CN108778320A - 一种预防和治疗心血管病的新方法 - Google Patents

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Abstract

纤溶酶原在制备治疗和/或消除心血管病，尤其是由糖尿病引起的心血管病的药物中的用途。提供一种用于预防和/或治疗心血管病的制品，其包含有效剂量的纤溶酶原。

Description

一种预防和治疗心血管病的新方法 技术领域
本发明涉及纤溶酶原在治疗和/或消除心血管病，尤其是由糖尿病引起的心血管病方面的作用，进而为治疗心血管病，尤其是由糖尿病引起的心血管病及其相关病症提供全新的治疗策略。
背景
“心血管病”是指心血管系统的组织学和功能变化的病变，常以大血管及微血管病变引起的心脏改变为其主要表现。临床可见心电图异常、心脏扩大、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。目前，糖尿病已是心血管病发生的高危因素和预测指标，且糖尿病合并心血管病的病人短期或长期预后均明显差于无糖尿病的病人。
“糖尿病”是一组由多种遗传和环境因素共同作用导致胰岛素分泌减少或胰岛素作用缺陷而引起体内糖、蛋白质、脂肪、水及电解质代谢紊乱的内分泌、代谢综合征。其以慢性血糖水平升高为特征，久病可引起多个系统器官的慢性并发症，其中心血管病为糖尿病的主要并发症。
“糖尿病性心血管病”指由糖尿病引起的心血管系统的组织学和功能变化的病变，为最常见的糖尿病并发症之一。糖尿病性心血管病这一糖尿病并发症危害大，常以大血管及微血管病变引起的心脏改变为其主要表现。临床可见心电图异常、心脏扩大、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。据统计，大约70％-80％的糖尿病患者最后死于心血管并发症。糖尿病患者中动脉粥样硬化、高血压、急性心肌梗死、慢性心力衰竭和猝死的发生率明显升高。目前，糖尿病已是心血管病发生的高危因素和预测指标，且糖尿病合并心血管病的病人短期或长期预后均明显差于无糖尿病的病人。
纤溶酶是纤溶酶原激活系统(PA系统)的关键组分。它是一种广谱的蛋白酶，能够水解细胞外基质(ECM)的几个组分，包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖[1]。此外，纤溶酶能将一些金属蛋白酶前体(pro-MMP)激活形成具有活性的金属蛋白酶(MMP)。因此纤溶酶被认为是胞 外蛋白水解作用的一个重要的上游调节物[2，3]。纤溶酶是由纤溶酶原通过两种生理性的PA：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白水解形成的。由于纤溶酶原在血浆和其他体液中相对水平较高，传统上认为PA系统的调节主要通过PA的合成和活性水平实现。PA系统组分的合成受不同因素严格调节，如激素、生长因子和细胞因子。此外，还存在纤溶酶和PA的特定生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制剂是α2-抗纤溶酶(α2-antiplasmin)。某些细胞表面具有直接水解活性的uPA特异性细胞表面受体(uPAR)[4，5]。
纤溶酶原(plasminogen，plg)是一个单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，分子量约为92kD[6，7]。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源[8，9]。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PA激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成[10]。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些kringle含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个为38kD的纤维蛋白溶酶原片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。
纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的溶解是预防病理性血栓形成的关键[11]。纤溶酶还具有对ECM几个组分的底物特异性，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶，表明纤溶酶在ECM重建中也起着重要作用[7，12，13]。间接地，纤溶酶还可以通过将某些蛋白酶前体转化为活性蛋白酶来降解ECM的其他组分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一个重要的上游调节器[14]。 此外，纤溶酶具有激活某些潜在形式的生长因子的能力[15-17]。在体外，纤溶酶还能水解补体系统的组分并释放趋化补体片段。
目前，治疗糖尿病心血管并发症的方法主要有控制血糖、降低血脂、控制血压等。
我们的研究惊奇地发现纤溶酶原对糖尿病造成的心脏、血管壁的损伤有明显的修复作用，并能促进微血栓的溶解，修复糖尿病导致的内脏器官，例如肾脏、肝脏、视网膜组织的损伤，恢复损伤神经的感应功能，为糖尿病并发症，例如糖尿病性心血管病开辟了一个全新的治疗途径。
发明详述
一方面，本发明涉及一种预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原或纤溶酶。一方面，本发明涉及纤溶酶原或纤溶酶用于预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的用途，包括给药受试者有效量的纤溶酶原或纤溶酶。
在一个实施方案中，所述血管病变是糖尿病性血管病变，尤其是糖尿病性大血管病变、小血管病变和/或糖尿病性微血管病变。在一个实施方案中，所述血管病变包括动脉粥样硬化，包括主动脉及内脏器官的动脉粥样硬化，尤其是糖尿病导致的动脉粥样硬化，包括主动脉及内脏器官的动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述糖尿病性微血管病变包括微循环功能改变、血管壁损伤、微血栓形成和/或微血管闭塞。本发明还涉及一种预防和/或治疗受试者心血管病，尤其是糖尿病性心血管病的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原或纤溶酶。在一个实施方案中，所述心血管病包括糖尿病性心血管病、心脏肥大、心功能不全、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。在一个实施方案中，所述糖尿病性心血管病是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。
在上述实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
在一个实施方案中，本发明的心血管病包括但不限于糖尿病性心血管病、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉供血不足、胸闷、心悸不宁、心慌气短、心率不齐、心力衰竭等。
在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、马、狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药来进行治疗，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下、吸入给予纤溶酶原。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。
述纤溶酶原可以单独施用，也可以与其它药物联合使用，所述其它药物包括但不限于：抗心血管病药物、抗糖尿病药物、抗血栓药物、抗感染药物、抗心律失常药物、降血脂药物等。
另一方面，本发明涉及纤溶酶原或纤溶酶在制备预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的药物中的用途。一方面，本发明还涉及一种制药方法，包括将纤溶酶原或纤溶酶与药学可接受载体共同制备成预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的药物。
在一个实施方案中，所述血管病变是糖尿病性血管病变，尤其是糖尿病性大血管病变、小血管病变和/或糖尿病性微血管病变。在一个实施方案中，所述血管病变包括动脉粥样硬化，尤其是糖尿病导致的动脉粥样硬化，包括主动脉及内脏器官的动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述糖尿病性微血管病变包括微循环功能改变、血管壁损伤、微血栓形成和/或微血管闭塞。
本发明还涉及纤溶酶原或纤溶酶在预防和/或治疗受试者心血管病，尤其是糖尿病性心血管病的药物中的用途。在一个实施方案中，所述心血管病包括糖尿病性心血管病、心脏肥大、心功能不全、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。在一个实施方案中，所述糖尿病性心血管病是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。
在上述技术方案中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
在一个实施方案中，上述心血管病包括但不限于：糖尿病性心血管病、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉供血不足胸闷、心悸不宁、心慌气短、心率不齐、心力衰竭等。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下、吸入给予纤溶酶原来进行治疗。在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药来进行治疗，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下、吸入给予纤溶酶原。
上述纤溶酶原可以单独施用，也可以与其它药物联合使用，所述其它药物包括但不限于：抗心血管病药物、抗糖尿病药物、抗血栓药物、抗感染药物、抗心律失常药物、降血脂药物等。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
另一方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的纤溶酶原或纤溶酶，以及预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物。在一个实施方案中，所述血管病变，尤其是糖尿病性血管病变为糖尿病性大血管病变、小血管病变和/或糖尿病性微血管病变。在一个实施方案中，所述血管病变包括动脉粥样硬化，尤其是糖尿病性动脉粥样硬化，包括主动脉及内脏器官的动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述糖尿病性微血管病变包括微循环功能改变、血管壁损伤、微血栓形成和/或微血管闭塞。本发明还涉及预防和/或治疗受试者心血管病的、尤其是糖尿病性心血管病的纤溶酶原或纤溶酶，以及预防和/或治疗受试者心血管病的、尤其是糖尿病性心血管病的、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物。在一个实施方案中，所述心血管病包括糖尿病性心脏病，包括心脏肥大、心功能不全、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。在一个实施方案中，所述糖尿病性心血管病是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。
在一个实施方案中，上述心血管病，尤其是由糖尿病引起的心血管病包括但不限于：高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉供血不足胸闷、心悸不宁、心慌气短、心率不齐、心力衰竭等。
在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤 维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下、吸入给予纤溶酶原来进行治疗。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
另一个方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者血管病变，尤其是糖尿病性血管病变的、包含纤溶酶原或纤溶酶的制品或药盒。在一个实施方案中，所述血管病变，尤其是糖尿病性血管病变为糖尿病性大血管病变、小血管病变和/或糖尿病性微血管病变。在一个实施方案中，所述血管病变包括动脉粥样硬化，尤其是糖尿病导致的动脉粥样硬化，包括主动脉及内脏器官的动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述糖尿病性微血管病变包括微循环功能改变，血管壁损伤，微血栓形成和/或微血管闭塞。本发明还涉及预防和/或治疗受试者心血管病的、尤其是糖尿病性心血管病的、包含纤溶酶原或纤溶酶的制品或药盒。在一个实施方案中，所述心血管病包括糖尿病性心血管病、心脏肥大、心功能不全、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。在一个实施方案中，所述糖尿病性心血管病是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。在一个实施方案中，所述制品或药盒包含含有有效剂量的纤溶酶原/纤溶酶的容器。优选，该制品或药 盒还包含含有一种或多种其它的药物的容器。该制品或药盒药盒还可包含使用说明书，说明所述纤溶酶原可以用于治疗所述血管病变，尤其是糖尿病性血管病变或糖尿病性心血管病，并且可以进一步说明，所述纤溶酶原可以在其它药物施用之前，同时，和/或之后施用。在一个实施方案中，所述其它药物可以包括但不限于：抗心血管病药物、抗糖尿病药物、抗血栓药物、抗感染药物、抗心律失常药物、降血脂药物等。在一个实施方案中，上述心血管病包括但不限于：糖尿病性心血管病、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉供血不足胸闷、心悸不宁、心慌气短、心率不齐、心力衰竭。
在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下、吸入给予纤溶酶原来进行治疗。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10- 100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
一方面，本发明涉及纤溶酶原或纤溶酶在制备预防和/或治疗受试者的血管病变，尤其是血管病变导致的机体组织和内脏器官损伤(损害)的药物、制品、药盒中的用途。在一个实施方案中，所述组织和内脏器官损伤(损害)包括对大脑、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、神经、视网膜、皮肤、胃肠道的损伤(损害)。一方面，本发明涉及纤溶酶原在制备预防和/或治疗受试者的糖尿病并发症的药物、制品、药盒中的用途。在一个实施方案中，所述糖尿病并发症为糖尿病引发的糖尿病性大脑病变、糖尿病性心脏病变、糖尿病性肝脏病变、糖尿病性肾脏病变、糖尿病性肺脏病变、糖尿病性神经病变，糖尿病性血管病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性皮肤病变。
一方面，本发明涉及一种制药方法，包括将纤溶酶原或纤溶酶与药学可接受的载体制备成用于预防和/或治疗受试者的血管病变，尤其是血管病变导致的机体组织和内脏器官损伤(损害)的药物、制品、药盒。在一个实施方案中，所述组织和内脏器官损伤(损害)包括对大脑、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、神经、视网膜、皮肤、胃肠道的损伤(损害)。一方面，本发明涉及一种制药方法，包括将纤溶酶原或纤溶酶与药学可接受载体制备成预防和/或治疗受试者的糖尿病并发症的药物、制品或药盒。在一个实施方案中，所述糖尿病并发症为糖尿病引发的糖尿病性大脑病变、糖尿病性心脏病变、糖尿病性肝脏病变、糖尿病性肾脏病变、糖尿病性肺脏病变、糖尿病性神经病变，糖尿病性血管病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性皮肤病变。
一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗受试者的血管病变，尤其是血管病变导致的机体组织和内脏器官损伤(损害)的纤溶酶原或纤溶酶、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物、制品、药盒。在一个实施方案中，所述组织和内脏器官损伤(损害)包括对大脑、心脏、肝脏、肾脏、肺脏、神经、视网膜、胃肠道、皮肤的损伤(损害)。一方面，本发明涉及用于预防和/或治 疗受试者的糖尿病并发症的纤溶酶原、包含纤溶酶原的药物组合物、制品或药盒。在一个实施方案中，所述糖尿病并发症为糖尿病引发的糖尿病性大脑病变、糖尿病性心脏病变、糖尿病性肝脏病变、糖尿病性肺脏病变、糖尿病性肾脏病变、糖尿病性神经病变，糖尿病性血管病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性皮肤病变。
一方面，本发明涉及一种预防和/或治疗受试者的血管病变，尤其是血管病变导致的机体组织和内脏器官损伤(损害)的方法，包括给药受试者纤溶酶原或纤溶酶、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物、制品、药盒。本发明还涉及纤溶酶原或纤溶酶、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物、制品、药盒用于预防和/或治疗受试者的血管病变，尤其是血管病变导致的机体组织和内脏器官损伤(损害)的用途。在一个实施方案中，所述组织和内脏器官损伤(损害)包括对大脑、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、神经、视网膜、胃肠道、皮肤的损伤(损害)。一方面，本发明涉及一种预防和/或治疗受试者的糖尿病并发症的方法，包括给药受试者纤溶酶原或纤溶酶、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物、制品或药盒。本发明还包括纤溶酶原或纤溶酶、包含纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物、制品或药盒用于预防和/或治疗受试者的糖尿病并发症的用途。在一个实施方案中，所述糖尿病并发症为糖尿病引发的糖尿病性大脑病变、糖尿病性心脏病变、糖尿病性肝脏病变、糖尿病性肺脏病变、糖尿病性肾脏病变、糖尿病性神经病变，糖尿病性血管病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性皮肤病变。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10、12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋 白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
在一个实施方案中，所述纤维蛋白溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或通过直肠。在一个实施方案中，所述局部给药通过在血栓区域应用含有纤维蛋白溶酶原的敷料和/或导管来进行。
在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。
上述纤维蛋白溶酶原可以单独施用，也可以与其它药物联合使用，所述其它药物，例如，心血管疾病治疗药物，心律失常治疗药物，糖尿病治疗药物等，以治疗与病理性血栓发生相伴的其它疾病。
在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。
本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的所有亚组合，并且在本文中公开，就像每一个此类亚组合单独且明确在本文中公开一样。
发明详述
“心血管病”是指心血管系统的组织学和功能变化的病变，常以大血管及微血管病变引起的心脏改变为其主要表现。临床可见心电图异常、心脏扩大、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。
“糖尿病”是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。
“糖尿病并发症”是由糖尿病过程中血糖控制不良导致的身体其他器官或组织的损害或功能障碍，其中包括肝脏、肾脏、心脏、视网膜、神经系统的损害或功能障碍等。据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。而这些糖尿病的并发症主要是由于患者各器官的大血管、小血管、微血管受损所致。
“糖尿病性血管病变”主要指糖尿病引发的主动脉及各内脏器官的动脉，包括大脑、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏的大、小动脉的动脉粥样硬化、以及相应引起的器官、组织病变。其发病机理包括以下方面：1)持续性高血糖使血液粘滞度和凝固性升高，进而引起动脉血管弹性减弱乃至丧失；2)脂类代谢异常，其促使胆固醇和胆固醇脂在细胞内堆积，导致动脉粥样硬化发生与发展；3)动脉壁内皮细胞损伤，血流动力学改变使血液机械性地长期冲击血管内皮，引起内皮损伤，进而导致血小板、纤维蛋白等在损伤部位粘附聚集形成血栓，并可进一步导致炎症；4)参与凝血机制的糖蛋白因子增多，促进血小板和纤维蛋白聚集粘附于损伤的内皮下层而溶解能力下降，进而形成血栓。因此，本发明权利要求技术方案中提到“糖尿病性血管病变”术语时，都涵盖了糖尿病引发的动脉粥样硬化和血栓、以及相应引起的器官、组织病变。
“糖尿病性微血管病变”指糖尿病患者机体各器官或组织微循环不同程度的异常导致的微血管病变。微血管病变形成的过程大致为：微循环功能改变；血管壁损伤，例如内皮损伤，基膜增厚；血粘度增高，红细胞聚集，血小板粘附和聚集，最后导致微血栓形成和/或微血管闭塞。
上述的两种“糖尿病性血管病变”导致组织或器官局部血管损伤、血流不畅、细胞缺氧、形成血凝块、血栓和炎症，并进一步影响周边的组织及器官功能，进而导致糖尿病并发症。
“糖尿病性心血管病”指由糖尿病引起的心血管系统的组织学和功能变化的病变，其为最常见的糖尿病并发症之一，主要由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。其中，患者临床可表现为心电图异常、心脏扩大、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。据统计，大约70％-80％的糖尿病患者最后死于心血管并发症。糖尿病患者中动脉粥样硬化、高血压、急性心肌梗死、慢性心力衰竭和猝死的发生率明显升高。目前，糖尿病已是心血管病发生的高危因素和预测指标，且糖尿病合并心血管病的病人短期或长期预后均明显差于无糖尿病的病人。
“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。
“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为92kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。
Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-纤溶酶原(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域[18，19]，有文献报道了δ-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)[19]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋 白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)[20]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)[21]，也有专利文献CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
“血栓”是凝血过程中形成的产物。凝血过程是机体保持封闭高压循环系统完整性的防御机制。在正常情况下，该过程应保持非活化状态，但当组织受到损伤时，需要立即启动该机制以减少血液外渗。当血管受损时，在凝血酶的作用下溶于血浆中的纤维蛋白原(fibrinogen)将最终转变为不溶于水的纤维蛋白(fibrin)多聚体，并彼此交织成网，将血细胞网罗在内，形成血凝块，完成凝血过程。在该过程中，血凝块与伤处的大小比例至关重要。因此初始血凝块形成的分子(纤维蛋白，凝血酶)和溶解血凝块的分子(纤溶酶、纤溶酶原激活剂等)间应存在平衡。但在病理过程中，该平衡的破坏将导致过量的血凝块形成分子，进而形成血栓(thrombus)，该血栓为“病理性血栓”。
在人体中，血栓可在具有血流的任何位置发生，目前主要将其分为两大类：静脉血栓和动脉血栓。静脉血栓由在静脉中产生的血凝块导致。最常见的静脉血栓类型为：深静脉血栓(DVT)，其通常影响肢体静脉如股静脉，导致受影响部位的疼痛和红肿；门静脉血栓，其可影响肝门静脉，进而导致胰腺炎、肝硬化、憩室炎或胆管癌；肾静脉血栓，导致肾栓塞；颈内静脉血栓，其可引起全身性败血症、肺栓塞等多种并发症；脑静脉血栓，导致患者呈现头痛、视觉异常中风等症状。动脉血栓则可能导致在体内几乎任何器官的梗死，其引发的病症包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、动脉粥样硬化疾病、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞等。
在糖尿病情况下，动脉壁内皮细胞损伤，血流动力学改变使血液机械性地长期冲击血管内皮，引起内皮损伤，进而导致血小板、纤维蛋白等在 损伤部位粘附聚集形成血栓。本发明实验发现，纤溶酶原能够使糖尿病小鼠血清中的D-二聚体明显升高，心脏、肝脏、肾脏、神经组织局部的纤维蛋白相对于对照组明显减少，说明纤溶酶原能够促进糖尿病小鼠微血栓的溶解。本发明涵盖纤溶酶原对糖尿病微血栓的治疗。
本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。
本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。
本发明所述的血栓包括新鲜血栓和陈旧血栓。本发明的“新鲜血栓”和“急性血栓”可以互换使用；“陈旧血栓”和“慢性血栓”可以互换使用。
在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。
“纤溶酶原活性片段”是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。
目前，对于血液中纤维蛋白溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤维蛋白溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物活性的 检测、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤维蛋白溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤维蛋白溶酶原活性进行测定。
“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。
“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。
“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。
本发明纤溶酶原的制备
纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005Protein Pept Lett.12：723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。
可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。
合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。
其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的纤溶酶原(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系，和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。
一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、高效液相层析(HPLC)、凝胶电泳等来纯化本发明 所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。
药物配制剂
可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。
本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物、抗心律失常的药物、治疗糖尿病的药物等。
本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3773919，EP 58，481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
给药和剂量
可以通过不同方式，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、颅内、鞘内、动脉内(例如经由颈动脉)、肌内、鼻内、表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。
用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。
医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康和同时施用的其它 药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以例如为例如每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估、定期评估糖尿病心血管病及其相关病症的治疗效果和安全性。
治疗效力和治疗安全性
本发明的一个实施方案涉及使用纤溶酶原治疗受试者后，对治疗效力和治疗安全性的判断。其中对所述治疗效力的判断方法包括但不限于对受试者的血压、心电图、血常规、尿常规、血脂、血糖、血流动力学进行测定。具体地，包括对受试者实施下列检查：1)心血管超声，以全面的诊断、检测心脏各房室大小、室壁运动、血流速度和心脏功能方面；2)心肌标志物检测，如C反应蛋白(CRP)、肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、B型尿钠肽(BNP)、等浓度进行检测，这些标志物为急性心肌梗死的重要诊断标志，预期受试者在接受本发明的纤溶酶原治疗后上述检测恢复至正常值范围或得到改善，如Mb在男性受试者中恢复至19～92μg/L，女性为12～76μg/L；3)动态心电图监测。此外，本发明还涉及使用纤溶酶原对受试者进行治疗过程中和治疗后，对所述该治疗方案安全性的判断，监测各种不良事件。
制品或药盒
本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗心血管病，尤其是由糖尿病引起的心血管病及其相关病症的本发明纤溶酶原或纤溶酶。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原/纤溶酶。所述容器上或所附 的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述心血管病，尤其是由糖尿病引起的心血管病及其相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。
附图简述
图1显示24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后体重变化。给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组在第0、4、7、11、16、21、26、31天体重无显著差异。
图2显示24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后心脏HE染色结果。
图3显示24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后心脏纤维蛋白原染色结果。
图4显示24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后主动脉弓HE染色结果。
图5显示24-25周小鼠给予PBS或纤溶酶原31天血清心肌肌钙蛋白浓度测定结果。
图6显示24-25周龄的db/db小鼠在连续15天给药纤溶酶原后血清中D-二聚体的含量检测结果。
图7显示24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后视网膜PAS染色观察结果。
图8 24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后肾脏纤维蛋白免疫染色观察结果。
图9 24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后肾脏Bcl2免疫染色观察结果。
图10 24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后肝脏纤维蛋白免疫染色观察结果。
图11 24-25周龄的db/db小鼠在连续31天给药纤溶酶原后肝F4/80免疫染色观察结果。
图12显示24-25周龄的db/db小鼠在给药纤溶酶原后第0、4、7、11、16天检测机械触诱发痛感应能力的结果。在第16天检测时发现纤溶酶原组50％痛觉阈值与给溶媒PBS对照组相比出现了极显著差异。
图13显示24-25周龄的db/db小鼠在给药纤溶酶原后第0、4、7、11、16天检测冷刺激感应能力的结果。
图14 24-25周神经损伤小鼠纤溶酶原15天后坐骨神经纤维蛋白免疫组化染色观察结果。
图15 24-25周小鼠给予纤溶酶原31天肾脏IgM免疫染色观察结果。
图16 24-25周小鼠给予纤溶酶原31天后血清谷丙转氨酶(ALT)检测结果。
实施例
实施例1纤溶酶原对小鼠体重的影响
24-25周龄db/db雄鼠20只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各10只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第0，4，7，11，16，21，26，31天分别称体重。
结果显示，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组在第0、4、7、11、16、21、26、31天体重无显著差异(图1)。说明纤溶酶原对动物体重影响不大，给药处理对动物体重没有显著的影响。
实施例2纤溶酶原对小鼠心肌的损伤修复作用
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取心脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的心脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，切片在显微镜下400倍下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组心肌细胞肥大，偶可见长梭形肥大的细胞核，轻度脂肪变性，呈空泡状，在血管边缘或是肌细胞间隙可见轻度炎细胞浸润，肌纤维间隙增宽(图2A)；给纤溶酶原组心肌细胞圆形或梭形，肥大的细胞较对照组少，肌纤维间隙较对照组致密，炎细胞浸润及脂肪变性与给溶媒PBS对照组比均明显减轻(图2B)。说明注射纤溶酶原使小鼠心肌的损伤得到显著修复。
实施例3纤溶酶原促进小鼠心脏纤维蛋白水解
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取心脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的心脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次，以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vectorlaboratories，Inc.，USA)封闭1小时；之后弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下400倍下观察。
纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白[22-24]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。
结果显示，与给溶媒PBS对照组(图3A)相比，给纤溶酶原组(图3B)的小鼠心脏组织纤维蛋白阳性着色较浅，说明给纤溶酶原组心脏组织沉积的纤维蛋白减少，反映纤溶酶原能够促进心脏组织损伤修复，也说明纤溶酶原能够促进心脏组织血栓的溶解。
实施例4纤溶酶原对小鼠动脉壁损伤的修复作用
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取主动脉弓在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的心脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，切片在显微镜下400倍下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组血管管壁有泡沫细胞沉积，中层弹性膜排列紊乱，血管壁增厚，管壁凸凹不均(图4A)；给纤溶酶原组中层弹性膜结构规则，呈波浪形，血管管壁厚度均匀(图4B)。表明注射纤溶酶原对主动脉管壁损伤具有修复作用。
实施例5纤溶酶原显著减轻心肌的损伤
24-25周龄db/db雄鼠28只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组12只，给纤溶酶原组16只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。第32天摘除眼球取血，以3500r/min离心15-20分钟，并取上清，检测血清中心肌肌钙蛋白I的浓度。
心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin，CTNI)是心肌损伤的重要标志物，其血清浓度能够反映心肌损伤的程度[25]。结果显示，给纤溶酶原组心肌肌钙蛋白I的浓度显著低于给溶媒PBS对照组，且具有极显著统计学差异(图5)。说明纤溶酶原能够显著减轻心肌的损伤。
实施例6纤溶酶原糖促进微血栓的溶解
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。最后一次给药24小时后摘眼球取血，全血静置后血清用于检测血液中D-二聚体(D-dimer)含量。
结果显示，给药纤溶酶原15天后，血清中D-二聚体的含量显著上升(图6)，说明纤溶酶原能显著促进微血栓溶解。
实施例7纤溶酶原促进小鼠视网膜毛细血管损伤的修复
24-25周龄db/db雄鼠20只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各10只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取左侧眼球在多聚甲醛固定液中固定24小时。固定后的眼球剥离出视网膜后，置于1mL 3％胰酶(Solarbio)的EP管中，在摇床中37℃震荡消化2-3h。待视网膜出现软化、脱落的现象后小心的将视网膜移入装有蒸馏水的EP管中，于摇床中37℃震荡2-3h，使视网膜上多余的组织脱落。轻柔的吹打视网膜，使其只剩血管层后在玻片上铺片，自然风干。视网膜于Schiff氏液染色(PAS染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水二甲苯透明后封片，在显微镜下400倍下观察。
从实验结果可以看出，与纤溶酶原组(图7B)相比，给溶媒PBS对照组(图7A)db/db鼠毛细血管管径粗细不一，血管管壁增厚深染，血管内皮细胞(Δ)增生，周细胞(↓)明显减少；定量分析发现给纤溶酶原组与给溶媒PBS对照组相比无细胞血管长度(图7C)显著减少，并且统计学分析结果显示显著差异。说明纤溶酶原能够显著促进小鼠视网膜毛细血管损伤的修复，从而促进视网膜损伤的修复。
实施例8纤溶酶原减少小鼠肾脏纤维蛋白沉积
24-25周龄db/db雄鼠20只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各10只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肾脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories，Inc.，USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗 兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。
纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白[22-24]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。
结果显示，给纤溶酶原组(图8B)比给溶媒PBS对照组(图8A)纤维蛋白原阳性着色浅。说明注射纤溶酶原能够显著降低小鼠肾脏纤维蛋白沉积，反映出纤溶酶原对小鼠肾脏损伤有显著的修复作用，也说明纤溶酶原能够促进肾脏组织血栓的溶解。
实施例9纤溶酶原促进小鼠肾脏凋亡抑制蛋白Bcl-2表达
24-25周龄db/db雄鼠20只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各10只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肾脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories，Inc.，USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠Bcl2抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。
Bcl-2为细胞凋亡抑制蛋白，在凋亡刺激因子作用下会下调表达[26，27]。Bcl-2免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图9B)肾小管上皮细胞阳性表达着色要明显深于给溶媒PBS对照组(图9A)，且前者的着色范围更广。定量分析结果与观察结果一致，且具有显著差异(图9C)。这表明纤溶酶原能促进 小鼠肾脏细胞凋亡抑制分子Bcl-2的表达，从而抑制小鼠肾脏组织细胞的凋亡。
实施例10纤溶酶原减少肝组织纤维蛋白水平
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories，Inc.，USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。
纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白[22-24]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。
研究发现，与给溶媒PBS对照组(图10A)相比，给纤溶酶原组(图10B)的小鼠其肝脏组织纤维蛋白阳性着色浅，说明注射纤溶酶原能够显著降低小鼠肝脏纤维蛋白沉积，反映出纤溶酶原对小鼠肝脏损伤有显著修复作用，也说明纤溶酶原能够促进肝脏组织血栓的溶解。
实施例11纤溶酶原促进肝脏组织的炎症修复
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。给纤溶酶原31天后处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定 液中固定24小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％正常羊血清(Vector laboratories，Inc.，USA)封闭1小时，时间到后甩去血清，用PAP笔圈出组织。针对F4/80的兔多克隆抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。
F4/80为巨噬细胞标志物。巨噬细胞作为炎症阶段的主要吞噬细胞，负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及病原体等，因此，局部巨噬细胞的量可以表示炎症反应的程度和阶段。实验结果显示，给纤溶酶原组(图11B)与给溶媒PBS对照组(图11A)相比，给纤溶酶原组小鼠的F4/80阳性水平明显降低，说明给纤溶酶原能够减轻肝脏组织炎症。图11C为F4/80免疫组化阳性表达数定量分析结果，给纤溶酶原组F4/80表达量显著减少，且具有统计学差异，说明注射纤溶酶原能够显著促进小鼠肝脏炎症的修复。
实施例12纤溶酶原促进神经损伤小鼠对机械触诱发痛感应能力的修复
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组并开始做生理实验，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在给纤溶酶原后第0，4，7，11，16天用Von-Frey纤维丝(Stoelting，USA)检测动物对机械性损伤的敏感程度。以2.0g力为起始力，先检测其左脚。若5次刺激有2次有缩爪反应即为阳性，若为阳性即用小一级的力再对其右脚进行刺激；若为阴性，则用大一级的力对其右脚进行刺激，如此左右脚交替刺激，刺激间隔为5分钟，总共刺激6次，然后根据S.R.Chaplan et al.(1994)[28]介绍的方法计算其50％缩爪的阈值。
研究发现，与给溶媒PBS对照组相比，给纤溶酶原组的小鼠机械触诱发痛反应均一性增加，且在第16天检测时发现与给溶媒PBS对照组相比出现了极显著差异(图12)，说明纤溶酶原能够修复神经损伤小鼠对机械触诱发痛(mechanical allodynia)的感应能力。
实施例13纤溶酶原对神经损伤小鼠冷刺激感应的修复
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组并开始做生理实验，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在给药后第0，4，7，11，16天用去针头注射器挤出一滴丙酮液珠并轻触db/db鼠足底，使其覆盖整个足底。从左脚开始，每隔3分钟轮流刺激其左右脚，共刺激10次，并统计缩爪反应次数。反应百分比＝缩爪次数/刺激次数计100％。
实验结果显示，在第0和第4天时，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组对丙酮刺激并无显著差异，而第7天开始观察到显著差异，在第16天则观察到极显著差异，P值＜0.0001(图13)，说明给药15天后，小鼠几乎完全恢复了对冷刺激的反应，表明了纤溶酶原能够修复神经损伤小鼠对冷刺激的感应能力。
实施例14纤溶酶原减少神经损伤小鼠神经组织纤维蛋白水平
24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第16天处死小鼠并取坐骨神经在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的坐骨神经经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次，然后用PAP笔圈出组织。以3％TBS稀释的双氧水孵育15分钟，水洗3次。10％正常羊血清(Vector laboratories，Inc.，USA)封闭1小时，吸走多余血清。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)室温孵育1小时或4℃孵育过夜，TBS洗3次。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗3次。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下400倍下观察。
纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白[22-24]，因此可将纤维蛋 白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。
研究发现，与给溶媒PBS对照组(图14A)相比，给纤溶酶原组(图14B)的小鼠其坐骨神经纤维蛋白的水平降低，说明纤溶酶原具有降解纤维蛋白水平的功能，损伤得到一定程度的修复，也说明纤溶酶原能够促进神经组织周围血栓的溶解。
实施例15纤溶酶原减轻小鼠肾脏的损伤
24-25周龄db/db雄鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各4只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天检测生理指标结束，处死小鼠并取肾脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。山羊抗鼠IgM(HRP)抗体(Abcam)室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.，USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下400倍下观察。
IgM抗体在清除凋亡和坏死细胞过程中发挥着重要作用，细胞的凋亡和坏死细胞越多，局部IgM抗体水平越高[29-31]。因此，局部IgM抗体水平能够反映组织器官的损伤情况。
结果显示，给纤溶酶原组(图15B)小鼠肾小球IgM的阳性着色浅于给溶媒PBS对照组(图15A)，并且范围也较对照组小，统计分析结果与观察结果一致(图15C)，这表明注射纤溶酶原后肾小球的损伤明显改善，反映出纤溶酶原对小鼠的机体损伤有显著保护和修复作用。
实施例16纤溶酶原促进小鼠肝脏损伤的修复25-28周龄db/db雄鼠9只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组3只，给纤溶酶原组6只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。给纤溶酶原31天后摘眼球采全血，待血清析出后4℃ 3500r/min离心 10分钟，取上清液进行检测。本实验使用谷丙转氨酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C009-2)，运用赖氏比色法(Reitman-Frankel)检测血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量。
谷丙转氨酶是肝脏健康状态的一个重要指标[32，33]，谷丙转氨酶的正常参考值区间为9～50U/L。检测结果显示，给溶媒PBS对照组血清中ALT的含量显著高于正常生理指标，而给纤溶酶原组则已经恢复到体内的正常水平，并且给纤溶酶原组ALT的含量显著低于给溶媒PBS对照组，且具有统计学差异(图16)。说明在模型小鼠中，注射纤溶酶原能明显修复肝损伤。
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Claims (15)

  1. 一种预防和/或治疗受试者血管病变的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。
  2. 权利要求1的方法，其中所述血管病变是糖尿病性血管病变。
  3. 权利要求1或2的方法，其中所述血管病变包括动脉粥样硬化。
  4. 权利要求2的方法，其中所述糖尿病性血管病变包括糖尿病性微血管病变，所述糖尿病性微血管病变包括微循环功能改变、血管壁损伤、微血栓形成和/或微血管闭塞。
  5. 一种预防和/或治疗受试者心血管病，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。
  6. 权利要求5的方法，其中所述心血管病包括糖尿病性心血管病、心脏肥大、心功能不全、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。
  7. 权利要求6的方法，其中所述糖尿病性心血管病是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。
  8. 根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述纤溶酶原为与序列2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的蛋白质。
  9. 根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物联合施用。
  10. 根据权利要求9的方法，其中所述其它药物包括：抗心绞痛药、抗高血脂药、抗高血压药、抗炎药、抗感染药、醛固酮拮抗剂、血糖调节剂、胰岛素、抗血栓药。
  11. 一种用于预防和/或治疗心血管病的制品，其包含含有有效剂量的纤溶酶原的容器，和指导施用所述制品预防和/或治疗血管病变的说明书。
  12. 权利要求11的制品，其中所述心血管病是糖尿病性心血管病。
  13. 权利要求11或12的制品，进一步包含含有一种或多种其它药物的容器。
  14. 权利要求13的制品，其中所述其它药物为抗心血管病药物、抗糖尿病药物、抗血栓药物、抗感染药物、抗心律失常药物、降血脂药物。
  15. 权利要求13或14的制品，其中所述说明书进一步说明所述纤溶酶原可以在所述其它药物施用之前，同时，和/或之后施用。
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