TWI538918B - 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途 - Google Patents

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Description

人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
本發明係關於一種抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的抗體，且特別關於一種具高度中和腫瘤壞死因子α之能力的人源化單株抗體與及其變異區之序列。
腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)為前發炎細胞激素(pro-inflammatory cytokine)，其主要由包括巨噬細胞與單核球的免疫系統細胞所產生。腫瘤壞死因子α呈現為一同源三聚體(homotrimeric)蛋白質，於其中各次單元最初被轉譯為一個26kDa之穿膜前驅物蛋白質。在腫瘤壞死因子α轉換酵素(TNF-α converting enzyme,TACE)於接近穿膜區域之位置進行切割後，釋出腫瘤壞死因子α之可溶三聚體形式，並經由與效應細胞(effector cell)上之結構區分type I與type II腫瘤壞死因子受器(TNFRI與TNFRII)結合而發揮其活性。
穿膜形式之腫瘤壞死因子α也以其獨特之生物功能而被熟知，例如以細胞-細胞接觸的方式產生生物毒性活性與B細胞的多細胞株活化(polyclonal B-cell activation)，(Mitoma et al.,2008)。已證明腫瘤壞死因子α對於自體免疫過程具有特定影響，且已成為許多自體免疫疾病的關鍵治療標的(Feldmann,2001)。到目前為止，一些抗腫瘤壞死因子α之試劑，如etanercept、adalimumab與infliximab已 被美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)所核准，且皆具有有效中和可溶形式之腫瘤壞死因子α為作用之主要生理機制的能力。然而，這些對抗藥對於穿膜形式之腫瘤壞死因子α的結合功效並不同，其可能導致於臨床疾病上的不同結果(Taylor,2010)。例如，etanercept對於其中穿膜形式之腫瘤壞死因子α扮演一關鍵角色的肉芽腫病(granulomatous disease)發病在臨床上並無功效(2008,Mitoma)。因此，是否抗腫瘤壞死因子α試劑可與穿膜形式之腫瘤壞死因子α結合對於引起抗體依賴型細胞仲介毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、補體依賴細胞毒殺作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)、細胞凋亡與外至內訊號傳遞機制而言為必要條件。
鼠源動物之單株抗體於臨床實施上之主要阻礙為其可能在病患中引起人類抗鼠源動物抗體(human anti-murine antibody,HAMA)反應(Owens and Young,1994；Sandhu,1992；Schroff et al.,1985)。因此，為改善臨床使用的效能，已使用基因工程技術以將屬於鼠源動物之胺基酸殘基置換為人類對應的胺基酸殘基，並以減少於病患中之誘發致免疫原性(immunogenicity)的可能性。
理想的抗體人源化應可維持抗體對抗原的專一性與親和力，並儘可能減低致免疫原性。到目前為止，對於抗體人源化已使用許多方式來進行，例如由鼠源抗原結合變異區基因融合至人類抗體不變區所組成的嵌合抗體(chimeric antibodies)為最早試圖用以減少致免疫原性(Morrison et al.,1984)。然而，嵌合抗體仍然產生非期望之抗變異區反應(Bruggemann et al.,1989)。互補決定區段移植法(complementarity determining region gtafting,CDR-gtafting)為另一方式，其包含將嚙齒類抗體之互補決定區段轉移至人類抗體的Fv支架(Fv framework,FR)。不幸的是，介於互補決定區段與的Fv支架之間的介面嚴重妨礙與抗原的結合。最初的互補決定區段移植抗體傾向於失去來源抗體所具有的結合親和力，因此需要回復突變一些對於互補決定區段結構而言為必須的鼠源支架胺基酸的額外工作。藉由變異區表面重組(variable domain resurfacing)之人源化為可維持來源抗體之專一性與結合親和力的另一方式，經由將於鼠源Fv支架中暴露於表面之殘基取代為一般於人類抗體中發現之暴露於表面的殘基，可減少抗體之致免疫原性(Fontayne et al.,2006；Padlan,1991；Roguska et al.,1994；Staelens et al.,2006；Zhang et al.,2005)。雖然現今之分子生物技術可使改變胺基酸之方法更易實行，然而，若無抗體之可靠電腦模型時，仍難以確認在溶劑中暴露於表面上之殘基。
本發明提供一種人源化之單株抗體的胺基酸序列，包括：一輕鏈之變異區的胺基酸序列，其包括序列辨識號：1的序列；以及一重鏈之變異區的胺基酸序列，其包括序列辨識號：2的序列，其中序列辨識號：1之序列與序列辨識 號：2具有至少一置換，該置換係擇自由下列所組成之群組：序列辨識號：1之第10個胺基酸由異白胺酸置換為羥丁胺酸、序列辨識號：1之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸、序列辨識號：2之第2個胺基酸由離胺酸置換為榖胺醯胺、序列辨識號：2之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸、序列辨識號：2之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸與序列辨識號：2之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸，且其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
本發明提供另一種人源化之單株抗體的胺基酸序列，包括：一輕鏈之變異區的胺基酸序列，其包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈之變異區的胺基酸序列，其包括序列辨識號：6的序列，其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
本發明也提供一種人源化之單株抗體的核苷酸序列，包括：一輕鏈之變異區的核苷酸序列，其包括序列辨識號：7的序列；以及一重鏈之變異區的核苷酸序列，其包括序列辨識號：8的序列，其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
本發明又提供一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：1的序列；以及一重鏈，該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：2的序列，其中序列辨識號：1之序列與序列辨識號：2之序列具有至少一置換，該置換係擇自由下列所組成之群組：序列辨識號：1之第10個胺基酸由異白胺酸置換為 羥丁胺酸、序列辨識號：1之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸、序列辨識號：2之第2個胺基酸由離胺酸置換為榖胺醯胺、序列辨識號：2之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸、序列辨識號：2之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸與序列辨識號：2之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸，其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
本發明另提供一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
本發明還提供一種人源化單株抗體用於中和可溶性腫瘤壞死因子α的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與可溶性腫瘤壞死因子α結合。
本發明提供一種人源化單株抗體用於引起抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與穿膜型腫瘤壞死因子α結合。
本發明也提供一種人源化單株抗體人源化單株抗體用 於製備治療與穿膜型腫瘤壞死因子α相關之疾病的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與穿膜型腫瘤壞死因子α結合。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
在本發明一態樣中，本發明提供一人源化單株抗體之胺基酸序列，其中此人源化單株抗體與腫瘤壞死因子α結合，而腫瘤壞死因子α可為人類腫瘤壞死因子α。上述人源化單株抗體之胺基酸序列可包括一輕鏈變異區之胺基酸序列與一重鏈變異區之胺基酸序列。在一實施例中，上述本發明人源化單株抗體之胺基酸序列為一免疫球蛋白G(IgG)抗體之胺基酸序列，其可包括一輕鏈變異區之胺基酸序列、一重鏈變異區之胺基酸序列與人類免疫球蛋白G保守區域的胺基酸序列。
在一實施例中，本發明人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列可藉由對與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體執行變異區表面重組(variable domain resurfacing)來獲得。
首先，取得一與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列與重鏈變異區胺基酸序列。在一實施例中，與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體可包括一鼠源單株抗體。此鼠源單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列，而重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列。
接著，根據前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列與重鏈變異區胺基酸序列來建立前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的分子模擬結構，並且標定出其非保守表面殘基。在一實施例中，分子模擬結構可以電腦輔助同源性模擬方式來進行。
之後，搜尋與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列相似度最高之人類序列，並將兩者進行比對而決定出此與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的可置換殘基。最後，將此與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的可置換殘基置換為對應於此殘基位置之前述人類序列的胺基酸殘基，以獲得與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列。
在一實施例中，前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列且重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，而與前述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列及重鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為PPS4之輕鏈變異區胺基酸序列(序列辨識號：3)與重鏈變異區胺基酸序列(序列辨識號：4)。在此實施例中，可對前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的胺基酸序列進行的置換則至少包括下列之一：序列辨識號：1之第10個胺基酸由異白胺酸置換為羥丁胺酸、序列辨識號：1之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸、序列辨識號：2之第2個胺基酸由離胺酸置換為穀胺醯胺、序列辨識號：2之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸、序列辨識號：2之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸與序列辨識號：2之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸。因此，所獲得之與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體的胺基酸序列可含有包括序列辨識號：1之輕鏈變異區胺基酸序列及包括序列辨識號：2之重鏈變異區胺基酸序列，且序列辨識號：1之序列與序列辨識號：2之序列具有至少下列置換之一：序列辨識號：1之第10個胺基酸由異白胺酸置換為羥丁胺酸、序列辨識號：1之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸、序列辨識號：2之第2個胺基酸由離胺酸置換為穀胺醯胺、序列辨識號：2之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸、序列辨識號：2之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸與序列辨識號：2之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸。
在另一實施例中，前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列而重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，而與前述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列及重鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為PPS4之輕鏈變異區胺基酸序列(序列辨識號：3)與重鏈變異區胺基酸序列(序列辨識號：4)。而在進行前述序列比對後，所獲得之與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5，而重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6。
因此根據上述，在本發明另一態樣中，本發明也可提供上述本發明人源化單株抗體之核苷酸序列。上述人源化單株抗體之核苷酸序列可包括一輕鏈變異區之核苷酸序列與一重鏈變異區之核苷酸序列。在一實施例中，上述本發明人源化單株抗體之核苷酸序列為一免疫球蛋白G(IgG)抗體之核苷酸序列，其可包括一輕鏈變異區之核苷酸序列、一重鏈變異區之核苷酸序列與人類免疫球蛋白G保守區域核苷酸序列。
在一實施例中，上述人源化單株抗體之輕鏈變異區核苷酸序列可包括編碼出序列辨識號：5之序列的核苷酸序列，而重鏈變異區核苷酸序列可包括編碼出序列辨識號：6之序列的核苷酸序列。編碼出序列辨識號：5之序列的核苷酸序列可為序列辨識號：7之序列，而編碼出序列辨識號：6之序列的核苷酸序列可為序列辨識號：8之序列。
在本發明另一態樣中，本發明還可提供一人源化單株抗體，其中此人源化單株抗體與腫瘤壞死因子α結合，而腫瘤壞死因子α可為人類腫瘤壞死因子α。上述人源化單株抗體可包括一輕鏈與一重鏈。在一實施例中，上述本發明人源化單株抗體為一免疫球蛋白G(IgG)抗體，其單側可包括一輕鏈變異區、一重鏈變異區與人類免疫球蛋白G保守區域。
在一實施例中，上述本發明人源化單株抗體可藉由下述步驟來獲得。
首先，取得一與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區核苷酸片段及其序列與重鏈變異區核苷酸片段及其序列。在一實施例中，可藉由抽取一產生上述非人類單株抗體融合瘤的總RNA，並對此總RNA以分別對於輕鏈變異區與重鏈變異區之兩對引子進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應以獲得非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的核苷酸片段(cDNA)，且之後將輕鏈變異區與重鏈變異區的核苷酸片段進行定序以分別獲得輕鏈變異區與重鏈變異區的核苷酸序列。在一實施例中，與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體可包括一鼠源單株抗體。此鼠源單株抗體之輕鏈變異區核苷酸序列可包括序列辨識號：9之序列，而重鏈變異區核苷酸序列可包括序列辨識號：10之序列。
接著，根據非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的核苷酸序列分別推知此非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列與重鏈變異區胺基酸序列。在一實施例中，輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列，而重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列。
然後，根據前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列與重鏈變異區胺基酸序列來建立前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的分子模擬結構，並且標定出其非保守表面殘基。在一實施例中，分子模擬結構可以電腦輔助同源性模擬方式來進行。
再來，搜尋與前述本發明與腫瘤壞死因子α結合的單株抗體之變異區胺基酸序列相似度最高之人類序列，並將兩者進行比對而決定出此與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的可置換殘基。最後，將編碼出前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的核苷酸序列於上述可置換殘基的對應位置以定點突變方式置換為編碼出對應於此殘基位置之前述人類序列的胺基酸殘基的核苷酸，以獲得本發明與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區核苷酸片段與重鏈變異區的核苷酸片段。
之後，藉由本技術領域熟知的方法，將前述本發明與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區核苷酸片段與重鏈變異區的核苷酸片段與一已知人類保守區域核苷酸片段分別選殖進入合適的表現載體，並將此表現載體轉染進合適的宿主細胞，以使宿主細胞表現本發明與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體。
在一實施例中，前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列且重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，而與前述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列及重鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為PPS4之輕鏈變異區胺基酸序列(序列辨識號：3)與重鏈變異區胺基酸序列(序列辨識號：4)。在此實施例中，可對前述與腫瘤壞死因子α結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的胺基酸序列進行的置換則至少包括下列之一：序列辨識號：1之第10個胺基酸由異白胺酸置換為羥丁胺酸、序列辨識號：1之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸、序列辨識號：2之第2個胺基酸由離胺酸置換為穀胺醯胺、序列辨識號：2之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸、序列辨識號：2之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸與序列辨識號：2之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸。因此，本發明與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體的胺基酸序列可含有包括序列辨識號：1之輕鏈變異區胺基酸序列及包括序列辨識號：2之重鏈變異區胺基酸序列，且序列辨識號：1之序列與序列辨識號：2之序列具有至少下列置換之一：具有至少下列置換之一：序列辨識號：1之第10個胺基酸由異白胺酸置換為羥丁胺酸、序列辨識號：1之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸、序列辨識號：2之第2個胺基酸由離胺酸置換為穀胺醯胺、序列辨識號：2之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸、序列辨識號：2之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸與序列辨識號：2之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸。
在另一實施例中，前述本發明與腫瘤壞死因子α結合的單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列而重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，且前述本發明與腫瘤壞死因子α結合的單株抗體之變異區胺基酸序列相似度最高之人類序列為PPS4之輕鏈變異區序列(序列辨識號：3)與重鏈變異區序列(序列辨識號：4)，而在進行前述序列比對後，所獲得之與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5而重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6。因此，本發明與腫瘤壞死因子α結合的人源化單株抗體可含有包括序列辨識號：5之輕鏈變異區胺基酸序列及包括序列辨識號：6之重鏈變異區胺基酸序列。
可與本發明之人源化單株抗體結合之腫瘤壞死因子α包括可溶性腫瘤壞死因子α或穿膜型腫瘤壞死因子α。本發明之人源化單株抗體對可溶性腫瘤壞死因子α的親和力可為約20-40nM，較佳為約10-20nM。
又，本發明之人源化單株抗體對穿膜型腫瘤壞死因子α的親和力可為約20-40nM，較佳為約10-20nM。在一實施例中，本發明之人源化單株抗體對穿膜型腫瘤壞死因子α的親和力可為約16.8nM。
又，在一實施例中，本發明之人源化單株抗體可藉由與表現於細胞上之穿膜型腫瘤壞死因子α結合，而引起抗 體依賴型細胞仲介毒殺作用。
目前已知，穿膜型腫瘤壞死因子α與許多疾病相關。例如偏好細胞表面表現之穿膜型腫瘤壞死因子α的巨噬細胞與單核球細胞在肉芽腫性疾病(granulomatous disease)，例如克隆氏症(Crohn’s disease)與韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)中扮演一非常重要的角色，且藉由抗體依賴型細胞仲介毒殺作用可將細胞直接殺死(Beenhouwer et al.,2004)。
而根據上述，由於本發明之人源化單株抗體具有與穿膜型腫瘤壞死因子α結合之能力且具有引起抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的能力，因此，在本發明又另一態樣中，本發明可提供本發明之人源化單株抗體用於結合穿膜型腫瘤壞死因子α的用途以及用於引起抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的用途。
此外，本發明之人源化單株抗體也可應用於製備治療與穿膜型腫瘤壞死因子α相關之疾病之藥物的用途。
【實施例】
材料與方法
A. 與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體
1. 與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體的獲得與純化
將產生與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體的融合瘤(hybridoma)細胞株357-104-4(ECACC No.92030603)(購自European Collection of Cell Cultures)注射進入小鼠腹腔，使小鼠產生腫瘤與腹水。小鼠腹水中含有高量之與人類腫瘤壞死因子結合之鼠源單株抗體(m357 IgG)。上述步驟為委託台灣醣聯生技醫藥股份有限公司(GlycoNEX Inc.)(https://www.glyconex.com.tw/)進行。
接著將腹水自小鼠取出並將腹水通過蛋白質A(protein A)管柱(GE Helth-care)來進行純化以獲得與人類腫瘤壞死因子結合之鼠源單株抗體(m357 IgG)。
2.　與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體(m357 IgG)cDNA序列的獲得
(1)　抽取融合瘤細胞株357-104-4(ECACC No. 92030603)總RNA(QIAGEN RNeasy Mini Kit)。
(2)　以Amersham公司所生產之Light Primer Mix與Heavy Primers兩組引子對總RNA(total RNA)進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)以獲得鼠源357 IgG之輕鏈與重鏈的cDNA。
(3)　將此輕鏈與重鏈的cDNA分別選殖進入TOPO載體上，可以得到兩個選殖體(clones)。
(4)　經由DNA定序後，可設計具有酵素切位之引子。
(5)　合成兩對具有酵素切位之引子。
用於輕鏈之引子對為：
357VL’Asc primer：
5’-CAGGCGCGCCGAAATTGTGCTGACCCAGTC-3’(序列辨識號：11)
357VL3’Glink primer：
5’-CCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCAATTTCCAGCTTGC-3’(序列辨識號：12)
用於重鏈之引子對為：
357VH5’Glink primer
5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGTGAAACTGCAGGA-3’(序列辨識號：13)
357VH3’Not
5’-CAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(序列辨識號：14)
之後，對步驟(3)中所完成的選殖體中以此兩引子對進行聚合酶鏈鎖反應以獲得m357 IgG的輕鏈與重鏈之cDNA。
B.　與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體(m357 IgG)的電腦模擬
使用Discovery Studio Modeling 2.1(Accelrys,Inc,.San Diego,CA)來執行與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體(m357 IgG)的同源模擬程序(homology modeling process)。對m357 IgG之輕鏈變異區(VL)與重鏈變異區(VH)執行兩個分開之BLASTP搜尋。經由在蛋白質資料銀行(Protein Data Bank,PDB)(https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中搜尋來分析序列以確認m357蛋白質序列的同源性。藉由根據鼠源抗乳癌抗體Fab片段之重鏈變異區SM-3[PDB entry:1SM3](Dokurno et al.,1998)與抗thermus aquaticus DNA polymerase I單株抗體之輕鏈變異區結構[PDB entry:1AY1]結構的同源模擬來建構m357 Fv片段的三維(three-dimensional,3D)結構。最終的三維模型為藉由MODELLER模組(Sali et al.,1995)來產生，其藉由滿足空間限制(satisfaction of spatial restraints)來執行來一比較蛋白質結構模擬(comparative protein structure modeling)的自動方法。其自動對m357 IgG執行蛋白質同源模擬與環模擬(loop modeling)。藉由使用Model antibody Loops模組以最高序列鑑別度自PDB資料庫選擇模板結構來執行CDR環(CDR loop)的模擬建構，且使用Loop Refinement模組來使CDR環的模擬建構完善以將空間碰撞(steric clash)最小化並確認正確鍵長度與鍵角。之後，藉由在Discovery Studio Modeling 2.1中之CHARMm(B.R. Brooks,1983)程式並以Accelrys CHARMm forcefield來進行結構的能量最小化，可使此整個模擬更加完善。將結構進行能量最小化於兩個步驟中，首先執行受限之最陡坡降最小化(restrained steepest descent minimization)的5000個步驟，接著，執行共軛梯度最小化(conjugated gradient minimization)的5000個步驟，直到當支架(framework)之α碳(alpha carbon)被維持固定於適當位置中。以AREAIMOL程式(CCP4,1994)在三維模擬上計算m357 IgG殘基的溶劑可接近表面積(solvent-accessible surface areas)。將相對之可接近度大於30%之殘基定義為可接近的。
C. IgG之建構、表現與純化
藉由overlapping PCR來獲得編碼出m357 IgG之人源化變異區的cDNA片段。接著將來自人類IgG之保守區序列與藉由overlapping PCR合成之變異區序列次選殖(sub-cloning)於哺乳動物表現載體pSecTag2/Hygro(重鏈)(Invitrogen)與pcDNA3.3-TOPO TA(輕鏈)(Invitrogen)中。之後利用EcoRV限制切點(restriction site)將兩個構築體(construct)融合，產生pSec-pcDNA-h357-IgG。根據廠商之操作指南，使用Effectene(Qiagen)將含重鏈與輕鏈之基因的質體轉染(transfect)進入小鼠骨髓瘤(myeloma) NS0細胞(European Collection of Anlmal Cell cultures,Salisbury,Wiltshire,UK)。在以Hygromycin(400 μg/ml)篩選4週後，將穩定的選殖體(clone)以在一無血清化學定義培養基(chemically-defined medium) HyQNS0(Hyclone)中5 x 105 cells/ml的起始接種密度培養於搖瓶中。於37℃收取培養基5天且藉由蛋白質A(GE Health-care)層析自上清液純化抗體。
D.　抗腫瘤壞死因子α中和效力分析
根據先前文獻(Matthews N,1987)所敘述之方法以經actinomycin D處理之鼠源纖維母細胞(fibroblast) L929細胞(ATCC Cat. No. CCL-1)來測量m357 IgG與人類腫瘤壞死因子α結合之人源化單株抗體(h35 IgG)對於人類腫瘤壞死因子α的中和活性。簡單而言，將L929細胞以3×105 cells/well三重複接種於一96孔盤中並將其培養於添加10%(v/v)胎牛血清之RPMI 1640培養基中，16小時。之後，將抗體的一些稀釋製備於含actinomycin D(2 μg/ml)與腫瘤壞死因子α(TNF-α)(100 ng/ml)的培養基中，且培養於37℃，16小時。在移除表層懸浮物後，加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)(5 mg/ml)(Sigma-Aldrich)並培養於37℃，4小時。之後將SDS溶液(10%)加至孔洞中。於室溫培養24小時後，藉由色度計(colorimeter)記錄於各孔洞中之任何顏色改變成紫色。於570 nm測定洗提物之光學密度(optical density,OD)，其與存活細胞之數目具有正相關。也於實驗中設計空白控制組(僅有培養物)、腫瘤壞死因子α控制組(僅有腫瘤壞死因子α)與抗體控制組(僅有抗體)。使用Sigma plot軟體(Systat software,Inc. Richmond,CA)藉由複雜彎曲非線性回歸(complex sigmoid non-linear regression)分析來計算ED50值。
E.　於NS0細胞上之穿膜腫瘤壞死因子α的穩定表現
如先前技術(Perez et al.,1990)所述，以定點突變(site-directed mutagenesis)產生抵抗腫瘤壞死因子α轉換酵素(TNF-α converting enzyme,TACE)居間裂解之刪除型突變的穿膜腫瘤壞死因子α。於此非裂解形式之穿膜腫瘤壞死因子α中，刪除了天然穿膜腫瘤壞死因子α之胺基酸+1至+12。將不裂解形式之穿膜腫瘤壞死因子α基因選殖入pSecTag2/Hygro哺乳動物表現載體(Invitrogen)並以Effectene將其轉染進入小鼠骨髓瘤NS0細胞以在細胞表面上表現穿膜腫瘤壞死因子α。
F.　m357-IgG與h357-IgG對穿膜腫瘤壞死因子α之飽和結合分析
將經穿膜腫瘤壞死因子α轉染之NS0細胞以m357-IgG及h357-IgG的連續指數稀釋物在含2%胎牛血清之磷酸鹽緩衝溶液(螢光活化細胞儲存緩衝溶液(fluorescence-activated cell sorting[FACS]buffer))中於4℃培養1小時。將細胞以螢光活化細胞儲存緩衝溶液清洗3次，之後分別以對m357-IgG反應之Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)對h357-IgG之反應之Alexa Fluor 647山羊抗人類IgG(H+L)來將細胞在4℃進行染色1小時。使用FACSCalibur流式細胞儀(flow cytometer)(Becton Dickinson,San Jose,CA)來測量螢光強度。
G.　抗體依賴型細胞仲介毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)分析
h357-IgG之抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的活性為藉由LDH Cytotoxicity Detection Kit(Clontech)來測量，其根據製造商操作指南之來測量釋放自受損細胞之細胞溶質(cytosol)的活性。簡單而言，將可高度表現穿膜腫瘤壞死因子α之細胞在不同濃之h357抗體存在的分析培養基中培養1小時於5% CO2培養箱，37℃，然後加入人類周邊血液單核球(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)為效應細胞(effector cell)(效應細胞比目標細胞，20:1)。在額外於37℃培養16小時後，每孔洞獲得100 μl之上清液並將其轉移至一新的96-孔平底盤中。將LDH基質(100 μl)加至各孔洞且以避光於室溫培養30分鐘。樣本之吸光值以ELISA reader於490 nm下測量。藉由分解溶液(lysis buffer)測定最大釋放。根據下列公式來計算特定分解(specific lysis)之百分比：%細胞毒性=[實驗釋放-自然釋放]/[最大釋放-自然釋放]×100。
結果
A.　與人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體(m357 IgG)
1.　人類腫瘤壞死因子α結合之鼠源單株抗體之分析
將經純化之m357 IgG進行SDS-PAGE分析，結果如第1圖之lane 1與lane 2所示。lane 1為非還原狀態，lane 2為還原狀態。
2.　鼠源357 IgG的輕鏈與重鏈之cDNA
將前述藉由聚合酶鏈鎖反應獲得之鼠源357 IgG的輕鏈與重鏈之cDNA進行電泳分析，結果如第2圖所示，其中lane 1為輕鏈之cDNA(序列辨識號：9)，lane 2為重鏈之cDNA(序列辨識號：10)。
B. m357變異片段之分子模擬
藉由RT-PCR來獲得編碼出源自融合瘤細胞株357-101-4(ECACCNo. 92030603)之抗腫瘤壞死因子α單株抗體m357 IgG的重鏈變異區及輕鏈變異區之cDNA(資料未顯示)。藉由如“材料與方法”中所述之同源模擬(program MODELLER)來分別建構m357 IgG的重鏈變異區及輕鏈變異區之推演之胺基酸序列的三維結構。之後，以來自PDB之1SM3(享有序列相同度與相似度分別為87%與93%)模板結構以1.95解析度與來自PDB之1AY1(享有序列相同度與相似度分別為85%與91%)模板結構以2.20解析度分別模擬出m357 IgG的重鏈變異區及輕鏈變異區。經由Discovery Studio modeling 2.1 program獲得m357 IgG之重鏈變異區及輕鏈變異區的最終精確結構，如第3A圖中所示。
第3A圖顯示m357 IgG的變異區。藉由分別與對應於重鏈變異區之1SM3與對應於輕鏈變異區之1AY1的結晶結構進行比較的同源模擬來產生m357 IgG的三維結構。CDR環以粗黑線顯示。第3B圖為m357 IgG分子表面模擬，其顯示非類人類(non-humn like)表面殘基與CDR環相關。以箭號指出之17個相對溶劑接近度大於30%的殘基，為非類人類表面殘基。CDR環以粗黑線顯示。接近CDR環於5內(虛線圓圈)之殘基以虛線箭號顯示。較佳突變為“人類”胺基酸的6個殘基以實線箭號顯示。於重鏈變異區支架中應有4個殘基被人源化，而於輕鏈變異區支架中僅有2個殘基應被人源化。
C. m357 IgG變異區片段之人源化
藉由變異區重組之人源化首先由Padlan於1991年提出，於此方法中排除了在抗體之支架區中之潛在抗原位(antigenic site)，而不影響抗原親和力(Padlan,1991)。此方法係根據人類抗小鼠抗體僅對於來自表面殘基之變異區反應的前提，並且已被其他研究者(Fontayne et al.,2006;O'Connor et al.,1998;Staelens et al.,2006)採用與修飾。於本實施例中，以下列三個步驟來執行m357 IgG之變異區重組：首先，分別建構m357 IgG之重鏈變異區與輕鏈變異區；第二，使用AREAIMOL程式來計算溶劑可接近殘基以鑑定非類人類支架表面殘基，且最後根據人類支架之序列排列結果將這些表面殘基突變為人類之對應表面殘基。為了於變異區上置換鼠源m357 IgG的非類人類支架表面殘基，自人類目標序列選擇一組高度同源之表面殘基。搜尋IMGT資料庫(https://imgt.cines.fr/)，同時自搜尋結果排除噬菌體呈現(phage-display)或人源化抗體的序列，以鑑定出與m357 IgG之對應變異區具最高同源性之人類重鏈變異區與輕鏈變異區序列對。自人類序列所發現之最相同之表面殘基為PPS4之變異區(於價區中序列相似度分別為重鏈變異區；76%與輕鏈變異區：73%)(第4圖)。根據AREAIMOL程式之計算結果，於重鏈變異區中之20個表面殘基有8個為在人類與小鼠序列間為非保守的，而於輕鏈變異區中之16個表面殘基有9個為非保守的。這17個表面殘基為要被取代之候選者。然而，於CDR區中之重鏈52BQ、重鏈52CS、重鏈54N、重鏈61E、輕鏈31F、輕鏈55S、輕鏈90W、輕鏈92D、輕鏈93Y與輕鏈96R的取代可能潛在改變CDR的結構，且V59，於輕鏈中接近CDR2於5 內之一額外非保守表面殘基也可能潛在影響結合親和力(第3B圖)。如結果所示，保留這11個鼠源殘基以維持抗原親和力。最後，選擇剩餘之6個殘基來取代為人類保守殘基：與PPS4比對，輕鏈變異區之第10個比對位置由異白胺酸置換為羥丁胺酸(m357輕鏈變異區之第10個胺基酸由異白胺酸置換為羥丁胺酸)、第18個比對位置由離胺酸置換為精胺酸(m357輕鏈變異區之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸)；與PPS4比對，重鏈變異區第3個比對位置由離胺酸置換為穀胺醯胺(m357重鏈變異區之第2個胺基酸由離胺酸置換為穀胺醯胺)、第11個比對位置由色胺酸置換為白胺酸(m357重鏈變異區之第10個胺基酸由色胺酸置換為白胺酸)、第19個比對位置離胺酸置換為精胺酸(重鏈變異區之第18個胺基酸由離胺酸置換為精胺酸)與第42個比對位置胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸(重鏈變異區之第41個胺基酸由麩胺酸置換為甘胺酸)(第4圖)。
D.　人源化357(h357) IgG1之構築與表現
分別將m357 IgG之人源化重鏈變異區與輕鏈變異區的胺基酸序列讀框內(in-frame)融合至人類IgG1之重鏈與kappa輕鏈保守區。為了表現一完整之人源化357(h357) IgG1分子，使用兩種哺乳動物表現載體，pSecTag2/Hygro與pcDNA3.3-TOPO TA，以分別接受h357 IgG之人源化重鏈與輕鏈。之後將輕鏈表現框架(expression cassette)連接至重鏈表現pSecTag2/Hygro載體。重組h357 IgG之表現程度為~14 mg/L。藉由蛋白質A層析來分別純化含m357 IgG與h357 IgG兩者之培養基，並藉由SDS-PAGE來確認蛋白質純化物(第1圖)。如於第1圖中所示，在非還原環境下，兩抗體皆顯示具有155 kDa分子量之單一條帶(lanes 1與3)。在還原環境下，兩抗體分別產生具有55 kDa(重鏈)與26 kDa(輕鏈)之分子量的兩蛋白質條帶(lanes 2與4)。
E.　藉由m357 IgG與h357 IgG之腫瘤壞死因子α仲介細胞毒性的中和
為了試驗抗腫瘤壞死因子α抗體之功能活性，執行抗體抑制可溶性腫瘤壞死因子α的能力的測試。腫瘤壞死因子α引起對鼠源L929細胞之細胞毒性。藉由將抗體與重組之人類腫瘤壞死因子α及細胞共培養，於L929分析中評估m357 IgG與h357 IgG兩者。如於第5圖中所示，於以100 ng/ml之人類腫瘤壞死因子α處理之L929細胞中的腫瘤壞死因子α仲介細胞毒性被m357 IgG與h357 IgG兩者以劑量依賴方式(dose dependent manner)有效中和，分別具有3.07 nM與2.30 nM之ED50值。結果指出人源化357 IgG在相似於鼠源357 IgG之濃度維持腫瘤壞死因子α中和活性。
F. h357 IgG抗體對穿膜腫瘤壞死因子α的結合活性
腫瘤壞死因子α存在與膜連接之前驅物(穿膜腫瘤壞死因子α)，藉由腫瘤壞死因子α轉換酵素(TNF-converting enzyme,TACE)之蛋白酶切割(proteolytic cleavage)，自穿膜腫瘤壞死因子α釋放成熟的可溶形式。已有許多研究指出具與穿膜腫瘤壞死因子α結合能力腫瘤壞死因子α對抗藥(antagonist)可導致由細胞凋亡、抗體依賴型細胞仲介毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、補體依賴細胞毒毒殺作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)與外至內訊號傳遞機制引起之細胞溶解(Arora et al.,2009;Caron et al.,1999;Mitoma et al.,2008;Scallon et al.,1995)。為了分析h357 IgG對穿膜腫瘤壞死因子α的結合能力，將穿膜腫瘤壞死因子α之未裂解形式的cDNA轉染進NS0細胞以將其表現於細胞膜上，並使用流式細胞儀以評估m357 IgG與h357 IgG兩者之結合活性。於第6圖中之資料指出m357 IgG與h357 IgG兩者皆可以一濃度依賴方式與穿膜腫瘤壞死因子α結合，其KD值分別為12.0 nM與16.8 nM。相似之KD值指出人源化過程並沒有改變對穿膜TNF-α之結合親和力。於奈米級莫爾濃度(nanomolar)範圍中之結合親和力指出h357 IgG可潛在引起更多經由穿膜腫瘤壞死因子α的作用功能(effector function)或細胞凋亡機制。
G. h357 IgG對於仲介抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的能力
先前文獻已報導，Infliximab與Adalimumab對於穿膜腫瘤壞死因子α的結合親和力較佳於Etanercept，其可藉由抗體依賴型細胞仲介毒殺作用、補體依賴細胞毒毒殺作用或細胞凋亡機制影響細胞表面表現穿膜腫瘤壞死因子α的細胞殺死作用，且此可為在臨床疾病上導致不同功效的原因之一(Taylor,2010)。偏好細胞表面表現腫瘤壞死因子α的巨嗜細胞與單核球於肉芽腫性疾病(granulomatous disease)，例如克隆氏症(Crohn’s disease)與韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)中扮演一非常重要的角色，且藉由抗體依賴型細胞仲介毒殺作用可將細胞直接殺死(Beenhouwer et al.,2004)。當腫瘤壞死因子α對抗藥與表現穿膜型腫瘤壞死因子α結合時，這些細胞可被自然殺手細胞(natural killer cell)作為目標。具有來自人類IgG1之Fc區域的h357 IgG，其可於腫瘤壞死因子α產生細胞中潛在引起細胞分解。因此，為了評估h357 IgG對於仲介對表現穿膜腫瘤壞死因子α目標細胞的抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的能力，於抗體依賴型細胞仲介毒殺作用分析中，以效應細胞對目標細胞為(effector to target,E:T)20:1之比例使用經分離之人類周邊血液單核球。大於20%之腫瘤壞死因子α攜帶目標細胞在h357 IgG濃度為6.25 ug/ml時被分解(第7圖)。這些資料指出經由與表現於細胞表面之穿膜腫瘤壞死因子α結合，h357 IgG可仲介抗體依賴型細胞仲介毒殺作用，因此，相似於那些具ADCC能力的治療抗體，h357 IgG具有被發展為一更有效之腫瘤壞死因子α中和抗體的潛力。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
 【序列編號】
<110> 財團法人工業發展研究院
<120> 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
<160> 14
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
<210>　3
<211>　109
<212>　PRT
<213>　人類
<400>　3
<210>　4
<211>　122
<212>　PRT
<213>　人類
<400>　4
<210>　5
<211>　107
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<223>　人源化輕鏈變異區
<400>　5
<210>　6
<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<223>　人源化重鏈變異區
<400>　6
<210>　7
<211>　321
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人源化輕鏈變異區DNA
<400>　7
<210>　8
<211>　340
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人源化重鏈變異區DNA
<400>　8
<210>　9
<211>　321
<212>　DNA
<213>　小鼠
<400>　9
<210>　10
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<212>　DNA
<213>　小鼠
<400>　10
<210>　11
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工
<222>
<223>　人工引子
<400>　11
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<211>　47
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工引子
<400>　12
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<211>　47
<212>　DNA
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<222>
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<400>　13
<210>　14
<211>　31
<212> DNA
<213> 人工
<222>
<223> 人工引子
<400> 14
第1圖顯示經純化之m357 IgG與h357 IgG之SDS-PAGE分析結果。將m357 IgG與h357 IgG表現於小鼠NS0細胞中，並且藉由蛋白質A管柱自培養基中純化。將樣本在非還原狀態與還原狀態下以MOPS緩衝溶液於4~12% SDS/聚丙烯醯胺凝膠(Bis-Tris polyacrylamide gel)進行電泳。M為分子量標準品。
第2圖顯示m357 IgG之輕鏈與重鏈cDNA的電泳分析結果。
第3A圖顯示m357 IgG之重鏈變異區及輕鏈變異區的最終精確結構。
第3B圖顯示m357 IgG分子表面模擬。
第4圖顯示m357 IgG與PPS4之重鏈變異區(VH)(A)及重鏈變異區(VL)(B)的胺基酸序列比對。將PPS4 Fv序列顯示為PPS4VL與PPS4VH以進行比較，其與用在m357 IgG人源化中當作人類表面殘基接受者的m357 IgG Fv同源度最高。CDR殘基為在括號([])中。保守表面殘基以白色方框顯示，非保守表面殘基以灰方框顯示。根據Kabat’s慣例(Kabat,1991)將胺基酸序列編碼。
第5圖顯示藉由m357-IgG抗體與h357-IgG抗體於L929細胞中之腫瘤壞死因子α仲介細胞毒性的中和。將各種濃度之m357-IgG(●)抗體與h357-IgG(○)抗體加至L929細胞與100 ng/ml之人類腫瘤壞死因子α培養。將細胞培養於37℃，16小時，並使用比色MTT分析來分析細胞存活。
第6圖顯示m357-IgG抗體與h357-IgG抗體對在細胞表面上之穿膜腫瘤壞死因子α的飽和分析。將經穿膜腫瘤壞死因子α轉染之NS0細胞以m357-IgG及h357-IgG的連續指數稀釋物於4℃培養1小時。將細胞清洗3次並分別以對m357-IgG反應之Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)與對h357-IgG之反應之Alexa Fluor 647山羊抗人類IgG(H+L)在4℃進行培養1小時。將細胞清洗並藉由FACSCalibur流式細胞儀(flow cytometer)來分析。
第7圖顯示h357 IgG對於仲介抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的能力。將表現穿膜腫瘤壞死因子α之細胞在不同濃之h357抗體存在下培養1小時。然後將人類周邊血液單核球作為效應細胞(effector cell)，且表現穿膜腫瘤壞死因子α之細胞作為目標細胞。藉由測量自細胞質中進入上清液中的LDH量來計算細胞毒性。結果顯示將以溶解溶液處理之細胞群組作為100%溶解之細胞溶解百分比。

Claims (11)

  1. 一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該腫瘤壞死因子α為人類腫瘤壞死因子。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該腫瘤壞死因子α包括可溶性腫瘤壞死因子α或穿膜型腫瘤壞死因子α。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之人源化之單株抗體，其中該人源化之單株抗體對該穿膜型腫瘤壞死因子α之親和力為約20-40nM。
  5. 一種人源化之單株抗體的核苷酸序列，包括：一輕鏈之變異區的核苷酸序列，其包括序列辨識號：7的序列；以及一重鏈之變異區的核苷酸序列，其包括序列辨識號：8的序列，其中該單株抗體與腫瘤壞死因子α結合。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之人源化之單株抗體的核苷酸序列，其中該腫瘤壞死因子α為人類腫瘤壞死因子。
  7. 一種人源化單株抗體用於體外中和可溶性腫瘤壞 死因子α的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與可溶性腫瘤壞死因子α結合。
  8. 一種人源化單株抗體用於體外引起抗體依賴型細胞仲介毒殺作用的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與穿膜型腫瘤壞死因子α結合。
  9. 一種人源化單株抗體用於製備治療與穿膜型腫瘤壞死因子α相關之疾病之藥物的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與穿膜型腫瘤壞死因子α結合。
  10. 一種人源化單株抗體用於製備中和可溶性腫瘤壞死因子α之試劑的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與可溶性腫瘤壞死因子α結合。
  11. 一種人源化單株抗體用於製備引起抗體依賴型細胞仲介毒殺作用之試劑的用途，其中該人源化之單株抗體，包括：一輕鏈，其中該輕鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：5的序列；以及一重鏈，其中該重鏈之變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：6的序列，且其中該人源化單株抗體與穿膜型腫瘤壞死因子α結合。
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