CN105330736A - 一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子ix及vii的方法 - Google Patents

一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子ix及vii的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，包括如下步骤：（1）血浆去冷胶；（2）第一次强阴离子交换柱层析；（3）PEG沉淀去杂蛋白；（4）S/D病毒灭活；（5）第二次强阴离子交换柱层析分别得到FVII洗脱液与FIX洗脱液；（6）弱阴离子交换柱层析纯化凝血FVII；（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX；（8）超滤；（9）加稳定剂及调节；（10）纳米膜除病毒过滤；（11）除菌过滤并分装；（12）冻干；（13）干热病毒灭活。本发明采用PEG沉淀去杂蛋白，通过离子交换层析结合亲和层析纯化技术，实现了同时制备高纯FVII及FIX的目标，工艺流程简单，生产周期短，产品经三步病毒灭除措施，使用安全性高。

Description

一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法
技术领域
本发明属生物制药领域，涉及血液制品的制备，具体讲是涉及一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法。
背景技术
人凝血因子Ⅶ（FVII）与人凝血因子IX（FIX）均是肝脏合成的维生素K依赖的凝血因子，前者由406个氨基酸残基组成，分子量约50KD,等电点4.9,血浆中浓度为0.5-2mg/L,后者由416个氨基酸残基所组成，分子量约57KD，血浆中浓度为5mg/L左右。两种凝血因子在凝血过程中均发挥着非常重要的作用。其中FVII是机体外源凝血途径的始动因子，无论是原发性的还是继发性的FⅦ缺乏，都有可能造成出血，甚至危及生命，故对于FⅦ缺乏的患者，输注浓缩的纯化FⅦ,可以纠正其出血倾向，恢复正常的凝血机能。
近年来，重组活化人凝血VIIa对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的血具有令人满意的治疗效果，也成为带有凝血因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的先天性A型或B型血友病人的替代疗法。可见人凝血因子VII的临床需求是十分巨大的。而人体因缺乏凝血FIX则会导致凝血障碍即为乙型血友病，该病是一种遗传性疾病，以自发性或创伤相关的出血为特征，出血部位主要在关节、软组织和肌肉。治疗的延迟或不足会引起各种并发症，包括关节反复出血相关的关节病和滑膜炎，严重时可导致关节畸形和功能障碍。另外，更严重的出血，尤其是颅内出血可能导致死亡。目前治疗乙型血友病唯一有效的方法就是及时注射含凝血FIX的药物以达到止血的目的，或者定期注射含凝血FIX的药物预防出血。含凝血FIX的药物有血浆提取的高纯人凝血FIX、人凝血酶原复合物（PCC）以及基因重组人凝血FIX(辉瑞公司生产的“贝赋”)等，国内目前只有冻干人凝血酶原复合物（PCC）品种。临床实践表明，乙型血友病人注射高纯人凝血FIX很安全，而注射人凝血酶原复合物却可能产生严重的副作用―血栓症，所以高纯人凝血FIX是治疗乙型血友病的首选药物，但传统的高纯人凝血FIX生产工艺，工序复杂，在制备FIX过程中，将宝贵的FVII当作杂质去除，且在生产过程中易出现凝血酶激活的问题而致产品失败，再加上传统工艺的病毒灭活手段单一，不能完全保证制品的安全，而干热病毒灭活方式往往导致较大的活力损失。
针对这一现状，本发明开发了一种从去冷胶血浆中同时制备高纯FVII及FIX的方法，本发明采用离子交换层析结合亲和层析技术及PEG沉淀去杂，实现了纯化、精制FVII及FIX的目标，流程简单，生产周期短，FVII与FIX的收率均超过50%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品质量好、得率高、成本低及生产效率高的能同时制备人凝血因子IX及VII的方法。
1．一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）去冷胶血浆的制取
将新鲜冰冻血浆融化，在0-3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为0.01M-0.02M，氯化钠浓度为0.075M-0.15M氯化钠，缓冲液PH值为6.50-7.50，温度10-15℃；
（2）第一次强阴离子交换柱层析
步骤（1）得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡;上柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII与FIX的溶液；
（3）PEG沉淀去杂蛋白
在步骤（2）收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3-6%,搅拌0.5-1.5小时，后用1.0μm滤芯过滤，收集澄清的滤液；
（4）S/D病毒灭活
在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-7小时；
（5）第二次强阴离子柱层析
将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上强阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液2平衡;上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即为凝血FIX粗品；
（6）弱阴离子柱层析纯化凝血FVII
将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2-4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0.45μm滤芯过滤得到澄清滤液；
（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX
将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上肝素亲和柱，柱子预先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤,所得滤液即为精制的凝血FIX溶液；
（8）超滤
用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒体积透析4-6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包；
（9）加稳定剂及调节
按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值（一般为20-30IU/ml），后分别加入稳定剂并分别调PH值至6.50-7.50；
（10）纳米膜除病毒过滤
分别用15-20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤；
（11）除菌过滤并分装
分别用0.22μm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行
（12）冻干
分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉；
（13）干热除病毒过滤
分别或同时将FVII及FIX冻干品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（2）所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（2）所述的柱层析所用的平衡缓冲液1组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液1组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.4M-0.8M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
4.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（6）所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种；步骤（5）所述的平衡缓冲液2组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；步骤（5）所述的洗脱缓冲液2A组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.175M-0.35M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸,PH6.50-7.50；步骤（5）所述的洗脱缓冲液2B组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.5M-1.0M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
5.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（6）所述的弱阴离子交换柱层析所用填料为DEAE-SepharoseFF或CaptoDEAE；步骤（6）所述的平衡缓冲液3组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.1M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液3组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.15M-0.30M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
6.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（7）所述的肝素亲和柱层析所用填料为HeparinSepharoseFF或HeparinSepharoseCL-6B；步骤（7）所述的平衡缓冲液4组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.1M-0.15M氯化钠溶液，PH6.50-7.50；所述的洗涤缓冲液4组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.15-0.25M氯化钠溶液，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液4组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠,0.02M盐酸精氨酸,0.4M-1.0M氯化钠溶液，PH6.50-7.50。
7.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（5）~（7）所述的稀释液组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
8.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（8）所述的透析液组成为0.01M柠檬酸钠,0.075M-0.125M氯化钠，PH6.50-7.50；该透析液对FVII及FIX均适合。
9.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（9）所述的稳定剂，对于FVIII而言，稳定剂是精氨酸盐酸盐与甘氨酸，其中精氨酸盐酸盐加至0.5-3%，甘氨酸加至0.5-3%；对于FIX而言，稳定剂是组氨酸与甘氨酸，其中组氨酸加至0.5-3%，甘氨酸加至0.5-3%。
10.根据权利要求1-9所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：FVII冻干制剂与FIX冻干制剂均经历了S/D病毒灭活、纳米膜除病毒过滤及干热病毒灭活三个步骤。
本发明的优越性
1，本发明采用离子交换填料及肝素亲和填料从血浆中同时制备高纯人凝血FVII及凝血FIX，流程简洁，技术成熟，血浆利用率高；
2，采用PEG沉淀去除杂蛋白，大大减轻了后续柱层析的纯化压力，提高了终产品的比活；
3，PEG的引入，在S/D过程中起蛋白保护作用，防止蛋白变性及凝血因子失活；
4，在柱层析操作中，在洗脱缓冲液中均加入了蛋白保护剂，大大降低了制品被激活的概率；
5，本发明的生产流程中共使用了S/D病毒灭活、20纳米膜过滤去病毒及干热病毒灭活病三重灭除病毒措施，对脂包膜病毒、非脂包膜病毒及细小病毒进行了有效灭除，大大提高了产品的使用安全性。
附图说明
图1是从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明，不能认为本发明的实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所做出的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。
实施例一
1，去冷胶血浆的制备：取冰冻血浆35袋，用70%乙醇消毒并用注射用水冲洗后割袋，在夹套坦克中将冰冻血浆融化，称取20kg，在0-3℃下连续离心，去除冷胶，收集上清，后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠）预洗滤芯；
2，第一次强阴离子交换柱层析：将步骤1得到的澄清去冷胶血浆上QSepharose4FF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.8M氯化钠，0.04M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液；
3，PEG沉淀去杂蛋白：以上洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3%,搅拌1.5小时，后用1.0μm串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的滤液；
4，S/D病毒灭活：以上滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时；
5，第二次强阴离子柱层析：将上述S/D后的溶液用稀释液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.04M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上QSepharose4FF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液A（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.25M氯化钠，0.04M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液A（凝血七因子粗品）；再用洗脱缓冲液B(PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.5M氯化钠，0.04M盐酸精氨酸）洗脱，收集洗脱液B（凝血FIX粗品），置于2-8℃；
6，弱阴离子柱层析纯化凝血FVII：将上述洗脱液A用稀释液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.04M盐酸精氨酸）稀释到原来的2.5倍，然后上DEAE-SepharoseFF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.2M氯化钠，0.04M盐酸精氨酸）洗脱柱子，得到精制的凝血七因子溶液；用0.45μm滤芯过滤得到澄清滤液,置于2-8℃；
7，肝素亲和柱层析纯化凝血FIX：将步骤5得到的洗脱液B用稀释液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.04M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上HeparinSepharose6FF柱，柱子预先用平衡缓冲液平衡，平衡缓冲液为0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠溶液,PH6.90-7.10），后用洗涤缓冲液（0.02M柠檬酸钠，0.175M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）洗涤，再用洗脱缓冲液（0.02M柠檬酸钠,0.04M盐酸精氨酸,0.5M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液，得到精制的凝血FIX溶液；
8，用10k分子量的超滤膜包分别浓缩步骤6,7得到的凝血FVII及FIX滤液，并用透析液（0.02M柠檬酸钠,0.1M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）分别透析，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包,分别得到凝血FVII及凝血FIX浓缩液205克，231克,活力分别为39.7IU/ml，36.4IU/ml;
9，按照30IU/ml的规格分别调节人凝血FVII溶液及FIX溶液的活力，后分别调PH值至6.90-7.10，在FVII溶液中加入精氨酸盐酸盐至0.5%，甘氨酸至3%，做为稳定剂；在FIX溶液中加入组氨酸0.5%，甘氨酸至3%，做为稳定剂；
10，分别用20纳米滤芯对以上凝血FVII及FIX溶液进行除病毒过滤；
11，分别用0.22μm滤芯对以上凝血FVII及FIX溶液进行除菌过滤并分装；
12，将以上分装好的样品放入两台冻干机分别冻干，得到凝血FVII及FIX冻干品；
13，同时将FVII及FIX冻干品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
实施例二
1，去冷胶血浆的制备：同实施例一；
2，第一次强阴离子交换柱层析：将步骤1得到的澄清去冷胶血浆上Capto-Q柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.8M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液（富含凝血FVII与FIX）；
3，PEG沉淀去杂蛋白：以上洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至6%,搅拌0.5小时，后用1.0μm串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的滤液；
4，S/D病毒灭活：同实施例一；
5，第二次强阴离子柱层析：将上述S/D后的溶液用稀释液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.02M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上Capto-Q柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液A（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.3M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液A（凝血七因子粗品）；再用洗脱缓冲液B(PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，1.0M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱，收集洗脱液B（凝血九因子粗品）；得到凝血FIX粗品，置于2-8℃；
6，弱阴离子柱层析纯化凝血FVII：将上述洗脱液A用稀释液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.02M盐酸精氨酸）稀释到原来的3倍，然后上DEAE-SepharoseFF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.3M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱柱子，得到精制的凝血七因子溶液；用0.45μm滤芯过滤得到澄清滤液,置于2-8℃；
7，肝素亲和柱层析纯化凝血FIX：将步骤5得到的洗脱液B用稀释液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.02M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上HeparinSepharoseCL-6B柱，柱子预先用平衡缓冲液（0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠溶液,PH7.30-7.40）平衡，，后用洗涤缓冲液（0.02M柠檬酸钠，0.25M氯化钠溶液，PH7.30-7.40）洗涤，再用洗脱缓冲液（0.02M柠檬酸钠,0.04M盐酸精氨酸,1.0M氯化钠溶液，PH7.30-7.40）洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液得到精制的凝血FIX溶液；
8，用10k分子量的超滤膜包分别浓缩步骤6,7得到的凝血FVII及FIX滤液，并用透析液（0.02M柠檬酸钠,0.1M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）分别透析，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包,分别得到凝血FVII及凝血FIX浓缩液196克，219克,活力分别为41.1IU/ml，38.2IU/ml;
9~13，同实施例一。
实施例三
1，去冷胶血浆的制备：同实施例一；
2，第一次强阴离子交换柱层析：将步骤1得到的澄清去冷胶血浆上Capto-Q柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.50-6.60,0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.6M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液（富含凝血FVII与FIX）；
3，PEG沉淀去杂蛋白：以上洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至4%,搅拌1小时，后用1.0μm串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的滤液；
4，S/D病毒灭活：同实施例一；
5，第二次强阴离子柱层析：将上述S/D后的溶液用稀释液（PH6.50-6.60,0.02M柠檬酸钠，0.02M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上Capto-Q柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.50-6.60,0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液A（PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.25M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱柱子，收集洗脱液A（凝血七因子粗品）；再用洗脱缓冲液B(PH7.30-7.40,0.02M柠檬酸钠，0.7M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱，收集洗脱液B（凝血FIX粗品），置于2-8℃；
6，弱阴离子柱层析纯化凝血FVII：将上述洗脱液A用稀释液（PH6.50-6.60,0.02M柠檬酸钠，0.02M盐酸精氨酸）稀释到原来的2倍，然后上DEAE-SepharoseFF柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH6.50-6.60,0.02M柠檬酸钠，0.1M氯化钠，）平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6.50-6.60,0.02M柠檬酸钠，0.25M氯化钠，0.02M盐酸精氨酸）洗脱柱子，得到精制的凝血七因子溶液；用0.45μm滤芯过滤得到澄清滤液,置于2-8℃；
7，肝素亲和柱层析纯化凝血FIX：将步骤5得到的洗脱液B用稀释液（PH6.90-7.10,0.02M柠檬酸钠，0.02M盐酸精氨酸）稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上HeparinSepharose6FF柱，柱子预先用平衡缓冲液（0.02M柠檬酸钠，0.15M氯化钠溶液,PH6.90-7.10）平衡，，后用洗涤缓冲液（0.02M柠檬酸钠，0.25M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）洗涤，再用洗脱缓冲液（0.02M柠檬酸钠,0.04M盐酸精氨酸,0.6M氯化钠溶液，PH6.90-7.10）洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液得到精制的凝血FIX溶液；
8，同实施例一，最后分别得到凝血FVII及凝血FIX浓缩液219克，242克,活力分别为37.8IU/ml，36.7IU/ml；
9~13，同实施例一。
附表试制品FVII及FIX收率及比活一览表

Claims (10)

1.一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）去冷胶血浆的制取
将新鲜冰冻血浆融化，在0-3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为0.01M-0.02M，氯化钠浓度为0.075M-0.15M氯化钠，缓冲液PH值为6.50-7.50，温度10-15℃；
（2）第一次强阴离子交换柱层析
步骤（1）得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡;上柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII与FIX的溶液；
（3）PEG沉淀去杂蛋白
在步骤（2）收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3-6%,搅拌0.5-1.5小时，后用1.0μm滤芯过滤，收集澄清的滤液；
（4）S/D病毒灭活
在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-7小时；
（5）第二次强阴离子柱层析
将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上强阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液2平衡;上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即为凝血FIX粗品；
（6）弱阴离子柱层析纯化凝血FVII
将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2-4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0.45μm滤芯过滤得到澄清滤液；
（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX
将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上肝素亲和柱，柱子预先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤,所得滤液即为精制的凝血FIX溶液；
（8）超滤
用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒体积透析4-6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包；
（9）加稳定剂及调节
按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值（一般为20-30IU/ml），后分别加入稳定剂并分别调PH值至6.50-7.50；
（10）纳米膜除病毒过滤
分别用15-20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤；
（11）除菌过滤并分装
分别用0.22μm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行
（12）冻干
分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉；
（13）干热除病毒过滤
分别或同时将FVII及FIX冻干品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（2）所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（2）所述的柱层析所用的平衡缓冲液1组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液1组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.4M-0.8M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
4.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（6）所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种；步骤（5）所述的平衡缓冲液2组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；步骤（5）所述的洗脱缓冲液2A组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.175M-0.35M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸,PH6.50-7.50；步骤（5）所述的洗脱缓冲液2B组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.5M-1.0M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
5.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（6）所述的弱阴离子交换柱层析所用填料为DEAE-SepharoseFF或CaptoDEAE；步骤（6）所述的平衡缓冲液3组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.1M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液3组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.15M-0.30M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
6.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（7）所述的肝素亲和柱层析所用填料为HeparinSepharoseFF或HeparinSepharoseCL-6B；步骤（7）所述的平衡缓冲液4组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.1M-0.15M氯化钠溶液，PH6.50-7.50；所述的洗涤缓冲液4组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.15-0.25M氯化钠溶液，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液4组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠,0.02M盐酸精氨酸,0.4M-1.0M氯化钠溶液，PH6.50-7.50。
7.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（5）~（7）所述的稀释液组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。
8.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（8）所述的透析液组成为0.01M柠檬酸钠,0.075M-0.125M氯化钠，PH6.50-7.50；该透析液对FVII及FIX均适合。
9.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（9）所述的稳定剂，对于FVIII而言，稳定剂是精氨酸盐酸盐与甘氨酸，其中精氨酸盐酸盐加至0.5-3%，甘氨酸加至0.5-3%；对于FIX而言，稳定剂是组氨酸与甘氨酸，其中组氨酸加至0.5-3%，甘氨酸加至0.5-3%。
10.根据权利要求1-9所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：FVII冻干制剂与FIX冻干制剂均经历了S/D病毒灭活、纳米膜除病毒过滤及干热病毒灭活三个步骤。
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