CN105175486A - 一种高纯人凝血因子ix的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括冰冻血浆融化后的低温离心；DEAE？Sephadex？A-50凝胶吸附去冷胶血浆中的凝血因子IX；聚乙二醇去除溶液中杂蛋白；S/D病毒灭活；阴离子交换柱层析得到纯化的凝血因子IX溶液；再上肝素亲和柱进一步层析得到高纯凝血因子IX溶液；超滤、透析、浓缩并加入盐酸精氨酸和甘氨酸作为保护剂；20纳米滤芯过滤去除病毒；冻干；干热病毒灭活。本发明在凝胶吸附、柱层析、超滤透析操作均加入了蛋白保护剂，降低了FIX制品凝血酶激活的概率，提高了产品的合格率；本发明工艺产品得率高，FIX比活可达150IU/mg左右，远高于传统产品，且经三步病毒灭活，产品使用安全可靠。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种人凝血因子IX，具体来说是一种高纯人凝血因子IX的制备方法。
背景技术
人凝血因子IX(FIX)是人体十三种凝血因子中的一种，在人体凝血机制中扮演非常重要的作用。因缺乏凝血因子IX而导致凝血障碍即为乙型血友病，该病是一种遗传性疾病，患者以男性为主，发病率约为男性活婴的1/30000，以自发性或创伤相关的出血为特征，出血部位主要在关节、软组织和肌肉。治疗的延迟或不足会引起各种并发症，包括关节反复出血相关的关节病和滑膜炎，严重时可导致关节畸形和功能障碍。另外，更严重的出血，尤其是颅内出血可能导致死亡。
目前治疗乙型血友病唯一有效的方法就是及时注射含凝血因子FIX的药物以达到止血的目的，或者规律性注射含凝血因子IX的药物预防出血。含凝血因子FIX的药物有血浆提取的人凝血因子FIX、人凝血酶原复合物以及基因重组的人凝血因子IX等，国外有冻干人凝血因子IX及重组人凝血因子IX制品，国内目前只有冻干人凝血酶原复合物品种。临床实践表明，乙型血友病人可以自我注射纯的人凝血因子IX，通常不会有副作用，是比较安全的，但是注射人凝血酶原复合物却可能产生严重的副作用―血栓症，所以一般乙型血友病人输注该药时需在医院注射，留院观察以防意外。可见，纯化的人凝血因子FIX是治疗乙型血友病的首选药物，但传统的纯化人凝血因子IX生产工艺，工序较多，成本很高，且在生产过程中易出现凝血酶激活的问题而致产品失败，再加上传统工艺的病毒灭活手段单一，不能完全保证制品的安全，而干热病毒灭活方式往往导致较大的活力损失，所以，长期以来，纯化的人凝血因子IX一直未能取代虽有副作用但成本低廉的人凝血酶原复合物，
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种高纯人凝血因子IX的制备方法，所述的这种高纯人凝血因子IX的制备方法解决了现有技术中制备人凝血因子IX的方法工序复杂、成本高，产品安全性不高的技术问题。
本发明提供了一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：
1)将新鲜冰冻血浆融浆后离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆，然后将去冷胶血浆加热至10-15℃；
2)将DEAE-SephadexA-50凝胶置于一个不锈钢树脂桶中，先用温度在75～85℃的注射用水充分溶胀，再用10～20℃的注射用水冷却，然后用缓冲液平衡，所述的缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate(柠檬酸钠)的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.075M-0.15M，所述的缓冲液的PH为6.50-7.50，将上述平衡好的凝胶加入到去冷胶血浆中，按照每升去冷胶血浆加入0.5-1.5克干凝胶的比例加入平衡好的凝胶，搅拌0.5-1.5小时，再静置10-20分钟；
3)过滤去冷胶血浆，收集吸附了凝血因子IX的DEAE-SephadexA-50凝胶，后用洗涤缓冲液冲洗树脂4-6次，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.1M-0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50-7.50；再用洗脱缓冲液洗脱树脂2-4次，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride(盐酸精氨酸)和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M-2.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50-7.50，收集洗脱液，然后用0.45μm或1.0μm滤芯过滤洗脱液，收集滤液，即为凝血因子IX粗品溶液；
4)在过滤后的洗脱液中加入聚乙二醇，加入后的聚乙二醇在洗脱液中的质量百分比浓度为2-6％，搅拌0.5-1.5小时，过滤；
5)在上述的滤液中加入Tween80，加入后的Tween80在上述滤液中的质量百分比浓度为1.0％，再加入磷酸三丁酯，加入后的磷酸三丁酯在上述滤液中的质量百分比浓度为0.3％，搅匀后升温至24-26℃，后保温6～7小时；
6)然后降温至5-15℃，用第一稀释液稀释至电导率不高于15ms/cm，所述的第一稀释液为0.01MNa-citrate溶液，所述的第一稀释液的PH6.2-7.20，然后上阴离子交换柱，所述的阴离子交换柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.1M-0.15M，所述的平衡缓冲液的PH为6.20-7.20；再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.18-0.3M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.20-7.20，再用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M-1.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.80-7.80，收集洗脱液即为纯化的凝血因子IX溶液；
7)用第二稀释液稀释步骤6)的洗脱液至电导率不高于15ms/cm，所述的第二稀释液由Na-citrate、ArginineHydrochloride组成，在所述的稀释液中，Na-citrate的浓度为0.01M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M，所述的第二稀释液的PH为6.50-7.50，然后上肝素亲和柱，所述的肝素亲和柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.01M-0.02M、NaCL的浓度为0.1M-0.15M，所述的平衡缓冲液为PH6.50-7.50；再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.01M-0.02M、NaCL的浓度为0.18-0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50-7.50；再用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride、和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.01M-0.02M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.4M-1.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50-7.50，收集洗脱液，用0.45μm或0.22μm滤芯过滤以上洗脱液，所得滤液即为高纯凝血因子IX溶液；
8)用10k分子量的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析，再浓缩至凝血因子IX活力高于35IU/ml，得到凝血因子IX浓缩液；
9)调节人凝血因子IX含量至20-30IU/ml，然后调PH值至6.50-7.50，并加入肝素钠至0.1-0.4IU/单位FIX，加入盐酸精氨酸和甘氨酸，所述的盐酸精氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓度为0.5-3％，所述的甘氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓度为0.5-3％；
10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
11)用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；
12)冻干；
13)在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活，得到高纯人凝血因子IX。
进一步的，步骤6)中，所述的阴离子交换柱为Capto-Q、Q-SepharoseFF、Q-Sepharose4FF、Q-SepharoseHP、Q-SepharoseXL、DEAE-SepharoseFF、或者Capto-DEAE层析柱。
进一步的，所述的上肝素亲和柱为HeparinSepharose6FF、HeparinSepharoseCL-6B。
本发明采用经典的DEAESephadexA-50凝胶吸附，获得富含凝血因子FIX的粗品，该凝胶吸附为批处理，对血浆的澄清度无特殊要求，无需过滤，故处理时间短，同时该工序操作简单，凝血因子IX损失少；本发明获取FIX粗品后，加入PEG沉淀剂，使杂蛋白从凝血因子IX溶液中沉降、过滤，除掉大部分杂蛋白；同时，PEG也是蛋白保护剂，在接下来的S/D病毒灭活工序可防止凝血因子IX变性失活；本发明选用Capto-Q新型高效强阴离子填料，分辨率高，压降小，流速快，比传统填料可节省很多操作时间；由此获得纯化的凝血因子IX；本发明选用HeparinSepharose6FF亲和填料，对纯化的FIX进一步精制，获得最高达153IU/mg的比活；本发明在凝胶吸附及后续的两步柱层析操作中，在洗脱缓冲液中均加入了蛋白保护剂精氨酸盐酸盐，中间的超滤透析操作中也加入了精氨酸盐酸盐，大大降低了FIX制品凝血酶激活的概率，提高了产品的合格率；本发明的生产流程中共使用了S/D病毒灭活、20纳米膜过滤去病毒及干热病毒灭活病三重灭除病毒措施，对脂包膜病毒、非脂包膜病毒及细小病毒进行了有效灭除，极大提高了产品的使用安全性。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的一种从去冷胶血浆中制备冻干人凝血因子FIX的方法，该工艺流程简洁，操作方便，易于实现工业化，且该工艺具有产品得率高、比活高的优点，产品经三步病毒灭活，使用安全可靠。
附图说明
图1是本发明的一种制备高纯人凝血因子IX的工艺流程框图。
具体实施方式
实施例1
一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：
1)取冰冻血浆35袋，表面用70％乙醇淋洗并用冷注射用水冲洗后，割袋，倒入不锈钢融浆桶中，在0-3℃水浴中融化，后精确称取20kg，离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆19.8kg，然后置于15℃水浴中加热去冷胶血浆至13-15℃；
2)称取20克DEAE-SephadexA-50凝胶置于凝胶桶中，先用约2kg热注射用水(约80℃)充分溶胀，再用约2kg冷注射用水(约15℃)冲洗冷却，后用约1kg缓冲液(PH6.50，0.01MNa-citrate，0.075MNaCL，15℃)平衡，然后加到去冷胶血浆中，缓慢搅拌1小时，后静置10分钟；
3)在凝胶桶中用滤布过滤去冷胶血浆，收集DEAE-SephadexA-50凝胶，然后在凝胶桶中加入2升洗涤缓冲液(PH6.50，0.01MNa-citrate，0.1MNaCL)搅拌约10分钟，后经滤布过滤后从桶底放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶4次，再用洗脱缓冲液(PH6.50，0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，0.5MNaCL)洗脱凝胶3次，每次2升，收集洗脱液约2005g，用0.45μm滤芯过滤洗脱液，，去除碎胶微粒，得到滤液1950克；
4)称取PEG(聚乙二醇)65克，先溶于65克注射用水中，后加入到滤液中，搅拌0.5小时后过滤，收集滤液2036克；
5)以上滤液中加入S/D母液(即Tween8010％(wt％)，TNBP(磷酸三丁酯)至3％(wt％))225克，搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时；
6)将S/D后溶液降温至5℃，用稀释液(0.01MNa-citrate溶液，PH6.20)稀释上述溶液至原溶液重量的3.5倍，然后上阴离子交换柱Q-SepharoseFF，层析柱预先用平衡缓冲液(0.01MNa-citrate，0.1MNaCL溶液，PH6.20)充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液(0.01MNa-citrate，0.18MNaCL溶液，PH6.20)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，0.5MNaCL溶液，PH6.80)洗脱，收集洗脱液用0.45μm滤芯过滤；
7)用稀释液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，PH6.50-7.50)稀释以上滤液，然后上HeparinSepharose6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡，平衡缓冲液为0.01MNa-citrate，0.15MNaCL溶液(PH6.80)，后用洗涤缓冲液(0.01MNa-citrate，0.18MNaCL溶液，PH6.80)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，0.5MNaCL溶液，PH6.80)洗脱，收集洗脱液810克，用0.45μm滤芯过滤洗脱液得到滤液772g；
8)用10k分子量的超滤膜(0.1M2)浓缩洗脱液至约300ml，后用1.5升透析液(0.01MNa-citrate，0.1MNaCL溶液，PH7.00)恒体积透析，再次浓缩并移出超滤膜包，得到浓缩液245克，测得FIX活力35.1IU/ml；
9)调节人凝血因子IX含量至30IU/ml，根据计算，称取盐酸精氨酸1.5克，甘氨酸8.3克，加入步骤9所述透析液23克，将盐酸精氨酸、甘氨酸加入透析液悬浮，后加到步骤9所述浓缩液中，然后调PH值至7.00，并加入肝素钠至0.15IU/单位九因子；
10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
11)用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装，10ml/瓶；
12)冻干；
13)在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；测FIX活力，28.1IU/ml；
实施例2
一种高纯人凝血因子FIX的制备方法，包括如下步骤：
1)同实施例1；
2)DEAE-SephadexA-50凝胶的用量、溶胀与冷却同实施例1，后用约1kg缓冲液(PH7.35，0.01MNa-citrate，0.15MNaCL，15℃)平衡，然后加到去冷胶血浆中，缓慢搅拌1小时，后静置20分钟；
3)在凝胶桶中用滤布过滤去冷胶血浆，收集DEAE-SephadexA-50凝胶，然后在凝胶桶中加入2升洗涤缓冲液(PH7.35，0.015MNa-citrate，0.2MNaCL)搅拌约5分钟，后经滤布过滤后从桶底放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶6次；再用洗脱缓冲液(PH7.35，0.015MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，1.0MNaCL)洗脱凝胶4次，每次1升，收集洗脱液约3988g，用0.45μm滤芯过滤洗脱液，得到滤液3936克；
4)称取PEG(聚乙二醇)260克，先溶于260克注射用水中，后加入到滤液中，搅拌1.5小时后过滤，收集滤液4402克；
5)以上滤液中加入S/D母液(即Tween8010％(wt％)，TNBP(磷酸三丁酯)至3％(wt％))500克，搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时；
6)将S/D后溶液降温至15℃，用稀释液(0.01MNa-citrate溶液，PH7.20)稀释上述溶液至电导率13.8ms/cm，然后上DEAE-SepharoseFF层析柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.01MNa-citrate，0.15MNaCL溶液，PH7.20)充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液冲洗，后用洗涤缓冲液(0.01MNa-citrate，0.3MNaCL溶液，PH7.20)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，1.0MNaCL溶液，PH7.80)洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤；
7)用稀释液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，PH7.50)稀释以上滤液，然后上HeparinSepharoseCL-6B柱，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡，平衡缓冲液为0.01MNa-citrate，0.15MNaCL溶液(PH7.50)，后用洗涤缓冲液(0.01MNa-citrate，0.2MNaCL，PH7.50)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，1.0MNaCL，PH7.50)洗脱，收集洗脱液764克，用0.45μm滤芯过滤洗脱液得到滤液713g；
8)用10k分子量的超滤膜(0.1M2)浓缩洗脱液至约300ml，后用1.5升透析液(0.01MNa-citrate，0.1MNaCL溶液，PH7.50)恒体积透析，再次浓缩并移出超滤膜包，得到浓缩液237克，测得FIX活力36IU/ml；
9)调节人凝血因子FIX含量至30IU/ml，根据计算，称取盐酸精氨酸8.6克，甘氨酸1.5克，加入步骤9所述透析液48克，将盐酸精氨酸、甘氨酸加入透析液溶解，后加到步骤9所述浓缩液中，然后调PH值至7.00，并加入肝素钠至0.3IU/单位九因子；
10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
11)用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装，10ml/瓶；
12)冻干；
13)在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；测FIX活力，27.8IU/ml。
实施例3
一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：
1)同实施例1；
2)DEAE-SephadexA-50凝胶的用量、溶胀与冷却同实施例1，后用约1kg缓冲液(PH7.05，0.01MNa-citrate，0.10MNaCL，15℃)平衡，然后加到去冷胶血浆中，缓慢搅拌1小时，后静置20分钟；
3)在凝胶桶中用滤布过滤去冷胶血浆，收集DEAE-SephadexA-50凝胶，然后在凝胶桶中加入2升洗涤缓冲液(PH7.05，0.01MNa-citrate，0.15MNaCL)搅拌约8分钟，后经滤布过滤后从桶底放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶5次，再用洗脱缓冲液(PH7.05，0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，0.65MNaCL)洗脱凝胶3次，每次1升，收集洗脱液约2955g，用0.45μm滤芯过滤洗脱液，得到滤液2904克；
4)称取PEG(聚乙二醇)130克，先溶于130克注射用水中，后加入到滤液中，搅拌1小时后过滤，收集滤液3108克；
5)以上滤液中加入S/D母液(即Tween8010％(wt％)，TNBP(磷酸三丁酯)至3％(wt％))350克，搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时；
6)将S/D后溶液降温至10℃，用稀释液(0.01MNa-citrate溶液，PH7.05)稀释上述溶液，然后上Capto-Q层析柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.01MNa-citrate，0.15MNaCL溶液，PH7.05)充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液冲洗，后用洗涤缓冲液(0.01MNa-citrate，0.25MNaCL溶液，PH6.20)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，0.6MNaCL溶液，PH7.05)洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤；
7)用稀释液(0.01MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，PH6.50-7.50)稀释以上洗脱液，然后上HeparinSepharose6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡，平衡缓冲液为0.01MNa-citrate，0.15MNaCL溶液(PH7.15)，后用洗涤缓冲液(0.02MNa-citrate，0.25MNaCL溶液，PH7.15)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.02MNa-citrate，0.02MArginineHydrochloride，0.65MNaCL溶液，PH7.15)洗脱，收集洗脱液739克，用0.45μm滤芯过滤洗脱液得到滤液692g；
8)用10k分子量的超滤膜(0.1M2)浓缩洗脱液至约300ml，后用1.5升透析液(0.01MNa-citrate，0.1MNaCL溶液，PH7.15)恒体积透析，再次浓缩并移出超滤膜包，得到浓缩液218克，测得FIX活力38IU/ml；
9)调节人凝血因子IX含量至30IU/ml，根据计算，称取盐酸精氨酸4.2克，甘氨酸4.2克，加入步骤9所述透析液50克，将盐酸精氨酸、甘氨酸加入透析液溶解，后加到步骤9所述浓缩液中，然后调PH值至7.15，并加入肝素钠至0.2IU/单位九因子；
10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
11)用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装，10ml/瓶；
12)冻干；
13)在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；测FIX活力，27.1IU/ml。
试制品FIX收率及比活一览表
Claims (3)
1.一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将新鲜冰冻血浆融浆后离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆，然后将去冷胶血浆加热至10-15℃；
2)将DEAE-SephadexA-50凝胶置于一个不锈钢树脂桶中，先用温度在75～85℃的注射用水充分溶胀，再用10～20℃的注射用水冷却，然后用缓冲液平衡，所述的缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.075M-0.15M，所述的缓冲液的PH为6.50-7.50，将上述平衡好的凝胶加入到去冷胶血浆中，按照每升去冷胶血浆加入0.5-1.5克干凝胶的比例加入平衡好的凝胶，搅拌0.5-1.5小时，再静置10-20分钟；
3)过滤去冷胶血浆，收集吸附了凝血因子IX的DEAESephadexA-50凝胶，后用洗涤缓冲液冲洗树脂4-6次，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的洗涤缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.1M-0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50-7.50，再用洗脱缓冲液洗脱树脂2-4次，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride和NaCL组成，在所述的洗脱缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M-2.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50-7.50，收集洗脱液，然后用0.45μm或1.0μm滤芯过滤洗脱液，收集滤液，即为凝血因子IX粗品溶液；
4)在过滤后的洗脱液中加入聚乙二醇，加入后的聚乙二醇在洗脱液中的质量百分比浓度为2-6％，搅拌0.5-1.5小时，过滤；
5)在上述的滤液中加入Tween80，加入后的Tween80在上述滤液中的质量百分比浓度为1.0％，再加入磷酸三丁酯，加入后的磷酸三丁酯在上述滤液中的质量百分比浓度为0.3％，搅匀后升温至24-26℃，后保温6～7小时；
6)然后降温至5-15℃，用第一稀释液稀释至电导率不高于15ms/cm，所述的第一稀释液为0.01MNa-citrate溶液，所述的第一稀释液的PH6.2-7.20，然后上阴离子交换柱，所述的阴离子交换柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.1M-0.15M，所述的平衡缓冲液的PH为6.20-7.20；再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的洗涤缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、NaCL的浓度为0.18-0.3M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.20-7.20，再用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride、和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.005M-0.015M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M-1.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.80-7.80，收集洗脱液即为纯化的凝血因子IX溶液；
7)用第二稀释液稀释步骤6)的洗脱液至电导率不高于15ms/cm，所述的第二稀释由Na-citrate、ArginineHydrochloride组成，在所述的稀释液中，Na-citrate的浓度为0.01M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M，所述的第二稀释液的PH为6.50-7.50，然后上肝素亲和柱，所述的肝素亲和柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.01M-0.02M、NaCL的浓度为0.1M-0.15M，所述的平衡缓冲液为PH6.50-7.50，再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.01M-0.02M、NaCL的浓度为0.18-0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50-7.50，再用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0.01M-0.02M、ArginineHydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.4M-1.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50-7.50，收集洗脱液，用0.45μm或0.22μm滤芯过滤以上洗脱液，所得滤液即为高纯凝血因子IX溶液；
8)用10k分子量的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析，再浓缩至凝血因子IX活力高于35IU/ml，得到凝血因子IX浓缩液；
9)调节人凝血因子IX含量至20-30IU/ml，然后调PH值至6.50-7.50，并加入肝素钠至0.1-0.4IU/单位FIX，加入盐酸精氨酸和甘氨酸，所述的盐酸精氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓度为0.5-3％，所述的甘氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓度为0.5-3％；
10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
11)用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；
12)冻干；
13)在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活，得到高纯人凝血因子IX。
2.根据权利要求1所述的一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于：步骤6)中，所述的阴离子交换柱为Capto-Q、Q-SepharoseFF、Q-Sepharose4FF、Q-SepharoseHP、Q-SepharoseXL、DEAE-SepharoseFF、或者Capto-DEAE层析柱。
3.根据权利要求1所述的一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于：所述的肝素亲和柱为HeparinSepharose6FF、HeparinSepharoseCL-6B。
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