결찰(분자생물학)

Ligation (molecular biology)
이 기사는 핵산의 결찰에 관한 것이다.펩타이드의 결찰은 화학적 결찰을 참조하십시오.기타 용도는 결속(동음이의)을 참조하십시오.
스틱 엔드릴레이션

분자생물학에서 결찰은 효소의 작용을 통해 두 개의 핵산 조각이 결합하는 것이다.이것은 DNA의 분자 복제에서 필수적인 실험 절차로, DNA 조각이 결합되어 재조합 DNA 분자를 만든다(예: 외부 DNA 조각이 플라스미드에 삽입될 때).DNA 조각의 끝은 한 DNA 말단의 3'-히드록실기와 다른 말단의 5'-포스포릴 사이의 포스포디에스테르 결합 형성에 의해 함께 결합된다.RNA는 또한 유사하게 결합될 수 있다.보조 인자는 일반적으로 반응에 관여하며, 이것은 보통 ATP 또는+ NAD이다.

실험실에서의 결찰은 일반적으로 T4 DNA 연결효소를 사용하여 수행됩니다.그러나 표준 DNA 연결효소를 사용하지 않는 결찰 시술도 인기가 있다.

결찰 반응

결찰 반응의 메커니즘은 I. Robert [1][2]Leman의 실험실에서 처음 설명되었습니다.DNA의 두 조각은 DNA 가닥의 한쪽 끝에서 3'-OH와 다른 쪽 끝의 5'-인산기 사이의 포스포디에스테르 결합 형성을 촉매하는 DNA 연결효소에 의해 결합될 수 있다.동물과 박테리오파지에서는 결찰을 위한 에너지원으로 ATP가 사용되는 반면, 박테리아에서는 NAD가+ 사용됩니다.[3]

DNA 연결효소는 먼저 ATP 또는+ NAD와 반응하여 포스포아미드 결합을 통해 리신의 γ-아미노기에 연결된 AMP와 연결효소-AMP 중간체를 형성한다.이 아데닐기는 DNA 사슬의 5' 말단에서 인산기로 전달되어 DNA-아데닐산 복합체를 형성한다.마지막으로 [1]다른 DNA의 활성화된 5γ-포스포릴기상의 DNA 가닥 말단에서 3'-히드록실 친핵 공격을 통해 두 DNA 말단 사이의 포스포디에스테르 결합을 형성한다.

DNA의 흠집(즉, 이중가닥 DNA의 한 가닥의 파손)은 연결효소에 의해 매우 효율적으로 복구할 수 있다.그러나 결찰 반응이 진행되기 전에 두 개의 분리된 DNA 끝을 결합할 때 결찰의 복잡한 특징이 나타난다.점착성 또는 점착성 단부를 가진 DNA의 결찰에서는 돌출된 DNA 가닥을 이미 아닐할 수 있으므로 DNA의 2개의 칼집을 수복하는 것과 동등하므로 비교적 효율적인 프로세스이다.단, DNA가 함께 아닐하기 위한 돌출단부가 없는 뭉툭한 단부의 결찰에서는 결속되기 전에 단부가 서로 정렬되는 무작위 충돌에 의존하며 결과적으로 훨씬 덜 효율적인 공정이다.[4]대장균의 DNA 연결효소는 분자 밀집 조건을 제외하고 뭉툭한 끝의 DNA를 결찰할 수 없기 때문에 일반적으로 실험실에서 결찰에 사용되지 않는다.대신 단가닥 [5][3]DNA뿐만 아니라 뭉툭한 끝의 DNA를 결합할 수 있기 때문에 파지 T4의 DNA 연결효소가 사용된다.

결찰에 영향을 미치는 요인

효소 매개 화학 반응에 영향을 미치는 인자는 반응 온도 및 배양 시간뿐만 아니라 효소와 반응 물질의 농도와 같은 결찰 반응에 자연스럽게 영향을 미칠 것이다.대부분의 결찰 반응에 대해 원하는 결찰 생성물은 두 개의 다른 DNA 분자 사이여야 하며 반응은 분자 간 및 분자 내 반응을 모두 수반하며 효율적인 결찰을 위해 추가적인 어닐링 단계가 필요하다는 사실로 인해 결찰은 복잡하다.

결찰 중에 새로운 포스포디에스테르 결합을 형성하기 위한 세 가지 단계는 효소 아데닐화, DNA로의 아데닐 전이, 그리고 닉 실링입니다.Mg(2+)는 촉매작용의 보조인자이므로 고농도 Mg(2+)에서는 결찰효율이 높다.Mg(2+)의 농도가 제한되면 닉씰링은 프로세스의 속도제한 반응이며, 아데닐화 DNA 중간체가 용액에 잔류한다.효소의 이러한 아데닐화는 LIG1의 아킬레스힐의 아데닐화 DNA 중간 비교에 대한 재결합을 억제하고 [6]고정되지 않으면 위험을 나타낸다.

DNA 농도

DNA의 농도는 결찰 속도와 결찰이 분자간 반응인지 분자내 반응인지에 영향을 미칠 수 있다.결찰은 DNA의 끝을 다른 끝과 결합하는 것을 포함하지만, 각 DNA 조각은 두 끝을 가지고 있으며, 만약 그 끝이 양립할 수 있다면, DNA 분자는 자신의 끝을 결합함으로써 순환할 수 있다.고DNA 농도에서는 DNA 분자의 한쪽 끝이 다른 DNA의 끝과 만나 분자간 결속을 형성할 가능성이 높아진다.낮은 DNA 농도에서, DNA 분자의 한쪽 끝이 같은 분자의 다른 쪽 끝과 만날 확률이 증가하며, 따라서 DNA를 순환시키는 분자 내 반응이 더 가능성이 높습니다.선형 DNA의 변환 효율 또한 원형 DNA보다 훨씬 낮으며, DNA가 순환하기 위해서는 DNA 농도가 너무 높아서는 안 된다.일반적으로 총 DNA 농도는 10μg/ml [7]미만이어야 한다.

DNA 조각의 상대적 농도, 길이 및 완충 조건도 분자간 또는 분자내 반응이 선호되는지 여부에 영향을 미칠 수 있는 요인이다.

DNA 농도는 코발트 헥사민 등의 축합제와 스펠미딘 등의 생물성 폴리아민을 첨가하거나 [8][9]효소의 유효 농도를 높이는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 크라우딩제를 사용하여 인위적으로 높일 수 있다.그러나 코발트 헥사민과 같은 첨가물은 독점적으로 분자간 [10]반응을 일으켜 원형 DNA가 아닌 선형 응집체를 만들어 플라스미드 DNA의 변형에 더 적합하므로 플라스미드 결속에는 바람직하지 않다.플라스미드 결찰에 첨가제를 사용할 필요가 있는 경우에는 분자내 [11]결찰과 분자간 결찰을 촉진할 수 있으므로 PEG를 사용하는 것이 바람직하다.

리가아제 농도

연결효소 농도가 높을수록 결찰속도가 빨라진다.뭉툭한 말단 결찰은 끈적거리는 말단 결찰보다 훨씬 덜 효율적이기 때문에 뭉툭한 말단 결찰에는 고농도의 연결효소가 사용된다.보다 빠른 결찰을 위해 높은 DNA 연결효소 농도를 PEG와 함께 사용할 수 있으며, 이들은 신속한 [12][13]결찰을 위해 설계된 시판 키트에서 종종 발견되는 성분이다.

온도

결찰 반응의 온도를 고려할 때 두 가지 문제가 있습니다.첫째, DNA결합효소 활성의 최적온도 37°℃, 둘째, DNA의 용융온도(Tm)가 결합을 종료한다.녹는 온도는 DNA 돌출부의 길이와 염기 구성에 따라 달라집니다. G와 C의 수가 많을수록 T는m A-T 염기쌍의 2개에 비해 G-C 염기쌍 사이에 3개의 수소 결합이 형성되기 때문에 T는 높아집니다. 이는 조각들 사이의 염기 쌓기의 일부 기여입니다.결찰반응이 효율적으로 진행되기 위해서는 결찰단부가 안정적으로 아닐되어야 하며 결찰실험에서는 일반적으로 DNA단부의 T가m 37C보다° 훨씬 낮다.따라서 응집 말단을 결합하기 위한 최적의 온도는 DNA 연결효소 활성에 대한 최적의 온도와 말단이 [14]결합할 수 있는 T 사이의m 타협이다.단, 다른 제한효소에 의해 다른 단부가 생성되며, 이들 효소에 의해 생성되는 단부의 염기성분도 다를 수 있으며, 용융온도와 최적온도는 사용되는 제한효소에 따라 크게 다를 수 있으며, 결찰의 최적온도는 단부에 따라 4~15°℃가 될 수 있다.s.[15][16] 결합은 종종 동일한 반응 혼합물의 다른 제한 효소에서 생성된 결합 말단을 포함하므로 특정 결합 반응에 대해 최적의 온도를 선택하는 것은 실용적이지 않을 수 있으며 대부분의 프로토콜은 단순히 12-16C°, 실온 또는 4C를° 선택한다.

버퍼 구성

사용되는 버퍼의 이온 강도는 결합에 영향을 줄 수 있습니다.양이온 존재의 종류는 결찰 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, Na의 과다량은+ DNA가 더 단단해지도록 하고 분자간 결찰의 가능성을 증가시킬 수 있습니다.고농도의 1가 양이온(200mM 이상)에서는 결찰도 거의 완전히 [17]억제할 수 있다.결찰에 사용되는 표준 버퍼는 이온 [18]효과를 최소화하도록 설계되었습니다.

스틱 엔드 경계

제한 효소는 그들이 소화시키는 DNA에서 다양한 말단을 생성할 수 있지만, 복제 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 제한 효소는 끈적임 또는 응집성 말단이라고 불리는 4염기 단일 가닥 돌기를 생성한다. (2염기 돌기를 생성하는 NdeI와 둔기를 생성하는 NdeI는 예외이다.)이러한 스틱 엔드는 호환성이 있는 다른 엔드로 어닐링되어 스틱 엔드(또는 응집성 엔드) 결합으로 결합될 수 있습니다.예를 들어 EcoRI는 AAT 엔드를 생성하는데, A, T는 C, G보다 용융온도가 낮기 때문에 용융온도m T는 약 6°℃[19]로 낮다.대부분의 제한 효소의 경우 생성된 돌출부의 T는m [18]약 15C입니다°.실용적으로는 12~16°℃ 또는 상온에서, 또는 대체적으로° 4℃에서 장기간에 걸쳐 끈적끈적한 말단 결속을 실시한다.

플라스미드 벡터에 DNA 단편을 삽입하기 위해서는 서로 다른 단부가 생성되도록 두 가지 다른 제한 효소를 사용하여 DNA를 소화시키는 것이 바람직하다.두 개의 다른 끝은 삽입 없이 벡터의 교화를 방지할 수 있으며, 또한 파편을 방향성 있게 삽입할 수 있습니다.

두 개의 다른 부위를 사용할 수 없는 경우, 벡터 DNA는 삽입 없이 재순환된 벡터 DNA의 높은 배경을 피하기 위해 탈인산화되어야 할 수 있다.끝부분에 인산기가 없으면 벡터는 스스로 결합할 수 없지만 인산기가 있는 삽입물에 결합할 수 있다.탈인산화효소는 일반적으로 소화 DNA의 5' 말단에서 인산기를 제거하는 종아리-장알칼리인산가수분해효소(CIAP)를 사용하여 이루어지지만, CIAP는 쉽게 불활성화되지 않으며 CIAP를 제거하기 위한 추가 단계 없이 결찰을 방해할 수 있어 결찰에 실패할 수 있다.CIAP는 너무 많이 사용하지 말고 필요할 때만 사용해야 합니다.새우알칼리인산가수분해효소(SAP) 또는 남극인산가수분해효소(AP)는 쉽게 불활성화되기 때문에 적절한 대안이다.

뭉툭한 끝의 결찰

둔단 결찰은 돌출된 단부의 베이스 페어링을 수반하지 않기 때문에 둔단은 다른 둔단에 묶일 수 있다.SmaI 및 EcoRV와 같은 제한 효소에 의해 뭉툭한 끝이 생성될 수 있습니다.블런트 엔드 클로닝의 주요 장점은 보통 PCR에서 블런트 엔드가 생성되기 때문에 원하는 삽입물은 그 시퀀스에서 제한 부위를 필요로 하지 않으며, PCR에서 생성된 블런트 엔드의 DNA 단편은 제한 다이제스트에서 생성된 블런트 엔드의 벡터에 결합될 수 있다는 것이다.

단, 블런트엔드 결합은 스틱엔드 결합보다 효율이 훨씬 떨어집니다.일반적으로 반응은 스틱엔드 결합보다 100배 느립니다.뭉툭한 끝에는 돌출된 끝이 없기 때문에 결찰 반응은 뭉툭한 끝 사이의 무작위 충돌에 의존하며 결과적으로 훨씬 덜 효율적입니다.낮은 효율을 보완하기 위해 사용되는 리가아제 농도는 스틱 엔드 결찰(10배 이상)보다 높다.뭉툭한 끝 결찰에 사용되는 DNA의 농도 또한 말단 간 충돌 가능성을 증가시키기 위해 더 높으며, 뭉툭한 끝 결찰에 더 긴 배양 시간을 사용할 수도 있다.

벡터에 결합할 필요가 있는 양끝이 뭉툭한 경우에는 자가 결합을 최소화하기 위해 벡터를 탈인산화해야 합니다.이는 CIAP를 사용하여 수행할 수 있지만 앞에서 설명한 바와 같이 사용 시 주의가 필요합니다.벡터는 탈인산화되었고 결찰은 5'-인산의 존재를 요구하므로 삽입물은 인산화되어야 한다.무딘 말단 PCR 생성물은 일반적으로 5'-인산이 없으므로 T4 폴리뉴클레오티드 [20]키나아제 처리에 의해 인산화되어야 한다.

무딘 말단 결찰은 또한 고농도의 [21]ATP에 의해 가역적으로 억제된다.

PCR은 보통 무딘 끝 PCR 제품을 생성하지만, Taq 중합효소를 사용하는 PCR은 PCR 제품의 3' 말단에 추가 아데닌(A)을 첨가할 수 있습니다.이 특성은 PCR 생성물의 끝이 벡터의 T 끝에 아닐할 수 있는 TA 복제에서 이용될 수 있습니다.따라서 TA 결합은 스틱엔드 결합의 한 형태입니다.무딘 끝 벡터는 말단 트랜스페라아제를 사용하여 디옥시티미딘3인산(ddTTP)에 의한 TA 결찰용 벡터로 할 수 있다.

일반적인 가이드라인

원형 플라스미드에 삽입물을 복제하는 경우:

  • 플라스미드가 재순환되어야 하므로 사용되는 총 DNA 농도는 10μg/ml 미만이어야 합니다.
  • 인서트 대 벡터의 몰비는 보통 약 3:1로 사용됩니다.비율이 매우 높으면 여러 개의 삽입물이 발생할 수 있습니다.비율은 삽입물의 크기에 따라 조정할 수 있으며 1:1과 같은 다른 비율을 사용할 수 있습니다.

트러블 슈팅

경우에 따라서는 결찰이 원하는 결합 제품을 생성하지 못할 수 있으며, 생각할 수 있는 이유 중 일부는 다음과 같습니다.

  • 손상된 DNA – 결찰을 위해 DNA를 준비하는 동안 UV 방사선에 과도하게 노출되면 DNA가 손상되어 변환 효율성이 크게 저하될 수 있습니다.장시간 UV 투광기로 DNA 작업을 위해 필요한 경우 DNA 손상을 줄이는 고파장 UV 방사선(365 nm)을 사용해야 합니다.그러나 1mM 농도의 전기영동 완충기에 시티딘 또는 구아노신을 첨가하면 DNA를 [22]손상으로부터 보호할 수 있습니다.
  • CIAP의 잘못된 사용 또는 비효율적인 비활성화 또는 삭제.
  • 과도한 양의 DNA가 사용되었습니다.
  • 불완전한 DNA 다이제스트 – 불완전하게 소화되는 벡터 DNA는 높은 배경을 발생시키며, 이는 대조군으로서 삽입되지 않은 결찰로 확인할 수 있습니다.완전히 소화되지 않은 삽입물도 제대로 결합되지 않고 원형화됩니다.PCR 제품을 소화시킬 때, 많은 제한 효소가 효율적인 소화를 위해 최소 수의 추가 염기쌍을 필요로 하므로 PCR에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 충분한 추가 염기가 추가되었는지 확인하십시오.필요한 최소 염기쌍에 대한 정보는 New England [23]Biolabs 카탈로그와 같은 제한 효소 공급업체에서 얻을 수 있습니다.
  • 불완전한 결찰 – 녹는 온도가 낮은 무딘 말단 DNA(예: SmaI)와 일부 끈적끈적한 말단 DNA(예: NdeI)는 더 많은 연결효소 및 더 긴 배양 [24]시간이 필요합니다.
  • 결합 유전자 삽입에서 발현되는 단백질은 세포에 독성이 있다.
  • 플라스미드 DNA의 배열에 삽입된 상동 배열로 결실을 초래합니다.

다른 DNA 결찰 방법

시판되는 많은 DNA 복제 키트는 일반적인 DNA 연결효소를 사용하지 않아도 되는 다른 결찰 방법을 사용합니다.이 방법들은 복제 DNA 삽입물을 다른 벡터에 더 쉽게 전송할 수 있을 뿐만 아니라 훨씬 더 빠르게 복제를 할 수 있게 해준다.그러나 이러한 방법에는 특별히 설계된 벡터와 컴포넌트를 사용해야 하며 유연성이 부족할 수 있습니다.

토포이소머라아제 매개결찰

결찰을 위해 연결효소 대신 토포이소머라아제를 사용할 수 있으며, 클로닝은 벡터 또는 삽입물의 제한적인 소화 없이 보다 빠르게 이루어질 수 있다.본 발명의 TOPO 클로닝방법은 토포이소머라아제 I를 단부에 부착함으로써 선형화 벡터를 활성화하고, 이 「TOPO활성화」벡터는 PCR 생성물의 양끝에 결합함으로써 PCR 생성물을 받아들여 토포이소머라아제를 방출하고,[25] 그 과정에서 원형 벡터를 형성한다.

상동재조합

연결효소를 사용하지 않는 복제의 또 다른 방법은 예를 들어 게이트웨이 복제 [26][27]시스템에서 사용되는 DNA 재조합에 의한 것이다.일단 복제 벡터(이 방법에서는 엔트리 클론이라고 함)로 복제되면, 그 유전자는 [28]재조합에 의해 다양한 발현 벡터에 쉽게 도입될 수 있다.

분석.

결찰은 DNA 분석 [29]방법으로도 사용할 수 있다.일부 기술은 롤링 서클 [29]증폭을 사용합니다.이 중 가장 주목할 만한 것은 Smolina et al., 2007 및 Smolina et al., 2008에서 현장 형광 교배와 펩타이드 [29]핵산을 사용하여 설명한다.그들은 박테리아 [29]염색체 분석을 위해 이 기술을 개발하고 사용했다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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