CN105622746A - 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，用一步Q-Sepharose阴离子交换层析及一步亲和层析纯化得到纯度较高的vWF：收集冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制备中经层析柱流出来的液体作为原料；通过Q-Sepharose离子交换柱层析后，收集洗脱液，再经明胶亲和层析，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，得到血管性血友病因子。本发明获得高纯度的血管性血友病因子，质量可靠，可满足临床上血管性血友病人急需的治疗用药需求。同时对于冷沉淀的综合利用，间接节约稀缺血浆资源具有十分重要的意义。

Description

一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种从人血浆冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺，属于生物制药领域。

背景技术

vWF是一种具有多聚体的血浆糖蛋白，其分子量从250kDa到2千万kDa不等，形成血浆中已知的最大分子量可溶性蛋白。血浆中小分子量vWF主要是二聚体形式，分子量约500kDa。大小不等的多聚体，对维持vWF正常生物活性具有重要意义。

血浆vWF在原发性止血中起着重要作用，其负责血小板与受损伤血管表面的粘附，并因此形成血小板栓子，有助于纤维蛋白交联的形成。另外，血浆vWF起着凝血因子VIII的运输剂和稳定剂的作用。

血管性血友病(vWD)是最常见的遗传性出血性疾病，患者vonWillebrand因子(vonWillebrandfactor，vWF)基因突变或调控异常导致血浆vWF数量减少或质量异常。vWD临床特征主要为皮肤黏膜出血，2N型和3型患者还可发生与血友病A相似的关节腔出血和肌肉血肿。据国外报道，vWD发病率(2.3～11.0)/10万人口，一般认为在遗传性出血性疾病中，vWD居第二位。

临床上vWF的活性用瑞斯托霉素辅因子活性(vWF:RCo)来表征，主要用于治疗先天性、获得性血管性血友病(vWD)，一般以20～60UvWF:RCo/kg剂量来给药。

研究表明冷沉淀中富含vWF等凝血因子类物质。在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉淀来制备vWF，对冷沉淀的综合利用，节约稀缺血浆资源，提高市场竞争力具有重大意义。

现有技术中，较早的工艺使用vWF的抗体偶联到琼脂糖凝胶上，通过免疫亲和层析纯化vWF，但其抗体制备周期长，凝胶载量低，不适合作大规模制备，如《PurificationofvonWillebrandFactorsolutionsusinggelpermeationchromatography》(UP4774323)。

有专利用DEAEFractogelTSK650M(Merck)纯化vWF因子组分，纯度高，但是工艺比较复杂，需要两步离子交换和一步亲和层析，如《Processforanindustrial-scalepreparationofastandardizedhumanvonWillebrandfactorconcentrateofveryhighpurityandsuitablefortherapeuticuse》(US5408039)。也有报道CHT层析结合PH5.4酸沉淀分离vWF组分的，其比活不高，且酸沉淀去除纤维结合蛋白的同时，可能影响vWF的生物学活性，如《Productionofavonwillebrandfactorprepartionhavingagreatspecificactivity》(US20070135619A1)。

另外还有一些工艺用EMDFractogelTMAE(Merck)来纯化VIII/vWF因子复合物，但是都无法单独得到高纯度的vWF，治疗针对性不强，如《具有止血活性的含有vWF的制剂及其制备方法》(CN1425024A)，《AProcessforrecoveringahigh-purityvirus-inactivatedfactorVIIIbyanionexchangerchromatography》(US5714590)。

还有一些公司用基因重组的方法(猴肾细胞或CHO细胞)纯化vWF，他们通过阴离子交换层析法从动物细胞培养液中进行提纯，但是由于动物原性抗原的存在，人体对其可能有排斥作用，如《MethodforisolationofhighlypurevonWillebrandFactor》(US5854403)。

另有采用两步层析法纯化制备vWF的报道，但其纯度不高，比活相对较低，仅50IU/mg，如《ProcessformanufacturingvonWillebrandfactor》(US5252710)。

可见，现有的的vWF纯化工艺仍存在一些问题：(1)制备周期长，不适应于大规模制备，尤其是采用免疫亲和层析法纯化时，其抗体制备周期长，凝胶载量低。(2)VIII/vWF复合物产品在较难控制工艺稳定性；(3)重组方法所得vWF产品可能存在异质抗原；(4)分离纯化工艺繁琐。

目前，血管性血友病可用冷沉淀、VIII/vWF因子复合物和DDAVP(1-去氨基-8-D-精氨酸加压素)治疗，但针对性不强，更纯的vWF因子可专一性治疗各种类型的血管性血友病，与前几种方法比有较大优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人vWF的制备工艺。

本发明的主要技术构思如下：

本发明于S/D病毒灭活前优化添加2％氢氧化铝凝胶进行吸附去除II、VII、IX、X因子；S/D灭活前串联过滤使用的滤芯尺寸为1.0μm和0.45μm的滤芯。

本发明对经层析后的蛋白液在层析缓冲液中加入甘氨酸保护vWF活性；优选层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白作为冻干保护剂，保护vWF活性；优选层析缓冲液中甘氨酸质量浓度0.6％～1％，冻干保护剂中赖氨酸质量浓度2～3％，甘氨酸质量浓度0.2％，白蛋白质量浓度0.8～1.3％。

本发明用一步Q-Sepharose阴离子交换层析及一步亲和层析纯化得到纯度较高的vWF。即收集冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制备中经层析柱流出来的液体作为原料；通过Q-Sepharose离子交换柱层析后，收集洗脱液，再经明胶亲和层析，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，得到血管性血友病因子。

本发明的制备工艺中：

(1)通过调整洗涤缓冲液B和洗脱缓冲液B中的盐浓度；采用Q-Sepharose柱层析法去除纤维蛋白原和纤维结合蛋白及其它杂蛋白；

(2)经Q-Sepharose柱层析后的洗脱液，再经明胶层析，通过调整洗脱缓冲液B和透析液的盐浓度，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，即得含高纯度vWF的流穿液。

本发明的制备工艺，它依次包括：冷沉淀溶解、2％氢氧化铝凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D病毒灭活、离子交换层析；离子交换层析得收集洗脱液，洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产，再从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即收集经层析柱流穿出的液体中提取vWF；Q-Sepharose阴离子交换层析、明胶亲和层析、除菌过滤分装、冷冻干燥、干热灭活。离子交换层析流穿液收集后，先浓缩一倍，再用洗涤缓冲液B等体积超滤6次，再经Q-Sepharose层析柱，用洗脱缓冲液B收集洗脱下来的蛋白液。

本发明是这样来实现的，其具体工艺方案如下：

(1)检疫期检疫合格的人血浆领取后，75％乙醇擦拭血浆袋表面，用注射用水冲洗，合并到融浆罐中，用30～35℃以下循环水融化，血浆温度控制不高于4℃；待融化后，离心，出液温度控制在0～4℃，收集冷沉淀；

(2)将步骤(1)的制得物加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在28～37℃；开始离心，收集上清液，称重；

(3)将步骤(2)的制得物上清液用1mol/L盐酸调节PH至6.0～7.0；加入2％氢氧化铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重；

(4)按“W(离子强度缓冲液)＝上清液重量/10”计算，称取计算量的离子强度缓冲液至步骤(3)的制得物上清液中；调节上清液PH至6.0～7.0；用蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于10g/L；用1.0μm的滤芯过滤，收集过滤液，称重；

(5)按步骤(4)的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45μm滤芯过滤；过滤液用30KD超滤膜浓缩至蛋白浓度2％，然后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液A恒体积超滤，得超滤液，称重；

(6)将步骤(5)的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液A洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液A洗脱，收集洗脱液(洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产)。

(7)收集步骤(6)经层析柱流出来的液体，浓缩一倍，洗涤缓冲液B等体积超滤6次，得超滤液，称重。

(8)将步骤(7)的制得物超滤液用Q-Sepharose阴离子交换层析柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液B洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液B洗脱，收集洗脱液，称重。

(9)将步骤(8)的制得物洗脱液明胶亲和层析进行纯化，用洗脱缓冲液B洗涤柱子直至成基线，收集上样后经层析柱流出来的液体，用透析液透析、稀释至效价100IU/ml，得蛋白液，称重。

(10)将步骤(9)的制得物蛋白液经0.2μm除菌滤芯过滤分装；分装好的制品传入冻干柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库。

离子强度缓冲液的配制方法：48.5g三羟甲基氨基甲烷，10g氯化钙，100g氯化钠，28.1g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.0～7.0；蛋白浓度缓冲液的配制方法：量取0.05L调节离子强度缓冲液，加注射用水至1L，调节PH为6.0～7.0。

洗涤缓冲液A配方：2.5g三羟甲基氨基甲烷，10g氯化钙，25g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.0～7.0。

洗脱缓冲液A配方：2.5g三羟甲基氨基甲烷，15g氯化钙，40.9g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.0～7.0。

洗涤缓冲液B的配方：4g枸橼酸钠，11.4g氯化钠，3g氯化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为5.8～6.8。

洗脱缓冲液B配方：4g枸橼酸钠，16.38g氯化钠，3g氯化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为5.8～6.8。

透析液的配方：2.94g枸橼酸钠，25g氯化钠，0.111g氯化钙，30g甘氨酸，2g盐酸赖氨酸，人血白蛋白8g，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.8～7.2。

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

本发明的积极效果：

1、在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉淀来制备vWF，对冷沉淀的充分利用，提高市场竞争力有着重大意义，另外也能间接节约稀缺血浆资源。

2、在离子交换层析提纯vWF的过程中，用适当洗脱液洗脱下来的溶液，再经超滤、透析、过滤等工序，可用于生产凝血因子Ⅷ。

本发明相比于传统vWF的制备工艺，创新点在于：

1.充分利用血浆资源，用凝血因子VIII离子交换的流穿废液制备高纯度vWF。生产凝血因子VIII时会产生废料如vWF、纤维蛋白原等，将废料中的组分分离出来，变废为宝，最大限度利用紧缺的血浆资源，提高血浆利用率。

2、对层析缓冲液加入甘氨酸，层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白，保护vWF活性。层析缓冲液中加入甘氨酸可以在层析分离纯化过程中，减少vWF的活性损失。在蛋白透析液中加入白蛋白、赖氨酸、甘氨酸作为冻干保护剂，可稳定vWF分子。白蛋白是优良蛋白稳定剂，同时可以有效蛋白质表面的吸附。赖氨酸、甘氨酸为小分子氨基酸，可以保护蛋白质结构，能升高成品的塌陷温度，阻止冻干过程中因塌陷导致的蛋白质损伤。保持生物学活性。

3、离子交换层析分离vWF的最关键因素是洗涤液和洗脱液的盐离子浓度。洗涤液盐浓度过低会导致纤维蛋白原、纤维结合蛋白等杂质残存，洗涤液盐浓度过高，将导致vWF的回收率降低，洗脱得到的vWF量减少。在多次试验后发现，195mM(11.4g/L)氯化钠为最佳洗涤液盐浓度。另外洗脱液盐浓度也需在适宜范围内，过高过低也不利于vWF的获得，我们通过试验确定为280mM(16.38g/L)。这两种盐浓度的配比可以兼顾vWF的活性和比活，是一对最好的配比浓度。

4、本工艺采用一步离子交换和一步亲和层析工艺，既能保证vWF的纯度和收率，也可简化生产工艺，充分降低人力和时间成本。离子交换层析起到初步纯化的作用，亲和层析填料具有特异性结合蛋白的特点，进一步对蛋白进行精细纯化。

5、采用人源性的冷沉淀作为起始原料，避免了重组蛋白的异质抗原排斥反应的发生，提高了临床使用安全性。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施案例

本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

以6000L血浆为例，具体制备工艺如下：

(1)检疫期检疫合格的人血浆领取后，75％乙醇擦拭血浆袋表面，用注射用水冲洗，合并到融浆罐中，用30～35℃以下循环水融化，血浆温度控制不高于4℃；待融化后，离心，出液温度控制在0～4℃，收集得冷沉淀45.2kg；

(2)将步骤(1)的制得物冷沉淀加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在28～37℃；开始离心，收集上清液，称重得169.5kg；

(3)将步骤(2)的制得物上清液用1mol/LHCL调节PH至6.0～7.0；加2％氢氧化铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重得178.6kg；

(4)按“W(离子强度缓冲液)＝上清液重量/10”计算，称取计算量的离子强度缓冲液至步骤(3)的制得物上清液中；调节上清液PH至6.0～7.0；用蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于10g/L；用1.0μm的滤芯和0.45μm的滤芯串联后过滤，收集过滤液，称重得189.9kg；

(5)按步骤(4)的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45μm滤芯过滤；过滤液用30KD超滤膜浓缩至蛋白浓度约2％，然后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液A恒体积超滤，即超滤液，称重得201.4L；

(6)将步骤(5)的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液A洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液A洗脱，收集洗脱液。

(7)收集步骤(6)经层析柱流出来的液体，浓缩一倍，洗涤缓冲液B等体积超滤6次，得超滤液，称重得120.5L；

(8)将步骤(7)的制得物超滤液用Q-Sepharose阴离子交换层析柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液B洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液B洗脱，收集洗脱液，称重得48.5L；

(9)将步骤(8)的制得物洗脱液明胶亲和层析进行纯化，用洗脱缓冲液B洗涤柱子直至成基线，收集上样后经层析柱流出来的液体，超滤浓缩至5L,透析6遍，得超滤液，称重得5.2L；按效价100IU/ml稀配至6.1L；

(10)将步骤(9)的制得物滤液经0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装装量为每瓶5mL，分装数量为1196瓶；分装好的制品传入冻干柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库；

所述百分数除有限定外，其余为质量百分数。

本发明方法制备的产品与《欧洲药典中》描述的vWF关键质量指标的对比如下表1。

表1：

项目	本发明	《欧洲药典》
			PH	6.8～7.2	6.5～7.5
活性	应≥100IU/ml	≥1IU/ml
			比活	应≥200IU/mg	≥20IU/mg
凝血因子VIII含量	每100IU vWF:RCo中VIII:C 2～4IU/ml	每100IUvWF:RCo中VIII:C≤10IU/ml
			渗透压摩尔浓度	240～1000mOsmol/kg	应不低于240mOsmol/kg

本发明方法制备的产品中，不同的离子交换盐浓度对产品质量的影响的小试研究，如下表2。

表2：

说明：阴离子交换过程中，vWF和纤维结合蛋白在150mMNaCl到300mMNaCl这个盐浓度区间，对盐浓度即离子强度非常敏感，经试验对比分析，筛选得到两种主要杂质(纤维结合蛋白和纤维蛋白原)最少的层析缓冲液配方。优选洗涤液为195mMNaCl(11.4g/L)和洗脱液为280mM(16.38g/L)NaCl，可得到活性和比活均较高的vWF。

本发明方法制备的产品中，层析缓冲液中甘氨酸对产品的影响，如表3。

表3：

甘氨酸浓度(％)	洗涤液B盐浓度(％)	洗脱液B盐浓度(％)	vWF:RCo活性(IU/ml)
				0	195	280	101.5
0.2	195	280	102.1
				0.6	195	280	104.8
1.0	195	280	104.81

说明：层析缓冲液中的甘氨酸能在层析过程中，保护vWF中的作用，质量浓度0.6％～1％，此范围的甘氨酸浓度对层析过程vWF的保护作用相差不大，选择较低的即可，最佳的是0.6％。

本发明方法制备的产品中，透析液(冻干保护液)各种不同成分对产品的影响，如表4。

表4：

说明：甘氨酸质量浓度2～3％，赖氨酸质量浓度0.2％，白蛋白质量浓度0.8～1.3％，为较好的适用范围，外观略微或无萎缩，且有轻微或无乳光，活性亦得到较好保护。赖氨酸的质量浓度的差别对冻干保护影响较小，选择0.2％即可。最佳的透析缓冲液(冻干保护液)配方为甘氨酸浓度为3％，白蛋白浓度为0.8％，外观和活性均为最佳。

Claims (10)

1.一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，用一步Q-Sepharose阴离子交换层析及一步亲和层析纯化得到纯度较高的vWF：收集冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制备中经层析柱流出来的液体作为原料；通过Q-Sepharose离子交换柱层析后，收集洗脱液，再经明胶亲和层析，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，得到血管性血友病因子。

2.根据权利要求1所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的的制备工艺包括：冷沉淀溶解、凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D灭活、离子交换层析；离子交换层析收集洗脱液，洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产；优选在S/D灭活前的凝胶吸附为添加2％氢氧化铝凝胶进行吸附。

3.一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，收集冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制备中经层析柱流出来的液体作为原料；在血管性血友病因子的制备工艺中，对经层析后的蛋白液在层析缓冲液中加入甘氨酸保护vWF活性；优选层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白作为冻干保护剂，保护vWF活性；优选层析缓冲液中甘氨酸质量浓度0.6％～1％，冻干保护剂中赖氨酸质量浓度2～3％，甘氨酸质量浓度0.2％，白蛋白质量浓度0.8～1.3％。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，

(1)通过调整洗涤缓冲液B和洗脱缓冲液B中的盐浓度；采用Q-Sepharose柱层析法去除纤维蛋白原和纤维结合蛋白及其它杂蛋白；

(2)经Q-Sepharose柱层析后的洗脱液，再经明胶层析，通过调整洗脱缓冲液B和透析液的盐浓度，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，即得含高纯度vWF的流穿液。

5.根据权利要求2所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，S/D灭活前串联过滤使用的滤芯尺寸为1.0μm和0.45μm的滤芯。

6.根据权利要求2所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，离子交换层析流穿液收集后，先浓缩一倍，再用洗涤缓冲液B等体积超滤6次，再经Q-Sepharose层析柱，用洗脱缓冲液B收集洗脱下来的蛋白液。

7.根据权利要求4所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，所述的洗涤缓冲液B的配方：4g枸橼酸钠，11.4g氯化钠，3g氯化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为5.8～6.8。

8.根据权利要求4所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，所述的洗脱缓冲液B配方：4g枸橼酸钠，16.38g氯化钠，3g氯化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为5.8～6.8。

9.根据权利要求4所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，所述的透析液配方：2.94g枸橼酸钠，25g氯化钠，0.111g氯化钙，30g甘氨酸，2g盐酸赖氨酸，人血白蛋白8g，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.8～7.2。

10.根据权利要求1所述的一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，其特征在于，制备工艺如下：

(1)收集冷沉淀；

(2)将步骤(1)的冷沉淀加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在28～37℃；开始离心，收集上清液，称重；

(3)将步骤(2)的制得物上清液用1mol/LHCL调节pH至6.0～7.0；加入2％氢氧化铝凝胶，搅拌；开始离心，收集上清液，称重；

(4)按“调节离子强度缓冲液W＝上清液重量/10”计算，称取计算量的调节离子强度缓冲液至步骤(3)的制得物上清液中；调节上清液pH至6.0～7.0；用调节蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于10g/L；用1.0μm的滤芯和0.45μm的滤芯串联过滤，收集过滤液，称重；

(5)按步骤(4)的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45μm滤芯过滤；过滤液用30KD超滤膜浓缩至蛋白浓度2％，然后用蛋白液重量的2倍以上洗涤缓冲液A恒体积超滤，得超滤液，称重；

(6)将步骤(5)的制得物超滤液用离子交换柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液A洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液A洗脱，收集洗脱液；

(7)收集步骤(6)经层析柱流出来的液体，浓缩一倍，洗涤缓冲液B等体积超滤6次，得超滤液，称重；

(8)将步骤(7)的制得物超滤液用Q-Sepharose阴离子交换层析柱进行层析纯化，用洗涤缓冲液B洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液B洗脱，收集洗脱液，称重；

(9)将步骤(8)的制得物洗脱液明胶亲和层析进行纯化，用洗脱缓冲液B洗涤柱子直至成基线，收集上样后经层析柱流出来的液体，用透析液透析、稀释至效价100IU/ml，得蛋白液，称重；

(10)将步骤(9)的制得物蛋白液经0.2μm除菌滤芯过滤分装；分装好的制品传入冻干柜进行冷冻干燥；出柜扎盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数；

优选：步骤(4)所述的调节离子强度缓冲液的配方：离子强度缓冲液的配制方法：48.5g三羟甲基氨基甲烷，10g氯化钙，100g氯化钠，28.1g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0；蛋白浓度缓冲液的配制方法：量取0.05L调节离子强度缓冲液，加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0；

优选：步骤(5)所述的洗涤缓冲液A的配方：2.5g三羟甲基氨基甲烷，10g氯化钙，25g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0；

优选：步骤(6)所述的洗脱缓冲液A配方：2.5g三羟甲基氨基甲烷，15g氯化钙，40.9g氯化钠，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.0～7.0。