면역 유지

Immunostaining
뇌종양의 GFAP 면역결핍부위 마이크로그래프.

생화학에서 면역유지란 시료의 특정 단백질을 검출하기 위한 항체 기반 방법을 사용하는 것이다."[1]임모노스테닝"이라는 용어는 원래 1941년 Albert Coons에 의해 처음 기술된 조직 부분의 면역 조직 화학적 염색을 지칭하기 위해 사용되었습니다.하지만, 면역 유지에는 이제 항체 기반 염색 방법을 사용하는 조직학, 세포 생물학, 분자 생물학에서 사용되는 광범위한 기술이 포함됩니다.

기술

면역 조직 화학

주요 기사:면역 조직 화학

조직 단면의 면역 조직 화학 또는 IHC 염색(또는 세포의 염색인 면역 세포 화학)은 아마도 가장 일반적으로 적용되는 면역 유지 [2]기술일 것입니다.IHC 염색의 첫 번째 사례는 형광 염료(면역 형광 참조)를 사용했지만, 현재는 페르옥시다아제(면역 산화효소 염색 참조)와 알칼리 포스파타아제(알칼리성 포스파타아제)와 같은 효소를 사용하는 다른 비형광 방법이 사용되고 있다.이 효소들은 광현미경 검사로 쉽게 검출할 수 있는 착색된 제품을 제공하는 촉매작용을 할 수 있다.또, 라벨로서 방사성 원소를 사용할 수 있어 면역 반응을 [3]오토라디오그래피로 가시화할 수 있다.

조직 준비 또는 고정은 세포 형태와 조직 구조를 보존하기 위해 필수적이다.부적절하거나 장기간 고정하면 항체 결합 능력이 현저하게 저하될 수 있습니다.포르말린 고정 파라핀 내장 조직 부분에서 많은 항원이 성공적으로 발현될 수 있다.그러나 일부 항원은 적당한 양의 알데히드 고정으로도 살아남지 못한다.이러한 조건 하에서 조직은 액체 질소에서 빠르게 냉동되고 크라이오스탯으로 절단되어야 한다.냉동 섹션의 단점으로는 형태학, 고배율 해상도, 파라핀 섹션의 절단 어려움, 냉동 보관 필요성 등이 있습니다.또는 바이브라톰 단면은 유기용제나 고열을 통해 조직을 처리할 필요가 없으며, 이는 항원성을 파괴하거나 동결 해동에 의해 파괴될 수 있다.진동체 섹션의 단점은 조직이 부드럽고 제대로 고정되지 않아 분할 과정이 느리고 어려우며, 단면에 떨림 자국이나 진동체 라인이 자주 나타난다는 것이다.

많은 항원의 검출은 고정에 의해 형성되는 단백질의 일부 가교고리를 끊고 숨겨진 항원부위를 밝혀냄으로써 작용하는 항원검색법에 의해 극적으로 개선될 수 있다.이는 다양한 시간 동안 가열(열 유도 에피토프 회수 또는 HIER)하거나 효소 소화(단백질 유도 에피토프 회수 또는 [4]PIER)를 사용하여 달성할 수 있다.

IHC 염색의 주요 어려움 중 하나는 특정 배경 또는 비특정 배경을 극복하는 것입니다.고정 방법 및 시간의 최적화, 차단제에 의한 전처리, 고염분 항체 배양, 항체 후 세척 완충 및 세척 시간의 최적화는 모두 고품질 면역 유지에 중요하다.또한 염색에 대한 양성 및 음성 대조군의 존재는 특이성을 결정하는 데 필수적이다.

플로우 세포 측정

주요 기사:플로우 세포 측정

플로우 세포계는 하나 이상의 특이 단백질을 발현하는 세포의 직접 분석에 사용할 수 있다.세포는 면역 형광에 사용되는 방법과 유사한 방법을 사용하여 용액에 면역 유지된 후 흐름 세포 측정법에 의해 분석된다.

플로우 세포측정법은 IHC에 비해 몇 가지 장점이 있다: 크기와 입도에 따라 구별되는 세포군을 정의할 수 있는 능력, 죽은 세포를 차단하는 능력, 개선된 민감도, 그리고 여러 항원을 동시에 측정하는 다색 분석.그러나 플로우 세포측정법은 극히 희귀한 세포군을 검출하는 데 덜 효과적일 수 있으며, 조직 [5]단면이 없을 경우 구조적 관계가 손실된다.플로우 세포계는 플로우 세포계의 구입과 관련된 자본 비용도 높습니다.

웨스턴 블롯

주요 기사:웨스턴 블롯

웨스턴 블롯은 정제 단계 전후에 세포나 조직으로부터 만들어진 추출물에서 특정 단백질을 검출할 수 있게 해준다.단백질은 일반적으로 겔 전기영동을 사용하여 크기별로 분리한 후 건조, 반건조 또는 습식 블롯 방법을 통해 합성막으로 전달됩니다.그 후 이 막은 면역 조직 화학과 유사한 방법을 사용하여 항체를 사용하여 프로빙될 수 있지만, 고정할 필요는 없습니다.검출은 일반적으로 화학 발광 반응을 촉매하기 위해 페르옥시다아제 결합 항체를 사용하여 수행됩니다.

웨스턴 블롯은 추출물 간의 단백질 수준을 반정량적으로 비교하기 위해 사용될 수 있는 일상적인 분자 생물학 방법입니다.블롯 전 크기 분리는 알려진 분자량 마커와 비교하여 단백질 분자량을 측정할 수 있게 한다.

효소결합면역흡수제측정

주요 기사: ELISA

효소연계면역흡수제(ELISA)는 혈장, 혈청 또는 세포/조직 추출물로부터의 단백질 농도를 복수 웰 플레이트 형식(일반적으로 플레이트당 96웰)으로 정량적 또는 반정량적으로 결정하기 위한 진단 방법이다.일반적으로 용액 중의 단백질은 ELISA 플레이트에 흡수된다.관심 단백질에 특유한 항체가 플레이트를 탐침하기 위해 사용된다.배경은 차단 및 세척 방법을 최적화하여 최소화하고(IHC의 경우), 양성 및 음성 대조군의 존재를 통해 특이성이 보장된다.검출방법은 보통 측색 또는 화학발광에 기초한다.

면역전자현미경법

주요 기사 : 면역전자현미경 검사

전자현미경 또는 전자현미경은 조직이나 세포의 상세한 마이크로아키텍처를 연구하기 위해 사용될 수 있다.Immuno-EM은 초박막 조직 부분에서 특정 단백질을 검출할 수 있도록 합니다.중금속 입자(예: 금)로 표시된 항체는 투과 전자 현미경을 사용하여 직접 시각화할 수 있습니다.면역-EM은 단백질의 세포 내 국소화를 검출하는 데 강력하지만 기술적으로 어렵고 비용이 많이 들 수 있으며 조직 고정 및 처리 방법의 엄격한 최적화가 필요하다.생체 내 단백질 바이오티닐화는 세포 형태를 더 잘 보존하는 고정 프로토콜과 [6]항체 염색의 빈번한 비호환성으로 인한 문제를 완화하기 위해 제안되었다.

방법론적 개요

면역유지방법에서 항체는 특정 단백질 에피토프를 검출하기 위해 사용된다.이러한 항체는 모노클로널 또는 폴리클로널일 수 있다.이 제1항체 또는 제1항체의 검출은 여러 가지 방법으로 이루어질 수 있다.

  • 1차 항체는 효소 또는 불소 포자를 사용하여 직접 라벨링할 수 있습니다.
  • 1차 항체는 효소 또는 불소체와 연결될 수 있는 고친화성 결합 파트너와 상호작용하는 작은 분자를 사용하여 라벨링할 수 있다.비오틴-스트렙타비딘은 일반적으로 사용되는 고친화성 상호작용 중 하나이다.
  • 1차 항체는 효소 또는 불소포자를 사용하여 라벨링된 광범위한 종 특이적 2차 항체를 사용하기 위해 시험될 수 있다.
  • 전자현미경 검사에서 항체는 중금속 입자(일반적으로 직경 5~15nm 범위의 금 나노 입자)에 연결되어 있습니다.

앞서 기술한 바와 같이 고추냉이 과산화효소 또는 알칼리 포스파타아제 등의 효소는 착색 또는 화학발광물을 생성하는 반응을 촉매하기 위해 일반적으로 사용된다.형광 분자는 형광 현미경법 또는 공초점 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다.

적용들

면역 유지의 적용은 매우 다양하지만, 임상 진단 및 실험실 연구에 가장 일반적으로 사용됩니다.

임상적으로 IHC는 분자 표지에 기초한 특정 유형의 암을 진단하기 위해 조직병리학에서 사용된다.

실험실 과학에서 면역 유지는 단백질의 유무, 조직 분포, 세포하 국소화 및 단백질 발현 또는 열화의 변화를 조사하는 데 기초해 다양한 응용 분야에 사용될 수 있다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Coons, Albert; Creech HJ; Jones, RN (1941). "Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group". Proc Soc Exp Biol Med. 47: 200–202.
  2. ^ Ramos-Vara, JA (2005). "Technical Aspects of Immunohistochemistry". Vet Pathol. 42 (4): 405–426. doi:10.1354/vp.42-4-405. PMID 16006601.
  3. ^ 면역 조직 화학 소개
  4. ^ AbD Serotec, Bio-Rad. "IHC Tip 1: Antigen retrieval - should I do PIER or HIER?". Bio-Rad Antibodies (formerly AbD Serotec).
  5. ^ Cherie, H (2004). "Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology". Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 128 (9): 1004–1022. doi:10.1043/1543-2165(2004)128<1004:AOFCAI>2.0.CO;2. PMID 15335254.
  6. ^ Viens, A.; Harper, F.; Pichard, E.; Comisso, M.; Pierron, G.; Ogryzko, V. (2008). "Use of Protein Biotinylation in Vivo for Immunoelectron Microscopic Localization of a Specific Protein Isoform". Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (10): 911–919. doi:10.1369/jhc.2008.951624. PMC 2544619. PMID 18574249.