변환 효율성

Transformation efficiency

변환 효율은 세포가 세포외 DNA를 차지하여 그것에 의해 암호화된 유전자를 표현할 수 있는 효율이다.이것은 세포의 역량에 기초한다.성공적인 변환제의 개수를 변환 절차 중에 사용된 DNA의 양으로 나누어 계산할 수 있다.변형 물질은 DNA(해외, 인공 또는 변형)를 차지하고 도입된 DNA에 유전자를 표현할 수 있는 세포다.

측정

변환 효율은 셀 초과 조건에서 결정되어야 한다.[1]변형 반응을 위한 준비에서 실행 가능한 세포의 수는 2×10에서8 10까지11 다양할 수 있다; 대장균 준비의 가장 일반적인 방법은 반응당 10개10 정도의 실행 가능한 세포를 산출한다.대장균에서 변환 효율의 결정에 사용되는 표준 플라스미드는 pBR322 또는 pUC 벡터 시리즈와 같은 유사하거나 작은 벡터들이다.그러나 변환 효율을 결정하기 위해 다른 벡터를 사용할 수 있다. 변환에는 10–100 pg의 DNA가 사용될 수 있으며, 저효율 변환에는 더 많은 DNA가 필요할 수 있다(일반적으로 포화 수준은 10 ng 이상에 도달한다).[2]

변환 후, 1%와 10%의 셀이 별도로 도금되며, 도금 용이성을 위해 필요한 경우 셀을 용지에 희석할 수 있다.고효율 변환에는 추가 희석을 사용할 수 있다.

변환 효율은 사용되는 μg DNA 당 변환제 또는 군집 형성 단위(cfu)로 측정할 수 있다.pUC19와 같은 작은 플라스미드에 대해 1×108 cfu/μg의 변환 효율은 대략 변환되는 플라스미드의 2000년 분자 중 1과 같다.대장균에서 가장 일반적으로 사용되는 플라스미드에 대한 변환 효율의 이론적 한계는 1×1011 cfu/μg을 초과할 것이다.실제로 가장 잘 달성할 수 있는 결과는 pUC19와 같은 작은 플라스미드의 경우 약 2–4×1010 cfu/μg이고, 큰 플라스미드의 경우 상당히 낮을 수 있다.

변환 효율성에 영향을 미치는 요인

개별 세포는 많은 DNA 분자를 차지할 수 있지만, 복수의 플라스미드가 존재한다고 해서 성공적인 변환 사건의 발생에 큰 영향을 미치지는 않는다.[3]변환 효율성에 영향을 미칠 수 있는 요인은 다음과 같다.[1]

플라스미드 크기 – 대장균에서 수행된 연구는 플라스미드 크기가 증가함에 따라 변환 효율이 선형적으로 감소한다는 것을 발견했다. 즉, 큰 플라스미드는 작은 플라스미드보다 덜 잘 변환된다.[3]

DNA의 형태 – 슈퍼코일 플라스미드는 이완된 플라스미드보다 약간 더 변환 효율이 높다 – 이완된 플라스미드는 슈퍼코일드보다 약 75%의 효율로 변환된다.[3]그러나 선형 및 단일 가닥 DNA는 변환 효율성이 훨씬 낮다.단일 가닥 DNA는 이중 가닥보다 10개의4 낮은 효율로 변형된다.

세포 유전자형 – 복제 변종은 세포의 변환 효율을 향상시키는 돌연변이를 포함할 수 있다.예를 들어 doR 돌연변이를 가진 대장균 K12 변종은 원래 이노신을 유일한 탄소원으로 사용하여 최소 매체에서 세포가 성장하는 능력을 부여한 것으로 밝혀졌으며, 이 변종 없이도 유사한 변종의 변환 효율이 4~5배 높다.대장균에서 잘 변형되지 않는 선형 DNA의 경우, recBC나 recD 돌연변이가 변환의 효율성을 크게 향상시킬 수 있다.

세포의 성장 – 대장균 세포는 빠르게 성장할 때 더욱 유능하게 만들기 쉬우며, 따라서 유능 세포를 준비할 때 세포 성장의 초기 로그 단계에서 보통 세포가 수확된다.세포 수확을 위한 최적의 광학 밀도는 보통 0.4 정도인데, 세포 변종에 따라 다를 수 있다.0.94-0.95라는 더 높은 값도 유능한 세포의 수율이 좋은 것으로 밝혀졌지만, 세포 성장이 빠른 경우에는 비현실적일 수 있다.[4]

변환 방법 – 유능한 세포의 준비 방법, 열충격 시간, 열충격 온도, 열충격 후 배양 시간, 사용되는 배지, 각종 첨가물 등이 세포의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있다.레저 혼합물에 리가스와 함께 오염물이 존재하면 전기 회전의 변환 효율을 낮출 수 있으며,[5] DNA의 리가제 또는 클로로포름 추출의 불활성화가 전기 회전을 위해 필요할 수 있으며, 또는 오염물질의 양을 줄이기 위해 레저 혼합물의 10분의 1만 사용할 수도 있다.유능한 세포의 정상적인 준비는8 106 - 10 cfu/μg DNA에 이르는 변환 효율을 산출할 수 있다. 그러나 화학적 방법에9 대한 프로토콜은 1 x 10 이상의 변환 효율을 산출할 수 있는 초경쟁적인 세포를 만들기 위해 존재한다.[6]일반적으로 전기회수법은 1 x 1010 cfu/μg 이상의 DNA가 가능한 화학적 방법보다 변환 효율이 뛰어나며, 200 kb 크기의 대형 플라스미드를 변환할 수 있다.

DNA 손상 – 표준 준비제 아가로오스 젤 전기영양증 시술에서 45초 동안 UV 방사선에 DNA가 노출되면 DNA가 손상될 수 있으며, 이는 변환 효율을 현저히 떨어뜨릴 수 있다.[7]그러나 1 mM 농도의 전기영동 완충기에 cytidine이나 guanosine을 첨가하면 DNA가 손상되지 않도록 보호할 수 있다.장기간 UV 트랜지머에 대한 DNA 작업을 위해 필요한 경우, DNA 손상을 덜 일으키는 파장 UV 방사선(365nm)을 사용해야 한다.이렇게 긴 파장의 UV는 DNA에 중간수분된 에티듐브로마이드와 함께 형광성이 약해지므로 DNA 대역의 영상을 캡처할 필요가 있을 경우 더 짧은 파장(302nm 또는 312nm)의 자외선 방사선을 사용할 수 있다.그러나 이러한 노출은 DNA를 나중에 조사 및 변환을 위해 복구하려면 매우 짧은 시간으로 제한해야 한다.

참고 항목

참조

  1. ^ a b Hanahan, D.; Jessee, J.; Bloom, F. R. (1991). "Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria". Methods in Enzymology. 204: 63–113. doi:10.1016/0076-6879(91)04006-a. ISBN 9780121821050. PMID 1943786.
  2. ^ "Calculating Transformation Efficiency". Sigma-Aldrich.
  3. ^ a b c Hanahan D (1983). "Studies on the transformation of Escherichia coli with plasmids". J. Mol. Biol. 166 (4): 557–580. doi:10.1016/S0022-2836(83)80284-8. PMID 6345791.
  4. ^ Tang, X.; Nakata, Y.; Li, H. O.; Zhang, M.; Gao, H.; Fujita, A.; Sakatsume, O.; Ohta, T.; Yokoyama, K. (1994). "The optimization of preparations of competent cells for transformation of E. Coli". Nucleic Acids Research. 22 (14): 2857–2858. doi:10.1093/nar/22.14.2857. PMC 308259. PMID 8052542.
  5. ^ Ymer, S. (1991). "Heat inactivation of DNA ligase prior to electroporation increases transformation efficiency". Nucleic Acids Research. 19 (24): 6960. doi:10.1093/nar/19.24.6960. PMC 329344. PMID 1762931.
  6. ^ Inoue, H.; Nojima, H.; Okayama, H. (1990). "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids". Gene. 96 (1): 23–28. doi:10.1016/0378-1119(90)90336-P. PMID 2265755.
  7. ^ Gründemann D, Schömig E. (1996). "Protection of DNA during preparative agarose gel electrophoresis against damage induced by ultraviolet light" (PDF). BioTechniques. 21 (5): 898–903. doi:10.2144/96215rr02. PMID 8922632.

외부 링크