CN112521485A - 一种犬血白蛋白的制备方法、利用其得到的犬血白蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种犬血白蛋白的制备方法、利用其得到的犬血白蛋白和应用。所述制备方法包括：将犬血浆离心后取上清液，再依次使用阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化所述上清液，而后，经过超滤浓缩和缓冲液置换，得到犬血白蛋白溶液。本发明所述制备方法以犬血浆离心分离后的上清液为原料，通过阳离子交换层析和阴离子交换层析去除上清液中的多种大分子及小分子杂质蛋白，提高了所得犬血白蛋白的纯度，且该方法中不经过沉淀、深层过滤和溶解等工艺过程，减少了制备过程中白蛋白的损耗，提高了产品的收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品和血液制品生产技术领域，具体涉及动物血浆白蛋白的制备方法，尤其涉及一种犬血白蛋白的制备方法、利用其得到的犬血白蛋白和应用。
背景技术
随着宠物犬进入千家万户，宠物犬的保健问题引起广泛的关注。犬血白蛋白的主要生理功能为调节渗透压和在新陈代谢中充当重要的物质运输载体，其适应症非常广泛，常用作血溶扩充剂代替输血，可提高血浆胶体渗透压，增加血容量，用于治疗因失血、创伤及烧伤等引起的休克、脑水肿及大脑损伤所致的颅内压增高，对防治低蛋白血症以及肝硬化或肾病引起的水肿或腹水有较好的疗效。
目前由犬血浆制备犬血白蛋白的方法主要为基于Cohn-Oncley法或Kistler-Nitschmann法为主的低温乙醇工艺。
例如，CN1648134A中记载了一种制备犬血白蛋白的低温乙醇工艺，所述工艺步骤包括：血浆的合并与融化、经过四次离心对上清液进行处理去除杂蛋白后得到沉淀的白蛋白、超滤和巴氏灭活后分装得到犬血白蛋白。现今多数血液制品生产厂家均按照此方法制备犬血白蛋白，然而，上述方法分离步骤多、分离周期长、工艺复杂且全程要求低温环境，而制品纯度却不高。以中国药典规定的方法对国内市售的犬血白蛋白产品进行检测，纯度在90％左右，多聚体含量≥6％。较低的纯度会影响制品的稳定性和临床应用的安全性，导致更多的用药不良反应。
因此，提供一种制备过程简单、适用于大规模生产且所得犬血白蛋白纯度和收率都较高的犬血白蛋白制备方法，对本领域而言具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种犬血白蛋白的制备方法、利用其得到的犬血白蛋白和应用。所述制备方法过程简单，减少了沉淀、深层过滤和溶解工艺过程中引起的犬血白蛋白收率损失，且经过两步层析，提高了所得蛋白制品的纯度，极大地提高了应用的安全性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种犬血白蛋白的制备方法，所述制备方法包括：将犬血浆离心后取上清液，再依次使用阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化所述上清液，而后，经过超滤浓缩和缓冲液置换，得到犬血白蛋白溶液。
本发明提供的制备方法采用犬血浆离心分离后的上清液为原料进行柱层析处理，通过阳离子交换层析和阴离子交换层析去除上清液中的多种大分子及小分子杂质蛋白，提高了所得犬血白蛋白的纯度，且该方法中不经过沉淀、深层过滤和溶解等工艺过程，减少了制备过程中白蛋白的损耗，提高了产品的收率；并且，阳离子交换层析采用犬血白蛋白流穿法，大大地提高了血浆原料的处理量，因此该方法也同样适用于大规模生产。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将犬血浆离心，收集上清液并调节pH，再使用平衡缓冲液进行稀释；
(2)将步骤(1)中稀释后得到的上清液使用阳离子交换层析柱进行层析，收集流穿液；
(3)调节步骤(2)所得流穿液的pH，并使用阴离子交换层析柱进行层析，再用阴离子交换层析洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(4)调节步骤(3)所得的洗脱液的pH，并使用超滤膜进行超滤浓缩和缓冲液置换，得到犬血白蛋白溶液。
根据层析介质性能参数中的载量信息，本发明中，阳离子交换层析采用犬血白蛋白流穿法，可极大地提高阳离子交换层析对料液的处理量，达到100L层析介质的层析规模即可处理相当于200～1000L的血浆原料，可放大用于实际生产。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述离心的温度为2～6℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃或6℃等。
优选地，步骤(1)所述离心的转速为8000～12,000r/min，例如可以是8,000r/min、9,000r/min、10,000r/min、11,000r/min或12,000r/min等，时间为20～40min，例如可以是20min、22min、25min、28min、30min、32min、35min、38min或40min等。
优选地，步骤(1)所述调节pH为将pH调节至4.0～6.9，例如可以是4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.4、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7或6.9等。
本发明中，各步骤中pH的调节尤为重要，针对于犬血白蛋白的等电点(pI＝4.7)，本发明中在各步骤中调节其至合适的pH，能够提高蛋白的溶解度、让白蛋白与杂蛋白带上不同电荷，在离子交换介质上的吸附和保留行为有所不同，从而实现高效分离。
优选地，步骤(1)所述平衡缓冲液包含1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的柠檬酸钠。
优选地，步骤(1)所述平衡缓冲液的pH值为4.0～6.9，例如可以是4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.4、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7或6.9等。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述阳离子交换层析柱使用的阳离子交换层析介质包括CM QZT 6FF、SP QZT 6FF、CM QZT XL、SP QZT XL、CM Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow、SP Sepharose XL或Capto S中的任意一种或至少两种的组合。
其中，CM QZT 6FF、SP QZT 6FF、CM QZT XL和SP QZT XL可购自中科森辉微球技术(苏州)有限公司，CM Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow、SP Sepharose XL和Capto S可购自GE Healthcare公司。
优选地，所述阳离子交换层析介质的使用量与流穿液的体积比为1:(2～40)，例如可以是1:2、1:3、1:5、1:6、1:8、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:28、1:30、1:32、1:35、1:38或1:40等。
优选地，步骤(2)所述层析时液体的流速60～240cm/h，例如可以是60cm/h、80cm/h、100cm/h、120cm/h、140cm/h、150cm/h、160cm/h、180cm/h、200cm/h、220cm/h或240cm/h等。
优选地，步骤(2)所述阳离子交换层析柱在使用前还包括使用平衡液1进行处理的步骤。
优选地，所述平衡液1包括1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的柠檬酸钠。
优选地，所述平衡液1的pH为4.0～6.9，例如可以是4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.4、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7或6.9等。
优选地，步骤(2)收集流穿液后还包括使用阳离子层析洗脱缓冲液进行洗脱的步骤。
优选地，所述阳离子层析洗脱缓冲液包括1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的柠檬酸钠和0.1～1.0mol/L(例如可以是0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L或1mol/L等)的氯化钠。
优选地，所述阳离子层析洗脱缓冲液的pH为4.0～6.9，例如可以是4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.4、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7或6.9等。
优选地，步骤(2)所述阳离子交换层析柱在使用后还包括使用洗涤液1和洗涤液2进行交替洗涤的步骤。
优选地，所述洗涤液1包括1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的柠檬酸钠和0.5～2.0mol/L(例如可以是0.5mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L或2mol/L等)的氯化钠。
优选地，所述洗涤液2包括0.1～0.5mol/L(例如可以是0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L或0.5mol/L等)氢氧化钠水溶液。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述阴离子交换层析柱使用的阴离子交换层析介质包括DEAE QZT 6FF、Q QZT 6FF、DEAE QZT XL、Q QZT XL、DEAE Sepharose FastFlow、Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose XL、Fractogel TMAE或Capto DEAE中的任意一种或至少两种的组合。
其中，DEAE QZT 6FF、Q QZT 6FF、DEAE QZT XL和Q QZT XL可购自中科森辉微球技术(苏州)有限公司，DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Q SepharoseXL和Capto DEAE可购自GE Healthcare公司，Fractogel TMAE可购自默克密理博公司。
优选地，所述阴离子交换层析介质的使用量与稀释后得到的上清液的体积比为1:(2～20)，例如可以是1:2、1:3、1:5、1:6、1:8、1:10、1:12、1:13、1:14、1:15、1:18或1:20等。
优选地，步骤(3)中将所述流穿液的pH调节为4.8～6.0，例如可以是4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0等，优选为5.4。
优选地，步骤(3)所述层析时液体的流速60～240cm/h，例如可以是60cm/h、80cm/h、100cm/h、120cm/h、140cm/h、150cm/h、160cm/h、180cm/h、200cm/h、220cm/h或240cm/h等。
优选地，步骤(3)所述阴离子交换层析柱在使用前还包括使用平衡液2进行处理的步骤。
优选地，所述平衡液2包括1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的醋酸钠。
优选地，所述平衡液2的pH为4.8～6.0，例如可以是4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0等，优选为5.4。
优选地，步骤(3)所述阴离子交换层析洗脱缓冲液包括1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的醋酸钠和0.01～0.5mol/L(例如可以是0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L或0.5mol/L等)的氯化钠。
本发明中，采用所述洗脱缓冲液对阴离子层析柱进行洗脱，能够将层析柱上吸附的白蛋白洗脱下来，提高白蛋白的收率。
优选地，所述阴离子交换层析洗脱缓冲液的pH为4.8～6.0，例如可以是4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0等，优选为5.4。
本发明中，所述阴离子交换层析采用的缓冲液与阳离子缓冲液种类有所不同，其目的是为了选择适宜的缓冲液pH，让白蛋白带上负电荷吸附在阴离子交换介质上，而其他杂蛋白带上正电荷从而流穿，这样就可以实现白蛋白与其他杂蛋白的分离，因此，选择适宜的层析缓冲液pH尤为重要。
优选地，步骤(3)所述阴离子交换层析柱在使用后还包括使用洗涤液3和洗涤液4进行交替洗涤的步骤。
优选地，所述洗涤液3包括1～50mmol/L(例如可以是1mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或50mmol/L等)的醋酸钠和0.5～2.0mol/L(例如可以是0.5mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L或2.0mol/L等)的氯化钠。
优选地，所述洗涤液4包括0.1～0.5mol/L(例如可以是0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L或0.5mol/L等)氢氧化钠水溶液。
作为本发明优选的技术方案，所述阳离子交换层析柱和阴离子交换层析柱在交替洗涤后，保存于储存液中。
优选地，所述储存液为质量分数为15～25％(例如可以是15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％等)的乙醇溶液。
优选地，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中调节pH使用的pH调节剂包括盐酸和/或氢氧化钠。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中将所述洗脱液的pH调节至6.5～7.0，例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0等。
优选地，步骤(4)所述超滤浓缩和缓冲液置换的方法包括：将调节pH后的洗脱液置于超滤膜内，并将所述超滤膜放入超滤稀释液中，超滤后得到所述犬血白蛋白溶液；
优选地，所述超滤膜的截留分子量为10～30kDa，例如可以是10kDa、12kDa、14kDa、15kDa、18kDa、20kDa、22kDa、24kDa、25kDa、26kDa、28kDa或30kDa等。
优选地，所述超滤稀释液包括生理盐水。
优选地，所述超滤后还包括添加稳定剂的操作。
优选地，所述稳定剂包括辛酸钠。
优选地，所述超滤后还包括巴氏病毒灭活处理的操作。
优选地，所述巴氏病毒灭活处理的温度为59.5℃～60.5℃，例如可以是59.5℃、59.8℃、60℃、60.1℃、60.2℃、60.3℃或60.5℃等，时间为9.5～12h，例如可以是9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h或12h等。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)在2～6℃下离心犬血浆，所述离心的转速为8000～12,000r/min，时间为20～40min，所述离心结束后收集上清液并调节pH至4.0～6.9，再使用包含1～50mmol/L柠檬酸钠的平衡缓冲液进行稀释；
(2)使用pH为4.0～6.9、包含1～50mmol/L柠檬酸钠的平衡液1平衡阳离子交换层析柱，再将步骤(1)中稀释后得到的上清液使用阳离子交换层析柱进行层析，层析时液体的流速60～240cm/h，收集流穿液；
而后，使用pH为4.0～6.9、包含1～50mmol/L柠檬酸钠和0.1～1.0mol/L氯化钠的阳离子层析洗脱缓冲液洗脱所述阳离子交换层析柱，再使用洗涤液1和洗涤液2进行交替洗涤，存储于质量分数为15～25％的乙醇溶液中；
(3)使用pH为4.8～6.0、包含1～50mmol/L醋酸钠的平衡液2平衡阴离子交换层析柱，调节步骤(2)所得流穿液的pH至4.8～6.0，并使用阴离子交换层析柱进行层析，再用pH为4.8～6.0、包括1～50mmol/L醋酸钠和0.01～0.5mol/L氯化钠的阴离子交换层析洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
而后，使用洗涤液3和洗涤液4进行交替洗涤，存储于质量分数为15～25％的乙醇溶液中；
(4)调节步骤(3)所得的洗脱液的pH至6.5～7.0，置于截留分子量为10kDa的超滤膜内，并将所述超滤膜放入生理盐水中进行超滤浓缩和缓冲液置换，再加入辛酸钠，而后进行巴氏病毒灭活处理，得到犬血白蛋白溶液。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的制备方法制备得到的犬血白蛋白。
本发明中，利用所述方法制备得到的犬血白蛋白溶于生理盐水中，犬血白蛋白的浓度为20～25％，pH为6.6～7.2，钠离子含量为140～180mmo/L、电导率7.0～9.0mS/cm。
经过SDS-PAGE或者高效液相色谱法检测可知，所述犬血白蛋白的纯度较高，且多聚体较少。
第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的制备方法或如第二方面所述的犬血白蛋白在制备犬类疾病的治疗药物或疫苗中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的制备犬血白蛋白的方法先采用犬血浆离心分离后的上清液为原料进行柱层析处理，与传统的低温乙醇沉淀工艺比较，减少了对后续组分进行低温乙醇沉淀、深层过滤和沉淀溶解等分离步骤，工艺时间相对缩短了24～48h，且减少了上述分离步骤，也减少了的犬血白蛋白损耗，提高蛋白的收率，本发明所述的制备方法可使犬血白蛋白制品的收率比低温乙醇法提高22～24％；
(2)本发明提供的制备方法通过阳离子交换层析和阴离子交换层析可以去除制品中的多种大分子及小分子杂质蛋白，即利用两步层析提高制品纯度，经该方法处理得到的犬血白蛋白通过SDS-PAGE电泳检测，纯度≥97％，多聚体含量≤3％，极大地提高了应用的安全性；
(3)本发明提供的制备方法中阳离子交换层析采用犬血白蛋白流穿法，因此通过调整各项参数使犬血白蛋白流穿层析柱，可极大的提高层析介质对料液的处理量，达到100L层析介质可处理相当于200～1000L的血浆原料的层析规模，完全可放大用于实际生产；相比于目前使用层析介质吸附犬血白蛋白而使制品中杂质流穿层析柱的方法，每100L层析介质最多仅能吸附4～6kg犬血白蛋白，即相当于处理100～200L血浆，本发明具有明显的放大优势，节约成本。
附图说明
图1为实施例1中所得到的流穿液、洗脱液以及商品化的犬血白蛋白的SDS-PAGE电泳图；
其中，M表示蛋白Marker，泳道1对应商品化的犬血白蛋白，泳道2对应阳离子交换层析流穿液，泳道3对应阴离子交换层析洗脱液。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
本实施例中提供一种犬血白蛋白的制备方法，具体步骤如下：
(1)犬血浆离心
取-20℃下的新鲜冷冻犬血浆在4℃冰箱缓慢融化后离心(4℃，10,000r/min，30min)，离心上清用纱布(四层)过滤；
采用0.5mol/L盐酸调节pH为6.0，再次离心(4℃，10,000r/min，30min)，取上清，采用平衡缓冲液(含有柠檬酸钠50mmol/L的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液、pH 6.0)稀释至蛋白浓度5g/L；
(2)阳离子交换层析
将阳离子交换层析介质CM QZT 6FF装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:5，装填好的层析柱使用含有柠檬酸钠50mmol/L、pH 5.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积；
犬血浆离心分离后上清液经过0.45μm的在线膜过滤后泵入层析柱，层析过程中控制流速240cm/h，收集层析过程中的流穿液；
再使用含有柠檬酸钠50mmol/L、氯化钠1.0mol/L、pH 5.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液作为缓冲液进行洗脱；
阳离子交换层析的后处理：用含有柠檬酸钠50mmol/L、2mol/L氯化钠、pH 5.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液交替处理层析柱，20％乙醇保存；
其中，本实施例中所述1L阳离子交换凝胶层析介质能够处理2L血浆；
(3)阴离子交换层析
将阴离子交换层析介质DEAE QZT 6FF装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:5，装填好的层析柱使用含有醋酸钠50mmol/L、pH 5.4的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积；
将阳离子交换层析的流穿液的pH调节为5.4，再经过0.45μm的在线膜过滤后泵入层析柱，层析过程中控制流速240cm/h；
再采用含有醋酸钠50mmol/L、氯化钠0.5mol/L、pH 5.4的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液洗脱层析柱，收集洗脱液；
阴离子交换层析的后处理：用含有醋酸钠50mmol/L、氯化钠2.0mol/L、pH5.4的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液交替处理层析柱，并采用质量分数为20％乙醇保存。
(4)超滤浓缩和缓冲液置换
用0.1mo1/L氢氧化钠溶液调节步骤(3)所得洗脱液的pH至6.8；
用10kDa的超滤膜包超滤层析混合液，超滤稀释液为生理盐水，调整制品蛋白质浓度22％、pH为6.8、钠离子含量160mmo/L、电导率8.0mS/cm，得到犬血白蛋白制品溶液；
按犬血白蛋白制品溶液每克蛋白质补加辛酸钠0.170mmol/L，60℃、10h灭活病毒，该工艺制备的犬血白蛋白的纯度为98.1％，多聚体含量1.0％，收率达到93％，内毒素含量4EU/mL制品。
实施例2
本实施例中提供一种犬血白蛋白的制备方法，具体步骤如下：
(1)犬血浆离心
取-20℃下的新鲜冷冻犬血浆在4℃冰箱缓慢融化后离心(4℃，10,000r/min，30min)，离心上清用纱布(四层)过滤；
采用0.5mol/L盐酸调节pH为6.0，再次离心(4℃，10,000r/min，30min)，取上清，采用平衡缓冲液(含有柠檬酸钠50mmol/L、pH 6.0的磷酸氢二钠与柠檬酸)稀释至蛋白浓度10g/L；
(2)阳离子交换层析
将阳离子交换层析介质SP QZT 6FF装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:5，装填好的层析柱使用含有柠檬酸钠20mmol/L、pH 6.0的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积；
犬血浆离心分离后上清液经过0.45μm的在线膜过滤后泵入层析柱，层析过程中控制流速120cm/h，收集层析过程中的流穿液；
再使用含有柠檬酸钠20mmol/L、氯化钠1.0mol/L、pH 6.0的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液洗脱；
最后用含有柠檬酸钠20mmol/L、2mol/L氯化钠、pH 6.0的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液交替处理层析柱，并采用质量分数为20％乙醇保存；
(3)阴离子交换层析
将阴离子交换层析介质Capto DEAE装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:5，装填好的层析柱使用含有醋酸钠100mmol/L、pH 4.9的缓冲液平衡5个柱体积；
将阳离子交换层析的流穿液的调节pH为4.9，再经过0.45μm的在线膜过滤后泵入层析柱，层析过程中控制流速120cm/h；
再采用含有醋酸钠100mmol/L、氯化钠0.5mol/L、pH 4.9的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液洗脱层析柱，收集层析过程中的洗脱液；
最后，用含有醋酸钠100mmol/L、氯化钠2.0mol/L、pH 4.9的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液交替处理层析柱，并采用质量分数为20％乙醇保存。
其余步骤的技术特征同实施例1，该实施例1中制备得到的犬血白蛋白的纯度为97.2％，多聚体含量2.5％，收率达到94％，内毒素含量为5EU/mL。
实施例3
本实施例中提供一种犬血白蛋白的制备方法，具体步骤如下：
(1)犬血浆离心
取-20℃下的新鲜冷冻犬血浆在4℃冰箱缓慢融化后离心(4℃，10,000r/min，30min)，离心上清用纱布(四层)过滤；
采用0.5mol/L盐酸调节pH为6.5，再次离心(4℃，10,000r/min，30min)，取上清，采用平衡缓冲液(含有柠檬酸钠20mmol/L、pH 6.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液)稀释至蛋白浓度15g/L；
(2)阳离子交换层析
将阳离子交换层析介质Capto S装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:15，装填好的层析柱使用含有柠檬酸钠20mmol/L、pH 6.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积；
犬血浆离心分离后上清液经过0.45μm的在线膜过滤后泵入层析柱，层析过程中控制流速60cm/h收集层析过程中的流穿液；
再使用含有柠檬酸钠20mmol/L、氯化钠1.0mol/L、pH 6.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液洗脱，再用含有柠檬酸钠20mmol/L、2mol/L氯化钠、pH 6.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液交替处理层析柱，并采用质量分数为20％乙醇保存。
(3)阴离子交换层析
将阴离子交换层析介质Fractogel TMAE装填在层析柱内，柱床体积与上样制品体积的比例为1:15，层析柱使用含有醋酸钠20mmol/L、pH 4.9的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液平衡5个柱体积；
将阳离子交换层析的流穿液的pH调节为4.9，再经过0.45μm的在线膜过滤后泵入层析柱，层析过程中控制流速60cm/h；
再采用含有醋酸钠20mmol/L、氯化钠0.5mol/L、pH 4.9的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液洗脱层析柱，收集层析过程中洗脱液；
而后，用含有醋酸钠20mmol/L、氯化钠2.0mol/L、pH 4.9的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液交替处理层析柱，并采用质量分数为20％乙醇保存；
其余步骤的技术特征同实施例1，该工艺制备的犬血白蛋白的纯度为98.1％，多聚体含量1.8％，收率达到92％，内毒素含量4EU/mL制品。
实施例4
与实施例1的区别在于，本实施例中步骤(1)不包括调节pH的步骤，即将离心后的血浆直接使用平衡缓冲液进行稀释，再进行阳离子交换层析；其余步骤与实施例1保持一致。
实施例5
与实施例1的区别在于，本实施例中步骤(3)不包括调节pH的步骤，即将流穿液直接进行阴离子交换层析；其余步骤与实施例1保持一致。
实施例6
与实施例1的区别在于，本实施例中步骤(3)所用的洗脱缓冲液为相同pH的乙酸和乙酸钠缓冲液；其余步骤与实施例1保持一致。
对比例1
与实施例1的区别在于，本对比例中不经过阴离子交换层析的步骤；
其余步骤与实施例1保持一致。
对比例2
与实施例1的区别在于，本对比例中先进行阴离子交换层析，再进行阳离子交换层析；
其余步骤与实施例1保持一致。
对比例3
本对比例中采用低温乙醇法进行纯化，具体步骤参见CN1648134A中记载的纯化方法。
上述实施例与对比例中制备得到的犬血白蛋白的各项参数如表1所示：
其中，纯度采用中国药典2015版通则0541第二法进行检测；聚集体采用中国药典2015版通则3121进行检测；收率采用中国药典2015版通则0731第三法进行计算；内毒素采用中国药典2015版通则1143进行检测。
表1
由上表可知，本发明中提供的纯化方法能够得到纯度较高的犬血白蛋白，其纯度均大于85％，由实施例1～6可知，所得白蛋白的纯度为86.1～98.1％，最高可达98.1％，聚集体含量为1.0～2.5％，收率为90％～94％，内毒素含量较低，生物安全性较高；
同时，由实施例1与实施例4和5比较可知，在层析前调节pH的步骤较为重要，能够有效对白蛋白和杂蛋白进行分离和纯化，提高收率和纯度，同时，由实施例1和实施例6比较可知，选择合适的洗脱缓冲液能够进一步提高产品的收率和纯度。
本发明中还将先进行阴离子交换层析后进行阳离子交换层析的方式作为对比(即对比例2)，结果发现由于白蛋白是血浆中含量最高的蛋白，约占血浆中蛋白总量的55％～60％，如果第一步采用吸附方式的阴离子交换层析，介质的处理量较低，不符合纯化工艺中先高处理量再精制的原则。
同时，图1显示了商品化犬血白蛋白、实施例1中步骤(2)结束后收集得到的流穿液以及步骤(3)结束后收集的洗脱液经SDS凝胶电泳后得到的电泳图，其中，泳道1为商品化犬血白蛋白，泳道2为阳离子交换层析流穿液，泳道3为阴离子交换层析洗脱液；由图可知，在只经过阳离子层析后，所得流穿液中杂蛋白含量已经较少，且犬血白蛋白的含量较高，在经过阴离子层析后，所得洗脱液中基本不存在杂蛋白，所得犬血白蛋白的纯度较高。
此外，本发明中还将实施例1所述的纯化方法与只进行两次阴离子交换层析的纯化方法与进行了比较，发现两步阴离子交换层析仅相当于重复了本发明所述的步骤(3)两次，处理量较小，不适用于大规模生产，工业应用价值较低。
综上所述，本发明的犬血白蛋白制备工艺，以健康犬血浆为原料，通过血浆的合并与融化、经离心分离后上清液进行处理，结合两步层析工艺，即可制备高纯犬血白蛋白，且100L层析介质的层析规模即可处理相当于200～1000L的血浆原料，完全可放大于实际生产；经SDS-PAGE检测该工艺制备的犬血白蛋白的纯度≥97％，多聚体含量≤3％，收率达到90％以上。制品的纯度更高，收率更高，杂蛋白含量更低，用药更加安全。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种犬血白蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将犬血浆离心后取上清液，再依次使用阳离子交换层析和阴离子交换层析纯化所述上清液，而后，经过超滤浓缩和缓冲液置换，得到犬血白蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将犬血浆离心，收集上清液并调节pH，再使用平衡缓冲液进行稀释；
(2)将步骤(1)中稀释后得到的上清液使用阳离子交换层析柱进行层析，收集流穿液；
(3)调节步骤(2)所得流穿液的pH，并使用阴离子交换层析柱进行层析，再用阴离子交换层析洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
(4)调节步骤(3)所得的洗脱液的pH，并使用超滤膜进行超滤浓缩和缓冲液置换，得到犬血白蛋白溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的温度为2～6℃；
优选地，步骤(1)所述离心的转速为8000～12,000r/min，时间为20～40min；
优选地，步骤(1)所述调节pH为将pH调节至4.0～6.9；
优选地，步骤(1)所述平衡缓冲液包含1～50mmol/L的柠檬酸钠；
优选地，步骤(1)所述平衡缓冲液的pH值为4.0～6.9。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述阳离子交换层析柱使用的阳离子交换层析介质包括CM QZT 6FF、SP QZT 6FF、CM QZT XL、SP QZT XL、CMSepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow、SP Sepharose XL或Capto S中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述阳离子交换层析介质的使用量与流穿液的体积比为1:(2～40)；
优选地，步骤(2)所述层析时液体的流速60～240cm/h；
优选地，步骤(2)所述阳离子交换层析柱在使用前还包括使用平衡液1进行处理的步骤；
优选地，所述平衡液1包括1～50mmol/L的柠檬酸钠；
优选地，所述平衡液1的pH为4.0～6.9，优选为6.0；
优选地，步骤(2)收集流穿液后还包括使用阳离子层析洗脱缓冲液进行洗脱的步骤；
优选地，所述阳离子层析洗脱缓冲液包括1～50mmol/L的柠檬酸钠和0.1～1.0mol/L的氯化钠；
优选地，所述阳离子层析洗脱缓冲液的pH为4.0～6.9，优选为6.0；
优选地，步骤(2)所述阳离子交换层析柱在使用后还包括使用洗涤液1和洗涤液2进行交替洗涤的步骤；
优选地，所述洗涤液1包括1～50mmol/L的柠檬酸钠和0.5～2.0mol/L的氯化钠；
优选地，所述洗涤液2包括0.1～0.5mol/L氢氧化钠水溶液。
5.根据权利要求2～4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述阴离子交换层析柱使用的阴离子交换层析介质包括DEAE QZT 6FF、Q QZT 6FF、DEAE QZT XL、Q QZT XL、DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose XL、Fractogel TMAE或Capto DEAE中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述阴离子交换层析介质的使用量与稀释后得到的上清液的体积比为1:(2～20)；
优选地，步骤(3)中将所述流穿液的pH调节为4.8～6.0，优选为5.4；
优选地，步骤(3)所述层析时液体的流速60～240cm/h；
优选地，步骤(3)所述阴离子交换层析柱在使用前还包括使用平衡液2进行处理的步骤；
优选地，所述平衡液2包括1～50mmol/L的醋酸钠；
优选地，所述平衡液2的pH为4.8～6.0，优选为5.4；
优选地，步骤(3)所述阴离子交换层析洗脱缓冲液包括1～50mmol/L的醋酸钠和0.01～0.5mol/L的氯化钠；
优选地，所述阴离子交换层析洗脱缓冲液的pH为4.8～6.0，优选为5.4；
优选地，步骤(3)所述阴离子交换层析柱在使用后还包括使用洗涤液3和洗涤液4进行交替洗涤的步骤；
优选地，所述洗涤液3包括1～50mmol/L的醋酸钠和0.5～2.0mol/L的氯化钠；
优选地，所述洗涤液4包括0.1～0.5mol/L氢氧化钠水溶液。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱和阴离子交换层析柱在交替洗涤后，保存于储存液中；
优选地，所述储存液为质量分数为15～25％的乙醇溶液；
优选地，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中调节pH使用的pH调节剂包括盐酸和/或氢氧化钠。
7.根据权利要求2～6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中将所述洗脱液的pH调节至6.5～7.0；
优选地，步骤(4)所述超滤浓缩和缓冲液置换的方法包括：将调节pH后的洗脱液置于超滤膜内，并将所述超滤膜放入超滤稀释液中，超滤后得到所述犬血白蛋白溶液；
优选地，所述超滤膜的截留分子量为10～30kDa；
优选地，所述超滤稀释液包括生理盐水；
优选地，所述超滤后还包括添加稳定剂的操作；
优选地，所述稳定剂包括辛酸钠；
优选地，所述超滤后还包括巴氏病毒灭活处理的操作；
优选地，所述巴氏病毒灭活处理的温度为59.5℃～60.5℃，时间为9.5～12h。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在2～6℃下离心犬血浆，所述离心的转速为8000～12,000r/min，时间为20～40min，所述离心结束后收集上清液并调节pH至4.0～6.9，再使用包含1～50mmol/L柠檬酸钠的平衡缓冲液进行稀释；
(2)使用pH为4.0～6.9、包含1～50mmol/L柠檬酸钠的平衡液1平衡阳离子交换层析柱，再将步骤(1)中稀释后得到的上清液使用阳离子交换层析柱进行层析，层析时液体的流速60～240cm/h，收集流穿液；
而后，使用pH为4.0～6.9、包含1～50mmol/L柠檬酸钠和0.1～1.0mol/L氯化钠的阳离子层析洗脱缓冲液洗脱所述阳离子交换层析柱，再使用洗涤液1和洗涤液2进行交替洗涤，存储于质量分数为15～25％的乙醇溶液中；
(3)使用pH为4.8～6.0、包含1～50mmol/L醋酸钠的平衡液2平衡阴离子交换层析柱，调节步骤(2)所得流穿液的pH至4.8～6.0，并使用阴离子交换层析柱进行层析，再用pH为4.8～6.0、包括1～50mmol/L醋酸钠和0.01～0.5mol/L氯化钠的阴离子交换层析洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
而后，使用洗涤液3和洗涤液4进行交替洗涤，存储于质量分数为15～25％的乙醇溶液中；
(4)调节步骤(3)所得的洗脱液的pH至6.5～7.0，置于截留分子量为10kDa的超滤膜内，并将所述超滤膜放入生理盐水中进行超滤浓缩和缓冲液置换，再加入辛酸钠，而后进行巴氏病毒灭活处理，得到犬血白蛋白溶液。
9.一种利用如权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的犬血白蛋白。
10.如权利要求1～8任一项所述的制备方法或如权利要求9所述的犬血白蛋白在制备犬类疾病的治疗药物或疫苗中的应用。
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