tkání, například pro použití při léčení nádorů, může být výhodné použít polymer s nízkou molekulovou hmotností, například s molekulovou hmotností přibližně
5000 (Da). Pro aplikace, při kterých produkt v cirkulaci zůstává, může být výhodné použít polymer s vyšší molekulovou hmotností, mající například molekulovou hmotnost v rozmezí 25000 (Da) až 40000 (Da).
Mezi obzvláště výhodné polymery patří polyalky lenové polymery, jako je například polyethylenglykol nebo, zejména, methvxypvly(euiylenglykvl) nebo jejich deriváty a zejména polymery s molekulovou hmotností v rozmezí přibližně 25000 (Da) až přibližně 40000 (Da).
Každá molekula polymeru připojená k modifikovanému protilátkovému fragmentu může být kovalentně připojena k atomu síry cysteinového zbytku lokalizovaného ve fragmentu. Kovalentní vazba je obecně disulfidová vazba nebo, zejména, vazba mezi atomy síry a uhlíku.
V případě potřeby může mít protilátkový fragment připojenou jednu nebo více efektorových nebo reportérových molekul. Efektorové nebo reportérové molekuly mohou být připojeny k protilátkovému fragmentu přes kterýkoliv dostupný aminokyselinový postranní řetězec nebo termi40 nální aminokyselinovou funkční skupinu ve fragmentu lokalizovanou, například jakoukoliv volnou aminoskupinu, iminoskupinu, hydroxylovou skupinu nebo karboxylovou skupinu.
Pro přípravu proti látkových fragmentů modifikovaných polymerem popsaných výše může být použit jako výchozí látka každý aktivovaný polymer. Aktivovaný polymer může být každý polymer obsahující thiolovou reaktivní skupinu, jako je například α-halogenkarboxylová kyselina nebo ester, například jodacetamid, imid, například maleimid, vinylsulfon nebo disulfíd. Tato výchozí látka může být získána z komerčních zdrojů (například od firmy Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) nebo může být připravena z komerčně dostupných výchozích látek s použitím obvyklých chemických postupů,
Co se týče připojení poly(ethylenglykol)ových (PEG) skupin, je možno odkázat se na dokumenty „Poly(ethylenglykol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications'1, 1992, J. Milion Harris (ed), Plenům Press, New York, „Poly(ethylenglykol) Chemistry and Biological Applications 1997, J. Milton Harris a S. Zalipsky (eds), American Chemical Society,
-Ί CZ 300737 B6
Washington DC a „ Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Science , 1998, M. AslamaA. Dění, Grove Publishers, New York.
V případě, že je třeba získat protilátkový fragment připojený k efektorové nebo reportérové molekule, je možno přípravu provést standardními chemickými postupy nebo technikami rekombinantní DNA, kdy je protilátkový fragment spojen buď přímo nebo prostřednictvím kondenzačního činidla k efektorové nebo reportérové molekule buď před nebo po reakci s vhodným aktivovaným polymerem. Mezi konkrétní chemické postupy patří například postupy popsané v publikovaných mezinárodních patentových přihláškách WO 93/62331, WO 92/22583, WO io 90/195 a WO 89/1476. Alternativně, v případě, že je efektorovou nebo reportérovou molekulou protein nebo polypeptid, může být spojení dosaženo s použitím postupů rekombinantní DNA, popsaných například v dokumentech WO 86/01533 a EP-A-0392745.
Ve výhodném provedeni je modifikovaný Fab fragment podle předkládaného vynálezu
PEGylován (tj. má k sobě kovalentně připojen PEG (polyethylenglykol)) podle metody popsané v EP-A-0948544. Výhodně je protilátkovou molekulou podle předkládaného vynálezu PEGylovaný modifikovaný Fab fragment ukázaný na obrázku 13. Jak je ukázáno na obrázku 13, modifikovaný Fab fragment má maleimidovou skupinu kovalentně připojenou k jedné thiolové skupině v modifikovaném kloubovém úseku. K maleimidové skupině je kovalentně připojen zbytek lysinu. Ke každé aminoskupině na lysinovém zbytku je připojen polymer methoxypoly(ethylenglykol)u mající molekulovou hmotnost přibližně 20000 (Da). Celková molekulová hmotnost celé efektorové molekuly je tudíž přibližně 40000 (Da).
Ve výhodném provedení má ve sloučenině ukázané na obrázku 13 těžký řetězec protilátkové části sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 115 a lehký řetězec má sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 113. Tato sloučenina je v tomto textu nazývána CDP870.
Domény konstantních úseků protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu, jestliže se vyskytují, mohou být vybírány s ohledem na navrhovanou funkci protilátkové molekuly a zejména efektorové funkce, které mohou být nezbytné. Například, domény konstantních úseků mohou být humánní domény IgA, IgD, IgE, IgG nebo IgM. Mohou být použity obzvláště domény konstantních úseků humánního IgG, zejména izotypy IgG 1 a IgG3, a to v případech, kdy je protilátková molekula zamýšlena pro terapeutické použití a kdy jsou nezbytné protilátkové efektorové funkce. Alternativně, mohou být použity izotypy IgG2 a IgG4, a to v případě, kdy je protilátková molekula zamýšlena pro terapeutické použití a protilátkové efektorové funkce nejsou nezbytné, například pro jednoduchou blokádu aktivity TNFa.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může mít také připojenou efektorovou nebo reportérovou molekulu. Například může mít připojen makrocyklus, pro chelataci těžkého kovového atomu, nebo toxin, jako například ricin, kovalentní můstkovou strukturou. Nebo může být použita technologie rekombinantní DNA pro produkci protilátkové molekuly, kdy Fc fragment (CH2, CH3 a kloubové domény), CH2 a CH3 domény nebo CH3 doména kompletní molekuly imunoglobulinů jsou (byly) nahrazeny nebo byly připojeny peptidovou vazbou, k funkčnímu neimunoglobulinovému proteinu, jako například k molekule enzymu nebo toxinu.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu má výhodně vazebnou afinitu alespoň 0,85 x 10_I° M, výhodněji alespoň 0,75 x ΙΟ’10 M a nej výhodnčj i alespoň 0,5 x 10_1° M. Je nutné poznamenat, že výhodná humanizovaná protilátková molekula podle předkládaného vynálezu, jak je popsáno níže, má afinitu přibližně 0,5 x 10“’° M, což je lepší než afinita myší monoklonální protilátky, ze které pochází. Myší protilátka má afinitu přibližně 0,85 x 10”10 M.)
Ve výhodném provedení obsahuje protilátková molekula podle předkládaného vynálezu variabilní doménu lehkého řetězce hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č. 8) a variabilní doménu těžkého řetězce gh3hTNF40.4 (SEKV, ID, Č, 11). Sekvence variabilní domény těchto lehkých a těžkých řetězců jsou ukázány na obrázku 8 a 11, v daném pořadí.
-8CZ. JllU/J/ B&
Předkládaný vynález rovněž zahrnuje varianty protilátkových molekul podle předkládaného vynálezu, které máji zlepšenou afinitu pro TNFa. Tyto varianty mohou být získány pomocí velkého počtu postupů afinitního zrání (afinitní maturace) včetně mutací CDR (Yang a kol.,
J.Mol. Biol., 254, 392^103, 1995), „shufíiing“ řetězce (Marks a kol., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), použití mutátorového kmen £. coli (Low a kol., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA „shuffiing“ (Patten a kol., Curr. Opin. Biotechnoí., 8, 724-733, 1997), vystavování na fágu, fágový displej (Thompson a kol., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) a „sexual“ PCR (Crameri a kol.. Nátuře, 391, 288-291, 1998). Vaughan a kol. (viz výše) pojednávají o těchto io metodách afinitní maturace.
Předkládaný vynález také poskytuje DNA sekvence kódující těžké a/nebo lehké řetězce(řetězec) protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu.
Výhodně DNA sekvence kóduje těžký nebo lehký řetězec protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu.
Podle jednoho z výhodných provedení DNA sekvence kóduje lehký řetězec a obsahuje sekvence ukázané v SEKV. ID. Č. 8 (hTNF40-gLl) nebo SEKV. ID. Č. 9 (h-TNF40-gL2) nebo jejich degenerované ekvivalenty.
V alternativním výhodném provedení DNA sekvence kóduje těžký řetězec a obsahuje sekvence ukázané v SEKV, ID, Č, 10 (ghlhTNF40,4) nebo SEKV. ID. Č. 11 (gh3hTNF40.4) nebo jejich degenerované ekvivalenty.
DNA sekvence podle předkládaného vynálezu může obsahovat syntetickou DNA, například vytvořenou chemickými postupy, cDNA, genomovou DNA nebo jakoukoliv jejich kombinaci.
Předkládaný vynález se také týká klonovacího nebo expresního vektoru obsahujícího jednu nebo vína Π\ί A cabiranní l/lnnAirn/M val/l/v»· * iww wi ix l jvn* vuvi ^vuiv |/i vuaiUMUUVii v »jnuivz.u, vjnvunv^ iyiwiiw v uvi nvuv ννΛίνι obsahuje dvě DNA sekvence, kódující lehký řetězec a těžký řetězec protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu, v daném pořadí.
Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález E. coli expresní vektor obsahující DNA 35 sekvenci podle předkládaného vynálezu. Výhodně expresní vektor je pTTO(CDP870), jak je schematicky ukázán na obrázku 22.
Předkládaný vynález také obsahuje vektor pDNAbEng-Gl, jak je ukázán na obrázku 19.
Obecné metody, kterými mohou být vektory konstruovány, transfekění metody a kultivační metody jsou odborníkům dobře známy. V tomto ohleduje možno odkázat na publikaci „Current Protocois in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York a Maniatis Manual vydaný nakladatelstvím Cold Spring Harbor Publishing.
DNA sekvence, které kódují protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu mohou být získány metodami, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známé. Například, DNA sekvence kódující část nebo celý protilátkový těžký a lehký řetězec mohou být syntetizovány dle přání ze zjištěných DNA sekvencí nebo na základě odpovídajících aminokyselinových sekvencí.
DNA kódující sekvence prijemcovského (akceptorového) rámce je odborníkům široce dostupná a může být snadno syntetizována na základě svých známých aminokyselinových sekvencí.
Pro přípravu DNA sekvencí kódujících protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu 55 mohou být použity standardní techniky molekulární biologie. Požadované DNA sekvence mohou
-9CZ 300737 B6 být syntetizovány kompletně nebo částečně s použitím technik syntézy pomocí oligonukleotidů. Vhodně mohou být použity techniky místně cílené mutageneze a polymerázové řetězové reakce (PCR).
Pro expresi DNA sekvence kódující proti látkovou molekulu podle předkládaného vynálezu může být použit každý vhodný systém hostitelská buňka/vektor. Může být použit bakteriální systém, například E. coli, a další mikrobiální systémy, částečně, pro expresi proti látkových fragmentů, jako jsou například Fab a F(ab')2 fragmenty a zejména Fv fragmenty a fragmenty protilátky s jedním řetězcem, například, jednořetězcové Fvs. Eukaryotické, například savčí, hostitelské buněčné expresní systémy mohou být použity pro produkci větších proti látkových molekul, io včetně kompletních protilátkových molekul. Vhodné savčí hostitelské buňky zahrnují CHO buňky, myelomové nebo hybridomové buňky.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby protilátkových molekul podle předkládaného vynálezu obsahující kultivaci hostitelských buněk obsahujících vektor podle předkládaného vynálezu za podmínek vhodných a vedoucích k expresi proteinu z DNA kódující protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu a izolaci protilátkové molekuly.
Výhodně způsob výroby protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu zahrnuje pěstování E. coli obsahující E. coli expresní vektor obsahující DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu za podmínek vhodných a vedoucích k expresi proteinu a izolaci protilátkové molekuly. Protilátková molekula může být sekretována z buněk nebo cílena do periplazmy vhodnými signálními sekvencemi. Nebo se protilátková molekula může akumulovat v cytoplazmě buňky. Výhodně je protilátková molekula cílena do periplazmy. V závislosti na vytvářené protilátkové molekule a použitém postupu, je žádoucí, aby se protilátková molekula správně prostorově složila („refold“) a přijala funkční konformaci. Postupy umožňující protilátkové molekule, aby se složila, jsou odborníkům dobře známé.
Protilátková molekula může obsahovat pouze polypeptid těžkého nebo lehkého řetězce, v tomto případě je zapotřebí použít pouze kódující sekvenci těžkého řetězce nebo lehkého řetězce polypeptidu pro transfekci hostitelských buněk. Pro výrobu produktů obsahujících oba těžké a lehké řetězce, může být buněčná linie transfekována dvěma vektoiy, první vektor kódující polypeptid lehkého řetězce a druhý vektor kódující polypeptid těžkého řetězce. Nebo může být použit jeden vektor, který zahrnuje sekvence kódující polypeptidy lehkého řetězce a těžkého řetězce,
Předkládaný vynález také poskytuje terapeutický nebo diagnostický přípravek obsahující protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem.
Pokud se týče způsobu výroby tohoto terapeutického nebo diagnostického přípravku, tento postup zahrnuje smísení protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem.
Protilátková molekula může být jediná aktivní složka v terapeutickém nebo diagnostickém přípravku nebo může být doprovázena další aktivní složkou včetně dalších protilátkových složek, například protilátek anti-T lymfocyt, anti-IFNy nebo anti-LP nebo neproti látkových složek, jako jsou například xantiny.
Farmaceutické přípravky výhodně obsahují terapeuticky účinné množství protilátky podle vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množství“, použitý v tomto textu, se vztahuje k množství terapeutického činidla potřebného k léčbě, zmírnění nebo prevenci cílové nemoci nebo stavu nebo k projevení detekovatelného terapeutického nebo preventivního účinku. Pro každou protilátku může být terapeuticky účinná dávka stanovena nejprve buď v testech na tkáňových kulturách nebo ve zvířecích modelech, obvykle na hlodavcích, králících, psech, prasatech nebo primátech. Zvířecí model může být také použit pro stanovení příslušného rozmezí koncentrace a
-10\j£j DU způsobu podávání. Tyto informace pak mohou být použity pro stanovení použitelné dávky a způsobu podávání u lidí.
Přesné účinné množství pro lidského pacienta závisí na závažnosti chorobného stavu, všeobec5 ném zdraví pacienta, věku, hmotnosti a pohlaví pacienta, stravě, době a častosti podávání, kombinaci léků reakční citlivosti a toleranci/reakci na léčbu. Toto množství může být stanoveno rutinním experimentováním a závisí na úsudku lékaře. Obecně se účinná dávka pohybuje v rozmezí od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, výhodně 0,1 mg/kg až 20 mg/kg, výhodněji přibližně 15 mg/kg. Jak je ukázáno v příkladu níže, dávky 1,5 a 20 mg/kg byly použity pro léčení pacientů ío trpících revmatoidní artritidou.
Přípravky mohou být podávány pacientovi samostatně nebo mohou být podávány v kombinaci s dalšími činidly, léčivy nebo hormony.
ís Dávka, ve které jsou protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu podávány, závisí na povaze léčeného chorobného stavu, na stupni, do kterého vystoupila nebo se očekává, že vystoupila, hladina TNFa, která má být neutralizována, nad požadovanou úroveň, a na tom, zda protilátková molekula bude použita profylakticky nebo k léčení již existujícího chorobného stavu.
Tak například, jestliže je produkt určen pro léčení nebo profylaxi chronického zánětlivého onemocnění, jako je například revmatoidní artritida, pohybuje se vhodná dávka protilátkové molekula podle předkládaného vynálezu v rozmezí mezi 0,5 a 50 mg/kg, výhodněji mezi 1 a 20 mg/kg a nej výhodněji je přibližně 15 mg/kg. Častost podávání dávky závisí na biologickém poločase protilátkové molekuly a trvání účinku.
Jestliže má protilátková molekula krátký biologický poločas (například 2 až 10 hodin) může být nezbytné podávat jednu nebo více dávek denně. Nebo, jestliže má protilátková molekula dlouhý biologický poločas (například 2 až 15 dnů) může být nutné podávat dávku pouze jednou denně, týdně nebo dokonce jednou za 1 nebo 2 měsíce.
Farmaceutický přípravek může také obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič pro podávání protilátky. Nosič sám by neměl indukovat produkci protilátek škodlivých pro jedince, který dostává přípravek, a neměl by být toxický. Vhodné nosiče jsou velké, pomalu metabolizované makromolekuly, jako jsou například proteiny, polypeptidy, liposomy, polysacharidy, polymléěné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerní aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery a inaktivní virové částice.
Rovněž je možno použít farmaceuticky přijatelné soli, například soli minerálních kyselin, jako jsou například hydrochloridy, hydrobromidy, fosfáty a sulfáty nebo soli organických kyselin, jako jsou například acetáty, propionáty, malonáty a benzoáty.
Farmaceuticky přijatelné nosiče v terapeutických přípravcích mohou dále obsahovat tekutiny, jako je například voda, fyziologický roztok, glycerol a ethanol. V těchto přípravcích mohou být dále přítomny pomocné látky, jako jsou například smáčedla nebo emulgátory nebo pH pufry.
Tyto nosiče umožňují, že farmaceutické přípravky jsou formulovány jako tablety, pilulky, dražé, tobolky, tekutiny, gely, sirupy, směsi a suspenze, pro požití pacientem.
Výhodné formy pro podávání zahrnují formy vhodné pro parenterální podávání, například injekcí nebo infúzí, například bolusovou injekcí nebo kontinuální infúzí. Když je produkt určen pro injekci nebo infuzi, může mít formu suspenze, roztoku nebo emulze v olejovitém nebo vodném vehikulu a může obsahovat formulační činidla, jako jsou například suspendační činidla, konzervační činidla, stabilizační a/nebo dispergační činidla. Nebo může být protilátková molekula v suché formě pro rekonstituci před použitím s vhodnou sterilní tekutinou.
-11CZ 300737 B6
Jakmile jsou jednou formulovány, mohou být podávány přípravky podle vynálezu přímo pacientovi. Léčení pacienti mohou být zvířata. Ale je výhodné, když jsou přípravky upraveny pro podávání lidským pacientům.
Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být podávány celou řadou způsobů včetně, aniž by tím byl rozsah nějak omezován, perorálního, intravenózního, intramuskulámího, intraarteriálního, intramedulámího, intrathekálního, intraventrikulámího, transdermálního, transkutánního (víz například, WO 98/20734), subkutánního, intraperitoneálního, intranazálního, enterálního, topického, sublingválního, intravaginálního nebo rektálního způsobu. Spreje mohou io také být použity pro podávání farmaceutických přípravků podle vynálezu. Terapeutické přípravky mohou být typicky připraveny jako přípravky pro injekce, a to buď jako tekuté roztoky nebo suspenze. Mohou být také připraveny pevné látkové formy vhodné pro přípravu roztoku nebo suspenze v tekutém vehikulu před injekci.
Přímá aplikace přípravku je obecně uskutečňována injekcí, subkutánní, intraperitoneální, intravenózní nebo intramuskulární nebo aplikací do interstícia tkání. Přípravek může také být podáván na léze. Dávkování léčby může být jednou dávkou nebo podle rozpisu několika dávek.
V této souvislosti je třeba uvést, že aktivní složka v přípravku je proti látková molekula. Jako taková podléhá degradaci v gastrointestinálním traktu. Tedy, jestliže přípravek má být podáván způsobem používajícím gastroíntestinální trakt, je zapotřebí, aby přípravek obsahoval činidla, která chrání protilátku před degradací, ale která protilátku po absorbování uvolní z gastrointestinálního traktu.
Podrobná diskuse o farmaceuticky přijatelných nosičích je k dispozici v publikaci Remmgtotťs Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J, 1991).
Předpokládá se také, že protilátka podle předkládaného vynálezu bude podávána s použitím genové terapie. Aby se toho dosáhlo, jsou DNA sekvence kódující těžké a lehké řetězce protilát30 kove molekuly pod kontrolou příslušných DNA složek zavedeny pacientovi, takže protilátkové řetězce jsou exprimovány z DNA sekvence a sestaveny in šitu.
Předkládaný vynález také poskytuje protilátkovou molekulu podle předkládaného vynálezu pro použití v terapii, to znamená k léčení nemocí zprostředkovaných TNFa.
Předkládaný vynález dále poskytuje použití protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení nemocí zprostředkovaných TNFa.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může být použita pro jakoukoliv léčbu, kde je žádoucí, aby se snížil stupeň biologicky aktivního TNFa vyskytujícího se v lidském nebo zvířecím organismu. TNFa může cirkulovat v organismu nebo se může vyskytovat v nežádoucím vysokém stupni lokalizovaný v konkrétním místě v organismu.
Například je zvýšená hladina TNFa zapojena do akutních a chronických imunitních a imuno45 regulačních poruch, infekcí včetně septického, endotoxického a kardiovaskulárního šoku, zánětlivých onemocnění, neurodegenerativních onemocnění, maligních nemocí a hepatitidy indukované alkoholem. Detaily o početných chorobách spojených se zvýšenou hladinou TNFa jsou uvedeny v patentu Spojených států amerických č. US-A-5 919 452. Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může/mohou být použita pro léčbu nemocí zprostředkovaných TNFa.
Konkrétní relevantní nemoci, které mohou být léčeny protilátkovou molekulou podle předkládaného vynálezu, jsou sepse, městnavé srdeční selhání, septický nebo endotoxický šok, kachexie, syndrom respirační tísně dospělých, AIDS, alergie, psoriasis, TBC, zánětlivá kostní onemocnění, poruchy krevní koagulace, popáleniny, rejekce po transplantaci orgánů nebo tkání, Crohnova nemoc a autoimunitní onemocnění, jako je například tyreoiditida a revmatoidní artritida a osteo55 artritida.
_ 1*) _
CL OUU/J/ BO
Protilátková molekula nebo přípravek mohou být dále použity: ke snížení vedlejších účinků sdružených s tvořením TNFa v průběhu terapie neoplastických onemocnění, k odstranění nebo snížení symptomů šoku spojených s léčením nebo prevencí rejekce štěpu při použití anti-lymfo5 cytámích protilátek, nebo k léčení multiorgánového selhání.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu se výhodně použije pro léčení revmatoidní artritidy nebo osteoartritidy.
ío Pokud se týče způsobu léčení humánních nebo zvířecích pacientů, kteří trpí nebo jsou v riziku onemocnění zprostředkovaného TNFa, potom tento postup zahrnuje podávání pacientovi účinného množství protilátkové molekuly podle předkládaného vynálezu.
Protilátková molekula podle předkládaného vynálezu může také být použita pro diagnózu, napří15 klad pro in vivo diagnózu a znázornění chorobného stavu se zvýšenou hladinou TNFa.
Předkládaný vynález také poskytuje protílátkovou molekulu obsahující hybridní CDR obsahující zkrácené dárcovské CDR sekvence, kde chybějící část zkráceného dárcovského CDR je nahrazena odlišnou sekvencí a tvoří funkční CDR. Termín „hybridní CDR“, používaný v tomto textu, znamená CDR obsahující dárcovský CDR, který byl zkrácen v jedné nebo více polohách, například na jednom nebo obou koncích, chybějící část zkráceného dárcovského CDR je nahrazena odlišnou sekvencí a tvoří kompletní a funkční CDR. Hybridní CDR má alespoň jednu aminokyselinovou změnu ve srovnání s kompletním dárcovským CDR. Sekvence nahrazující zkrácenou část CDR může být jakákoliv sekvence. Výhodně nedárcovská část CDR sekvence je z protilátky, ze které pocházejí úseky rámce protilátkové molekuly, jako je například protilátková sekvence zárodeční linie.
Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že protilátkové molekuly obsahující hybridní CDR si podržely v podstatě stejnou vazebnou afinitu jako protilátková molekula obsahující kompletní dárcovské CDR. Termín „v podstatě stejná vazebná afinita“, používaný v tomto textu znamená alespoň 70 %, výhodněji alespoň 85 % a nejvýhodněji alespoň 95 % vazebné afinity odpovídající protilátkové molekuly obsahující kompletní dárcovské CDR. Jak uvedeno výše, v určitých případech může být afinita protilátky podle vynálezu větší než afinita dárcovské protilátky. Použití hybridní CDR poskytuje výhodu redukce množství cizorodé (tj. dárcovské) sekvence vyskytující se v protilátkové molekule a může zvýšit vazebnou afinitu protilátkové molekuly ve srovnání s odpovídající protílátkovou molekulou obsahující kompletní dárcovské CDR.
Každý CDR protilátkové molekuly může být hybridní. V protilátkové molekule je výhodně hybridní CDR2 těžkého řetězce.
Výhodné je zkrácení dárcovského CDR o 1 až 8 aminokyselin, výhodněji o 4 až 6 aminokyselin. Je dále výhodné, když je zkrácení provedeno v C-koncové části CDR.
V závislosti na sekvenci zkrácené části CDR a sekvenci odlišné sekvence nahrazující chybějící 45 část může být vytvořen velký počet aminokyselinových změn. Výhodně jsou vytvořeny alespoň aminokyselinové změny, výhodněji jsou vytvořeny alespoň 3 aminokyselinové změny a nejvýhodněji jsou vytvořeny alespoň 4 aminokyselinové změny.
Konkrétním provedením tohoto aspektu vynálezu je protilátka podle prvního aspektu vynálezu, 50 kde druhý CDR v těžkém řetězci má sekvenci označenou jako SEKV. ID. Č. 2. Ta má lepší afinitu pro svůj antigen, než dárcovská protilátka, ze které pochází část CDR.
Předkládaný vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protílátkovou molekulu obsahující hybridní CDR podle předkládaného vynálezu.
-13CZ 300737 B6
Předkládaný vynález také poskytuje expresní vektor obsahující sekvencí nukleové kyseliny kódující protilátkovou molekulu obsahující hybridní CDR podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález také poskytuje hostitelskou buňku transformovanou vektorem podle před5 kládaného vynálezu.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby protilátkové molekuly obsahující hybridní CDR zahrnující kultivaci hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu a izolaci protilátkové molekuly.
io
Popis přiložených obrázků
Předkládaný vynález je pro ilustraci dále popsán v následujících příkladech, které se vztahují k přiloženým obrázkům, přičemž na těchto obrázcích:
Obrázek 1 ukazuje úseky rámce podskupiny 1 humánních lehkých řetězců ve srovnání s úseky rámce hTNF40 lehkého řetězce (SEKY. ID. Č. 83 až 90).
Obrázek 2 ukazuje úseky rámce podskupiny 1 a podskupiny 3 humánních těžkých řetězců ve srovnání s úseky rámce hTNF40 těžkého řetězce (SEKV, ID, C. 91 až 98 a 106 až 109).
Obrázek 3 ukazuje aminokyselinovou sekvenci CDR z hTNF40 (SEKV. ID. Č. 1 až 7), kde CDR H2' je hybridní CDR, kde šest aminokyselin z C -koncové části je z H2 CDR sekvence humánní podskupiny 3 protilátky zárodečné linie a aminokyselinové změny sekvence plynoucí z této hybridizaee jsou podtrženy.
Obrázek 4 ukazuje vektor pMR15.l.
Obrázek 5 ukazuje vektor pMR14,
Obrázek 6 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci myší hTNF40Vl (SEKV. ID. Č. 99).
Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci myší hTNF40Vh (SEKV. ID. Č. 100).
Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci hTNF40-gLl (SEKV. ID. Č. 8).
Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci hTNF40-gL2 (SEKV. ID. Č. 9).
Obrázek 10 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci ghlhTNF40,4 (SEKV. ID.Č. 10).
Obrázek 11 ukazuje nukleotidovou a předpovězenou aminokyselinovou sekvenci gh3hTNF40.4 (SEKV. ID.Č. 11).
Obrázek 12 ukazuje vektor CTIL5-gL6.
Obrázek 13 ukazuje strukturu sloučeniny nazvané CDP870 obsahující modifikovaný Fab fragment pocházející z protilátky hTNF40 kovalentně spojený prostřednictvím cysteinového zbytku k lysyl-maleimidové spojce, kde každá aminoskupina na lysylovém zbytku má k sobě kovalentně připojen methoxy-PEG zbytek, přičemž n je přibližně 420.
Obrázek 14 ukazuje vektor pTTQ9.
Obrázek 15 ukazuje sekvence OmpA oligonukleotidového adaptéru (SEKV. ID. C. 101).
Obrázek 16 ukazuje vektor pACYC184.
- 14JVVIJI DO
Obrázek 17 ukazuje vektor pTTO-1.
Obrázek 18 ukazuje vektor pTTO-2.
Obrázek 19 ukazuje vektor pDNAbEng-Ό 1.
Obrázek 20 ukazuje oligonukleotidové kazety kódující odlišné intergenové sekvence pro expresi modifikovaného Fab v E. coli (SEKV. ID. Č 102 až 105).
Obrázek 21 ukazuje akumulaci modifikovaného Fab IGS variant v periplazmě.
Obrázek 22 ukazuje vektor PTTO (CDP870) io Obrázek 23 ukazuje skóre aktivity nemoci (DAS) u pacientů léčených odlišnými dávkami CDP870 a placebo. Medián a IQ rozmezí jsou uvedeny pro populaci pro každý postup s posledními pokračujícími pozorováními. Malé čtverečky označuji placebo, kosočtverce označují I mg/kg, trojúhelníky označuji 5 mg/kg a velké čtverce označují 20 mg/kg.
Obrázek 24 ukazuje četnost výskytu citlivých kloubů, četnost výskytu oteklých kloubů, skóre bolestí, celkový odhad aktivity nemocí stanovený odhadcem, modifikovaný dotazník k vyhodnocení zdravotního stavu (HAQ), C reaktivní protein (CRP) a rychlost sedimentace červených krvinek (ESR) u pacientů léčených odlišnou dávkou CDP870 a placebem. Medián a IQ rozmezí jsou uvedeny pro populaci pro každý postup s posledními pokračujícími pozorováními. Malé čtverečky označují placebo, kosočtverce označují 1 mg/kg, trojúhelníky označují 5 mg/kg a velké čtverce označují 20 mg/kg.
Příklady provedení vynálezu
Klonování genu a exprese chimérické hTNF40 protilátkové molekuly Izolace RNA z hTNF40 hybridomových buněk
Celková RNA byla připravena z 3 x 107 hTNF40 hybridomových buněk takto. Buňky byly promyty ve fyziologickém roztoku a rozpuštěny v RNAzolu (0,2 ml na 106 buněk). Byl přidán chloroform (0,2 ml na 2 ml homogenátu) a směs byla důkladně třepána po dobu 15 sekund, a poté ponechána na ledu po dobu 15 minut. Výsledná vodná a organická fáze byly odděleny centrifugací po dobu 15 minut v Eppendorfově centrifuze a RNA byla precipitována z vodné fáze přidáním stejného objemu ísopropanolu. Po 15 minutách na ledu byla RNA stočena do peletu, promyta 70% ethanolem, usušena a rozpuštěna ve sterilní vodě bez RNázy. Výtěžek RNA byl 400 pg.
PCR klonováni hTNF40 Vh a VI cDNA sekvence kódující variabilní domény hTNF40 těžkého a lehkého řetězce byly syntetizovány s použití reverzní transkriptázy za vzniku jednovláknových cDNA kopií mRNA přítomné v celkové RNA, pak následovala polymerázová řetězová reakce (PCR) na cDNA se specifickými oligonukleotidovými primery.
a) syntéza cDNA cDNA byla syntetizována v reakční směsi o objemu 20 μΐ obsahující následující reagencie: 50mM Tris-HCI, pH 8,3, 75 mM KC1, 10 mM dithiothreitol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 20 jednotek RNAsinu, 75 ng náhodných hexanukleotidových příměrů, 2 gg hTNF40 RNA a 200 jednotek reverzní transkriptázy z viru MoMuLV (Moloneyovy myší leukémie). Po inkubaci ve 42 °C po dobu 60 minut, reakce byla ukončena zahříváním v 95 °C po dobu 5 minut.
- 15CZ 300737 B6
b) PCR
Alikvóty cDNA byly podrobeny PCR s použitím kombinace primerů specifických pro těžké a lehké řetězce. Nukleotidové sekvence 5' primerů pro těžké a lehké řetězce jsou ukázány v tabulce 1 a 2, v daném pořadí. Tyto sekvence všechny obsahují postupně restrikční místo začínající 7 nukleotidů od jejich 5' konců, sekvenci GCCGCCACC (SEKV. ID. Č. 12) pro umožnění optimální translace výsledných mRNA, iniciační kodon a 20-30 nukleotidů založených na vedoucí peptidové sekvenci známých myších protilátek (Kabat a kol., Sequences of proteins io of immunological interest, 5. vydání, 1991, U. S. Department of Health and Human Services,
Public Health Service, National Institutes of Health).
3' primery jsou ukázány v tabulce 3. Primer lehkého řetězce přesahuje J-C spojení protilátky a obsahuje restrikční místo pro enzym SplI pro usnadnění klonování VI PCR fragmentu. 3' primery těžkého řetězce jsou směsí navrženou k přesáhnutí J-C spojení protilátky. 3' primer zahrnuje Apal restrikční místo pro usnadnění klonování. 3' úsek primerů obsahuje smíšenou sekvenci založenou na sekvencích zjištěných ve známých myších protilátkách (Kabat a kol., 1991, výše).
Kombinace primerů popsaných výše umožní PCR produktům pro Vh a VI, že jsou klonovány přímo do vhodného expresního vektoru (viz níže) pro produkci chimérických (myší-humánní) těžkých a lehkých řetězců, a těmto genům, že jsou exprimovány v savčích buňkách k pro produkci chimérických protilátek požadovaného izotypu.
Inkubace (100 μΐ) pro PCR byly nastaveny takto. Každá reakce obsahovala 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,01 % (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 10 pmol směsi 5' primerů (tabulka 4), 10 pmol 3' primeru (CL 12 (lehký řetězec) nebo R2155 (těžký řetězec) (tabulka 3), 1 μΐ cDNA a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly inkubovány v 95 °C po dobu 5 minut a poté podrobeny cyklům v 94 °C po dobu
I minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byl alikvót z každé reakce analyzován elektroforézou na agarózovém gelu. Reakce pro lehké řetězce obsahující směsi 5' primerů ze skupin pro lehké řetězce 1, 2 a 7 vytvořily pásy o velikostech souhlasných s kompletními VI fragmenty, zatímco reakce ze skupin pro těžké řetězce 3 vytvořily fragment o velikosti očekávaného Vh genu. Pás vytvořený primery ze skupiny pro lehké řetězce 1 nebyl dále sledován, protože předběžné výsledky ukázaly, že tento pás odpovídá pseudogenu lehkého řetězce tvořeného hybridomovýmí buňkami. Pás vytvořený primery ze skupiny pro lehké řetězce 7 byl slabší než pás primerů ze skupiny 2, a tudíž nebyl dále sledován. Pouze pás vytvořený primery ze skupiny pro lehké řetězce 2, což byl nejsilnější pás, byl dále sledován.
c) Molekulární klonování PCR fragmentů
DNA fragmenty vytvořené v reakcích s primery ze skupiny pro lehké řetězce 2 byly štěpeny enzymy BstBI a SplI, koncentrovány ethanolovou precipitaci, podrobeny elektroforéze na 1,4% agarózovém gelu a DNA pásy o velikosti 400 párů bází byly opětně získány. Byly klonovány ligací do vektoru pMRl 5.1 (obrázek 4), který byl štěpen BstBI a SpiI. Po ligaci byly směsi transformovány do E. coli LM 1035 a s plazmidy z výsledných bakteriálních kolonií byl prováděn screening na inzerty pomocí štěpení s BstBI a SplI. Reprezentativní vzorky s inzerty z každé ligace byly analyzovány dále prostřednictvím nukleotidového sekvencování.
Podobně byly štěpeny DNA fragmenty vytvořené v reakcích s primery ze skupiny pro těžké řetězce 3 s enzymy Hindlll a Apal a klonovány do vektoru pMR14 (obrázek 5), který byl štěpen Hindlll a Apal. Opět, reprezentativní plazmidy obsahující inzerty byly analyzovány nukleotidovým sekvenco váním.
. 16.
LZ JW/37 Bí>
d) Analýza sekvencováním nukleotidů
Plazmidová DNA z velkého počtu izolátů obsahujících Vh inzerty byla sekvencována s použití primerů Rl 053 (viz tabulka 5) (které nasedají v 3' úseku HCMV promotoru v pMR14) a R720 (viz tabulka 5) (které nasedají v 5' úseku humánního C - gama 4 a umožňují sekvencování pres DNA inzert v pMR14). Bylo zjištěno, že nukleotidové sekvence Vh inzertu ve velkém počtu klonů byly totožné, s výjimkou rozdílů v signálním peptidu a J úsecích. To ukazovalo, že vyšetřené klony jsou nezávislé izoláty vznikající použitím odlišných primerů ze směsi oligonukleotidů v průběhu PCR stádia. Zjištěné nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyseliio nové sekvence variabilní domény těžkého řetězce protilátky hTNF40 (hTNF40Vh) jsou uvedeny na obrázku 7 (SEKY. ID. Č. 100).
Pro analýzu klonů lehkého řetězce byly vyšetřovány sekvence pocházející z reakcí s primery R1453 (viz tabulka 5) a R684 (SEKV. ID. C. 62) (které nasedají v 5' úseku humánního C-kappa a umožňují sekvencování přes DNA inzert na pMR15.1). Nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence VI genů vznikajících z reakcí ve skupině 2 byly analyzovány podobně. Opět bylo zjištěno, že nukleotidové sekvence VI inzertu ve velkém počtu klonů byly totožné, s výjimkou rozdílů v signálním peptidu a J úsecích, což ukazovalo, že vyšetřené klony byly nezávislé izoláty vznikající použitím odlišných primerů ze směsi oligonukleotidů v průběhu
PCR stádia. Zjištěné nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence variabilní domény lehkého řetězce protilátky hTNF40 (hTNF40Vl) jsou uvedeny na obrázku 6 (SEKV. ID. Č. 99).
Tabulka 1
Oligonukleotidové primery pro 5' úsek myších těžkých řetězců.
CH1: 5'ATGAAATGCAGCTGGGTCAT (G, C)TTCTT3 ’ (SEKV. ID. Č. 13)
CH2: 5T ATGGGAIGGAGCT (A,G)TATCAT (C,G) (C,T) TCTT3f (SEKV. ID. Č. 14)
CH3: 5'ATGAAG (A, T) TGTGGTTAAACTGGGTTTT31 (SEKV. ID. Č. 15)
CH4: 5'ATG (G, A) ACTTTGGG{T,C) TCAGCTTG(G, A)T3 ’ (SEKV. ID. Č. 16) CHS: 5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3’ (SEKV. ID. Č. 17)
CH6: 5'ATGGCTGTC(C,T)T(G,A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG31 (SEKV. ID. Č. 18)
CH7: 51ATGG(G,A)ATGGAGC(G,T)GG(G,A)TCTTT(A,C)TCTT3’ (SEKV. ID. Č. 19)
CHS: 51ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3' (SEKV. ID. Č. 20)
CH9: 5'ATGG (C, A)TTGGGTGTGGA(A, C) CTTGCTATT3' (SEKV. ID. Č. 21) CH10: 5' ATGGGCAGACTTACATTCTGATTCCT3’ (SEKV. ID. Č. 22)
CH11: 5'ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’ (SEKV. ID. Č. 23)
CH12: 5'ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3' (SEKV. ID. Č, 24)
Každý z výše uvedených primerů má ke svému 5' konci přidanou sekvenci
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3ř (SEKV. ID. Č. 25).
-17CZ 300737 B6
Tabulka 2
Oligonukleotidové příměry pro 5' úsek myších lehkých řetězců.
CLI: 5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT31 (SEKV. ID. Č. 26)
CL2: 5’ATGGAG{T,A)CAGACACACTCCTG(T,C)TATGGGT3’ (SEKV. ID. Č.
27)
CL3: 5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3’ (SEKV, ID. Č. 28)
CL4: 5'ATGAGG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3’ (SEKV. ID. Č.
29)
CL5: 5'ATGGATTT (T,A) CAGGTGCAGATT (T,A) TCAGCTT3 ' (SEKV. ID. Č.
30)
CL5A: 5'ATGGATTT (T,A) CA(A, G) GTGCAGATT (T,A) TGAGCTT3 ' (SEKV. ID. Č. 31)
CL6:
5'ATGAGGT (T,G) C(T, C) (T, C) TG (T, C) T (G, C) AG (T, C) T (T, C} CTG (A, G) G3' (SEKV, ID. Č. 32}
CL7: 5'ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3 ’ (SEKV. ID. Č. 33)
CL8:
5*ATGTGGGGA(T,C)CT(G,T)TTT(T,C)C(A,C) (A, C)TTTTTCAAT3’ (SEKV.
ID. Č. 34)
CL9: 5' ATGGT (G, A) TCC (T, A) CA(G, C}CTCAGTTCCTT3' (SEKV. ID. Č.
35)
CL10: 5'ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3' (SEKV. ID. Č. 36}
CL11: 5*ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3*(SEKY. ID. Č. 37)
CL12A: 5 ’ATG(A, G) AGT (T, C) (A, T) CAGACCCAGGTCTT (T, C) (A,G)T3' (SEKV. ID. Č. 38)
CL12B: 5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3' (SEKV. ID. Č. 39)
CLI3: 5’ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCT'TAT3' (SEKV. ID. Č. 40)
CL14: 5 'ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3 ’ (SEKV. ID. Č. 41)
CL15: 5'ATGAATTTGCCTGTTCATCTGTTGGTGCT3’ (SEKV. ID. Č. 42}
CL16: 5'ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3' (SEKV. ID. Č. 43)
CL17A: 5 ’ ATGAGGTGCCTA (A, G) CT (C, G} AGTTCCTG (A,G)G3’ (SEKV. ID.
Č, 44}
CL17B: 5'ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3’ (SEKV. ID. Č. 45)
CL17C: 5’ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3' (SEKV. ID. Č. 46)
Každý z výše uvedených primerú má ke svému 5' konci přidanou sekvenci 5 GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3' (SEKV. ID. Č. 47).
- 18ουυυι dd
Tabulka 3
Oligonukleotidové primery pro 3' konce myších Vh a VI genů.
Lehký řetězec (CL12):
5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT31 (SEKV. ID. Č. 48)
Těžký řetězec (R2155):
5' GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG (A, C) (A, G) GAGAC (G, T, A) GTGA3 1 5 (SEKV. ID. Č. 49)
Tabulka 4
a) směsi 5' primerů pro lehké řetězce pro PCR reakce skupina 1: CL2.
io skupina 2: CL7.
skupina 3: CL13.
skupina 4: CL6.
skupina 5: CL5A, CL9, CLI 7 A.
skupina 6: CL8.
is skupina 7: CL12A.
skupina 8: CLI, CL3, CL4, CL5, CL10, CLU, CL2B, CLU, CL15, CL1Ó, CLUB, CL17C
b) směsi 5' primerů pro těžké řetězce pro PCR reakce skupina 1: CH1, CH2, CH3, CH4.
skupina 2; CH5, CH6, CH7, CH8. skupina 3: CH9, CH10, CHU, CH12.
Tabulka 5
Primery použité pro analýzu sekvencováním nukleotidů
R1053: 5 ’ GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3 ’ (SEKV. ID. Č. 50} R720: 5 OCTCTCGGAGGTGCTCCTS’ (SEKV. ID. Č. 51)
Hodnocení aktivity chimérických genů
Aktivita chimérických genů byla hodnocena jejich expresí v savčích buňkách a purifikací a kvantifikací nově syntetizovaných protilátek. Metodologie je popsána níže, následovaná popisem biochemických a buněčných testů použitých pro biologickou charakterizaci protilátek.
a) Produkce chimérické hTNF40 protilátkové molekuly
Chimérická protilátka pro biologické hodnocení byla vytvořena pomocí přechodné exprese příslušných párů těžkých a lehkých řetězců po ko-transfekci (společné transfekci) na buňkách z ovarií čínského křečka - Chinese Hamster Ovary (CHO) s použití precipitace fosfátem vápenatým.
-19CZ 300737 B6
V den před transfekcí byly baňky s napůl konfluentními buňkami CHO-L761 podrobenu působení trypsinu, buňky byly počítány a do každé baňky T75 bylo vloženo 107 buněk.
Příští den bylo kultivační médium změněno 3 hodiny před transfekcí. Pro provádění transfekce byl připraven precipitát fosfátu vápenatého smícháním 1,25 ml 0,25M CaCl2 obsahujícího 50 pg expresních vektorů s každým těžkým a lehkým řetězcem s 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCI, 11,0 g HEPES a 0,4 g NB2HPO4 v 1 I vody, pH upraveno na 7,1 pomocí NaOH) a byl okamžitě přidán do média k buňkám. Po 3 hodinách ve 37 °C v CO2 inkubátoru byly médium a precipitát odstraněny a buňky byly podrobeny šoku přidáním 15 ml 15% glyeerolu ve fyziologickém io roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) po dobu 1 minuty. Glyeerol byl odstraněn, buňky byly jednou promyty PBS a inkubovány po dobu 48-96 hodin ve 25 ml média obsahujícího 10 mM butyrát sodný. Protilátka byla purifikována z kultivačního média vazbou na protein Α-Sepharose a elueí.
b) ELISA
Pro provádění testu ELISA byly destičky Nunc ELISA potaženy přes noc ve 4 °C s F(ab)2 fragmentem anti-humánní polyklonální kozí protilátky specifické pro Fc fragment (Jackson Imunovýzkum, kóduj 109-006-098) v 5 pg/ml ve vazebném pufru (15 mM uhličitan sodný, 35 mM hydrouhličitan sodný, pH 6,9). Nenavázaná protilátka byla odstraněna promytím 5 krát destilovanou vodou. Vzorky a purifikované standardy, které měly být kvantifikovány, byly naředěny přibližně na 1 pg/ml v konjugačním pufru (0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,1 M NaCI, 0,2% (objem/objem) Tween 20, 0,2% (hmotnost/objem) Hammerstenův kasein). Vzorky byly titrovány v mikrotitračních jamkách ve dvojkových ředěních za vzniku konečného objemu 0,1 ml v každé jamce a destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny s třepáním. Po prvním inkubačním kroku byly destičky promyty 10 krát destilovanou vodou, a poté inkubovány po dobu 1 hodiny jako předtím s 0,1 ml myší anti-humánní kappa monoklonální protilátkou (klon GDI 2) konjugovanou s peroxidázou (The Binding Site, katalog, č. MP135) v ředění 1 k 700 v konjugačním pufru. Destička byla opět promyta a do každé jamky byl přidán roztok substrátu (0,1 ml). Roztok substrátu obsahoval 150 pl Ν,Ν,Ν,Ν-tetramethylbenzidin (10 mg/ml v DMSO), so 150 pl peroxid vodíku (30% roztok) v 10 ml 0,1 M acetát sodný/ citrát sodný, pH 6,0. Destičky byly vyvolávány po dobu 5-10 minut, dokud nebyla absorbance v 630 nm přibližně 1,0 pro horní standard. Absorbance v 630 nm byla měřena s použitím přístroje pro odečítání mikrotitračních destiček a koncentrace vzorku stanovena srovnáním titrační křivky s křivkou standardu.
c) stanovení afínitních konstant analýzou BiaCore
Vazebné interakce mezi hTNF40 a humánním TNF byly zkoumány s použitím technologie BIA. Afínitně puntíkovaná kozí polyklonální protilátka, namířená proti konstantnímu úseku hTNF40, byla imobilizována na dextranový polymer povrchu sensorického čipu s použitím standardní
NHS/EDC chemie. Relativně nízké množství (200-500 RU) hTNF40 bylo zachyceno, aby bylo zajištěno, že byly minimalizovány účinky hmotového transportu. Přes zachycenou hTNF40 „protékal“ humánní TNF v různých koncentracích, aby bylo možné stanovit asociační kinetiku. Po injekci ligandu přecházel přes povrch pufr, aby bylo možné měřit disociací. Byly vypočteny konstanty rychlosti asociace a disociace pro interakce mezi hTNF40 na pevné fázi a humánním
TNF a byla určena hodnota KD.
Příklad 1
CDR-roubování hTNF40
Molekulární klonování genů pro variabilní úseky těžkých a lehkých řetězců hTNF40 protilátky ajejich použití pro produkci chimérických (myší-humánní) hTNF40 protilátek bylo popsánu výše. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence myších hTNF40 VI a Vh jsou ukázány na
-20vz. juu/a/ do obrázku 6 a 7 (SEKV. ID. Č. 99 a 100), v daném poradí. Tyto příklady popisují CDR-roubování hTNF40 protilátky.
CDR-roubování hTNF40 lehkého řetězce
Porovnání úseků rámce hTNF40 lehkého řetězce s úseky čtyř podskupin humánních lehkých řetězců (Kabat a kol., 1991, výše) odhalilo, že hTNF40 byla většinou homologní s protilátkami v podskupině humánních lehkých řetězců 1. proto tedy pro konstrukci CDR-roubovan lehkého řetězce vybrané úseky rámce odpovídaly úsekům kanonické sekvence humánní skupiny 1.
io
Srovnání aminokyselinových sekvencí úseků rámce myší hTNF40 a kanonických lehkých řetězců humánní skupiny 1 je uvedeno na obrázku 1 a ukazuje, že se vyskytuje 22 rozdílů (podtrženo) mezi těmito dvěma sekvencemi. Analýza přínosu, který každý z těchto rozdílů v rámcovém úseku protilátky může mít na vazbu antigenu, identifikovala 2 zbytky pro výzkum, byly v polohách 46 a 60. Na základě této analýzy byly konstruovány dvě verze CDR-roubovaného lehkého řetéz. V první z nich, hTNF4(F-gLl (SEKV. ID. Č. 8), zbytky 46 a 60 pocházejí z hTNF40 lehkého řetěz, zatímco ve druhé, hTNF40-gL2 (SEKV. ID. Č. 9), všechny zbytky jsou humánní kanonické kromě zbytku Č. 60, který je z hTNF40 lehkého řetězce.
Konstrukce CDR-roubovaného lehkého řetězce hTNF40-gLl
Konstrukce hTNF40-gLl je detailně uvedena níže. Následující překrývající se oligonukleotidy (P7982-P7986) byly použity v polymerázových řetězových reakcích (PCR) k sestavení zkráceného roubovaného lehkého řetězce. Sestavený fragment postrádá protilátkovou vedoucí sekvenci a prvních 17 aminokyselin rámce 1.
oligo 1 P7982:
5' GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGAACGTAGGTACTAAC GTAGCCTGGTATCAGCAAA3' (SEKV. ID. Č. 52) oligo 2 P7983:
5' ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTT TTGCTGATACCAGGCTACGT3' (SEKV. ID. Č. 53) oligo 3 P7984;
5' TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCG GTAGTGGTACTGATTTCAC31 (SEKV. ID. Č. 54) oligo 4 P7985:
5' GACAGTAATA, AGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGTGAGGGT GAAATCAGTACCACTACCG3' (SEKV. ID. Č. 55)
-21 CZ 300737 B6 oligo 5 P7986:
5' ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTACCCACTCACATTCGGT
CAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3' (SEKV. ID. č. 56)
Fwd P7981:
5 1 GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3 ’ (SEKV. ID. c. 57)
Bwd P7980
5' GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3 ’ (SEKV. ID. č. 58),
PCR reakce v objemu 100 μΐ obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCI, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukíeosidtrifosfátu, 2 pmol
P7982, P7983, P7984, P7985, P7986, 10 pmol P7980, P7981 a 1 jednotku Taq polymerázy.
Reakce byly podrobeny cyklům v 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla každá reakce analyzována elektroforézou na agarózovém gelu a PCR fragment byl z gelu vyříznut a znovu získán s použití soupravy Mermaid Kit. Získaný fragment byl štěpen enzymy BstEII a SpiI v příslušném pufru. Výsledný produkt byl nakonec io podroben elektroforéze na agarózovém gelu a z gelového řezu byl opět získán DNA fragment o velikosti 270 párů bází a byl ligován do vektoru CTIL5-gL6 (obrázek 12), kteiý byl dříve štěpen stejným enzymem. Výše uvedený vektor poskytuje chybějící protilátkovou vedoucí sekvenci a prvních 17 aminokyselin rámce 1.
Ligační směs byla použita pro transformaci kmene LM1035 E. coli a výsledné kolonie byly analyzována pomocí PCR, štěpením restríkčními enzymy a nukleotidovým sekvencováním. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence VI úseku hTNF40-gLl je ukázána na obrázku 8 (SEKV. ID. Č. 8).
Konstrukce CDR-roubovaného lehkého řetězce hTNF40-gL2 hTNF40-gL2 (SEKV. ID. Č. 9) byl konstruován s použitím PCR. Pro zavedení aminokyselinových změn byly použity následující oligonukleotidy:
R 1053: 5' GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’ (SEKV. ID. Č. 59)
R5350: 5 ' TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCATAGAT CAGGAGCTTAGGAGC3’ (SEKV. ID. Č. 60)
R534 9: 5 ' GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCA GGCACAGACTTTACCCTAAC3' (SEKV. ID. Č. 61)
R684: 5'TTCAACTGCTCATCAGAT31 (SEKV. ID. Č. 62)
Dvě reakce, každá po 20 μΙ, obsahovaly po 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCU, 50 mM KCI, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukíeosidtrifosfátu, 0,1 pg hTNF40-gLI, 6 pmol R1053/R5350 nebo R5349/R684 a 0,25 jednotky Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu
-T? CZ JWI/O/ DO minuty. Po 30 cyklech byla každá reakce analyzována elektroforézou na agarózovém gelu a PCR fragment byl z gelu vyříznut a znovu získán s použitím soupravy Mermaid Kit.
Alikvóty těchto reakcí byly poté podrobeny druhému kolu PCR. Reakce 100 μΙ obsahovala
10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,01 % (hmotnost/objem) želatiny, 1/5 každého PCR fragmentu z první sady reakcí, 30 pmol Rl 053 a R684 a 2,5 jednotky Taq polymerázy. Reakční teploty byly uvedeny výše. Po PCR byla směs extrahována směsí fenolu a chloroformu, a poté chloroformem a precipitována ethanolem. Ethanolový precipitát byl znovu získán centrifugací, rozpuštěn v příslušném pufru a štěpen enzymy BstEII a SplI. Výsledný io produkt byl nakonec podroben elektroforéze na agarózovém gelu a z gólového řezu byl opět získán DNA fragment o velikosti 20 párů bází a byl ligován do vektoru pMR15.1 (obrázek 4), který byl dříve štěpen stejným enzymem.
Ligaění směs byla použita pro transformaci kmene LM1035 E. coli a výsledné kolonie byly analyzována pomocí PCR, štěpením restrikčními enzymy a nukleotidovým sekvencováním. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence Vl úsek hTNF40-glL2 je ukázána na obrázku 9 (SEKV. ID. Č. 9).
CDR-roubování KTNF40 těžkého řetězce
CDR-roubování hTNF40 těžkého řetězce bylo uskutečněno s použitím stejné strategie, jak byla popsána pro lehké řetězce. Bylo zjištěno, že hTNF40 těžkého řetězce je většinou homologní s humánními těžkými řetězci patřícími k podskupině 1, a tudíž kanonická sekvence čtecích rámců humánní podskupiny 1 byl vybrán pro přijetí CDR z hTNF40 těžkého řetěz.
Pro zkoumání podmínek, aby homologní humánní rámec fungoval jako příjemcovský rámec pro CDR roubování, byl vybrán druhý rámec z humánní skupiny 3 pro humanizaci hTNF40 těžkého řetězce.
Srovnání hTNF40 se dvěma odlišnými úseky rámce je ukázáno na obrázku 2, kde je možné vidět, že hTNF40 se liší od kanonické humánní podskupiny 1 v poloze 32 (podtrženo) a od kanonické humánní podskupiny 3 se liší v poloze 40 (podtrženu). Po analýze příspěvku k tomu, že každý žních může vázat antigen, byly zbytky 28, 38, 46, 67, 69 a 71 zachovány jako dárcovské v CDR-roubovaném těžkém řetězci ghlhTNF40.1, s použitím rámce skupiny 1. Zbytky 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 a 78 byly zachovaná jako dárcovské v CDR-roubovaném těžkém řetězci, gh3hTNF40.4, s použitím rámce skupiny 3. Zbytky 28, 69 a 71 byly udrženy jako dárcovské v CDR-roubovaném těžkém řetězci, gh 1 hTNF40,4 s použitím rámce skupiny 1. Konstrukce CDR-roubovaného těžkého řetězce ghlhTNF40.4 ghlhTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 1,0) byla sestavena pomocí přektývajících se oligonukleotidů metodou PCR v přítomnosti příslušných primerů. V PCR byly použity následující oligonukleotidy:
Roub skupiny 1 oligo 1 P7989:
5' GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAG AGTGCACGAATTC3' (SEKV. ID. Č. 63) oligo 2 P7990:
5' GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGCTAC GTGTTCACAGACTATGGTA3' (SEKV. ID. Č. 64)
-23CZ 300737 B6 oligo 3 P7991:
’ CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTCATAC CATAGTCTGTGAACACGT3' (SEKV. TD. Č. 65) oligo 4 P7995:
5' GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEKV. ID. Č. 66) □ligo 5 P7992:
’ CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3 ' (SEKV. ID. Č. 67) oligo 6 P7993:
5' CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGC AGTGTACTAT3’ (SEKV. ID. Č. 63) oligo 7 P7994:
5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAG
CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’ (SEKV. ID. Č. 69)
Fwd: P7988:
5*GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGC*TGGTC3’ {SEKV. ID. Č. 70)
Bwd P7987: 5 'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT31 (SEKV. ID. Č.
71)
100 μΐ reakce obsahovala 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtri fosfátu, 2 pmol každého z p7989, p7990, p7991, p7995, p7992, p7993 a p7994, 10 pmol každého z p7988 a p7987 a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla reakce extrahována směsi fenolu a chloroformu (1/1), poté chloroformem a precipitována ethanolem. Po centrifugaci byla DNA. rozpuštěna v příslušném restrikěním pufru a štěpena ApaLI a KpnI. Výsledný fragment byl ío izolován z agarózového gelu a ligován do pMR14 (obrázek 5), který byl dříve štěpen stejným enzymem. pMR14 obsahují humánní gama 4 konstantní úseky těžkého řetězce. Když pMR14 je štěpen ApaLI a KpnI, naštěpený vektor je schopný přijmout štěpenou DNA tak, že 3' konec štěpené DNA se ve čtecím rámci spojí s 5' koncem sekvence kódující konstantní úsek gama 4. Tudíž těžký řetězec exprimovaný tímto vektorem má izotyp gama 4. Ligační směs byla použita pro transformaci £. coli LM1O35 a výsledné bakteriální kolonie byly podrobeny screeningu restrikčním štěpením a analýze nukleotidovým sekvencováním. Takto byl identifikován plazmid obsahující správnou sekvenci pro gh 1 hTNF40.4 (obrázek 10) (SEKV. ID. Č. 10).
Konstrukce CDR-roubovaného těžkého řetězce gh3hTNF40.4
- 74 Cí JVV/JI DO gh3hTNF40.4 (SEKV, ID. Č. II) byla sestavena podrobením překrývajících se oligonukleotidů metodou PCR v přítomnosti příslušných primerů. V PCR byly použity následující oligonukleotidy:
Roub skupiny 3 oligo 1 P7999:
' GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCTCAG AGTGCACGAATTC3’ (SEKV. ID. Č. 72) oligo 2 P8000:
* TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCTGGTTACG TCTTCACAGACTATGGAA3' (SEKV. ID. Č. 73) oligo 3 P8001:
51 CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTGATTC CATAGTCTGTGAAGACGT3r (SEKV. ID. Č. 74) oligo 4 P7995:
5' GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC31 (SEKV. ID. Č. 66) oligo 5 P7997:
’ GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3 ’ (SEKV. ID. Č. 75) oligo 6 P7998:
’ CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCGC AGTGTACTAT3' (SEKV. ID. Č. 76) oligo 7 P7993:
51 GAAITCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAG CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3 ’ (SEKV. ID. Č. 77)
Fwd P7996:
5' GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3' (SEKV. ID. Č. 78)
Bwd P7987:
5' GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT31 (SEKV. ID. Č. 71)
-25CZ 300737 B6
100 μΐ reakce obsahovala 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCU 50 mM KC1, 0,01% (hmotnost/objem) želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosidtrifosfátu, 2 pmol každého z p7999, p8000, p8001, p7995, p7997, p7998 a p7993, 10 pmol každý p7996 a p7987 a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakce byly podrobeny cyklům v 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech byla reakce extrahována směsi fenolu a chloroformu (1/1), poté chloroformem a precipitována ethanolem. Po centrifugaci byla DNA rozpuštěna v příslušném restrikčním pufru a štěpena ApaLI a KpnI. Výsledný fragment byl izolován z agarózového gelu a ligován do pMR14 (obrázek 5), který byl dříve štěpen stejným enzymem. pMR14 obsahují humánní gama 4 konstantní úseky těžkého řetězce. Když pMR14 je io štěpen ApaLI a KpnI, naštěpený vektor je schopný přijmout štěpenou DNA tak, že 3' konec štěpené DNA se ve čtecím rámci spojí s 5' koncem sekvence kódující konstantní úsek gama 4. Tudíž těžký řetězec exprimovaný tímto vektorem má izotyp gama 4. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli LM1035 a výsledné bakteriální kolonie byly podrobeny screeningu restrikčním štěpením a analýze nukleotidovým sekvencováním. Takto byl identifikován plazmid is obsahující správnou sekvenci pro gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 11) (obrázek 11).
Produkce CDR-roubovaného modifikovaného Fab Fragmentu
CDR-roubovaný modifikovaný Fab fragment, založený na protilátce hTNF40, byl konstruován s použitím E. coli vektoru pTTO-1. Variabilní úseky protilátky hTNF40 byly subklonovány do tohoto vektoru a intergenové sekvence byly optimalizovány za vzniku pTTO(CDP870). pTTO expresní vektor byl navržen za vzniku rozpustné periplazmatické akumulace rekombinantních proteinů v £. coli. Hlavní charakteristické vlastnosti tohoto plazmidu jsou:
(i) markér rezistence na tetracy kliň - přičemž antibiotikum není inaktivováno produktem genu rezistence, proto je udržována selekce buněk obsahujících plazmid, (ii) nízký počet kopií - počátek replikace pocházející z plazmidu pl5A, který je kompatibilní s plazmidy obsahujícími replikony pocházející z colEl, (iii) silný indukovatelný tac promotor pro transkripci klonovaného genu(ů), (iv) laclq gen - propůjčuje konstitutivní exprese lac represorového proteinu, udržujícího tac promotor v reprimovaném stavu až do indukce s IPTG/alIo laktózou, (v) OmpA signální sekvence - zajišťuje periplazmatickou sekreci klonovaného genu(ů), a (vi) translační připojení OmpA signální sekvence ke krátkému lacZ peptidů, zajišťující účinnou iniciaci translace.
Vektor byl vyvinut pro expresi modifikovaných Fab fragmentů z dicistronové mRNA tak, že byla navržena metoda pro empirický výběr optimální intergenové sekvence ze série 4 cíleně připravených kazet. Použití je popsáno při konstrukci pTTO(CDP870).
Materiál a metody
Techniky DNA
Standardní postupy byly použity pro protokoly zahrnující DNA restrikci, elektroforézu na agarózovém gelu, ligaci a transformaci. Restrikční enzymy a DNA modifikující enzymy byly získány od firem New England Biolabs nebo Boehringer Mannheim a byly použity podle doporučení výrobce. DNA fragmenty byly purifikovány z agarózy s použitím protokolu GeneCIean (BIO 101). Oligonukleotidy byly dodány firmou Oswel Oligonukíeotíd Service a byly syntetizovány v měřítku 40 nM. Plazmidová DNA byla izolována s použitím souprav Plazmid DNA Mini/Mídi od firmy Qiagen. PCR bylo prováděno s použitím Perkin Elmer „Amplitaq“ dle doporučení. DNA sekvencování bylo prováděno s použitím soupravy pro sekvencování Applied
Biosystem Taq cycle.
-26k/υν ! u / uu
Indukce v třepaných baňkách
£. coli W3110 kultury byly pěstovány v médiu L-broth doplněném tetracyklinem (7,5 g/ml). Pro indukce byly čerstvé přes noc rostoucí kultury (pěstované ve 30 °C) naředěny na OD^oo 0,1 do 200 ml L-broth ve 2 1 kultivačních baňkách a byly pěstovány ve 30 °C v orbitálním inkubátoru.
Při OD6oo 0,5 byl přidán IPTG do koncentrace 200 μΜ. V intervalech byly odebírány vzorky (normalizované dle OD).
Periplazmatická extrakce
Vzorky kultury byly ochlazeny na ledu (5 minut), a poté byly buňky sklizeny centrifugách Po io resuspendování v extrakčním pufru (100 mM Tri HCI, 10 mM EDTA, pH 7,4) byly vzorky inkubovány přes noc ve 30 °C, a poté vyčištěny centrifugách
Test sestavení
Koncentrace modifikovaných Fab byly určovány pomocí testu ELISA. Destičky byly potaženy ve 4 °C přes noc s anti-humánní Fd 6045 (2 pg/ml ve vazebném pufru, fyziologický roztok, 100 pl na jamku). Po promytí byly jamky plněny 100 μΐ vzorku, jako standard byl použit purifikovaný A5B7 gama-1 Fab', původně v koncentraci 2 pg/ml. Vzorky byly sériově naředěny 2 krát napříč přes destičku konjugačním pufrem (na 1 litr: 6,05 g trisaminomethanu, 2,92 g NaCI, 0,1 ml Tween-20, 1 ml kaseinu (0,2%)), destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, s třepáním. Destičky byly promyty a usušeny, a poté bylo přidáno 100 μΐ anti-humánní C-kappa (GD12)-peroxidázy (naředěno v konjugačním pufru). Inkubace byla prováděna při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny s třepáním. Destičky byly promyty a usušeny, a poté bylo přidáno 100 pl roztoku substrátu (10 ml roztoku acetát sodný/citrát (O,1M pH 6), 100 pl roztoku H2O2, 100 pl roztoku tetramethylbenzidinu (10 mg/ml v dimethylsulfoxidu)). Absorbance v 630 nm byla odečítána 4 až 6 minut po přidáni substrátu.
Konstrukce plazmidů pTTO-1 (a) nahrazení pTTO9 polylinkeru
Plazmid pTTQ9 byl získán od firmy Amersham aje ukázán na obrázku 14. Alikvot (2 pg) byl štěpen restrikčními enzymy Sall a EcoRI, štěpný produkt byl puštěn na 1% agarózovém gelu a velký DNA fragment (4520 bp) byl puntíkován. Byly syntetizovány dva oligonukleotidy, které po společném nasednutí kódují úsek OmpA. polylinkeru ukázaný na obrázku 15. Tato sekvence má kohezivní konce, které jsou kompatibilní se Sall a EcoRI konci vytvořenými restrikci pTTQ9. Klonováním této oligonukleotidové 'kazety' do pTTQ9 vektoru nebylo regenerováno místo Sall, ale místo EcoRI bylo udrženo. Kazeta kóduje prvních 13 aminokyselin signální sekvence E. coli proteinu Omp-A vnější membrány, předcházených Shine-Dalgamo vazebným místem pro ribozom OmpA genu. Kromě toho jsou přítomna restrikění místa pro enzymy Xbal, MunI, Styl a Šplh MunI a Styl místa jsou v kódujícím úseku OmpA signální sekvence a jsou zamýšlena jako 5' klonovací místa pro inzerci genů. Dva oligonukleotidy, které vytváří tuto kazetu, byly spojeny dohromady smícháním v koncentraci 5 pmol/pl a zahříváním ve vodní lázni na 95 °C po dobu 3 minut, a poté pomalým ochlazením na teplotu místnosti. Spojená sekvence pak byla ligována do pTTQ9 štěpeného Sall/EcoRI. Výsledný plazmidový meziprodukt, nazvaný pTQOmp, byl ověřen pomocí DNA sekvencování.
(b) Příprava a ligace fragmentu
Plazmid pTTO-1 byl konstruován ligací jednoho DNA fragmentu z plazmidů pACYC184 ke dvěma fragmentům vytvořeným z pTQOmp. Plazmid pACYC184 byl získán od firmy New England Biolabs a restrikční mapa je ukázána na obrázku 16. Alikvot (2bg) byl štěpen do úplnosti restrikčním enzymem Styl, a pak podroben působení nukleázy z fazolí mungo, což vytvořilo slepé konce odstřižením 5' báze přesahů. Po fenolové extrakci a ethanolové precipitaci byla DNA štěpena enzymem PvuII, za vytvoření fragmentů o velikosti 2348, 1081,412 a 403 bp. fragment o velikosti 2348 bp byl purifikován po elektroforéze na agarózovém gelu. Tento
-27CZ 300737 B6 fragment kóduje markér rezistence na tetracyklin a pl5A počátek replikace. Fragment pak byl podroben působení alkalické fosfatázy z telecího střeva, aby se odstranily 5' koncové fosfáty, a tím se této molekule zabránilo v ligaci sama k sobě.
Alikvot (2 pg) plazmidů pTQOmp byl štěpen enzymem SspI a EcoRI a fragment o velikosti 2350 bp byl purifikován z nežádoucích fragmentů o velikosti 2040 bp a 170 bp po elektroforéze na agarózovém gelu, tento fragment kóduje úsek transkripčního terminátoru a gen laclq. Další alikvot (2 pg) pTQOmp byl* štěpen s EcoRI a XmnI, za vzniku fragmentů o velikosti 2289, 1670, 350 a 250 bp. Fragment o velikosti 350 bp, kódující tác promotor, OmpA signální sekvenci a io multiklonovací místo, byl purifikován přes gel.
Tři fragmenty byly poté ligovány s použitím přibližně ekvimolámího množství každého fragmentu za vzniku plazmidů pTTO-1. Všechna klonovací spojení byla ověřena pomocí DNA sekvencování. RestrikČní mapa tohoto plazmidů je ukázána na obrázku 17. Plazmid pTTO -2 byl is pak vytvořen inzercí DNA kódující konstantní doménu lehkého řetězce kappa humánního Ig. Ta byla získána jako SplI - EcoRI restrikční fragment z plazmidů pHC132 a vložena na odpovídající místa v pTTO-1. Plazmid pTTO-2 je ukázán na obrázku 18.
Inzerce humanizovaných hTNF40 variabilních úseků do pTTO-2
Variabilní úsek lehkého řetězce hTNF40gLl (SEKV. ID. Č. 8) byl získán pomocí PCR „záchrany“ z odpovídajícího vektoru pro expresi v savčích buňkách pMRlO.l. OmpA vedoucí sekvence nahradila nativní Ig vedoucí sekvencí. Sekvence PCR primerů je ukázána níže;
51 primer: CGCGCGGCAATTGCAGTGGCGTTGGCTGGTTTGGCTACCGTAGCGCAAG CTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC (SEKV. ID. Č. 79)
3T primer: TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEKV. ID, Č. 80)
Po PCR ve standardních podmínkách byl produkt purifikován, štěpen enzymy MunI a SplI, a poté purifikován přes gel. Purifikovaný fragment byl poté vložen do MunI/SplI míst v pTTO-2 za vzniku meziproduktu lehkého řetězce pTTO(hTNF40L).
Variabilní úsek těžkého řetězce gh3hTNF40.4 byl získán stejným způsobem z vektoru pGamma-4. Sekvence PCR primerů je ukázána níže:
5' primer: GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAG CTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC (SEKV. ID. Č. 81)
3' primer: GCCTGAGTTCCACGACAC (SEKV. ID. Č. 82)
Po PCR byl produkt purifikován, štěpen enzymy Nheí a Apal, a poté byl subklonován do vektoru pDNAbEng-Gl (obrázek 19). Po ověření pomocí DNA sekvencování byl těžký řetězec štěpen enzymem EcoRI a subklonován do EcoRI místa v pTTO(hTNF40L) za vzniku £. coii expresního plazmidů pTTO(hTNF40).
Optimalizace intergenové sekvence pro expresi modifikovaného Fab
Ve vektoru pTTO nastává exprese modifikovaného Fab z dicistronické RNA kódující nejdříve lehký řetězec, a poté těžký řetězec. DNA sekvence mezi těmito dvěma geny (intergenová sekvence, ÍGS) může ovlivnit stupeň exprese těžkého řetězce působením na rychlost iniciace translace. Například krátká intergenová sekvence může mít za následek translační spojení mezi lehkými a těžkými řetězci, ve kterém translační ribozom nemusí plně disociovat z mRNA po
-28LZ, JUV/J7 BĎ ukončení syntézy lehkého řetězce před iniciací syntézy těžkého řetězce. „Síla“ jakéhokoliv vazebného Shine-Dalgamova (SD) místa ribozomu (homologie s 16 rRNA-) může mít také vliv, stejně jako vzdálenost a složení sekvence mezi SD a ATG startovacím kodonem. Potenciální sekundární struktura mRNA kolem ATG je další důležitý faktor, ATG by měl být v „kličce“ a ne stísněný ve „stonku“, zatímco pro SD to platí opačně. Tak modifikací složení a délky IGS je možné modifikovat sílu iniciace translace, a tudíž stupeň produkce těžkého řetěz. Je pravděpodobné, že pro maximalizací exprese těžkého řetězce daného modifikovaného Fab je nutné dosáhnout optimální rychlosti iniciace translace. Například, pro jeden modifikovaný Fab může být tolerován vysoký stupeň exprese, ale pro odlišný modifikovaný Fab s odlišnou aminokyseli10 novou sekvencí se ukáže vysoký stupeň exprese jako toxický, možná pro odlišnou účinnost sekrece nebo skládání. Z tohoto důvodu byly navrženy série Čtyř intergenových sekvencí (obrázek 20) umožňujících empirické stanovení optimálních IGS pro modifikovaný Fab založený na hTNF40. IGSI a IGS2 mají velmi krátké intergenové sekvence (-1 a +1, v daném pořadí) a je možné očekávat vznik těsně spojené translace, SD sekvence (podtrženo) jsou slabé odlišné. Tyto dvě sekvence s největší pravděpodobností propůjčují vysoký stupeň iniciace translace. IGS3 a IGS4 mají delší vzdálenost mezi startovacím kodonem a stop kodonem (+13) a liší se ve složení svých sekvencí, IGS3 má „silnější“ SD sekvence. Všechny sekvence byly studované na výskyt sekundární struktury (s použitím programu m/fold) a „optimalizovány“ co možná nejvíce, ale, při těsném spojení translace dvou řetězců chybění ribozomální disociace znamená, že mRNA nemusí být „nahá“, aby se zabránilo vytvoření sekundární struktury.
Klonování IGS variant
IGS kazety ukázané na obrázku 20 mají hraniční klonovací místa Sací a MunI. Byly vytvořeny nasednutím komplementárních oligonukleotidových párů. Vektorový fragment byl připraven štěpením pTTO(hTNF40) enzymy Sací a Notl a fragment těžkého řetězce byl připraven štěpením pDNAbEngGl (hTNF40H) enzymy MunI a Notl. Poté byly prováděny trojcestné ligace s použitím ekvimolámích množství dvou restrikčních fragmentů a přibližně 0,05 pmol každé spojené oligokazety. Tak vznikly čtyři expresní plazmidy pTTO(hTNF40 IGS-1), pTTO(hTNF40 IGS-2), pTTO(hTNF10 IGS-3), PTTO(hTNF40 IGS 4).
Expresní analýza při kultivaci v třepaných baňkách
Čtyři plazmidy byly transformovány do kmene W3110 E. coli, spolu s původním expresním konstruktem, a poté byla analyzována jejich exprese v třepaných baňkách, jak bylo popsáno. Výsledky typického pokusu jsou ukázány na obrázku 21. Odlišné intergenové sekvence propůjčují odlišné expresní profily. IGSI a IGS2 akumulují peri plazmatické modifikované Fab rychle s vrcholem 1 hodinu po indukci, po kterém dosažená hladina padá. Pro IGSI je vrchol větší a padá ostřeji. Tyto výsledky jsou souhlasné s vysokým stupněm syntézy, jak je očekáváno pro těsné translační spojení u těchto konstruktů. IGS 1 zjevně propůjčuje vyšší stupeň exprese těžkého řetězce než IGS2. V tomto případě se zdá, že tento vysoký stupeň exprese je špatně tolerován, protože periplazmatické hladiny exprese padají po 1 hodině vrcholu. To lze pozorovat na růstovém profilu IGSI kultury (není ukázáno), který vrcholí 1 hodinu po indukci před poklesem svědčícím pro buněčnou smrt a lýzi. IGS3 akumuluje modifikovaný Fab pomaleji, ale vrcholí
2 hodiny po indukci s vyšší hodnotou vrcholu (325 ng/ml/OD) předtím, než se hladiny sníží. Růst této kultury pokračoval 3 hodiny po indukci a dosáhl vyššího vrcholu biomasy (neukázáno). To je v souhlase s nižším stupněm syntézy těžkého řetězce. IGS4 akumuluje materiál ještě pomaleji a nezdaří se mu dosáhnout vysoký vrchol produktivity dalších 3 konstruktů. Všechny IGS varianty významně překonaly původní vektor. Hypotéza, že odlišné IGS sekvence propůjčují odlišnou rychlost iniciace translace je podporována těmito experimentálními výsledky. Zdá se, že pro modifikovaný Fab založený na hTNF40 je vysoká rychlost iniciace translace těžkého řetězce špatně tolerována a není tudíž optimální. Pomalejší rychlost propůjčena IGS3 má za následek lepší růstové charakteristiky a proto v průběhu času akumuluje lepší výtěžek.
-29CZ 300737 B6
Po srovnání produktivity ve fermentoru byl 1GS3 konstrukt vybrán jako poskytující nejvyšší výtěžek a byl nazván pTTO(CDP870) - viz obrázek 22.
Těžký řetězec kódovaný plazmidem pTTO(CDP870) má sekvenci označenou jako SEKV. ID.
Č. 115 a lehký řetězec má sekvenci označenou jako 3EKV. ID. Č. 113.
PEGylace CDR-roubovaného, modifikovaného Fab založeného na hTMF40
Purifikovaný modifikovaný Fab je místně specificky konjugován s rozvětvenou molekulou PEG. io Tím je dosažena aktivace jednoho cysteinového zbytku ve zkráceném kloubovém úseku modifikovaného Fab, pak následuje reakce s (PEG)-lycyl-maleimidem, jak bylo popsáno už dříve (A.P.
Chapman a kol., Nátuře Biotechnology 17, 780-783, 1999). PEGylovaná molekula je ukázána na obrázku 13 a je nazývána sloučenina CDP870.
Účinnost PEGylovaného CDR-roubovaného modifikovaného Fab založeného na hTNF40 (CDP870) v léčbě revmatoidní artritidy CDP870 má biologický poločas dlouhý přibližně 11 dnů.
Původci hodnotili bezpečnost a účinnost Íntravenózně podávané CDP870 v randomizované dvojitě slepé klinické zkoušce s placebem a stoupající kontrolovanou dávkou u pacientů s RA.
Metody
Pacienti:
Pacienti ve věku mezi 18 a 75 lety a ti, kteří splnili diagnostická kritéria pro revmatoidní arthri25 tidu (RA) revidovaná v roce 1987 American CoIIege Rheumatology (ACR) (Amett al., Arthriti Rheum., 31, 315-324, 1998) byli získáváni z ambulance revmatologické kliniky v Londýně, Cambridgi, Norfolku a Norwichi (Spojené království). Byli požadováni pacienti, kteří měli klinicky aktivní nemoc, což bylo definováno tak, že měli alespoň 3 z následujících kritérií: > 6 bolestivých nebo citlivých kloubů, > 45 minut trvající ranní ztuhlost a rychlost sedimentace červených krvinek (ESR) > 28 mm/hodinu. Pacienti dále nereagovali na léčbu alespoň jedním lékem modifikujícím průběh revmatických nemocí (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug DMARD) a byli bez léčby po dobu nejméně 4 týdnů. Užívání kortikosteroidů bylo povoleno, jestliže dávka byla > 7,5 mg/den prednisolonu. Těhotné ženy, kojící ženy a ženy ve fertilním věku neužívající účinnou metodu kontracepce byly vyloučeny. Pacienti byly také vyloučeni, jestliže měli v anamnéze malignitu, současné závažné nekontrolované chorobné stavy, předešlou terapii neutralizující TNFa, která selhala, nebo alergii na polyethylengiykol. Před zapsáním do studie byl od každého pacienta získán psaný souhlas. Studie byla schválena místní etickou komisí pro vědu.
Léčebný protokol:
pacientů s RA bylo rozděleno do 3 skupin, které dostávaly stoupající dávku zkoušeného léčiva (1,5 nebo 20 mg/kg). Každá skupina po 12 byla náhodně rozdělena na 8 pacientů, kteří dostávali CDP870 a na 4 pacienty, kteří dostávali placebo. CDP870 byla podávána jako jedna intravenózní infúze (100 ml celkem) po dobu 60 minut. Placebo (pufr acetát sodný) bylo podáváno podobně, jako jedna intravenózní infuze o objemu 100 ml po dobu 60 minut. Léčba byla podávána ambulantně. Po 8 týdnech měli všichni pacienti otevřenou možnost dostat infúzi buď 5 nebo 20 mg/kg CDP870.
Klinické vyhodnocení:
Aktivita RA byla hodnocena na základě kritérií Worid Health Organization a International League of Assocíations for Rheumatology (Boers a kol., J. Rheumatol., Supplement, 41, 86- 89, 1994) a European League Against Rheumatism (EULAR) (Scott a kol., Clin. Exp. Rheumatol., 10, 521-525, 1992) s hodnocením souboru dat získaných z 28 kloubů. Změny v aktivitě nemoc
-30CZ ÚUU/J/ BO byly hodnoceny pomocí stupnice pro aktivitu nemoci (Prevoo a kol., Arthritis Rheum., 38, 44-48, 1995) a kritérií ACR (Felson a kol.. Arthritis Rheum., 38, 727-735, 1995). Hodnocení se provádělo před léčbou a 1, 2, 4, 6 a 8 týdnů po léčbě. U pacientů byla také hodnocena bezpečnost a tolerance studovaného léčiva. Při každé vizitě byly hodnoceny hematologické a biochemické parametry a anti-CDP870 protilátky a vedlejší účinky.
Plazmatická koncentrace CDP870 a anti-CDP870 protilátek
CDP870 byla měřena enzymatickým imunotestem (ELISA). Sériová ředění plazmy pacientů byla inkubována na mikrotitrační destičce (Nunc) potažené rekombinantním humánním TNFa (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Zachycená CDP870 byla detekována kozí anti-humánní protilátkou, specifickou pro lehký řetězec kappa, konjugovanou s křenovou peroxidázou (Cappel, ICN), následovanou přidáním tetramethylbenzidinu (TMB) jako substrátu.
S protilátkami k CDP870 byl prováděn screening (s ředěním plazmy 1/10) s použití „sendvičového“ testu ELISA s dvojím antigenem s bíotinylovanou CDP870 jako druhou vrstvou. Navázané protilátky byly detekovány s použitím HRP-streptavidinu a substrátu TMB. Test byl kalibrován s použitím hyperimunitního králičího standardního IgG. Jednotka aktivity je totožná s 1 pg králičího standardu.
Statistická analýza
Studie měla výzkumný charakter a velikost vzorku byla založena na předešlé zkušenosti s podobnými přípravky. Účinnost CDP870 byla analyzována vypočtením skóre aktivity nemoci (DAS) a reakcí ACR20/50 na léčebný záměr a na protokol s použitím neměnného testovacího postupu. Skóre aktivity nemoci bylo vypočteno takto: DAS = 0,555 x druhá odmocnina (28 citlivých kloubů) + 0,284 x druhá odmocnina (28 oteklých kloubů) + 0,7 x In(ESR) + 0,0142 x (pacientovo celkové hodnocení). Nejdříve byly sloučené aktivní skupiny porovnány s placebem. Jestliže toto srovnání bylo významné na 5% hladině, každý dávkovaná skupina byla nnrnvnína c nlapAham ^VlVinUílU lJ jjiuwuvuL· crnvnóni Ivwlo /ji/Aiicfronno c lilorltnzMV inSrmomnncfi ζΟΛ. \7 » JUV1 11114 uj 114 U- » U 14<J41 €41 11144 tJ IHUUiUUU » J 4^114411 11 IU J 41 1 JVVIHlj
P-hodnoty pocházely z výzkumných analýz a neměly by být použity pro deduktivní interpretaci.
Výsledky
Demografická situace:
Bylo získáno 36 pacientů s RA. Jejich demografické detaily jsou uvedeny v tabulce 6. Průměrný věk byl 56 let a 30 pacientů byly ženy. Průměrné trvání RA bylo 13 let a 21 pacientů mělo pozitivní revmatoidní faktor. Pacienti v odlišných skupinách měli podobné demografické charakteristiky. V období slepého dávkování 6/12 pacientů léčených placebem opustilo studii kvůli zhoršení RA > 4 týdny po začátku podávání dávky. 2/24 pacientů léčených CDP870 opustilo studii, oba ve skupině s dávkou 1 mg/kg, kvůli zhoršení RA/ztrátě pro další sledování > 4 týdny po začátku podávání dávky. Rozdíl byl statisticky významný (p=0,009, Fisherův přesný test).
Tabulka 6
Demografické detaily (průměr ± standardní odchylka)
Počet Pohlaví (M:Ž) Věk Trvání nemoci Revmatoidní faktor Počet dřívějáích DMARD
Placebo 12 1:11 5118 1218 8(67%) 511
1 mg/kg 8 1:7 5917 1217 4(0%) 411
5 mg/kg 3 2:6 54113 1315 5(63%) 512
20 mg/kg 3 2:6 61111 14113 4(50%) 412
-31 CZ 300737 B6
Klinická účinnost:
Podíl pacientů se zlepšením ACR20 ve skupinách podle jednotlivých protokolů s posledním prováděným sledováním byl 16,7, 50, 87,5 a 62,5% po placebu, 1, 5 a 20 mg/kg CDP870 (účinek kombinované léčby p=0,012) ve 4 týdnech a 16,7, 25, 75 a 75% (p=0,032) v 8 týdnech. Snížení skóre DAS (medián) ve skupinách podle jednotlivých protokolů s posledním prováděným sledováním bylo 0,15, 1,14, 1,91 a 1,95 po placebu, 1, 5 a 20 mg/kg CDP870 (účinek kombinované léčby p=0,00I) ve 4 týdnech a 0,31, 0,09, 2,09 a 1,76 (p=0,008) v 8 týdnech (obrázek 23). io Změny v jednotlivých složkách souboru dat podle Worid Health Organization a International
League of Associations for Rheumatology jsou ukázány na obrázku 24.
Po viditelně značené dávce CDP870 bylo dosaženo podobného prospěšného účinku. Ze 36 pacientů získaných do studie dostalo 32 pacientů druhou infuzi CDP870. Podíl pacientů se is zlepšením ACR20 oproti období před první infuzi bylo 72,2 a 55,6% po 5 a 20 mg/kg CDP870 ve 4 týdnech a 55,6 a 66,7% v 8 týdnech.
Výskyt vedlejších účinků
Léčba byla dobře snášena bez reakcí spojených s podáváním infúze. Nebyla hlášena žádná alergická reakce nebo kožní vyrážka. Ve dvojitě slepé fázi se vyskytlo 19, 38, 8 a 14 vedlejších účinků ve skupinách s placebem, 1, 5 a 20 mg/kg, v daném pořadí. Nejčastější byly bolesti hlavy s 9 epizodami u 5 pacientů (1 placebo, 3 ve skupině $ dávkou 1 mg/kg, 1 ve skupině s dávkou 20 mg/kg). U jednoho pacienta, který dostával placebo a u 3 pacientů, kteří dostali CDP870 (1 ve skupině s dávkou 5 mg/kg a 2 ve skupině s dávkou 20 mg/kg), se objevily infekce dolních cest dýchacích. Byly označeny jako lehké nebo mírné. Byly léčeny perorálními antibiotiky a vyléčeny v průběhu období 1 až 2 týdnů. U tří pacientů ve skupinách s dávkou 1 a 5 mg/kg a u jednoho ve skupině s dávkou 20 mg/kg se objevila infekce močových cest 1 až 2 měsíce po léčení CDP870. Jeden vedlejší účinek byl popsán jako vážný, byla to epizoda bolesti krční páteře, která se objevila 3 dny po infuzi s dávkou 1 mg/kg. U 4 pacientů bylo pozorováno zvýšení anti-nukleárních protilátek: u 1 ve skupině s placebem (negativní až 1/40), u 2 ve skupině s 1 mg/kg (negativní až 1/40, negativní až 1/80) a u 1 ve skupině 20 mg/kg (negativní až 1/40). Co se týče protilátek anti-DNA nebo anti-kardiolipinových protilátek, nebyla zjištěna žádná změna. Plazmatická koncentrace CDP870 a hladina anti-CDP870
Jak bylo očekáváno u všech dávek CDP870, vrcholové plazmatické koncentrace se vyskytovaly na konci infúze a byly proporcionální podávané dávce, přičemž plazmatická koncentrace poté pomalu klesala. Profily plazmatických koncentrací CDP870 vypadaly velmi podobně profilům, které byly dříve pozorovány u dobrovolníků, kdy bylo vypočteno, že biologický poločas je přibližně 14 dnů. Při opětovném podání dávky byl pozorován podobný profil jako u infúze jedné dávky.
Po jedné intravenózní infúzi byly hladiny anti-CDP870 nízké nebo nedetekovatelné.
Diskuse
Neutralizace TNFa je účinná léčebná strategie u RA. V současné době vyžaduje použití biologických přípravků, jako například chimérických mAb nebo fúzního proteinu rozpustný receptor/humánní Fc, které jsou pro výrobu drahé. Léčebný přípravek neutralizující TNFa potřebuje vázat TNFa s vysokou afinitou a musí mít dlouhý biologický poločas, nízkou antigeničnost a so vysokou snášenlivost a musí být bezpečný. Je také zapotřebí, aby byl přístupný pro všechny pacienty s RA, kteří by mohli mít prospěch z blokády TNFa. Jedna technika, která by mohla dosáhnout těchto cílů, je konjugace v E. coli vytvořeného protilátkového fragmentu vázajícího
TNFa s polyethylenglykolem. V této předběžné studii původci zjistili, že CDP870, PEGylovaná anti-TNFa modifikovaná Fab, je účinná a dobře snášena pacienty s RA.
LZ OWI/J/ bO
In vitro studie ukázaly, že CDP870 má podobnou TNFa neutralizující aktivitu k myším anti-TNFa parentálním protilátkám. Tato studie potvrdila, CDP870 redukoval zánět a zlepšil příznaky RA. Klinické zlepšení měřené podle kritérií ACR20 u skupin s dávkou 5 a 20 mg/kg (75%, 75%) byly srovnatelné s etanerceptem (60%) (Moreland a kol., Annals ínt. Med., 130,
478-486, 1999) a infliximabem (50%) (Maini a kot, Lancet, 354, 1932-1939, 1999). U středních a nejvyšších testovaných dávek trval léčebný účinek 8 týdnů, což je srovnatelné s jinými dosavadními mAb (Elliott a kot, Lancet, 344, 1105-1110, 1994 a Rankin a kot, Br. J. Rheumatof, 34, 334—342, 1995). Dřívější studie ukázala, že terapeutický účinek anti-TNFa protilátek je ve io vztahu k jejich plazmatickému poločasu a vytvoření cirkulujících protilátek (Maini a kot. Arthritis Rheum., 38 (doplněk): S186, 1995 (abstrakt)). Studie původců prokázala, že CDP870 má plazmatický poločas 14 dnů, což je ekvivalentní poločasu celé protilátky (Rankin a kot, (výše)) a mnohem déle než biologický poločas nekonjugovaných Fab' fragmentů. Dále CDP870 vyvolala pouze velmi nízké hladiny stupně protilátkové reakce.
Jedním z důležitých cílů této studie bylo prozkoumat toleranci a bezpečnost podávání tohoto PEGylovaného Fab'. Ve studii původců byla CDP870 dobře tolerována. Ale pro vyhodnocení dlouhodobé toxicity bude nutná další studie, zejména co se týče rizika demyelinizačního onemocnění, infekce a kožních vyrážek, které byly publikovány u léčení etanerceptem a infliximabem.
Úhrnem, CDP870 je terapeuticky účinná u RA, a v této krátkodobé studii byla dobře snášena.
Výše popsané příklady jsou uvedeny pouze jako ilustrativní příklady a neomezují rozsah předkládaného vynálezu, jak je definován následujícími patentovými nároky.
SEZNAM SEKVENCÍ <160> 115 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 35 <211>5 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRH1 <400> 1
Asp Tyr Gly Met Asn 1 5 <210>2 <211> 17 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence CDRH2 hTNF40/ Humánní hybrid <400> 2
33CZ 300737 B6
Trp lle Asn Thr Tyr lle Gly Glu Pro lle Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 3 <211>9 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRH3 o
<400>3
Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 15 <211>11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
hTNF40 CDRL1 <400> 4
Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 15 io <210>5 <211> 7 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 5
Ser Ala Ser Phe leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211>9 <212> PRT <213> Umělá sekvence 40 <220>
<223> Popis umělé sekvence:
hTNF40 CDRL2 hTNF40 CDRL3 <400> 6
Gin Gin Tyr Asn lle Tyr Pro Leu Thr
-Ί46.L JWtfJf DO <210 7 <211> 17 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 CDRH2 <400> 7
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 8 <211> 321 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <221>CDS <222> (1)..(321) <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40-gLl <400 8
gac att caa atg Asp Ile Gin Met 1 acc Thr 5 cag age cca tcc age ctg age gca tet gta gga 48
Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
gac egg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa gcc ctc atc 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
tac agt gcc tet ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc age gga 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt age ctc cag cca 240
Sex Gly Sex Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <2109 <211> 321
35CZ 5U0737 B6 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221>CDS <222> (1)..(321) <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40~gL2 <400> 9
gac att caa atg acc cag age cca tcc age 1 ctg age gca tet , gta gga 48
Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
gta gcc tgg tst cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ctc ctc atc 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac agt gcc tet ttc ctc tat agt ggt gta cca tac 2gg ttc age gga 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Giy Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt age ctc cag cca 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ue Tyr Pro Leu
85 90 95
aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210 10 <211>354 <2I2>DNA <213> Umělá sekvence <220 <221>CDS <222> (1)..(354) <220>
<223> Popis umělé sekvence: ghlhTNF40.4 (Figuře 10) <400 10
-36uu cag gtg cag ctg gtc cag tca gga gca gag gtt aag aag cct ggt gct 48
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
5 10 15 tcc gtc aaa gtt tcg tgt aag gcc tca ggc tac gtg ttc aca gac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys‘ Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thx Asp Tyr
25 30 ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
40 45 ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct caa aag ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro lle Tyr Ala Gin Lys Phe
cag Gin 65 50 ggc Gly aga gtc 55
acg ttc Thr Phe 70 act cta Thr Leu
Arg Val
atg gag ctg tca tet ctg aga tcc
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
85
gct aga gga tac aga tet tat gcc
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala
100
cta gtc aca gtc tcc tca
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
gac acc Asp Thr 60 tcc aca Ser Thr 75 age act gca tac Ser Thr Ala Tyr 80 240
gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
105 110
354 <210> 11 5 <211>354 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
io <221>CDS <222> (1)..(354) <220>
<223> Popis umělé sekvence:
gh3hTNF40.4(Figuře ll)
<400> 11
gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt ctc gtg cag cct ggc gga
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
tca ctg aga ttg tcc tgt gct gca tet ggt tac gtc ttc aca gac tat
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gga atg aat tgg gtt aga cag gcc ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct gac age gtc
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
144
192
-37CZ 300737 B6
240
aag Lys 65 ggc Gly aga ttc acg ttc tet cta gac aca tcc aag tca aca gca tac Tyr 80
Arg Phe Thr Phe 70 Ser Leu Asp Thr Ser Lys 75 Ser Thr Ala
ctc caa atg aat age ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gct aga gga tac aga tet tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc
288
336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 cta gtc aca gtc tcc tca
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
354
<210> 12 <211>9 <212> DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: Část sekvence primeru
<400> 12
gccgccacc
<210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: primer CH1
<400> 13
atgaaatgca gctgggtcat sttett
<210> 14
<211> 26
<212>DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: primer CH2
<400> 14
atgggatgga gctrtatcat sytett
<210> 15 <211>26 <212>DNA
- 3ít Vi JWIJI DV <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 15 atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt primer CH3 <210> 16 <211>21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
ís <223> Popis umělé sekvence:
<400> 16 atgractttg ggytcagctt grt <210> 17 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt <210> 18 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 18 40 atggctgtcy trgsgctrct cttctg <210> 19 <211> 25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 19 atggratgga gckggrtctt tratctt primer CH4 primer CHS primer CH6 primer CH7
-39CZ 300737 B6 <210> 20 <211> 23 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
io <400>20 atgagagtgc tgattctttt gtg <210> 21 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400 21 atggmttggg tgtggamctt gctatt <210> 22 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400 22 atgggcagac ttacattctc attcct <210>23 <211>28 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 23 atggattttg ggctgatttt ttttattg <21O> 24 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
primer CH8 primer CH9 primer CH10 primer CH11
-40ví, jvviji ου <223> Popis umělé sekvence:
<400> 24 atgatggtgt taagtcttct gtacct <210> 25 <211> 21 <212>DNA <213> Umělá sekvence ío <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 25 gcgcgcaagc ttgccgccac c 15 <210 26 <211> 29 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence:
<400> 26 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct primer CH 12 primer 5' end primer CL 1 <210 27 <211> 29 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence:
<400 27 atggagwcag acacactcct gytatgggt primer CL2 <210> 28 40 <211>23 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 28 atgagtgtgc tcactcaggt cct <210> 29 50 <211>26 primer CL3
-41 CZ 300737 B6 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 29 atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg primer CL4 io <210>30 <211> 29 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 30 atggatttwc aggtgcagat twtcagctt primer CL5 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400 31 atggatttwc argtgcagat twtcagctt <210> 32 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 32 atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg primer CL5A primer CL6 <210> 33 <211> 23 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: 50 <400> 33 primer CL7 .4? JVUIJ! UV atgggcwtca agatggagtc aca <210> 34 <211> 29 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 34 atgtggggay ctktttycinni tttttcaat primer CL8 <210> 35 15 <211>24 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 35 atggtrtccw casctcagtt cctt primer CL9 <210>36 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer CL 10 <4Q0> 36 atgtatatat gtttgttgtc tatttc <210> 37 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer CL 11 <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctctt <210> 38 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence
-43CZ 300737 B6 <220>
<223> Popis umělé sekvence;
<400> 38 atgragtywc agacccaggt cttyrt primer CL12A <210> 39 <211> 26 <212> DNA io <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400 39 atggagacac attctcaggt ctttgt primer CL12B <210> 40 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 40 atggattcac aggcccaggt tcttat primer CLI 3 <210> 41 <211>26 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 41 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtt <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400>42 atgaatttgc ctgttcatct cttggtgct <210> 43 <211> 29 primer CL 14 primer CLI 5
-44WV f U I VV <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 43 atggattttc aattgcrtcct catctcctt io <210>44 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 44 atgaggtgcc tarctsagtt cctgrg <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 45 atgaagtact ctgctcagtt tctagg <210>46 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 46 atgaggcatt ctcttcaatt cttggg <210> 47 <211> 21 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
<400> 47 primer CL 16 primer CL17A primer CL 17B primer CL 17C primer 5' end
-45CZ 300737 B6
ggactgttcg aagccgccac c
<210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: primer CLI2
<400> 48 ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt
<210> 49 <211> 37 <212>DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: primer R2155
<400 49 gcagatgggc ccttcgttga ggctgnirgag acdgtga
<210> 50 <211> 24 <212>DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: primer R1053
<400 50 gctgacagac taacagactg ttcc
<210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: primer R720
<400>51 gctctcggag gtgctcct
<210> 52 <211> 70 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
-46JVVtJf DO <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7982 <400> 52 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa cgtagcctgg 60 tatcagcaaa 70 <210> 53 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7983 <400> 53 atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt tttgctgata 60 ccaggctacg t 71 <210> 54 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P79B4 <400> 54 tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt 60 <210 55 <211> 71 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7985 <400> 55 gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg gtgaaatcag 60 taccactacc g 71 <210> 56 40 <211>89 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7986 <400> 56
-47CZ JWI737 B6 atttcgccac ttattactgt caacagtata ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc acatctaccc actcacattc ggtcagggta 60 89 <210> 57 <211> 30 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7981 io <400> 57 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc <210> 58 <211>30 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid P7980 <400> 58 gaattccgta cgtttgattt ctactttagt <210> 59 <211> 24 <212>DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid R1053
<400> 59 gctgaúagac taacagactg ttcc
<210> 60 <211> 57 <212>DNA <213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid R535O
<400> 60 tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc 57 <2t0> 61 <211> 59 <212>DNA <213> Umělá sekvence
-48fc/ W / fc/ I <220>
<223> Popis umělé sekvence:
oligonukíeotíd R5349 <400>61 gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac 59 <210> 62 <211> 18 to <212>DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: oligonukíeotíd R684 <400 62 ttcaactgct catcagat <210> 63 <211>65 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7989 <400> 63 gaagcaccag gcttcttaac ctctgctcct gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60 aattc 65 <2l0>64 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7990 <400> 64 ggttaagaag cctggtgctt ccgtcaaagt ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgttcac 60 agactatggt a 71 <210> 65 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
primer P7991 <400>65
-49CZ JWJ7J7 B6 ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60 tgtgaacacg t 7i <210> 66 <211> 81 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: primer P7995 io <400 66 ggcctgaaat ggatgggttg gattaatact tacattggag agcctattta tgttgacgac 60 ttcaagggca gattcacgtt c 81 <210> 67 <211>56 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7992 <400> 67 ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc cttgaa 56 <210>68 <211> 62 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7993 <400> 68 ccacaagcac tgcatacatg gagctgtcat ctctgagate cgaggacacc gcagtgtact 60 at 62 <210 69 <211> 78 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7994 <400> 69 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc -ig <210> 70 <211> 30
-50Vi UU <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7988 <400> 70 gaattcgtgc actctcaggt gcagctggtc 30 io <210>71 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7987 <400> 71 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat qn <210> 72 <211> 65 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umele sekvence: primer P7999 <400> 72 gatccgccag gctgcacgag accgcctcct gactcgacca gctgaacctc agagtgcacg 60 aattc <210> 73 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P8000 <400> 73 tqtcgtgcag cctggcggat cgctgagatt gtcctgtgct gcatctggtt acgtcttcac 60 agactatgga a 71 <210> 74 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P8001
-51 CZ 300737 B6 <400> 74 ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg tgtgaagacg t ggcctgctta acccaattca ttccatagtc 60 71 <210> 75 5 <211>55 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 io <223> Popis umělé sekvence: primer P7997 <400 75 ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta gagagaacgt gaatctgccc ttgaa 55 <210 76 <211> 62 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7998 <400> 76 ccaagtcaac agcatacctc caaatgaata gcctgagagc agaggacacc gcagtgtact 60 at 62 <210> 77 <211> 78 <2I2>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer P7993 <400> 77 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 7θ <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
primer P7996 <400> 78 gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc <210> 79
-52VL l tJ t DV <211> 74 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: 5' primer <400> 79 cgcgcggcaa ttgcagtggc cttggctggt ttcgetaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60 atgacccaga gccc 74 <210> 80 <21I> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: 3' primer <400> 80 ttcaactgct catcagatgg 20 <210> 81 <211> 78 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: 5' primer <400> 81 gctatcgcaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggttcag 60 ctggtcgagt caggaggc 78 <210> 82 <211> 18 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: 3' primer <400> 82 gcctgagttc cacgacac 18 <210> 83 <211> 23 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence rámce skupiny 1
-53CZ 300737 B6 <400> 83
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Sex Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Tle Thr Cys 20 <210> 84 <211>23 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
io <223> Popis umělé sekvence: HTNF40 rámec Ll <400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 20 <21O>85 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence L2 rámce skupiny 1 <400> 85
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec L2 <400> 86
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr 15 10 í5 <210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence L3 rámce skupiny 1
- 54JVV / f lj\j <400> 87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210>88 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec L3 <400> 88
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 is
Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 20 25 30 <21O> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
Pnnic nmňtá cpLvcopp· humánní VannnicVá cplcvcncc ί A rámce cknnínv 1 —“ * f'1“ -***-*- --*.............................. ...... ..... — . ----r ···./ · <400> 89
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 15 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec L4 35 <400> 90
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 15 10 <210> 91 40 <211>30 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence HI rámce skupiny 1
-55CZ 300737 B6 <400> 91
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
5 10 ‘ 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210>92 <211> 30 <2Í2> PRT <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec HI <400> 92
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr 20 25 30 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H2 rámce skupiny I <400> 93
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 25 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H2 <400> 94
Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly 15 10 <210> 95 <211> 32 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H3 rámce skupiny 1
-56<400 95
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
25 30 <210 96 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H3 <400 96
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gin 15 10 15
Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220> _ <223> Popis uméié sekvence: humánní kanonická sekvence H4 rámce skupiny 1 <400> 97
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: hTNF40 rámec H4 <400> 98
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 99 <211> 324 <212>DNA <213> myš <220>
<221>CDS
-57CL JUU/37 BO <222> (1)..(324) <223> variabilní doména lehkého řetězce myší hTNF40 <400> 99
gac att Asp Ile 1 gtg atg acc cag tet caa aaa Lys ttc atg tcc aca tea gta gga 48
Val Met Thr 5 Gin Ser Gin Phe 10 Met Ser Thr Ser Val 15 Gly
gac agg gtc age gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aat 96
Asp Arg Val Ser val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca aga caa tet cct aaa gca ctg att 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
tac tcg gca tcc ttc cta tat agt gga gtc cct tat ege ttc aca ggc 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly
50 55 60
agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc atc age act gtg cag tet 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser
65 70 75 80
gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac atc tat cct ctc 288
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn Tle Tyr Pro Leu
85 90 95
acg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt 324
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 <210> 100 <211> 354 <212> DNA io <213>myš <220>
<221>CDS <222> (1)..(3 54) <223> variabilní doména těžkého řetězce myší hTNF40 <400> 100
cag atc cag ttg gtg Gin Ile Gin Leu Val cag tet gga cct gag ctg aag aag cct gga gag Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 48
Gin Ser Gly Pro
1 5 10 15
aca gtc aag atc tcc tgc aag get tet gga tat gtt ttc aca gac tat 96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gga atg aat tgg gtg aag cag get cca gga aag get ttc aag tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met
35 40 45
ggc tgg ata aac acc tac att gga gag cca ata tat gtt gat gac ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe
50 55 60
-58S W f W f
aag gga ega ttt gcc ttc tet ttg gaa acc tet gcc age act ccc ttt 240
Lys Gly Arg 65 Phe Ala Phe 70 Ser Leu Glu Thr Ser Ala 75 Ser Thr Ala Phe 80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg get aca tat ttc tgt 288
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Aáp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
gca aga ggt tac cgg tcc tat get atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
tca g.tc acc gtc tet tca 354
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 101 <211> 84 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221>CDS ío <222> (29)..(67) <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotidový adaptor OmpA <400> 101 tcgagttcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca get atc gca att 52
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
5 gca gtg gcc ttg get ctgacgtacg agtcagg 84
Ala Val Ala Leu Ala <210> 102 <211> 67 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221>CDS <222> (2)..(40) <220>
<221>CDS <222> (43)..(66) <220>
<223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-1 <400> 102 g age tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt ta atg aag 48
-59CZ JUU737 B6
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 aag act gct ata gca att g 67
Lvs Thr Ala Ile Ala Ile <210> 103 <211> 69 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221>CDS io <222> (2)..(43) <220>
<221>CDS <222> (45)..(68) <220>
<223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-2 <400> 103 egc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga ggg gag tgt taa a atg 47
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Met 1 5 10 15 aag aag act gct ata gca att g βθ
Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile <210> 104 <211> 81 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221>CDS <222> (2)..(43) <220>
<221>CDS <222> (57)..(80) <220>
<223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta~3 <400> 104 g agc tca cca gta aca aaa agc ttt aat aga gga gag tgt tga Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly qiu cy3
10 ggaggaaaaa aaa atg aag aaa act gct ata gca att g Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala ile
-60<210> 105 <211> 81 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221>CDS <222> (2). .(43) io <220>
<221>CDS <222> (57)..(80) <220>
<223> Popis umělé sekvence: IGS kazeta-4 <400> 105 g age tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt tga 43
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
10 egaggattat ata atg aag aaa act gct ata gca att g 81
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
20 <210> 106 <211> 30 <212> PRT
-Μ 1 VÍIIVIU * VilV* <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence Hl rámce skupiny 3 <400> 106
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Pha Ser 20 25 30 <210> 107 <211> 13 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H2 rámce skupiny 3 <400> 107
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10
-61 CZ 300737 B6 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H3 rámce skupiny 3 <400> 108
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg <210> 109 <211> 11 <212> PRT is <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: humánní kanonická sekvence H4 rámce skupiny 3 <400> 109
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 110 <211> 648 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Roubovaný těžký řetězec pro Fab <400> 110 gaggttcagc tagtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctga gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctaeagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagtt 648 <210>lll <211> 216 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
-62fcP W / fcF / U\J <223> Roubovaný těžký řetězec pro Fab
<400> 111 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 <210>U2 <211> 642 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Roubovaný lehký řetězec pro Fab a modifikovaný Fab <400> 112
-63CZ 300737 B6 gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga Ccgggtcacc 60 atcscttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 ggtaaagccc caaaagccct catctacagt gcctctttcc tctatagtgg tgtaccatac 180 aggttcagcg gatccggtag tggtactgat ttcaccctca cgatcagtag cctccagcca 240 gaagatttcg ccacttatta ctgtcaacag tataacstct acccactcac attcggtcag 300 ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttúat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt ¢42 <210> 113 <211> 214 <212>PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Roubovaný lehký řetězec pro Fab a modifikovaný Fab <400> 113
Asp 1 lle Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu lle
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn lle Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
-64165
170
175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyt Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 114 <211> 687 s <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Roubovaný těžký řetězec pro modifikovaný Fab io <400> 114 gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg 687 <210> 115 15 <211> 229 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Roubovaný těžký řetězec pro modifikovaný Fab <400> 115
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tip Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
-65CZ 300737 B6
Leu Gin Ϊ/Λ ** Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Ala Ala 225

Claims (12)

  1. 5 PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec a těžký řetězec, kde tento lehký řetězec obsahuje variabilní úsek lehkého řetězce hTNF40-gLl io (SEKV. ID. C. 8) a těžký řetězec obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce gh3hTNF40.4 (SEKV. ID.Č. 11).
  2. 2. Molekula protilátky specifická pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec obsahující sekvenci uvedenou zde
    15 jako SEKV. ID.Č. 115.
  3. 3. Sloučenina obsahující molekulu protilátky specifické pro humánní TNFa, která obsahuje lehký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 113 a těžký řetězec tvořený sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 115, mající na jednom ze svých cysteinových zbytků
    20 na C-konci těžkého řetězce navázanou skupinu odvozenou z lysyl-maleinimidové skupiny, kde každá ze dvou aminových skupin lysylových zbytků má kovalentně navázaný methoxypoly(ethyíenglykol)ový zbytek o molekulové hmotnosti asi 20 000 Da, každý v aminoskupině lysylu, přičemž celková molekulová hmotnost methoxypoly(ethylenglykoi)ových zbytků je asi 40 000 Da.
  4. 4. Sloučenina podle nároku 3, kde skupinou odvozenou od lysyl-maleinimidové skupiny je [l-[[[2-[[3-(2,5-dÍoxo-l-pynOlidynyl)-l-oxopropyl]amino]ethyl]amino]karbonyl]-l,5pentandiyl]bis(iminokarbonyl).
    -66ť W I i_fV
  5. 5, Sloučenina obsahující molekulu protilátky podle nároku 2, mající vzorec:
  6. 6. Sekvence DNA kódující téžký a/nebo lehký řetězec molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
  7. 7. Klonovací nebo expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 6. io
  8. 8. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 7.
  9. 9. Způsob přípravy molekuly protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje hostitelská buňka podle nároku8 a izoluje se
    15 molekula protilátky.
  10. 10. Terapeutická nebo diagnostická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu protilátky podle nároku 1 nebo 2 nebo sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5 se spojení s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou.
  11. 11. Molekula protilátky podle nároku 1 nebo podle nároku 2 nebo sloučenina podle nároků 3 až 5 pro použití v terapii.
  12. 12. Použití molekuly protilátky podle nároku 1 nebo podle nároku 2 nebo sloučeniny podle 25 kteréhokoliv z nároků 3 až 5 pro výrobu léčiva pro léčení revmatoidní artritidy, osteoartritidy,
    Crohnovy nemoci nebo psoriázy.
CZ20020837A 2000-06-06 2001-06-05 Molekula protilátky specifická pro humánní TNFalfa, sloucenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití mo CZ300737B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2002837A3 CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
CZ300737B6 true CZ300737B6 (cs) 2009-07-29

Family

ID=9893121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20020837A CZ300737B6 (cs) 2000-06-06 2001-06-05 Molekula protilátky specifická pro humánní TNFalfa, sloucenina obsahující molekulu protilátky, sekvence DNA, klonovací nebo expresní vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy molekuly protilátky, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití mo

Country Status (43)

Country Link
US (4) US7012135B2 (cs)
EP (4) EP2230308B1 (cs)
JP (3) JP4064812B2 (cs)
KR (1) KR20020047097A (cs)
CN (1) CN1289671C (cs)
AP (1) AP2092A (cs)
AR (1) AR033978A1 (cs)
AT (1) ATE451460T1 (cs)
AU (1) AU783756B2 (cs)
BE (1) BE2010C019I2 (cs)
BG (1) BG66072B1 (cs)
BR (2) BR0106682A (cs)
CA (2) CA2707766C (cs)
CY (6) CY1109889T1 (cs)
CZ (1) CZ300737B6 (cs)
DE (3) DE122010000027I1 (cs)
DK (4) DK2230308T3 (cs)
EC (1) ECSP024210A (cs)
ES (5) ES2600080T3 (cs)
FR (1) FR10C0015I2 (cs)
GB (2) GB0013810D0 (cs)
HK (2) HK1051385A1 (cs)
HU (4) HU230561B1 (cs)
IL (3) IL147992A0 (cs)
IS (2) IS2808B (cs)
LT (1) LT2308975T (cs)
LU (1) LU91674I2 (cs)
MX (1) MXPA01013440A (cs)
MY (1) MY136603A (cs)
NL (1) NL300982I9 (cs)
NO (4) NO334808B1 (cs)
NZ (1) NZ516596A (cs)
OA (1) OA12282A (cs)
PE (1) PE20020292A1 (cs)
PL (2) PL212738B1 (cs)
PT (4) PT1287140E (cs)
RU (1) RU2303604C2 (cs)
SI (3) SI2230308T1 (cs)
SK (1) SK288343B6 (cs)
TR (1) TR201900227T4 (cs)
TW (2) TWI316088B (cs)
WO (1) WO2001094585A1 (cs)
ZA (1) ZA200200097B (cs)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2817619A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
WO2003080674A1 (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Pharmacia Corporation Antibody disulfide isomers, use thereof, and methods of analyzing same
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
SG187991A1 (en) 2002-05-02 2013-03-28 Wyeth Corp Calicheamicin derivative-carrier conjugates
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1534753B1 (en) 2002-05-28 2011-08-03 UCB Pharma, S.A. Peg positional isomer of an anti-tnfalpha antibody (cdp870)
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
CA2800126A1 (en) * 2002-07-19 2004-01-29 Abbott Biotechnology Ltd. Treatment of tnf.alpha. related disorders
US20040247588A1 (en) * 2002-08-28 2004-12-09 Johnson Robert E. Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US20040091490A1 (en) * 2002-08-28 2004-05-13 Robert Johnson Stable pH optimized formulation of a modified antibody
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
US20070010658A1 (en) 2002-10-29 2007-01-11 Holtet Thor L Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US7575893B2 (en) * 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1597299A2 (en) * 2003-02-19 2005-11-23 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
SI1639011T1 (sl) * 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
SI1656455T1 (sl) * 2003-08-13 2012-12-31 Sandoz Ag Postopek za čiščenje rekombinantnih polipeptidov
US7785830B2 (en) * 2003-08-13 2010-08-31 Sandoz Ag Expression vectors, transformed host cells and fermentation process for the production of recombinant polypeptides
GB0319601D0 (en) * 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2006062776A2 (en) * 2004-11-29 2006-06-15 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
JP4642862B2 (ja) * 2004-12-29 2011-03-02 ユーハン・コーポレイション ヒト腫瘍壊死因子−アルファに特異的なヒト化抗体
TWI399384B (zh) * 2005-05-16 2013-06-21 Abbott Biotech Ltd ＴＮＦα抑制劑於治療侵蝕型多發性關節炎之用途
RU2425054C2 (ru) * 2005-06-01 2011-07-27 Микромет Аг Антитела против il2
PT2390267E (pt) 2005-06-07 2013-07-16 Esbatech A Novartis Co Llc Anticorpos estáveis e solúveis que inibem tnf(alfa)
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
JP2009533347A (ja) * 2006-04-07 2009-09-17 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 抗ＴＮＦα抗体の複合体
EP2666472A3 (en) * 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
AU2007269714A1 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CA2678367C (en) * 2007-03-02 2014-07-08 Farnam Companies, Inc. Sustained release compositions using wax-like materials
WO2008153997A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-18 Brookwood Pharmaceuticals, Inc. Reduced-mass, long-acting dosage forms
WO2008154543A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
BRPI0907485A2 (pt) * 2008-02-05 2015-08-04 Delenex Therapeutics Ag Polipeptídeos de ligação a antígeno contra degeneração de cartilagem
BRPI0912570B8 (pt) * 2008-05-07 2021-05-25 Argos Therapeutics Inc anticorpo anti-ifn-alfa humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição terapêutica e seus usos
SI2307457T2 (sl) * 2008-06-25 2022-10-28 Novartis Ag Stabilna in topna protitelesa, ki inhibirajo TNF
PL2752428T3 (pl) 2008-06-25 2020-05-18 Novartis Ag Humanizowanie przeciwciał króliczych z zastosowaniem uniwersalnego zrębu przeciwciała
ES2890405T3 (es) 2008-06-25 2022-01-19 Novartis Ag Humanización de anticuerpos de conejo usando un armazón de anticuerpo universal
CA3020290A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting vegf
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
CA2749966A1 (en) * 2009-01-29 2010-08-05 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US9150640B2 (en) 2009-07-10 2015-10-06 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
CN102575241B (zh) 2009-09-24 2016-02-24 Ucb医药有限公司 细菌宿主菌株
CN104447996A (zh) 2009-10-23 2015-03-25 米伦纽姆医药公司 抗gcc抗体分子及其相关组合物和方法
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201001791D0 (en) 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
AU2011223547B2 (en) 2010-03-04 2016-05-05 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD52
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
KR20150038556A (ko) 2010-04-07 2015-04-08 애브비 인코포레이티드 ＴＮＦ-α 결합 단백질
GB201012603D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012599D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
UY33679A (es) 2010-10-22 2012-03-30 Esbatech Anticuerpos estables y solubles
BR112013030824A8 (pt) 2011-06-01 2018-04-03 Actogenix Nv Bactéria gram-positiva, ácido necleico recombinante, composição farmacêutica e vetor
KR102023786B1 (ko) 2011-07-13 2019-09-20 유씨비 파마, 에스.에이. 재조합 dsbc를 발현하는 세균 숙주 균주
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
ES2676270T3 (es) 2011-09-23 2018-07-18 Intrexon Actobiotics Nv Bacterias grampositivas modificadas y usos de éstas
ES2676707T3 (es) 2011-09-23 2018-07-24 Intrexon Actobiotics Nv Bacterias gram positivas modificadas y usos de las mismas
WO2013087911A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
CN104520328B (zh) 2012-08-13 2019-06-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗锯齿蛋白抗体及使用方法
JP2017518737A (ja) 2014-04-21 2017-07-13 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＳＹＫ標的治療薬のための抗ｐＳＹＫ抗体分子及びその使用
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
EP3237433A1 (en) 2014-12-22 2017-11-01 UCB Biopharma SPRL Method of protein manufacture
US11091559B2 (en) 2015-08-27 2021-08-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ALK antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
DK3402499T3 (da) 2016-01-14 2021-09-27 Intrexon Actobiotics Nv Sammensætninger og fremgangsmåder til behandlingen af type 1 diabetes
RU2680011C2 (ru) * 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
DK3464318T3 (da) * 2016-06-02 2021-06-28 Abbvie Inc Glucocorticoidreceptoragonist og immunkonjugater deraf
RS61994B1 (sr) 2017-12-01 2021-07-30 Abbvie Inc Agonist glukokortikoidnog receptora i njegovi imunokonjugati
KR20210122243A (ko) 2019-01-31 2021-10-08 누맙 세러퓨틱스 아게 ＴＮＦα 및 ＩＬ-17Ａ에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체, ＩＬ-17Ａ를 표적화하는 항체, 그리고 이의 사용 방법
KR102323342B1 (ko) * 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
KR20230146032A (ko) 2021-02-15 2023-10-18 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Tgf-b 신호전달을 조절하기 위한 세포 치료 조성물 및 방법
WO2023025248A1 (zh) 2021-08-26 2023-03-02 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
JP2024534603A (ja) 2021-09-24 2024-09-20 エックスブレイン バイオファーマ エービー 組換えタンパク質を発現させるためのｄｎａ構築物及び宿主細胞
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
WO2024180518A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0380068A1 (en) * 1989-01-24 1990-08-01 Miles Inc. An expression system for production of chimeric monoclonal antibodies
WO1992011383A1 (en) * 1990-12-21 1992-07-09 Celltech Limited RECOMBINANT ANTIBODIES SPECIFIC FOR TNF$g(a)
WO1998025971A1 (en) * 1996-12-10 1998-06-18 Celltech Therapeutics Limited Monovalent antibody fragments
WO1999064460A1 (en) * 1998-06-10 1999-12-16 Celltech Therapeutics Limited Divalent antibody fragments

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
EP0871641A4 (en) 1995-04-20 2001-09-26 Kennedy Inst Of Rheumatology MULTIPLE ADMINISTRATION OF ANTI-TNF ANTIBODIES
BRPI9715219B8 (pt) 1996-02-09 2015-07-07 Abbvie Biotechnology Ltd Vetor recombinante de expressão, e célula hospedeira procariótica.
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
EP1015480A2 (en) * 1997-08-18 2000-07-05 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CA2323048C (en) 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0380068A1 (en) * 1989-01-24 1990-08-01 Miles Inc. An expression system for production of chimeric monoclonal antibodies
WO1992011383A1 (en) * 1990-12-21 1992-07-09 Celltech Limited RECOMBINANT ANTIBODIES SPECIFIC FOR TNF$g(a)
WO1998025971A1 (en) * 1996-12-10 1998-06-18 Celltech Therapeutics Limited Monovalent antibody fragments
WO1999064460A1 (en) * 1998-06-10 1999-12-16 Celltech Therapeutics Limited Divalent antibody fragments

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Stephens S. et al.: "Comprehensive pharmacokinetics of a humanized antibody and analysis of residual anti-idiotypic responses", Immunology, vol. 85, no. 4, 668-674, 1995 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20131316L (no) 2002-04-08
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
PT1287140E (pt) 2010-03-08
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
NO341218B1 (no) 2017-09-11
BG66072B1 (bg) 2011-01-31
IL195085A0 (en) 2009-08-03
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
TWI316088B (en) 2009-10-21
MY136603A (en) 2008-10-31
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
NO339282B1 (no) 2016-11-21
NZ516596A (en) 2004-07-30
NO334808B1 (no) 2014-06-02
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
IS3016B (is) 2019-10-15
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
LU91674I9 (cs) 2019-01-03
CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
HUP1600483A2 (cs) 2002-10-28
ECSP024210A (es) 2002-05-23
GB2366800A (en) 2002-03-20
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
PT2230308E (pt) 2013-05-03
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
TWI353358B (en) 2011-12-01
IL147992A0 (en) 2002-09-12
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
BE2010C019I2 (cs) 2020-08-20
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
IS6217A (is) 2002-01-03
US7186820B2 (en) 2007-03-06
IS2808B (is) 2012-09-15
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
BR0106682A (pt) 2002-05-14
US7402662B2 (en) 2008-07-22
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
IL147992A (en) 2009-06-15
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
CA2380298C (en) 2010-09-28
NO20020554L (no) 2002-04-08
PL353960A1 (en) 2003-12-15
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
NL300982I1 (cs) 2019-05-01
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
DE60140738D1 (de) 2010-01-21
GB2366800B (en) 2005-01-19
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
PT3059314T (pt) 2019-02-01
LT2308975T (lt) 2016-11-10
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
ZA200200097B (en) 2003-01-06
US7012135B2 (en) 2006-03-14
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
PL212738B1 (pl) 2012-11-30
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
CN1383450A (zh) 2002-12-04
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
FR10C0015I1 (cs) 2010-04-16
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
OA12282A (en) 2006-05-11
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17
AP2092A (en) 2010-02-28
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
TW200817430A (en) 2008-04-16
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
AR033978A1 (es) 2004-01-21
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
US7977464B2 (en) 2011-07-12
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
PT2308975T (pt) 2016-11-14
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
CN1289671C (zh) 2006-12-13
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
PL218516B1 (pl) 2014-12-31
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
HU230561B1 (hu) 2016-12-28
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
BG106278A (bg) 2002-12-29
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
AU783756B2 (en) 2005-12-01
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
AU6051101A (en) 2001-12-17
CA2707766C (en) 2013-05-21
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
PL399351A1 (pl) 2012-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2380298C (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
SK288706B6 (sk) Molekuly protilátky, ktoré sú špecifické pre humánny nádorový nekrotický faktor alfa a ich použitie

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20241006