CN114174331B - 结合人类偏肺病毒融合蛋白的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合人类偏肺病毒(hMPV)F蛋白并中和hMPV的抗体和抗原结合片段。还提供编码这些抗体、载体和宿主细胞的核酸。所公开的抗体、抗原结合片段、核酸和载体可用于例如抑制hMPV感染或检测hMPV感染。

Description

结合人类偏肺病毒融合蛋白的抗体及其用途
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月21日提交的第62/851020号美国临时申请的利益，该申请通过引用并入本文。
政府支持声明
本发明是根据美国政府国立卫生研究院授予的项目号1R01AI143865、K01OD026569和UL1TR002378在政府资助下完成的。政府对这项发明享有一定权利。
本发明涉及偏肺病毒领域，具体而言涉及特异性结合人类偏肺病毒F蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段。
背景技术
人类偏肺病毒(hMPV)是一种重要的呼吸道病原体，是单负病毒目和肺病毒科病毒家族的成员，其中也包括呼吸道合胞病毒(RSV)。该家族的成员是单链、非分段、负义RNA病毒，具有相似的生命周期(Schildgen等人，2011，Clin Microbiol Rev 24：734-754)。婴儿和老年人是hMPV感染可能需要住院治疗的主要人群(Panda等人，2014，Int J Infect Dis25：45-52；Falsey等人，2003，J Infect Dis 187：785-790；van den Hoogen等人，2003，JInfect Dis 188：1571-1577；Madhi等人，2003，Clin Infect Dis 37：1705-1710；Haas等人，2013，Clin Infect Dis 5：87-110)。另外，hMPV感染在包括肺移植在内的免疫功能低下患者(Larcher等人，J Hear Lung Transpl 24：1891-1901)和造血干细胞移植受者中很常见(Cane等人，2003，Bone Marrow Transplant 31：309-310；Englund等人，2013，AnnIntern Med 144：344-34；Dokos等人，2013，Transpl Infect Dis 15：97-101；Shah等人，2016，Cancer Lett 379：100-106)，其中一些死亡与病毒感染有关(Cane等人，2003，BoneMarrow Transplant 31：309-310；Englund等人，2013，Ann Intern Med 144：344-34；Dokos等人，2013，Transpl Infect Dis 15：97-101；Shah等人，2016，Cancer Lett 379：100-106)。hMPV是HIV感染患者出现发热性呼吸道疾病的重要原因(Klein等人，2010，J InfectDis 201：297-301)，并在几个感染艾滋病毒的年龄组中发病率有所增加(Groome等人，2015，J Clin Virol 69：125-132)。hMPV也与慢性阻塞性肺疾病的恶化有关(Kan-o等人，2018，J Infect Dis 215：1536-1545)。hMPV最初于2001年确定(van den Hoogen等人，2001，Nat Med 7：719-724)，hMPV感染的临床特征表现为中上呼吸道感染，严重程度足以引起危及生命的毛细支气管炎和肺炎。hMPV的养老院爆发支持了对老年人有效疫苗和疗法的需求(等人，2019，Emerg Infect Dis 25：https://doi.org/10.3201/eid2502.181298)。目前还没有获得许可的疫苗可以预防hMPV，但已经在动物模型中检测了几种候选疫苗，包括减毒活病毒、重组病毒、载体疫苗和重组表面蛋白(Shafagati和Williams，2018，F1000Res 7：135)。目前，只有一种疫苗(NCT01255410)进行了临床试验，然而，试验结果尚未公布。仍然需要针对hMPV的其他试剂。
发明内容
公开了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链可变区和轻链可变区，其包括分别列为SEQ ID NO：1和2的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
b)重链可变区和轻链可变区，其分别包括列为SEQ ID NO：11和12的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
c)重链可变区和轻链可变区，其包括分别列为SEQ ID NO：21和22的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
d)重链可变区和轻链可变区，其包括分别列为SEQ ID NO：31和32的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
e)重链可变区和轻链可变区，其包括分别列为SEQ ID NO：49和50的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；或
f)重链可变区和轻链可变区，其包括分别列为SEQ ID NO：59和60的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3，
其中单克隆抗体特异性结合人类偏肺病毒(hMPV)F蛋白并中和hMPV。在特定的非限制性实例中，可使用e Kabat、Chothia或IMGT编号方案识别。
在一些实施方式中，a)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括列为SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10的氨基酸序列；b)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括列为SEQ ID NO：15、16、17、18、19和20的氨基酸序列；c)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括列为SEQ ID NO：25、26、27、28、29和30的氨基酸序列；或d)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括列为SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40的氨基酸序列；
e)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括列为SEQ ID NO：53、54、55、56、57和58的氨基酸序列；或
HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括列为SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段与效应分子或可检测标记相结合。
还公开了包含抗体或抗原结合片段的双特异性抗体。
在进一步的实施方式中，编码抗体、抗原结合片段或抗体或抗原结合片段的VH或VL的核酸和载体。
在更多的实施方式中，公开了用于抑制hMPV感染的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的抗体、抗原结合片段、核酸分子或载体；和药学上可接受的载体。
在进一步的实施方式中，公开了一种生产与hMPV F蛋白特异性结合的抗体或抗原结合片段的方法。
在一些实施方式中，还公开了一种用于检测人类受试者生物样品中hMPV存在的方法。
在其他实施方式中，公开了用于抑制受试者的hMPV感染的方法，该方法包括对受试者施用有效量的的抗体、抗原结合片段、核酸分子、载体或药物组合物，其中受试者具有hMPV感染或具有hMPV感染的风险。
通过参考附图进行的对几个实施方式的详细描述，本发明的前述和其他特征及优点将变得更加明显。
附图说明
图1A-1C.重组表达的hMPV F蛋白的特性和hMPV F特异性B细胞频率。(A)hMPV F蛋白的尺寸排除色谱图。hMPV B2 F和hMPV A1 F蛋白是基于洗脱体积的单体。在胰蛋白酶裂解后，hMPV A1 F形成三聚体，由洗脱曲线的变化确定。(B)胰蛋白酶裂解后MPV A1 F蛋白的负染色电镜图像。该蛋白类似于融合后hMPV F蛋白(PDB:5L1X)的晶体结构，显示在EM图像旁边以供参考。(C)与供体5的hMPV B2 F蛋白结合的大量B细胞上清液的ELISA结合数据。选择信号大于1.5Abs单位的选定孔进行电融合以产生杂交瘤。
图2A-2B.hMPV F蛋白-特异性mAbs的结合亲和力。(A)分离的mAbs以及对照与hMPVF蛋白(包括胰蛋白酶裂解的三聚体hMPV A1 F蛋白)的四种亚型的ELISA结合曲线。融合前RSV F蛋白(SC-TM)用于确定是否有任何mAb与RSV F发生交叉反应。除mAbs 101F和MPE8外，未观察到交叉反应。肺炎链球菌的溶血素毒素用作阴性结合对照。每个点代表三次重复的平均值，误差条代表95％的置信区间。数据代表两个独立的实验。EC50值嵌入每个图形中，并在曲线顶部用图例进行颜色编码。(B)使用生物层干涉法的MPV364、MPV196和MPV314的联接和解离曲线。将hMPV B2 F蛋白加载到抗penta-HIS生物传感器上。曲线包括120秒的联接，然后是600秒的解离。Kon、Koff和KD值显示在各曲线下方，并计算为各结合曲线计算的值的平均值。每个实验的抗体浓度为666nM、333nM、167nM、83nM和42nM。从各曲线中减去仅包含缓冲液的参考曲线。
图3.hMPV F蛋白-特异性mAbs的中和谱。人mAbs和对照的中和曲线。IC50值嵌入每个图形中，并在每个曲线顶部用图例进行颜色编码。数据代表三次重复的平均值，误差条为95％置信区间。数据代表两个独立的实验。
图4A-4B.mAbs结合hMPV F蛋白的表位分析。(A)mAbs结合hMPV B2 F和hMPV A1 F蛋白的表位分析。数据表明，与单独的竞争抗体相比，存在一抗时竞争抗体的结合百分比。填充黑色的单元格表示完全竞争，其中观察到≤33％的非竞争信号，如果信号介于33％和66％之间，则为中间竞争(灰色)，如果信号≥66％，则为非竞争(白色)。基于与mAbs MPE8和25P13(位点III)、DS7和101F(位点IV)的竞争结合，抗原位点在顶部和侧面突出显示。(B)RSV F蛋白在与MPE8(PDB ID：5U68)的复合物中的晶体结构由hMPV F蛋白在与DS7 Fab(PDB：4DAG)的复合物中的晶体结构覆盖。基于MPV364的竞争曲线，mAb可能以偏离DS7的角度结合，因为在DS7和MPV364之间未观察到竞争。这与位点III mAbs MPE8和25P13形成对比，两者至少在一个方向上与DS7竞争。位点III通过与MPE8的结合来定义。位点IV如下图4B所示(MPV为SEQ ID NO：45；RSV为SEQ ID NO：46)。
图5A-5B.MPV364的体内递送限制了BALB/c小鼠肺中的病毒复制。(A)检测血清治疗前和治疗后是否存在人抗-hMPV F蛋白-特异性mAbs。MPV364治疗动物的MPV364滴度在五只小鼠之间的平均终点滴度为1/1,318，表明肌肉注射足以转移到循环系统。(B)各治疗组BALB/c小鼠肺匀浆中的病毒复制。与P19F80对照mAb治疗组和PBS治疗组相比，MPV364治疗组小鼠显示出显著降低的病毒滴度。MPV364治疗组和未感染组之间未观察到显著差异。n＝5只小鼠/组。****p<0.0001，***p＝0.0001，*p＝0.0348，ns＝不显著。
图6A-6F是序列表。(A)重链(HC)核苷酸，SEQ ID NO：3、13、23、33、51和61(B)HC氨基酸(AA)，SEQ ID NO：1、11、21、31、49和59(C)轻链(LC)核苷酸，SEQ ID NO：4、14、24、34、52和62(D)LC AA，SEQ ID NO：2、12、22、32、50和60，(E)HC互补决定区(CDR)1、HC CDR2和HCCDR3，SEQ ID NO：5、6和7，SEQ ID NO：15、16和17，SEQ ID NO：25、26和27以及SEQ ID NO：35、36和37，SEQ ID NO：53、54和55；和SEQ ID NO：63、64和65(F)LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，SEQ ID NO：8、9和10，SEQ ID NO：18、19和20，SEQ ID NO：28、29和30，SEQ ID NO：38、39和40，SEQ ID NO：56、57和58，以及SEQ ID NO：66、67和68。使用IMGT测定CDR。
图7A-7D.MPV458和MPV465的结合和中和特性。(A)hMPV F-特异性mAb面板的表位分析。表位对照mAbs包括101F(位点IV)、DS7和MPV196(DS7表位)以及MPV364和MPE8(位点III)。MPV465和MPV458不与已知的mAbs竞争，并相互竞争结合，这表明两种mAbs在以前未发现的抗原位点结合。数据表明与单独竞争抗体相比，存在一抗时竞争抗体的结合百分比。填充黑色的单元格表示完全竞争，其中观察到≤33％的未竞争信号；灰色的单元格表示中间竞争，其中信号介于33％和66％之间；白色的单元格表示非竞争，其中信号为≥66％。基于与对照mAbs的竞争结合，抗原位点在顶部和侧面突出显示。(B)MPV458和MPV465与对照的菌斑中和曲线。MPV458和MPV465二者都具有中和性，而MPV458具有类似于MPE8和101F的中和特性。IC50值嵌入各曲线中。肺炎球菌特异性抗体Ply34用作阴性对照。数据点是三次重复的平均值，误差条是95％的置信区间。数据来自一个实验，代表两个独立实验。(C)针对经胰蛋白酶处理的单体和三聚体hMPV B2 F蛋白的hMPV F特异性mAbs的ELISA结合曲线。MPV458和MPV465对单体hMPV B2 F具有比三聚体hMPV B2更低的EC50值(更高的亲和力)。结合曲线和EC50值根据图例上色。每个数据点是四次重复的平均值，误差条表示95％的置信区间。数据代表两个独立重复的一个实验。(D)得自生物层干涉仪的结合曲线。hMPV 130-BV涂覆的抗penta-HIS生物传感器暴露于mAbs中120秒，然后在缓冲液中解离600秒。在每个图形中显示结合常数。对于表现出有限解离的mAbs，仅显示结合常数(association constant)。
图8A-8D.hMPV B2 F+MPV458 Fab复合物的X射线晶体结构。(A)显示复合体的非对称单元。单体hMPV B2 F与MPV458的一个Fab共结晶。(B)用先前确定的融合前构象中hMPVA1 F的X-射线晶体结构覆盖hMPV B2 F+MPV458 Fab复合物(PDB：5WB0)。来自各结构的hMPVF蛋白在PyMol中被覆盖。MPV458与三聚体结构不相配。(C)使用MPV458重链观察到的氢键事件。(D)使用MPV458轻链观察到的氢键事件。MPV458轻链还与Asn57连接的扩展聚糖斑相互作用。
图9A-9E.hMPV B2 F+MPV458复合物的结构比较。(A)融合前hMPV F的X-射线晶体结构以66-87表位显示(LIKTELDLTKSALRELKTVSAD，SEQ ID NO：72)(PDB ID：5WB0)。(B)相应的66-87表位在融合后hMPV F(5L1X)的X-射线晶体结构上着色。66-87表位在三聚体融合后hMPV F表面暴露。(C)来自hMPV B2 F+MPV458复合物的融合前(青色)hMPV F和融合后hMPVF(PDB ID：5L1X)之间66-87区域的结构覆盖。B2和A1亚群之间的保守氨基酸残基以黑色列出，而具有突变或移位位置的残基根据相应的结构着色。(D)先前结构表征的hMPV F特异性mAbs对hMPV F蛋白上的MPV458的结构覆盖。通过将相应的RSV F残基对准来自与RSV F的共复合物的hMPV F而将MPE8(位点III)和101F(位点IV)对准hMPV F(PDB ID：5U68和PBD ID：3O45)。DS7与PDB 4DAG对齐。(E)将(D)中的结构覆盖旋转90度，从头部观察hMPV F蛋白。
图10.胰蛋白酶处理前纯化的hMPV B2 F的负染色电子显微照片。观察到融合前三聚体、融合后三聚体和单体蛋白的混合物。
图11.胰蛋白酶处理后hMPV B2 F的负染色电子显微照片。三聚体蛋白经尺寸排除色谱纯化后，进行负染色电子显微镜检查。
图12.hMPV 130-BV F蛋白的负染色电子显微照片。蛋白主要类似于融合前的F构象。
图13.hMPV B2 F-GCN4 dFP 6R蛋白的负染色电子显微照片。蛋白包含一个扩展的裂解位点，其含有六个重复的Arg残基，以增强细胞内的裂解。该蛋白主要类似于融合后的构象。
图14.hMPV F蛋白特异性mAbs与来自多个亚组的一组hMPV F蛋白构建物的ELISA结合曲线。MPV458和MPV465与来自所有四个亚组的hMPV F蛋白结合。EC50值嵌入每个图形中。结合曲线和EC50值根据图例上色。数据点是四次重复的平均值，误差条是95％的置信区间。>表示在20μg/mL的最高浓度下未检测到高于0.5吸光度单位的信号。
图15.hMPV B2 F和hMPV B2 F+Fab复合物的尺寸排除色谱法的色谱图。hMPV B2F的胰蛋白酶化产生均匀的三聚体和单体峰。将三聚体hMPV B2 F与MPV458或MPV465的Fabs复合生成单体F-Fab复合物和过量的Fabs。数据代表至少两个独立实验。
图16.hMPV B2 F+MPV458 Fab复合物中的对称相关配对物。未观察到hMPV F蛋白的三聚体结构。
图17.hMPV B2 F+MPV458 X-射线晶体结构周围电子密度图的代表性图像。图像以COOT完成，图像级别rmsd设置为2.45。
图18.融合后hMPV B2 F在与101F和MPV458的复合物中的尺寸排除色谱的色谱图。未观察到与MPV458的复合物，而101F很容易与hMPV F形成复合物。
图19.MPV458与66-87表位结合的Western blot分析。在转移到PVDF膜之前，对一组hMPV F蛋白构建物进行SDS-PAGE分离。在各组上列出的特异性mAbs用作一抗。MPV458与所有受试构建物(包括煮沸样品)结合，而MPE8和101F仅与有限处理的样品结合。
图20A-20D.流式细胞术分析hMPV F感染的LLC-MK2细胞。感染24小时后，收集细胞并用所示的mAbs染色。与肺炎球菌特异性mAb PspA16相比，MPV458和MPE8在感染细胞中诱导荧光位移。
序列
序列如图6A-6F所示。核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示，如37C.F.R.1.822所定义。仅显示每个核酸序列的一条链，但通过对所示链的任何引用互补链被理解为也包含在内。提交的序列表为ASCII文本文件，命名为Sequence_Listing.txt，该文件创建于2020年5月20日，31KB，通过引用并入本文。在随附的序列表中：
SEQ ID NO：1是MPV196重链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是MPV196轻链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是编码MPV196重链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：4是编码MPV196轻链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：5、6和7分别是MPV196的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：8、9和10分别是MPV196的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO：11是MPV201重链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是MPV201轻链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是编码MPV201重链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：14是编码MPV201轻链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：15、16和17分别是MPV201的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：18、19和20分别是MPV201的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO：21是MPV314重链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22是MPV314轻链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是编码MPV314重链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：24是编码MPV314轻链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：25、26和27分别是MPV314的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：28、29和30分别是MPV314的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO：31是MPV364重链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32是MPV364轻链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33是编码MPV364重链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：34是编码MPV364轻链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：35、36和37分别是MPV364的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：38、39和40分别是MPV364的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO：41和42是DS7抗体的VH和VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43和44是MPE8抗体的VH和VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45是MPV F蛋白位点IV的氨基酸序列。
SEQ ID NO：46是RSV F蛋白位点IV的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47和48是部分重链序列。
SEQ ID NO：49是MPV458重链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50是MPV458轻链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51是编码MPV458重链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：52是编码MPV458轻链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：53、54和55分别是MPV458的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：56、57和58分别是MPV458的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO：59是MPV465重链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：60是MPV465轻链可变域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61是编码MPV465重链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：62是编码MPV465轻链可变域的核酸序列。
SEQ ID NO：63、64和65分别是MPV465的IMGT HCDR1、HCDR2和HCDR3。
SEQ ID NO：66、67和68分别是MPV465的IMGT LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO：69、70和71是裂解位点。
SEQ ID NO：72是66-87表位的氨基酸序列。
具体实施方式
对人类呼吸道合胞病毒免疫反应的最新研究进展为预防和治疗疾病的新疫苗抗原和疗法铺平了道路。尽管hMPV是儿童下呼吸道感染的主要原因，但对hMPV免疫反应的理解的进展滞后。公开了特异性结合hMPV F蛋白的人单克隆抗体(mAbs)，以及使用这些抗体抑制hMPV感染或检测hMPV感染的方法。
本文公开了示例性单克隆抗体。其中的三种抗体，称为MPV196、MPV201和MPV314对hMPV F蛋白具有高亲和力。这些抗体不会与RSV F蛋白发生交叉反应。在一些实施方式中，这些抗体中和hMPV的A和B两种基因型。另外一种被称为MPV364的单克隆抗体在所有已识别的抗体中具有最弱的结合亲和力，但在体外中和能力最强。该抗体靶向hMPV F蛋白上的抗原位点III，但与先前发现的mAbs不同，因为它不会与RSV F蛋白发生交叉反应。MPV196、MPV201和MPV314结合在与DS7抗体相同的位点附近，但中和基因型A和基因型B MPV二者。另外两种抗体MPV458和MPV465结合至hMPV F蛋白上的独特抗原位点。MPV458具有有效的中和作用，MPV458和MPV465均与来自所有四个hMPV F亚组的hMPV F蛋白结合，并在hMPV F蛋白上新定义的表位处结合，该表位由位于MPV F蛋白头部的α-螺旋66-87定义。
I.术语概要
除非另有说明，否则技术术语按常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义见Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett出版社出版，2009；以及迈尔斯等人，(eds)，《细胞生物学和分子医学百科全书》，由Wiley VCH出版，2008，16卷；和其他类似参考文献。
如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”指单数形式和复数形式，除非上下文另有明确指示。例如，术语“抗原”包括单个或多个抗原，并且可以被认为等同于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含(comprise)”是指“包含(include)”。还应理解，除非另有说明，否则针对核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，且仅用于说明目的。尽管可以使用与本文所述类似或等效的许多方法和材料，但本文描述了特定的合适方法和材料。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在限制。为便于审查各种实施方式，提供以下术语解释：
约：除非上下文另有说明，“约”指参考值的正负5％。例如，“约”100指的是95至105。
施用：通过所选途径将组合物引入受试者。施用可以是局部的，也可以是全身的。例如，如果所选途径是静脉注射，则通过将组合物(例如包含公开的抗体或抗原结合片段的组合物)引入受试者的静脉来施用该组合物。示例性施用途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹腔内和静脉内)、舌下、直肠、经皮(例如局部)、鼻内、阴道和吸入途径。
试剂：对实现目的或结果有用的任何物质或任何物质组合；例如，用于抑制受试者hMPV感染的物质或物质组合。试剂包括蛋白质、核酸分子、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其他感兴趣的分子。试剂可包括治疗试剂(例如抗逆转录病毒试剂)、诊断试剂或药剂。在一些实施方式中，试剂是特异性结合hMPV的抗体，任选地与抗病毒试剂结合。本领域技术人员将理解，特定试剂可用于实现多个结果。
氨基酸取代：多肽中的一个氨基酸用不同的氨基酸取代或无氨基酸取代(即缺失)。在一些实例中，例如，多肽中的氨基酸被来自同源多肽的氨基酸取代，并且重组A组MPVF多肽中的氨基酸可被来自组B MPV F多肽的相应氨基酸取代。
抗体和抗原结合片段：免疫球蛋白、抗原结合片段或其衍生物，其特异性结合并识别分析物(抗原)，例如hMPV F多肽。术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。
抗体的非限制性实例包括，例如，保持与抗原结合亲和力的完整免疫球蛋白及其变体和片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'，Fab'-SH、F(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰整个抗体产生的抗原结合片段或使用重组DNA方法从头合成的抗原结合片段(参见，例如，Kontermann和Dübel(eds)，《抗体工程》，第1-2卷，第2版，Springer Verlag，2010)。
抗体还包括基因工程形式，如嵌合抗体(如人源化鼠抗体)和复共轭对配合物抗体(如双特异性抗体)。
抗体可以有一个或多个结合位点。如果存在多个结合位点，则结合位点可能彼此相同或不同。例如，自然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体具有两个不同的结合位点。
通常，自然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变域基因。轻链有两种类型，lamda(λ)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每个重链和轻链都包含恒定区(或恒定域)和可变区(或可变域)。在组合中，重链和轻链可变区特异性结合抗原。
提及“VH”或“VH”是指抗体重链的可变区，包括抗原结合片段的可变区，例如Fv、scFv、dsFv或Fab。提及“VL”或“VL”是指抗体轻链的可变域，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。
VH和VL包含被三个高变区打断的“框架”区域，也称为“互补决定区”或“CDRs”(参见，例如，Kabat等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，NIH出版号第91-3242，公共卫生服务，国立卫生研究院，美国卫生与公共服务部，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区，即构成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDRs。
CDR主要负责与抗原表位结合。给定CDR的氨基酸序列边界可以使用许多已知方案中的任何一个来容易地确定，包括Kabat等人(具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，NIH出版号91-3242，公共卫生服务，国立卫生研究院，美国卫生与公共服务部，1991；“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人，(“免疫球蛋白典型结构的标准构象”，J.Mol.Bio.，273(4)：927-9481997；“Chothia”编号方案)和Lefranc等人(“免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT唯一编号”，Dev.Comp.Immunol.,，27(1)：55-772003；“IMGT”编号方案)所描述的方案。每条链的CDRs通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N末端到C末端)，并且也通常由特定CDR所在的链来识别。因此，VH CDR3是发现它的抗体的VH中的CDR3，而VL CDR1是发现它的抗体的VL中的CDR1。轻链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR有时被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方式中，公开的抗体包括异源恒定域。例如，抗体包括不同于天然恒定域的恒定域，例如包括一个或多个修饰(例如“LS”突变)以增加半衰期的恒定域。
“单克隆抗体”是从基本上均质性抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，但可能的变异抗体除外，例如，含有自然存在的突变或在单克隆抗体制备过程中产生的，这种变体通常以少量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上均质性抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白位点的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。在一些实例中，由受试者分离出单克隆抗体。单克隆抗体可具有保守的氨基酸替代，这对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。(参见，例如，Greenfield(编辑)，《抗体：实验室手册》，第二版。纽约：冷泉港实验室出版社，2014)。
“人源化”抗体或抗原结合片段包括人类框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)抗体或抗原结合片段的一个或多个CDR。提供CDR的非人型抗体或抗原结合片段称为“供体”，提供框架的人型抗体或抗原结合片段称为“受体”。在一个实施方式中，所有CDRs均来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果存在，则它们可以与人类免疫球蛋白恒定区基本相同，例如至少约85％至90％，例如约95％或更多相同。因此，除CDRs外，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分与天然人型抗体序列的相应部分基本上相同。
“嵌合抗体”是包含来自两种不同抗体序列的抗体，这两种抗体通常属于不同的种类。在一些实例中，嵌合抗体包括来自一种人型抗体的一个或多个CDRs和/或框架区以及来自另一种人型抗体的CDRs和/或框架区。
“全人型抗体”或“人型抗体”是一种包含来自(或源自)人基因组的序列，且不包含其他物种序列的抗体。在一些实施方式中，人型抗体包括CDR、框架区和(如果存在)来自(或源自)人基因组的Fc区。人型抗体可以使用基于源自人基因组的序列来制造抗体的技术来识别和分离，例如通过噬菌体展示或使用转基因动物(参见，例如，Barbas等人，噬菌体展示：实验室手册，第一版，纽约：冷泉港实验室出版社，2004；Print.；Lonberg，Nat.Biotech.，23：1117-1125，2005；Lonenberg，Curr.Opin，《免疫学》，20：450-459，2008)。
中和MPV的抗体或抗原结合片段：一种抗体或抗原结合片段，其以抑制与抑制hMPV感染相关的生物功能的方式特异性结合hMPV抗原，例如hMPV(例如，F蛋白)。抗体可在病原体生命周期的不同时间点中和hMPV的活性。
生物样品：获自受试者的样品。生物样品包括可用于检测受试者疾病或感染(例如hMPV感染)的所有临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液，如血液、血液衍生物和部分(如血清)、脑脊液；以及活检或手术切除的组织，例如未固定、冷冻或固定在福尔马林或石蜡中的组织。在特定的实例中，生物样品获自从患有或怀疑患有hMPV感染的受试者。
双特异性抗体：一种重组分子，其由两个不同的抗原结合域组成，从而与两个不同的抗原表位结合。双特异性抗体包括两个抗原结合域的化学或遗传连接分子。抗原结合域可以使用连接物连接。抗原结合域可以是单克隆抗体、抗原结合片段(例如，Fab、scFv)或其组合。双特异性抗体可包括一个或多个恒定域，但不一定包括恒定域。
足以形成免疫复合物的条件：允许抗体或其抗原结合片段与同源表位结合的条件，其可检测程度大于和/或基本排除与基本上所有其他表位的结合。足以形成免疫复合物的条件取决于结合反应的形式，通常是免疫分析协议中使用的条件或体内遇到的那些条件。有关免疫分析形式和条件的说明，参见Harlow&Lane，《抗体，实验室手册》，第二版，冷泉港出版物，纽约(2013)。方法中使用的条件是“生理条件”，包括通常为活体哺乳动物或哺乳动物细胞内的条件(例如，温度、渗透压、pH)。虽然一些器官受到极端条件的影响，但组织内和细胞内环境通常在pH 7左右(例如，pH 6.0至pH 8.0，更典型的是pH 6.5至7.5)，包含水作为主要溶剂，并在高于0℃和低于50℃的温度存在。渗透压在支持细胞活力和增殖的范围内。
结合物：由两个分子连接在一起的复合物，例如，通过共价键连接在一起。在一个实施方式中，抗体与效应分子连接；例如，特异性结合hMPV F蛋白的抗体与效应分子共价连接。连接可以通过化学或重组手段进行。在一个实施方式中，该连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽连接物(短肽序列)可任选地包括在抗体和效应分子之间。由于结合物可以由两个具有不同功能的分子制备，例如抗体和效应分子，因此它们有时也被称为“嵌合体分子”。
保守变异：“保守”氨基酸取代是指不会实质性影响或降低蛋白功能，例如蛋白与目标蛋白相互作用的能力的取代。例如，与参考抗体序列相比，MPV特异性抗体可包括多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个保守取代，并保留MPV的特异性结合活性和/或MPV中和活性。术语保守变异还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸。
改变、添加或删除编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸(例如小于5％，在一些实施方式中小于1％)的单个取代、删除或添加是保守变异，这种变异导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。
以下六组是被认为彼此保守替代的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
非保守取代是那些降低hMPV特异性抗体的活性或功能，例如特异性结合hMPV F蛋白或中和hMPV能力的取代。例如，如果氨基酸残基对蛋白的功能是必需的，即使是其他的保守取代也可能破坏这种活性。因此，保守取代不会改变所关注的蛋白质基本功能。
接触：以直接物理联接的方式放置；包括在固体和液体形式中二者，可在体内或体外进行。接触包括一个分子与另一个分子之间的接触，例如一个多肽(例如肽)表面上的氨基酸与另一个多肽接触。接触还可以包括例如通过使多肽与细胞直接物理联接而接触细胞。
对照：参考标准。在一些实施方式中，对照是获自健康患者的阴性对照样品。在其他实施方式中，对照是获自诊断为MPV感染的患者的阳性对照样品。在另一些其它实施方式中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(例如先前测试的对照样品，例如具有已知预后或结果的MPV患者组，或代表基线或正常值的样品组)。
测试样品和对照之间的差异可以是增加，也可以是减少。差异可以是定性差异或定量差异，例如统计显著性差异。在一些实例中，差异是相对于对照的的增加或减少为至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％，至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或大于500％。
简并变体：在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码包含由于遗传密码而简并的序列的多肽(例如重组MPV F蛋白或其免疫原性片段)的多核苷酸。有20种天然氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列保持不变，就包括编码肽的所有简并核苷酸序列。
可检测标记：一种可检测的分子(也称为标签)，直接或间接与第二分子(如抗体)结合，以便于检测第二分子。例如，可检测标记可通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(如CT扫描、MRI、超声波、光纤检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记的具体、非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如，通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如在Green和Sambrook(《分子克隆：实验室手册》，第四版，纽约：冷泉港实验室出版社，2012)和Ausubel等人，(Eds.)(《分子生物学当前方案》，纽约：John Wiley and Sons，包括补充，2017)中讨论了使用可检测标记的方法以及选择适合于各种目的的可检测标记的指南。
检测：识别某物的存在、存在或事实。
DS7抗体：一种中和单克隆抗体，其特异性结合存在于hMPV F蛋白的融合前和融合后构象上的hMPV F蛋白上的表位。DS7抗体其融合后构象不特异性结合hMPV F。例如，在Wen等人，Nat.Struct.Mol.Biol.，19，461-463，2012中描述了DS7抗体及其生产方法，其全文通过引用并入本文。DS7抗体的重可变区和轻可变区的氨基酸序列以SEQ ID NO：41和42提供，并已作为No.4DAG_H(DS7 VH)和4DAG_L(DS7 VL)保存在PDB中，其中每一个均通过引用并入本文，如2014年11月10日数据库中所示)。
DS7 VH-EVQLLESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFTVSSSYMSWVRQTPGKGLEWISVFYSGGTTYYADAVKGRFSISMDTSKNTLHLQMNSLRVEDTAIYYCARVLSRASGMPDAFDIWGPGTMVTVSS(SEQ ID NO：41)
DS7 VL-ELALIQPASVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTTLTVLGQ(SEQ ID NO：42)
有效量：一种特定物质的量，足以对施用该物质的受试者达到所需效果。例如，其可以是抑制hMPV感染或可测量地改变hMPV感染的外部症状所需的抗体量。
在一些实施方式中，与合适的对照相比，施用有效量的结合hMPV F蛋白的所公开的抗体或抗原结合片段可减少或抑制MPV感染(例如，通过细胞感染、或通过hMPV感染的受试者的数量或百分比、或通过受感染受试者生存时间的增加或与hMPV相关的症状的减少来测量)所需的量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，至少98％，甚至至少100％(消除或预防可检测的hMPV感染)。
施用给受试者以抑制hMPV感染的抗体或抗原结合片段(特异性结合hMPV F蛋白)的有效量将取决于与该受试者相关的许多因素，例如受试者的整体健康和/或体重。有效剂量可通过改变剂量和测量产生的反应，如，例如，病原体滴度的降低来确定。有效量也可以通过各种体外、体内或原位免疫分析来确定。
有效剂量包括分数剂量，其与先前或后续的施用相结合，有助于获得有效反应。例如，在持续数天或数周的治疗过程中，可单剂量或多剂量(例如每天)施用有效量的试剂。然而，有效剂量取决于待治疗的受试者、治疗情况的严重程度和类型以及施用的方式。试剂的单位剂型可按有效量的一定量或倍数包装，例如，在带有无菌成分的小瓶(例如，带可穿透盖)或注射器中。
表位：一种抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特定的化学基团或肽序列，从而引发特定的免疫反应，例如，表位是B细胞和/或T细胞应答的抗原区域。抗体可以结合到特定的抗原表位，例如hMPV F蛋白上的表位。
表达：核酸序列的转录或翻译。例如，当基因的DNA被转录成RNA或RNA片段(在一些实例中被加工成mRNA)时，该基因被表达。当基因的mRNA被翻译成氨基酸序列，如蛋白或蛋白片段时，基因也可能被表达。在特定的实例中，异源基因在转录成RNA时表达。在另一个实例中，当异源基因的RNA被翻译成氨基酸序列时，该基因被表达。术语“表达”在本文中用于表示转录或翻译。表达调控可以包括对转录、翻译、RNA运输和加工、如mRNA的中间分子的降解的控制，或通过特定蛋白质分子产生后的激活、失活、区域化或降解。
表达控制序列：核酸序列，其调节与其操作连接的异源核酸序列的表达。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和(视情况而定)翻译时，表达控制序列操作性地连接至核酸序列。因此，表达控制序列可包括适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许正确翻译mRNA以及终止密码子。术语“控制序列”旨在至少包括其存在可影响表达的元件，并且还可包括其存在有利的附加元件，例如，前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。
启动子是足以指导转录的最小序列。还包括足以使启动子依赖性基因的表达对于细胞类型特异性、组织特异性，或由外部信号或试剂产生的可诱导性可控的那些启动子元件；这样的元件可能位于基因的5'或3'区域。包括组成型和诱导型启动子二者(参见例如，Bitter等人，酶学方法，153:516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等。在一个实施方式中，在哺乳动物细胞系统中进行克隆时，可使用源自哺乳动物细胞基因组(如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供核酸序列的转录。
可以将多核苷酸插入包含启动子序列的表达载体中，该启动子序列有助于插入的宿主遗传序列的有效转录。表达载体通常包含复制来源、启动子以及允许转化细胞表型选择的特定核酸序列。
表达载体：一种包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列操作连接的表达控制序列。表达载体包括用于表达的足够顺式作用元件；其他表达元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中所有已知的表达载体，例如包含组多核苷酸的载体、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
Fc区域：抗体的恒定区，不包括第一重链恒定域。Fc区通常指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定域，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定域。Fc区域还可以包括这些域的部分或全部柔性铰链N端。对于IgA和IgM，Fc区域可能包括也可能不包括附属物，也可能受J链约束也可能不受J链约束。对于IgG，Fc区域通常被理解为包括免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3以及任选地Cγ1和Cγ2之间的铰链的下部。尽管Fc区域的边界可能不同，但人IgG重链Fc区域通常被定义为包括C226或P230之后到Fc羧基末端的残基，其中根据Kabat编号。对于IgA，Fc区域包括免疫球蛋白域Cα2和Cα3以及任选地Cα1和Cα2之间的铰链的下部。
异源：起源于不同的遗传源。与细胞异源的核酸分子起源于遗传源，而不是表达它的细胞。在一个特定的、非限制性实例中，编码蛋白质(如scFv)的异源核酸分子在细胞(如哺乳动物细胞)中表达。用于在细胞或生物体中引入异源核酸分子的方法在本领域中是众所周知的，例如用核酸转化，包括电穿孔、脂质转染、粒子枪加速和同源重组。
宿主细胞：载体可以在其中繁殖并表达其DNA的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能与亲本细胞不同，因为在复制过程中可能会发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这些后代也包括在内。
IgG：一种多肽，属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别或同种型。在人类中，这一类包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
免疫复合物：抗体或抗原结合片段(如scFv)与可溶性抗原结合形成免疫复合物。免疫复合物的形成可通过常规方法检测，例如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如，Western blot)、磁共振成像、CT扫描、放射照相和亲和色谱法。
免疫反应：免疫系统的细胞，如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的反应。在一个实施方式中，该反应对特定抗原具有特异性(“抗原特异性反应”)。在一个实施方式中，免疫反应是T细胞反应，如CD4+反应或CD8+反应。在另一实施方式中，反应为B细胞反应，并导致产生特异性抗体。
免疫原：一种化合物、组合物或物质，可刺激动物体内抗体的产生或T细胞反应，包括注射或吸收到动物体内的组合物，如hMPV。免疫原与特定体液或细胞免疫的产物发生反应。
抑制疾病或状况：减少受试者疾病或状况的全面发展，例如，在有MPV感染风险的受试者中，减少MPV感染(如hMVP感染)的全面发展。这包括中和、对抗、禁止、抑制、减缓、干扰、停止或逆转疾病或状况的进展或严重程度。
抑制疾病或状况可指在疾病或状况开始发展之前实施的预防性干预(例如，在有hMPV感染风险但未感染hMPV的受试者中开始的治疗)减少疾病或状况的后续发展和/或改善疾病或状况发展后的迹象或症状。关于抑制疾病或状况的术语“改善”是指旨在抑制疾病或状况的预防性干预的任何可观察到的有益效果。其有益效果可如下得到证明，例如，易感受试者的疾病或状况的临床症状延迟出现、疾病或状况的部分或全部临床症状的严重程度降低、疾病或状况进展缓慢、受试者整体健康或安康改善、感染减少、或通过对特定疾病或状况具有特异性的其他参数。
在一些实施方式中，所公开的hMPV F蛋白特异性抗体和抗原结合片段抑制受试者中hMPV的生长，例如，抗体和抗原结合片段抑制受试者的hMPV增殖，与相关对照组相比，导致受试者的病原体负荷减少。例如，所公开的hMPV F蛋白特异性抗体和抗原结合片段与合适的对照相比可抑制受试者中的hMPV感染，或抑制病毒复制至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
分离的：一种生物成分(如核酸、肽、蛋白质或蛋白质复合物，例如抗体)，已从该成分自然存在的生物体细胞的其他生物成分(即，其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)中基本上分离出来、产生出来或纯化出来。因此，分离的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。分离的核酸、肽或蛋白质，例如抗体，可为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯度。
Kabat位置：氨基酸序列中残基的位置，遵循Kabat等人规定的编号规则(具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生服务部卫生与人类服务部，贝塞斯达，NIH出版号91-3242，1991)。
连接物：一种双功能分子，可用于将两个分子连接成一个连续的分子，例如，将效应分子与抗体或可检测标记与抗体连接。肽连接物的非限制性示例包括甘氨酸-丝氨酸连接物。
术语“结合”、“联结”、“结合”或“连接”可以指将两个分子合成为一个邻接分子；例如，将两个多肽连接成一个邻接多肽，或将效应分子或可检测标记放射性核素或其他分子共价连接到多肽，如scFv。连接可以通过化学或重组方式进行。“化学手段”是指抗体部分和效应分子之间的反应，从而在两个分子之间形成共价键形成一个分子。
偏肺病毒(metapneumovirus，MPV)：副粘病毒科的一种有包膜的非分段负义单链RNA病毒。它是儿童和成人下呼吸道感染(包括毛细支气管炎和肺炎)的常见原因，在五岁时几乎感染所有人。MPV引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，可能发生在任何年龄段，尤其是老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人。hMPV可以感染人类。
MPV基因组包括编码9种蛋白的8个基因，包括糖蛋白SH、G和F。F蛋白介导融合，允许病毒进入细胞质。已经描述了两组人类MPV菌株，A组和B组，其进一步分为亚组A1、A2、B1和B2。本领域普通技术人员已知示例性MPV菌株序列。此外，有几种人类MPV感染模型可用，包括感染hMPV的模型生物体(参见，例如，Herfst等人，J General Virol.，88，2702-2709，2007；Bayon等人，Rev.Med.Virol.，2，15-34，2013；和Liu等人，Clinical VaccineImmunol.，20，1246-1254，2013)。F蛋白具有头部和尾部；头部是融合前状态的顶部50％，尾部是融合前状态的底部50％。
诊断MPV感染的方法是已知的，包括使用直接荧光抗体检测(DFA)、色谱快速抗原检测和使用RT PCR检测病毒RNA。病毒载量的量化可以，例如，通过菌斑分析、抗原捕获酶免疫分析(EIA)或PCR确定。抗体水平的定量可通过亚组特异性中和试验或ELISA进行。目前的MPV治疗包括使用抗病毒利巴韦林和被动施用实验性单克隆抗体，如MPE8(参见，例如，Corti等人，Nature，501，439-443，2013)和mAb338(Medimmune,Inc.，参见Hamelin等人，Antiviral Res.，88，31-37,2010)，其在动物模型中识别MPV F蛋白并降低MPV感染和疾病的发生率。
MPV有几个亚组，包括A组和B组，以及人类MPV中的A1、A2、B1和B2亚组。在MPV亚组中，每个亚组都有单独的菌株。本文已知并提供来自特定MPV菌株的F蛋白序列(参见，例如表1)。
MPV融合(F)蛋白：一种MPV包膜糖蛋白，促进病毒和细胞膜的融合。在自然界中，MPV F蛋白最初合成为单多肽前体，长度为约540个氨基酸，命名为F0。F0包括使定位指向内质网的N末端信号肽，其中信号肽(F0的大约前18个残基)以蛋白水解的方式裂解。剩余的F0残基寡聚以形成三聚体，三聚体再次在蛋白酶位点进行处理(大约在F0位置102和103之间；例如，RQSR102(残基99-102)生成两个二硫键连接片段F1和F2。这些片段中较小的片段F2源于F0前体的N末端部分，并包括大约F0的残基20-102。这些片段中较大的片段F1包括F0前体的C末端部分(约为残基103-540)，包括C末端的细胞外/管腔区(约残基103-490)、跨膜区(约残基491-513)和细胞质区(约残基514-540)。
三个F2-F1原聚体在成熟F蛋白中寡聚，其采用亚稳“融合前”构象，在与靶细胞膜接触时被触发经历构象变化(变为“融合后”构象)。这种构象变化暴露了一个疏水序列，称为融合肽，位于F1多肽的N末端，与宿主细胞膜联接并促进病毒膜或感染细胞与靶细胞膜的融合。
MPV F蛋白的细胞外部分是MPV F胞外域，包括F2蛋白(约MPV F位置20-102)和F1胞外域(约MPV F位置103-490)。MPV F胞外域三聚体包含三个MPV F胞外域的蛋白质复合物。
图4显示了F蛋白的抗原位点，其基于与对照mAbs MPE8和25P13(位点III)、DS7和101F(位点IV)的竞争结合。结合位点III的抗体与抗体MPE8结合用于结合MPV F蛋白。
MPV F融合前构象：MPV F蛋白在触发融合事件之前采用的结构构象，该融合事件导致MPV F转变为融合后构象，然后在分泌系统中加工成成熟的MPV F蛋白。MPV F的融合前构象在整体结构上与其他副粘病毒(如RSV)F蛋白的融合前构象相似。
MPE8抗体：一种中和的单克隆抗体，其特异性结合存在于MPV F蛋白融合前构象上，但不存在于融合后构象上的MPV F蛋白的表位。MPE8抗体及其生产方法见述于例如，Corti等人，(Nature，501，439-443，2013)，通过引用并入本文。MPE8与MPV F蛋白的位点III结合；位点III可通过MPE8结合识别。本文所用MPE8抗体的重和轻可变区的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：43和44。MPE8重链和轻链序列已作为编号AGU13651.1(MPE8 VH)和AGU13652.1(MPE8 VL)存放在GenBank中，每一个均通过引用并入本文，如2014年11月10日数据库中所示)。
MPE8 VH-EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISASSSYSDYADSAKGRFTISRDNAKTSLFLQMNSLRAEDTAIYFCARARATGYSSITPYFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：43)
MPE8 VL-QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDNNNRPSGVPDRFSASKSGT(SEQ ID NO：44)
中和抗体：通过与传染原上的特定抗原结合而降低传染原的感染性滴度的抗体。在一些实例中，传染原是病毒。在一些实例中，MPV F特异性抗体能够中和hMPV的传染性滴度。“广泛中和抗体”是一种结合并抑制相关抗原功能的抗体，例如共享抗原的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同抗原表面的抗原。关于来自病原体(例如病毒)的抗原，抗体可结合并抑制来自病原体的一个以上类别和/或子类别的抗原的功能。例如，关于MPV，抗体可结合并抑制抗原的功能，例如来自一个以上组的MPV F。
核酸：一种聚合物，由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关自然存在的结构变体及其合成的非自然存在的类似物)、相关自然存在的结构变体及其合成的非自然存在的类似物组成。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸及其之间的连接包括非自然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)，等等。这样的多核苷酸，例如，可通过使用自动DNA合成器合成。术语“寡核苷酸”通常指短多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，其还包括其中“U”取代“T”的RNA序列(即A、U、G、C)。
“核苷酸”包括但不限于单体，其包括连接到糖的碱基，例如嘧啶、嘌呤或其合成类似物，或连接到氨基酸的碱基，如肽核酸(PNA)。核苷酸是多核苷酸中的一个单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。
本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左端为5'-端；双链核苷酸序列的左手方向称为5'-方向。向新生RNA转录本中添加核苷酸的5'至3'方向称为转录方向。与mRNA具有相同序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上与从该DNA转录的mRNA具有相同序列且位于RNA转录本5'端至5'端的序列称为“上游序列”；DNA链上与RNA序列相同且编码RNA转录本3'至3'末端的序列称为“下游序列”。
“cDNA”是指以单链或双链形式与mRNA互补或相同的DNA。
“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中用作生物过程中合成具有限定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的核苷酸的特定序列的固有特性，以及由此产生的生物特性。因此，如果基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。基因或cDNA的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)和用作转录模板的非编码链二者均可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。
如果序列为第一序列的多核苷酸与序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则第一序列相对于第二序列为“反义”。
可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作链接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则诸如CMV启动子的启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时在同一阅读框中。
药学上可接受的载体：所使用的药学上可接受的载体为常规载体。E.W.Martin的雷明顿制药科学，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版，1995，描述了适用于药学递送所公开抗体及其抗原结合片段的组合物和制剂。
一般而言，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠外制剂通常包括可注射液体，其包含药学上和生理上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为载体。对于固体组合物(例如，粉末、药丸、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体可包括，例如，医药级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨醇酐单月桂酸酯。在特定实施方式中，适合向受试者施用的载体可以是无菌的，和/或悬浮在，或以其他方式包含在含有组合物的一个或多个测量剂量的单位剂型中。它也可能伴随着用于治疗目的的药物。单位剂型可例如，在含有无菌内容物的密封小瓶中，或在注射到受试者体内的注射器中，或被冻干以用于后续的溶解和施用，或为固体或控释剂量。
多肽：任何氨基酸链，不论长度或翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)。“多肽”适用于氨基酸聚合物，包括自然存在的氨基酸聚合物和非自然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然氨基酸的氨基酸聚合物，例如相应自然存在的氨基酸的人工化学模拟物。“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物混入多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基末端(N末端)和羧基末端(C末端)。“多肽”可与肽或蛋白质互换使用，在本文中用于指氨基酸残基的聚合物。
多肽修饰：多肽和肽，例如本文公开的抗体，可通过多种化学技术修饰以产生具有与未修饰的肽基本相同的活性且任选地具有其它期望性质的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团，无论是羧基末端还是侧链，可以以药学上可接受的阳离子的盐的形式提供或酯化以形成C1-C16酯，或转化为式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地为H或C1-C16烷基，或组合以形成杂环，例如五元或六元环。肽的氨基，无论是氨基末端还是侧链，可以呈药学上可接受的酸加成盐的形式，例如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其他有机盐，或者可以改性为C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺。
肽侧链的羟基基团可以使用公认的技术转化为C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽侧链的苯环和酚环可被一个或多个卤素原子(例如F、Cl、Br或I)取代，或被C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或此类羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基基团可以延伸为同源的C2-C4亚烃基。硫醇可以用许多公认的保护基中的任何一个进行保护，例如乙酰胺基团。本领域的技术人员还将认识到用于将环状结构引入本公开的肽中的方法以选择和提供对导致增强稳定性的结构的构象约束。例如，可将C-或N-末端半胱氨酸添加到肽中，以便当被氧化时肽将包含二硫键，从而生成环肽。其他肽环化方法包括形成硫醚、羧基和氨基末端酰胺和酯。
纯化：术语纯化不需要绝对纯度；相反，它是一个相对术语。因此，例如，纯化肽制剂是一种其中肽或蛋白质(如抗体)比细胞内其自然环境中的肽或蛋白质更富集的制剂。在一个实施方式中，制剂被纯化，使蛋白质或肽代表制剂的总肽或蛋白质含量的至少50％。
重组：重组核酸是一种具有非自然存在的序列或具有由两个分离的序列片段人工组合而成的序列的核酸。这种人工合成可以通过化学合成完成，或者更常见的是，通过人工操纵分离的核酸片段，例如，通过基因工程技术完成。重组蛋白是一种具有非自然存在的序列或具有由两个分离的序列片段人工组合而成的序列的蛋白质。在若干实施方式中，重组蛋白由已引入宿主细胞(如细菌或真核细胞)的异源(例如，重组)核酸编码。核酸可以被引入，例如，具有能够表达由引入的核酸编码的蛋白质的信号的表达载体上，或者可以将核酸整合到宿主细胞染色体中。
呼吸道合胞病毒(RSV)：副粘病毒科的一种有包膜的非分段负义单链RNA病毒。它是儿童一岁时毛细支气管炎和肺炎的最常见病因，在三岁时几乎感染所有儿童。呼吸道合胞病毒还会引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，可能发生在任何年龄段，尤其是老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人。在美国，呼吸道合胞病毒毛细支气管炎是婴儿住院的主要原因，也是整个儿童时期哮喘和喘息的主要原因(Shay等人，JAMA,282,1440(1999)；Hall等人，N.Engl.J.Med.，360，588(2009))。在全球范围内，RSV每年造成66,000-199,000名五岁以下儿童死亡(Nair等人，Lancet，375，1545(2010))，占一个月至一岁婴儿死亡人数的6.7％，超过除疟疾以外的任何其他单一病原体(Lozano等人，Lancet，380，2095(2013))。
RSV基因组长度为约15,000个核苷酸，包含10个基因，编码11种蛋白质，包括糖蛋白SH、G和F。F蛋白介导融合，允许病毒进入细胞质并促进合胞体的形成。基于G糖蛋白抗原性的差异，已经描述了两种人类RSV菌株亚型，A亚型和B亚型。其他种类的RSV菌株也已知，包括牛RSV。示例性RSV菌株序列是本领域普通技术人员已知的。此外，有几种人RSV感染模型可用，包括感染hRSV的模型生物，以及感染物种特异性RSV的模型生物，例如在牛中使用bRSV感染(参见，例如，Bern等人，Am J,Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.，301：L148-L156，2011)。
序列同一性：氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，也称为序列同一性。序列同一性通常以百分比同一性(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽的同源物、同源物或变体将具有相对较高程度的序列同一性。
用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。各种程序和比对算法见述于：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math，2：482，1981；Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol，48：443，1970；Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins&Sharp，Gene，73：237-44，1988；Higgins&Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等人，Nuc.AcidsRes.16：10881-90，1988；Huang等人，Computer Appls.in the Biosciences 8，155-65，1992；和Pearson等人，Meth.Mol.Bio，24：307-31，1994。Altschul等人，J.Mol.Biol，215：403-10，1990详细介绍了序列比对方法和同源性计算。
一旦比对，匹配数通过计算两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定。序列的百分比一致性通过将匹配数除以已识别序列中所述序列的长度或铰接长度(例如，来自已识别序列中所述序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将结果值乘以100来确定。例如，当与具有1554个氨基酸的测试序列比对时，具有1166个匹配数的肽序列与测试序列的同一性为75.0％(1166÷1554*100＝75.0)。百分比序列同一性值四舍五入到最接近的十分之一。例如，75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入为75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入为75.2。长度值将始终为整数。
NCBI基本局部对齐搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403，1990)可从多个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，马里兰州贝塞斯达)和互联网，用于序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。关于如何使用这个程序确定序列同一性的描述可以在互联网上的NCBI网站上找到。。
多肽的同系物和变体的典型特征是相对于所关注的氨基酸序列的全长比对拥有计算为至少约75％，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。当通过该方法评估时，与参考序列具有更大相似性的蛋白质将显示出增加的百分比同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当比较的序列同一性小于整个序列时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗上具有至少80％的序列同一性，并且可能具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，这取决于它们与参考序列的相似性。在互联网上的NCBI网站可以找到在这些短窗中确定序列同一性的方法。本领域技术人员将理解，这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能获得不在规定范围内的强显著同系物。
对于核酸序列的序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。用于比较的最佳序列比对可如下进行，例如，通过Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482，1981，通过Needleman&Wunsch的同源性比对算法J.Mol.Biol.48:443，1970，通过Pearson&Lipman的搜索相似性方法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444，1988，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin GeneticsSoftware Package的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.,Madison，WI)，或通过手动比对和目视检查(参见，例如Sambrook等人，(分子克隆：实验室手册，第四版，冷泉港，纽约，2012)和Ausubel等人，(在《分子生物学当前方案》中，John Wiley&Sons，纽约，通过第104期增刊，2013)。有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用Feng&Doolittle的渐进比对方法的简化，J.Mol.Evol.35:351-360，1987。所用方法与Higgins&Sharp，CABIOS 5：151-153，1989所述方法相似。使用PILEUP，将参考序列与其他测试序列进行比较，使用以下参数以确定序列一致性百分比关系：默认间隙重量(3.00)、默认间隙长度重量(0.10)和加权端部间隙。PILEUP可获自GCG序列分析软件包，例如，7.0版本(Devereaux等人，Nuc.Acids Res.12：387-395，1984)。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其见述于Altschul等人，J.Mol.Biol，215：403-410，1990和Altschul等人，Nucleic Acids Res，25：3389-3402，1977。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获取(ncbi.nlm.nih.gov)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。BLASTP程序(用于氨基酸序列)默认使用字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)。寡核苷酸是长度为约100个碱基的线性多核苷酸序列。
如本文所用，提及“至少80％同一性”是指对指定的参考序列为“至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性”。如本文所用，提及“至少90％同一性”是指对指定的参考序列为“至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性”。
特异性结合：当提及抗体或抗原结合片段时，指的是一种结合反应，其在蛋白质和其他生物制剂的异质性群体的存在下确定目标蛋白的存在。因此，在指定的条件下，抗体优先结合特定的目标蛋白、肽或多糖(例如存在于病原体表面的抗原，例如MPV F蛋白)，并且不大量结合样品或受试者中存在的其他蛋白质。特异性结合可通过标准方法确定。参见arlow&Lane，抗体，实验室手册，第二版，冷泉港出版物，纽约(2013)，用于描述可用于确定特异性免疫反应性的免疫分析格式和条件。
关于抗体-抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合具有小于约10-7摩尔的KD，例如小于约10-8摩尔、10-9摩尔或甚至小于约10-10摩尔。KD是指给定相互作用的解离常数，例如多肽-配体相互作用或抗体-抗原相互作用。例如，对于抗体或抗原结合片段与抗原的双分子相互作用，它是双分子相互作用的单个组分的浓度除以复合物的浓度。
特异性结合hMPV F蛋白上的表位的抗体是基本上结合hMPV F蛋白的抗体，包括表达hMPV F蛋白的细胞或组织、hMPV F蛋白附着的底物或生物样本中的hMPV F蛋白。当然，人们认识到抗体和非靶标(例如不表达hMPV F蛋白的细胞)之间可能发生一定程度的非特异性相互作用。通常，特异性结合导致抗体与携带抗原的蛋白质或细胞之间的联接比抗体与缺乏抗原的蛋白质或细胞之间的联接强得多。与缺乏表位的蛋白质或细胞或组织相比，特异性结合通常导致与包括该表位的蛋白质或表达目标表位的细胞或组织的结合抗体量(每单位时间)增加2倍以上，例如增加5倍以上、10倍以上或100倍以上。在这种条件下与蛋白质的特异性结合需要一种因其针对特定蛋白质具有特异性而选择的抗体。多种免疫分析格式适用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，固相ELISA免疫分析通常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的单克隆抗体。
受试者：活的多细胞脊椎生物，该类别包括人类和非人类哺乳动物。在一个实例中，受试者是人。在特定的实例中，受试者是新生婴儿。在附加实例中，选择需要抑制hMPV感染的受试者。例如，受试者未受感染且有感染hMPV的风险，或被感染需要治疗。
治疗有效量：足以预防、治疗(包括预防)、减少和/或改善紊乱或疾病的症状和/或潜在原因，例如预防、抑制和/或治疗hMPV感染的试剂(例如公开的抗体或其抗原结合片段)的量。在一些实施方式中，治疗有效量足以减少或消除疾病症状，例如hMPV感染。例如，这可能是抑制或防止病毒复制或可测量地改变病毒感染的外部症状所必需的量。一般来说，该量足以显著抑制病毒复制或传染性。
在一个实例中，理想的反应是抑制、减少或预防hMPV感染。对于有效的方法，MPV感染不需要完全消除、减少或预防。例如，与适当的对照相比，施用治疗有效量的试剂可减少hMPV感染(例如，通过细胞感染或通过hMPV感染受试者的数量或百分比进行测量)所需量，为例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％(消除或预防可检测的hMPV感染)。
治疗有效量的试剂可在治疗过程中(例如，加强免疫疫苗治疗)以单剂量或多剂量(例如每天)施用。然而，治疗有效量可取决于所治疗的受试者、所治疗疾病的严重程度和类型以及施用方式。试剂的单位剂型可按治疗量或治疗量的倍数包装在，例如，装有无菌成分的小瓶(例如，带可穿透盖)或注射器中。
治疗或预防疾病：抑制例如，存在hMPV感染的疾病风险或患有此类疾病的受试者的疾病或状况的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后，改善疾病或病理状况的症状或体征的治疗干预。关于疾病或病理状况，术语“改善”指的是治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可如下得到证明，例如，易感受试者的疾病的临床症状延迟出现、疾病的部分或全部临床症状的严重程度降低、疾病进展缓慢、受试者整体健康或安康改善、或通过本领域中已知的对特定疾病具有特异性的其他参数。“预防性”治疗是指对未表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的受试者施用的治疗，目的在于降低发生病理学的风险。
术语“减少”是相对术语，例如，与参考试剂相比，如果在施用试剂后疾病或状况在量上减少，或者在施用试剂后疾病或状况减少，则该试剂减少疾病或状况。类似地，术语“预防”并不一定意味着试剂完全消除了疾病或状况，只要该疾病或状况的至少一个特征被消除即可。因此，减少或预防感染的组合物可以但不一定完全消除这种感染，只要在不存在制剂，或与参考试剂相比时感染显著地减少，例如，至少约50％，例如至少约70％或约80％，或甚至约90％的感染。
转化：转化细胞是通过分子生物学技术将核酸分子引入其中的细胞。如本文所使用的，术语转化等(例如，转化、转染、转导等)包括可将核酸分子引入此类细胞的所有技术，包括使用病毒载体的转导、使用质粒载体的转化，以及通过电穿孔、脂质体转染和粒子枪加速引入DNA。
载体：一种含有核酸分子(如DNA或RNA分子)的实体，该核酸分子带有一个或多个启动子，该启动子与所关注的蛋白质的编码序列可操作地相连，并可表达该编码序列。非限制性实例包括裸的或包装的(脂质和/或蛋白质)DNA、裸的或包装的RNA、可能无复制能力的病毒或细菌或其他微生物的亚组分，或可能有复制能力的病毒或细菌或其他微生物。载体有时被称为构建物。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制源。病毒载体是具有至少一些源自一种或多种病毒的核酸序列的重组核酸载体。在一些实施方式中，病毒载体包含编码所公开抗体或抗原结合片段的核酸分子，该抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在足以…的条件下：用于描述允许所需活动的任何环境的短语。
II.描述数个实施方式
提供特异性结合hMPV F蛋白的分离单克隆抗体和抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可以完全由人产生。抗体和抗原结合片段可中和hMPV，例如，所公开的抗体可在体内抑制hMPV感染，并且可在感染hMPV之前或之后施用。本文还公开了包含抗体和抗原结合片段以及药学上可接受的载体的组合物。还提供编码抗体或抗原结合片段的核酸、包含这些核酸的表达载体(例如腺相关病毒(AAV)病毒载体)。抗体、抗原结合片段、核酸分子、宿主细胞和组合物可用于研究、诊断、治疗和预防目的。例如，所公开的抗体和抗原结合片段可用于诊断具有hMPV感染的受试者，或可施用以抑制受试者的hMPV感染。
在一些实施方式中，所公开的抗体不与RSV F蛋白交叉反应。在其他实施方式中，这些抗体中和hMPV的A基因型和B基因型二者。在进一步的实施方式中，所公开的抗体结合MPV F蛋白的位点III。在其它实施方式中，所公开的抗体结合包括α-螺旋66-87的hMPV F蛋白上的表位。
A.特异性结合hMPV F蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段
以下对单克隆抗体的讨论是指包括重链和/或轻链可变域(或其抗原结合片段)的分离单克隆抗体，这些可变域包含参照IMGT编号方案的CDR1、CDR2和/或CDR3(除非上下文另有指示)。各种CDR编号方案(如Kabat、Chothia或IMGT编号方案)可用于确定CDR位置。序列中提供了根据IMGT编号方案的MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458和MPV465单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列和CDR，但仅为示例性序列。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段基于MPV196抗体或源自MPV196抗体，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实例中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，分别包含MPV196抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段基于MPV201抗体或源自MPV201抗体，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实例中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，分别包含MPV201抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段基于MPV314抗体或源自MPV314抗体，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实例中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，分别包含MPV314抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。在其他的实施方式中，抗体或抗原结合片段基于MPV364抗体或源自MPV364抗体，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实例中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，分别包含MPV364抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段基于MPV458抗体或源自MPV458抗体，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实例中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，分别包含MPV458抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段基于MPV465抗体或源自MPV465抗体，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实例中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，分别包含MPV465抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。在实施方式中，单克隆抗体结合包括66-87表位的表位，参见例如图9。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其包含与列为SEQ ID NO：1的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL，其包含与列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其独立地分别包括与列为SEQID NO：1和2的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其包含与列为SEQ ID NO：11的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL，其包含与列为SEQ ID NO：12的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其独立地分别包括与列为SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其包含与列为SEQ ID NO：21的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL，其包含与列为SEQ ID NO：22的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其独立地分别包括与列为SEQ ID NO：21和22的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其包含与列为SEQ ID NO：31的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL，其包含与列为SEQ ID NO：32的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其独立地分别包括与列为SEQ ID NO：31和32的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其包含与列为SEQ ID NO：49的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL，其包含与列为SEQ ID NO：50的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其独立地分别包括与列为SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其包含与列为SEQ ID NO：59的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL，其包含与列为SEQ ID NO：60的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸系列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL，其独立地分别包括与列为SEQ ID NO：59和60的氨基酸序列为至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：3、4和5的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：6、7和8的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：13、14和15的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在其他的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：23、24和25的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：26、27和28的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ IDNO：33、34和35的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：36、37和38的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：53、54和55的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：56、57和58的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在另外的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：63、64和65的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：66、67和68的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：3、4和5的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：6、7和8的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH包含与SEQ ID NO：1为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：1为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：2为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：2为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，且抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：13、14和15的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH包含与SEQ ID NO：11为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：11为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：12为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：12为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，且抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在其他的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：23、24和25的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：26、27和28的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH包含与SEQ ID NO：21为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：21为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：22为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：22为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，且抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ IDNO：33、34和35的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：36、37和38的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH包含与SEQ ID NO：31为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：31为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：32为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：32为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，且抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：53、54和55的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：56、57和58的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH包含与SEQ ID NO：49为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：49为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：50为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：50为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，且抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH，其分别包括列为SEQ ID NO：63、64和65的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含VL，其分别包括列为SEQ ID NO：66、67和68的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH包含与SEQ ID NO：59为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：59为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：60为至少90％相同，例如与SEQ ID NO：60为至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，且抗体或抗原结合片段特异性结合hMPV F蛋白并中和hMPV。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH(包含列为SEQ ID NO：1的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL(包含列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL(分别包括列为SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH(包含列为SEQ ID NO：11的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL(包含列为SEQ ID NO：12的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL(分别包括列为SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在其他的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH(包含列为SEQ ID NO：21的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL(包含列为SEQ ID NO：22的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL(分别包括列为SEQ ID NO：21和22的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH(包含列为SEQ ID NO：31的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL(包含列为SEQ ID NO：32的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL(分别包括列为SEQ ID NO：31和32的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH(包含列为SEQ ID NO：49的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL(包含列为SEQ ID NO：50的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL(分别包括列为SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH(包含列为SEQ ID NO：59的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在更多的实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VL(包含列为SEQ ID NO：60的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含VH和VL(分别包括列为SEQ ID NO：59和60的氨基酸序列)，并特异性结合hMPV F蛋白且中和hMPV。
在一些实施方式中，所公开的抗体抑制病毒复制。
1.结合MPV F蛋白上的MPV364表位的额外抗体
本文公开了MPV364靶向hMPV F蛋白上的抗原位点III，并与先前发现的mAbs MPE8和25P13竞争结合。然而，MPE8和25P13二者都与呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白发生交叉反应(参见Wen等人，Nat.Microbiol.2：1672(2017))。MPV364不与RSV F蛋白发生交叉反应。因此，MPV364的结合模式发生了变化。因此，在一些实施方式中，提供一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合由MPV364结合的hMPV F蛋白上的表位，其中抗体不与RSV F蛋白发生交叉反应。
此外，本文还公开了MPV458和MPV465靶向包含hMPV F的66-87螺旋的表位。hMPV F的66-87螺旋在融合前和融合后构象中结构保守，尽管该螺旋在三聚体融合后构象中暴露在外表面。螺旋的这种序列特性是高度保守的，因为A1和B2亚群之间的残基是相同的，除了Lys82/Arg82突变。
在一些实例中，结合所关注的表位的抗体可基于其与结合分析中提供的MPV364抗体的交叉竞争的(例如，以统计显著方式竞争性抑制其结合的)能力来识别。在其他实例中，结合所关注的表位的抗体可基于其与结合分析中提供的MPV458或MPV465抗体的交叉竞争的(例如，以统计显著方式竞争性抑制其结合的)能力来识别。
可使用任何合适的方法制备与MPV364抗体所结合的或MPV458/MPV465抗体所结合的hMPV F蛋白上的相同表位结合的人型抗体。这种抗体，例如，可通过向已被修饰的转基因动物施用免疫原以产生完整的人型抗体或具有人类可变区的完整抗体以响应抗原挑战来制备。这类动物通常包含全部或部分人类免疫球蛋白基因座，这些基因座取代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。对于从转基因动物中获得人型抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还请参见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，描述了XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，描述了技术；美国专利号7,041,870，描述了K-M技术，以及美国专利申请出版号US 2007/0061900，描述了技术)。可进一步修饰来自此类动物产生的完整抗体的人类可变区，例如通过与不同的人类恒定区结合。
也可以通过基于杂交瘤的方法制备与MPV364抗体所结合的或MPV458/MPV465抗体所结合的hMPV F蛋白上的相同表位结合的人型抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，单克隆抗体生产技术和应用，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人型抗体还见述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。另外的方法包括见述于例如，美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中的那些。人类杂交瘤技术(Trioma技术)还见述于Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，实验和临床药理学的方法和发现，27(3)：185-91(2005)。也可通过分离选自人源性噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列来产生人型抗体。这样的可变域序列随后可与期望的人恒定域组合。
也可以通过筛选具有所需结合特性的抗体组合库来分离特异性结合MPV364抗体所结合的hMPV F蛋白质上的相同表位或结合MPV458/MPV465抗体所结合的hMPV F蛋白质上的相同表位的抗体和抗原结合片段。例如，通过生成噬菌体展示库并筛选具有所需结合特性的抗体库。例如，这些方法Hoogenboom等人的《分子生物学方法》178：1-37中进行了综述(O'Brien等人，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2001)，并进一步见述于，例如McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol，222：581-597(1992)；Marks and Bradbury，《分子生物学方法》248：161-175(Lo,ed.,Human Press，Totowa，N.J.，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol，338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol，340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci，USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后，对抗原结合噬菌体进行筛选，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol，12：433-455(1994)中所述。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫来源的库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。作为选择，这些天然抗体库可以被克隆出来(例如，来自人类)，提供针对各种非自体和自体抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)中所述。最后，通过从干细胞中克隆未排列的V基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区域并在体外完成重排，也可以合成天然抗体库，如Hoogenboomand Winter，J.Mol.Biol，227：381-388(1992)所述。描述人型抗体噬菌体库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利出版物2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360号。
2.抗体和抗原结合片段的补充说明
抗体或抗原结合片段可以是人型抗体或其片段。还提供嵌合抗体。抗体或抗原结合片段可包括任何合适的框架区域，例如(但不限于)来自另一来源的人类框架区，或优化的框架区。作为选择，异源框架区，例如但不限于小鼠或猴子框架区，可包括在抗体的重链或轻链中。
抗体可以是任何同种型。抗体可以是，例如，IgM或IgG抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。特异性结合hMPV的一类抗体可以与另一类进行转换。在一个方面中，分离编码VL或VH的核酸分子，使其不包含任何分别编码轻链或重链恒定区的核酸序列。编码VL或VH的核酸分子然后操作性地连接到编码来自不同类别免疫球蛋白分子的CL或CH的核酸序列。这可以例如，通过使用包含CL或CH链的载体或核酸分子实现。例如，特异性结合PfCSP的抗体(最初为IgG)可为转换为IgM的类别。类转换可用于将一种IgG子类转换为另一种，例如，由IgG1转化为IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实例中，所公开的抗体是抗体的低聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等。
抗体或抗原结合片段可衍生或连接至另一分子(如另一肽或蛋白质)。通常，对抗体或抗原结合片段进行衍生化，使得与hMPV的结合不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体或抗原结合片段可以功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他分子实体，诸如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双特异抗体)、可检测标记、效应分子或可介导抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)联接的蛋白质或肽。
(a)结合亲和力
在几个实施方式中，抗体或抗原结合片段以不超过1.0×10-8M、不超过5.0×10- 8M、不超过1.0×10-9M、不超过5.0×10-9M、不超过1.0×10-10M、不超过5.0×10-10M、或不超过1.0×10-11M的亲和力(例如，通过KD测量)特异性结合hMPV F蛋白。KD可通过例如，使用所关注的抗体及其抗原的Fab版本执行的放射性标记抗原结合分析(RIA)来测量。在一项试验中，通过在未标记抗原的滴定系列的存在下使Fab与(125I)标记抗原的最低浓度平衡，然后用抗Fab抗体涂覆板捕获结合抗原，来测量Fab与抗原的溶液结合亲和力(参见，例如Chen等人，J.Mol.Biol.293(4)：865-881，1999)。为建立分析条件，多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中5μg/ml捕获性抗Fab抗体(Cappel Labs)涂覆过夜，然后在室温下用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭2至5小时(约23℃)。在非吸附板(NUNCTM Catalog#269620)中，100μM或26pM[125I]-抗原与所关注的Fab的系列稀释液(例如，与抗VEGF抗体Fab-12的评估一致，Presta等人，Cancer Res.57(20)：4593-4599，1997中)混合。然后将所关注的Fab孵化过夜；然而，孵育可能会持续更长的时间(例如，约65小时)，以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板，以便在室温孵育(例如，1小时)。然后移除溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20(吐温-)洗涤板八次。板干燥后，添加150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINTTM-20；PerkinEmler)，并使板在TOPCOUNTTMγ计数器(PerkinEmler)上计数10分钟。选择产生小于或等于最大结合20％的每个Fab的浓度用于竞争结合分析。
在另一种分析中，KD可使用表面等离子共振分析在25℃使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.,Piscataway，N.J)以约10个响应单位(RU)采用固定化抗原CM5芯片进行测量。简而言之，根据供应商的说明，使用N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，Inc.)。抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5l/min的流率注射，以获得约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应基团。对于动力学测量，将Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)在25℃以约25l/min的流率注入含有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。结合速率(kon)和解离速率(koff)通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software，3.2版)计算。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果结合速率通过上述表面等离子体共振分析测定为超过106M-1s-1，然后可通过使用荧光猝灭技术来测定结合速率，该技术在抗原浓度增加的情况下在25℃测量pH 7.2的PBS中20nm抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如在分光计中，诸如配有止流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌反应杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中所测量。
(b)多特异性抗体
在一些实施方式中，提供一种多特异性抗体，例如双特异性抗体，其包含如本文所提供的特异性结合hMPV的抗体或抗原结合片段或其抗原结合片段。可以使用任何合适的方法来设计和生产多特异性抗体，例如交联两种或更多种相同类型或不同类型的抗体、抗原结合片段(例如scFvs)。制备多特异性抗体的示例性方法包括PCT出版WO2013/163427号中所述的方法，通过引用将其全部并入本文。合适交联剂的非限制性实例包括具有异双官能团的交联剂，其具有由适当间隔基(例如m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯)或同双官能团(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)分隔的两个明显反应性基团。
多特异性抗体可具有任何合适形式，其允许通过如本文所提供的抗体或抗原结合片段与hMPV F蛋白结合。双特异性单链抗体可以由单个核酸分子编码。在美国专利号8,076,459、8,017,748、8,007,796、7,919,089、7,820,166、7,635,472、7,575,923、7,435,549、7,332,168、7,323,440、7,235,641、7,229,760、7,112,324、6,723,538中提供了双特异性单链抗体的非限制性实例以及构建此类抗体的方法。双特异性单链抗体的其他实例可在PCT申请号WO 99/54440；Mack等人，J.Immunol.,158(8)：3965-3970,1997；Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92(15)：7021-7025，1995；Kufer等人，CancerImmunol.Immunother.,45(3-4)：193-197，1997；等人，Blood,95(6)：2098-2103，2000；和Brühl等人，J.Immunol.,166(4)：2420-2426，2001中找到。双特异性Fab-scFv(“双抗体”)分子的生产见述于例如，Schoonjans等人，(J.Immunol.,165(12)：7050-7057，2000)和Willems等人，(J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed Life Sci.786(1-2)：161-176，2003)中。双特异性单链抗体的其他实例可在PCT申请号WO 99/54440中找到。对于双抗体，scFv分子可与VL-CL(L)或VH-CH1链之一融合，例如，为了产生双抗体，一个scFv可与Fab链的C-端融合。
(c)抗原结合片段
抗原结合片段涵盖在本公开中，例如包含重链和VL并特异性结合hMPV F蛋白的Fab、F(ab')2和Fv。这些抗体片段保留与抗原选择性结合的能力，是“抗原结合”片段。此类片段的非限制性实例包括：
(1)Fab(包含抗体分子单价抗原结合片段的片段)可通过木瓜蛋白酶消化整个抗体生产，以产生完整的轻链和一部分重链；
(2)Fab'(抗体分子的片段)可通过胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原得到，以产生完整的轻链和部分重链；
(3)(Fab')2，通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行后续还原而得到的抗体片段；F(ab')2是由两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，含有表达为两条链的VL和VL的基因工程片段；和
(5)单链抗体(如scFv)，定义为包含VH和VL的基因工程分子，通过合适的多肽连接物连接为基因融合的单链分子(参见，例如，Ahmad等人，Clin.Dev.Immunol.,2012，doi:10.1155/2012/980250；Marbry and Snavely，IDrugs，13(8)：543-549，2010)。scFv中VH域和VL域的分子内取向对于所提供的抗体(例如，对于所提供的多特异性抗体)不是决定性的。因此，可以使用具有两种可能排列的scFvs(VH-域连接域-VL-域；VL-域连接域-VH-域)。
(6)单链抗体(scFV2)的二聚体，定义为scFV的二聚体。这也被称为“微抗体”。
可以使用任何合适的方法来生产上述抗原结合片段。在Harlow and Lane，《抗体：实验室手册》，第2期，冷泉港实验室，纽约，2013中提供了非限制性实例。
抗原结合片段可通过抗体的蛋白水解或通过在宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)中表达编码该片段的DNA来制备。抗原结合片段也可以通过传统方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体获得。例如，抗原结合片段可通过胃蛋白酶对抗体进行酶切来生产，以提供表示F(ab')2的5S片段。该片段可使用硫醇还原剂进一步裂解，并任选地使用由二硫键裂解产生的巯基的阻断基团，以产生3.5S Fab'单价片段。
也可使用其他裂解抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段、进一裂解片段或其他酶、化学或遗传技术，只要片段与完整抗体识别的抗原结合。
(d)变体
在一些实施方式中，提供本文提供的抗体的氨基酸序列变体(例如MPV196、MPV201、MPV314或MPV364)。例如，可能希望提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。这些修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列中删除和/或插入和/或取代残基。只要最终的构建物具有所需的特征，例如抗原结合，则可以进行任何删除、插入和取代的组合以获得最终构建物。
在一些实施方式中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。替代突变的相关位点包括CDR和框架区。可将氨基酸取代引入所关注的抗体中，并针对所需活性筛选产物，例如，保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC。
变体通常保留VH和VL区域之间正确折叠和稳定所需的氨基酸残基，并保留残基的电荷特征，以保持分子的低pI和低毒性。可以在VH和VL区域内进行氨基酸取代以提高产率。
在一些实施方式中，与列为SEQ ID NO：1之一的氨基酸序列相比，抗体的重链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方式中，与列为SEQ ID NO：2之一的氨基酸序列相比，抗体的轻链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在更多的实施方式中，与列为SEQ ID NO：11之一的氨基酸序列相比，抗体的重链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方式中，与列为SEQ ID NO：12之一的氨基酸序列相比，抗体的轻链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在进一步的实施方式中，与列为SEQ ID NO：21之一的氨基酸序列相比，抗体的重链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方式中，与列为SEQ IDNO：22之一的氨基酸序列相比，抗体的轻链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在其他的实施方式中，与列为SEQ ID NO：31之一的氨基酸序列相比，抗体的重链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方式中，与列为SEQ ID NO：32之一的氨基酸序列相比，抗体的轻链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在更多的实施方式中，与列为SEQ ID NO：49之一的氨基酸序列相比，抗体的重链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方式中，与列为SEQ ID NO：50之一的氨基酸序列相比，抗体的轻链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在更多的实施方式中，与列为SEQ ID NO：59之一的氨基酸序列相比，抗体的重链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方式中，与列为SEQ ID NO：60之一的氨基酸序列相比，抗体的轻链包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在一些实施方式中，与已知框架区相比，或与MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465抗体的框架区相比，抗体或抗原结合片段可在抗体的重链、或抗体的轻链、或抗体的重链和轻链的框架区中包括多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)，并维持与hMPV F蛋白的特异性结合活性。
在一些实施方式中，取代、插入或删除可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可在CDR中进行不会显著降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守替换)。在上文提供的变体VH和VL序列的一些实施方式中，每个CDR或者未改变，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
为了增加抗体的结合亲和力，VL和VH片段可以在类似于体内体细胞突变过程的过程中随机突变，例如在HCDR3区域或LCDR3区域内，该过程在自然免疫应答期间导致抗体亲和力成熟。因此，体外亲和力成熟可以通过分别使用与HCDR3或LCDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区域来完成。在此过程中，引物由某些位置的四个核苷酸碱基的随机混合物“加标”，从而产生的PCR产物编码随机突变已引入VH和/或VL CDR3区域的VH和VL片段。可以测试这些随机突变的VH和VL片段，以确定对hMPV F蛋白的结合亲和力。在特定实例中，VH氨基酸序列为SEQ ID NO：1、11、21、31、49或59中的一个。在其他实例中，VL氨基酸序列为SEQ ID NO：2、12、22、32、50或60中的一个。
在一些实施方式中，改变抗体(例如MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465)或抗原结合片段以增加或减少抗体或抗原结合片段糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创建或移除一个或多个糖基化位点来方便地完成糖基化位点的添加或删除。
当抗体(例如MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465)包含Fc区域时，可改变连接于其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的二分支低聚糖，该低聚糖通常通过N-键连接到Fc区域CH2域的Asn297。参见，例如Wright等人，Trends Biotechnol.15(1)：26-32，1997。低聚糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在二分支低聚糖结构的“茎”中连接到GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方式中，可以对抗体中的低聚糖进行修饰，以产生具有某些改进性质的抗体变体。
在一个实施方式中，所提供的抗体变体具有缺少(直接或间接)连接于Fc区域的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，该抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过相对于Asn 297上连接所有糖结构(例如，复合、杂交和高甘露糖结构)的总和计算糖链内Asn297的岩藻糖的平均量来确定，由MALDI-TOF质谱法测量，例如WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指位于Fc区域中约297位的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294和300之间。这种岩藻糖基化变体可能改善ADCC功能。参见，例如美国专利出版号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.,336(5)：1239-1249，2004；Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol.Bioeng.87(5)：614-622，2004。能够产生去岩藻糖基化的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec 13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249(2)：533-545，1986；美国专利申请号US 2003/0157108和WO 2004/056312，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol.Bioeng.,87(5)：614-622，2004；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688，2006；以及WO2003/085107)。
抗体变体还提供有二分低聚糖，例如，与抗体的Fc区域连接的二分支低聚糖被GlcNAc一分为二。这种抗体变体可能降低岩藻糖基化和/或改善ADCC功能。这种抗体变体的实例可见述于，例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在连接到Fc区域的低聚糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这种抗体变体可能改善了CDC的功能。这种抗体变体见述于，例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中。
在几个实施方式中，抗体的恒定区(例如MPV196、MPV201、MPV314或MPV364)包括一个或多个氨基酸取代以优化抗体的体内半衰期。IgG-Abs的血清半衰期由新生儿Fc受体(FcRn)调节。因此，在几个实施方式中，抗体包含增加与FcRn结合的氨基酸取代。此类取代的非限制性实例包括在IgG恒定区T250Q和M428L处(参见，例如，Hinton等人，J Immunol.,176(1)：346-356，2006)；M428L和N434S处(“LS”突变，参见，例如，Zalevsky,等人，NatureBiotechnol.,28(2)：157-159，2010)；N434A处(参见，例如，Petkova等人，Int.Immunol.,18(12)：1759-1769，2006)；T307A、E380A和N434A处(参见，例如，Petkova等人，Int.Immunol.,18(12)：1759-1769，2006)；以及M252Y、S254T和T256E处的取代(参见，例如，Dall’Acqua等人，J.Biol.Chem.,281(33)：23514-23524，2006)。所公开的抗体和抗原结合片段可连接到或包含Fc多肽(包括上文所列任何取代)，例如，Fc多肽可包括M428L和N434S取代。
在一些实施方式中，抗体的恒定区包括一个或多个氨基酸取代以优化ADCC。ADCC主要通过一组密切相关的Fc受体介导。在一些实施方式中，抗体包含一个或多个增加与FcRIIIa结合的氨基酸取代。此类取代的非限制性实例包括在IgG恒定区S239D和I332E处(参见，例如，Lazar等人，Proc.Natl.,Acad.Sci.U.S.A.,103(11)：4005-4010,2006)；以及S239D、A330L和I332E处的取代(参见，例如，Lazar等人，Proc.Natl.,Acad.Sci.U.S.A.,103(11)：4005-4010，2006)。
还包括上述取代的组合，以产生与FcRn和FcRIIIa结合增强的IgG恒定区。组合增加了抗体半衰期和ADCC。例如，此类组合包括在Fc区具有以下氨基酸取代的抗体：(1)S239D/I332E和T250Q/M428L；(2)S239D/I332E和M428L/N434S；(3)S239D/I332E和N434A；(4)S239D/I332E和T307A/E380A/N434A；(5)S239D/I332E和M252Y/S254T/T256E；(6)S239D/A330L/I332E和250Q/M428L；(7)S239D/A330L/I332E和M428L/N434S；(8)S239D/A330L/I332E和N434A；(9)S239D/A330L/I332E和T307A/E380A/N434A；或(10)S239D/A330L/I332E和M252Y/S254T/T256E。在一些实例中，抗体或其抗原结合片段经修饰以使其对感染细胞直接具有细胞毒性，或使用自然防御诸如补体、ADCC或巨噬细胞吞噬。
在一些实施方式中，本文提供的抗体可进一步修饰以包含额外的非蛋白部分。适于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基甲酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于聚乙二醇丙醛在水中的稳定性，在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支的或不分支的。连接到抗体的聚合物的数目可能不同，如果连接多个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于以下考虑因素确定，这些因素包括但不限于待改进抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在规定条件下用于应用等。
B.结合物
如本文所公开的特异性结合hMPV F蛋白的抗体和抗原结合片段可与试剂，例如效应分子或可检测标记结合。可以使用共价和非共价两种连接方式。可以使用各种效应分子和可检测标记，包括(但不限于)毒素和放射性试剂，例如125I、32P、14C、3H和35S以及其他标签、目标部分和配体等。特定效应分子或可检测标记的选择取决于特定目标分子或细胞以及所需的生物效应。
使效应分子或可检测标记与抗体或抗原结合片段连接的程序根据效应物的化学结构而变化。多肽通常包含各种官能团，例如羧基(-COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，它们可用于与多肽上的适当官能团反应，从而导致效应分子或可检测标记的结合。作为选择，抗体或抗原结合片段衍生以暴露或连接额外的反应性官能团。衍生化可能涉及任何合适的连接分子的连接。连接物能够与抗体或抗原结合片段以及效应分子或可检测标记二者形成共价键。合适的连接器包括但不限于直链或支链的碳连接物、杂环碳连接物或肽连接物。如果抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标记是多肽，则连接物可通过其侧链(例如通过与半胱氨酸的二硫键)或α-碳，或通过末端氨基酸的氨基和/或羧基连接到成分氨基酸。
鉴于已报告的将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、标签(如酶或荧光分子)、毒素和其他试剂连接至抗体的大量方法，可以确定将给定试剂连接至抗体或抗原结合片段或其他多肽的合适方法。
抗体或抗原结合片段可与可检测标记结合；例如，能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(如CT、计算机轴向断层扫描(CAT)、MRI、磁共振断层扫描(MTR)、超声波、纤维光学检查和腹腔镜检查)进行检测的可检测标记。可检测标记的具体、非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶连接物、放射性同位素和重金属或化合物(例如，通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。生物发光标记也有用途，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可与可用于检测的酶结合，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶结合时，可通过添加酶使用的其他试剂产生可识别的反应产物来检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺会产生有色反应产物，其可目视检测。抗体或抗原结合片段也可与生物素结合，并通过间接测量抗生物素或链霉亲和素结合来检测。应注意的是，抗生物素本身可以与酶或荧光标记结合。
抗体或抗原结合片段可与顺磁剂(例如钆)结合。顺磁剂如超顺磁性氧化铁也可用作标签。抗体也可以与镧系元素(如铕和镝)和锰结合。抗体或抗原结合片段也可以用第二报告者识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合域、表位标签)标记。
抗体或抗原结合片段也可与放射性标记的氨基酸结合，例如，用于诊断目的。例如，放射性标签可用于通过放射线照相术、发射光谱或其他诊断技术检测hMPV。多肽标签的实例包括但不限于以下放射性同位素：3H、14C、35S、90Y、99mTc、111In、125I、131I。放射性标记可以例如，使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记可使用光电探测器检测，以检测发射照明。酶标签通常通过向酶提供底物并检测酶在底物上的作用产生的反应产物来检测，而比色标签则通过简单目测彩色标签来检测。
结合物中每个抗体或抗原结合片段的效应分子或可检测标记部分的平均数目可以在以下范围内，例如，每个抗体或抗原结合片段1到20个部分。在一些实施方式中，结合物中每个抗体或抗原结合片段的效应分子或可检测标记部分的平均数目在约1到约2、约1到约3、约1到约8的范围内；约2到约6；约3到约5；或者约3到约4。结合物的负载(例如，效应分子/抗体比率)可通过不同的方式进行控制，例如，通过：(i)限制效应分子-连接物中间体或连接物试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制结合反应时间或温度，(iii)半胱氨酸巯基修饰的部分或限制还原条件，(iv)通过重组技术改造抗体的氨基酸序列，从而修改半胱氨酸残基的数目和位置，以控制连接物-效应分子接合物的数目或位置。
C.多核苷酸和表达
提供了编码特异性结合hMPV的抗体、抗原结合片段和结合物的氨基酸序列的核酸分子(例如，cDNA或RNA分子)，如本文中所公开。编码这些分子的核酸可以使用本文提供的氨基酸序列(例如CDR序列以及VH和VL序列)、本领域可用的序列(例如框架或恒定区序列)和遗传代码容易地产生。在几个实施方式中，核酸分子可编码所公开抗体或抗原结合片段的VH、VL或VH和VL二者(例如在双顺反子表达载体中)。在一些实施方式中，核酸分子编码scFv。在几个实施方式中，核酸分子可在宿主细胞(例如哺乳动物细胞)中表达以产生所公开的抗体或抗原结合片段。
遗传代码可用于构建各种功能上等效的核酸序列，例如序列不同但编码相同抗体序列，或编码包括VL和/或VH核酸序列的结合物或融合蛋白的核酸。
在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV196抗体或抗原结合片段的VH，并包含列为SEQ ID NO：3的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV196抗体或抗原结合片段的VL，并包含列为SEQ ID NO：4的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子分别编码MPV196抗体或其抗原结合片段的VH和VL，并包含列为SEQ ID NO：3和4中任一项的核酸序列。
在另一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV201抗体或抗原结合片段的VH，并包含列为SEQ ID NO：13的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV201抗体或抗原结合片段的VL，并包含列为SEQ ID NO：14的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子分别编码MPV201抗体或其抗原结合片段的VH和VL，并包含列为SEQ ID NO：13和14中任一项的核酸序列。
在另一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV314抗体或抗原结合片段的VH，并包含列为SEQ ID NO：23的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV314抗体或抗原结合片段的VL，并包含列为SEQ ID NO：24的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子分别编码MPV314抗体或其抗原结合片段的VH和VL，并包含列为SEQ ID NO：23和24中任一项的核酸序列。
在又一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV364抗体或抗原结合片段的VH，并包含列为SEQ ID NO：33的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV364抗体或抗原结合片段的VL，并包含列为SEQ ID NO：34的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子分别编码MPV364抗体或其抗原结合片段的VH和VL，并包含列为SEQ ID NO：33和34中任一项的核酸序列。
在另一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV458抗体或抗原结合片段的VH，并包含列为SEQ ID NO：51的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV458抗体或抗原结合片段的VL，并包含列为SEQ ID NO：52的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子分别编码MPV458抗体或其抗原结合片段的VH和VL，并包含列为SEQ ID NO：51和52中任一项的核酸序列。
在又一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV465抗体或抗原结合片段的VH，并包含列为SEQ ID NO：61的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子编码MPV465抗体或抗原结合片段的VL，并包含列为SEQ ID NO：62的核酸序列。在非限制性实例中，分离的核酸分子分别编码MPV465抗体或其抗原结合片段的VH和VL，并包含列为SEQ ID NO：61和62中任一项的核酸序列。
编码特异性结合hMPV F蛋白的抗体、抗原结合片段和结合物的核酸分子可通过任何合适的方法制备，包括，例如，进行适当序列的克隆或通过标准方法直接化学合成。化学合成产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交或以单链为模板与DNA聚合酶聚合，可将其转化为双链DNA。
示例性核酸可通过克隆技术制备。适当的克隆和测序技术的实例可以在例如，Green and Sambrook(分子克隆：实验室手册，第四版，纽约：冷泉港实验室出版社，2012)和Ausubel等人，(Eds.)(目前的分子生物学协议，纽约：John Wiley和Sons，包括补充)中找到。
核酸也可以通过扩增方法制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)和自维持序列复制系统(3SR)。
核酸分子可以在重组工程细胞中表达，如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。抗体、抗原结合片段和结合物可表达为包含VH和/或VL(根据需要连接到效应分子或可检测标记)的单个蛋白质，或可表达为融合蛋白。可使用表达和纯化抗体和抗原结合片段的任何合适方法；在Al Rubeai(Ed.)，《抗体表达与生产》，Dordrecht；纽约：Springer，2011)中提供了非限制性实例。也可以表达免疫粘附素。因此，在一些实例中，提供编码VH和VL的核酸以及免疫粘附素。核酸序列可任选地编码前导序列。
为创建scFv，编码VH和VL的DNA片段可以操作性地连接至编码柔性连接物的另一片段，例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中VL和VH域由柔性连接物连接(参见，例如，Bird等人，Science,242(4877)：423-426，1988；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85(16)：5879-5883，1988；McCafferty等人，Nature,348:552-554，1990；Kontermann and Dübel(Eds.)，抗体工程，第1-2卷，第二版，Springer Verlag，2010；Greenfield(Ed.)，《抗体：实验室手册》，第二版，纽约：冷泉港实验室出版社，2014)。任选地，裂解位点可包括在连接物中，例如furin裂解位点。
如果仅使用单个VH和VL，则单链抗体可以是单价的；如果使用两个VH和VL，则单链抗体可以是二价的；如果使用两个以上的VH和VL，则单链抗体可以是多价的。可产生特异性结合hMPV F蛋白和另一抗原的双特异性或多价抗体。编码的VH和VL任选地包括VH和VL域之间的furin裂解位点。
编码抗体、抗原结合片段或结合物的一个或多个DNA序列可通过DNA转移到合适的宿主细胞中在体外表达。细胞可以是原核细胞或真核细胞。可用于表达蛋白质的多种表达系统，包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系，可用于表达所公开的抗体和抗原结合片段。可以使用稳定转移的方法，即外源DNA在宿主体内持续保持。表达所关注的抗体的杂交瘤也包含在本公开中。
编码本文所述抗体和抗原结合片段的核酸的表达可通过将DNA或cDNA可操作地连接至启动子(其为组成型或可诱导型)然后并入表达盒来实现。启动子可以是任何所关注的启动子，包括巨细胞病毒启动子。任选地，增强子，例如巨细胞病毒增强子，包含在构建物中。盒可适用于原核生物或真核生物的复制和整合。典型的表达盒包含用于调节编码蛋白质的DNA表达的特定序列。例如，表达盒可包含适当的启动子、增强子、转录和翻译终止子、起始序列、蛋白质编码基因前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、用于维持该基因的正确阅读框以允许正确翻译mRNA的序列和停止密码子。载体可编码可选标记，例如编码耐药性的标记(例如，氨苄西林或四环素耐药性)。
为了获得克隆基因的高水平表达，需要构建包含，例如，引导转录的强启动子、翻译起始的核糖体结合位点(例如内部核糖体结合序列)和转录/翻译终止子。对于大肠杆菌，可包含诸如T7、trp、lac或λ启动子的启动子、核糖体结合位点，以及优选转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可包含源自以下物质的启动子和/或增强子：例如，免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒，以及多聚腺苷酸化序列，并且还可进一步包含剪接供体和/或受体序列(例如，CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。盒可通过任何合适的方法转移到所选宿主细胞中，例如大肠杆菌的转化或电穿孔以及哺乳动物细胞的磷酸钙处理、电穿孔或脂质体感染。通过盒中包含的基因(如amp、gpt、neo和hyg基因)所赋予的抗生素耐药性，可以选择通过盒转化的细胞。
可以对编码本文所述多肽的核酸进行修饰而不降低其生物活性。可以进行一些修饰以促进将靶向分子克隆、表达或并入融合蛋白中。这些修改包括，例如，终止密码子、用于创建方便定位的限制性位点的序列、以及用于在氨基末端添加蛋氨酸以提供起始位点的序列、或用于辅助纯化步骤的附加氨基酸(例如聚-His)。
一旦表达，抗体、抗原结合片段和结合物可根据本领域的标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱等(通常参见，Simpson等人，(Eds.)，《蛋白质纯化和分析的基本方法：实验室手册》，纽约：冷泉港实验室出版社，2009)。抗体、抗原结合片段和结合物不需要100％纯。一旦纯化，根据需要部分或同质化，如果预防性使用，多肽应基本上不含内毒素。
已经描述了用于从哺乳动物细胞和细菌(例如大肠杆菌)表达抗体、抗原结合片段和结合物和/或重新折叠成适当活性形式的方法，并且适用于本文公开的抗体。参见，例如，Greenfield(Ed.)，《抗体：实验室手册》，第二版，纽约：冷泉港实验室出版社，2014；Simpson等人，(Eds.)，《蛋白质纯化和分析的基本方法：实验室手册》，纽约：冷泉港实验室出版社，2009；以及Ward等人，Nature 341(6242)：544-546，1989。
D.方法和组合物
1.抑制hMPV感染
本文公开了用于抑制受试者hMPV感染的方法。该方法包括向受试者施用有效量(即，有效抑制受试者hMPV感染的量)的公开的抗体、抗原结合片段、结合物或编码这种抗体、抗原结合片段或结合物的核酸，施用给有hMPV感染风险或有hMPV感染的受试者。这些方法可在暴露前使用或在暴露后使用。
对于有效的方法来说，hMPV感染不需要完全消除或抑制。例如，与未经治疗的hMPV感染相比，该方法可将hMPV感染降低所需量，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％(消除或预防可检测的hMPV感染)。在一些实施方式中，受试者也可使用有效量的其他试剂，例如抗病毒试剂进行治疗。
在一些实施方式中，施用有效量的所公开的抗体、抗原结合片段、结合物或核酸分子可抑制受试者中hMPV感染的建立和/或随后的疾病进展，这可包括hMPV活性的任何统计学显著降低(例如，生长或侵袭)或受试者的hMPV感染症状。
本文公开了用于抑制受试者hMPV复制的方法。方法包括向受试者施用有效量(即，有效抑制受试者hMPV复制的量)的所公开的抗体、抗原结合片段、结合物或编码这种抗体、抗原结合片段或结合物的核酸，施用给有hMPV感染风险或有hMPV感染的受试者。这些方法可在暴露前使用或在暴露后使用。
公开了治疗受试者hMPV感染的方法。还公开了用于预防受试者的hMPV感染的方法。这些方法包括施用一种或多种hMPV F蛋白质特异性抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物或编码此类分子的核酸分子，或包括此类分子的组合物，如本文所公开。
抗体及其抗原结合片段可通过静脉输注施用。抗体或抗原结合片段的剂量不同，但通常在约0.5mg/kg至约50mg/kg之间，例如约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg的剂量。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段的剂量可为约0.5mg/kg至约5mg/kg，例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg的剂量。抗体或抗原结合片段根据开业医生确定的给药计划施用。在一些实例中，每周、每两周、每三周或每四周施用抗体或抗原结合片段。
在一些实施方式中，抑制受试者hMPV感染的方法还包括向受试者施用一种或多种附加试剂。其他所关注的试剂包括但不限于抗病毒试剂。
在一些实施方式中，方法包括施用如本文所公开的特异性结合hMPV F蛋白的一抗和也特异性结合hMPV F蛋白的二抗，例如hMPV F蛋白的不同表位。在一些实施方式中，一抗是MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465中的一种。在进一步的实施方式中，二抗是DDS7或MPE8。在更多的实施方式中，一抗是MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465中的一种，二抗是MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465中的另一种。可向受试者施用有效量的MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458和/或MPV465中的一种、两种、三种或四种、五种或六种。
在一些实施方式中，向受试者施用编码所公开抗体的DNA或RNA以提供体内抗体产生，例如使用受试者的细胞机器。可以使用任何合适的核酸施用方法；在美国专利号5,643,578、美国专利号5,593,972和美国专利号5,817,637中提供了非限制性实例。美国专利号5,880,103描述了几种将编码蛋白质的核酸输送至生物体的方法。施用核酸的一种方法是以质粒DNA直接施用，如以哺乳动物表达质粒。编码所公开的抗体的核苷酸序列或其抗原结合片段可置于启动子的控制下以增加表达。方法包括核酸的脂质体递送。此类方法可应用于抗体或其抗原结合片段的生产。在一些实施方式中，使用pVRC8400载体在受试者中表达所公开的抗体或抗原结合片段(见述于Barouch等人，J.Virol.,79(14)，8828-8834，2005，通过引用将其并入本文)。
在几个实施方式中，可向受试者(例如具有hMPV感染风险或具有hMPV感染的人类受试者)施用有效量的AAV病毒载体，该AAV病毒载体包含一种或多种编码所公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子。AAV病毒载体设计用于表达编码公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子，并且将有效量的AAV病毒载体施用受试者导致在受试者中表达有效量的抗体或抗原结合片段。可用于在受试者中表达所公开的抗体或抗原结合片段的AAV病毒载体的非限制性实例包括Johnson等人，Nat.Med.，15(8)：901-906，2009和Gardner等人，Nature，519(7541)：87-91，2015中提供的那些，其中每一个通过引用全部并入本文。
在一个实施方式中，将编码所公开的抗体的核酸或其抗原结合片段直接引入组织中。例如，核酸可以通过标准方法装载到金微球上，并通过Bio-Rad的HELIOS基因枪等设备导入皮肤。核酸可以是“裸的”，由强启动子控制的质粒组成。
通常，DNA被注射到肌肉中，但也可以直接注射到其他部位。注射剂量通常为约0.5g/kg至约50mg/kg，通常为约0.005mg/kg至约5mg/kg(参见，例如，美国专利号5,589,466)。
根据所需的且患者耐受的剂量和频率，可单次或多次施用包含所公开的hMPV F蛋白特异性抗体、抗原结合片段、结合物或编码此类分子的核酸分子的组合物。剂量可一次性施用，但可定期施用，直到达到预期效果或副作用导致停止治疗。通常，剂量足以抑制hMPV感染，而不会对患者产生不可接受的毒性。
从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于制定用于人类的剂量范围。剂量通常在包括ED50的循环浓度范围内，几乎没有毒性或毒性很小。根据使用的剂型和使用的施用途径，剂量可在此范围内变化。有效剂量可通过细胞培养试验和动物研究确定。
hMPV F蛋白特异性抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物或编码此类分子的核酸分子、或包含此类分子的组合物可通过各种方式对受试者施用，包括局部和全身施用，例如通过皮下注射、静脉注射、动脉内、腹腔内、肌肉内、皮内或鞘内。在一个实施方式中，抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物或编码此类分子的核酸分子、或包含此类分子的组合物，通过单次皮下、静脉注射、动脉内、腹腔内、肌肉内、皮内或鞘内每天施用一次。抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物或编码此类分子的核酸分子、或包含此类分子的组合物，也可通过在疾病部位或其附近直接注射施用。另一种施用方法是通过渗透泵(例如，Alzet泵)或微型泵(例如，Alzet微型渗透泵)，其允许在预定的时期内控制、连续和/或缓释递送抗体、抗原结合片段、结合物或编码此类分子的核酸分子、或包含此类分子的组合物。渗透泵或微型泵可植入皮下，或靠近目标部位。
2.组合物
提供了包含药学上可接受的载体中的一种或多种本文中公开的hMPV F蛋白特异性抗体、抗原结合片段、结合物或编码此类分子的核酸分子的组合物。在一些实施方式中，组合物包含本文公开的MPV196、MPV201、MPV314、MPV364、MPV458或MPV465抗体，或其抗原结合片段。在一些实施方式中，组合物包含两种、三种、四种或更多种特异性结合hMPV F蛋白的抗体。组合物可用于，例如，抑制或检测hMPV感染。组合物可以以单位剂型制备以施用给受试者。施用的量和时间由给药医生自行决定，以达到预期目的。可配制用于全身或局部施用的抗体、抗原结合片段、结合物或编码此类分子的核酸分子。在一个实例中，抗原结合片段、结合物或编码该分子的核酸分子被配制用于肠外施用，例如静脉施用。
在一些实施方式中，组合物中的抗体、抗原结合片段或其结合物为至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)的纯度。在一些实施方式中，组合物含有小于10％(例如小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％或甚至更少)的大分子污染物，例如其他哺乳动物(例如，人类)蛋白质。
用于施用的组合物可包含溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中的抗体、抗原结合片段、结合物或编码此类分子的核酸分子的溶液。可以使用多种水性载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，且通常不含有害物质。这些组合物可通过任何合适的技术进行灭菌。组合物可根据需要包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的抗体浓度可以变化很大，并且将根据所选择的特定施用方式和受试者的需要，主要基于液体体积、粘度、体重等进行选择。
用于静脉施用的典型组合物包含每个受试者每天约0.01至约30mg/kg的抗体或抗原结合片段或结合物(或含抗体或抗原结合片段的结合物的相应剂量)。可使用任何合适的方法来制备可施用组合物；在如《雷明顿：药学科学与实践》，第22版，英国伦敦：药学出版社，2013这样的出版物中提供了非限制性实例。在一些实施方式中，组合物可以是包含一种或多种抗体、抗原结合片段(例如特异性结合PfCSP的抗体或抗原结合片段)的液体制剂，其浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml、或约0.5mg/ml至约20mg/ml、或约1mg/ml至约20mg/ml、或约0.1mg/ml至约10mg/ml、或约0.5mg/ml至约10mg/ml、或约1mg/ml至约10mg/ml。
抗体或其抗原结合片段或结合物或编码此类分子的核酸可以以冻干形式提供，并在施用前用无菌水再水化，尽管它们也以已知浓度的无菌溶液提供。然后可将抗体溶液或抗原结合片段或编码此类抗体或抗原结合片段的核酸添加到含有0.9％氯化钠(USP)的输液袋中，并且通常以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。自1997年利妥昔单抗获得批准以来，在本领域已在美国上市的抗体药物的管理方面有相当丰富的经验。抗体、抗原结合片段、结合物或编码这些分子的核酸可以通过缓慢输注而不是静脉推注或团注的方式施用。在一个实例中，施用较高的负荷剂量，随后施用较低水平的维持剂量。例如，可在约90分钟的时间内注入4mg/kg的初始负荷剂量，然后在30分钟的时间内注入每周2mg/kg的维持剂量，持续4-8周，前提是之前的剂量耐受性良好。
控释肠外制剂可制成植入物、油性注射剂或微粒系统。关于蛋白质输送系统的广泛概述，请参见Banga，《治疗性肽和蛋白质：配制、加工和输送系统》，宾夕法尼亚州兰开斯特：技术出版公司，1995。微粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微囊含有活性蛋白剂，如细胞毒素或药物，作为中心核心。在微球中，活性蛋白试剂分散在整个颗粒中。小于约1m的颗粒、微球和微胶囊通常分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径约为5m，因此只有纳米颗粒通过静脉注射。微粒通常直径约100m，通过皮下或肌肉注射施用。参见，例如，Kreuter，胶体给药系统，J.Kreuter(Ed.)，纽约，NY：MarcelDekker，Inc.，第219-342页，1994；和Tice and Tabibi，关于控制药物传递的论文：基础，优化，应用，A.Kydonieus(Ed.)，纽约，NY：Marcel Dekker,Inc.，第315-339页，1992。
聚合物可用于本文公开的抗体组合物的离子控制释放。可使用任何合适的聚合物，例如设计用于受控药物递送的可降解或不可降解聚合物基质。作为选择，羟基磷灰石已用作蛋白质控释的微载体。在另一方面中，脂质体用于脂质胶囊药物的控制释放以及药物靶向。
2.检测和诊断方法
还提供了在体外或体内检测hMPV F蛋白存在的方法。在一个实例中，在受试者的生物样品中检测hMPV F蛋白的存在，并可用于识别hMPV感染的受试者。样品可以是任何样品，包括但不限于活检、尸检和病理标本的组织。生物样品还包括组织切片，例如，用于组织学目的的冰冻切片。生物样品还包括体液，如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿液。检测方法可包括在足以形成免疫复合物的条件下，将细胞或样品与特异性结合hMPV F蛋白的抗体或抗原结合片段或其结合物(例如，包含可检测标记的结合物)接触，并检测免疫复合物(例如，通过检测与抗体或抗原结合片段结合的可检测标记)。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段用可检测标记直接标记。在另一实施方式中，结合hMPV F蛋白的抗体(一抗)未标记，二抗或可结合一抗的其他分子用于检测。选择能够特异性结合一抗的特定种类和类别的二抗。例如，如果一抗是人IgG，则二抗可以是抗人IgG。其他可以与抗体结合的分子包括但不限于蛋白质A和蛋白质G，这两种都可以在市场上买到。抗体、抗原结合片段或二级抗体的合适标签是已知的并如上所述，并且包括各种酶、人工基团、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射性材料。
在一些实施方式中，所公开的抗体或其抗原结合片段用于测试疫苗。例如，测试包含hMPV F蛋白或其片段的疫苗组合物是否呈现包含所公开的抗体表位的融合前构象。因此，本文提供了一种测试疫苗的方法，其中该方法包括在足以形成免疫复合物的条件下，将含有疫苗的样品(例如hMPV F蛋白免疫原)与所公开的抗体或抗原结合片段接触，并检测免疫复合物，以检测样品中包含所关注的表位的疫苗。在一个实例中，对样品中免疫复合物的检测表明，疫苗成分，如hMPV F蛋白免疫原，呈现能够结合抗体或抗原结合片段的构象。
实施例
hMPV基因组由大约13,000个核苷酸组成，其中8个基因编码9种蛋白质，其中3种是表面糖蛋白—小疏水(SH)、附着(G)蛋白和融合(F)蛋白。hMPV F蛋白是响应hMPV的中和抗体的唯一靶点(Ulbrandt等人，2008，J Gen Virol 89：3113-3118)。这与RSV形成对比，RSVG和RSV F蛋白二者都能诱导中和抗体(Tripp等人，2017，J Virol 92：1-8)。RSV/hMPV F蛋白也显示出A和B病毒基因型之间的高度保守性，这是开发广泛反应性疫苗和疗法的关键优势(Van Den Hoogen等人，2004，Emerg Infect Dis 10：658-666)。RSV和hMPV F蛋白介导病毒和宿主细胞膜之间的膜融合，然而，RSV和hMPV膜融合的确切机制尚未确定。与RSV相似，hMPV可以在没有hMPV G蛋白的情况下在体外介导感染，尽管这种病毒在体内是减毒的(Skiadopoulos等人，2004，J Virol 78：12877-12887)。hMPV F蛋白具有假定为与α5β1整合素相互作用的RGD基序(Cox等人，2012，J Virol 86：12148-12160)，硫酸肝素也显示出在hMPV F蛋白介导的附着中起作用attachment(Chang等人，2012，J Virol 86：3230-3243)。
hMPV F蛋白是一种三聚体I类病毒融合蛋白，其最初作为前体单体(F0)合成，该单体在蛋白水解裂解成亚稳态融合前构象后均质三聚。已确定hMPV F蛋白的两种构象的晶体结构(Battles等人，2017，Nat Commun 8：1528；Más等人，2016，PLoS Pathog 12：e1005859)。hMPV融合前和融合后F蛋白已被证明能诱导类似的抗体反应(Battles等人，2017，Nat Commun 8:1528)，与RSV F蛋白(McLellan等人，2013，Science 340：1113-1117)以及相关的副流感病毒F蛋白不同(Stewart-Jones等人，2018，PNAS https://doi.org/10.1073/pnas.1811980115)，其中融合前诱导的抗体更丰富，并具有有效的中和作用。重要的是，hMPV F蛋白被不同于RSV F的细胞内酶切割(Schowalter等人，2006，J Virol 80：10931-10941)，在一些菌株中，需要低pH来激活融合机制(Schowalter等人，2006，J Virol80：10931-10941)。hMPV可以在细胞膜或内体膜上与宿主细胞融合，而不是像RSV那样仅在细胞膜上(Cox等人，2015，PLoS Pathog 11：e1005303)。
hMPV F蛋白中的中和区已通过使用源自亚美尼亚仓鼠和BALB/c小鼠(Ulbrandt等人，2006，J Virol 80:7799-7806)免疫的mAbs产生抗mAb突变来确定(Ulbrandt等人，2008，J Gen Virol 89：3113-3118)。来自噬菌体展示文库的人mAb已被发现(Williams等人，2007，J Virol 81：8315-8324)，并与融合前hMPV F的片段共结晶(Wen等人，2012，NatStruc Mol Biol 19：461-463)。由于RSV F和hMPV F蛋白具有约30％的序列同源性，因此产生中和这两种病毒的mAbs也就不足为奇了。mAb 54G10在RSV F蛋白的抗原位点IV附近结合，并在体内降低hMPV和RSV的肺滴度(Schuster等人，2014，J Infect Dis 211：1-34)。与RSV F蛋白的复合物中的MPE8的晶体结构(Corti等人，2013，Nature 501：439-43)已被确定，并具有与mAb 25P13相似的结合谱(Wen等人，2017，Nat Microbiol 2：16272)。另一种分离的人mAb是17E10，其靶向抗原位点IV，具有促进RSV和hMPV F蛋白之间交叉反应的结合姿势(Mousa等人，2018，PLoS Pathog 14：e1006837)。虽然已经分离出靶向hMPV F蛋白的几个小鼠mAbs和一些人mAbs，但hMPV F蛋白上的主要抗原位点和诱导的抗体尚不清楚。四种新的中和人mAbs被分离至hMPV F蛋白。
实施例1
HEK293F细胞中重组hMPV F蛋白的分析
与RSV F蛋白类似，hMPV F蛋白被翻译为单链蛋白(F0)，在运输到细胞膜之前，被裂解成两个片段(F1和F2)并通过二硫键连接。当RSV F蛋白被furin在两个位置裂解以释放一个小的蛋白质片段时，hMPV F蛋白包含一个被尚未确定的细胞内蛋白酶裂解的裂解位点(Schowalter等人，2006，J Virol 80：10931-10941)。hMPV F蛋白可在体外被胰蛋白酶裂解，胰蛋白酶已用于病毒生长和中和试验。报道了结合中和的mAb DS7的融合前构象中的单体hMPV F蛋白的部分片段(Wen等人，2012，Nat Struc Mol Biol 19：461-463)。最近，已经报道了在CV-1细胞中重组表达的融合前(MPV 115-BV)(Battles等人，2017，Nat Commun 8:1528)和融合后(MPV F FurinΔFP)(Wen等人，2012，Nat Struc Mol Biol 19：461-463)hMPV F蛋白外结构域二者的X射线晶体结构。在这两种蛋白构建物中，hMPV F蛋白裂解位点均被RSV F蛋白的furin裂解位点取代。对于融合后hMPV F蛋白晶体结构，三聚化域的添加促进了蛋白质三聚化，并且与furin的共表达进一步增强了融合后构象中蛋白质的均一性。对于抗体分离，在HEK293F细胞中表达hMPV F蛋白的四个亚组，构建物包含三聚化域，并且如先前针对融合后hMPV F蛋白所述，裂解位点由来自RSV F蛋白的furin裂解位点替换(Más等人，2016，PLoS Pathog 12：e1005859)。所有四种蛋白质在HEK293F细胞中均表达良好，表达量为至少1mg蛋白质/L培养体积。尽管这些蛋白质确实包含三聚化域和furin裂解位点，其适合于HEK293F细胞中RSV F蛋白的裂解和三聚化(McLellan等人，2011，J Virol 85：7788-7796)，但通过尺寸排除色谱法纯化和分析后观察到单体蛋白质(图1A)。这与CV-1细胞中的表达相反，在没有共表达furin的情况下，具有三聚化域的hMPV F蛋白的表达促进了蛋白质三聚化(Más等人，2016，PLoS Pathog 12：e1005859)。由于大多数抗原位点可能位于hMPV F蛋白的每个单体上，因此该蛋白用于随后的抗体分离和结合研究。为了获得三聚体hMPV F蛋白，采用了先前描述的方法(Más等人，2016，PLoS Pathog 12：e1005859)，使蛋白质与胰蛋白酶一起孵育以诱导裂解和随后的三聚化。事实上，在胰蛋白酶裂解后，观察到尺寸排除曲线的变化，表明蛋白质已三聚(图1A)。负染色电子显微镜进一步分析揭示了类似hMPV F蛋白融合后构象的同质群体(图1B)。
实施例2
分离人mAbs
以前的报告描述了在人类血清中发现的大多数抗体结合融合前和融合后hMPV F蛋白二者(Battles等人，2017，Nat Commun 8：1528)。这与那些结合RSV F蛋白的抗体形成对比，其中血清中抗体的优势是融合前特异性的(Ngwuta等人，2015，Sci Transl Med 7：309ra162)。为了扩大响应hMPV F蛋白的人型抗体的知识，分离了四种靶向hMPV F蛋白的新的人类mAbs。大多数人在5岁时对hMPV呈血清阳性(Edwards等人，2013，N Engl J Med 368：633-643)，因此，招募健康献血者进行抽血和随后的mAb分离。从19岁女性观察到高频率的hMPV F特异性B细胞，该供体的细胞用于随后的mAb分离实验(图1C)。从产生hMPV F蛋白反应性抗体的培养物中提取的B细胞用于产生稳定的杂交瘤细胞系(Mousa等人，2016，PNAS113：E6849-E6858)。杂交瘤群通过单细胞流式细胞术分选进行生物学克隆，并在无血清培养基中生长以纯化抗体之前逐步扩增。分离出四种新的mAbs，即MPV196、MPV201、MPV314和MPV364，并对每种mAbs进行了同种型分析。所有四种抗体均为IgG1亚型。mAbs MPV201和MPV314包含κ轻链，而mAbs MPV364和MPV196利用λ轻链。
实施例3
hMPV F特异性人mAbs的结合和中和特性
先前分离的hMPV F蛋白的小鼠mAbs显示出中和病毒并防止病毒在体内复制，然而，大多数mAbs没有跨亚组中和(Ulbrandt等人，2006，J Virol 80：7799-7806)。相反，分离出的能中和RSV和hMPV二者的有限数目的人mAbs在hMPV亚群中表现出广泛的活性(Corti等人，2013，Nature 501：439-43；Schuster等人，2014，J Infect Dis 211：1-34；Wen等人，2017，Nat Microbiol 2：16272；Mousa等人，2018，PLoS Pathog 14：e1006837)。
为了确定分离的人mAbs的结合宽度，通过ELISA检测与来自hMPV F四个亚组中每个亚组的hMPV F蛋白的结合，以及与胰蛋白酶裂解后分离的三聚体hMPV A1 F蛋白的结合(图2A、1A、1B)。所有四种mAbs均与来自四种hMPV F蛋白亚群的hMPV F蛋白结合，并且四种mAbs均未显示与融合前RSV F蛋白A2 SC-TM的交叉反应(Krarup等人，2015，Nat Commun 6：8143)。mAbs MPV196、MPV314和MPV201彼此显示出等效的结合，而基于ELISA测定的EC50，MPV364结合略微降低，表明MPV364对hMPV F蛋白的亲和力较低(图2A)。包括两种先前发现在RSV F和hMPV F蛋白之间进行交叉反应的对照mAbs，即人源化小鼠mAbs 101F(Wu等人，2007，J Gen Virol 88：2719-2723)，和人mAb MPE8(Corti等人，2013，Nature 501：439-43)。101F的表位已知在RSV F和hMPV F蛋白二者上都包含保守GIIK基序(Más等人，2016，PLoS Pathog 12：e1005859)，并由位点IV交叉反应的mAb 17E10共享(Mousa等人，2018，PLoS Pathog 14：e1006837)。值得注意的是，MPE8具有融合前F蛋白特异性(Battles等人，2017，Nat Commun 8：1528；Corti等人，2013，Nature 501：439-43)，未观察到与hMPV F蛋白结构的结合，表明这些蛋白处于融合后构象，这与胰蛋白酶裂解后的阴性染色电镜结果一致(图2A、1B)。为了分析MPV364与其余的mAbs相比是否具有降低的结合速率或解离速率，通过木瓜蛋白酶消化将MPV364、MPV196和MPV314裂解为Fab片段，并通过biolayer干涉仪进行亲和性研究(图2B)。与MPV196和MPV314相比，MPV364的KD高10倍，这是由于Fab对hMPV F蛋白的结合速率较慢。总体而言，与MPV196、MPV201和MPV314相比，这些数据与MPV364的EC50增加一致。
为了确定分离的mAbs是否中和hMPV感染，使用免疫染色法进行菌斑中和试验，以显示菌斑。测试mAbs对分别代表A和B基因型的hMPV CAN/97-83和hMPV TN/93-32的中和。所有四种mAbs均中和了hMPV的两种基因型。令人惊讶的是，MPV364是最有效的中和mAbs，MPVCAN/97-83和MPV TN/93-32的IC50值分别为8和18ng/mL。MPV TN/93-32菌株的IC50比其他三种mAbs低至少1log，而MPV364的KD比其余mAbs高1log。因此，虽然MPV364在四种mAbs中显示出最弱的结合亲和力，但它显示出最有效的中和活性。这些数据导致了探测每个mAb靶向的抗原区域的实验，以确定表位对中和效力是否重要。这一点先前已在RSV F蛋白中得到显示，其中融合前F蛋白特异性mAbs D25(McLellan等人，2013，Science 340：1113-1117)和hRSV90(Mousa等人，2017，Nat Microbiol 2：16271)表现出的有效中和活性远远低于结合融合前和融合后F蛋白构象二者的mAbs。
实施例4
新分离mAbs的表位测定
为了确定分离的人mAbs的抗原位点，进行了表位分类，即以成对组合的方式对竞争相同结合区域的抗体进行测试，然后使用RED384系统将这些抗体分组到分类箱中。先前发现的人mAbs被用于识别hMPV F蛋白的一般抗原区域。hMPV/RSV交叉反应人源化小鼠mAb 101F(Wu等人，2007，J Gen Virol 88：2719-2723；McLellan等人，2010，J Virol84：12236-12244)用于鉴定抗原位点IV，交叉反应的人mAbs MPE8(Corti等人，2013，Nature501：439–43)和25P13(Wen等人，2017，Nat Microbiol 2：16272)用于鉴定抗原位点III。先前发现的mAb DS7(Wen等人，2012，Nat Struc Mol Biol 19：461-463)也被纳入其中，其来源于人类噬菌体展示库。每个mAb与自身和组内其他mAbs竞争结合。抗penta HIS生物传感器加载hMPV F蛋白，然后在不同的实验中加载mAbs作为第一mAb和第二mAb。虽然通过ELISA，MPE8未显示出与hMPV F蛋白的实质性结合，但通过biolayer干涉仪在浓度为100μg/mL时观察到显著结合，表明MPE8表位在hMPV F蛋白的融合后构象中为至少部分保守。观察到mAbs分为三组(图4A)。mAbs MPV201、MPV314和MPV196均主要与mAb DS7竞争，并在抗原位点III部分与MPE8和25P13竞争。抗原位点III与DS7抗原位点非常接近，mAbs 25P13和DS7显示部分竞争。相反，mAb MPV364主要在抗原位点III与mAbs MPE8和25P13竞争。虽然mAbsMPE8和25P13与mAbs MPV196、MPV201和MPV314部分竞争，但MPV364与这些单克隆抗体没有竞争，除了在MPV A1 F蛋白上的单相竞争。最近测定了MPE8与RSV F蛋白复合物的晶体结构(Wen等人，2017，Nat Microbiol 2：16272)。基于融合前RSV和hMPV F蛋白的结构覆盖，MPV364与MPE8相比可能以略微改变的角度结合，从DS7位点偏移(图4B)。MPE8和25P13二者在hMPV和RSV F蛋白之间可交叉反应，然而，MPV364没有观察到这种交叉反应。因此推测，MPV364改变的结合姿势降低了与RSV F的交叉反应性，结合在附近的抗原位点，这里称为抗原位点IIIa。
还测定了IC50(中和50％病毒的抗体浓度)。对于下面列出的每个抗体，第一个数字是A2病毒的中和，第二个数字是B2病毒的中和。
MPV196：29ng/μL、110ng/μL
MPV314：22ng/μL、150ng/μL
MPV201 75ng/μL、680ng/μL
相比之下，DS7 Fab的值如下：1100ng/μL(A2病毒)、无中和(B2病毒)、2400μg/mL(A1病毒)、9800μg/mL(B1病毒)。这些数值被报告为菌斑减少60％，但仍然可以直接比较。
总之，与市售抗体相比，MPV196、MPV314和MPV201具有中和B2病毒的独特特性。
实施例5
MPV364的序列决定簇
通过RNA分离和可变区的RT-PCR测定MPV364重链和轻链可变区。IMGT/V-Quest分析预测MPV364使用VH1-3*01、JH5*02和DH2-8*02基因用于重链，使用VL3-21*02和JL*01基因用于轻链。MPV364重链的CDR3延伸21个氨基酸，序列为ARVDQYCIGGVCYGGKNWFDP(SEQ IDNO：47)，而轻链CDR3是长度为12个氨基酸，序列为QVWDRDSDHPYV(SEQ ID NO：48)。重链和轻链V区二者都发生了严重突变，与各自VH基因的同源性百分比为91.67％，与VL基因的同源性百分比为90.32％。这些数据表明，MPV364是该特定供体中多重hMPV感染的结果。先前发现的针对RSV分离的抗原位点III靶向人mAbs也与hMPV发生交叉反应，利用VH3-21、VH1-46、VH3-11和VH1-69(Corti等人，2013，Nature 501：439-43；Wen等人，2017，Nat Microbiol 2：16272；Gilman等人，2016，Sci Immunol 1：1-12)。总的来说，这些数据提供了新的V基因谱系，其可以在抗原位点III靶向hMPV F蛋白，但不提供与RSV F蛋白的交叉反应性。
实施例6
mAb MPV364减少体内病毒复制hMPV
由于MPV364在体外表现出强大的中和活性，因此在hMPV感染前在体内测定mAb的效力。对于RSV感染高危婴儿，建议预防性施用帕利珠单抗(Group TIm-RS，1998，Pediatrics 102：531-537)；hMPV也可采用类似的治疗施用。MPV364是一种全人型抗体，可能不需要广泛优化以降低人类患者的免疫原性。在这些研究中，使用了BALB/c小鼠，因为这些动物先前显示出对hMPV复制敏感(Alvarez等人，2004，J Virol 78：14003-14011；Liu等人，2009，J Virol 83：6837-6848；Alvarez and Tripp，2005，J Virol 79：5971-5978)。
在hMPV感染前一天，用10mg/kg的MPV364治疗小鼠，并将另外三组作为对照：未感染组、PBS治疗组和IgG1同种型对照非hMPV特异性mAb P19F80治疗组。治疗后，第二天感染小鼠，第5天将其杀死。由于对hMPV感染的保护可能是由MPV364的Fab区介导的，这将抑制hMPV F蛋白的附着和/或融合活性，因此抗体的Fc区不是同种型转换的。通过ELISA在每只小鼠中追踪MPV364的肌内递送，并且如预期的那样，在终末样品中确定与平均50％终点血清滴度1/1,318相关的稳健信号(图5A)。为了确定MPV364是否能有效减少感染小鼠肺部的病毒复制，在病毒感染后五天采集肺部并在PBS中均质化。使用免疫染色菌斑减少试验测定病毒滴度。与PBS治疗组或阴性对照抗体治疗组相比，MPV364治疗组的肺病毒滴度显著降低(图5B)。对照抗体P19F80也观察到肺部病毒滴度的轻微非特异性下降。MPV364治疗组和未感染组小鼠之间未观察到实质性差异。总的来说，这些数据表明，病毒感染前施用MPV364可限制BALB/c小鼠肺部的病毒复制。
虽然已经分离出数百种针对RSV F蛋白的人mAbs，并且抗原位点已经得到了很好的表征，但是由人类免疫系统靶向的hMPV F蛋白上的主要中和和非中和表位尚未确定。针对RSV F蛋白的人mAbs的分离得以设计出目前正在进行临床前和临床试验的新疫苗构建物。然而，以前很少有关于人mAbs靶向的hMPV F蛋白的表位的研究。本文公开了四种新的人mAbs，它们结合hMPV F蛋白并在体外中和hMPV的两种基因型。mAbs被比对到两个不同的抗原位点：抗原位点III被MPV364靶向，其余的mAbs与噬菌体展示衍生的人mAb DS7竞争。
MPV364是一种hMPV F蛋白特异性人mAb，其在抗原位点III结合，并展示出有效的中和活性。此外，预防性施用时，MPV364限制了感染小鼠模型中的病毒复制。hMPV F蛋白特异性mAbs的结合亲和力虽然对病毒中和很重要，但不是有效中和的唯一决定因素。与其余的人mAbs相比，MPV364的结合亲和力弱1-log倍，但中和效力更强。这被确定是由于MPV364靶向的抗原位点所致。
所公开的中和hMPV的人mAbs可用于人类。人源化小鼠mAb，帕利珠单抗施用给RSV感染高危婴儿(Group TIm-RS，1998，Pediatrics 102:531-537)。MPV364和本文公开的其他mAbs是完全人类的，因此不应引起显著的免疫反应。RSV和hMPV二者对于疫苗设计而言仍然是有问题的病毒，病毒的化学失活与Th2优势型免疫应答的诱导有关，对于RSV，与RSV攻击时疫苗诱导的增强疾病致敏作用有关(de Swart等人，2007，Vaccine 25：8518-8528；Murphy and Walsh，1988，J Clin Microbiol 26：1595-7)。这些病原体是年轻人、老年人和免疫功能低下者所关心的问题。所公开的人mAbs可用作在这些人群中控制感染和疾病的手段。
实施例7
实施例1-6的材料和方法
抽血和知情同意。招募健康献血者，在获得知情同意后，通过静脉穿刺将90ml血液抽取到9根肝素涂覆管中，并将10ml血液收集到血清分离管中。使用Ficoll-密度梯度离心法从人类供体血液样品分离外周血单核细胞，并将PBMC在液氮气相中冷冻，直到进一步使用。
重组hMPV F蛋白的生产和纯化。合成了编码hMPV A1、A2、B1和B2 F蛋白(Más等人，2016，PLoS Pathog 12：e1005859)的cDNA的质粒(Genscript)并克隆到pcDNA3.1+载体中。使用100μg/ml氨苄西林(Fisher Scientific)通过在大肠杆菌DH5α细胞中转化来扩展质粒以进行选择。质粒通过使用ZYMOPURETM II Maxiprep试剂盒(Zymo Research)或Plasmid Maxi试剂盒(Omega Biotek)来纯化，二者都遵循循制造商的协议。对于每升蛋白质表达，1mg质粒DNA与4mg分子量为25,000的聚乙烯亚胺(PEI，PolySciences Inc.)在OPTI-MEMTM I细胞培养基(Thermo Fisher Scientific)中混合。30分钟后，DNA/PEI混合物以1×106细胞/mL添加到FREESTYLETM 293表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中的FREESTYLETM HEK293F(Thermo Fisher Scientific)细胞中。4至6天后，将培养物离心以使细胞形成颗粒，并通过0.45μm无菌过滤器过滤上清液。使用HISTRAPTM Excel columns(GEHealthcare Life Sciences)直接从过滤的培养基上清液纯化重组蛋白。在将样品装载到柱上之前，将每个柱储存在20％乙醇中，并用5个柱体积(CV)的20mM Tris pH 7.5 500mMNaCl洗涤。样品施用后，柱子用10CV的20mM Tris pH 7.5 500mM NaCl和20mM咪唑洗涤。用5CV的20mmTris pH 7.5 500mM的NaCl和250mM咪唑从柱上洗脱蛋白质。使用分子量截止值为30kDa的Ultra-15离心过滤装置(Millipore Sigma)对蛋白质进行浓缩和缓冲液交换，并将缓冲液交换为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
人类杂交瘤的生成。对于抗体生成实验，将800万先前冷冻和辐照的NIH 3T3细胞(经修饰以表达人CD40L、人IL-21和人BAFF(来自华盛顿大学Deepta Bhattacharya的礼物))与1000万PBMC在80mL STEMCELLTM介质A(STEMCELLTM Technologies)中混合，介质A包含6.3μg/mL的CpG(来自Invitrogen的硫代磷酸修饰的寡聚脱氧核苷酸，参见PCT公开号WO2017/011394A1，和Bar-Peled等人，J.Virol.Doi：10.1128/JVI.00342-19(2019)doi：10.1128/jvi.00342-19，二者均通过引用并入本文)和1μg/mL的环孢霉素A(Sigma)，并且细胞以200μL/孔镀覆在STEMCELLTM介质A中的四个96孔板中。6天后，通过ELISA筛选与重组hMPV F蛋白结合的培养基上清液，如前所述，将阳性孔中的细胞与非分泌性骨髓瘤细胞系电融合(Mousa等人，2016，PNAS 113：E6849-E6858)。每个比色皿中的细胞再次悬浮在20mL的STEMCELLTM培养基A(含有1x HAT(Sigma-Aldrich)、0.2×HT和0.3μg/mLouabain(Fisher Scientific))中，并以50μL/孔镀覆在384孔板中。7天后，细胞用25μL的STEMCELLTM培养基A补料。两周后通过ELISA筛选杂交瘤以产生抗体，并使带有反应性上清液的孔中的细胞在0.5mL STEMCELLTM介质E(STEMCELLTM Technologies)中扩展至48孔板中，持续一周，之后再次通过ELISA筛选，然后进行单细胞荧光活化分选。将细胞分选到含有STEMCELLTM介质A的384孔板中后，通过ELISA筛选杂交瘤后再进一步扩展。
人mAb和Fab的生产与纯化。合成了编码mAbs 101F、MPE8、25P13和DS7的蛋白序列的cDNA的质粒(Genscript)，将重链和轻链序列分别克隆到编码人IgG1和λ或κ轻链恒定区的载体中。分离大规模DNA，并通过转染到FREESTYLETM HEK293F细胞中获得mAbs，如上所述。对于杂交瘤衍生的mAbs，杂交瘤细胞系在STEMCELLTM介质A中扩展直至80％在75-cm2烧瓶中至融合状态。为了生产抗体，使用细胞刮刀收集一个75-cm2细胞培养瓶中的细胞，并在无血清培养基(杂交瘤-SFM，Thermo Fisher Scientific)中扩展到四个225-cm2细胞培养瓶中。4至6天后停止重组培养，30天后停止杂交瘤培养，使用0.45μm孔径的过滤装置无菌过滤培养基上清液。使用HITRAPTM Protein G columns(GE Healthcare Life Sciences)，遵循制造商协议，从培养基上清液直接纯化mAbs。为了获得Fab片段，使用木瓜蛋白酶消化(PIERCETM Fab Preparation Kit，Thermo Scientific)。通过使用HITRAPTMMABSELECTSURETM，遵循制造商协议，通过去除IgG和Fc污染物纯化Fab片段。
负染色电子显微镜分析。通过将1mg蛋白质与5单位胰蛋白酶在37℃孵育2小时用胰蛋白酶-TPCK(Thermo Fisher Scientific)裂解MPV A1 F蛋白。随后，在50mM Tris pH7.5和100mM NaCl中通过尺寸排除色谱法(S200，16/300；GE Healthcare Life Sciences)纯化复合物。用100μg/mL的蛋白质覆盖碳涂覆的铜载网3分钟。网格在水中洗涤两次，然后用0.75％甲酸双氧铀染色1分钟。使用配备高对比度2k×2k AMT中置数码相机的JEOLJEM1011 TEM显微镜，使用50,000倍放大倍数获得负染色电子显微照片。
结合hMPV F蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)。对于重组蛋白捕获ELISA，384孔板用2μg/mL抗原在37℃处理1小时或在4℃处理过夜。随后，在含有0.05％吐温-20的PBS(PBS-T)中用2％的牛奶加上2％的山羊血清封闭板一小时。在用PBS-T进行三次洗涤后，将初级mAbs或培养基上清液应用于孔中1小时。在以1:4,000的稀释度在封闭溶液中应用25μL二抗(Meridian Life Science的山羊抗人IgG Fc)之前，用PBS-T洗涤板四次。孵育1小时后，用PBS-T洗涤板5次，并向每个孔中添加25μL PNPP溶液(1M Tris碱中1mg/mL PNPP)。板在室温孵育1小时，然后在Biotek平板阅读器上读取405nm处的光密度。
人mAbs的同种型测定。为了测定mAb同种型，96孔HB 4x ELISA板(Thermo Fisher Scientific)在PBS中涂有2μg/mL的每种mAb。板在37℃孵育1小时或在4℃孵育过夜，然后用水冲洗。在PBS-T中用2％无脂乳块和2％山羊血清封闭板，然后在室温孵育1小时。孵育后，用PBS-T洗涤板三次。将获自Southern Biotech的同种型特异性抗体(山羊抗人κ-AP#100244-340、山羊抗人λ-AP#100244-376、小鼠抗人IgG1(Fc)-AP#100245714、小鼠抗人IgG2(Fc)-AP#100245-734和小鼠抗人IgG3(Hinge)-AP#100245-824、小鼠抗人IgG4(Fc)-AP#100245-812)以1:1000全部稀释，并将50μL每种溶液添加到相应的孔中。板在室温孵育1小时，然后用PBS-T洗涤五次。在1M Tris碱中的1mg/mL溶液中制备PNPP底物，并向每个孔中添加100μL该溶液。板在室温孵育1小时，并在Biotek平板读取器上在405nm处读取。
杂交瘤mAb可变γ链和可变轻链的RT-PCR。通过Zymo Research QUICK RNATM微量提取试剂盒，遵循制造商的协议，从扩展的杂交瘤抗体中分离RNA。Qiagen ONESTEPTM RT-PCR试剂盒用于cDNA分析和PCR扩增。对于RT-PCR反应，设计50μL反应，最终浓度如下：1×Qiagen ONESTEPTM RT-PCR缓冲液、400μM dNTP混合物、0.6μM引物混合物、2μL QiagenONESTEPTM RT-PCR酶混合、总共600ng模板RNA和不含RNA酶的水。使用了三组不同的引物混合物：如前所述的γ和卡帕正向和反向引物(Thornburg等人，2016，J Clin Invest 126:1482–1494)，和如前所述的λ链引物(Smith等人，Nat Protoc 4：372-384)。混合后，按照以下程序将RT-PCR反应放入热循环器中：在50℃30分钟，在95℃15分钟，然后进行三步循环，在94℃重复30次变性30秒，在50℃退火30秒，在72℃延伸1分钟，然后在72℃进行10分钟的最终延伸。样品在琼脂糖凝胶上进行分析。使用IMGT/V-QUEST分析序列(Brochet等人，2008，Nucleic Acids Res 36：503-508)。
hMPV的生长。hMPV B2菌株TN/93-32获自BEI Resources(NR-22240)，hMPV A2菌株CAN/97-83来自Dr.Ralph Tripp。病毒在LLC-MK2-7.1细胞(ATCC CCL-7.1)中生长。细胞在补充有2％FBS的I中在185cm2烧瓶中生长至80％融合状态。对于病毒感染，细胞用DPBS洗涤2次，然后用6mL稀释的病毒涂覆。在室温摇动烧瓶1小时，以便吸附病毒。随后，向烧瓶中添加10mL补充有5μg/mL胰蛋白酶EDTA和100μg/mL CaCl2的I。细胞孵育4至5天，然后获取病毒。为获取病毒，从烧瓶中移出培养基，并向烧瓶中添加5mL冷25％(重量/体积)无菌过滤蔗糖。将烧瓶转移至-80℃，直到溶液冻结。然后移动烧瓶在室温下解冻，随后进行另一个冻融循环。刮去细胞裂解物，将所有细胞和蔗糖溶液转移到无菌管中，并以1100rpm离心5分钟。将含有hMPV的澄清上清液等分并快速冷冻以备日后使用。
hMPV菌斑中和实验。LLC-MK2-7.1细胞保存在补充有2％胎牛血清的I(Thermo Fisher Scientific)中，并在CO2孵育箱中于37℃在24孔板中生长。在中和试验前两天，将40,000个细胞/孔接种在24孔板中。在实验当天，从杂交瘤上清液中分离的连续稀释的mAbs与感染性hMPV B2菌株TN/93-32或hMPV A2菌株CAN/97-83的悬浮液按1:1孵育1小时。随后，在室温下摇动时，细胞用50μL的抗体：病毒混合物接种1小时。细胞然后用1mL溶解在I中(补充有5μg/mL胰蛋白酶EDTA和100μg/mL CaCl2)的0.75％甲基纤维素覆盖。细胞孵育4至5天后，用10％中性缓冲福尔马林固定细胞。细胞单层用补充有2％山羊血清的2％无脂乳封闭1小时。用水洗涤板，并将200μL以1:1000在封闭溶液中稀释的小鼠抗hMPV N一抗(Meridian Biosciences,#C01851M)添加到每个孔中且孵育1小时。板然后用水洗涤三次，之后将200μL以1:1000在封闭溶液中稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP二抗添加到每个孔中，持续1小时。板然后用水洗涤5次，并将200μL过氧化物酶底物添加到每个孔中。对板进行孵育，直到菌斑清晰可见。在立体显微镜下手工计数菌斑，并与纯病毒对照进行比较，在Graphpad Prism中分析数据。
生物层干涉测量术的实验装置。在运行缓冲液(PBS、0.5％BSA、0.05％吐温-20、0.04％硫柳汞)中获得初始基线后，将10μg/mL组氨酸标记的hMPV F蛋白固定在生物层干涉测量设备(Red，ForteBio)的抗penta-HIS生物传感器尖端(ForteBio)上120秒。再次测量基线信号60秒，然后将生物传感器尖端浸入含有100μg/mL的一抗的孔中300秒。随后，将生物传感器浸入含有100μg/mL第二mAb的孔中300秒。通过将第一mAb添加到单独的第二mAb的最大信号后比较第二mAb的最大信号来确定在第一mAb存在的情况下第二mAb的结合百分比。如果第二mAb的最大结合为≥其非竞争性结合的66％，则认为mAb是非竞争的。其未竞争结合的33％至66％之间的水平被视为中间竞争，且≤33％被视为竞争。对于Fab亲和力研究，如上所述加载hMPV F蛋白，并通过结合120秒并解离600秒分析降低浓度的Fab结合。从数据中减去不含抗体的参考孔，并在数据分析软件中获得亲和力值。
小鼠实验。为了检测hMPV364的功效，使用了hMPV感染的BALB/c小鼠模型。在病毒感染前一天，小鼠通过尾部切口抽血以收集基线血清。小鼠然后用10mg/kg MPV364、10mg/kg同种型对照抗体P19F80、PBS预防性地治疗，其中一组未经治疗。第二天，MPV364、P19F80和PBS组鼻内接种100μL 105pfu hMPV CAN/97-83。感染后5天，通过2,2,2-三溴乙醇(Avertin)对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位，并收集血清和肺部。取肺，用GENTLEMACSTM解离器均质，在液氮中快速冷冻，并在使用前储存在-80℃。如前所述，通过菌斑免疫染色测定肺病毒滴度(Alvarez and Tripp，2005，J Virol 79：5971-5978)。使用上述方案，利用MPV B2 F进行小鼠血清的ELISA分析。
实施例8
人偏肺病毒融合蛋白三聚体界面的抗体识别
hMPV有三种表面糖蛋白：小疏水蛋白、附着蛋白(G)和融合蛋白(F)。hMPV F蛋白是hMPV感染所必需的，在hMPV亚群中高度保守(Piyaratna等人，Virus Res.160，200-205(2011))。此外，hMPV F蛋白是中和抗体的唯一靶点(Skiadopoulos等人，Virology 345，492-501(2006))。尽管之前已经分离出几种靶向hMPV F蛋白的单克隆抗体(mAb)(参见，例如，Ulbrandt等人，J.Virol，80，7799-7806(2006))，但人型抗体反应所靶向的主要抗原位点尚不清楚。为了确定对hMPV F蛋白的体液免疫应答，分离了两种人mAb，MPV458和MPV465。这两种mAb都在体外中和，且靶向hMPV F蛋白三聚体界面内包含的独特抗原位点。确定MPV458和MPV465二者对单体hMPV F的亲和力高于对三聚体hMPV F的亲和力。MPV458与hMPVF共结晶以确定表位的分子足迹，并且mAb主要与hMPV F蛋白质F2区域上的α螺旋相互作用。MPV458还通过mAb轻链与N-连接聚糖接触。
hMPV和呼吸道合胞病毒(RSV)共享肺病毒科病毒家族，和在两种病毒之间具有约30％的同源性的类似的F蛋白。对于这两种病毒，F蛋白具有两种长寿命构象，即融合前和融合后状态(Huang等人，Front.Immunol.doi.org/10.3389/fimmu.2019.02778(2019))。缺乏G蛋白的RSV和hMPV二者都能在体外感染细胞，尽管这些病毒在体内是减毒的(Biacchesi等人，J.Virol，78，12877–12887(2004))。F蛋白的融合前构象是亚稳定的，并且已产生hMPV F(Battles等人，Nat.Commun，8，1528(2017))和RSV F(McLellan等人，Science，(80-.)，342，592-598(2013)；Krarup等人，Nat.Commun，6，8143(2015))二者的稳定版本，但是融合前hMPV F蛋白对于常规HEK293F或CHO细胞系表达尚不稳定。对于RSV F，融合前构象包含位于F蛋白头部的抗原位点和V20，与融合后构象相比，其引发最有效的中和抗体(Gilman等人，Sci.Immunol，1，1-12(2016)；Mousa等人，Nat.Microbiol，2，16271(2017))。此外，人型抗体对RSV感染的反应主要集中在这些融合前特异性表位上(Ngwuta等人，Sci.Transl.Med，7，309ra162(2015))。对于hMPV F，使用人类血清的数据表明，hMPV F特异性人型抗体主要结合融合前和融合后的F构象二者(Battles等人，2017，在前)。与其他呼吸道病原体类似，儿童、老年人和免疫功能低下者是hMPV感染可能需要住院治疗的主要人群(参见，例如，Panda等人，Int.J.Infect，Dis.25，45-52(2014))。
hMPV F蛋白包含一个被裂解以将多肽F0蛋白转化为亚稳态二硫键连接的F1-F2融合前同源三聚体的单一位点。这与RSV F不同，RSV F包含两个位于p27肽片段两侧的furin裂解位点。hMPV F在体内的裂解酶尚不清楚，尽管在体外可以通过胰蛋白酶完成裂解(Schowalter等人，J.Virol.80，10931-10941(2006))。来自A1亚群的hMPV F蛋白的X射线晶体结构已在融合前和融合后构象中确定(Más等人，PLoS Pathog.12，e1005859(2016)；Battles等人，2017，在前)。一组啮齿动物源性mAb最初用于利用病毒逃逸突变体绘制hMPVF蛋白上的中和表位(Ulbrandt等人，J.Virol.80，7799-7806(2006)；Ulbrandt等人，J.Gen.Virol，89，3113-3118(2008))。hMPV F蛋白上的已知抗原位点包括抗原位点III、IV和mAb DS7靶向的未命名位点(Huang等人，Front.Immunol.doi.org/10.3389/fimmu，2019，02778(2019))。DS7从人噬菌体展示库中分离(Williams等人，J.Virol.81，8315-8324(2007))，并与融合前hMPV F蛋白片段共结晶(Wen等人，Nat.Struc.Mol.Biol，19，461-463(2012))。已发现几种分离的mAb可交叉中和RSV和hMPV，包括MPE8(Corti等人，Nature 501，439-43(2013))和25P13(Wen等人，Nat.Microbiol.2，16272(2017))(位点III)，以及101F(Mas等人，PLoS Pathog.12，e1005859(2016))、54G10(Schuster等人，J.Infect.Dis，211，1-34(2014))和17E10(Mousa等人，PLoS Pathog.14，e1006837(2018))(位点IV)。如上所述，MPV364在抗原位点III上竞争结合，但不与RSV F发生交叉反应。分离出另外两种人mAb，以进一步鉴定人类免疫系统识别的hMPV F蛋白上的表位。
通过筛选HEK293F细胞中表达的hMPV B2 F蛋白(表S1)，从健康成人供体中分离出两种新的人型抗体(Bar-Peled等人，J.Virol.Doi：10.1128/JVI.00342-19(2019)doi：10.1128/jvi.00342-19)。
MPV458和MPV465从两个不同的供体中分离，分别具有IgG3和κ以及IgG1和λ的同种型。MPV458使用VH3-30、JH3、DH2、VK1-33和JK5，而MPV465使用VH3-33、JH5、DH3-22、VL-47和JL3。两种抗体之间的CDR3环存在显著差异，因为MPV458只有8个氨基酸，而MPV465有21个氨基酸长的CDR3环(表S2)。
为了鉴定分离的mAb由靶向的抗原表位，使用竞争性生物层干涉法进行表位结合(Mousa等人，PNAS 113，E6849-E6858(2016)。以前发现的具有已知抗原表位的mAb被用作绘图对照，包括mAbs 101F(Wu等人，J.Gen.Virol.88，2719-2723(2007))(位点IV)、MPV196(Bar-Peled等人，J.Virol.Doi：10.1128/JVI.00342-19(2019)doi：10.1128/jvi.00342-19)和DS7(Williams等人，J.Virol，81，8315-8324(2007))(DS7表位)以及MPE8(Corti等人，Nature 501，439-43(2013))和MPV364(Bar-Peled等人，2019，supra)(位点III)(图7A)。抗penta-HIS生物传感器装载hMPV 130-BV F蛋白(Battles等人，2017，在前)，然后装载一个hMPV F特异性单克隆抗体，随后暴露于第二mAb。mAbs MPV458和MPV465没有与任何图谱对照mAbs竞争，但相互竞争结合，表明这两种mAbs结合到hMPV F蛋白上的独特抗原位点。
进行菌斑中和试验，以确定MPV458和MPV465在体外对hMPV B2亚组(菌株TN/93-32)和hMPV A2亚组(菌株CAN/97-83)的中和特性(图7B)。对于MPV CAN/97-83和MPV TN/93-32，MPV458分别以33ng/mL和490ng/mL的50％抑制浓度(IC50)值中和hMPV，而MPV465的IC50值分别为950和2700ng/mL。MPV458的中和效力与mAbs MPE8和101F相当。通过ELISA和生物层干涉法测定MPV458和MPV465的结合特性。对于ELISA，半最大有效浓度(EC50)值用于量化多个hMPV F蛋白构建物中mAb之间的结合(表S1、图10-13)。如前所述，通过用胰蛋白酶处理纯化的蛋白质可以产生三聚体hMPV F(Más等人，2019，在前；Bar-Peled等人，2019，在前)，尽管这一过程产生了融合前和融合后构象二者的批间变化。两种mAb均与来自所有四个hMPV F亚群的hMPV F蛋白结合(图14)。评估了与主要呈融合前和融合后构象的hMPV F构建物的结合(图14)。主要融合前hMPV F 130-BV蛋白和主要融合后hMPV B2 GCN4 6R F蛋白之间未观察到重大差异，表明这些mAb结合融合前和融合后构象二者。也评估了与经胰蛋白酶处理以诱导裂解的专一单体和三聚体hMPV B2 F蛋白的结合(图7C)。mAbs MPV458和MPV465二者与单体hMPV F的结合强于与三聚体hMPV F的结合。MPV458与单体hMPV B2 F的EC50比三聚体hMPV B2 F低近四倍，而MPV465与hMPV B2F三聚体的结合被完全消除，但与hMPV B2 F单体的结合良好。这些数据表明MPV458和MPV465的表位主要暴露在单体hMPV F上。通过使用主要为融合前hMPV 130-BV蛋白的生物层干涉术评估结合亲和力和亲和力(图7D)。亲和力测量通过将mAbs裂解成Fab片段完成。MPV458 Fab具有比MPV465 Fab和101F Fab更快的KON，并且也具有有限的解离，这使得KD比MPV458高2-logs，比101F高3-logs。与101F IgG相比，观察到MPV458和MPV465 IgG分子的有限解离，并且未获得KOFF速率。总的来说，这些数据表明MPV458对hMPV 130-BV F蛋白的亲和力高于mAbs MPV465和101F。
为了完全限定新分离的mAb所靶向的表位，MPV458的Fab与hMPV B2 F在复合物中共结晶。hMPV B2 F的胰蛋白酶化产生hMPV F的三聚体和单体版本，通过尺寸排阻色谱法评估(图15)。将MPV458和MPV465 mAbs裂解成Fab片段，随后在这些Fab中添加胰蛋白酶化三聚体hMPV B2 F，形成单体hMPV F-Fab复合物(图15)。尽管hMPV B2 F三聚体在Fab结合时出现断裂，但这不能归因于MPV458和MPV465的结合，因为其他Fab也导致该构建物的三聚体解离。对MPV458-hMPV B2 F复合物进行结晶筛选，并在0.5M硫酸铵、0.1M柠檬酸三钠二水合物(pH 5.6)和1.0M硫酸锂一水合物中获得晶体。收集晶体并收集X-射线衍射数据，确定复合物的结构至(图8A-8D、表S3)。
不对称单元包含一个hMPV F原聚体和一个MPV458 Fab分子。在融合前构象中观察到hMPV F，但在观察对称性相关伴侣时未观察到三聚体结构(图16)。与先前发现的肺病毒抗原位点相比，MPV458靶向一个独特的表位。原表位由F2区氨基酸66-87的单个α螺旋组成(图8A)。与hMPV F蛋白相比，MPV458处于几乎垂直于F蛋白长轴的位置。在与先前确定的融合前hMPV F的X-射线晶体结构重叠后，很明显，主要表位完全位于三聚体hMPV F的两个原聚体之间的界面内(图8B)。这一不寻常的表位表明hMPV F蛋白在病毒粒子包膜或受感染细胞的表面部分为单体，或者hMPV F蛋白发生大量呼吸以允许抗体结合并中和病毒。如前所述，MPV458具有不寻常的短HCDR3环，只有8个氨基酸。HCDR3和LCDR3集中在66-87螺旋区域上。在电子密度中，许多氢键事件都很明显(图8C、8D、17)。HCDR3通过Asp107与hMPV F的Arg79相互作用，而HCDR2 Asn64和Ser63分别与Glu80和Arg205相互作用(图8C)。HCDR1利用Arg36与Glu70相互作用。轻链LCDR3比HCDR3具有更多的氢键事件，利用Leu114的主链氨基与Thr83相互作用、Arg115氢键与Asp87相互作用以及Asp108氢键与Lys82相互作用(图8D)。LCDR1 Arg37与Asn57相互作用，Asn57具有扩展的N-连接聚糖基序。LCDR2 Asp56与Lys75相互作用。轻链的非CDR环与由NAG-NAG-BMA(具有BMA聚糖上的分支的MAN残基)组成的聚糖基序相互作用，其中Tyr83与扩展的MAN聚糖相互作用，而Tyr83位点的长面平行于扩展的聚糖，表明与聚糖基序有良好的相互作用。
hMPV F的66-87螺旋在融合前和融合后构象中结构保守，尽管该螺旋在三聚体融合后构象中暴露在外表面(图9A、9B)。在融合前和融合后hMPV F蛋白的66-87区域重叠后，残基66-83排列良好，而在融合后hMPV F残基84-87处螺旋断裂(图9C)。螺旋的该序列同一性是高度保守的，因为A1和B2亚群之间的残基是相同的，除了Lys82/Arg82突变。由于MPV458和MPV465表现出与融合后hMPV F构建物的结合，因此通过尝试在MPV458的Fab和融合后构象的胰蛋白酶化hMPV B2 F之间生成复合物进一步检验结合(图11、18)。如尺寸排除色谱法评估，未观察到复合物，而101F的Fab与融合后的hMPV F蛋白形成复合物。这表明，尽管通过ELISA观察到结合，但完整的表位位于66-87螺旋之外，且在融合后构象中不完整。由于主要表位集中在单螺旋上，因此通过Western blot评估结合，以确定MPV458是否与变性hMPV F蛋白中的线性构象结合(图19)。使用还原和加热的蛋白质以及非还原蛋白质分析与hMPV B2 F的结合。MPV458显示与hMPV B2 F的所有状态结合，而对照mAbs 101F和MPE8显示仅与非还原状态结合。这些数据表明MPV458表位至少部分呈线性。由于MPV458的表位位于三聚体界面内，因此B细胞识别该表位的机制尚不清楚。为了确定MPV458表位是否暴露在病毒感染细胞表面，使用MPV458、MPE8和阴性对照肺炎球菌特异性抗体进行流式细胞术(图20A-20D)。MPV458和MPE8二者都能诱导病毒感染细胞的荧光位移，而阴性对照mAb则不能。这表明MPV F蛋白在感染细胞表面以单体形式存在，或者hMPV F三聚体表现出呼吸运动以允许MPV458结合。通过将结合位点与先前描述的已进行了结构表征的hMPV F特异性mAbs(MPE8、101F、DS7)进行比较，MPV458表位与所有三个已知抗原位点(IV、VI和III)距离较远，并且位于单体hMPV F蛋白的对面(图9D、9E)。尽管最近通过mAb FluA-20在流感血凝素蛋白上观察到一个三聚体内表位，但hMPV F蛋白上的这一独特表位仍是出乎意料的(Bangaru等人，Cell 177，1136-1152，e18(2019))。然而，FluA-20是非中和的，其功能是破坏HA三聚体并抑制细胞间扩散。肺病毒F蛋白呼吸的证据先前已在RSV F蛋白上证实，其中在抗原位点V结合的mAb CR9501增强了融合前RSV F蛋白的开放(Gilman等人，Nat.Commun.10，2105(2019))。
Abs MPV458和MPV465展示了一类新的中和hMPV F-特异性人型抗体。这些mAb结合在由α螺旋66-87定义的hMPV F蛋白上新定义的表位上。这个新的表位是第一个被定义在hMPV F蛋白头部的。RSV F蛋白具有至少两个暴露在三聚体头部表面的抗原位点(抗原位点和V)，然而，hMPV F的此类抗原位点尚未确定，可能是由于聚糖屏蔽所致(Biacchesi等人，J.Virol.78，12877-12887(2004))。本文提供的结果为人型抗体对hMPV F蛋白的反应以及对病毒糖蛋白的反应提供了见解。至少MPV458可以潜在地应用于治疗和预防hMPV感染。
实施例9
实施例8的材料和方法
抽血和知情同意。健康的人类供体被招募到佐治亚大学临床和转化研究单位。在获得知情同意后，通过静脉穿刺将90ml血液抽取到9根肝素涂覆管中，并将10ml血液收集到血清分离管中。使用Ficoll-Histopaque密度梯度离心法从人类供体血液样品分离外周血单核细胞(PBMCs)，并将PBMC在液氮气相中冷冻，直到进一步使用。
重组hMPV F蛋白的生产和纯化：合成了编码hMPV A1 F、A2 F、B1 F和B2 F蛋白(Bar-Peled等人，J.Virol.Doi：10.1128/JVI.00342-19(2019)doi：10.1128/jvi.00342-19)和hMPVF 130-BV(Battles等人，Nat.Commun，8，1528(2017))蛋白的cDNA的质粒(GenScript)并克隆到pcDNA3.1+载体中。使用100μg/ml氨苄西林(Fisher Scientific)通过在大肠杆菌DH5α细胞中转化来扩展质粒以进行选择。质粒通过使用质粒提取试剂盒(Omega BioTek)，根据制造商的协议来纯化。为了产生表达hMPV B2 F、hMPV B2 FGCN4和hMPV F 130-BV的稳定细胞系，HEK293F(Thermo Fisher Scientific)细胞在转染前1天被接种到12孔板(4×105/孔)中，其中含有1mL 10％胎牛血清(FBS；)的生长培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM；)。对于每毫升转染，1μg质粒DNA与4μg 25,000分子量的聚乙烯亚胺(PEI；PolySciences Inc.)在66.67μl细胞培养基(Gibco)中混合。30分钟后，将DNA-PEI混合物添加到中的HEK293F细胞中。3至4天后，使用20μl细胞培养基的上清液进行Western blot以确定蛋白质的表达。然后培养基用补充有G418(Geneticin；VWR)抗生素的1mL生长培养基替换，最终浓度为250μg/mL。2至3天后，用补充有G418的生长培养基再次悬浮HEK293F细胞，并扩展至25-cm2的细胞培养瓶中。一旦细胞达到80％至90％的融合状态，就进行胰蛋白酶消化，并进一步扩展到75-cm2的细胞培养瓶中。同样，在80％至90％的融合状态下，将胰蛋白酶化的细胞转移到250mL烧瓶中的100mL 293FREESTYLETM介质(Gibco)(补充有G418)中，并在37℃和5％CO2的摇动孵育箱中培养。
为了蛋白的表达和纯化，稳定的细胞系在500mL 293FREESTYLETM介质(补充有G418)中以1×106/mL扩展。其余构建物通过以HEK293F细胞转染来表达。5至7天后，将培养物离心以使细胞形成颗粒，并通过0.45μm无菌过滤器过滤上清液。使用HISTRAPTM Excelcolumns(GE Healthcare Life Sciences)直接从过滤的培养基上清液纯化重组蛋白。在将样品装载到柱上之前，将每个柱储存在20％乙醇中，并用5个柱体积(CV)的洗涤缓冲液(20mM Tris pH 7.5、500mM NaCl和20mM咪唑)洗涤。样品施用后，柱子用10CV洗涤缓冲液洗涤。用6CV的洗脱缓冲液(20mM Tris pH 7.5,500mM NaCl,and 250mM imidazole)从柱子上洗脱蛋白质。使用分子量截止值为30kDa的Ultra-15离心过滤装置(MilliporeSigma)对蛋白质进行浓缩，并将缓冲液交换为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
hMPV F的胰蛋白酶化：为了生成均一裂解的三聚体hMPV F，将TPCK(L-1-对甲苯酰胺基-2-苯乙基氯甲基酮)-胰蛋白酶(Thermo-Scientific)以2mg/mL溶解在双蒸水(ddH2O)中。纯化的hMPV B2 F用5TAME(对甲苯-磺酰-L-精氨酸甲酯)单位/mg TPCK-胰蛋白酶在37℃孵育1小时。三聚体B2 F通过尺寸排除色谱法在S200，16/600柱(GEHealthcare Life Sciences)上在柱缓冲液(50mM Tris pH 7.5和100mM NaCl)中从消化反应混合物中纯化。三聚体F通过单体hMPV B2 F蛋白的洗脱曲线的变化来确定。使用30-kDaUF浓缩器对含有三聚体和单体的馏分进行浓缩，之后进行以下分析。
hMPV F特异性杂交瘤的产生：对于杂交瘤的生成，将1000万从健康供体的血液中纯化的外周血单核细胞(PBMCs)与800万先前冷冻和辐照的NIH 3T3细胞(经修饰以表达人CD40L、人白细胞介素-21(IL-21)和人BAFF(华盛顿大学Deepta Bhattacharya赠送的礼物))在80mL STEMCELLTM介质A(STEMCELLTM Technologies)(含有6.3μg/mL CpG(硫代磷酸修饰的寡核苷酸)(Invitrogen，参见PCT公开号WO2017/011394A1，和Bar-Peled等人，J.Virol.Doi：10.1128/JVI.00342-19(2019)doi：10.1128/jvi.00342-19，二者均通过引用并入本文)和1μg/mL环孢霉素(Sigma))中混合。细胞混合物以200μL/孔镀覆在STEMCELLTM介质A中的四个96孔板中。6天后，通过ELISA筛选与重组hMPV B2 F蛋白结合的培养基上清液，如前所述，将阳性孔中的细胞与非分泌性骨髓瘤细胞系电融合(Bar-Peled等人，2019，在前)。每个比色皿中的细胞再次悬浮在20mL的STEMCELLTM培养基A(含有1x HAT(次黄嘌呤氨基蝶呤-胸腺嘧啶；Sigma-Aldrich)、0.2×HT(次黄嘌呤-胸腺嘧啶；)和0.3μg/mL ouabain(Thermo Fisher Scientific))中，并以50μL/孔镀覆在384孔板中。7天后，细胞用25μL的STEMCELLTM培养基A补料。2周后，通过ELISA筛选杂交瘤上清液以产生抗体，并使带有反应性上清液的孔中的细胞在0.5mL STEMCELLTM介质E(STEMCELLTM Technologies)中扩展至48孔板中，持续1周，之后再次通过ELISA筛选。阳性杂交瘤然后进行单细胞荧光活化分选到容纳有75％STEMCELLTM介质A和25％STEMCELLTM介质E的384孔板中。细胞分选后两周，在进一步扩展容纳有hMPV F特异性杂交瘤的孔之前，通过ELISA筛选杂交瘤。
人mAb和Fab的生产与纯化：对于重组mAbs，合成了编码101F(McLellan等人，J.Virol.84，12236-12244(2010)、MPE8(Corti等人，Nature 501，439-43(2013))和DS7(Williams等人，J.Virol.81，8315–8324(2007)的重链和轻链序列cDNA的质粒(GenScript)，并分别克隆到编码人IgG1和λ或κ轻链恒定区的载体中。大量提取质粒，并通过转染到FREESTYLETM HEK293F细胞中获得mAbs，如上所述。对于杂交瘤衍生的mAbs，杂交瘤细胞系在STEMCELLTM介质A中扩展直至80％在75-cm2烧瓶中至融合状态。使用细胞刮刀收集一个75-cm2细胞培养瓶中的细胞，并在无血清培养基(杂交瘤-SFM，Thermo FisherScientific)中扩展到225-cm2细胞培养瓶中。在5至7天后停止转染的重组培养，在30天后停止杂交瘤培养。使用0.45-μm过滤器过滤来自两种方法的培养基上清液，以去除细胞碎片。使用HITRAPTM Protein G columns(GE Healthcare Life Sciences)，根据制造商协议，从培养基上清液直接纯化mAbs。为了获得Fab片段，使用Pierce Fab制备试剂盒(ThermoFisher Scientific)，根据制造商协议进行木瓜蛋白酶消化。使用HITRAPTMMABSELECTSURETM(GE Healthcare Life Sciences)柱，根据制造商协议，通过去除IgG和Fc污染物纯化Fab片段。
人mAbs的同种型测定：为了测定mAb同种型，96孔Immulon HB 4×ELISA板(ThermoFisher Scientific)在PBS中涂有2μg/mL的每种mAb(每个样品都有两个孔)。板在4℃孵育过夜，然后用水洗涤一次。板用封闭缓冲液(PBS-T中2％无脂乳、2％山羊血清)封闭，然后于室温孵育1小时。孵育后，板用水洗涤三次。获自的同种型特异性抗体Southern Biotech(山羊抗人κ-碱性磷酸酶[AP][目录号100244-340]、山羊抗人λ-AP[目录号100244-376]、小鼠抗人IgG1[Fc]-AP[目录号100245714]、小鼠抗人IgG2[Fc]-AP[目录号100245-734]、小鼠抗人IgG3[hinge]-AP[目录号100245-824]和小鼠抗人IgG4[Fc]-AP[目录号100245-812])在封闭缓冲液中以1:1000稀释，并将50μL每种溶液添加到相应的孔中。板在室温孵育1小时，然后用PBS-T洗涤五次。在底物缓冲液(1M三(羟甲基)氨基甲烷，0.5mM MgCl2，pH 9.8)中以1mg/mL制备PNPP底物，并向每个孔中添加100μL该溶液。板在室温孵育1小时，并在BioTek平板读取器上在405nm处读取。
蛋白质印迹(Western blot)：还原条件下的蛋白质样品与含有β-ME的加载缓冲液混合，并在96℃加热10分钟，然后加载到4％至12％的Bis-Tris Plus凝胶上(Invitrogen)。相同的样品在非还原加载缓冲液中混合，没有任何其他处理。然后通过iBlot系统(Invitrogen)将样品转移至PVDF膜，并用5％的封闭缓冲液(PBST中5％阻滞剂)在4℃封闭过夜。一抗以0.5μg/mL在PBST中稀释，并使HRP-结合的山羊抗人二抗以1:10,000在PBST中稀释。两种孵育都是在室温进行1小时，中间用PBST洗涤5次。在使用ChemiDoc成像系统(BioRad)拍摄图像之前，立即添加底物(Pierce ECL Western Blotting Substrate，Thermo Scientific)。
负染色电子显微镜分析：所有样品均在柱缓冲液中在Superdex S200，16/600柱(GE Healthcare Life Sciences)上通过尺寸排除色谱法纯化，之后将其应用于网格。用5μl蛋白质(10μg/mL)覆盖碳涂覆的铜载网(Electron Microscopy Sciences)3分钟。网格在水中洗涤两次，然后用0.75％甲酸双氧铀染色1分钟。使用配备高对比度2K×2K AMT中置数码相机的JEOL JEM1011透射电子显微镜，以40,000倍的放大倍数获得负染色电子显微照片。
MPV458 Fab+B2 F复合物的结晶和结构测定：为了制备MPV458 Fab+B2 F复合物，将纯化的胰蛋白酶化B2 F三聚体以1:2的摩尔比添加到MPV458 Fab中，并在4℃孵育过夜。为使复合物结晶，样品在50mM Tris pH 7.5，100mM NaCl中进行尺寸排除色谱法(S200，16/300，GE Healthcare Life Sciences)。将含有复合物的馏分浓缩至14.9mg/mL，并在沉滴法MRC-2板(Hampton Research)中使用几种商用结晶筛在TTP LabTech Mosquito Robot上准备结晶试验。在条件F3(0.5M硫酸铵、0.1M柠檬酸三钠二水合物pH 5.6、1.0M硫酸锂一水合物)下在Crystal Screen HT(Hampton research)中获得晶体。采集晶体并在母液中用30％甘油冷冻保护，然后在液氮中快速冷冻。在Advanced Photon Source SER-CAT beamline21-ID-D上收集X-射线衍射数据。使用XDS.4对数据进行索引和缩放。使用hMPV融合前F结构(PDB 5WB0)和Fab结构(PDB 4Q9Q)在Phaser5中获得分子置换溶液。复合物的结构是通过在COOT6中人工构建，随后在Phenix 5进行了几轮人工重建和改进完成的。数据收集和细化统计显示在表S2中。
杂交瘤mAb可变γ链和可变轻链的RT-PCR：使用总RNA试剂盒OmegaBioTek)，根据制造商协议，从扩展的杂交瘤抗体中分离RNA。Qiagen ONESTEPTM RT-PCR试剂盒用于cDNA分析和PCR扩增。对于RT-PCR反应，50μL反应混合物设计为具有以下最终浓度：1×Qiagen ONESTEPTM RT-PCR缓冲液、400μM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合物、0.6μM引物混合物、2μl Qiagen ONESTEPTM RT-PCR酶混合物、总共1μg的模板RNA和不含RNase的水。使用了三组不同的引物混合物：如前所述的γ、κ和λ正向和反向引物(Tiller等人，J.Immunol.Methods 329，112-124(2008))。按照以下程序在热循环器中进行RT-PCR：在50℃30分钟，在95℃15分钟，然后进行三步循环，在94℃重复30次变性30秒，在50℃退火30秒，在72℃延伸1分钟，然后在72℃进行10分钟的最终延伸。样品通过琼脂糖凝胶电泳分析，并使用Original TA克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，根据制造商协议将纯化的PCR产物(循环纯试剂盒；Omega)克隆到pCR2.1载体中。使用质粒DNA迷你试剂盒(Omega)从阳性DH5α菌落中纯化质粒，并提交给Genewiz进行测序。序列使用IMGT/V-Quest进行分析(Tiller等人，J.Immunol.Methods 329，112-124(2008))。对于MPV458，将2×106杂交瘤细胞直接送至GenScript进行抗体可变结构域测序。
hMPV的生长：hMPV B2菌株TN/93-32获自BEI资源(目录号NR-22240)，hMPV A2菌株CAN/97-83是Ralph Tripp赠送的礼物。病毒在LLC-MK2细胞(ATCC)中生长。细胞在补充有2％FBS的在225-cm2烧瓶中生长至80％融合状态。对于病毒感染，细胞用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS；)洗涤2次，然后用6mL稀释的病毒涂覆。在室温摇动烧瓶1小时，以便吸附病毒。随后，向烧瓶中添加10mL补充有5μg/mL胰蛋白酶EDTA和100μg/mL CaCl2的细胞孵育4至5天，然后获取病毒。为获取病毒，从烧瓶中移出培养基，并向烧瓶中添加5mL冷25％(重量/体积)无菌过滤蔗糖。将烧瓶转移至-80℃，直到溶液冻结。然后移动烧瓶在室温下解冻，随后进行另一个冻融循环。刮去细胞裂解物，将所有细胞和蔗糖溶液转移到无菌管中，并以1,100rpm离心5分钟以除去细胞碎片。将含有hMPV的上清液的澄清等分样快速冷冻并滴定以备日后使用。
hMPV菌斑中和试验：LLC-MK2细胞保存在补充有2％胎牛血清的(Thermo Fisher Scientific)中，并在CO2孵育箱中于37℃在225-cm2烧瓶中生长。中和试验前两天，细胞被胰蛋白酶化，并在中以80,000细胞/mL稀释，将0.5mL的细胞接种在24孔板中。在实验当天，从杂交瘤上清液中分离的连续稀释的mAbs与感染性hMPV B2菌株TN/93-32或hMPV A2菌株CAN/97-83的悬浮液按1:1孵育1小时。随后，在室温下摇动时，细胞用50μL的抗体-病毒混合物接种1小时。细胞然后用1mL溶解在中(补充有5μg/mL胰蛋白酶-EDTA和100μg/mL CaCl2)的0.75％甲基纤维素覆盖。细胞孵育4天，之后用10％中性缓冲福尔马林固定细胞。细胞单层然后用封闭缓冲液(PBS-T中补充有2％山羊血清的2％无脂乳)封闭1小时。用水洗涤板，并将200μL以1:1000在封闭溶液中稀释的小鼠抗hMPV N一抗(目录号：C01851M；Meridian Biosciences)添加到每个孔中，板孵育1小时。板然后用水洗涤三次，之后将200μL以1:1000在封闭溶液中稀释的山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)二抗(目录号5220-0286；SeraCare)添加到每个孔中，持续1小时。板然后用水洗涤5次，并将200μL TrueBlue过氧化物酶底物(SeraCare)添加到每个孔中。对板进行孵育，直到菌斑清晰可见。在立体显微镜下手工计数菌斑，并与纯病毒对照进行比较，使用非线性回归曲线拟合和对数(抑制剂)-响应函数在GraphPad Prism中分析数据，以计算IC50值。
hMPV感染的LLC-MK2细胞的流式细胞术：LLC-MK2细胞在75-cm2烧瓶中以80％至90％的融合状态培养，然后在(含有100μg/mL CaCl2和5μg/mL胰蛋白酶-EDTA)中以0.1MOI被hMPV(CAN/97-83)感染。48小时后，细胞用PBS洗涤2次，并在37℃用Versene(Gibco)消化40至50分钟。细胞用PBS洗涤一次，然后转移到1.5mL试管中，制成颗粒并重新悬浮在1mL FACS缓冲液(PBS，包含5％FBS、灭活2％人血清、灭活2％山羊血清、2mM EDTA pH8.0、10％叠氮化钠)中，并孵育30分钟以封闭Fc受体。细胞用PBS洗涤三次，然后在96孔U底板中等分以进行抗体染色。小鼠抗人IgG Fc–APC(BioLegend)用于二抗。将染色细胞固定在4％多聚甲醛中，用Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪收集数据。
生物层干涉测量术的实验装置：在运行缓冲液(PBS，0.5％牛血清白蛋白[BSA]、0.05％吐温-20、0.04％硫柳汞)中获得初始基线后，将100μg/mL组氨酸标记的hMPV F蛋白固定在抗penta-HIS生物传感器尖端(FortéBio)上120秒。对于结合竞争，再次测量基线信号60秒，然后将生物传感器尖端浸入含有100μg/mL的一抗的孔中300秒。随后，将生物传感器浸入含有100μg/mL第二mAb的孔中300秒。通过将第一mAb添加到单独的第二mAb的最大信号后比较第二mAb的最大信号来确定在第一mAb存在的情况下第二mAb的结合百分比。如果第二mAb的最大结合为≥其非竞争性结合的66％，则认为mAb是非竞争的。其未竞争结合的33％-66％之间的水平被视为中间竞争，且≤33％被视为竞争。对于Fab亲和力研究，如上所述加载hMPV B2F或hMPV F BV130蛋白，并通过结合120秒并解离600秒分析降低浓度(100/75/50/12.5/0μg/mL)的Fabs或IgGs的结合。数据分析软件用于分析数据。从数据中减去不含抗体的参考孔的值，并使用局部和部分拟合曲线函数计算亲和值。结合曲线在用于数据可视化的GraphPad Prism中独立绘制。
鉴于本发明的原理可应用的许多可能的实施方式，应当认识到，所示实施方式只是本发明的示例，不应当被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的内容。
序列表
<110> 佐治亚大学研究基金会有限公司
<120> 结合人类偏肺病毒融合蛋白的抗体及其用途
<130> 8618-102433-02
<150> 62/851,020
<151> 2019-05-21
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu
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Lys Leu Ile Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Gly Val Arg Gly Gly Tyr Asn Leu Trp His Phe Asp Val Trp Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ala Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Tyr
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Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105
<210> 43
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ala Ser Ser Ser Tyr Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Ala Thr Gly Tyr Ser Ser Ile Thr Pro Tyr Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly
1 5 10 15
Cys Ser Tyr
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly
1 5 10 15
Cys Asp Tyr
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Ala Arg Val Asp Gln Tyr Cys Ile Gly Gly Val Cys Tyr Gly Gly Lys
1 5 10 15
Asn Trp Phe Asp Pro
20
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Gln Val Trp Asp Arg Asp Ser Asp His Pro Tyr Val
1 5 10
<210> 49
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Gln Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ile Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Val Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met His
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Asp Ala Ser His Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Ile
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 345
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
caggggaagt tggtggagtc tgggggaggc gtgatccaac ctgggaggtc cctaagactc 60
tcttgtgcag cctctggatt cgacttcagt cgttatggtc tccactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt attgtatacg ctggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccaaagata attctaagaa cacgatgcat 240
ctgcaaatga gcgacctgag aactgaggac acggctgttt attactgtgc gagagaccag 300
gcttttgatc tctggggcca agggacaatg gtcaccgtgt cctca 345
<210> 52
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
gacatccaga tgacccagtc tcctgcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca gggcattagc aggtctgtaa attggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatcttcgat gcatcccatt tggaaagagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggata tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacaa tatgataatc tccggatcag cttcggccaa 300
gggacacgac tcgagatcaa aa 322
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Gly
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Ile Val Tyr Ala Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Ala Arg Asp Gln Ala Phe Asp Leu
1 5
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Gln Gly Ile Ser Arg Ser
1 5
<210> 57
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Asp Ala Ser
1
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Ile Ser
1 5
<210> 59
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Trp Leu Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Lys Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Gly Ser Val Trp Tyr Asp Thr Arg Gly His Met Lys
100 105 110
Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser
115 120 125
<210> 60
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Gln Ser Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Asn Leu
85 90 95
Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 61
<211> 385
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggacgtc cctgagactc 60
acctgtgtag cgtctggatt cacattcggt acttatggca tgtactggct ccgccagtct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggccttt atatggcttg atggaagtaa gacttactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca attccaagaa taagttgtat 240
ctggaaatga acagcctgag cgccgaggac acggcgatgt actactgtgc gagagcccca 300
ggctcggttt ggtatgacac tcgtggccat atgaaagggt ggttcgaccc ctggggccag 360
ggaaccctgg tcaccgtcgc ctcag 385
<210> 62
<211> 331
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
cagtctgtgc tgactcagac accctcagtg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgaa aataattatt tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat ggtgataatc ggcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ccggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaagatg aggctgatta ttactgtgca acatgggatg acaacctgag tggtccggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt gaccgtccta g 331
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Gly Phe Thr Phe Gly Thr Tyr Gly
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Ile Trp Leu Asp Gly Ser Lys Thr
1 5
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Ala Arg Ala Pro Gly Ser Val Trp Tyr Asp Thr Arg Gly His Met Lys
1 5 10 15
Gly Trp Phe Asp Pro
20
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn Tyr
1 5
<210> 67
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Gly Asp Asn
1
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Ala Thr Trp Asp Asp Asn Leu Ser Gly Pro Val
1 5 10
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位点
<400> 69
Lys Lys Arg Lys Arg Arg
1 5
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位点
<400> 70
Arg Gln Ser Arg
1
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 裂解位点
<400> 71
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu
1 5 10 15
Lys Thr Val Ser Ala Asp
20

Claims (26)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括分别如SEQ ID NO：53、54和55所示的重链互补决定区（HCDR）1、HCDR2和HCDR3，以及所述轻链可变区包括分别如56、57和58所示的轻链互补决定区（LCDR）1、LCDR2和LCDR3，
其中单克隆抗体特异性结合人类偏肺病毒（hMPV）F蛋白并中和hMPV。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
所述VH和VL分别包括与列为SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列为至少90%相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含人类框架区。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH和VL分别包括列为SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含人恒定域。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人型抗体。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是IgG。
8.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体包含重组恒定域，该重组恒定域包含增加抗体半衰期的修饰。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述修饰增加了与新生儿Fc受体的结合。
10.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体中和A组和B组hMPV。
11.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体中和B2组hMPV。
12.根据权利要求1至4或10至11中任一项所述的抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fv、Fab、F(ab')2、scFV或scFV2片段。
14.一种偶联物，所述偶联物包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其与效应分子或可检测标记相结合。
15.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
16. 一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的VH和VL。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，所述核酸分子包含
分别如SEQ ID NO：51和52所示的VH和VL核苷酸序列。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子是cDNA序列。
19.根据权利要求16或权利要求17所述的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至启动子。
20.一种载体，所述载体包含权利要求16至19中任一项所述的核酸分子。
21. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求16至19中任一项所述的核酸分子或权利要求20所述的载体。
22.一种用于抑制hMPV感染的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的权利要求1-13中任一项所述的抗体、抗原结合片段、权利要求16至19中任一项所述的核酸分子或权利要求20所述的载体；和
药学上可接受的载体。
23. 一种用于生产与hMPV F蛋白特异性结合的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：
在宿主细胞中表达一个或多个编码权利要求1至13中任一项所述的抗体、抗原结合片段或权利要求15所述的双特异性抗体的核酸分子；和
纯化所述抗体或抗原结合片段。
24. 权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测人类受试者生物样品中hMPV存在的试剂中的用途，所述检测包括：
在足以形成免疫复合物的条件下，使生物样品与有效量的试剂接触；和
检测所述生物样品中所述免疫复合物的存在，其中所述生物样品中免疫复合物的存在指示样品中hMPV的存在。
25.根据权利要求24所述的用途，其中检测生物样本中免疫复合物的存在表明受试者具有hMVP感染。
26.权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16至19中任一项所述的核酸分子、权利要求20所述的载体、或权利要求22所述的药物组合物在制备用于抑制受试者的hMPV感染的药物或用于检测生物样品中hMPV存在的试剂中的用途。
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