CN103880947A - 一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法，包括将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I；在结合条件下，将初级产物I经阴离子/疏水复合填料的交换层析，得到中级产物II；将中级产物II经疏水层析，得到纯化的高纯度重组人血清白蛋白目标物。用本发明的层析方法分离纯化后得到的重组人血清白蛋白纯度达99.9999％，内毒素含量达到我国药典规定的标准。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白(OsrHSA)可用于临床应用的方法。
背景技术
人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。
目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点：一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在问题，例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。
随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(OsrHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产OsrHSA，例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta，M.et al.，Bio/Technology，5：1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders，C.W.etal，J.Bacteriol.169：2917-2925，(1987))，真核生物如酵母(WO 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产OsrHSA。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。
本发明人的中国专利申请No.201010606635.8公开了一种从水稻种子中提取OsrHSA的方法，在该方法的基础上，本发明进一步对去除OsOsrHSA的内毒素含量和提高纯度到＞99.9999％的工艺进行研究，从而得到本发明的新技术方案，在此，将申请No.201010606635.8公开的内容全文引入本发明的背景技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种从转基因水稻种子的蛋白粗提液中分离纯化重组人血清白蛋白的层析方法，纯化后得到的重组人血清白蛋白纯度达99.9999％，内毒素含量达到我国人血清白蛋白的药典标准。
本发明的技术方案为：
一种用分离纯化重组人血清白蛋白(OsrHSA)的层析方法
包括以下步骤：
1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I；
2)在结合条件下，将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II；
3)将中级产物II经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白目标物。
其中，所述阳离子交换层析的填料为Capto-MMC或Bestarose DiamondMMC；所述阴离子交换层析的填料为Capto-Adhere或Bestarose Diamond MMA；所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose HP或Phenyl Bestarose HP；所述缓冲液包括洗杂缓冲液、平衡缓冲液I和平衡缓冲液II，其中洗杂缓冲液加入10-20％的乙醇，优选10％，平衡缓冲液I加入0-10％的乙醇，平衡缓冲液II加入5-15％，优选10％。
附图说明
图1是三种不同条件的Capto-MMC层析纯化效果与载量测定图；
其中，M为分子量标记，L为提取液样品，M1为对照组，M2为试验组1，M3为试验组2，FT为上样穿透液，M3FT为M3试验组的上样流穿液，600、660和730分别为上样600mL、660mL和730mL时的流穿液，wash为含OsrHSA组分的洗杂液，Elution为含OsrHSA组分的洗脱液。
图2是Capto MMC与Bestarose Diamond MMC进行初级纯化的纯度比较图；
其中，GE-MMC即为Capto-MMC，Best-MMC即为Bestarose Diamond MMC，Elu表示两种填料进行初级纯化的洗脱液；M为分子量标记，FT为上样穿透液，wash为OsrHSA洗杂液，Elu为含OsrHSA组分的洗脱液，S为提取液样品，CIP1为填料再生1洗脱液，CIP2为填料再生2洗脱液。
图3是UNO Sphere S加醇与不加醇层析的纯化效果比较图；
其中，CK为对照组；UE为试验组(样品和平衡液中加10％乙醇)；M为分子量标记；Load为样品；FT为上样穿透液；Elution为两种条件下洗脱的目标峰收集液CIP为填料再生。
图4是Capto-Adhere与Bestarose Diamond MMA在穿透条件下进行中级纯化的比较SDS-PAGE图谱；
其中，M为分子量标记，MMC为样品，FT为含OsrHSA组分的穿透液，CIP为填料再生。
图5是Capto-Adhere与Bestarose Diamond MMA在结合条件下进行中级纯化的比较；
其中，M为分子量标记，L为样品，FT为上样穿透液，Elu为含OsrHSA组分的洗脱液，C为填料再生。
图6是Phenyl Sepharose HP和Phenyl Bestarose HP疏水层析进行最终纯化比较；
其中，M为分子量标记，Ad为上样样品，FT为含有OsrHSA组分的穿透液，CIP为填料再生)
图7是水稻种子蛋白质纯化前后的杂质检测图；
其中，左图为水稻种子人血清白蛋白纯化前后的杂质检测SDS-PAGE对比图；右图为水稻种子人血清白蛋白纯化前后的采用全水稻种子杂质抗体进行杂交的Western Blotting检测图；M为分子量标记。
图8是本发明一个实施例中分离纯化OsrHSA的SDS-PAGE图谱。
其中，A为Capto-MMC层析，B为Capto-Adhere层析，C为Phenyl HP层析；L为上样液，FT为流穿液，W为洗杂液，Elu为洗脱液，C为填料CIP。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。
【实施例1】0srHSA得取液的制备
参考本发明人的中国专利NO.200510019084.4的方法制备含有OsrHSA的转基因水稻，并参考本发明人的中国专利NO.201010606635.8的方法从水稻种子中提取OsOsrHSA，得到澄清的OsrHSA提取液。
【实施例2】阳离子交换层析进行初级纯化的条件筛选
方法：参考本发明人中国专利申请号NO.201010606635.8的方法进行；
分组：试验组和对照组
1.用Capto MMC阳离子交换层析进行初级纯化及加醇去除内毒素工艺
以下利用Capto MMC阳离子交换层析进行初级纯化，并在试验组的缓冲液中添加乙醇以去除OsrHSA提取液中的内毒素，对照组(M1)则不加乙醇。
试验组1(M2)：平衡液和样品中加10％乙醇，具体工艺条件为：
装柱：将Capto MMC填料约30mL装于XK16/400mm层析柱中，用0.5NNaOH清洗30min灭热原；
平衡：用200mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
上样：向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加10％(v/v)无水乙醇和11g/LNaCl，用NaOH调pH4.5；以600cm/h的流速上样，样品电导为20-21mS/cm，pH为4.5；
再平衡：上样结束后，用100mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
洗杂：用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 58.5g/L，乙酸调至pH4.8，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
洗脱：用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
试验组2(M3)：平衡液和样品中加10％乙醇，洗染液中加20％乙醇，具体工艺条件为：
装柱：将Capto MMC填料约30mL装于XK16/400mm层析柱中(柱高21cm)，用0.5N NaOH清洗30min灭热原；
平衡：用200mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
上样：向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加10％(v/v)无水乙醇和11g/LNaCl，用NaOH调pH4.5；以600cm/h的流速上样，样品电导为20-21mS/cm，pH为4.5；
再平衡：上样结束后，用100mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
洗杂：用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，NaCl 120g/L，20％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.8，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
洗脱：用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
结果：纯度及载量测定如图1所示：对照组和两个试验组在纯度上无明显差异，洗杂液中加醇洗有利于17-26KD杂带的去除；Capto-MMC加醇洗对载量没有影响，3组试验中的FT显示载量均高于30mL提取液/mL填料。
内毒素情况：如表1所示，Capto-MMC加醇洗层析对内毒素的去除有良好的效果，与对照试验相比，平衡液和提取液样品中加10％(v/v)乙醇，洗杂液中加20％乙醇进行Capto-MMC层析对内毒素的去除效果最佳，约为对照试验的3.6倍。
表1Capto-MMC加醇洗试验的内毒素情况比较
2.Capto MMC加醇洗除内毒素工艺的条件优化
2.1提取液样品中加醇/不加醇的除内毒素效果比较，具体工艺条件为
对照组(M1)：平衡液和样品中加10％乙醇，洗杂液中加20％乙醇，具体工艺条件为：
装柱：将Capto MMC填料约29mL装于BioRad 15/400mm层析柱中，用0.5N NaOH清洗30min灭热原；
平衡：用200mL平衡缓冲液I(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
上样：向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加10％(v/v)无水乙醇和11g/LNaCl，用NaOH调pH4.5；以600cm/h的流速上样，上样870mL，样品电导为20-21mS/cm，pH为4.5，样品内毒素1000-2000EU/mL；
再平衡：上样结束后，用100mL平衡缓冲液II(无水乙酸钠2g/L，NaCl15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
洗杂：用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，20％(v/v)无水乙醇，NaCl调电导至83mS/cm，乙酸调至pH4.8，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
洗脱：用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
试验组(M2)：样品与平衡液I中不加乙醇，上样结束后，用含10％乙醇的平衡液II平衡150mL(约5CV)，Wash加20％乙醇；其他条件与M1完全相同。
结果如表2所示，两组平行试验的总EU降低倍数基本一致，样品与平衡液I加醇与不加醇对内毒素的去除效果的影响不显著。两者收集液蛋白浓度和体积相差不大，且内毒素大小相同，进一步说明了样品和平衡液I中不加乙醇也可以达到相同的除内毒素效果。
表2Capto-MMC样品与平衡液中加乙醇与不加乙醇的除内毒素比较
2.2洗杂液中不同加醇量对内毒素去除效果的比较
对照组1(M1)：
装柱：将Capto MMC填料约29mL装于BioRad 15/400mm层析柱中，用0.5N NaOH清洗30min灭热原；
平衡：用200mL平衡缓冲液I(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，乙酸调至pH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
上样：向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加11g/L NaCl，用NaOH调pH4.5；以600cm/h的流速上样，上样650mL，样品电导为20-21mS/cm，pH为4.5，样品内毒素1000-2000EU/mL；
再平衡：上样结束后，用150mL平衡缓冲液II(无水乙酸钠2g/L，NaCl15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
洗杂：用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，20％(v/v)无水乙醇，NaCl调电导至83mS/cm，乙酸调至pH4.8，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
洗脱：用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
试验组1(M2)：洗杂液中添加15％(v/v)无水乙醇，其他条件与M1相同。
试验组2(M3)：洗杂液中添加10％(v/v)无水乙醇，其他条件与M1相同。
结果如表3所示。
表3Capto-MMC洗杂液中加不同量乙醇的除内毒素情况比较
由表3分析：M3组内毒素总EU降低38倍，与M1(对照组)差异明显；M2组加15％乙醇，降低52倍，收集液内毒素大小与M1相同，与M1(对照组)差异不明显，可以将MMC洗杂液中的乙醇浓度降至15％左右，对内毒素的去除效果无显著影响。
3.阳离子层析介质的筛选及加醇洗除内毒素情况
3.1利用Bestarose Diamond MMC进行阳离子交换层析及加醇除内毒素工艺，具体工艺条件为：
装柱：将Bestarose Diamond MMC填料约33mL装于BioRad 15/400mm层析柱中，用0.5N NaOH清洗30min灭热原；
平衡：用200mL平衡缓冲液I(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，乙酸调至pH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到4.5并稳定；
上样：向含有OsrHSA的澄清提取液样品中添加11g/L NaCl，用NaOH调pH4.5；以600cm/h的流速上样，上样600mL，样品电导为20-21mS/cm，pH为4.5，样品内毒素1500-2000EU/mL；
再平衡：上样结束后，用150mL平衡缓冲液II(无水乙酸钠2g/L，NaCl15g/L，10％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.5，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱；
洗杂：用200mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，15％(v/v)无水乙醇，NaCl调电导至83mS/cm，乙酸调至pH4.8，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质；
洗脱：用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。
结果：如图2所示。纯度：纯度上Bestarose Diamond MMC与Capto-MMC无明显差异，表明Bestarose Diamond MMC可以用于OsrHSA的初级纯化。
内毒素：使用Bestarose Diamond MMC加醇层析对提取液样品进行初级纯化后，内毒素总EU降低62倍，达到了Capto-MMC相同的除内毒素效果。
【实施例3】阴离子交换层析进行中级纯化的条件筛选
1.在OsrHSA穿透条件下(即在电导为40mS/cm，pH7.0的条件下，OsrHSA组分不与填料结合直接穿出，而杂质与填料结合，从而分离纯化)，利用Capto-Adhere和Bestarose Diamond MMA进行阴离子交换层析
使用XK16×400mm层析柱，装Capto-Adhere填料约40mL，柱高20.5cm。用平衡缓冲液(25mM PB，NaCl 23.4g/L，pH7.0)平衡约8CV，至UV、pH和cond至基线。将Capto-MMC或Bestarose Diamond MMC的洗脱液样品调pH7.0，以300cm/h的流速上样288mL。当穿透紫外吸收值＞20mAU时开始收集，即得到含有OsrHSA的目标组分。每20mL取样一次，用于测试载量，记录穿透部分的纯度无明显变化的总上样量，计算在300cm/h的流速下，每毫升Capto-Adhere填料的实际载量。
使用Bestarose Diamond MMA填料在OsrHSA穿透条件下的层析条件与Capto-Adhere相同，进行平行试验比较其纯化效果和载量大小。
在OsrHSA穿透条件下，经过两种阴离子填料进行中级纯化后，HPLC纯度达到98％以上，两种填料在纯度上没有明显差异，如图4所示。
2.在OsrHSA结合条件下，利用Capto-Adhere进行阴离子交换层析
结合条件，即先让目标蛋白与填料结合，部分杂质穿出，然后通过特定的盐和pH洗脱出目标蛋白，达到分离纯化和富集目标产物的作用，该模式的条件为：电导为20mS/cm，pH7.0-7.5时目标组分与阴离子填料结合，再通过电导为40mS/cm，pH为7.0-7.2的条件洗脱目标组分，达到除杂和富集目的。
将Capto-Adhere填料约22mL装于BioRad 15/200mm层析柱上，用220mL平衡缓冲液(磷酸二氢钠1.0g/L，磷酸氢二钠5.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH7.5-7.6)以流速300cm/h平衡柱子，直到pH达到7.5-7.6并稳定。将Capto-MMC或Bestarose Diamond MMC的洗脱液样品用水稀释至电导19-21mS/cm，NaOH调pH至7.0，以300cm/h流速上样150mL。用平衡缓冲液再次平衡约100mL，用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钠5.0g/L，NaCl 23.4g/L，pH7.1-7.2)以流速300cm/h洗脱柱子，收集洗脱峰即得到含OsrHSA的组分。收集液内毒素为100-200EU/mL。
使用Bestarose Diamond MMA填料在OsrHSA结合条件下的层析条件下与Capto-Adhere相同，进行平行试验比较其纯化效果和载量大小。
在OsrHSA结合条件下，经过Capto-Adhere和Bestarose Diamond MMA两种填料进行中级纯化后，纯度均达到99.9％以上(ELISA检测结果)，BestaroseDiamond MMA与Capto-Adhere具有相同的纯化效果，电泳图谱如图5所示。
3.利用Capto-Adhere和Bestarose Diamond MMA进行阴离子交换层析的条件筛选
通过对Capto-Adhere和Bestarose Diamond MMA两种填料的平行比较发现，在同一条件下，两种填料对Capto-MMC或Bestarose Diamond MMC的洗脱液样品的中级纯化效果和载量基本一致，表明两种阴离子交换层析介质均可以用于OsrHSA的中级纯化。
两种填料在OsrHSA穿透条件下的载量比结合条件下高，前者载量约为25mg样品/mL填料，而后者载量约为20mg样品/mL填料。但在OsrHSA结合条件下的纯化效果比穿透条件下的纯化效果好，前者纯度达到99.9％以上，而后者只有98％-99％。
在OsrHSA结合条件下，两种填料对样品的内毒素去除效果优于穿透条件，在OsrHSA穿透条件时，大部分内毒素与OsrHSA一同穿透下来，导致填料对内毒素的去除效果不理想；而在结合条件时，部分游离型的内毒素在上样时穿出，另一部分内毒素与填料紧密结合，选择性洗脱OsrHSA，达到了良好的去内毒素效果。
综合考虑各种因素，优选OsrHSA结合条件作为Capto-Adhere和BestaroseDiamond MMA两种阴离子交换介质的层析条件。
【实施例4】疏水层析进行最终纯化的条件筛选
1.利用Phenyl Sepharose HP进行疏水层析
参照本发明人的中国专利CN201010606635.8的方法，将Phenyl sepharoseHP填料约28mL装于XK16/200mm层析柱中，用150mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2.32g/L，磷酸二氢钠2.81g/L，辛酸钠2g/L，硫酸铵66g/L，pH6.5)以100cm/h流速平衡层析柱。将Capto-Adhere或Bestarose Diamond MMA纯化得到的含OsrHSA的洗脱组分100mL加入硫酸铵调电导至75mS/cm，加入辛酸钠0.15g，盐酸调pH6.5，以100cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有OsrHSA的组分，并分段取样进行载量测定，计算每mL填料对中级纯化后的样品的实际载量大小。电泳图谱如图6所示。
2.利用Phenyl Bestarose HP进行疏水层析
将Phenyl Bestarose HP填料约24mL装于XK16/200mm层析柱中，参照本实施例上述1中介绍的层析方法进行平行试验，电泳图谱如图6和图7所示。
结果与分析：
Capto-Adhere或Bestarose Diamond MMA中级纯化的样品经过PhenylSepharose HP或Phenyl Bestarose HP疏水层析后，纯度均达到99.9999％(ElISA检测)，完全检测不到水稻种子蛋白杂质；两种疏水填料在纯度上没有明显差异。经过两种疏水层析介质纯化后得到的含OsrHSA组分的内毒素均小于0.06EU/mg。结果表明，Phenyl Sepharose HP或Phenyl Bestarose HP疏水层析介质均可以用于OsrHSA的最终纯化，达到了良好的纯化和除内毒素效果。
【实施例5】重组人血清白蛋白的分离纯化
以阳离子交换作为初级纯化：将Capto MMC填料约400mL装于XK50/400mm层析柱中，用0.5N NaOH清洗30min灭热原，用2L平衡缓冲液I(无水乙酸钠2g/L，NaCl 11g/L，乙酸调至pH4.5)以300cm/h流速平衡层析柱，直到pH达到5.0并稳定。上样10L，样品电导为20.3mS/cm，pH4.8。上样结束后，用2L平衡缓冲液II(无水乙酸钠2g/L，NaCl 15g/L，10-11％(v/v)无水乙醇，乙酸调至pH4.8，注射用水配制)以300cm/h流速，再次平衡层析柱，用3000mL洗杂缓冲液(无水乙酸钠2g/L，16％(v/v)无水乙醇，NaCl调电导至83.5mS/cm，乙酸调至pH5.0，注射用水配制)以300cm/h流速洗脱杂质。用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠2.67g/L，磷酸氢二钠2.82g/L，NaCl 23.4g/L，pH6.3-6.4，注射用水配制)洗脱目标峰，得到含OsrHSA的组分。电泳图谱如图8中A所示。
以阴离子/疏水复合填料交换层析进行中级纯化：将Capto-Adhere填料约68mL装于XK26/200mm层析柱上，用600mL平衡缓冲液(磷酸二氢钠1.0g/L，磷酸氢二钠5.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH7.5-7.6)以流速300cm/h平衡柱子，直到pH达到7.5-7.6并稳定。以300cm/h流速上样500mL。用平衡缓冲液再次平衡约200mL，用洗脱缓冲液(磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钠5.0g/L，NaCl 23.4g/L，pH7.1-7.2)以流速300cm/h洗脱柱子，收集洗脱峰即得到含OsrHSA的组分。收集液内毒素为100-200EU/mL。电泳图谱如图8中B所示。
以疏水作用层析进行最终纯化：将Phenyl sepharose HP填料约15mL装于XK16/200mm层析柱中，用100mL平衡缓冲液(无水乙酸钠2.32g/L，磷酸二氢钠2.81g/L，辛酸钠2g/L，硫酸铵66g/L，pH6.5)以100cm/h流速平衡层析柱。将Capto-Adhere纯化得到的含OsrHSA的洗脱组分100mL加入硫酸铵调电导至75mS/cm，加入辛酸钠0.15g，盐酸调pH6.5，以100cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有OsrHSA的组分，其内毒素小于0.08EU/mg，纯度大于99.9999％。电泳图谱图8中C所示。
Claims (9)
1.一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I；
2)将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II；
3)将中级产物II经疏水层析，得到高纯度的重组人血清白蛋白目标物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述阳离子交换层析的阳离子/疏水复合填料为Capto-MMC或Bestarose Diamond MMC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述阴离子交换层析的阴离子/疏水复合填料为Capto-Adhere或Bestarose Diamond MMA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中疏水层析的填料为PhenylSepharose HP、Phenyl Sepharose FF、Phenyl Bestarose HP或Phenyl Bestarose FF。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括洗杂缓冲液、平衡缓冲液I和平衡缓冲液II；其中洗杂缓冲液含体积比为10-20％的无水乙醇，平衡缓冲液I含体积比为0-10％的无水乙醇，平衡缓冲液II含体积比为5-15％的无水乙醇。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗杂缓冲液含15％的无水乙醇，平衡缓冲液II含10％的无水乙醇。
7.如权利要求5所述的方法，其中洗杂缓冲液含有：无水乙酸钠2g/L，15％无水乙醇，用NaCl调节电导至83mS/cm，用乙酸调节pH至pH4.6-5.0。
8.如权利要求5所述的方法，其中平衡缓冲液I为：无水乙酸钠2g/L，NaCl15g/L，乙酸调至pH4.2-4.8。
9.如权利要求5所述的方法，其中平衡缓冲液II为：无水乙酸钠2g/L，NaCl15g/L，10％无水乙醇，乙酸调至pH4.2-4.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 430079 Wuhan Province, East Lake City Development Zone, high tech Avenue, No. 666, No. Applicant after: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Corp. Address before: 430079 Wuhan Province, East Lake City Development Zone, high tech Avenue, No. 666, No. Applicant before: HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: WUHAN HEYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. TO: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY CORP. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Denomination of invention: Chromatography method for separating and purifying high purity recombinant human serum albumin Effective date of registration: 20190418 Granted publication date: 20160113 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Corp. Registration number: 2019420000013 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20210322 Granted publication date: 20160113 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Corp. Registration number: 2019420000013 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A kind of chromatography method for separating and purifying high-purity recombinant human serum albumin Effective date of registration: 20220729 Granted publication date: 20160113 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Corp. Registration number: Y2022420000242 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20221027 Granted publication date: 20160113 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Corp. Registration number: Y2022420000242 |