BG66072B1 - Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване - Google Patents

Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване Download PDF

Info

Publication number
BG66072B1
BG66072B1 BG106278A BG10627802A BG66072B1 BG 66072 B1 BG66072 B1 BG 66072B1 BG 106278 A BG106278 A BG 106278A BG 10627802 A BG10627802 A BG 10627802A BG 66072 B1 BG66072 B1 BG 66072B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
seq
antibody
antibody molecule
light chain
heavy chain
Prior art date
Application number
BG106278A
Other languages
English (en)
Other versions
BG106278A (bg
Inventor
Diljeet ATHWAL
Derek Brown
Andrew WEIR
Andrew POPPLEWELL
Andrew Chapman
David King
Original Assignee
Celltech R&D Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG66072(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Celltech R&D Limited filed Critical Celltech R&D Limited
Publication of BG106278A publication Critical patent/BG106278A/bg
Publication of BG66072B1 publication Critical patent/BG66072B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до молекули на антитела, съдържащи най-малко една CDR производна или мише моноклонално антитяло, имащи специфичност към човешки TNFалфа, до CDR присадено антитяло, където най-малко една от CDRs е хибридна CDR. Изобретението се отнася и до ДНК последователности, кодиращи веригите на молекулите на антитела, до вектори, до трансформирани клетки гостоприемници, до използванетона молекулите на антитела при лечението на заболявания, медиирани чрез TNFалфа.

Description

Настоящото изобретение се отнася до молекули на антитела, имащи специфичност към антигенни детерминанти на човешки туморен некрозис фактор алфа (1Ъ1Еалфа). Настоящото изобретение се отнася, също така, до терапевтичното използване на молекулите на антитела, и методи за получаване на молекулите на антитела.
Предшестващо състояние на техниката
Изобретението се отнася до молекули на антитела. В молекулата на антитяло, има две тежки вериги, и две леки вериги. Всяка тежка верига и всяка лека верига има на нейния Nтерминален край променлив домен. Всеки променлив домен се състои от четири рамкирани области (FRs), редуващи се с три комплементарно детерминантни области (CDRs). Остатъците в променливите домени се номерират конвенционално съгласно системата, създадена от Rabat et al., 1987 г., в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (тук по-надолу наричан “Rabat et al. (supra)”). Тази система за номериране се използва в настоящото описание, освен в случаите, когато се посочва друго.
Означенията на остатъка на Rabat не винаги съответстват директно на линейното номериране на амино киселинните остатъци. Действителната линейна амино киселинна последователност може да съдържа по-малко, или повече амино киселини, отколкото в стриктното номериране на Rabat, отговаряйки на скъсяването на, или вмъкването в основната структура на променливия домен, на структурни компоненти, било рамки, било CDR. Точното номериране на Rabat на остатъците за дадено антитяло може да се определи чрез хомоложен ред на остатъци в последователност на анти-тялото със “стандартна” последователност, номерирана по Rabat.
CDRs на тежката верига на променлива област са локализирани при остатъци 31-35 (CDRH1), остатъци 50 - 65 (CDRH2), и остатъци 95 - 102 (CDRH3), съгласно номерирането по Rabat.
CDRs на леката верига на променлива област са локализирани при остатъци 24 - 34 (CDRL1), остатъци 50 - 56 (CDRL2), и остатъци 89 - 97 (CDRL3), съгласно номерирането по Rabat.
Конструкцията на CDR-присадени антитела се описва в ЕР-А-0239400, който описва метод, по който CDRs на мише моноклонално антитяло се присажда върху рамкираните области на променливите домени на човешки имуноглобулин, посредством сайт насочена мутагенеза, използвайки дълги олигонуклеотиди. CDRs определят антиген свързващата специфичност на антителата, и са относително къси пептидни последователности, носени от рамковите области на променливите домени.
Последната работа върху хуманизирани моноклонални антитела чрез CDR-присаждане е осъществена върху моноклонални антитела, разпознаващи синтетични антигени, такива като NR Обаче, примери, в които мише моноклонално антитяло, разпознаващо лизозим и моноклонално антитяло от плъх, разпознаващо антиген на човешки Т-клетки, са хуманизирани чрез CDRприсаждане, са описани от Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534 - 1536, 1988), и Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), съответно.
Riechmann et al. смятат, че трансфера на CDRs единствено (както е дефинирано от Rabat (Rabat et al. (supra) и Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) не е достатъчен, за да осигури задоволителна антиген свързваща активност в CDR-присадения продукт. Установено е, че голям брой от рамкирани остатъци трябва да са били изменени, така че те съответстват на тези от рамковата област на донора. Предложените критерии за това, как да се избере кои от рамкираните остатъци имат нужда да бъдат променени, са описани в WO 1990/007861.
Доста статии, дискутиращи CDRприсадени антитела бяха публикувани, включително Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
TNFалфа е провъзпалителен цитокин, който се освобождава от, и взаимодейства с клетки от имунната система. Така, Т№алфа се освобождава от макрофаги, които са били
66072 Bl активирани посредством липополизахариди (LPS) на грам отрицателни бактерии. Като такъв, ТИБалфа изглежда, че се явява като ендогенен медиатор от централна величина, включен в развитието и патогенезиса на ендотоксичен шок, свързан с бактериален сепсис. ТМБалфа също така е показал, че е ир-регулиран в много от заболяванията на човека, включително хронични заболявания, такива като ревматоиден артрит, болестта на Крон, язвеноподобни колити и мултиплена склероза. Мишки, трансгенни за човешки ТОБалфа, продуцират високи нива на ЮТалфа в основни линии, и развиват спонтанни, деструктивни полиартрити, наподобяващи ревматоиден артрит (Kaffer et al., EMBP J., 10, 4025-4031, 1991). Поради това ТИБалфа се смята за провъзпалителен цитокин.
Моноклонални антитела срещу ТМБалфа бяха описани в предшестващото състояние на техниката. Medgar et al., (Hybridoma, 6,305-311, 1987) описва миши моноклонални антитела срещу рекомбинантен ЮТалфа. Fendly et al., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987), описва използването на миши моноклонални антитела срещу рекомбинантен ТИБалфа при дефиниране на неутрализиращи епитопи на ТИРалфа. Shimamoto et al., (Immunology Letters, 17, 311318, 1988) описва използването на миши моноклонални антитела срещу рекомбинантен TNFraMa, и тяхното използване за предотвратяване на ендотоксичен шок при мишки. Освен това, в International Patent Application WO 1992/011383, са описани антитела, включително CDR-присадени антитела, специфични за ТМБалфа. Rankin et al., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995), описват използването на такива CDR-присадени антитела при лечението на ревматоиден артрит. US-A-5 919 452 описва анти-TNF химерни антитела и тяхното използване при лечение на патологични случаи, свързани с наличието на TNF.
Антитела на ТМБалфа са предложени за профилактика и лечение на ендотоксичен шок (Beulter et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et al., (Critical Care Medicine, 21, S446-, 1993) и Wherry et al., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) описват лечебната сила на анти-ТМБалфа антитела при лечението на септичен шок. Използването на анти-TNFалфа антитела при лечението на септичен шок също така е описано от Krischenbaum et al., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Артрит, индуциран от колаген, може да се лекува ефикасно, използвайки анти-ТМБалфа моноклонално антитяло (Williams et al. (PNASUSA, 89, 9784-9788, 1992)).
Повишени нива на TNFалфа са намерени и в синувиалната течност, и в периферната кръв на пациенти, страдащи от ревматоиден артрит. Когато ТМБалфа блокиращи средства се прилагат на пациенти, страдащи от ревматоиден артрит; те намаляват възпалението, подобряват симптоматиката, и забавят уврежданията на ставата (Artritis Rheum., 42,1204-1208,1999).
Използването на анти-TNFалфа антитела при лечението на ревматоиден артрит и болестта на Крон е описано във Feldman et al., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al., (Trends in Immunology Today, 18,209-211,1997), и във Feldman et al., Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Антителата за ТМБалфа, използвани при такива лечения обикновено са химерни антитела, такива като тези, описани в US-A-5 919 452.
Два продукта, блокиращи ТМБалфа, са лицензирани понастоящем за лечение на ревматоиден артрит. Първият, наречен етанерсепт (etanercept), се продава от Immunen Corporation като Enbrel™. Той е рекомбинантен слят протеин, съдържащ две р75 разтворими области на TNFрецептора, свързани към Fc протона на човешки имуноглобулин. Вторият, наречен инфликсимаб (infliximab), се продава от Centocor Corporation като Ремикад™ (Remicade™). Той е химерно антитяло, имащо миши анти-ТИБалфа променливи области, и човешки IgGl константни области.
В предшестващото състояние на техниката рекомбинантните анти-ТМРалфа молекули на антитела обикновено имат намален афинитет към ТМБалфа, в сравнение с антителата, от които произлизат променливите области, или CDRs, обикновено се продуцират в клетки на бозайник, и са скъпи за производство. Анти-ТМРалфа на антитела в предшестващото състояние на техниката са описани в Stephens et al., Immunflfgy, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 и GB-A-2-297 145.
6№П Bl
Техническа същност на изобретението
Има необходимост от молекула на антитяло за лечение на хронични възпалителни заболявания, която може да се използва с повторяемост, и да се получава лесно и резултатно. Има необходимост, също така, от молекула на антитяло, която има голям афинитет към ТИРалфа, и ниска имуногеничност при човека.
По първия аспект, настоящото изобретение предоставя молекула на антитяло, която има специфичност към ТОТалфа, съдържайки тежка верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Rabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като Н1 на фигура 3 (SEQ ID NO: 1) за CDRH1, като Н2' на фигура 3 (SEQ ID NO: 2), или като Н2 на фигура 3 (SEQ ID NO: 7) за CDRH2, или като НЗ на фигура 3 (SEQ ID NO: 3) за CDRH3.
Молекулата на антитяло по първия аспект на настоящото изобретение съдържа най-малко една CDR, избрана от групата, състояща се от Hl, Н2', или Н2 и НЗ (SEQ IDNO: 1; SEQ IDNO: 2 или SEQ ID NO: Ί и SEQ ID NO: 3), за променливата област на тежката верига. За предпочитане, молекулата на антитяло съдържа най-малко две, или повече, за предпочитане всичките три CDRs в тежката верига на променливата област.
Във втория аспект на настоящото изобретение, се предоставя молекула на антитяло, която има специфичност към човешки Т№алфа, съдържайки лека верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Rabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като L1 на фигура 3 (SEQ ID NO: 4) за CDRL1, като L2 на фигура 3 (SEQ ID N0: 5) за CDRL2, или като L3 на фигура 3 (SEQ ID N0:6) 3aCDRB3.
Молекулата на антитяло във втория аспект на настоящото изобретение съдържа най-малко една CDR, избрана от групата, състояща се от LI, L2 и L3 (SEQ ID N0: 4 до SEQ ID N0:6) за леката верига на променливата област. За предпочитане, молекулата на антитялото съдържа най-малко две, или повече, за предпочитане всичките три CDRs в променливия домен на леката верига.
Молекулите на антитяло в първия и във втория аспект на настоящото изобретение за предпочитане имат комплементарна лека верига, или комплементарна тежка верига, съответно.
За предпочитане, молекулата на антитяло в първия и във втория аспект на настоящото изобретение съдържа тежка верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Rabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като Н1 на фигура 3 (SEQ ID NO: 1) за CDRH1, като Н2’ или като Н2 на фигура 3 (SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0: 7) за CDRH2, или като НЗ на фигура 3 (SEQ ID N0: 3) за CDRH3, и лека верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Rabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като L1 на фигура 3 (SEQ ID N0:4) за CDRL1, като L2 на фигура 3 (SEQ ID N0: 5) за CDRL2, или като L3 на фигура 3 (SEQ ID N0: 6) за CDRB3.
CDRs, дадени в SEQ IDS NOS: 1 и 3 до 7, и на фигура 3, отнасящи се до горното, са производни на моноклонално антитяло hTNF40 на мишка. Обаче, SEQ ID N0: 2 се състои от хибридна CDR. Хибридната CDR съдържа част от тежката верига CDR2 на мише моноклонално антитяло hTNF40 (SEQ ID NO: 7) и част от тежката верига от CDR2 на човешка група 3 зародишна линия последователност на V област.
Пълните последователности на променливите области на мише hTNF40 антитяло са показани на фигура 6 (лека верига) (SEQ ID N0: 99) и на фигура 7 (тежка верига) (SEQ ID N0:100). Това мише антитяло по-долу се приема като “донорното антитяло”.
Първи алтернативно предпочитан вариант на първия, или на втория аспект на настоящото изобретение е моноклонално мише антитяло hTNF40, имащо последователности на променливия домен на леката и на тежката верига, показани на фигура 6 (SEQ ID N0: 99), и на фигура 7 (SEQ ID N0: 100), съответно. Константната област на леката верига на hlNF40 е капа, а константната област на тежката верига е IgG2a.
Във втория алтернативно предпочитан вариант, антитялото съгласно, било първия, било втория аспект на настоящото изобретение, е химерна молекула на мише/човешко антитяло, приемано тук като химерна молекула на hTNF40 антитяло. Химерната молекула на антитяло
66072 Bl съдържа променливи области на мише моноклонално антитяло hTNF40 (SEQ ID NO: 99 и 100), и човешки константни области. За предпочитане, химерната молекула на антитяло hINF40 съдържа човешка С капа област (Hieter et al., Cell., 22, 197-207, 1980; Genebank accession number J00241) в леката верига, и човешките гама 4 области (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982), в тежката верига.
В трети алтернативно предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение, антитялото, било съгласно първия, било съгласно втория аспект на настоящото изобретение, е CDR-присадена молекула на антитяло. Терминът “CDR-присадена молекула на антитяло”, така, както се използва тук, се отнася до молекула на антитяло, където тежката и/или леката верига съдържа една, или повече CDRs (включително, при избор, хибридна CDR) от антитялото донор (например, мише моноклонално антитяло) присадено в рамката на променливата област на тежката и/или леката верига (например човешко антитяло).
За предпочитане, такова CDR-присадено антитяло има променлива област, съдържаща рамкови области на човешки приемник, така както и една, или повече от CDRs на донора, посочени по-горе.
Когато CDRs са присадени, която и да е приемлива рамкирана последователност на променлива област на приемника може да се използва, имаща отношение към класа/вида на антитялото на донора, от който произлизат CDRs, включително миши рамкирани области, рамкирани области на примат, или на човек. Примери за рамки на човек, които могат да се използват в настоящото изобретение, са KOL, NEWM, REI, EU, TLJR, ΊΈΙ, LAY и РОМ Rabat et al. (supra)). Например, KOL и NEWM могат да се използват за тежката верига, REI може да се използва за леката верига, a EU, LAY и РОМ могат да се използват за двете, и за тежката верига, и за леката верига. Предпочитаните рамкирани области за леката верига са рамкираните области на човешка група 1, показани на фигура 1 (SEQ ID NO: 83, 85, 87 и 89). Предпочитаните рамкирани области за тежката верига са рамкираните области на човешка група 1 и група 3, показани на фигура 2 (SEQ ID N0: 91, 93, 95 и 97, и SEQ ID N0:
106, 107, 108 и 109), съответно.
В CDR-присадено антитяло на настоящото изобретение, за предпочитане е като антитяло приемник да се използва такова, имащо вериги, които са хомолози на веригите на антитялото на донора. Не е необходимо тежката и леката верига на приемника да бъдат непременно производни на същото антитяло, и могат, при желание, да съдържат вериги, имащи рамкирани области, производни на различни вериги.
Също така, в CDR-присадено антитяло на настоящото изобретение, рамкираните области не се нуждаят точно от същата последователност както тази на антитялото на приемника. Например, необичайните остатъци могат да бъдат променени до много по-често срещаните остатъци за този клас, или вид верига на приемника. Алтернативно, избрани остатъци в рамковите области могат да бъдат променени, така че те да съответстват на остатъка, намиращ се на същата позиция в антитялото на донора. Такива промени би трябвало да се поддържат до минималната необходимост да възстановят афинитета на антитялото на донора. Протокол за избор на остатъци в рамковите области на приемника, които може да е необходимо да бъдат променени е описан във WO 1991/009967.
За предпочитане, в молекула на CDRприсадено антитяло на настоящото изобретение, ако тежката верига на приемника има човешка група 1 на рамковите области (показано е на фигура 2) (SEQ ID NOS: 91, 93,95 и 97), тогава рамковите области на тежката верига на приемника съдържат, допълнително към една, или повече CDRs на донора, остатъци от донора на позиции 28, 69 и 71 (съгласно Rabat et at. (supra)).
Алтернативно, ако тежката верига на приемника има рамкови области група 1, тогава рамковите области на тежката верига на приемника съдържат, допълнително към една, или повече CDRs на донора, остатъци от донора на позиции 28,38,46,67,69 и 71 (съгласно Rabat et al. (supra)).
За предпочитане, в молекула на CDRприсадено антитяло на настоящото изобретение, ако тежката верига на приемника има рамкови области човешка група 3 (показано е на фигура 2) (SEQ ID NOS: 106, 107, 108 и 109), тогава рамковите области на тежката верига на приемника съдържат, допълнително към една, или повече CDRs на донора, остатъци от донора на позиции 27, 18, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 и 78 (съгласно Kabat et al. (supra)).
За предпочитане, в молекула на CDRприсадено антитяло на настоящото изобретение, ако леката верига на приемника има рамкови области човешка група 1 (показано е на фигура 1) (SEQ ID NOS: 83, 85, 87 и 89), тогава рамковите области на леката верига на приемника съдържат, остатъци от донора на позиции 46 и 60 (съгласно Kabat et al. (supra)).
Остатъци от донора са остатъци от антитяло на донора, тоест, антитяло, от което произлизат оригиналните CDRs.
Молекулата на антитяло на настоящото изобретение може да съдържа завършена молекула на антитяло, имаща цяла дължина тежка и лека верига; нейна част, такава, като например Fab, модифициран Fab, Fab’, F(ab’)2) или Fv фрагмент; мономер, или димер на лека верига, или мономер или димер на тежка верига; една верига на антитяло, например, една верига Fv, в която променливите области на тежката верига и на леката верига са свързани посредством пептиден линкер. По подобен начин, променливите области на тежката верига и на леката верига могат да са комбинирани с други области на антитяло като подходящи.
За предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение е фрагмент Fab. За предпочитане, фрагментът Fab има тежка верига, имаща последователността, дадена като SEQ ID NO: 111, и лека верига, имаща последователността, дадена като SEQ IDNO: 113. Амино киселинните последователности, дадени в SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113 за предпочитане са кодирани посредством нуклеотидните последователности, дадени в SEQ ID N0: 110 и SEQ ID NO: 112, съответно.
Алтернативно, за предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение е фрагмент Fab, в който модифицирането е присъединяването към С-терминалния край на неговата тежка верига на една, или повече амино киселини, за да дадат възможност за прикрепянето на молекула ефектор, или молекула репортер. За предпочитане, присъединените амино киселини образуват модифицирана стърчаща (hinge) област, съдържаща един, или два цистеинови остатъка, към които може да е прикрепена молекулата ефектор, или репортер. Такъв модифициран фрагмент Fab за предпочитане има тежка верига, имаща последователността, дадена като SEQ ID N0: 115, и лека верига, имаща последователността, дадена като SEQ ID N0:113. Амино киселинната последователност, дадена в SEQ ID N0: 115 за предпочитане е кодирана посредством нуклеотидната последователност в SEQ ID N0: 114.
Предпочитана група ефектор е полимерна молекула, която може да бъде прикрепена към модифициран фрагмент Fab, за да повиши неговия полуживот in vivo.
Полимерната молекула може, обикновено, да бъде синтетичен, или природен полимер, например, по избор заместен полиалкилен, полиалкиленов, или полиоксиалкиленов полимер с права или разклонена верига, или полизахарид с разклонена, или с неразклонена верига, например, хомо- или хетерополизахарид.
По-специални заместители по избор, които могат да присъстват в по-горе посочените синтетични полимери включват една, или повече хидрокси, метилови, или метокси групи. Поспециални примери на синтетични полимери включват по избор заместен поли(етиленпгикол), поли(винилалкохол) поли-(етиленгликол), или техни производни, с права, или с разклонена верига, по-специално, по избор заместен поли(етиленгликол), такъв като метоксиполи(етиленгликол), или негови производни. Поспециални природни полимери включват лактоза, амилоза, декстран, пгикоген, или техни производни. “Производни”, така, както се използва тук, означава, че включва реактивни производни, например, тиол-селективни реактивни групи, такива като малеимиди, и други подобни. Реактивната група може да бъде свързана директно, или чрез свързващ сегмент към полимера. Трябва да се отбележи, че остатъкът на такава група понякога образува част от продукта, като свързваща група между фрагмента на антитялото и полимера.
Големината на полимера може да бъде различна, според желанието, но обикновено трябва да е със средно молекулно тегло в границите от 500 до 50000 Da, за предпочитане,
66072 Bl от 5000 до 40000 Da, a по-за предпочитане от 25000 до 40000 Da. Големината на полимера може по-специално да се избере на базата на използването, за което е предназначен продукта. Така, например, когато продуктът е предназначен да напусне кръвообръщението и да проникне в тъканта, например, за използване при лечение на тумор, може да е благоприятно да се използва полимер с малко молекулно тегло, например, с молекулно тегло от порядъка на приблизително 5000 Da. При приложение, когато продуктът остава в кръвообръщението, може да е благоприятно да се използва полимер с по-голямо молекулно тегло, например, имащ молекулно тегло в границите от 25000 до 40000 Da.
Особено предпочитаните полимери включват полиалкиленов полимер, такъв като например, поли(етиленгликол), или, поспециално, метоксиполи(етиленгликол), или техни производни, и по-специално с молекулно тегло в границите от 25000 до около 40000 Da.
Всяка полимерна молекула, прикрепена към модифициран фрагмент на антитяло може да бъде прикрепена ковалентно към серния атом на цистеиновия остатък, намиращ се във фрагмента. Ковалентната връзка обикновено е дисулфидна връзка, или, по-специално, връзка сяравъглерод.
При желание, фрагментът на антитяло може да има една, или повече молекули ефектори, или репортери, прикачени към него. Молекулите ефектори, или репортери, могат да бъдат прикачени към фрагмента посредством която и да е подходяща амино киселинна странична верига, или терминал на амино киселинна функционална група във фрагмента, например, която и да е свободна амино, имино, хидрокси, или карбоксилна група.
Активиран полимер може да се използва като изходен продукт при получаването на полимер-модифицирани фрагменти на антитела, съгласно горното описание. Активираният полимер може да бъде който и да е полимер, съдържащ тиолова реактивна група, такъв като алфа-халогенокарбоксилна киселина, или естер, например, йодацетамид, имид, например, винил сулфон, или дисулфид. Такива изходни продукти могат да се доставят от търговската мрежа (например, от Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA), или могат да се получат от достъпни чрез търговската мрежа изходни продукти, използвайки конвенционални химични методи.
По отношение на прикрепването на поли(етиленгликол)-ови (PEG) остатъци, направена е литературна справка с “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and “Bioconjugation Protein Coupling Technics for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Когато желанието е да се получи фрагмент на антитяло, свързан с молекула ефектор, или репортер, това може да се осъществи чрез стандартни химични методи, или стандартни методи за рекомбинантна ДНК, при които фрагмент на антитяло се свързва или директно, или посредством присъединяващо средство, към молекулата ефектор, или репортер, било преди, било след взаимодействие с активирания полимер, който е подходящ. По-специалните химични методи включващ например, тези, описани във WO 1993/006231, WO 1992/022583, WO 1989/000195 и WO 1989/001476. Алтернативно, когато молекулата ефектор, или репортер е протеин, или полипептид, свързването може да се осъществи, като се използват методи за рекомбинантна ДНК, например, съгласно описаното във WO 1986/ 001533 и ЕР-А-0392745.
За предпочитане, модифицираният Fab фрагмент съгласно настоящото изобретение е PEG-илиран (тоест, има PRG (поли(етиленгликол)) ковалентно прикрепен към него) съгласно метода, описан в ЕР-А-0948544. За предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение е PEG-илиран модифициран Fab фрагмент, както е показано на фигура 13. Както е показано на фигура 13, модифицираният Fab фрагмент има малеимидна група, ковалентно свързана към единична тиолова група в модифицирана висяща област. Лизинов остатък е свързан ковалентно към малеимидната група. Към всяка една от амино групите на лизиновия остатък е прикрепен метоксиполи(етиленгликол)ов полимер, имащ молекулно тегло от порядъка на приблизително 20,000 Da. Общото
66072 Bl молекулно тегло на цялата молекула ефектор е приблизително 40,000 Da.
За предпочитане, в съединенията, показани на фигура 13, тежката верига на частта от антитялото има последователността, дадена като SEQ ID N0: 115, а леката верига има последователността, дадена като SEQ ID NO: 113. Това съединение тук се обозначава като CDP870.
Домените от константната област на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, ако присъства, може да се избере, като се има предвид предложената функция на молекулата на антитялото, и по-специално, функциите на ефектор, които могат да се изискват. Например, домените на константните области могат да са човешки IgA, IgD, IgE, IgG или IgM области. По-специално, човешки IgG домени на константни области могат да се използват, особено от изовидовете IgGl и IgG3, когато молекулата на антитяло е предназначена да се използва за терапевтични цели, и се изисква антитялото да има ефекторни функции. Алтернативно, изо-видовете IgG2 и IgG4 могат да се използват, когато молекулата на антитялото е предназначена да се използва за терапевтични цели, и не се изисква антитялото да има ефекторни функции, например, само за блокиране на активността на ТИРалфа.
Също така, молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение може да има молекула ефектор, или репортер, прикрепена към нея. Например, тя може да има макроцикъл, за превръщане на атом на тежък метал, или токсин, в хелатно съединение, такъв като рицин, прикрепен към нея, посредством ковалентна мостова структура. Алтернативно, технологии на методи за рекомбинантна ДНК могат да се използват за получаването на молекула на антитяло, в която Fc фрагментът (СН2, СНЗ и висящи области), областите СН2 и СНЗ, или областта СНЗ на завършена молекула имуноглобулин е (са) заместена (заместени) от, или е прикрепена към него посредством пептидна връзка, функционално неимуноглобулинов протеин, такъв като ензим, или молекула токсин.
Молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение за предпочитане има свързващ афинитет най-малко 0,85 х 10 '°М, попредпочитано най-малко 0,75 х 1010 М, а найпредпочитано най-малко 0,5 х 1010М. (Това не пречи, да се отбележи, че предпочитаната хуманизирана молекула на антитяло съгласно настоящото изобретение, както е описано подолу, има афинитет от порядъка на приблизително 0,5 х 1010М, който е по-добър отколкото афинитета на мишето моноклонално антитяло, от което произлиза. Мишето антитяло има афинитет от порядъка на приблизително 0,85 хЮ-’°М).
За предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, съдържа променлива област hTNF40-gLl (SEQ ID NO: 8) на леката верига, и променлива област gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO: 11) на тежката верига. Последователностите на променливите области на тези лека и тежка верига са показани на фигури 8 и 11, съответно.
Настоящото изобретение се отнася, също така, до варианти на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, които имат подобрен афинитет за ТИРалфа. Такива варианти могат да се получат посредством многобройни протоколи за афинитетно узряване, включително мутиране на CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403,1995), размесване на верига (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), използване на мутаторни щамове от Е. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), ДНК размесване (Pattern et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8,724-733,1997), phage display (Thomson et al., J. Mol. Biol., 256,77-88,1996), и сексуална PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) дискутира тези методи за афинитетно узряване.
Настоящото изобретение също така предоставя ДНК последователност, кодираща тежка(и) и/или лека(и) верига(и) на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение.
За предпочитане, ДНК последователността, кодира тежка, или лека верига на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение.
Съгласно един предпочитан вариант за изпълнение на настоящото изобретение, ДНК последователността кодира лека верига, и съдържа последователността, показана в SEQ ID NO: 8 (hTNF40-gLl), или SEQ ID NO: 9 (hTNF40-gL2, или негов еквивалентен разпад на генетичния код.
Съгласно един алтернативен предпочитан
66072 Bl вариант за изпълнение на настоящото изобретение, ДНК последователността кодира тежка верига, и съдържа последователността, показана в SEQ ID NO: 10 (ghlhTNF40.4), или SEQ ID NO: 11 (gh3hTNF40.4, или техен еквивалентен дегенерат.
ДНК последователността съгласно настоящото изобретение може да съдържа синтетична ДНК, например, получена посредством химичен процес, сДНК, геномна ДНК, или каквато и да е комбинация от тях.
Настоящото изобретение се отнася, също така, до вектор за клониране, или за експресиране, съдържащ една, или повече ДНК последователности съгласно настоящото изобретение. За предпочитане, клониращият, или експресиращият вектор, съдържа леката верига, и тежката верига на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, съответно.
Съгласно един предпочитан вариант за изпълнение, настоящото изобретение предоставя експресиращ вектор на Е. coli, съдържащ ДНК последователност съгласно настоящото изобретение. За предпочитане, експресиращият вектор е pTTO(CDP870), както е показано схематично на фигура 22.
Настоящото изобретение също така съдържа вектор pDNAbEng-G 1, както е показано на фигура 19.
Общи методи, чрез които могат да се конструират векторите, методи на трансфектиране, и методи за култивиране, са добре известни на специалистите в областта на техниката. В това отношение, е направена справка с “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wley Interscience, New York и the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.
ДНК последователности, които кодират молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение могат да бъдат получени посредством методи, добре познати на специалистите в областта на техниката. Например, ДНК последователности, кодиращи за част, или за цялата тежка, и лека верига, могат да бъдат синтезирани от определени ДНК последователности, или на базата на съответстващите амино киселинни последователности.
ДНК кодираща за последователности на рамката за разчитане на приемника се прилага широко от специалистите в областта на техниката, и може лесно да се синтезира, на базата на нейните известни амино киселинни последователности.
Стандартни техники на молекулярната биология могат да се използват за получаване на ДНК последователности, кодиращи за молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение. Желаните ДНК последователности могат да се синтезират изцяло, или част от тях, използвайки олигонуклеотидни синтетични техники. Техники на сайт-насочена мутагенеза и на полимеразна верижна реакция (PCR), могат успешно да се използват.
Която и да е подходяща система клетка гостоприемник/вектор, може да се използва за експресиране на ДНК последователности, кодиращи молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение. Бактериална, например Е. coli, и други микробни системи могат да се използват, отчасти, за експресиране на фрагменти на антитяло, такива като Fab и F(ab’)2 фрагменти, и по-специално Fv фрагменти и единични фрагменти от веригата на антитяло, например, единични Fvs. Еукариотни, например, системи за експресиране на клетки гостоприемници от бозайници, могат да се използват за получаването на по-големи молекули на антитяло, включително завършени молекули на антитяло. Подходящи клетъчни системи гостоприемници на бозайници включват клетки СНО, клетки миелома, или хибридома.
Настоящото изобретение предоставя също така метод за получаването на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, който се състои в култивиране на клетка гостоприемник, съдържаща вектор съгласно настоящото изобретение, в условия, подходящи за провеждане на експресиране на протеин от ДНК кодираща молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, и изолиране на молекулата на антитяло.
За предпочитане, методът за получаване на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение се състои в култивиране на Е. coli, съдържащ Е. coli експресиращ вектор, съдържащ ДНК последователността съгласно настоящото изобретение, в условия, подходящи за провеждане на експресиране на протеин от ДНК последователността, и изолиране на молекулата на
66072 Bl антитяло. Молекулата на антитяло може да се отдели от клетката, или да се насочи към периплазмата чрез подходящи единични последователности. Алтернативно, молекулите на антитяло могат да се натрупват вътре в клетъчната цитоплазма. За предпочитане, молекулата на антитяло се насочва в периплазмата. В зависимост от молекулата на антитяло, която е получена, и от метода, който е използван, желателно е да се предостави възможност на молекулите на антитяло да обхванат и да възприемат функционално устройство. Методи за предоставяне на възможност на молекулите на антитяло да обхванат са добре познати на специалистите в областта на техниката.
Молекулата на антитялото може да съдържа полипептид само с тежка, или с лека верига, като в такъв случай е необходимо да се използва последователност, кодираща полипептид само с тежка, или с лека верига, за трансфектиране на клетки гостоприемници. За получаването на продукти, съдържащи и двете вериги, и тежка, и лека вериги, клетъчната линия може да се трансфектира с два вектора, първият вектор кодиращ полипептид с лека верига, а вторият вектор кодиращ полипептид с тежка верига. Алтернативно, може да се използва единичен вектор, като векторът включва последователности, кодиращи полипептиди с лека верига, и полипептиди с тежка верига.
Настоящото изобретение също така осигурява терапевтичен, или диагностичен състав, съдържащ молекула на антитяло съгласно настоящото изобретение в комбинация с фармацевтично приемлив инертен пълнител, разредител, или носител.
Настоящото изобретение също така осигурява метод за получаване на терапевтичен, или диагностичен състав, съдържащ смес от молекула на антитяло съгласно настоящото изобретение, заедно с фармацевтично приемлив инертен пълнител, разредител, или носител.
Молекулата на антитяло може да е единствената активна съставна част в терапевтичния, или диагностичния състав, или може да се придружава от други активни съставни части, включително други съставни части на антитела, например, анти-Т клетка, анти-IFNraMa, или антиLPS антитела, или съставни части, които не са на антитела, такива като ксантин.
Фармацевтичният състав за предпочитане трябва да съдържа терапевтично ефективно количество от антитялото съгласно изобретението. Терминът “терапевтично ефективно количество”, така както се използва тук, се отнася до количество от терапевтично средство, необходимо, за да лекува, подобрява, или да предотвратява набелязана болест, или състояние, или да показва откриваем терапевтичен, или превантивен ефект. За което и да е антитяло, терапевтично ефективната доза за еднократно приложение може да се прецени първоначално било при изследване на клетъчна култура, било в животински модели, обикновено в гризачи, зайци, кучета, прасета, или примати. Животинският модел може също така да се използва, за да се определи границата на подходящата концентрация, и начина на приложение. Тази информация след това може да се използва, за да се определят полезните дози за еднократно приложение, и начина на приложение при човека.
Точното ефективно количество за човешки субект зависи от това, колко тежко е болестното състояние, от общото здравословно състояние на субекта, от възрастта, от теглото, и от пола на субекта, от хранителния режим, от времето и от честотата на приложение, от лекарствена(и) комбинация(и), от реакциите на чувствителност, и от толеранс/отговор към лечението. Това количество може да се определи, като се направи рутинно експериментиране и се преценява от клиницистите. Обикновено, ефективна доза за еднократно приложение е от 0,01 mg/kg до 50 mg/kg, за предпочитане 0,1 до 20 mg/kg, по-предпочитано приблизително 15 mg/kg. Както е показано в примерите по-долу, дози за еднократно приложение от 1,5 и 20 mg/ kg се използват за лечение на пациенти, страдащи от ревматоиден артрит.
Съставите могат да се прилагат индивидуално върху пациент; или могат да се прилагат в комбинация с други средства, лекарствени средства, или хормони.
Дозата за еднократно приложение, при която се прилага молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение, зависи от характера на състоянието, което трябва да се лекува, степента, до която трябва да се неутрализира, нивото на ЮТалфа, или да се експресира, повишаване на желано ниво, и дали молекулата на антитяло е била използвана профилактично, или
66072 Bl за лечение на съществуващо болестно състояние.
Така, например, когато продуктът е за лечение, или за профилактика на хронично възпалително заболяване, такова като ревматоиден артрит, подходящите дози за еднократно приложение на молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение са в границите от 0,5 и 50 mg/kg, по-предпочитано между 1 и 20 mg/kg, а най-предпочитано приблизително 15 mg/kg. Честотата на приложение на дозата за еднократно приложение зависи от полуживота на молекулата на антитялото, и от продължителността на нейния ефект.
Ако молекулата на антитялото има кратък полуживот (например 2 до 10 h), може да е необходимо да се приемат една, или повече дози за еднократно приложение на ден. Алтернативно, ако молекулата на антитялото има дълъг полуживот (например 2 до 15 дена), може да е необходимо да се приеме дозата за еднократно приложение само веднъж на ден, на седмица, или даже веднъж на всеки 1, или 2 месеца.
Фармацевтичният състав може също така да съдържа фармацевтично приемлив носител за приложение на антитялото. Самият носител не трябва да индуцира получаването на антитела, вредни за индивида, получаващ състава, и не трябва да бъде токсичен. Подходящи носители могат да бъдат големи, слабо метаболизирани макромолекули, такива като протеини, полипептиди, липозоми, полизахариди, полимлечни киселини, полигликолови киселини, полимерни амино киселини, съполимери на амино киселини, и инактивирани части от вируси.
Могат да се използват фармацевтично приемливи соли, например, соли на минерални киселини, такива като хидрохлориди, хидробромиди, фосфати и сулфати, или соли на органични киселини, такива като ацетати, пропионати, малонати и бензоати.
Фармацевтично приемливите носители в лекарствените състави могат допълнително да съдържат течности, такива като вода, физиологичен разтвор, глицерол и етанол. Освен това, в такива състави могат да присъствуват помощни вещества, такива като овлажнители, или емулгиращи средства, или pH буфериращи вещества. Такива носители дават възможност от фармацевтичните състави да бъдат изготвени лекарствени форми като таблетки, пилюли, дражета, капсули, течности, гелове, сиропи, емулсии и суспензии, за приемане от пациента.
Предпочитаните форми за приложение включват форми, подходящи за парентерално приложение, например, чрез инжектиране, или чрез инфузия, например, чрез голяма инжекция, или продължителна инфузия. Когато продуктът е за инжектиране, или за инфузия, той може да е под формата на суспензия, разтвор, или емулсия в маслен, или воден вехикулум, и може да съдържа средства, подпомагащи образуването на лекарствената форма, такива като суспендиращи средства, консервиращи средства, стабилизиращи средства и/или диспергиращи средства. Алтернативно, молекулата на антитяло може да е под формата на сух продукт, за възстановяване преди използването с подходяща стерилна течност.
След като вече са получени под формата на лекарствени форми, съставите съгласно изобретението могат да се прилагат директно върху субекта. Субектът, който ще се лекува може да е животно. Обаче, за предпочитане е съставите да са пригодени за приложение върху субекти хора.
Фармацевтичните състави съгласно това изобретение могат да се прилагат посредством който и да е от многобройните начини, включително, но без да се ограничават от, орално, венозно, мускулно, интрартериално, интрамедуларно, в гръбначно мозъчния канал, интравентрикуларно, трансдермално, през кожата (например, виж WO 1998/020734), подкожно, интраперитонеално, в носа, чревно, локално, под езика, във вагината, или ректума. Хипоспрейове могат също така да се използват за приложение на фармацевтичните състави на изобретението. Характерно, лекарствените състави могат да се приготвят като инжектируеми, било като течни разтвори, било като суспензии. Могат да се получават твърди форми, подходящи за разтваряне в течни вехикулуми, или за суспендиране в течни вехикулуми, преди инжектирането.
Директното доставяне на съставите обикновено се осъществява чрез инжектиране, подкожно, интраперитонеално, интравенозно,
66072 Bl или интрамускулно, или доставяни в промеждутъчните цепнатини на тъканта (интерстициално). Съставите могат също така да се прилагат в лезия. Лечението с дози за еднократно приложение може да е съгласно разписание с единична доза за еднократно приложение, или съгласно разписание с повече дози за еднократно приложение.
Трябва да се отбележи, че активната съставна част в състава е молекула на антитяло. И като такъв, той трябва да е чувствителен към разграждане в гастроинтестиналния тракт. Така, например, ако съставът е за приложение по начин, използващ гастроинтестиналния тракт, съставът трябва да съдържа средства, които защитават антитялото от разграждане, но които освобождават антитялото, след като вече е бил абсорбиран от гастроинтестиналния тракт.
Пълна дискусия за фармацевтично приемливи носители е предоставена от Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N. J. 1991).
Предвижда се, също така, антитялото съгласно настоящото изобретение да се прилага за целите на генната терапия. С цел да се постигне това, ДНК последователности, кодиращи тежка верига и лека верига на молекулата на антитяло при контролиране на подходящи съставни части на ДНК, се внасят в пациент по такъв начин, че веригите на антитялото се експресират от ДНК последователностите, и се натрупват in situ.
Настоящото изобретение също така предоставя молекулата на антитялото съгласно настоящото изобретение за използване при лечението на заболяване, медиирано от ТИРалфа.
Настоящото изобретение също така предоставя използването на молекулата на антитялото съгласно настоящото изобретение при получаването на лекарствено средство за лечението на заболяване, медиирано от ТИБалфа.
Молекулата на антитялото съгласно настоящото изобретение може да се използва при каквото и да е лечение, където е желателно да се редуцира нивото на биологично активен Т№алфа, присъстващ в тялото на човек, или в тялото на животно. ТМ-алфа може да циркулира в тялото, или да присъства в нежелателно високо ниво, локализиран в специален сайт в тялото.
Например, повишени нива на ТПБалфа са замесени при остри и хронични имунни и имунорегулаторни заболявания, инфекции, включващи сепсис, ендотоксичен шок и шок на сърдечносъдовата система, възпалителни заболявания, нервно-дегенеративни заболявания, злокачествени заболявания и индуциран от алкохол хепатит. Подробности за многобройните заболявания, свързани с повишени нива на ЮТалфа са изложени в US-A-5 919 452. Молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение може да се използва при лечението на заболявания, медиирани от ЮТалфа. Особено важни заболявания, които могат да се лекуват посредством молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение включват сепсис, конгестивна сърдечна недостатъчност, септичен, или ендотоксичен шок, кахексия, синдром на дихателно страдание при възрастни, СПИН, алергии, псориазис, туберкулоза, възпалителни заболявания на костите, заболявания свързани със съсирването на кръвта, изгаряния, епизодите на отхвърляне след трансплантиране на органи и тъкани, болестта на Крон, и автоимунни заболявания, такива като тироидит и ревматоиден- и остеоартрити.
Освен това, молекулата на антитяло, или състава могат да се използват за намаляване на странични ефекти, свързани с генериране на Т№алфа по време на неопластично лечение; за отстраняване, или за намаляване на шокови симптоми, свързани с лечението, или с предотвратяването на отхвърлянето на присаждания чрез използване на антилимфоцитно антитяло; или за лечение на увреждане на много органи.
Молекулата на антитялото съгласно настоящото изобретение за предпочитане се използва за лечение на ревматоиден- и остеоартрит.
Настоящото изобретение също така предоставя метод за лечение на субекти хора, или животни, страдащи от, или при риск от увреждания, медиирани от ЮТалфа, като методът се състои в приложение върху субекта на ефективно количество от молекулата на антитяло съгласно настоящото изобретение.
Молекулата на антитялото съгласно настоящото изобретение може също така да се използва при поставяне на диагнози, например при поставяне на диагнози in vitro, и образно представяне на болестни състояния, включващи
66072 Bl повишени нива на TNFалфа.
Настоящото изобретение също така предоставя молекула на антитяло, съдържаща хибриден CDR, съдържащ съкратена последователност от CDR на донор, където липсващата част от съкратената CDR на донор е заместена от различна последователност, и образува функционална CDR. Терминът “хибридна CDR”, така, както се използва тук, означава CDR, съдържаща CDR от донор, който е бил изрязан в една, или друга позиция, например, в единия, или и в двата му края. Липсващата част от изрязаната CDR на донор е заместена от различна последователност, и образува цяла и функционална CDR. Хибридната CDR има най-малко една промяна на амино киселина, сравнен с цялата CDR от донора. Последователността, заместваща изрязаната част на CDR може да е която и да е последователност. За предпочитане, не-донорната част на CDR последователността е от антитялото, от което произлизат рамкираните области на молекулата на антитялото, такава като последователност на антитяло на зародишна линия.
Установено е, че молекулата на антитяло, съдържаща хибридна CDR запазва по същество същия афинитет на свързване, както молекула на антитяло, съдържаща цели CDRs на донор. Терминът “по същество същия афинитет”, така, както се използва тук, означава най-малко 70 %, по-предпочитано най-малко 85 %, а найпредпочитано най-малко 95 %, от афинитета на свързване на съответната молекула на антитяло, съдържаща цели CDRs на донор. Както се посочва по-горе, в някои случаи, афинитетът на антитялото съгласно изобретението може да бъде по-голям, отколкото този на антитялото на донора. Използването на хибридна CDR предоставя предимството за намаляване количеството на чуждата (тоест, от донора) последователност, присъстваща в молекулата на антитялото, и може да повиши афинитета на свързване на молекулата на антитялото, в сравнение със съответната молекула на антитялото, съдържаща цели CDRs на донор.
Които и да са от CDRs на молекулата на антитялото могат да са хибриди. За предпочитане, CDR2 от тежката верига е хибридна в молекулата на антитялото.
За предпочитане, изрязването на CDR на донора е от 1 до 8 амино киселини, попредпочитано от 4 до 6 амино киселини. Предпочитано е, също така, изрязването да се прави при С-терминуса на CDR.
В зависимост от последователността на изрязаната част на CDR, и от последователността на различната последователност, заместваща липсващата част, могат да се направят множество промени на амино киселини. За предпочитане, правят се промени най-малко на 2 амино киселини, по-предпочитано, правят се промени най-малко на 3 амино киселини, а найпредпочитано, правят се промени най-малко на 4 амино киселини.
По-специален вариант за изпълнение в този аспект на изобретението е антитяло, съгласно първия аспект на изобретението, в който втората CDR в тежката верига има последователността, дадена като SEQ ID NO: 2. Тя има по-добър афинитет към неговия антиген, отколкото има антитялото на донора, от който произлиза част otCDR.
Настоящото изобретение също така предоставя последователност на нуклеинова киселина, която кодира молекулата на антитяло, съдържаща хибридна CDR съгласно настоящото изобретение.
Настоящото изобретение също така предоставя вектор за експресиране, съдържащ последователността на нуклеинова киселина, кодираща молекулата на антитяло, съдържаща хибридна CDR съгласно настоящото изобретение.
Настоящото изобретение също така предоставя клетка гостоприемник, трансформирана с вектора съгласно настоящото изобретение.
Настоящото изобретение също така предоставя метод за получаване на молекула на антитяло, съдържаща хибридна CDR, който се състои в култивиране на клетка гостоприемник съгласно настоящото изобретение, и изолиране на молекулата на антитялото.
Настоящото изобретение също така описва само по илюстративен начин в следващите примери, които се отнасят до придружаващите фигури, в които:
фигура 1 показва рамкирани области на лека верига на човешка подгрупа 1, сравнени с рамкирани области на лека верига на hTNF40 (SEQ ID NOS: 83 до 90);
66072 Bl фигура 2 показва рамкирани области на тежка верига на човешка подгрупа 1 и подгрупа 3, сравнена с рамкирани области на лека верига на hTNF40 (SEQ ID NOS: 98 и 106 до 109);
фигура 3 показва аминокиселинна последователност на CDRs на hTNF40 (SEQ ID NOS: 1 до 7), където CDR Н2' е хибридна CDR, където шестте амино киселини на С-терминала са от Н2 CDR последователността на антитяло на зародишна линия на човешка подгрупа 3, и амино киселинните промени в последователността, получени в резултат на това хибридизиране са подчертани;
фигура 4 показва вектор pMRl5.1; фигура 5 показва вектор pMR14;
фигура 6 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на миши hTNF40VI (SEQ ID NO: 99);
фигура Ί показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на миши hTNF40Vh (SEQ ID NO: 100);
фигура 8 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на hTNF40-gLl (SEQ ID NO: 8);
фигура 9 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на hTNF40-gL2 (SEQ ID NO: 9);
фигура 10 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на ghlhTNF40.4 (SEQ ID NO: 10);
фигура 11 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO: 11);
фигура 12 показва вектор CTIL-gL6;
фигура 13 показва структурата на съединение наречено CDP870, съдържащо модифициран Fab фрагмент, производен на антитяло hTNF40, ковалентно свързан посредством цистеинов остатък към лизил-малеимиден линкер, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно прикрепен към нея метокси PEG остатък, където η е приблизително 420;
фигура 14 показва вектор pTTQ9;
фигура 15 показва последователността на ОтрА олигонуклеотидния адаптер, (SEQ ID NO: 101);
фигура 16 показва вектор pACYC184;
фигура 17 показва вектор рТТО-1; фигура 18 показва вектор рТТО-2; фигура 19 показва вектор pDNAbEng-Gl;
фигура 20 показва олигонуклеотидните касети, кодиращи различни междугенни последователности за експресиране на модифициран Fab в Е. coli (SEQ ID NOS: 102 до 105);
фигура 21 показва акумулиране на периплазматичен модифициран Fab на IGS варианти;
фигура 22 показва вектор рТТО (CDP870);
фигура 23 показва резултата за активността на заболяването (DAS) при пациенти, лекувани с различни дози от CDP870 и с плацебо. Средните и IQ граници са представени за популация на протокол, с последното проведено наблюдение преди това. Малките карета показват плацебо, карото показват 1 mg/kg, триъгълниците показват 5 mg/kg, а големите карета показват 20 mg/kg;
фигура 24 показва броя на меките стави, броя на подутите стави, резултата за болка, общата оценка на експерта за активността на заболяването, въпросника за оценка на модифицираното здравословно състояние (HAQ), С реактивен протеин (CPR) и скоростта на утаяване на еритроцитите (ESR) при пациенти, лекувани с различни дози от CDP870 и с плацебо. Средните и IQ граници са представени за популация на протокол, с последното проведено наблюдение преди това. Малките карета показват плацебо, карото показват 1 mg/kg, триъгълниците показват 5 mg/kg, а големите карета показват 20 mg/kg.
Примери за изпълнение на изобретението
Генно клониране и експресиране на химерна молекула на антитяло hTNF40
Получаване на РНК от hTNF40 хибридома клетки
Обща РНК се получава от 3 х 107 hTNF40 хибридома клетки, както е описано по-долу. Клетките се промиват с физиологичен разтвор, и се разтварят в РНК-зол (0,2 ml на 106 клетки). Прибавя се хлороформ (0,2 ml на 2 ml хомогенат), сместа се разклаща енергично в продължение на 15 s, и след това се оставя в лед в продължение на 15 min. Получените водна и органична фаза се разделят чрез центрофугиране в продължение на 15 min в центрофуга Еррепdorf, и РНК се утаява из водната фаза чрез прибавяне на равен обем изопропанол. След 15 min в лед, РНК се гранулира чрез центрофугиране,
66072 Bl промива се със 70 % етанол, суши се, и се разтваря в стерилна вода, несъдържаща РНКза. Добивът на РНК е 400 microg.
PCR клониране на hTNF40Vh и VI
Последователности сДНК, клониращи за различни области на тежка и лека верига на hTNF40, се синтезират, използвайки обратна транскриптаза, за да се получат копия единична верижна сДНК от иРНК, присъстващи в общата РНК, последвано от верижна полимеразна реакция (PCR) в сДНК-тата, със специфични олигонуклеотидни праймери.
a) Синтезиране на сДНК сДНК се синтезира в 20 microl реакционен обем, съдържащ следните реактиви: 50 тМ трисНС1 pH 8,3,75 mM КС1,10 тМ дитиотрейтол, 3 mM MgCl2, 0,5 тМ от всеки един дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 20 единици PHK-sin, 75 ng случаен хексануклеотиден праймер, 2 microg hTNF40 РНК и 200 единици Moloney Murine Leukemia Virus обратна транскриптаза. След инкубиране при 42°С в продължение на 60 min, реакцията се спира, посредством нагряване при 95°С в продължение на 5 min.
b) PCR
Аликвотни части от сДНК се подлагат на PCR, използвайки комбинации от праймери, специфични за тежка и лека верига. Нуклеотидните последователности на 5' праймерите за тежката и за леката верига са показани в таблици 1 и 2, съответно. Всички тези последователности съдържат, по реда на начални 7 нуклеотиди на рестрикционен сайт откъм неговите 5' краища, последователността GCCGCCACC (SEQ ID NO: 12), за да предостави оптимална транслация на получената иРНК, кодон за иницииране и 20 - 30 нуклеотиди, базиращи се на лидерните пептидни последователности на известни миши антитела (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, 1991, U. S. Departement of Health and Human Services, Public Health Serviceq National Institutes of Health).
Праймерите 3' са показани на таблица 3. Праймерът на леката верига обхваща J-С връзката на антитялото, и съдържа рестрикционен сайт за ензима Sp 11, за да се улесни кпонирането на фрагмента VI PCR. Праймерите на тежките вериги 3' са смес, предназначена да обхване -С връзката на антитялото. Праймерът 3' включва Apal рестрикционен сайт, за да се улесни кпонирането. Регионът 3' на праймерите съдържа смесена последователност, на базата на тази, намерена в познати миши антитела (Kabat et al., 1991, supra).
Описаните по-горе комбинации от праймери дава възможност на продуктите PCR за Vh и VI, да бъдат клонирани директно в подходящ експресиращ вектор (виж по-долу), за получаване на химерни (миши - човешки) тежка и лека верига, и затова да бъдат експресирани гени в клетки на бозайник, за получаване на химерни антитела от желания изотип.
Осъществява се инкубиране (100 microl) за PCR, както следва. Всяка реакция се състои от 10 тМ трис-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 тМ КС1, 0,01 % w/v желатин, 0,25 тМ всеки дезоксирибонукпеозид трифосфат, 10 pmoles 5' праймер смес (таблица 4), 10 pmoles 3' праймер (CL12 (лека верига), или R2155 (тежка верига) (таблица 3)), 1 microl сДНК, и 1 единица Taq полимераза. Реакциите се инкубират при 95°С в продължение на 5 min, и след това се пускат в цикъл при 94°С в продължение на 1 min, при 55°С в продължение на 1 min, и при 72°С в продължение на 1 min. След 30 цикъла, аликвотни части от всяка реакция се анализират чрез електрофореза върху агарозен гел. Реакциите с лека верига, съдържащи смеси 5' праймер от обединения 1, 2 и 7 на лека верига продуцират ивици с размери в съгласие с фрагменти VI в цяла дължина, докато реакцията от реакционно обединение 3 на тежка верига продуцира фрагмент с размер очакван за Vh ген. Ивицата, продуцирана от праймери на обединение 1 на лека верига не се следва, като предишните резултати показват, че тази ивица съответства на псевдоген на лека верига, продуциран от клетка хибридома. Ивицата, продуцирана от праймери на обединение 7 от лека верига е по-тънка от ивицата на праймерите на обединение 2, и поради това не се следва. Само ивицата от реакционно обединение 2 на лека верига, която е най-здравата ивица, се следва.
с) Молекулярно клониране на фрагменти PCR
ДНК фрагментите, продуцирани в реакционния състав 2 на лека верига, разграден с ензимите BstBI и SplI, концентриран чрез утаяване с етанол, подложен на електрофореза
66072 Bl в 1,4 % агарозен гел, и възстановени ДНК ивици в границите на 400 базови двойки. Те се клонират чрез лигиране във вектора pMR15.1 (фигура 4), който е обработен с рестрикционни ензими BstBI и SplI. След лигирането, смесите се трансформират в Е. coli LM1035, и плазмиди от получените бактериални колонии скринирани за инсерти чрез разграждане с BstBI и SplI. Представители с инсерти от всяко лигиране се анализират след това, чрез нуклеотидно секвениране.
По подобен начин, ДНК фрагменти, продуцирани в реакционното обединение 3 на тежка верига, се разграждат с Hindlll и Apal, и клонирани във вектор pMR14 (фигура 5), който се обработва с рестрикционни ензими Hindlll и Apal. Отново, представителни плазмиди, съдържащи инсерти, се анализират чрез нуклеотидно секвениране.
d) Изследване на нуклеотидна последователност
Плазмидна ДНК от голям брой изолати, съдържаща Vh инсерти се секвенира, използвайки праймерите R1053 (виж таблица 5) (който праймира 3' областта на HCMV промотора в pMR14) и R720 (виж таблица 5) (който праймира 5' областта на човешки С - гама 4 и дават възможност да се секвенира чрез ДНК инсерт върху pMR14). Установи се, че нуклеотидните последователности на Vh инсерта в голям брой клонове са идентични, с изключение за различията в сигналния пептид и J областите. Това посочва, че изследваните клонове са независими изолати, произтичащи от използуването на различни праймери от сместа на олигонуклеотиди в течение на CDR етапа. Определената нуклеотидна последователност и предварително зададената амино киселинна последователност на променливия домен на тежката верига на антитяло hTNF40 (hTNF40Vh) са дадени на фигура 7 (SEQ ID NO: 100).
За да се анализират клоновете на леката верига, изследва се последователността, произлизаща от праймирането с R1053 (виж таблица 5) и R684 (SEQ ID NO: 62) (който запълва 5' областта на човешки С - капа, и дава възможност да се проследи последователност чрез ДНК инсерт в pMR15.1). Нуклеотидната последователност и предварително зададената амино киселинна последователност на гените VI, произтичащи от реакциите на обединение 2, са анализирани по еднакъв начин. Отново, се установи, че нуклеотидните последователности на Vh инсерт в голям брой клонове са идентични, с изключение за различията в сигналния пептид и J областите, което показва, че изследваните клонове са независими изолати, произтичащи от използването на различни праймери от сместа на олигонуклеотиди, използвана в течение на CDR етапа. Определената нуклеотидна последователност и предварително зададената амино киселинна последователност на променливия домен на леката верига на антитяло hTNF40 (hTNF40Vl) са дадени на фигура 6 (SEQ ID NO: 99).
66072 Bl
Таблица 1
Олигонуклеотидни праймери за областта 5’ на миши тежки вериги.
СН1 : 5’
ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3’ (SEQ ID N0:13)
СН2 :
5’ATGGGATGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G)(C,T)TCTT3’ (SEQ ID N0:14)
CH3 : 5’ATGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3’ (SEQ ID N0:15)
CH4 : 5’ATG(G,A)ACTTTGGG(T,C)TCAGCTTG(G,A)T3’ (SEQ ID N0:16)
CH5 : 5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3’ (SEQ ID N0:17)
CH6 :
5’ATGGCTGTC(C,OT(G,A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG3’ (SEQ ID N0:18)
CH7 :
5’ATGG(G,A)ATGGAGC(G,T)GG(G,A)TCTTT(A,C)TCTT3’ (SEQ ID N0:19)
CH8 : 5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3’ (SEQ ID N0:20)
CH9 :
5’ATGG(C,A)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT3’ (SEQ ID N0:21)
CH10: 5ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3’ (SEQ ID N0:22)
66072 Bl
CH 11: 5’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’ (SEQ ID N0:23)
CH12: 5’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3’ (SEQ ID N0:24)
Всеки един от горните праймери има последователността 5’GCGCGCAAGCTTGCC GCCACC3' (SEQ ID NO: 25), прибавена към неговия 5' край.
Таблица 2
Олигонуклеотидни праймери за областта 5’ на миши леки вериги.
CL1 : 5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3’ (SEQ ID N0:26)
CL2 :
5’ATGGAG(TA)CAGACACACTCCTG(T,C)TATGGGT3’ (SEQ ID N0:27)
CL3 : 5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3’ (SEQ ID N0:28)
CL4 :
5’ATGAGG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3’ (SEQ ID N0:29)
CL5 :
5’ATGGATTT(T,A)CAGGTGCAGATT(T.A)TCAGCTT3’ (SEQ ID N0:30)
CL5A:
5’ATGGATTTCT,A)CA(A.G)GTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3· (SEQ ID N0:31)
66072 Bl
CL6 :
5’ATGAGGT(T,G)C(T,C)(T,C)TG(T,C)T(G,C)AG(T,C)T(T,C)
CTG(A,G)G3’ (SEQ ID N0:32)
CL7 : 5’ATGGGCCT,A)TCAAGATGGAGTCACA3’ (SEQ ID N0:33)
CL8: 5ATGTGGGGA(T,C)CT(G,OTTT(T,C)C(A,C)(A,C)rnTrCAAT3’ (SEQ ID N0:34)
CL9 :
5ATGGT(G,A)TCC(T,A)CA(G,C)CTCAGTTCCTT3’ (SEQ ID N0:35)
CL10 : 5ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3’ (SEQ ID N0:36)
CL11 : 5ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3’ (SEQ ID N0:37)
CL12A: 5’ATG(A,G)AGT(T,C)(A,T)CAGACCCAGGTCTT(T,C)(A,G)T3’ (SEQ ID N0:38)
CL12B:
5’ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3’ (SEQ ID N0:39)
CL13:
5’ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3’ (SEQ ID N0:40)
CL14:
5’ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3’ (SEQ ID N0:41) CL15:
5’ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3’ (SEQ ID N0:42)
66072 Bl
CL16:
5’ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3’ (SEQ ID N0:43)
CL17A:
5ATGAGGTGCCTA(A,G)CT(C,G)AGTTCCTG(A,G)G3’ (SEQ ID N0:44)
CL17B :
5’ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3’ (SEQ ID N0:45) CL17C :
5’ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3’ (SEQ ID N0:46)
Всеки един от горните праймери има последователността 5’GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3' (SEQ ID NO: 47), прибавена към неговия 5' край.
Таблица 3
Олигонуклеотидни праймери за областта 3' на миши Vh и
VI гени
Лека верига (CL12):
5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3’ (SEQ ID NO : 48)
Тежка верига (R2155):
5’GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC (G,T,A)GTGA3’ (SEQ ID NO : 49)
66072 Bl
Таблица 4
a) 5’ смеси от праймери за PCR реакции на лека верига
обединение 1 обединение 2 обединение 3 обединение 4 обединение 5 обединение 6 обединение 7 обединение 8 CL2. CL7. CL13. CL6. CL5A, CL9, CL17A. CL8. CL12A. CL1, CL3, CL4, CL5, CL10, CL11, CL2B,
CL14, CL15, CL16, CL17B, CL17C
Ь) 5’ смеси от праймери за PCR реакции на тежка верига
обединение 1 обединение 2 обединение 3 : СН1, СН2, СНЗ, СН4. : СН5, СН6, СН7, СН8. :СН9,СН10, СН11.СН12.
Таблица 5
Праймери, използувани при изследване на нуклеотидна последователност
R1053: 5OCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’ (SEQ ID NO : 50)
R720: 5OCTCTCGGAGGTGCTCCT3’ (SEQ ID NO: 51)
66072 Bl
Оценяване на активностите на химерните гени
Активностите на химерните гени се оценява чрез тяхното експресиране в клетки на бозайник, и пречистване и количествено определяне на синтезираните нови антитела. Методиката затова е описана по-долу, след което следва описание на изследванията на биохимична и клетъчна основа, използувани за биохимичната характеристика на антителата.
a) Получаване на молекула на химерно hTNF40 антитяло.
Химерно антитяло за биологична оценка се получава чрез временно експресиране на подходящи двойки тежка и лека верига след сътрансфектиране в клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО), използвайки утайка от калциев фосфат.
В деня преди трансфектирането, полувливащи се колби с клетки CHO-L761 се обработват с трипсин, клетките се преброяват, и всяка колба Т75 се зарежда с 107 клетки.
На следващия ден, културалната среда се сменя 3 h преди трансфектирането. За трансфектиране, утайката от калциев фосфат се получава чрез смесване на 1,25 ml 0,25 М СаС12, съдържащ 50 microg от всеки един от векторите, експресиращи тежка и лека верига, с 1,25 ml от х HBS (16,36 g NaCl, 11,0 g HEPES и 0,4 g Na2HPO4 в 11 вода c pH доведено до 7,1 c NaOH), и веднага се прибавя в средата на клетките. След h при 37°С в инкубатор с СО2, средата и утайката се отстраняват, и клетките шокират, като се прибавят 15 ml 15 % глицерол във физиологичен разтвор, буфериран с фосфатен буфер (PBS) в продължение на 1 min. Глицеролът се отстранява, клетките се промиват веднъж с PBS, и се инкубират в продължение на 48 - 96 h в 25 ml среда, съдържаща 10 тМ натриев бутират. Антитялото трябва да се пречисти от културалната среда, чрез прикрепяне към, и елуиране с протеин А-сефароза.
b) ELISA
За ELISA, Nunc ELISA блюда се покриват в продължение на една нощ при 40°С с фрагмент F(ab)2 на поликлонално козе античовешко антитяло специфично за фрагмен Fc (Jackson Immunoresearch, code 109-006-098) при 5 microg/ml в поквиращ буфер (15 mM натриев карбонат, 35 тМ кисел натриев карбонат, pH
6,9). Непокритото антитяло се отстранява, като се промива 5 пъти с дестилирана вода. Проби и пречистени стандартни образци за количествено определение се разреждат до приблизително 1 microg/ml в буфер (0,1 М трис-HCl, pH 7,0, 0,1 М NaCl, 0,2 % обем/обем Tween 20,0,2 % тегло/ обем казеин Hammersten). Пробите се титруват в ямки за микротитруване в 2-кратни разреждания, до получаването на краен обем от 0,1 ml във всяка ямка, и блюдата се инкубират при стайна температура в продължение на 1 h, на клатачен апарат. След първия етап на инкубиране блюдата се промиват 10 пъти с дестилирана вода, и след това се инкубират в продължение на 1 h както преди това, с 0,1 ml от мише моноклонално античовешко капа антитяло (клон GD12), конюгирано с пероксидаза, (The binding Site, code MP135) при разреждане 1 към 700 в конюгиран буфер. Блюдото се промива отново, и във всяка ямка се прибавя субстратен разтвор (0,1 ml). Субстратният разтвор съдържа 150 microl Ν,Ν,Ν,Ν-тетра-метилбензидин (10 mg/ml в DMSO), 150 microl водороден пероксид (30 % разтвор) в 10 ml 0,1 М натриев ацетат / натриев цитрат, pH 6,0. Блюдото се развива за 5-10 min, докато абсорбцията при 630 nm е приблизително 1,0 за най-големия стандартен образец. Абсорбцията при 630 nm се измерва, използвайки брояч за блюдо, и концентрацията на пробата се определя чрез сравняване на кривите на титруване с тези на стандартния образец.
с) Определяне на константи на афинитет по метода на анализ BiaCore
Взаимодействието на свързване между hTNF40 и човешки TNF се изследва, използвайки технология BIA. Пречистено козе поликлонално антитяло, насочено срещу константната област на hTNF40, се фиксира върху сензорната повърхност на стружка от декстранов полимер, използвайки стандартна NHS/EDC химия. Относително ниски нива (200 - 5 - RU) от hTNF40 се улавят, за да се осигури, че се свеждат до минимум ефектите на мас транспорта. Човешки TNF с различни концентрации се пропускат над уловените hTNF40, което дава възможност за оценяването на асоциираните кинетики. След инжектирането на лиганда, се пропуска буфер върху повърхността, така че
66072 Bl дисоциирането да може да се измери. Скоростните константи на асоциирането и на дисоциирането за взаимодействието между твърдата фаза на hTNF40 и човешки TNF се изчисляват, и се извежда KD стойност. 5
Пример 1
CDR-присаждане на hTNF40
Молекулярното клониране на гени за вариабилните области на тежки и леки вериги на антитялото hTNF40 и използването му за 10 получаване на химерни (миши-човешки) антитела hTNF40 е описано по-горе. Нуклеотидната и амино киселинната последователност на миши hTNF40 VI и Vh са показани на фигури 6 и 7 (SEQ ID NOs: 99 и 100), съответно. Този опит 15 описва CDR-присаждането на антитялото hTNF40.
CDR-присаждане на hTNF40 лека верига
Подреждането на рамковите области на hTNF40 лека верига с тези на четирите човешки 20 подгрупи леки вериги (Rabat et al., 1991, supra) разкриват, че hTNF40 е най-хомоложен към антитела в човешка подгрупа лека верига 1. Следователно, за конструирането на CDRприсадена лека верига, избраните рамкирани 25 области съответстват на тези на човешката група 1 консенсус последователност.
Сравнение на амино киселинните последо вателности на рамковите области на мише hTNF40 и на консенсус леки вериги на човешка група 1 е дадено на фигура 1, и показва, че има 22 различия (подчертани) между двете последователности. Анализирането на приноса, който което и да е от тези рамкови различия би могло да има върху антигенното свързване идентифицира 2 остатъка за изследване; те са на позиции 46 и 60. На базата на този анализ, са създадени две версии на CDR-присадени леки вериги. Съгласно първата от тях, hTNF40-gLl (SEQ ID NO: 8), остатъци 46 и 60 произлизат от леката верига на hTNF40, докато съгласно втората, hTNF40-gLl (SEQ ID NO: 9), всичките остатъци са човешки консенсус, с изключение на остатък номер 60, който е от леката верига на hTNF40.
Конструиране на CDR-присадена лека верига на hTNF40-gLl.
Конструиране на hTNF40-gL 1 е дадено подолу в подробности. Следващото препокриване с олигонуклеотиди (Р7982 - Р7986) се използва при верижните реакции на полимераза (PCR), за да се събере накъсаната присадена лека верига. Събраните фрагменти имат нужда от лидерна последователност на антитялото, и от първите 17 амино киселини на рамка 1.
Олиго 1 Р7982:
5’GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGA ACGTAGGTACTAACGTAGCCTGGTATCAGCAAA3’ (SEQ ID N0:52)
Олиго 2 Р7983:
5’ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGG
GCTTTACCTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGT3’ (SEQ ID N0:55)
Олиго 3 P7984:
5TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAG GTTCAGCGGATCCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3’ (SEQ ID N0:54)
Олиго4Р7985:
5’GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCT ACTGATCGTGAGGGTGAAATCAGTACCACTACCG3’ (SEQ ID N0:55)
66072 Bl
Олиго 5 P7986:
5’ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTAC CCACTCACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGT ACGGAATTC3’ (SEQ ID N0:56)
Fwd P7981:
5GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3’ (SEQ ID N0:57)
Bwd P7980:
5’GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3’ (SEQ ID N0:58)
Реакция PCR, 100 microl, се прави да съдържа 10 шМтрис-HCl pH 8,3,1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1,0,01 % тегпо/обем желатин, 0,25 mM на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 2 pmoles от Р7982, Р7983, Р7984, Р7985, Р7986, 10 pmoles от Р7980, Р7981 и 1 единица Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 min, при 55°С в продължение на 1 min, и при 72°С в продължение на 1 min. След 30 цикъла, всяка една реакция се анализира чрез електрофореза върху агарозен гел и фрагмента PCR се изрязва от гела и се възстановява, използвайки Mermaid Kit. Възстановеният фрагмент се обработва с рестрикционните ензими BstEII и SplI в подходящ буфер. Полученият продукт накрая се подлага на електрофореза върху агарозен гел и ДНК фрагментът от 270 базови двойки се възстановява от гелния срез и се лигира във вектора CTIL5-gL6 (фигура 12), който предварително се разгражда със същите ензими. Горният вектор предоставя липсващата лидерна последователност на антитялото, и първите 17 амино киселини на рамката 1.
Сместа за лигиране се използва за трансформиране на щам Е. Coli щам LM1053, и получените колонии се анализират чрез PCR, разграждания с рестрикционен ензим, и нуклеотидно секвениране. Нуклеотидната и амино киселинната последователност на областта VI на hTNF40-gL 1 е показана на фигура 8 (SEQ ID NO: 8).
Конструиране на CDR-присадена лека верига на hTNF40-gL2.
hTNF40-gL2 (SEQ ID NO: 9) се конструира, използвайки PCR. Използват се следните олигонуклеотиди, за да се въведат промените на амино киселини:
R1053: 5OCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’ (SEQ ID N0:59)
R5350:
5’TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCAT AGATCAGGAGCTTAGGAGC3’ (SEQ ID N0:60)
R5349:
5’GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGAT
CAGGCACAGACTTTACCCTAAC3’ (SEQ ID N0:61)
R684: 5’TTCAACTGCTCATCAGAT3’ (SEQ ID N0:62)
66072 Bl
Две реакции, всяка по 20 microl, като се прави всяка една да съдържа 10 тМ трис-НС1 pH 8,3,1,5 mM MgCl2,50 тМ КС1,0,01 % тегло/ обем желатин, 0,25 тМ на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 0,1 microg hTNF40-gLl, 6 pmoles от R1053/R5350, или R5349/R684, и 0,25 единици Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 min, при 55°С в продължение на 1 min, и при 72°С в продължение на 1 min. След 30 цикъла, всяка една реакция се анализира чрез електрофореза върху агарозен гел и фрагмента PCR се изрязва от гела и се възстановява, използвайки Mermaid Kit.
Аликвотни части от тях след това се подлагат на втори кръг от PCR. Реакцията, 100 microl, съдържаща 10 тМ трис-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 тМ КС1, 0,01 % тегло/обем желатин, 1/5 от всеки от PCR фрагментите от първия комплект реакции, 30 pmoles от R1053 и R684, и 2,5 единици Taq полимераза. Температурите на реакциите са както по-горе. След PCR, сместа се екстрахира с фенол/хлороформ, и след това с хлороформ, и се утаява с етанол. Етаноловата утайка се възстановява чрез центрофугиране, разтваря се в подходящ буфер, и се обработват с рестрикционните ензими BstEII и SplI. Полученият продукт накрая се подлага на електрофореза върху агарозен гел и ДНК фрагмента от 270 основни двойки се възстановява от гелен срез и се лигира във вектора pMR15.1 (фигура 4), който предварително се разгражда със същите ензими.
Сместа за лигиране се използва за трансформиране на Е. Coli щам LM1053, и получените колонии се анализират чрез PCR, разграждания с рестрикционен ензим, и нуклеотидно секвениране. Нуклеотидната и амино киселинната последователност на областта VI на hTNF40-gL2 е показана на фигура 9 (SEQ ID NO: 9).
CDR-присаждане на тежка верига на hTNF40
CDR-присаждане на тежката верига на hTNF40 се осъществява, като се използва същата стратегия, както описаната за леката верига. Установено е, че тежката верига на hTNF40 е най-хомоложна към човешка тежка верига, принадлежаща на подгрупа 1, и поради това консенсус последователност на рамките на човешка подгрупа 1 се избират да приемат hTNF40 тежката верига на CDRs.
За да се изследва необходимостта хомоложна човешка рамка да действа като рамка приемник за CDR присаждане, избира се втора рамка, човешка група 3, да хуманизира тежка верига на h!NF40.
Сравнение на hTNF40 с двете различни рамкови области е показано на фигура 2, където може да се види, че hTNF40 се различава от консенсус човешка подгрупа 1 в 32 позиции (подчертано), и се различава от консенсус човешка подгрупа 3 в 40 позиции (подчертано). След анализирането на ползата, което всяко едно от тях би могло да даде за свързване на антиген, остатъци 28, 38, 46, 67, 69 и 71 се ангажират като донор в CDR-присадената тежка верига на hTNF40.1, използвайки рамката на група 1. Остатъци 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 и 78 се ангажират като донор в CDR-присадената тежка верига, gh3hTNF40.4, използвайки рамката на група 3. Остатъци 28, 69 и 71, се ангажират като донор в CDR-присадената тежка верига, gh3hTNF40.4, използвайки рамката на група 1.
Конструиране на CDR-присадена тежка верига на ghlhTNF40.4
GhlhINF40.4 (SEQ ID NO: 10) се събира, като се подложи на препокриване на олигонуклеотиди за PCR в присъствие на подходящи праймери. Следващите олигонуклеотиди се използват в PCR:
66072 Bl
Група 1 присадка
Олиго 1 Р7989:
5’GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGA CCAGCTGCACCTGAGAGTGCACGAATTC3’ (SEQ ID N0:63)
Олиго 2 P7990: 5’GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGT AAGGCCTCAGGCTACGTGTTCACAGACTATGGTA3’ (SEQ ID N0:64)
Олиго 3 P7991:
5’CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGC TTGACCCAATTCATACCATAGTCTGTGAACACGT3’ (SEQ ID N0:65)
Олиго 4 P7995:
5’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTG GAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGT TC3’ (SEQ ID N0:66)
Олиго 5 P7992:
5’CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGA ACGTGAATCTGCCCTTGAA3’ (SEQ ID N0:67)
Олиго 6 P7993:
5’CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAG ATCCGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’ (SEQ ID N0:68)
Олиго 7 P7994:
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAA GATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’ (SEQ ID N0:69)
Fwd: P7988:
5’GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3’ (SEQ ID N0:70)
66072 Bl
Bwd: P7987:
5OAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’ (SEQ ID N0.71)
Агрегатът от реакцията, 100 microl, съдържаща 10 mM трис-НСв pH 8,3, 1,5 mM MgCe2, 50 mM KCb, 0,01 % тегло/обем желатин, 0,25 mM на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 2 pmoles от р7989, р7990, р7991, р7995, р7992, р7993 и р7994,10 pmoles от всеки θ един от р7988, и р7987 и 1 единица Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 min, при 55°С в продължение на 1 min, и при 72°С в продължение на 1 min. След 30 цикъла, реакцията се екстрахира с фенол/хлороформ (1/1), след това с хлороформ, и се утаява с етанол. След центрофугиране ДНК се разтваря в подходящия рестрикционен буфер, и се разгражда с ApaLI и ΚρηΙ. Полученият фрагмент се изолира от агарозен гел и се лигира в pMR14 (фигура 5), който предварително се разгражда със същите ензими. pMR14 съдържа константната област на човешка гама 4 тежка верига, когато pMR14 се разцепва с ApaLI и ΚρηΙ, отцепеният вектор е в състояние да получи
Група 3 присадка
Олиго 1 Р7999:
разградената ДНК, така че 3' краят на разградената ДНК съединява в рамка за разчитане на 5' края на последователността кодираща гама 4 константната област. Поради това, тежката верига, експресирана от този вектор ще бъде изотип на гама 4. Сместа за свързване се използва за трансформиране на Е. Coli LM1053, и получените бактериални колонии, скринирани чрез рестрикционно разграждане и анализиране на нуклеотидна последователност. По този начин, се идентифицира плазмид, съдържащ коректната последователност за ghlhTNF40.4 (фигура 10) (SEQ IDNO: 10).
Конструиране на CDR-присадена тежка верига на gh3hTNF40.4 gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO: 11) се събира, като се подложи на припокриване на олигонуклеотиди за PCR в присъствие на подходящи праймери. Следващите олигонуклеотиди се използват в PCR:
5GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCG
ACCAGCTGAACCTCAGAGTGCACGAATTC3’ (SEQ ID N0:72)
Олиго 2 Р8000:
5TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGT GCTGCATCTGGTTACGTCTTCACAGACTATGGAA3’ (SEQ ID N0:73)
Олиго 3 Р8001:
5’CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGC TTAACCCAATTCATTCCATAGTCTGTGAAGACGT3’ (SEQ ID N0:74)
Олиго 4 P7995: 5’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTG GAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGT TC3’ (SEQ ID N0:66)
Олиго 5 P7997:
5’GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAA
CGTGAATCTGCCCTTGAA3’ (SEQ ID N0:75)
66072 Bl
Олиго 6 P7998:
5’CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAG AGCAGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’ (SEQ ID N0:76)
Олиго 7 P7993: 5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAA GATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’ (SEQ ID N0:77)
Fwd: P7996:
5’GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3’ (SEQ ID N0:78)
Bwd: P7987:
5OAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEQ ID N0:71)
Агрегатът от реакцията, 100 microl, съдържаща 10 mM трис-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCly 50 mM KC1, 0,01 % тегло/обем желатин, 25 0,25 mM на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 2 pmoles от р7999, р8000, р8001, р7995, р7997, р7998 и р7993,10 pmoles от всеки един от р7996, и р7987 и 1 единица Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 30 94°С в продължение на 1 min, при 55°С в продължение на 1 min, и при 72°С в продължение на 1 min. След 30 цикъла, реакцията се екстрахира с фенол/хлороформ (1/1), след това с хлороформ, и се утаява с етанол. След центрофугиране 3 5 ДНК се разтваря в подходящия рестрикционен буфер, и се разгражда cApaLI и KpnI. Полученият фрагмент се изолира от агарозен гел и се лигира в pMR14 (фигура 5), който предварително се разгражда със същите ензими. pMR14 съдържа 40 константна област на тежка верига на човешки гама 4. Когато pMR14 се отцепвас ApaLI и KpnI, присъединеният вектор е в състояние да получи разградената ДНК, така че 3’ краят на разградената ДНК да съединява в рамка за разчитане 45 на 5' края на последователността кодираща гама 4 константната област. Поради това, тежката верига, експресирана от този вектор ще бъде изотип на гама 4. Сместа за свързване се използ ва за трансформиране на Е. Coli LM1053, и получените бактериални колонии, екранирани чрез рестрикционно разграждане и анализиране на нуклеотидна последователност. По този начин, е идентифициран плазмид, съдържащ коректната последователност за gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO: 11) (фигура 11).
Получаване на CDR-присаден модифициран Fab фрагмент.
CDR-присаден, модифициран Fab фрагмент, на базата на антитяло hTNF40, се конструира, като се използва Е. coli вектора рТТО-1. Вариабилните области на hTNF40 се субклонират в този вектор, и междугенната последователност се оптимизира, за да създаде pTTO(CDP870). Векторът, експресиращ рТТО е предназначен да даде повишаване на разтворимото, периплазматично акумулиране на рекомбинантни протеини в Е. coli. Главните особености на този плазмид са:
(i) маркер за резистентност на тетрациклин - антибиотика не се инактивира от продукта на резистентен ген, от което следва, че се под държа селекционирането на плазмид-съдържащи клетки] (ii) малък брой копия - начало на репликация произхождаща от плазмид р15А, който е
66072 Bl сравним c плазмид, съдържащ colE произлизащи репликони;
(iii) силен, индуцируем tac промотор за транскриптиране на клониран(и) ген(и);
(iv) LacI4 ген - дава конститутивно експресиране на lac репресорния протеин, поддържащ tac промотора в репресирано състояние, до индуциране с IPTG/алолактоза;
(v) OmpA сигнална последователност дава периплазматично секретиране на клониран(и) ген(и); и (vi) транслационно свързване на OmpA сигнална последователност към къс lacZ пептид, даващ резултатно иницииране на транслиране.
Векторът е развит за експресиране на модифицирани Fab фрагменти от дицистронно съобщение от проектирането на метода да селекционира емпирично оптимална интергенна последователност от серия от по четири целесъобразно създадени касети. Описано е апликирането им в конструкцията на рТТО (CDP870).
Материали и методи
ДНК техники
Стандартни методики се използват за протоколи, включително ДНК обработване с рестрикционни ензими, електрофореза върху агарозен гел, лигиране и трансформиране. Рестрикционни ензими и ДНК модифициращи ензими се доставят от New England Biolab, или Boehringer Mannheim, и се използват съгласно приложените упътвания. ДНК фрагментите се пречистват от агароза, използвайки GeneClean protocol (BIO 101). Олигонуклеотиди се доставят от Oswel Oligonucleotide Service, и се синтезират по скалата 40 nm. Плазмид ДНК се изолира, използвайки Plasmid DMA Mini/Midi kits от Qiagen. PCR се осъществява, използвайки Perkin Elmer “Amplitaq”, съгласно указанието. ДНК секвенирането се осъществява, използвайки Applied Biosystems Tag cycl sequencing kit.
Индуциране в клатачна колба
Култура Е. coli W3110 се посяват в Lбульон, в който се добавя тетрациклин (7,5 microg/ml). За индуцирания, свежа култура от една нощ (прораснала при 30°С) се долива до OD^ на 0,1 в 200 ml L-бульон в 21 разделителна колба, и прерастват при 30°С в орбитален инкубатор. При OD^ от 0,5, се прибавя IPTG към 200 microM. Взимат се проби (калибрирани за OD) на интервали.
Периплазматично екстрахиране
Проби от култура се замразяват на лед (5 min), след това се събират клетки чрез центрофугиране. След повторно суспендиране в екстракционен буфер (100 тМ трис-НС1,10 тМ EDTA, pH 7,4), пробите се инкубират в продължение на една нощ при 30°С, след това се избистрят (изчистват от примеси) чрез центрофугиране.
Количествен анализ на агрегата
Модифицирани Fab концентрати се определят чрез ELISA. Блюдата се покриват при 4°С с античовешки Fd 6045 (2 microg/ml в покриващ буфер, физиологичен разтвор, 100 microl на ямка). След промиване, 100 microl от проба се пълни в ямка; като стандарт се използва пречистен А5В7 гама-1 Fab’, отначало при 2 microg/ml. Пробите се разреждат на серии 2кратно в блюдото в проба от конюгиращ буфер (на литър: 6,05 g трис-аминометан; 2,92 g NaCl; 0,1 ml Tween-20; 1 ml казеин (0,2 %)); блюдата се инкубират в продължение на 1 h при стайна температура, при разбъркване. Блюдата се промиват и се сушат, след това се прибавят 100 microl от античовешка С-капа (GDI 2)пероксидаза (разредена в буфер съединен с проба). Инкубирането се извършва при стайна температура в продължение на 1 h, при разбъркване. Блюдата се промиват и се сушат, след това се прибавят 100 microl от субстратния разтвор (10 ml разтвор натриев ацетат/цитрат (0,1 М pH 6); 100 microl разтвор на Н2О2; 100 microl тетраметилбензидинов разтвор (10 microg/ml в диметилсулфоксид)). Абсорбция при 630 mm се отчита 4-6 min след прибавянето на субстрата.
Конструиране на плазмид рТТО-1 (а) заместване на pTTQ9 полилинкер
Плазмид pTTQ9 се доставя от Amersham и е показан на фигура 14. Една аликвотна част (2 microg) се разгражда с рестрикционни ензими Sall и EcoRI, разграденият продукт се пуска на 1 % агарозен гел, и широк ДНК фрагмент (4520 Ьр) се пречиства. Синтезират се два олигонуклеотида, които, когато са хибридизирани заедно, кодират областта OmpA на полилинкера, показана на фигура 15. Тази последователност има кохезивни краища, които са сравними с краищата на Sall и EcoRI, генерирани от обработването с рестрикционни ензими на pTTQ9. Чрез
66072 Bl клониране на тази олигонуклеотидна “касета” във вектора pTTQ9, Sall сайта не се регенерира, но EcoRI сайта се поддържа. Касетата кодира първите 13 амино киселини на сигналната последователност на протеина на външната 5 мембрана Отр-А на Е. coli, предхождан от Shine Dalgarno рибозом свързващия сайт на гена ОтрА. Освен това, присъстват рестрикционни сайтове за ензими Xbal, Muni, Styl и SplI. Сайтовете Muni и Styl са в кодиращата област 10 на сигналната последователност ОтрА, и са предназначени да са 5' клониращи сайтове за инсериране на гени. Двата олигонуклеотида, които правят тази касета, се хибридизират заедно, чрез смесване при концентрация на 5 pmoles/ 15 microl, и водна баня до 95°С в продължение на 30 min, след това бавно се охлаждат до стайна температура. Хибридизираната последователност след това се лигира в Sall/EcoRI срязан pTTQ9.
(b) Получаване и лигиране на фрагмент 20 Плазмид рТТО-1 се конструира чрез лигиране на един ДНК фрагмент от плазмид pACYC184 до два фрагмента генерирани от pTQOmp. Плазмид pACYС184 се доставя от New England Biolabs, а рестрикционна карта е показана 25 на фигура 16. Една аликвотна част (2 microg) се разгражда напълно с рестрикционен ензим Styl, след това й се действа с Mung Been Nucleasa; при това въздействие се създават тъпи краища, чрез срязване след 5’ висящите бази. След 30 екстрахиране с фенол и утаяване с етанол, ДНК се разгражда с ензими PvuII, генериращи фрагменти на 2348, 1081, 412 и 403 Ьр. Фрагментът 2348 Ьр се пречиства след електрофореза върху агарозен гел. Този фрагмент 35 кодира маркер за резистентност на тетрациклин, и началото на репликирането на ρ 15А. След това на фрагмента се действа с телешка интестинална
Праймер 5':
алкална фосфатаза, за да се отстранят 5' терминалните фосфати, като с това се предотвратява самолигирането на тези молекули.
Една аликвотна част (2 microg) от плазмид pTQOmp се разгражда с ензимите Styl и EcoRI, и фрагментът 2350 Ьр се пречиства от нежелани фрагменти 2040 Ьр и 170 Ьр, след електрофореза върху агарозен гел; този фрагмент кодира областта на транскрипционния терминатор и гена laclq. Друга аликвотна част (2 microg) от плазмид pTQOmp се разгражда с EcoRI и XmnI, генериращи фрагменти 2289, 1670, 350 и 250 Ьр. Фрагментът 350 Ьр, кодиращ tac промотора, ОтрА сигналната последователност, и мултиклониращия сайт, се пречиства чрез гел.
След това трите фрагмента се лигират, използвайки приблизително еквимоларни количества от всеки фрагмент, за да се генерира плазмида рТТО-1. Всички клониращи съединения се проверяват чрез ДНК секвениране. Рестрикционната карта на този плазмид е показана на фигура 17. След това се създава плазмид рТТО-2, като се инсерира ДНК кодираща капа константен домен на лека верига на човешки Ig. Той се получава като рестрикционен фрагмент Spl I - EcoRI от плазмид рНС132, и инсериран в съответните сайтове в рТТО-1. Плазмид в рТТО-2 е показан на фигура 18.
Инсериране на хуманизирани hTNF40 вариабилни области в рТТО-2
Вариабилната област на леката верига на hTNF40gLl (SEQ ID NO: 8) се получава чрез PCR “освобождаване” от съответния вектор за експресиране на клетка от бозайник pMRIO.l. Лидерната последователност ОтрА замества нативния Ig лидер. Последователността на PCR праймерите е показана по-долу:
CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTAC CGTAGCGCAAGCTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC (SEQ ID N0:79)
Праймер 3':
TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEQ ID N0:80) зо
66072 Bl
След PCR при стандартни условия, продуктът се пречиства, разгражда се с ензими Muni и SplI, след това се пречиства с гел. След това пречистеният фрагмент се инсерира в сайтовете Munl/Sp 11 на рТТО-2, за да се създаде междинната pTTO(hTNF40L) лека верига.
Вариабилната област на тежката верига на gh3hTNF40.4 се получава по същия начин от вектора pGamma-4. Последователността на PCR 5 праймерите е показана по-долу:
Праймер 5':
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCAC CGTGGCGCAAGCTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC (SEQ ID N0:81)
Праймер 3’:
GCCTGAGTTCCACGACAC (SEQ ID N0:82)
След PCR продуктът се пречиства, разгражда се с ензими Nhel и Apal, след това се субклонира във вектора pflHKbEng-Gl (фигура 19). След проверяване чрез ДНК секвениране, тежката верига се обработва с рестрикционен ензим EcoRI, и се субклонира в EcoRI сайта на pTTO(hTNF40L), за да се създаде експресионния плазмид pTTO(hTNF40L) на Е. coli.
Оптимизиране на междугенна последователност за експресиране на модифициран фрагмент
Във вектора рТТО, модифициран Fab фрагмент се появява от дицистронно съобщение, кодиращо първо лека верига, след това тежка верига. ДНК последователността между двата гена (междугенна последователност, IGS) може да оказва влияние върху нивото на експресиране на тежката верига, като засяга скоростта на транслационното иницииране. Например, къса междугенна последователност може да доведе до транслационно присъединяване между леката и тежката верига, при което транслационният рибозом може да не се дисоциира напълно от иРНК след като синтезирането на леката верига завърши преди иницииране на синтезирането на тежката верига. “Силата” на който и да е Shine Delgamo (SD) рибозомен присъединяващ сайт (хомолог на 16S гРНК) може също така да има ефект, както може да има и разстоянието и състава на последователността между SD и ATG стартовия кодон. Потенциалната вторична структура на иРНК около ATG, е друг важен фактор; ATG ще бъде в “бримка” и няма да е скован в “стебло”, докато обратното важи за SD. Така, чрез модифициране на състава и дължината на IGS, е възможно да се модифицира дължината на транслационното иницииране, а оттук и нивото на получаването на тежка верига. Подходящо е, оптималната степен на транслационно иницииране да изисква да се осъществи до максимално експресиране на тежката верига на даден модифициран Fab. Например, с един модифициран Fab, може да се толерира високо ниво на експресиране, но за различно модифициран Fab с различна амино киселинна последователност, високо ниво на експресиране може да се окаже токсично, може би поради различните резултати от секретиране, или прегъване. Поради тази причина, създават се серии от четири междугенни последователности (фигура 20), позволяващи емпиричното определяне на оптимално IGS за hTNF40-6a3npaH модифициран Fab. IGS1 и IGS2 имат много къси междугенни последователности (-1 и+1 съответно), и може да се очаква да дадат плътно свързана транслация; SD последователностите (подчертани) са незабележимо различни. Тези две последователности найвероятно дават високо ниво на транслационно иницииране. IGS3 и IGS4 имат по-дълго разстояние между стартовите и стоп колоните (+13), и се различават по състава на тяхната последователност; IGS3 има “по-силна” SD последователност. Всички последователности се
66072 Bl изследват за вторична структура (използвайки програма m/гънка), и “се оптимизират” толкова, колкото е възможно; обаче, с недостатъчно съединяване на транслацията на двете вериги, липсата на рибозомно дисоцииране означава, че иРНК може да не е “оголена”, предотвратяващо образуването на вторична структура.
Клониране на IGS варианти
Касетите IGS, показани на фигура 20 имат граничещи SacI и Muni клониращи сайтове. Те са построени чрез хибридизиране на комплементарни олигонуклеотидни двойки. Векторен фрагмент се получава чрез разграждане на pTTO(hTNF40) със SacI и Notl, а фрагмент на тежка верига се получава чрез разграждане HapflHKbEngGl(hTNF40H)cMunI nNotl. След това се осъществяват три начина на лигиране, използвайки еквимоларни количества от двата рестрикционни фрагмента, и приблизително 0,05 pmoles от всяка една от хибридизираните олиго касети. Това създава четирите експресионни плазмидарТТО (hTNF40 IGS-1), pTTO (hTNF40 IGS-2), pTTO (hTNF40 IGS-3), pTTO (hTNF40 IGS-4).
Експресионен анализ в клатачна колба
Четирите плазмида се трансформират в Е. coli щам W3110, заедно с оригиналната експресионна конструкция, и след това се анализират за експресиране в клатачни колби, съгласно описанието. Резултатите от характерния експеримент са посочени на фигура 21. Различните междугенни последователности дават различни експресионни профили. IGS-1 и IGS-2 акумулират периплазматичен модифициран Fab бързо, с пик на 1 h след индуциране, след което възстановеното ниво спада. Пикът е по-голям, и спадът е по-остър за IGS1. Тези резултати съответстват с високо ниво на синтезиране, както се очаква за плътно транслационно свързване на тези конструкции. IGS1 очевидно води до по-високо ниво на експресиране на тежка верига, отколкото IGS2. В този случай, изглежда че това високо ниво на експресиране е по-слабо толерирано, тъй като нивата на периплазматично експресиране спадат след пика на 1 h. Това се вижда на профила на растеж на културата IGS1 (не е показано), чийто пик на 1 h след индуциране преди спадане, предполага умиране на клетките и лизис. IGS3 акумулира модифициран Fab по-бавно, но се издига най-високо на 2 h след индуцирането, с най-висока стойност на пика (325 ng/ml/OD), преди спадането на нивата. Растежа на тази култура продължава до 3 h след индуцирането, и достига до по-висок пик на биомаса (не е показано).
Това е в съгласие с по-ниското ниво на синтезиране на тежка верига. IGS4 акумулира материал при по-малка скорост все още, и не успява да достигне високия пик на продуктивност на другите 3 конструкции. Всички IGS варианти превъзхождат оригиналния вектор значително. Хипотезата, че различните IGS последователности дават различни скорости на транслационно иницииране се поддържа от тези експериментални резултати. За модифициран Fab на базата на hTNF40, изглежда че висока скорост на транслационно иницииране на тежка верига е слабо толерирана, и поради това не е оптимална. По-малка скорост, както е за IGS3, води до по-добри растежни характеристики, и, следователно, натрупване на по-добър добив с времето.
След сравняване на продуктивността във ферментатора, конструкцията IGS3 се избира като даваща най-висок добив, и е наречена pTTO(CDP870) - виж фигура 22.
Тежката верига, кодирана от плазмида pTTO(CDP870) има последователността, дадена в SEQ ID NO: 115, а леката верига има последователността, дадена в SEQ ID NO: 113.
PEG-илиране на CDR-присаден, hTNF40базиран модифициран Fab
Пречистеният модифициран Fab е специфично сайт конюгиран с разклонена молекула на PEG. Това се осъществява чрез активиране на единичен цистеинов остатък в отрязана стърчаща област на модифицирания Fab, последвано от реакция с (РЕС)-лизил малеимид, както е описано предварително (А. Р. Chapman et al., Nature Biotechnology 17,780783,1999). PEG-илираната молекула е показана на фигура 13, и се нарича съединение CDP870.
Ефикасност на PEG-илиран CDRприсаден, hTNF40-6a3npaH модифициран Fab (CDP870) при лечение на ревматоиден артрит
CDP870 има дълъг полуживот от порядъка на приблизително 11 дни.
Ние оценяваме безопасността и ефикасността на интравенозен CDP870 при опит със случайно двойно-сляпо дозиране с контрола
66072 Bl плацебо, при пациенти с RA.
Методи
Пациенти;
Пациенти на възраст между 18 и 75 години, и които удовлетворяват преразгледания през 1987 г. от American College of Rheumatology (ACR) diagnostic criteria for reumatoid arthritis (RA) (критерии за диагностициране на ревматоиден артрит) (Amet et al., Arthritis Reum., 31, 315-324, 1988), се избират от приходящи пациенти на Rheumatology clinics at London, Cambridge, Norfolk and Norwich (Unated Kingdom). Изисква се пациентите да имат клинично активно заболяване, което се определя, ако имат най-малко 3 от следните критерии: ? 6 болезнени, или меки стави; ? 45 min на сутрешна скованост; и скорост на утаяване на еритроцитите (ESR) ? 28 mm/hr. Те трябва да са имали неуспех при отговор на най-малко едно модифициращо болестта противоревматично лекарствено средство (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug (DRARD)) и са били подложени на лечение наймалко 4 седмици. Кортикостероиди са позволени, ако дозата е ? 7,5 mg/ден преднизолон. Бременни жени, кърмачки и жени в детеродна способност, неизползващи ефективен контрацептивен метод се изключват. Пациентите се изключват също така, ако те имат предшестваща история на злокачествено заболяване, съпътстващи тежки неконтролирани медицински състояния, предишен неуспех на лечение неутрализиращо TNF, или алергия към полиетиленгликол. Писмено информиращо съгласие се получава от всеки пациент преди записването. Изследването е одобрено от местния комитет по етика на изследванията.
Протокол на лечението
RA пациенти се разделят на 3 групи, като всяка една получава повишаваща доза от опитното лекарствено средство (1,5, или 20 mg/ kg). Всяка група от 12 се разделя произволно на 8, които да получат CDP870, и 4, които да получат плацебо. CDP870 се дава като единична интравенозна инфузия (100 ml общо) в продължение на 60 min. Плацебо (натриевоацетатен буфер) се дава по подобен начин като единична интравенозна инфузия от 100 ml в продължение на 60 min. Лечението се провежда на базата на приходящи пациенти. След 8 седмици, всички пациенти са имали възможността да получат инфузия или от 5, или от 20 mg/kg CDP870 по отворен начин.
Клинично изследване
Активността на RA заболяване се изследва на базата на World Health Oiganization (Световната здравна организация) и International League of Associations for Reumatology (Международен съюз на асоциациите по ревматология) (Boers et al., Reumatol - Supplement, 41, 86-89, 1994) и European League Ageinst Reumatism (EULAR) (Европейския съюз срещу ревматизъм) (Scott et al., Clin. Exp. Reumatol., 10, 521-525, 1992) съществените данни са изложени за бройка от 28 стави. Промени в активността на заболяването се изследват чрез Disease Activity Score (Prevoo et al., Arthritis Rheum., 38, 44-48, 1995) и ACR responses criteria (Felson et al., Arthritis Rheum., 38, 727-735, 1995). Изследвания се провеждат преди лечението, и на 1,2,4,6 и 8 седмици след лечението. Пациентите също така се изследват за безопасност и поносимост на изследваното лекарствено средство. Хематология, биохимия, противо-СОР870 антитела и различни възможности се изследват при всяка визита.
CDP870 плазмена концентрация и противоCDP870 антитела
CDP870 се измерва чрез изследване на ензимно-свързан имуносорбент (ELISA). Серийни разреждания на плазма от пациенти се инкубират в блюда за микротитруване (Nunc) покрити с рекомбинантни човешки Т№алфа (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Уловен CDP870 се проявява чрез козя противочовешка капа лека верига конюгирана с пероксидаза от хрян (Cappel, INC), последвано от тетраметилбензидинов (ТМВ) субстрат.
Антитела срещу CDP870 се скринират (при 1/10 разреждане на плазма), използвайки сандвич ELISA двоен антиген с биотинилиран CDP870 като втори пласт. Свързаните антитела се освобождават, използвайки HRPстрептавидин и ТМВ субстрат. Изследването се калибрира, използвайки свръхимунен заешки IG стандарт. Единицата за активност е еквивалентна на 1 microg заешки стандарт.
Статистически анализ
Изследването е изследователско по отношение на природата, и размера на пробата се базира на предварителен опит с подобни средства. Ефикасността на CDP870 се
66072 Bl анализира, като се изчисли резултата от активността на заболяването (DAS) и ACR20/50 отговори за намерението да се лекува и за протокол, използвайки методика на плътно изпитание. Резултатът от активността на заболяването 5 се изчислява както следва: DAS = 0,555 х корен квадратен от (28 меки стави) + 0,284 х корен квадратен от (28 подути стави) + 0,7 х In(ESR) + 0,0142 х (обща оценка на пациента). Най-напред, обединените активни групи се сравняват с 10 плацебо. Ако това сравнение е значимо при 5 % ниво, всяка група на дозиране се сравнява с плацебо. Всички сравнения са двойно обработени със значимо ниво от 5 %. Всички Р-стойности произлизат от изследователските анализи, и не 15 се използват за инференциращи интерпретации.
Резултати
Демография
Приемат се 36 пациенти с RA. Техните демографски подробности са дадени на таблица
6. Средната възраст е 56 години, и 30 пациенти са жени. Средната продължителност на RA е 13 години, а 21 пациенти са с положителен ревматоиден фактор. Пациенти в различните групи имат подобни демографски характеристики. През периода на сляпо дозиране, 6/12 пациенти лекувани с плацебо отпадат от изследването поради влошаване на RA ? 4, седмици след дозирането. 2/24 пациенти, лекувани с CDP870 отпадат, и двата в групата с 1 mg/kg, поради влошаване на RA/загуба при следващите > 4 седмици след дозирането. Разликата е статистически значителна (р = 0,009, Fisher exact test).
Таблица 6: Демографски подробности (средно ± стандартно отклонение)
Брой
Пол Възраст Продъл- Рев- Брой
(М:Ж) жител- матои- на
ност на ден предиш-
заболя- фак- ни
ването тор DMARDs
Плацебо 12 1,11 51±8 12±8 8(67%) 5±1
1 mg/kg 8 1:7 59±7 12±7 4(50%) 4±1
5 mg/kg 8 2:6 54±13 13±5 5(63%) 5±2
20 mg/kg 8 2:6 61±11 14±13 4(50%) 4±2
Клинична ефикасност
Пропорционалността на пациенти с ACR20 подобрение за популацията на протокол с последно извършено наблюдение преди това, е 16,7, 50, 87,5, и 62,5 % след плацебо, 1,5 и 20 mg/kg CDP870 (комбиниран лечебен ефект р = 0,012) на 4 седмици, и 16,7, 25, 75 и 75 % (р = 0,032) на 8 седмици. Намаление на резултата на DAS (средно) за популацията на протокол с последно извършено наблюдение е 0,15, 1,14, 1,91 и 1,95 след плацебо, 1,5 и 20 mg/kg CDP870 (комбиниран лечебен ефект р = 0,001) на 4 седмици, и 0,31, 0,09,2,09 и 1,76 (р = 0,008) на 8 седмици (фигура 23). Изменения в отделните съставни части на World Health Organization и International League of Associations for Rheumatology комплект от съществени данни е показан на фигура 24.
66072 Bl
След отворената белязана доза за еднократно дозиране на CDP870, се постигат подобни благоприятни ефекти. От 36-те пациенти, приети за изследването, 32 получават втора инфузия с CDP870. Пропорционалността на пациенти с ACR20 подобрение от предшестващото първо инфузиране е 72,2 и 55,6 % след 5 и 20 mg/kg CDP870 на 4 седмици, и 55,6 и 66,7 % на 8 седмици.
Нежелателни явления
Лечението се понася добре, без свързана с инфузия реакция. Не се докладва за никаква алергична реакция, или кожен обрив. При двойно-сляпата фаза, има 19, 38, 8 и 14 нежелателни явления с плацебо, в групите с 1,5 и 20 mg/kg съответно. Най-общото е главоболие с 9 епизоди при 5 пациента (1 с плацебо, 3 с 1 mg/kg, 1 с 20 mg/kg). Един пациент, който получава плацебо и 3 пациенти, които получават CDP870 (1 с 5 mg/kg, и 2 с 20 mg/kg) развиват инфекции в долните дихателни пътища. Те се докладват като средни, или умерени. Те се лекуват с орално приложение на антибиотици, и се възстановяват след 1-2-седмичен период. Трима пациенти, всеки един от които в групите с 1 и 5 mg/kg и един в групата с 20 mg/kg развиват инфекция на пикочните пътища 1-2 месеца след лечението с CDP870. Едно нежелателно явление е описано като тежко, което е епизод на болки в гърлото, появили се 3 дена след инфузия с 1 mg/kg. Повишаване на антинуклеарно антитяло се наблюдава при 4 пациенти: 1 в групата на плацебо (отрицателно до 1/40), 2 в групата с 1 mg/kg (отрицателно до 1/40, отрицателно до 1/80), и 1 в групата с 20 mg/kg (отрицателно до 1/40). Не се установяват промени в анти-ДНК антителата, или в антителата анти-кардиолипини.
CDP870 плазмена концентрация и антиCDP870 нива
Съгласно очакването, за всички нива на дозиране на CDP870, пикът на плазмена концентрация се появява в края на инфузията, и е с доза пропорционална на бавното спадане на плазмената концентрация след това. Профилът на плазмената концентрация на CDP870 изглежда много подобен на този, наблюдаван предварително при доброволци, където полуживотьт се изчислява, че е приблизително 14 дена. При повторно дозиране, се наблюдава подобен профил за единична доза на инфузия.
След единична интравенозна инфузия, нивата на анти-СОР870 са ниски, или неоткриваеми.
Обсъждане
Неутрализирането на ЮТалфа е ефективна стратегия за лечение на RA. Понастоящем, това изисква използването на биологични средства, такива като mAb, или разтворим рецептор/човешки Fc слят протеин, които са скъпи в търговската мрежа. Терапевтичното средство за неутрализиране на Т№алфа се нуждае от свързване към ТЪТалфа с висок афинитет, и има дълъг плазмен полуживот, ниска антигенност, и висока поносимост и безопасност. То също така се нуждае от това да бъде приемливо за всички пациенти с RA, които биха се подобрили от блокиране на Т№алфа. Една технология, която би могла да постигне тези цели е конюгирането с полиетилен гликол на ЮТалфа свързващ фрагмент от антитяло в Е. coli. В това предварително изследване, ние установяваме, че CDP870, PEG-илиран, антиТЪТалфа, модифициран Fab, е ефективен, и добре поносим от пациенти с RA.
Изследванията in vitro показват, че CDP870 има подобна ТЪТалфа неутрализираща активност към мише анти-TNFалфа родителско антитяло. Това изследване потвърждава, че CDP870 намалява възпалението, и подобрява симптомите HaRA. Клинично подобрение, както се измерва чрез критерий за ACR20 отговор в групите с 5 и с 20 mg/kg (75 %, 75 %) е сравнимо с етанерцепт (etanercept) (60 %) (Moreland et al., Anal. Int. Med., 130, 478-486, 1999) и инфликсимаб (infliximab) (50 %) (Maini et al., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). При средните и при най-високите изследвани нива на дозиране, терапевтичният ефект достига до 8 седмици, което е сравнимо с предшестващите други mAbs (Elliott et al., Lancet, 344,1105-1110,1994 и Rankin et al., Br. J. Rheumatol., 34, 334-342, 1995). Предшестващо изследване показва, че терапевтичният ефект на анти-ТЪШалфа антитяло е свързан с неговия плазмен полуживот и генерирането на циркулиращи антитела (Maini et al., Artritis Rheum. 38, (Supplement): S 186 1995 (Abstract)). Нашето изследване показва, че CDP870 има плазмен полуживот 14 дена, който е еквивалентен на този на цяло антитяло (Rankin
66072 Bl et al., (supra)) и много по-дълъг от полуживота на неконюгирани фрагменти Fab’. Освен това, CDP870 генерира само много ниски нива на отговор на антитяло.
Една от важните цели на това изследване е 5 да се изпита поносимостга и безопасността при прилагането на тези PEG-илирани Fab’. В нашето изследване, CDP870 се показва добре поносимо. Въпреки това, необходимо е допълнително изследване, за да се оцени дългосрочна токсичност, 10 по-специално риска от демиелиниращо заболяване, инфекция и кожни обриви, за които е докладвано при етанерцепт и инфликсимаб.
Като обобщение, CDP870 е терапевтично ефективно при RA, и е добре поносимо при това 15 краткотрайно изследване.
Трябва да се разбира, че гореописаните примери са само примерни образци, и не ограничават обхвата на настоящото изобретение, както се дефинира в следващите претенции. 20

Claims (12)

1. Молекула на антитяло, имаща специфичност за човешки ТИРалфа, съдържаща лека верига и тежка верига, в която леката верига съдър- 25 жа променлива област hTNF40-gLlV, посочена като SEQ ID N0: 8, и тежката верига съдържа променлива област ghTNF40.4, посочена като SEQ IDNO: 11.
2. Молекула на антитяло, имаща специфичност за човешки ЮТалфа, съдържаща лека верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID N0:113, и тежка верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID N0:115.
3. Съединение, съдържащо молекулата на антитяло, имаща специфичност за човешки ТИБалфа, съдържаща лека верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID NO: 113, и тежка верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID N0: 115, имащо прикрепена към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига лизил-малеимидна извлечена група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи-(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000 Da, такова че общото средно молекулно тегло на метоксиполи(етиленгликол)-ов остатъци е около 40,000 Da.
4. Съединение съгласно претенция 3, където лизил-малеимидна извлечената група е [1 -[[[2-[[3-(2,5-диоксо-1 -пиролидинил)-1оксопропил]амино]етил]амино]-карбонил]-1,5пентанедил]бис(иминокарбонил).
5. Съединение, съдържащо молекулата на антитяло съгласно претенция 2 с формула:
където η е около 420.
6. ДНК последователност, която кодира тежката и/или леката верига на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 3. 45
7. Клониращ или експресиращ вектор, съдържащ ДНК последователността съгласно претенция 6.
8. Клетка гостоприемник, трансформирана с вектора съгласно претенция 7. «θ
9. Метод за получаването на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че се състои в култивиране на клетката гостоприемник съгласно претенция 8 и изолиране на молекулата на антитялото.
10. Терапевтичен или диагностичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа молекулата на антитяло съгласно която и да е
66072 Bl претенция 1 или 2, или съединението съгласно която и да е претенция от 3 до 5, заедно с фармацевтично приемлив носител.
11. Молекула на антитяло съгласно претенция 1 или 2, или съединение съгласно която и да е претенция от 3 до 5, за използване при лечение.
Comparisons of framework regions of light chain of antibody hTNF40 and human group 1 consensus sequences
12. Използване на молекулата на антитяло съгласно претенция 1 или 2, или на съединение съгласно която и да е претенция от 3 до 5, в производството на лекарство за лечение на 5 ревматоиден артрит, остеоартрит, болест на Crohn или псориазис.
BG106278A 2000-06-06 2002-01-04 Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване BG66072B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products
PCT/GB2001/002477 WO2001094585A1 (en) 2000-06-06 2001-06-05 Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG106278A BG106278A (bg) 2002-12-29
BG66072B1 true BG66072B1 (bg) 2011-01-31

Family

ID=9893121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106278A BG66072B1 (bg) 2000-06-06 2002-01-04 Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване

Country Status (43)

Country Link
US (4) US7012135B2 (bg)
EP (4) EP2230308B1 (bg)
JP (3) JP4064812B2 (bg)
KR (1) KR20020047097A (bg)
CN (1) CN1289671C (bg)
AP (1) AP2092A (bg)
AR (1) AR033978A1 (bg)
AT (1) ATE451460T1 (bg)
AU (1) AU783756B2 (bg)
BE (1) BE2010C019I2 (bg)
BG (1) BG66072B1 (bg)
BR (2) BR0106682A (bg)
CA (2) CA2707766C (bg)
CY (6) CY1109889T1 (bg)
CZ (1) CZ300737B6 (bg)
DE (3) DE122010000027I1 (bg)
DK (4) DK2230308T3 (bg)
EC (1) ECSP024210A (bg)
ES (5) ES2600080T3 (bg)
FR (1) FR10C0015I2 (bg)
GB (2) GB0013810D0 (bg)
HK (2) HK1051385A1 (bg)
HU (4) HU230561B1 (bg)
IL (3) IL147992A0 (bg)
IS (2) IS2808B (bg)
LT (1) LT2308975T (bg)
LU (1) LU91674I2 (bg)
MX (1) MXPA01013440A (bg)
MY (1) MY136603A (bg)
NL (1) NL300982I9 (bg)
NO (4) NO334808B1 (bg)
NZ (1) NZ516596A (bg)
OA (1) OA12282A (bg)
PE (1) PE20020292A1 (bg)
PL (2) PL212738B1 (bg)
PT (4) PT1287140E (bg)
RU (1) RU2303604C2 (bg)
SI (3) SI2230308T1 (bg)
SK (1) SK288343B6 (bg)
TR (1) TR201900227T4 (bg)
TW (2) TWI316088B (bg)
WO (1) WO2001094585A1 (bg)
ZA (1) ZA200200097B (bg)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2817619A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
WO2003080674A1 (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Pharmacia Corporation Antibody disulfide isomers, use thereof, and methods of analyzing same
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
SG187991A1 (en) 2002-05-02 2013-03-28 Wyeth Corp Calicheamicin derivative-carrier conjugates
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1534753B1 (en) 2002-05-28 2011-08-03 UCB Pharma, S.A. Peg positional isomer of an anti-tnfalpha antibody (cdp870)
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
CA2800126A1 (en) * 2002-07-19 2004-01-29 Abbott Biotechnology Ltd. Treatment of tnf.alpha. related disorders
US20040247588A1 (en) * 2002-08-28 2004-12-09 Johnson Robert E. Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US20040091490A1 (en) * 2002-08-28 2004-05-13 Robert Johnson Stable pH optimized formulation of a modified antibody
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
US20070010658A1 (en) 2002-10-29 2007-01-11 Holtet Thor L Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US7575893B2 (en) * 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1597299A2 (en) * 2003-02-19 2005-11-23 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
SI1639011T1 (sl) * 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
SI1656455T1 (sl) * 2003-08-13 2012-12-31 Sandoz Ag Postopek za čiščenje rekombinantnih polipeptidov
US7785830B2 (en) * 2003-08-13 2010-08-31 Sandoz Ag Expression vectors, transformed host cells and fermentation process for the production of recombinant polypeptides
GB0319601D0 (en) * 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2006062776A2 (en) * 2004-11-29 2006-06-15 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
JP4642862B2 (ja) * 2004-12-29 2011-03-02 ユーハン・コーポレイション ヒト腫瘍壊死因子−アルファに特異的なヒト化抗体
TWI399384B (zh) * 2005-05-16 2013-06-21 Abbott Biotech Ltd ＴＮＦα抑制劑於治療侵蝕型多發性關節炎之用途
RU2425054C2 (ru) * 2005-06-01 2011-07-27 Микромет Аг Антитела против il2
PT2390267E (pt) 2005-06-07 2013-07-16 Esbatech A Novartis Co Llc Anticorpos estáveis e solúveis que inibem tnf(alfa)
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
JP2009533347A (ja) * 2006-04-07 2009-09-17 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 抗ＴＮＦα抗体の複合体
EP2666472A3 (en) * 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
AU2007269714A1 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CA2678367C (en) * 2007-03-02 2014-07-08 Farnam Companies, Inc. Sustained release compositions using wax-like materials
WO2008153997A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-18 Brookwood Pharmaceuticals, Inc. Reduced-mass, long-acting dosage forms
WO2008154543A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
BRPI0907485A2 (pt) * 2008-02-05 2015-08-04 Delenex Therapeutics Ag Polipeptídeos de ligação a antígeno contra degeneração de cartilagem
BRPI0912570B8 (pt) * 2008-05-07 2021-05-25 Argos Therapeutics Inc anticorpo anti-ifn-alfa humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição terapêutica e seus usos
SI2307457T2 (sl) * 2008-06-25 2022-10-28 Novartis Ag Stabilna in topna protitelesa, ki inhibirajo TNF
PL2752428T3 (pl) 2008-06-25 2020-05-18 Novartis Ag Humanizowanie przeciwciał króliczych z zastosowaniem uniwersalnego zrębu przeciwciała
ES2890405T3 (es) 2008-06-25 2022-01-19 Novartis Ag Humanización de anticuerpos de conejo usando un armazón de anticuerpo universal
CA3020290A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting vegf
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
CA2749966A1 (en) * 2009-01-29 2010-08-05 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US9150640B2 (en) 2009-07-10 2015-10-06 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
CN102575241B (zh) 2009-09-24 2016-02-24 Ucb医药有限公司 细菌宿主菌株
CN104447996A (zh) 2009-10-23 2015-03-25 米伦纽姆医药公司 抗gcc抗体分子及其相关组合物和方法
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201001791D0 (en) 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
AU2011223547B2 (en) 2010-03-04 2016-05-05 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD52
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
KR20150038556A (ko) 2010-04-07 2015-04-08 애브비 인코포레이티드 ＴＮＦ-α 결합 단백질
GB201012603D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012599D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
UY33679A (es) 2010-10-22 2012-03-30 Esbatech Anticuerpos estables y solubles
BR112013030824A8 (pt) 2011-06-01 2018-04-03 Actogenix Nv Bactéria gram-positiva, ácido necleico recombinante, composição farmacêutica e vetor
KR102023786B1 (ko) 2011-07-13 2019-09-20 유씨비 파마, 에스.에이. 재조합 dsbc를 발현하는 세균 숙주 균주
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
ES2676270T3 (es) 2011-09-23 2018-07-18 Intrexon Actobiotics Nv Bacterias grampositivas modificadas y usos de éstas
ES2676707T3 (es) 2011-09-23 2018-07-24 Intrexon Actobiotics Nv Bacterias gram positivas modificadas y usos de las mismas
WO2013087911A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
CN104520328B (zh) 2012-08-13 2019-06-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗锯齿蛋白抗体及使用方法
JP2017518737A (ja) 2014-04-21 2017-07-13 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＳＹＫ標的治療薬のための抗ｐＳＹＫ抗体分子及びその使用
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
EP3237433A1 (en) 2014-12-22 2017-11-01 UCB Biopharma SPRL Method of protein manufacture
US11091559B2 (en) 2015-08-27 2021-08-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ALK antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
DK3402499T3 (da) 2016-01-14 2021-09-27 Intrexon Actobiotics Nv Sammensætninger og fremgangsmåder til behandlingen af type 1 diabetes
RU2680011C2 (ru) * 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
DK3464318T3 (da) * 2016-06-02 2021-06-28 Abbvie Inc Glucocorticoidreceptoragonist og immunkonjugater deraf
RS61994B1 (sr) 2017-12-01 2021-07-30 Abbvie Inc Agonist glukokortikoidnog receptora i njegovi imunokonjugati
KR20210122243A (ko) 2019-01-31 2021-10-08 누맙 세러퓨틱스 아게 ＴＮＦα 및 ＩＬ-17Ａ에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체, ＩＬ-17Ａ를 표적화하는 항체, 그리고 이의 사용 방법
KR102323342B1 (ko) * 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
KR20230146032A (ko) 2021-02-15 2023-10-18 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Tgf-b 신호전달을 조절하기 위한 세포 치료 조성물 및 방법
WO2023025248A1 (zh) 2021-08-26 2023-03-02 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
JP2024534603A (ja) 2021-09-24 2024-09-20 エックスブレイン バイオファーマ エービー 組換えタンパク質を発現させるためのｄｎａ構築物及び宿主細胞
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
WO2024180518A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) * 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
GB2246570A (en) * 1989-12-21 1992-02-05 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB2297145A (en) * 1995-01-23 1996-07-24 Western Atlas Int Inc EBW perforating gun system
US5919452A (en) * 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
EP0871641A4 (en) 1995-04-20 2001-09-26 Kennedy Inst Of Rheumatology MULTIPLE ADMINISTRATION OF ANTI-TNF ANTIBODIES
BRPI9715219B8 (pt) 1996-02-09 2015-07-07 Abbvie Biotechnology Ltd Vetor recombinante de expressão, e célula hospedeira procariótica.
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) * 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
EP1015480A2 (en) * 1997-08-18 2000-07-05 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CA2323048C (en) 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) * 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
GB2246570A (en) * 1989-12-21 1992-02-05 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5919452A (en) * 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB2297145A (en) * 1995-01-23 1996-07-24 Western Atlas Int Inc EBW perforating gun system

Also Published As

Publication number Publication date
NO20131316L (no) 2002-04-08
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
PT1287140E (pt) 2010-03-08
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
NO341218B1 (no) 2017-09-11
IL195085A0 (en) 2009-08-03
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
TWI316088B (en) 2009-10-21
MY136603A (en) 2008-10-31
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
NO339282B1 (no) 2016-11-21
NZ516596A (en) 2004-07-30
NO334808B1 (no) 2014-06-02
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
IS3016B (is) 2019-10-15
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
LU91674I9 (bg) 2019-01-03
CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
HUP1600483A2 (bg) 2002-10-28
ECSP024210A (es) 2002-05-23
GB2366800A (en) 2002-03-20
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
PT2230308E (pt) 2013-05-03
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
TWI353358B (en) 2011-12-01
IL147992A0 (en) 2002-09-12
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
BE2010C019I2 (bg) 2020-08-20
CZ300737B6 (cs) 2009-07-29
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
IS6217A (is) 2002-01-03
US7186820B2 (en) 2007-03-06
IS2808B (is) 2012-09-15
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
BR0106682A (pt) 2002-05-14
US7402662B2 (en) 2008-07-22
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
IL147992A (en) 2009-06-15
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
CA2380298C (en) 2010-09-28
NO20020554L (no) 2002-04-08
PL353960A1 (en) 2003-12-15
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
NL300982I1 (bg) 2019-05-01
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
DE60140738D1 (de) 2010-01-21
GB2366800B (en) 2005-01-19
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
PT3059314T (pt) 2019-02-01
LT2308975T (lt) 2016-11-10
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
ZA200200097B (en) 2003-01-06
US7012135B2 (en) 2006-03-14
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
PL212738B1 (pl) 2012-11-30
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
CN1383450A (zh) 2002-12-04
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
FR10C0015I1 (bg) 2010-04-16
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
OA12282A (en) 2006-05-11
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17
AP2092A (en) 2010-02-28
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
TW200817430A (en) 2008-04-16
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
AR033978A1 (es) 2004-01-21
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
US7977464B2 (en) 2011-07-12
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
PT2308975T (pt) 2016-11-14
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
CN1289671C (zh) 2006-12-13
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
PL218516B1 (pl) 2014-12-31
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
HU230561B1 (hu) 2016-12-28
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
BG106278A (bg) 2002-12-29
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
AU783756B2 (en) 2005-12-01
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
AU6051101A (en) 2001-12-17
CA2707766C (en) 2013-05-21
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
PL399351A1 (pl) 2012-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7186820B2 (en) Production of humanised antibodies to TNFα