CN113330030A

CN113330030A - 确定受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂治疗的方法

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Publication number: CN113330030A
Application number: CN202080009781.4A
Authority: CN
Inventors: R·奥埃特; P·桑德纳; J·R·克拉林; A·比那迪奥; A·L·弗雷塔斯德梅斯基塔巴尔巴斯; L·诺布雷; H·苏亚雷斯; G·席尔瓦
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-08-31
Also published as: WO2020148379A1; US20220128561A1; CA3126778A1; EP3911675A1

Abstract

本发明提供了一种用于确定人或动物受试者是否患有氧化应激，是否适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗，和/或是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂，特别是用sGC的活化剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：提供来自所述受试者的组织或液体样本，并确定所述样品的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达。

Description

确定受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂治疗的方法

本发明提供了一种用于确定人或动物受试者是否患有氧化应激、是否适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗，和/或是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂，特别是用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂治疗的方法。

背景技术

一氧化氮(NO)、环磷酸鸟苷(cGMP)通路(NO/cGMP通路)对于调节细胞、组织和器官功能至关重要，并在健康和疾病中发挥重要作用。众所周知，NO/cGMP通路在疾病中起着关键作用，所述疾病包括心脏、肾脏、肺、心血管、心肾和心肺疾病，例如心力衰竭、慢性和急性肾脏疾病以及肺动脉高压。这由例如来自全基因组关联研究(GWAS)的遗传证据所证实，其显示该途径中的遗传改变与多种疾病的强相关性。

简而言之，所述途径如下(还参见图6)：

1.例如由于内皮剪切应力，NO通过NO合酶催化，由L-精氨酸形成

2.NO扩散至细胞中，并与可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的β亚基的血红素部分结合

3.结合至sGC的NO激活该酶，其然后催化GTP形成cGMP

4.cGMP充当多个下游靶标的第二信使，如cGMP调节的蛋白激酶(PKG、cGK-I/cGK-II)、cGMP调节的离子通道和cGMP调节的磷酸二酯酶(PDE)以及为磷酸化和/或去磷酸化的其他下游靶标

5.cGMP被终止NO/cGMP信号的磷酸二酯酶(PDE)水解为无活性的GMP。

由于NO/cGMP在细胞、组织和身体稳态中起着关键作用，cGMP水平的降低可能会产生不想要的甚至病理生理后果。解决这种情况的治疗方法包括

·给予硝酸盐或NO供体，例如，在心绞痛的治疗中。相应的试剂酶促地或非酶促地释放NO，NO与sGC结合并激活后者，导致cGMP产生增加。该方法有一些缺点，如自由基形成、快速耐受性(tachyphylaxia)的生成和动力学限制。

·给予PDE抑制剂，如西地那非(Sildenafil)、伐地那非(Vardenafil)或他达拉非(Tadalafil)。这些试剂已用于治疗勃起功能障碍(ED)、肺动脉高压(PAH)和治疗良性前列腺增生(BPH)的体征和症状。该方法也有一些缺点，如需要足够高的NO产生和高内源性cGMP水平，所述足够高的NO产生和高内源性cGMP水平在患有ED、PAH或BPH的患者中通常很低。

为了克服所述限制，已经尝试用适合的试剂直接刺激或激活sGC。该方法的优点为其为NO非依赖性、没有自由基形成，并且其不依赖于患者体内足够高的cGMP水平。

sGC为由一个α亚基和一个含有血红素的β亚基组成的异源二聚体。β亚基由四个结构域组成：N端HNOX结构域、PAS样结构域、卷曲螺旋(coiled-coil)结构域和C端催化结构域。β亚基的HNOX结构域包含具有Fe(II)的血红素部分，其为NO的靶标。NO结合后，sGC活性增加，且形成cGMP。包含无血红素β1亚基的sGC也还称为apo-sGC。

sGC的β亚基的HNOX(血红素一氧化氮/氧结合)结构域含有血红素辅基(prosthetic heme group)，并且是在各种生物体中发现的相关传感器蛋白家族的一部分。HNOX结构域使用结合的血红素来感知气态配体，例如NO。

广为接受的是，sGC刺激剂通过直接刺激sGC起作用，其不需要NO但需要血红素辅基。因此，这种化合物类型的sGC刺激剂被定义为NO非依赖性但血红素依赖性的sGC刺激剂。sGC刺激物结合于非氧化且含有血红素的sGC(α1/β1)的α亚基，所述sGC也称为野生型sGC，其导致胞内cGMP的NO非依赖性形成和增加(Stasch等人，2001；Stasch&Hobbs 2009)。此外，当NO结合于sGC时，sGC刺激剂增强NO对cGMP的影响。因此，sGC刺激剂还表现出与NO对cGMP产生的协同作用。吲唑衍生物YC-1为第一个记载的NO非依赖性但血红素依赖性的sGC刺激剂[Evgenov等人，2006.]。基于YC-1，发现了比YC-1更有效且没有显示出对磷酸二酯酶(PDE)的相关抑制的其他物质。这导致鉴定了吡唑并吡啶衍生物BAY 41-2272、BAY 41-8543和BAY 63-2521(Riociguat)[Evgenov等人，同上]。最近发现了其他化合物类型，其具有不同的药代动力学和不同的器官分布，这可能会影响其治疗潜力[Follmann等人J.Med Chem2017]。野生型sGC的sGC刺激物的精确结合位点仍在争论中。如果从sGC中去除血红素基团，酶仍然具有可检测的催化基础活性，即cGMP仍在形成。无血红素的酶的剩余催化基础活性不能被任何上述刺激剂刺激，并且也不能被NO刺激[Evgenov等人，同上]。

这一观察很重要，因为无血红素且氧化形式的sGC(α1/β1)(也称为apo-sGC)优先存在于与氧化应激和其他病症相关的疾病中。目前的理解是，在氧化应激条件下，β1亚基中的血红素基团的Fe²⁺铁原子被氧化成Fe³⁺，其破坏了血红素基团与β1亚基的结合并使酶血红素游离。随着BAY 58-2667(Cinaciguat)的发现，发现了一种能够激活无血红素apo-sGC的新化学物质。因此，BAY 58-2667是此类sGC活化剂的原型，且此化合物类型被定义为NO非依赖性且血红素非依赖性的sGC活化剂。这些物质的共同特征是，与NO结合时，它们仅对酶的活化有累加作用，并且氧化酶或无血红素的酶的活化明显高于含血红素的酶的活化[Evgenov等人,同上；J.P.Stasch等人,Br.J.Pharmacol.136(2002),773；J.P.Stasch等人,J.Clin.Invest.116(2006),2552]。光谱研究表明BAY 58-2667取代了β1亚基中的氧化的血红素基团，由于铁-组氨酸键的减弱，所述血红素基团仅微弱地连接至sGC。还已经表明，特征性sGC血红素结合基序(motif)Tyr-x-Ser-x-Arg对于血红素基团的带负电荷的丙酸的相互作用和BAY 58-2667的作用都是绝对必要的。因此，假设BAY 58-2667在sGC的结合位点与β1亚基中的血红素基团的结合位点相同。[J.P.Stasch等人,J.Clin.Invest.116(2006),2552]。最近发现了其他类别的sGC活化剂，其在药代动力学和器官分布方面都不同，这可能会影响它们的治疗潜力。

本发明的另一个目的为提供工具和方法以鉴定患有氧化应激和/或适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗的患者。

本发明的另一个目的为提供工具和方法以鉴定适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)激动剂，特别是用sGC活化剂治疗的患者。

发明内容

根据本发明的独立权利要求的方法和手段可以满足这些和其他目的。从属权利要求涉及特定实施方案。

本发明的实施方案

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的装置或组合物的特定组成部分或结构特征，或所描述的方法的工艺步骤，因为此类装置和方法可能变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图是限制性的。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施的纯粹事实并不表明不能有利地使用这些措施的组合。在权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。必须指出，除非上下文中另有明确规定，在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括单数/复数对象。此外，在权利要求中，“包括”一词不排除其他要素或步骤。

此外，应当理解，在给出由数值界定的参数范围的情况下，该范围被认为包括这些限定值。

还应理解，本文公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单个实施方案。与一个实施方案一起讨论的特征还意在与本文所示的其他实施方案一起公开。在一种情况下，如果特定特征没有在一个实施方案中公开，而在另一个实施方案中公开，技术人员将理解这并不一定意味着所述特征不打算与所述其他实施方案一起公开。技术人员将理解，本申请的主旨是还为其他实施方案公开所述特征，但这只是为了清楚的目的并且保持本说明书的长度易于管理。还应理解，本文提及的现有技术文件的内容以引用的方式并入，例如，为了实现目的，即，例如当讨论方法时，其细节记载于所述现有技术文件中。这种方法有助于保持本说明书的长度易于管理。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于确定人或动物受试者是否

·患有氧化应激

·是否适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗，和/或

·是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂，特别是用sGC的活化剂治疗的方法，

所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述受试者的组织或液体样本，和

b)确定所述样品的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、过表达或上调。

·患有氧化应激

·是否适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗，和/或

·是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂治疗的方法，

所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述受试者的组织或液体样本，和

这包括用于确定人或动物受试者是否患有氧化应激/来自细胞正常氧化还原状态的干扰/活性氧与身体清除他们的能力间的不平衡的方法，所述方法包括以下步骤：

·提供来自所述受试者的组织或液体样本，和

·确定所述样本的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、过表达或上调。

这还包括用于确定人或动物受试者是否适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

·提供来自所述受试者的组织或液体样本，和

这还包括用于确定人或动物受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

·提供来自所述受试者的组织或液体样本，和

如本文所用，术语“包含无血红素β1亚基的sGC的存在”意指在所述样本中，可通过组织化学、免疫学或分子方法确定包含无血红素β1亚基的此类sGC。

如本文所用，术语“包含无血红素β1亚基的sGC的过表达”意指与其在相同类型的组织的正常细胞(无疾病)中测量的水平相比，在类似条件下在给定组织的细胞中表达的包含无血红素β1亚基的sGC的水平升高至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，甚至更优选至少20％，甚至更优选至少25％，甚至更优选至少30％或至少40％或至少50％。所述表达水平可以通过本领域已知的多种技术来测定，包括但不限于定量RT-PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学和以上方法的适合的衍生方法。

如本文所用，术语“包含无血红素β1亚基的sGC的上调”意指与其在相同类型的组织的正常细胞(无疾病)中测量的水平相比，在类似条件下在给定组织的细胞中包含无血红素β1亚基的sGC的表达的基因调控提高至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，甚至更优选至少20％，甚至更优选至少25％，甚至更优选至少30％或至少40％或至少50％。

如本文所用，术语“氧化应激被定义为活性氧(自由基、ROS)的产生与抗氧化防御之间的平衡紊乱。ROS包括但不限于超氧阴离子·O^-、过氧化氢H₂O₂、羟基自由基·OH、有机氢过氧化物ROOH、烷氧基和过氧自由基RO·和ROO·、过氧亚硝酸盐ONOO^-。

如本文所用，术语“抗氧化剂”是指能够抑制另一实体的氧化的分子。氧化为一种可以产生自由基的化学反应，从而导致可以损害生物体的细胞的链式反应。例如硫醇或抗坏血酸(维生素C)的抗氧化剂会终止这些链式反应。抗氧化剂可分为初级抗氧化剂和次级抗氧化剂。生物抗氧化剂包括定义明确的酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硒谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶。非酶生物抗氧化剂包括生育酚和生育三烯酚、类胡萝卜素、醌、胆红素、抗坏血酸、尿酸和金属结合蛋白。各种为脂质性和水溶性的抗氧化剂发现于细胞和组织的所有部分中，尽管每种特定的抗氧化剂通常表现出特征性的分布模式。所谓的卵硫醇，其为巯基组氨酸衍生物，还能非酶促地分解过氧化物。

如本文所用，术语“自由基清除剂”涉及能够结合和解毒自由基的抗氧化剂亚组。实例包括丁硫氨酸亚砜亚胺、维生素C、吲哚美辛、布洛芬、N-乙酰半胱氨酸或阿司匹林。

根据本发明的一个实施方案，所述可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂为一种激活氧化的、无血红素的sGC异二聚体(α1/β1或α2/β1)以催化cGMP的形成的分子。

如本文所用，“活化剂”、“可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂”、“sGC活化剂”或“血红素非依赖性sGC活化剂”是与sGC的氧化或无血红素形式相互作用的活性化合物，其激活氧化或无血红素形式的sGC以催化cGMP的形成。应理解为与对照，即未处理的对照相比，一种使cGMP的测定产量增加至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，甚至更优选至少20％，甚至更优选至少25％，甚至更优选至少30％或至少40％或至少50％的化合物。当考虑本公开内容的教导时，适合的对照对于技术人员是显而易见的。对于技术人员而言，从相关文献中易于获得用于测定所述活化的适合的测定法。在本发明的一个实施方案中，使用下文描述的测定法“重组可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的体外活化”来测定所述活化。该测定法适于区分血红素依赖性sGC刺激剂和血红素非依赖性sGC活化剂。

优选地，可溶性鸟苷酸环化酶为人可溶性鸟苷酸环化酶。

根据本发明的一个实施方案，所述可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂为选自以下活化剂的至少一种：

·4-({(4-羧基丁基)[2-(2-{[4-(2-苯基乙基)苄基]氧基}苯基)乙基]氨基}甲基)苯甲酸

·5-氯-2-(5-氯噻吩-2-磺酰氨基-N-(4-(吗啉-4-磺酰基)苯基)苯甲酰胺钠盐

·2-(4-氯苯磺酰氨基)-4,5-二甲氧基-N-(4-(硫代吗啉-4-磺酰基)苯基)苯甲酰胺

·1-{6-[5-氯-2-({4-反-4-}三氟甲基)环己基]苄基}氧基)苯基]吡啶-2-基}-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸

·1-[6-(2-(2-甲基-4-(4-三氟甲氧基苯基)苄氧基)苯基)吡啶-2-基]-5-三氟甲基吡唑-4-羧酸

·1[6-(3,4-二氯苯基)-2-吡啶基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸

·1-({2-[3-氯-5-(三氟甲基)苯基]-5-甲基-1,3-噻唑-4-基}甲基)-1H-吡唑-4-羧酸

·4-({2-[3-(三氟甲基)苯基]-1,3-噻唑-4-基}甲基)苯甲酸

·1-({2-[2-氟-3-(三氟甲基)苯基]-5-甲基-1,3-噻唑-4-基}甲基)-1H-吡唑-4-羧酸

·3-(4-氯-3-{[(2S,3R)-2-(4-氯苯基)-4,4,4-三氟-3-甲基丁酰基]氨基}苯基)-3-环丙基丙酸

·5-{[2-(4-羧基苯基)乙基][2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)联苯基-4-基]甲氧基}苯基)乙基]氨基}-5,6,7,8-四氢喹啉-2-羧酸分子式

·5-{(4-羧基丁基)[2-(2-{[3-氯-4'-(三氟甲基)联苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]氨基}-5,6,7,8-四氢喹啉-2-羧酸的分子式

·(1R,5S)-3-[4-(5-甲基-2-{[2-甲基-4-(哌啶-1-基羰基)苄基]氧基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸

·1-[6-(5-甲基-2-{[2-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基]甲氧基}苯基)吡啶-2-基]-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸

·4-[[(4-羧基丁基)[2-[2-[[4-(2-苯基乙基)苯基]甲氧基]苯基]乙基]氨基]甲基]苯甲酸

·BAY 60-2770 4-({(4-羧基丁基)[2-(5-氟-2-{[40-(三氟甲基)联苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]氨基}甲基)苯甲酸)。

在以下出版物之一中公开了本发明上下文中的其他sGC活化剂：WO2013/157528、WO2015/056663、WO2009/123316、WO2016/001875、WO2016/001876、WO2016/001878、WO2000/02851、WO2012/122340、WO2013/025425、WO2014/039434、WO2016/014463、WO2009/068652、WO2009/071504、WO2010/015652、WO2010/015653、WO2015/033307、WO2016/042536、WO2009/032249、WO2010/099054、WO2012/058132、US2010/0216764、WO01/19776、WO01/19780、WO01/19778、WO02/070459、WO02/070460、WO02/070510、WO02/070462、WO2007/045366、WO2007/045369、WO2007/045433、WO2007/045370、WO2007/045367、WO2014/012935、WO2014/012934、WO2011/141409、WO2008/119457、WO2008/119458、WO2009/127338、WO2010/102717、WO2011/051165、WO2012/076466、WO2012/139888、WO2013/157528、WO2013/174736、WO2014/012934、WO2015/056663、WO2017103888、WO2017112617、WO2016042536、WO2016081668、WO2016191335、WO2016191334、WO2016001875、WO2016001876、WO2016001878、WO2016014463、WO2016044447、WO2016044445、WO2016044446、WO2015056663、WO2015033307、WO2015187470、WO2015088885、WO2015088886、WO2015089182、WO2014084312、WO2014039434、WO2014144100、WO2014047111、WO2014047325、WO2013025425、WO2013101830、WO2012165399、WO2012058132、WO2012122340、WO2012003405、WO2012064559、WO2011149921、WO2011119518、WO2011115804、WO2011056511、CN101670106、TW201028152、WO2010015653、WO2010015652、WO2010099054、WO2010065275、WO2009123316、WO2009068652、WO2009071504、WO2009032249、US2009209556。

根据本发明的一个实施方案，在确定所述样品的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达的步骤中，使用结合分子，其选择性地结合包含无血红素β1亚基的sGC。

如本文所用，术语“选择性地结合包含无血红素β1亚基的sGC”意指此类结合分子对(i)包含无血红素β1亚基的sGC比对(ii)包含天然的、含血红素的β亚基的野生型sGC具有显著更高的结合亲和力和/或选择性。

如本文所用，术语“结合亲和力”是指根据本发明的结合分子对其靶标——包含无血红素β1亚基的sGC——的亲和力，并使用“K_D”值以数字表示。通常，较高的K_D值对应较弱的结合。在一些实施方案中，“K_D”通过放射性标记抗原结合测定法(MA)或使用例如BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000的表面等离子共振(SPR)测定法来测量。在某些实施方案中，“结合速率(on-rate)”或“缔合的速率”或“缔合速率(association rate)”或“k_on”和“解离速率(off-rate)”或“解离的速率”或“解离速率(dissociation rate)”或“k_off”也用表面等离子共振(SPR)技术测定。在额外的实施方案中，使用

Systems(Pall Life Sciences)测量“K_D”、“k_on”和“k_off”。

如本文所用，术语“选择性”描述根据本发明的结合分子的特征，以比其结合其他蛋白(包括天然的、包含血红素的β亚基)低约1000倍、500倍、200倍、100倍、50倍或约10倍的K_D结合其靶标——包含无血红素β1亚基的sGC，例如通过表面等离子共振(SPR)所测量的。

如本文所用，术语根据本发明的结合分子的“更高的结合亲和力”和“更高的选择性”表明根据本发明的结合分子的相应参数对于包含无血红素β1亚基的sGC比对于天然的、含血红素的β亚基高至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，甚至更优选至少20％，甚至更优选至少25％，甚至更优选至少30％或至少40％或至少50％。

根据本发明的一个实施方案，所述结合分子为抗体或其保留靶标结合能力的片段或衍生物、抗体模拟物或适配体。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，特定的多肽序列还隐含地包括其保守修饰的变体。

本文中氨基酸可以通过它们通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号来指代。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来指代。

如本文所用，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，其优选由通常通过二硫键相互连接的4条多肽链——2条重(H)链和2条轻(L)链组成。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区可以包含例如3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区域可以进一步分成高变异性区域(称作互补决定区(CDR))，所述区域内夹杂着更保守的区域(称作框架区(FR))。每个VH和VL通常由3个CDR和最高达4个FR组成，从氨基末端至羧基末端，例如以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

如本文所用，术语“互补决定区”(CDR；例如CDR1、CDR2和CDR3)指抗体可变域的氨基酸残基，其存在为抗原结合所必需。每个可变域通常具有三个CDR区，称为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(例如，大约在轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmulologicalInterest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，大约在轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk；J Mol Biol 196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可以包含来自根据Kabat定义的CDR区的氨基酸和高变环的氨基酸。

根据完整抗体的重链的恒定域的氨基酸序列，完整抗体可以被分为不同的“类别”。完整抗体有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中一些可以被进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。用于本发明的优选类别的免疫球蛋白为IgG。

对应于不同类别的抗体的重链恒定域分别被称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。如本文所用，抗体为常规已知的抗体及其功能片段。

抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”或“片段”在此定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如，IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个超可变区，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区；然而，可变“框架”区还可以在抗原结合中发挥重要作用，例如通过为CDR提供支架。优选地，所述“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的4至103位氨基酸残基和可变重(HL)链的5至109位氨基酸残基，更优选包含VL的3至107位氨基酸残基和VH的4至111位氨基酸残基，特别优选的为完整的VL和VH链(VL的1至109位氨基酸和VH的1至113位氨基酸；根据WO 97/08320编号)。

实例为

·CDR(互补决定区)，

·高变区，

·可变域(Fv)，

·IgG重链(由VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区组成)，

·IgG轻链(由VL区和CL区组成)，和/或

·Fab和/或F(ab)₂。

本发明的“功能片段”、“抗原结合抗体片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂和Fv片段；双体；单域抗体(DAb)、线性抗体；单链抗体分子(scFv)；和多特异性，例如由抗体片段形成的双特异性抗体和三特异性抗体(CA K Borrebaeck，编辑(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),OxfordUniversity Press；R.Kontermann&S.Duebel,编辑(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。“多特异性”或“多功能”抗体以外的抗体被理解为使其每个结合位点相同。F(ab')₂或Fab可以设计成最小化或完全去除CH1和CL结构域间产生的分子间二硫键相互作用。

本文中术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其含有恒定区的至少一部分。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所记载。

本发明中涵盖的抗体或抗原结合抗体片段的变体为其中维持了抗体或抗原结合抗体片段的结合活性的分子。

本发明中涵盖的“结合蛋白”是例如抗体模拟物，例如亲合体(Affibody)、连接蛋白(Adnectins)、Anticalins、DARPins、高亲和性多聚体(Avimers)、纳米抗体(Nanobody)(由Gebauer M.等人,Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13:245-255；Nuttall S.D.等人,Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8:608-617综述)。

“人”抗体或其抗原结合片段在此定义为不是嵌合的(例如，不是“人源化的”)并且不是(全部或部分地)来自非人物种的抗体。人抗体或其抗原结合片段可以源自人或可以为合成人抗体。在本文中“合成人抗体”定义为具有全部或部分计算机衍生自基于已知人抗体序列分析的合成序列的序列的抗体。人抗体序列或其片段的计算机设计可以例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用从那里获得的数据设计多肽序列来实现。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是由从人源的抗体序列文库(例如，这类文库是基于取自人天然来源的抗体)分离的核酸编码的抗体。人抗体的实例包括如在

等人,Nature Biotech.2000,18:853-856中记载的抗体。

在本文中“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段定义为这样的抗体:(i)源自非人源(例如，具有异源免疫系统的转基因小鼠)，其抗体基于人种系序列；(ii)其中非人抗体的框架区的氨基酸通过基因工程部分交换为人氨基酸序列或(iii)CDR移植的，其中可变域的CDR来自非人源，而可变域的一个或多个框架为人源的，且恒定域(如果存在)为人源的。

在本文中“嵌合抗体”或其抗原结合片段定义为这样的抗体，其中可变域源自非人源且一些或全部恒定域源自人源。

本文中所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群获得的抗体，即除了可能的突变(例如，可能少量存在的天然发生的突变)外，构成群体的各个抗体是相同的。因此，术语“单克隆”表示该抗体的特征不是离散抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优势在于它们通常不会被其他免疫球蛋白污染。术语“单克隆”不应解释为需要通过任一特定方法产生抗体。术语单克隆抗体具体包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

“分离的抗体”为已被鉴定并从表达它的细胞的组分分离出的抗体。细胞的污染物组分为会干扰诊断或抗体治疗用途的物质，且可能包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。

如本文所用，抗体“特异性结合至”、“特异性于/针对”或“特异性识别”目的抗原(例如肿瘤相关的多肽抗原靶标)，是以足够的亲和力结合抗原使得抗体可用作靶向表达抗原的细胞或组织的治疗剂，并且不与其他蛋白质显著交叉反应或不与前述抗原靶标的直向同源物和变体以外的蛋白质(例如突变形式、剪接变体或蛋白水解截短形式)显著交叉反应。如本文所用，术语“特异性识别”或“特异性结合至”或“特异性于/针对”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可以例如通过抗体或其抗原结合片段展示，所述抗体或其抗原结合片段对小于约10^-4M，或者小于约10^-5M，或者小于约10^-6M，或者小于约10^-7M，或者小于约10^-8M，或者小于约10^-9M，或者小于约10^-10M，或者小于约10^-11M，或者小于约10^-12M，或更少的抗原具有单价K_D。如果该抗体能够区分该抗原和一种或多种参考抗原，则抗体“特异性结合至”、“特异性于/针对”或“特异性识别”抗原。在其最通常的形式中，“特异的结合”、“特异性结合至”、“特异性于/针对”或“特异性识别”是指抗体区分目的抗原和无关抗原的能力，其例如根据以下方法之一确定。此类方法包括但不限于表面等离子共振(SPR)、蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。评分可以通过标准显色来进行(例如带有辣根过氧化物酶的二抗和带有过氧化氢的四甲基联苯胺)。某些孔中的反应通过光密度评分，例如在450nm处。典型的背景(＝阴性反应)可以为0.1OD；典型的阳性反应可以为1OD。这意味着阳性/阴性差异大于5倍、10倍、50倍，且优选大于100倍。通常，结合特异性的测定不是通过使用单个参考抗原，而是一组约3至5个无关抗原(例如奶粉、BSA、转铁蛋白等)来进行的。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。

与参考抗体“结合相同表位的抗体”或与参考抗体“竞争结合的抗体”指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更多的抗体，反之，参考抗体在竞争测定中阻断抗体与其抗原的结合达50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。

相对于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分比(％)”分别定义为在比对序列并引入缺口后(如果需要的话)，候选序列中的核酸或氨基酸残基分别与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸残基分别相同的百分比，以实现最大的序列同一性百分比。保守置换不被视为序列同一性的一部分。优选的是无缺口对齐。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以在本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定比对序列的的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大对比所需的任何算法。

“序列同源性”表示相同或代表保守氨基酸置换的氨基酸的百分比。

术语“成熟抗体”或“成熟的抗原结合片段”(例如成熟的Fab变体)包括抗体或抗体片段的衍生物，其表现出与给定的抗原，例如靶蛋白的胞外结构域的更强的结合——即以增加的亲和力结合。成熟是鉴定少量突变，例如在导致这种亲和力增加的抗体或抗体片段的6个CDR内的过程。成熟过程是将突变引入抗体和筛选鉴定改良结合物的分子生物学方法的组合。

术语“药物制剂”/“药物组合物”指这样的制剂,其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将给予该制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外成分。

如本文所用，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够增殖与其连接的另一核酸。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”、“转化细胞”、“转染体”、“转染细胞”和“转导细胞”，其包括原代转化/转染/转导细胞及其衍生的不考虑传代次数的子代。子代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能包含突变。具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变子代包括在本文中。

抗体的序列不同，不仅在其互补决定区(CDR)内，而且在框架(FR)内。这些序列差异编码于不同的V基因中。人抗体种系库已完全测序。约有50个功能性VH种系基因,根据序列同源性VH1、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6，其可分为六个亚家族(Tomlinson等人,1992,J.Mol.Biol.227,776-798；Matsuda&Honjo,1996,Advan.Immunol.62,1-29)。已知包含7个亚家族的约40个功能性VLκ基因(Cox等人,1994,Eur.J.Immunol.24,827-836；Barbie&Lefranc,1998,Exp.Clin.Immunogenet.15,171-183)：Vkappa1、Vkappa2、Vkappa3、Vkappa4、Vkappa5、Vkappa6和Vkappa7。本文分别公开了属于人VH2亚家族的本发明的抗体的重链和属于人Vkappa1亚家族的本发明的抗体的轻链。已知属于同一亚家族的抗体的框架序列密切相关，例如包含人VH3亚家族成员的抗体都具有相当的稳定性(Honegger等人,2009,Protein Eng Des Sel.22(3):121-134)。本领域熟知来自抗体的CDR可以移植到不同的框架上，同时保持相应来源抗体的特殊特征。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含如表1中描述的本发明的抗体的至少一个CDR序列和人可变链框架序列。

在优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含如表1中描述的本发明的可变轻链或包含可变轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列的轻链抗原结合区，以及可变重链或包含可变重链抗体的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列的重链抗原结合区，以及人可变轻链和人可变重链框架序列。

本发明的抗体可以为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgA、IgD、IgE、IgM，而抗体片段可以为例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH或scFv。因此，本发明的抗体片段可以是或可以包含以如本文所述的一种或多种方式表现的抗原结合区。

在优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段为单克隆的。

在一些实施方案中，分离本发明的抗体或其抗原结合片段或编码其的核酸。分离的生物组分(例如核酸分子或蛋白质，例如抗体)是已与该组分天然存在其中的生物体的细胞中的其他生物组分(即,其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器)中基本分离或从中纯化的生物组分。该术语还包括核酸和通过在宿主细胞中重组表达制备的蛋白以及化学合成的核酸。

适配体是对预定靶标具有特异性结合特性的寡核苷酸。它们通过名为SELEX(“指数富集的配体系统进化”)的组合过程从包含最高达10¹⁵个不同序列的随机合成文库中获得。适配体特性由它们的3D形状决定，其由初级序列驱动的分子内折叠产生。适配体3D结构非常适合通过氢键、静电和堆叠相互作用识别其同源靶标。适配体通常表现出高亲和力(K_d对小分子约为微摩尔(μM)，对蛋白为皮摩尔(pM))。例如，在Blind和Blank 2015(其通过引用并入本文)中给出了关于生成靶标特异性适体的技术库的概述。适配体还可以被递送到胞内空间中，如在Thiel和Giangrande(2010)中所记载，其通过引用并入本文。

抗体生成

本发明的抗体可源自重组抗体文库，其基于已从大量健康志愿者的抗体中分离的氨基酸序列，例如使用

技术将完全人CDR重组到新的抗体分子中(Carlson&

Expert Rev Mol Diagn.2001 May；1(1):102-8)。或者，例如Hoet RM等人,NatBiotechnol 2005；23(3):344-8中所述的作为完全人抗体噬菌体展示文库的抗体文库可用于分离(Apo-sGC)特异性抗体。从人抗体文库中分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。

可以通过给予转基因动物免疫原来进一步制备人抗体，所述转基因动物已经被改良响应于抗原挑战(antigenic challenge)以产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。例如，可以进行基因工程小鼠的免疫，尤其是hMAb小鼠的免疫(例如VelocImmune

或

)。

可以使用杂交瘤技术产生其他抗体(例如，参见

和MilsteinNature.1975 Aug 7；256(5517):495-7)，产生例如可以转化为嵌合或人源化抗体的鼠、大鼠或兔抗体。人源化抗体及其制备方法在例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述，并进一步描述于例如，Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；US专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组(FRshuffling)”)；和Osboum等人,Methods 36:61-68(2005)以及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择(guided selection)”方法)。

提供了使用重组抗体文库产生抗体和免疫小鼠以及随后人源化的实例。

肽变体

本发明的抗体或抗原结合片段不限于本文提供的特定肽序列。相反，本发明还包括这些多肽的变体。参考本公开内容和常规可用的技术以及参考文献，技术人员将能够制备、测试和利用本文公开的抗体的功能性变体，同时理解这些具有结合apo-sGC能力的变体落入本发明的范围内。

相对于本文公开的肽序列，变体可以包括，例如，具有至少一个改变的互补决定区(CDR)(超可变)和/或框架(FR)(可变)结构域/位置的抗体。

通过改变CDR或FR区中的一个或多个氨基酸残基，技术人员通常可以产生突变的或多样化的抗体序列，例如可以针对抗原对其筛选新的或改进的特性。

本发明的另一个优选实施方案为如表2中示出的其中选择VH和VL序列的抗体或抗原结合片段。技术人员可以使用表2中的数据来设计在本发明范围内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体；变体还可能具有一个或多个改变的框架区。还可以在框架区中进行改变。例如，当与种系序列相比残基中存在偏差时，肽FR结构域可能改变。

或者，使用例如由Knappik A.,等人,JMB 2000,296:57-86描述的方法，技术人员可以通过将本文公开的氨基酸序列与此类抗体的同类已知序列比较来进行相同的分析。

此外，可以使用一种抗体作为进一步优化的起点，通过将抗体中的一个或多个氨基酸残基(优选在一个或多个CDR中的氨基酸残基)多样化来获得变体，并通过筛选所得抗体变体的集合得到具有改进特性的变体。特别优选的是CDR3的VL和/或VH中的一个或多个氨基酸残基的多样化。多样化可以通过例如使用三核苷酸诱变(TRIM)技术(

B.等人,Nucl.Acids Res.1994,22:5600.)合成DNA分子的集合来完成。抗体或其抗原结合片段包括具有修饰/变异的分子，其包括但不限于例如导致改变的半衰期的修饰(例如Fc部分的修饰或其他分子如PEG的连接)、改变的结合亲和力或改变的ADCC或CDC活性。

保守氨基酸变体

可以制备保留本文所述抗体肽序列的整体分子结构的多肽变体。给定单个氨基酸的特性，技术人员将认识到一些合理的置换。氨基酸置换，即，“保守置换”，可以基于，例如，极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性，和/或所涉及的残基的两亲性质的相似性来进行。

例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及(d)带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。置换通常可以在组(a)-(d)内进行。此外，甘氨酸和脯氨酸可以根据它们破坏α-螺旋的能力相互置换。同样，某些氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更常见于α-螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更常见于β折叠片层中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸通常发现于转角中。一些优选的置换可以在以下组中进行：(i)S和T；(ii)P和G；(iii)A、V、L和I。鉴于已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，有技能的科学家可以容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。

糖基化变体

在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与其相连的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N键连接至Asn297(使用Fc区的CH2结构域的Kabat EU编号)；参见，例如，Wright等人Trends Biotechnol.15:26-32(1997)。

在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。向抗体添加或删除糖基化位点可以通过改变表达系统(例如宿主细胞)和/或通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地完成。

在本发明的一个实施方案中，通过在原核宿主中表达来制备具有降低的效应子功能的无糖基抗体或抗体衍生物。适合的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的多个种。

在一个实施方案中，提供具有降低的效应子功能的抗体变体，其特征在于在所述抗体的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的修饰。在本发明的一个实施方案中，修饰包括重链糖基化位点处的突变以防止该位点处的糖基化。因此，在本发明的一个优选实施方案中，无糖基抗体或抗体衍生物通过重链糖基化位点处的突变(即使用Kabat EU编号的N297的突变)来制备并在合适的宿主细胞中表达。

在本发明的另一个实施方案中，无糖基抗体或抗体衍生物具有降低的效应子功能，其中在所述抗体或抗体衍生物的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点的修饰包括去除CH2结构域聚糖，即去糖基化。这些无糖基抗体可以通过常规方法产生，然后酶促去糖基化。抗体的酶促去糖基化方法为本领域所熟知的(例如Winkelhake&Nicolson(1976),JBiol Chem.251(4):1074-80)。

在本发明的另一个实施方案中，去糖基化可以使用糖基化抑制剂衣霉素来实现(Nose&Wigzell(1983),Proc Natl Acad Sci USA,80(21):6632-6)。即，修饰为防止在所述抗体的Fc部分的CH2结构域中保守N-连接位点处的糖基化。

在一个实施方案中，提供了具有缺乏(直接或间接地)连接至Fc区的岩藻糖的糖结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量是通过以下方式来确定的：计算相对于通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn 297相连的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，Asn297处糖链内的岩藻糖的平均量，例如，如在WO 2008/077546中所记载。Asn297指位于Fc区约第297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297还可能位于第297位的上游或下游约±3个氨基酸处，即第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可能具有提高的ADCC功能。

与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的实例包括：Okazaki等人J Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。

能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括：蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripk等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；和WO 2004/056312)，和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006))。

还提供具有等分型寡糖的抗体变体，例如，其中连接至抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可能具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例记载在例如WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546中。

还提供了在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可能具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载在例如，WO1997/30087；WO1998/58964；和WO1999/22764中。

Fc区变体

在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰(例如置换)引入本文提供的抗体的Fc区(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，从而产生Fc区变体。

在某些实施方案中，本发明涉及具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，所述具有一些但不是全部效应子功能使其成为抗体在体内的半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的应用中的理想候选。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/削弱。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致改变的(即，改善或减弱)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

在某些实施方案中，本发明涉及具有增加或减少的半衰期的抗体变体。具有增加的半衰期且与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,JImmunol.117:587(1976)和Kim等人,J Immunol.24:249(1994))结合增强的抗体记载在US2005/0014934(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其改善了Fc区与FcRn的结合。

本发明的DNA分子

本发明还涉及编码本发明抗体或其抗原结合片段的DNA分子。这些序列在某些情况下针对哺乳动物表达进行了优化。本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中的DNA变体可以通过参考它们在杂交中的物理特性来描述。技术人员将认识到，DNA可用于鉴定其补体，并且由于DNA为双链，使用核酸杂交技术可用于鉴定其等价物或同源物。还将认识到，杂交可以以小于100％的互补性发生。然而，如果选择适当条件，杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分它们。有关此类条件的指导参见Sambrook等人1989同上和Ausubel等人,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.编辑(1995).Current Protocols inMolecular Biology.New York:John Wiley and Sons)。

两条多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为在两条序列将彼此杂交的条件下的“严格性”的函数。如本文所用，术语“严格性”指条件不利于杂交的程度。严格的条件强烈不利于杂交，在这种条件下，只有结构最相关的分子才会相互杂交。相反，非严格条件有利于显示较低程度结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两条核酸序列的结构关系直接相关。

杂交严格性是许多因素的函数，包括整体DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的试剂的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、更长的探针尺寸和不存在破坏氢键的试剂。杂交通常分两个阶段进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。

功能等价的DNA变体

本发明范围内的另一类DNA变体可以参照其编码的产物进行描述。由于遗传密码的简并性，这些功能等价的多核苷酸的特征在于其编码相同的肽序列的事实。

认识到本文提供的DNA分子的变体可以多种不同的方式进行构建。例如，它们可以构建为完全合成的DNA。有效合成寡核苷酸的方法是广泛可得的。参见Ausubel等人，第2.11节，增刊21(1993).Overlapping oligonucleotides may be synthesized and assembledin a fashion first reported by Khorana等人,J.Mol.Biol.72:209 217(1971)；还参见Ausubel等人，同上，第8.2节。优选地，合成DNA设计有方便的限制性位点，其在基因的5'和3'端进行改造以促进克隆至合适的载体中。

如所指出的，产生变体的方法是从本文公开的DNA之一开始，然后进行定点诱变。参见Ausubel等人，同上，第8章，增刊37(1997)。在典型的方法中，目标DNA被克隆至单链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA并与含有所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，并将双链噬菌体引入宿主中。一些产生的子代将含有所需突变体，其可以使用DNA测序进行确认。此外，增加子代噬菌体成为所需突变体的可能性的多种方法是可得的。这些方法为本领域技术人员所熟知，并且用于产生此类突变体的试剂盒为市售可得的。

重组DNA构建体和表达

本发明还提供了包含一种或多种本发明核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体可与载体如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体结合使用，其中插入了编码本发明抗体或其抗原结合片段或其变体的DNA分子。

本文提供的抗体、抗原结合部分或其变体可以通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备。为了重组表达抗体、抗原结合部分或其变体，可以用一种或多种携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达。使用标准重组DNA方法来制备和/或获得编码重链和轻链的核酸，将这些核酸并入重组表达载体并将所述载体引入宿主细胞中，例如在Sambrook、Fritsch和Maniatis(编辑),Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.等人(编辑)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)和在Boss等人的美国专利号4,816,397中所记载的那些。

此外，可以将编码重链和/或轻链可变区的核酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或scFv的核酸序列。编码VL或VH的DNA片段可以可操作地连接(使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列在阅读框内)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列为本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和人类服务部，NIH出版号91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。

为了产生编码scFv的多核苷酸序列，可以将编码VH和VL的核酸可操作地连接至编码柔性接头的另一个片段，使得可以将VH和VL序列表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区由柔性接头连接(参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554)。

为了表达抗体、其抗原结合片段或其变体，可以使用标准重组DNA表达方法(参见例如Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990))。例如，可以将编码所需多肽的DNA插入表达载体中，然后将其转染至适合的宿主细胞中。适合的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为例如细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫和昆虫细胞、植物和植物细胞、转基因动物或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入至不同的载体中。在其他实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入至同一载体中。应当理解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)受多种因素影响，例如宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平以及表达是组成型还是诱导型。

因此，本发明的一个实施方案还是包含载体或核酸分子的宿主细胞，其中宿主细胞可以为高等真核宿主细胞(例如哺乳动物细胞)、低等真核宿主细胞(例如酵母细胞)并且可以为原核细胞(例如细菌细胞)。

本发明的另一个实施方案是一种使用宿主细胞产生抗体和抗原结合片段的方法，其包括在适合的条件下培养宿主细胞并回收所述抗体。

因此，本发明的另一个实施方案是用本发明的宿主细胞产生根据本发明的抗体并将这些抗体纯化至至少95％重量均质性。

细菌表达

用于细菌用途的有用的表达载体是通过将编码所需蛋白质的DNA序列与适合的翻译起始和终止信号一起在可操作的阅读阶段与功能启动子一起插入来构建的。载体将包含一种或多种表型选择标记和复制起点以确保维持载体，并且(如果需要)在宿主内提供扩增。用于转化的适合的原核宿主包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌，以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的多个种。

细菌载体可以是例如基于噬菌体、基于质粒或基于噬菌粒的。这些载体可以包含可选择标记和细菌复制起点，所述复制起点来源于市售可得的质粒，其通常含有熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件。在转化适合的宿主菌株并且宿主菌株生长至适当细胞密度后，通过合适的方式(例如，温度变化或化学诱导)去抑制/诱导选定的启动子，并且将细胞额外培养一段时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，并保留所得的粗制提取物用于进一步纯化。

在细菌系统中，可以根据所表达的蛋白质的预期用途有利地选择多种表达载体。例如，当要产生大量此类蛋白质时，为了产生抗体或筛选肽文库，例如，指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体可能是合乎需要的。

因此，本发明的一个实施方案是包含编码本发明的新型抗体的核酸序列的表达载体。

本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物和通过重组技术从原核宿主产生的产物，所述原核宿主包括例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的多个种，优选来自大肠杆菌细胞。

哺乳动物表达

用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)的启动子/增强子(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)的启动子/增强子(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒的启动子/增强子(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤的启动子和/或增强子。抗体的表达可以是组成型或受调控的(例如通过添加或去除小分子诱导物(如四环素)与Tet系统结合进行诱导)。对于病毒调控元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的U.S.5,168,062、Bell等人的U.S.4,510,245和Schaffner等人的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017)。适合的选择标记包括赋予药物抗性的基因，例如，G418、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素(blasticidin)、zeocin/博来霉素(bleomycin)或甲氨蝶呤，或利用已引入载体的宿主细胞上的营养缺陷的选择标记，例如谷氨酰胺合成酶(Bebbington等人,Biotechnology(N Y).1992Feb；10(2):169-75)。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，neo基因赋予对G418的抗性，土曲霉(Aspergillus terreus)的bsd基因赋予对杀稻瘟菌素的抗性，嘌呤霉素N-乙酰转移酶赋予对嘌呤霉素的抗性，Sh ble基因产物赋予对zeocin的抗性，以及由大肠杆菌潮霉素抗性基因(hyg或hph)赋予的对潮霉素的抗性。选择标记(如DHFR或谷氨酰胺合成酶)还可用于与MTX和MSX结合的扩增技术。

可以使用标准技术，例如电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、脂质体转染、基于聚阳离子的转染(例如基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染和DEAE-葡聚糖转染)将表达载体转染至宿主细胞中。

用于表达本文提供的抗体、其抗原结合片段或其变体的适合的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV[包括dhfr-CHO细胞，记载于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220和Urlaub等人,Cell.1983Jun；33(2):405-12，与DHFR选择标记一起使用，例如，在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所记载；以及其他敲除细胞[其在Fan等人,Biotechnol Bioeng.2012Apr；109(4):1007-15中举例说明]、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞、HKB11细胞、BHK21细胞、CAP细胞、EB66细胞和SP2细胞。

在以下表达系统中的表达还可能是瞬时或半稳定的：例如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHOFreestyle、CHO-S、CHO-K-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T细胞(例如，Durocher等人,Nucleic Acids Res.2002 Jan 15；30(2):E9)。

在一些实施方案中，表达载体被设计成使得表达的蛋白质分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中。使用标准蛋白质纯化方法可以从培养基中回收抗体、其抗原结合片段或其变体。

在昆虫细胞中的表达

在昆虫宿主细胞中表达异源蛋白包括使用基于DNA载体的表达(例如重组质粒)或使用基于病毒的表达系统(例如杆状病毒表达系统(BEVS))。使用基于昆虫病毒的载体瞬时表达目标蛋白使用来自病毒的调控序列和衍生物，所述病毒例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多衣壳核多角体病毒(AcMNPV)、家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒(BmNPV)和黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)多衣壳核多角体病毒(OpMNPV)。用于昆虫宿主细胞表达的优选调控序列包括使用BmNPV IE-1反式激活因子、BmNPV HR3增强子和Bm细胞质肌动蛋白启动子(Farrell,Lu等人1998)，来自果蝇(Drosophila)肌动蛋白5c基因(ac5)的启动子区域(Chung、Yang-Tsung等人1990)、来自OpMNPV的OpIE2启动子、来自AcMNPV的多角体蛋白(polh)和IE1启动子，以及来自AcMNPV的增强子元件hr 1至hr5(Ren、Linzhu等人2011)。

抗体或抗原的表达可以是组成型或受调控的(例如，通过添加或去除小分子诱导物(如四环素)与用于昆虫细胞的野生型或修饰的四环素响应表达系统(TRES)相结合来诱导(Wu,Tzong-Yuan等人2000)，或通过添加硫酸铜或氯化镉与果蝇金属硫蛋白基因启动子相结合来诱导(Bunch,Thomas等人1988))。

重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记，例如针对哺乳动物细胞所描述的那些。此外，还可以包括用于简易克隆的位点特异性重组载体。该位点特异性重组区包括但不限于源自重组酶(例如Flp和Cre)的那些，和所述重组酶的各自结合位点FRT和Lox以及这些的修饰版本(Jensen,Ida 2017)。还可以使用转座酶和靶向转座子序列(例如Mu、Tn7、IFP2、piggyback)和这些的改造版本实现位点特异性重组(Wang,Yongjie 2010)。可以使用标准技术，例如电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、脂质体转染、基于聚阳离子的转染(例如如在哺乳动物细胞表达系统中的基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染和DEAE-葡聚糖转染)将表达载体转染至宿主细胞中。

本文提供的用于病毒载体、抗体、其抗原结合片段或其变体的瞬时或组成性表达的适合的昆虫宿主细胞包括但不限于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)衍生的Sf21和Sf9、粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)衍生的Tn5和High-Five、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)衍生的S2细胞以及这些的衍生物。

纯化

本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体可以通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述熟知的方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A层析、蛋白G层析、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。参见，例如，Colligan,Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science,JohnWiley&Sons,NY,NY,(1997-2001)，例如，第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全部并入本文。

本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物和通过重组技术从真核宿主(包括，例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。取决于在重组生产过程中使用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此类方法在许多标准实验室手册中记载，例如Sambrook，同上，第17.37-17.42节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章。

在优选实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95重量％的抗体，其例如通过Lowry法、UV-Vis光谱法或通过SDS-毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII、GX 90或BioradBioanalyzer装置上)来测定，并且在其他优选实施方案中超过99重量％，(2)至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至均质，其通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE，使用考马斯蓝或优选银染。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体天然环境的至少一种成分将不存在。但是，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。

根据本发明的一个实施方案，来自受试者的组织或液体样本为选自以下的至少一种：

·心脏组织，

·脉管系统，

·肺组织，

·肾组织，

·肝组织，

·肌肉组织，

·皮肤组织和/或

·血液。

根据本发明的另一个实施方案，人或动物受试者

·患有，

·有风险发展为，和/或

·被诊断为

选自心脏、肾脏、肺、心血管、心肾和/或心肺疾病的病症。

根据本发明的另一个实施方案，人或动物受试者

·患有，

·有风险发展为，和/或

·被诊断为

选自慢性肾病(CKD)、糖尿病肾病(DKD)和心力衰竭(HF)(如射血分数保留的心力衰竭(HFpEF))的病症。

根据本发明的另一个实施方案，人或动物受试者至少在特定靶组织中包含含无血红素β1亚基的sGC。如所讨论的，所述靶组织可以为选自心脏组织、脉管系统、肺组织、肾组织、肝组织、肌肉组织、皮肤组织和/或血液的至少一种。

根据本发明的另一个实施方案，确定样品的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达的步骤为选自以下的至少一种：

·ELISA

·免疫组织化学

·免疫印迹

·免疫沉淀

·放射免疫测定，和/或

·原位PCR

ELISA(酶联免疫吸附测定)是基于平板的测定技术，其设计用于检测和量化物质(例如肽、蛋白质、抗体和激素)。其他名称，例如酶免疫分析(EIA)，也用于描述相同的技术。

原位聚合酶链式反应(原位PCR)是一种强大的方法，其可检测冷冻的或石蜡包埋的细胞或组织切片中的微量的稀有或单拷贝数的核酸序列，用于在细胞内定位这些序列。该方法的原理包括组织固定(以保持细胞形态)和随后的蛋白水解消化处理(为PCR试剂提供通向靶DNA的途径)。靶序列通过这些试剂扩增，然后通过标准免疫细胞化学方案进行检测。原位PCR结合了PCR或RT-PCR扩增的灵敏度以及对同一样本进行形态学分析的能力，因此它是诊断应用中有吸引力的工具。

免疫组织化学(IHC)，有时简称为免疫染色，涉及通过利用抗体特异性结合至生物组织中的抗原的原理，对组织切片细胞中的抗原(蛋白)进行选择性成像的过程。IHC的名字来源于词根“免疫(immuno)”，指所述过程中使用的抗体，而“组织(histo)”意指组织(相对于免疫细胞化学)。

免疫印迹，通常称为蛋白质印迹，是一种广泛使用的技术，用于通过抗体识别特定抗原。这涉及通过抗原-抗体特异性区域鉴定通常在复杂混合物中的蛋白质靶标。蛋白质通常被施加到凝胶上，根据大小、电荷或其他差异通过电泳分离，然后电泳转移至膜(通常是聚偏二氟乙烯或硝基纤维素)上。转移的蛋白质与膜表面结合，提供与抗体反应的通道用于检测。通过在含有蛋白质(酪蛋白或牛血清白蛋白)或洗涤剂-封闭剂的溶液中孵育膜来封闭所有剩余的结合位点。在用一抗探测特定靶标后，抗体-抗原复合物通过多种方法(例如荧光、化学发光)进行可视化，允许检测特定靶蛋白。

免疫沉淀是一种下拉测定技术，其设计用于从复杂混合物中分离物质，例如肽、蛋白质、核酸、聚糖、化学制品和激素。靶物质(还称为猎物)的分离是由之前与大颗粒(例如带有或不带磁芯的琼脂糖(sepharose)或琼脂糖(agarose)珠)偶联的抗体/免疫球蛋白(还称为捕获抗体或诱饵)的特异性结合介导的。一旦靶物质与大颗粒-抗体复合物结合，可以使用物理方法(例如离心或磁力吸引)将其从复杂混合物中分离。在严格洗涤后，可以使用极端pH、高温、高盐浓度、洗涤剂、正构(orthosteric)或变构(allosteric)竞争剂、酶消化或任何其他破坏特异性抗体结合的实体或条件从下拉珠中洗脱靶物质。

放射免疫测定(RIA)是一种使用放射性标记分子逐步形成免疫复合物的免疫测定。RIA是一种非常灵敏的用于测量物质浓度的体外测定技术，其通常通过使用抗体来测量抗原浓度(例如，血液中的激素水平)。

根据本发明的另一方面，提供了选择性结合至sGC的单克隆抗体、或其靶标结合片段或衍生物、或抗体模拟物或适配体。

根据本发明的另一个实施方案，包含以下至少一种的抗体、片段或衍生物

a)3条重链CDR和3条轻链CDR的组，该组选自根据表1的列表，和/或

b)3条重链CDR和3条轻链CDR的组，该组包含在表2的VH和VL序列中，和/或

c)a)或b)的重链CDR/轻链CDR组合，条件是相对于a)或b)中指定的各个CDR，CDR中的至少一个具有最高达3个氨基酸置换，同时保持其与包含无血红素β1亚基的sGC结合的能力，和/或

d)a)或b)的重链CDR/轻链CDR组合，条件是相对于a)或b)中指定的各个CDR，CDR中的至少一个具有≥66％的序列同一性，同时保持其与包含无血红素β1亚基的sGC结合的能力，

其中CDR嵌入适合的蛋白框架中以便能够结合包含无血红素β1亚基的sGC。

关于选项b)，重要的是要理解在抗体的VH/VL序列为已知的情况下，CDR序列可以用计算方法确定，例如在Kunik V,Ashkenazi S和Ofran Y,Nucleic Acids Research,第40卷,第W1期,2012年7月1日,第W521–W524页中所公开的。

表1：本文公开的抗体的CDR序列

表2：本文公开的抗体的重链/轻链可变域序列对

表3：本文公开的抗体的全长轻链/重链序列对

根据本发明的另一个实施方案，优选抗体为TPP16284、TPP19355和TPP19361。

根据本发明的另一个实施方案，优选抗体为TPP16284和TPP19355。

在一个实施方案中，相对于各个CDR，CDR中的至少一个具有≥66％、优选≥67％、更优选≥68％、≥69％、≥70％、≥71％、≥72％、≥73％、≥74％、≥75％、≥76％、≥77％、≥78％、≥79％、≥80％、≥81％、≥82％、≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％的序列同一性或最优选≥99％的序列同一性。在另一个实施方案中，CDR中的至少一个已经通过亲和力成熟或其他修饰进行了修饰，产生相对于以上公开的序列的序列修饰。

在一个实施方案中，相对于a)或b)中指定的各个CDR，CDR中的至少一个具有最高达2个，优选1个氨基酸置换。

根据本发明的另一个实施方案，所述抗体、片段或衍生物包含

a)根据表2的重链/轻链可变域序列对

b)a)的重链/轻链可变域序列对，条件是相对于表2中示出的各个SEQ ID No，其序列中的至少一个具有≥80％的序列同一性，同时保持其与包含无血红素β1亚基的sGC结合的能力，和/或

c)a)的重链/轻链可变域序列对，条件是相对于表2中示出的各个SEQ ID No，其序列中的至少一个具有最高达10个氨基酸置换，同时保持其与包含无血红素β1亚基的sGC结合的能力。

a)根据表3的全长轻链/重链序列对

b)a)的全长轻链/重链序列对，条件是相对于表3中示出的各个SEQ ID No，其序列中的至少一个具有≥80％的序列同一性，同时保持其与包含无血红素β1亚基的sGC结合的能力，和/或

c)a)的全长轻链/重链序列对，条件是相对于表3中示出的各个SEQ ID No，其序列中的至少一个具有最高达10个氨基酸置换，同时保持其与包含无血红素β1亚基的sGC结合的能力。

在一个实施方案中，相对于表2或3中示出的各个SEQ ID No，序列中的至少一个具有≥81％、优选≥82％、更优选≥83％、≥84％、≥85％、≥86％、≥87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％的序列同一性或最优选≥99％的序列同一性。

在一个实施方案中，相对于表2中示出的各个SEQ ID No，序列中的至少一个具有最高达9个，优选最高达8个，更优选最高达7、6、5、4、3或2个并且最优选最高达1个氨基酸置换。

根据本发明的另一个实施方案，至少一个如上所讨论的氨基酸置换是保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”比非保守置换对抗体功能具有更小的影响。尽管存在分类氨基酸的许多方法，但通常基于其结构和其R基团的一般化学特征将它们分为6个主要组。

在一个实施方案中，“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的置换。例如，在本领域已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸

·碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，

·酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，

·不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，

·非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，

·β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和

·芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

其他保守的氨基酸置换还可以跨氨基酸侧链家族而发生，例如当用天冬酰胺置换天冬氨酸以改变肽的电荷时。因此，例如，预测的HR结构域多肽中的非必需氨基酸残基优选由来自相同侧链家族或跨家族同系物(例如天冬酰胺置换天冬氨酸，谷氨酰胺置换谷氨酸)的另一个氨基酸残基取代。保守改变还可包括化学同源的非天然氨基酸的置换(即合成的非天然疏水性氨基酸取代亮氨酸，合成的非天然芳香族氨基酸取代色氨酸)。

根据本发明的另一个实施方案，所述抗体

·与由上述序列定义的抗体之一相比，对包含无血红素β1亚基的sGC具有≥50％的靶标结合亲和力，如通过SPR测量，和/或

·与由上述序列定义的抗体之一竞争结合包含无血红素β1亚基的sGC。

如本文所用，术语“竞争结合”用于指代由上述序列定义的抗体之一，意指实际抗体结合至相同的靶标、或靶表位或结构域或亚结构域的活性与所述序列定义的抗体一样，并且是后者的变体，或相关的或不同的。结合的效率(例如，动力学或热力学)可以与后者的效率相同或大于或小于后者的效率。例如，两种抗体的结合底物的平衡结合常数可能不同。

根据本发明的另一个实施方案，抗体、片段或衍生物、或抗体模拟物或适配体用可检测标记标记。

此类可检测标记是例如酶、发光标记、荧光标记、磷光标记、不透射线标记、放射性标记、可被另一种结合剂检测的部分、包含核苷酸的标记等。所述标记可以共价或非共价结合抗体、片段或衍生物、或抗体模拟物或适配体。

根据本发明的另一方面，提供了用于根据任何上述描述的方法中的伴随诊断，该伴随诊断包含选择性结合包含无血红素β1亚基的sGC的结合分子。伴随诊断(CDx)是一种用作治疗药物的伴随，以确定其对特定人的适用性的诊断测试或试剂盒。伴随诊断通常与药物共同开发，以根据确定治疗应答者和非应答者的生物学特征，帮助选择或排除用该特定药物治疗的患者组。伴随诊断基于伴随生物标志物开发，这些生物标志物可前瞻性地帮助预测可能的反应或严重毒性。

根据一个实施方案，所述结合分子是抗体，或其保留靶标结合能力的片段或衍生物、抗体模拟物或适配体。

根据另一个实施方案，所述结合分子是单克隆抗体、其片段或衍生物、或抗体模拟物或适配体，如本文另外所述。

根据本发明的另一方面，提供了一种用治疗有效量的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂治疗人或动物受试者的方法，所述人或动物受试者

·患有，

·有风险发展为，和/或

·被诊断为

选自心脏、肾脏、肺、心血管、心肾和/或心肺疾病的病症，该病症的进一步特征在于至少在特定靶组织中包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达。

根据本发明的另一方面，提供了一种用治疗有效量的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂治疗人或动物受试者的方法，所述人或动物受试者

·患有，

·有风险发展为，和/或

·被诊断为

根据本发明的另一方面，提供了可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂(用于制备)治疗人或动物受试者(的药物)中的用途，所述人或动物受试者

·患有或

·有风险发展为

·被诊断为，

根据本发明的另一方面，提供了一种用于确定人或动物受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂治疗的试剂盒，该试剂盒包含选择性结合包含无血红素β1亚基的sGC的结合分子。

在一个实施方案中，所述结合分子为抗体，或其保留靶标结合能力的片段或衍生物，或抗体模拟物，或适配体。在另一个实施方案中，所述结合分子为本文所述的单克隆抗体、片段或衍生物。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体、其片段或衍生物包含来自本文公开列表的至少一个VH/VL对，或其如本文公开的修饰变体。

序列表

以下序列构成本申请的公开内容的一部分。本申请还提供了与WIPO ST 25兼容的电子序列表。为避免疑问，如果下表中的序列与电子序列表中的序列存在差异，则该表中的序列应视为正确的。注意VH代表重链可变域，VL代表轻链可变域，CDR代表互补决定区。

实验和附图

尽管已经在附图和前述说明书中详细说明和描述了本发明，但是这样的说明和描述被认为是说明性或示例性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践所要求保护的本发明时可以理解和实现所公开的实施方案的其他变型。任何参考标号不应被解释为限制范围。本文公开的全部氨基酸序列从N-末端到C-末端显示；本文公开的所有核酸序列均显示为5'->3'。

材料和方法

细胞培养

将地贪夜蛾(Sf9)在含有1％青霉素/链霉素的Sf-900 III培养基中，在27℃100rpm下常规培养。在使用补充有10％胎牛血清(FCS)的相同培养基的Sf9细胞中产生重组大鼠可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)蛋白。为了表达大鼠wt-sGC，在杆状病毒感染前30分钟，还将0.1mM 5-氨基乙酰丙酸添加到培养物中。

杆状病毒原液

将编码大鼠α1亚基的序列克隆至pVL1393中，其与strep标记序列(α1-StrepII)或源自水泡性口炎病毒(VSV-G)的糖蛋白的肽序列融合，随后是6xHis标记(α1-VSV-His)，均位于α1亚基的C端。将编码大鼠sGC的β1亚基和用苯丙氨酸取代血红素配体组氨酸的变体(β1-H105F)的序列也克隆至pVL1393中。在H015F中，F105置换H105消除了血红素的结合，因为H105对血红素结合sGC非常重要。使用FlashBAC杆状病毒表达系统(Oxford ExpressionTechnologies)生成重组杆状病毒，在Sf9细胞中扩增后，将杆状病毒原液储存在4℃。

使用杆状病毒表达载体系统在Sf9细胞中产生重组大鼠wt-sGC和apo-sGC

将生长至5-7x10⁶细胞/mL的细胞密度的Sf9细胞，在感染前在新鲜培养基中稀释至2x10⁶细胞/mL。将Sf9细胞用编码β1HF和α1-StrepII或α1-VSV-His的杆状病毒原液以感染复数(MOI)1.5(0.5α1:1β1HF)共感染，以在C端分别产生与Strep标记融合的大鼠apo-sGC或与VSV-G-His标记融合的大鼠apo-sGC。为了产生大鼠wt-sGC，将Sf9细胞与编码α1-StrepII和β1亚基的杆状病毒以MOI 4(2α1:2β1)共感染。在27℃100rpm下生长72小时后，通过以800xg、20min和4℃离心收集细胞，并将颗粒用于蛋白分离。

含有重组大鼠wt-sGC和apo-sGC的细胞提取物的制备

将2x10⁶个Sf9细胞(表达在C端与Strep标记或VSV-G-His标记融合的大鼠apo-sGC)的颗粒以1.4x10⁷细胞/mL重悬在50mM TAE pH7.6、0.5mM EDTA、7mM GSH、0.2mM PMSF、1μM胃酶抑素A和1μM亮抑蛋白酶肽(leupeptin)中，并在4℃下超声0.6秒。通过在13000xg、15min和4℃下离心去除细胞碎片，且将上清液立即用于活性测定和噬菌体展示。

大鼠wt-sGC和apo-sGC的纯化

所有纯化步骤均在4℃下进行。收集后，将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液(50mMTAE pH7.4、1mM EDTA、10mM DTT和1片抗蛋白酶混合物/50mL缓冲液)中，并用Avestin C5匀浆器在600bar下匀浆。将匀浆液在4℃下用250nM抗生物素蛋白和1mM PMSF孵育30分钟，并且以30000xg 1小时30分钟和4℃离心。将上清液过滤并立即以1mL/min上样至Tricorn 10/100中，其含有预先用缓冲液W(100mM Tris pH8、1M NaCl、1mM EDTA、1mM苯甲脒和10mMDTT)平衡的链球菌素(streptactin)超流高容量树脂。用至少10CV洗涤柱子后，用补充2.5mM脱硫生物素的缓冲液W洗脱蛋白。合并洗脱峰中包含的所有级分，并通过连续离心在50kDa-amicon中将其浓缩。此时，将大鼠wt-sGC进一步用0.5％吐温20在37℃下处理20分钟，以产生无血红素版本的wt蛋白。纯化的最后一步包括尺寸排阻色谱。为此，将浓缩的wt-和apo形式的sGC分别上样至Superdex 200 16/600柱上，该柱预先用配方缓冲液(50mM TAEpH7.6、150mM NaCl、1mM EDTA、10mM DTT、1mM苯甲脒和10％甘油)平衡。将含有蛋白质二聚体状态的级分合并，在50kDa-amicon中浓缩，速冻并在-80℃下储存在低蛋白质结合管中。通过SDS-Page评估蛋白的纯度，并通过Bradford法测定蛋白浓度。

通过噬菌体展示选择大鼠apo-sGC结合分子

使用BIOINVENT

Fab Lambda Library选择靶向大鼠apo-sGC的抗体。使用预先用小鼠抗-VSV-G单克隆抗体(P5D4)包被的Dynabeads^TM M-280绵羊抗小鼠IgG，从1x10⁷ Sf9细胞的粗提取物中分离与α1亚基C端的VSV-G表位标记基因融合的大鼠apo-sGC。或者，将纯化的在C端与Strep标记融合的重组大鼠apo-sGC蛋白包被到StreptavidinDynabeads^TM M-280。通过将来自BIOINVENT

Fab Lambda Library的约10¹³噬菌体颗粒添加至用大鼠apo-sGC覆盖的磁性Dynabeads中，进行大鼠apo-sGC结合分子的分离。在4℃下孵育1小时后，彻底清洗未结合的噬菌体颗粒。使用具有结合噬菌体的磁性颗粒在37℃下感染处于指数生长阶段的大肠杆菌HB101F'菌株30分钟，使噬菌体从磁珠转移至细菌进行感染。保留氨苄青霉素抗性细菌并用于产生用于随后选择轮次的噬菌体颗粒。对于该策略，进行了三轮选择。使用已经描述的标准方法进行选择的噬菌体的保留、噬菌体基因III融合体的去除和单个克隆的分离。

测定重新格式化为完整IgG的选定sFab的物种apo选择性

为了通过ELISA测定单个IgG从带有血红素的版本中区分apo(无血红素)版本的wt大鼠sGC的能力，将5μg/mL的每种单独的IgG在

maxisorp 96孔板中包被，4℃下过夜。在至少16小时的吸附期后，在加入预先用0.5％(v/v)吐温处理的纯化的大鼠wt sGC蛋白以去除血红素基团(或未处理从而保留血红素)之前，用PBS-3％脱脂牛奶(v/v)封闭包被的maxisorp板。使用链霉亲和素-HRP检测出通过重新格式化的IgG分子成功捕获无血红素或带有血红素的wt大鼠sGC分子。

通过蛋白质印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)确定生物样本中选定的IgG的apo选择性。

为了确定获得的抗体的apo选择性，在以下物质上测试选定的sFab的结合：a)纯化的sGC，包括WT sGC、氧化的WT sGC(+/-吐温，ODQ)和apo sGC(H105F)，b)来自过表达sGC的细胞的细胞提取物，包括过表达WT sGC的细胞(处理的+/-ODQ)和过表达apo sGC(H105F)的细胞，c)来自表达sGC和处理的+/-ODQ的细胞系和原代细胞的细胞提取物，d)来自不同物种的组织和器官匀浆液，所述物种包括小鼠(例如WT和kiki小鼠)、大鼠(例如WT和RenTG或ZSF-1大鼠)和人体组织，包括但不限于心脏、肾脏和肺组织，以及e)来自不同物种的组织切片，所述物种包括小鼠(例如WT和kiki小鼠)、大鼠(例如WT和RenTG或ZSF-1大鼠)和人体组织，包括但不限于心脏、肾脏和肺组织。

读出技术为根据WB和IHC的标准实验室方案进行的石蜡包埋和冷冻包埋组织切片的蛋白质印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)。

对于WB，例如使用变性凝胶和天然凝胶。除了选定的sFab，还测试了阴性对照AB(即TPP-9809)和阳性对照WT sGC(商业抗sGCα1抗体和抗sGCβ1抗体)。测定条件包括，对于重组蛋白——0.1ug/泳道，150V运行3h；4-12％NuPage Bis Tris，MES。

对于IHC，将样本解剖、速冻、OCT嵌入和冷冻保存。切割和固定后，用1xPBS缓冲液洗涤并染色载玻片，用5％DKS+0.5％皂苷(saponing)封闭，然后用一抗孵育过夜，洗涤3次(每次4分钟)后用二抗孵育60分钟。

测定选定的sFab的物种交叉反应性

为了测定单个IgG结合不同sGC直向同源物的能力，使用了大鼠和人sGC的突变H105F apo形式。简言之，将5μg/mL的每种单独的IgG在

maxisorp孔板中在4℃下包被过夜。在至少16小时的吸附期后，在加入大鼠或人sGC突变蛋白前，用PBS-3％脱脂牛奶(v/v)封闭包被的maxisorp板。用链霉亲和素-HRP检测出通过重新格式化的IgG分子成功捕获大鼠或人apo-sGC分子。

重组可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的体外活化

使用和不使用硝普钠以及使用和不使用血红素依赖性sGC抑制剂1H-1,2,4-噁二唑并[4,3a]喹喔啉-1-酮(ODQ)，本发明的化合物对重组可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)调节的研究，通过以下参考文献中详细描述的方法进行：M.Hoenicka,E.M.Becker,H.Apeler,T.Sirichoke,H.Schroeder,R.Gerzer和J.-P.Stasch,"Purified soluble guanylylcyclase expressed in a baculovirus/Sf9 system:Stimulation by YC-1,nitricoxide,and carbon oxide",J.Mol.Med.77(1999),14-23。通过向样本缓冲液中加入吐温20(终浓度为0.5％)获得无血红素的鸟苷酸环化酶。

如在WO 2012/139888中所记载的，sGC活化剂与NO供体2-(N,N-二乙氨基)-二氮烯2-氧化物(DEA/NO)的组合显示无协同作用，即DEA/NO的作用没有像对通过血红素依赖性机制起作用的sGC调节剂所预期的那样增强。此外，本发明的sGC活化剂的作用不被1H-1,2,4-噁二唑并[4,3a]喹喔啉-1-酮(ODQ)(一种可溶性鸟苷酸环化酶的血红素依赖性抑制剂)阻断，反而实际上被提高了。因此，该测试适用于区分血红素依赖性sGC刺激剂和血红素非依赖性sGC活化剂。

附图

图1和图7-9示出了如在上述实验部分描述的所述先导(lead)发现过程中通过ELISA获得的抗体的结果。可以确定十种抗体(TPP15715、TPP15717、TPP16284、TPP15714、TPP15718、TPP15720、TPP15721、TPP15722、TPP19355和TPP19361)，其对无血红素的sGC(通过吐温处理获得)具有纳摩尔亲和力，而同种型对照(TPP9809和TPP5657)不结合。然后进一步分析TPP15715、TPP15717和TPP16284。通过SPR确定的亲和力如下：

图2-4和图10-13示出了十种各个IgG对来自大鼠和人的apo-sGC(H105F)的物种反应性。发现十种选择的抗体结合大鼠和人的无血红素sGC。然后进一步分析TPP15715、TPP15717和TPP16284。通过SPR测定的亲和力如下：

	K<sub>D</sub>(大鼠apo-sGC(H105F))	K<sub>D</sub>(人apo-sGC(H105F))
			TPP15715	59nM	148nM
TPP15717	45nM	72nM
			TPP16284	67nM	146nM
TPP9809(同种型对照)	不结合	不结合

图5A和B示出了抗体筛选过程的细节。

参考文献

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Wu等人,J Biotechnol.(2000)Jun 9；80(1):75-83

序列表

<110> 拜耳公司

<120> 确定受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的激动剂治疗的方法

<130> CP1210615P

<150> EP 19152338.0

<151> 2019-01-17

<160> 101

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 1

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 2

Glu Asn Asp Arg Arg Pro Ser

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 3

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 4

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Glu Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Asn Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 5

Asn Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 6

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 7

Asp Gly Thr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Gly Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 9

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Val Val His

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 10

Asn Asn Ser Gln Arg Pro Pro

1 5

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 11

Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val

1 5 10

<210> 12

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 12

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Asn Ser Gln Arg Pro Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 13

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 14

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 15

Glu Gln Trp Leu Gly Ala Glu Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 16

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 16

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Gln Trp Leu Gly Ala Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 17

Ser Gly Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 18

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 19

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val

1 5 10

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 20

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 21

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 22

Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 23

Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 24

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 586

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 25

Met Tyr Gly Phe Val Asn His Ala Leu Glu Leu Leu Val Ile Arg Asn

1 5 10 15

Tyr Gly Pro Glu Val Trp Glu Asp Ile Lys Lys Glu Ala Gln Leu Asp

20 25 30

Glu Glu Gly Gln Phe Leu Val Arg Ile Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Thr

35 40 45

Tyr Asp Leu Val Ala Ala Ala Ser Lys Val Leu Asn Leu Asn Ala Gly

50 55 60

Glu Ile Leu Gln Met Phe Gly Lys Met Phe Phe Val Phe Cys Gln Glu

65 70 75 80

Ser Gly Tyr Asp Thr Ile Leu Arg Val Leu Gly Ser Asn Val Arg Glu

85 90 95

Phe Leu Gln Asn Leu Asp Ala Leu His Asp His Leu Ala Thr Ile Tyr

100 105 110

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130 135 140

Ile Val Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Ala Gln Gln Ile His Gly Thr

145 150 155 160

Glu Ile Asp Met Lys Val Ile Gln Gln Arg Asn Glu Glu Cys Asp His

165 170 175

Thr Gln Phe Leu Ile Glu Glu Lys Glu Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr

180 185 190

Glu Asp Leu Asp Arg Phe Glu Glu Asn Gly Thr Gln Glu Ser Arg Ile

195 200 205

Ser Pro Tyr Thr Phe Cys Lys Ala Phe Pro Phe His Ile Ile Phe Asp

210 215 220

Arg Asp Leu Val Val Thr Gln Cys Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Val Leu

225 230 235 240

Pro Gln Leu Gln Pro Gly Asn Cys Ser Leu Leu Ser Val Phe Ser Leu

245 250 255

Val Arg Pro His Ile Asp Ile Ser Phe His Gly Ile Leu Ser His Ile

260 265 270

Asn Thr Val Phe Val Leu Arg Ser Lys Glu Gly Leu Leu Asp Val Glu

275 280 285

Lys Leu Glu Cys Glu Asp Glu Leu Thr Gly Thr Glu Ile Ser Cys Leu

290 295 300

Arg Leu Lys Gly Gln Met Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Asp Ser Ile Leu

305 310 315 320

Phe Leu Cys Ser Pro Ser Val Met Asn Leu Asp Asp Leu Thr Arg Arg

325 330 335

Gly Leu Tyr Leu Ser Asp Ile Pro Leu His Asp Ala Thr Arg Asp Leu

340 345 350

Val Leu Leu Gly Glu Gln Phe Arg Glu Glu Tyr Lys Leu Thr Gln Glu

355 360 365

Leu Glu Ile Leu Thr Asp Arg Leu Gln Leu Thr Leu Arg Ala Leu Glu

370 375 380

Asp Glu Lys Lys Lys Thr Asp Thr Gly Ile Val Gly Phe Asn Ala Phe

385 390 395 400

Cys Ser Lys His Ala Ser Gly Glu Gly Ala Met Lys Ile Val Asn Leu

405 410 415

Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Arg Phe Asp Thr Leu Thr Asp Ser Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Phe Val Tyr Lys Val Glu Thr Val Gly Asp Lys Tyr Met Thr

435 440 445

Val Ser Gly Leu Pro Glu Pro Cys Ile His His Ala Arg Ser Ile Cys

450 455 460

His Leu Ala Leu Asp Met Met Glu Ile Ala Gly Gln Val Gln Val Asp

465 470 475 480

Gly Glu Ser Val Gln Ile Thr Ile Gly Ile His Thr Gly Glu Val Val

485 490 495

Thr Gly Val Ile Gly Gln Arg Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asn

500 505 510

Thr Val Asn Leu Thr Ser Arg Thr Glu Thr Thr Gly Glu Lys Gly Lys

515 520 525

Ile Asn Val Ser Glu Tyr Thr Tyr Arg Cys Leu Met Ser Pro Glu Asn

530 535 540

Ser Asp Pro Gln Phe His Leu Glu His Arg Gly Pro Val Ser Met Lys

545 550 555 560

Gly Lys Lys Glu Pro Met Gln Val Trp Phe Leu Ser Arg Lys Asn Thr

565 570 575

Gly Thr Glu Glu Thr Lys Gln Asp Asp Asp

580 585

<210> 26

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 26

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Glu Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Asn Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

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Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 27

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 27

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asp Gly Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

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260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 28

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 28

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Asn Ser Gln Arg Pro Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 29

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 29

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Gln Trp Leu Gly Ala Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

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225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 30

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 30

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu

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Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 31

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 31

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 32

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr

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<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 33

Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 34

Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Val Val

1 5 10

<210> 35

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 35

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

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Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

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Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu

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Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 36

Asn Tyr Val Met Ser

1 5

<210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 37

Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys

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Arg

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 38

Gly Leu Arg Tyr Ser Ser Pro Phe Asp Phe

1 5 10

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 39

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 40

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 41

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 42

Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 43

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

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Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu

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Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 44

Arg Tyr Gly Ile His

1 5

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 45

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 46

Ala Arg Ser Arg Trp Ala Ser Leu Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 47

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 47

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Ala Arg Ser Arg Trp Ala Ser Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 48

Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn

1 5 10

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 49

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 50

Gln Ser Tyr Gly Thr Ser Leu Ser Gly Ser Arg Val Leu

1 5 10

<210> 51

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 51

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Gly Thr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ser Arg Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 52

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 52

Lys Tyr Trp Met His

1 5

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 53

Ser Val Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 54

Gly Pro Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Arg Leu Asp Gly Leu Val Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 55

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 55

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Val Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Arg Leu Asp Gly Leu Val

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 56

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 56

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 57

Arg Asp Asp Arg Leu Pro Ser

1 5

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 58

Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Thr Val Val

1 5 10

<210> 59

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 59

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asp Asp Arg Leu Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Ser

85 90 95

Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 60

Arg Tyr Ala Met Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

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Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Gly Ser Val Lys

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Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 62

Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 63

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Gly Ser Val

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 65

Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 66

Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Leu Val

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<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 67

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Val Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Asn

85 90 95

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

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Ser Tyr Ser Met Asn

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 69

Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Gly Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

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Gly

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 70

Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 71

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 71

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Gly Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 72

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 73

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 74

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<210> 75

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 75

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gln Asn

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100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 76

Ser Tyr Ser Met His

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 77

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 78

Thr Pro Arg Arg Trp Gly Trp Ser Ala Leu Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 79

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Pro Arg Arg Trp Gly Trp Ser Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 80

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 80

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10

<210> 81

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 81

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 82

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val Ser Gly Trp Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 83

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

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Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

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100 105 110

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 84

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 85

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 85

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 86

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 86

Glu Val Trp Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Asp Tyr

1 5 10

<210> 87

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 87

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Trp Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 88

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

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180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 89

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 89

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Arg Tyr Ser Ser Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 90

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 90

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 91

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 91

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Arg Ser Arg Trp Ala Ser Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 92

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 92

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Gly Thr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ser Arg Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 93

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 93

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Val Ser Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Arg Leu Asp Gly Leu Val

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 94

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 94

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asp Asp Arg Leu Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Ser

85 90 95

Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 95

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 95

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Gly Ser Val

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 96

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 96

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Ser

20 25 30

Val Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Asn

85 90 95

Asn Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 97

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 97

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Gly Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Leu Gly Lys Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 98

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 98

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gln Asn

85 90 95

Ser Thr Arg Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 99

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 99

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Pro Arg Arg Trp Gly Trp Ser Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 100

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 100

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Val Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 101

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体序列

<400> 101

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Trp Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Tyr Val Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

Claims

1.一种用于确定人或动物受试者是否

·患有氧化应激

·适于用抗氧化剂和/或自由基清除剂治疗，和/或

·适于用sGC的活化剂处理

的方法，所述方法包括以下步骤：

确定来自所述受试者的组织或液体样本的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂为选自以下的至少一种：

·1[6-(3,4-二氯苯基)-2-吡啶基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸

·4-({2-[3-(三氟甲基)苯基]-1,3-噻唑-4-基}甲基)苯甲酸

·BAY 60-2770 4-({(4-羧基丁基)[2-(5-氟-2-{[40-(三氟甲基)联苯-4-基]甲氧基}苯基)乙基]氨基}甲基)苯甲酸)

·(S)-1-(6-(3-((4-(1-(环丙烷羰基)哌啶-4-基)-2-甲基苯基)氨基)-2,3-二氢-1H-茚-4-基)吡啶-2-基)-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在确定所述样本的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达的步骤中，使用结合分子，其选择性地结合包含无血红素β1亚基的sGC。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合分子为抗体或其保留靶标结合能力的片段或衍生物，抗体模拟物或适配体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中来自受试者的组织或液体样本为选自以下的至少一种：

·心脏组织、

·脉管系统、

·肺组织、

·肾组织、

·肝组织、

·肌肉组织、

·皮肤组织和/或

·血液。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中人或动物受试者

·患有、

·有风险发展为和/或

·被诊断为

选自心脏、肾脏、肺、心血管、心肾和/或心肺疾病的病症。

7.单克隆抗体，或其靶标结合片段或衍生物，或抗体模拟物或适配体，其选择性结合包含无血红素β1亚基的sGC。

8.根据权利要求7所述的抗体、片段或衍生物，其包含以下的至少一种：

9.根据权利要求7或8中任一项所述的抗体、片段或衍生物，其包含

a)根据表2的重链/轻链可变域序列对

10.一种用于根据权利要求1-9中任一项所述的方法的伴随诊断，所述伴随诊断包含选择性结合包含无血红素β1亚基的sGC的结合分子。

11.根据权利要求10所述的伴随诊断，其中所述结合分子为根据权利要求7-9中任一项所述的单克隆抗体、其片段或衍生物。

12.一种用于治疗人或动物受试者的方法，所述人或动物受试者

·患有、

·有风险患有，和/或

·被诊断为

选自心脏、肾脏、肺、心血管、心肾和/或心肺疾病的病症，该病症的进一步特征在于至少在特定靶组织中包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达，所述方法包括给予治疗有效量的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂。

13.用于治疗人或动物受试者的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂，所述人或动物受试者

·患有或

·有风险发展为和/或

·被诊断为，

14.用于根据权利要求12或13中任一项所述的治疗的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂，其中在来自所述受试者的组织或液体样本中确定所述样本的特征是否在于包含无血红素β1亚基的sGC的存在、上调或过表达。

15.一种用于确定人或动物受试者是否适于用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活化剂治疗的试剂盒，所述试剂盒包含选择性结合包含无血红素β1亚基的sGC的结合分子。