WO2023277153A1

WO2023277153A1 - 骨髄系共通前駆細胞（ｃｍｐ）又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法

Info

Publication number: WO2023277153A1
Application number: PCT/JP2022/026341
Authority: WO
Inventors: 直也 ▲高▼山; 浩之江藤; 壮中村; スーディップクマールポール
Original assignee: 国立大学法人千葉大学; 国立大学法人京都大学
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2023-01-05
Also published as: JPWO2023277153A1; US20240301353A1; EP4365283A1

Abstract

本発明は、造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含み、骨髄球系前駆細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法、に関する。

Description

骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法

　本発明は広く、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法等に関する。

　末梢の血液細胞は、造血幹細胞から各系列の造血前駆細胞を経由して分化する。骨髄系共通前駆細胞は、血小板、赤血球、さらにリンパ球系以外の白血球細胞（好中球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞等）を産生する造血前駆細胞である。定常状態では骨髄中に存在するが、外傷や感染時等に必要に応じて分化し、成熟血液細胞を供給する。産生される好中球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞等は、自然免疫の主役であり、各種病原生物からの防御、腫瘍や変性した自己の細胞の排除、アレルギー反応、急性、慢性炎症に寄与する。

　これらの細胞は、炎症・アレルギーに対する薬剤スクリーニング、体内異物を除去するための細胞療法のソースとして期待される。従来の技術では、臍帯血、骨髄血、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞等から、試験管内で分化誘導する方法が取られてきたが、いずれの手技も煩雑であり、また大量の細胞を準備することが困難である。

Jie Z, Zhang Y, Wang C, Shen B, Guan X, Ren Z, et al. Large-scale ex vivo generation of human neutrophils from cord blood CD34+ cells. PLoS One. 2017;12(3). Caux C, Vanbervliet B, Massacrier C, Dezutter-Dambuyant C, De Saint-Vis B, Jacquet C, et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNFα. J Exp Med. 1996;184(2):695-706. Lachmann N, Ackermann M, Frenzel E, Liebhaber S, Brennig S, Happle C, et al. Large-scale hematopoietic differentiation of human induced pluripotent stem cells provides granulocytes or macrophages for cell replacement therapies. Stem Cell Reports. 2015; Hiramoto T, Ebihara Y, Mizoguchi Y, Nakamura K, Yamaguchi K, Ueno K, et al. Wnt3a stimulates maturation of impaired neutrophils developed from severe congenital neutropenia patient-derived pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(8):3023-8. Sweeney CL, Teng R, Wang H, Merling RK, Lee J, Choi U, et al. Molecular Analysis of Neutrophil Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells Delineates the Kinetics of Key Regulators of Hematopoiesis. Stem Cells. 2016;34(6):1513-26. Takata K, Kozaki T, Lee CZW, Thion MS, Otsuka M, Lim S, et al. Induced-Pluripotent-Stem-Cell-Derived Primitive Macrophages Provide a Platform for Modeling Tissue-Resident Macrophage Differentiation and Function. Immunity. 2017;47(1):183-198.e6. Cao X, Yakala GK, van den Hil FE, Cochrane A, Mummery CL, Orlova V V. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 2019;12(6):1282-97. Ackermann M, Kempf H, Hetzel M, Hesse C, Hashtchin AR, Brinkert K, et al. Bioreactor-based mass production of human iPSC-derived macrophages enables immunotherapies against bacterial airway infections. Nat Commun. 2018;9(1).

　臍帯血、骨髄血由来造血前駆細胞を用いた方法では、増殖因子を加えることで、好中球、マクロファージ等が得られるが（非特許文献１、２参照）、臍帯血、骨髄血自体の増殖が有限であり、且つロット差が大きく、均一な質の細胞を大量に準備することが困難である。

　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を用いた方法では、ＥＳ／ｉＰＳ細胞自体はほぼ無限に増殖可能であるが、分化誘導法が煩雑であり、且つ、血液細胞への誘導効率が悪く、臨床応用レベルでの大量供給は困難である（非特許文献３～７参照）。例えば報告されているヒトｉＰＳ細胞からのマクロファージ分化では、２５０ｍＬの培養系で、１０^８細胞が限度である（非特許文献８参照）。薬剤スクリーニング、細胞療法いずれの観点からも従来の技術では、細胞数が大幅に不足しており、より効率の良い誘導法の開発が必須である。

　骨髄球系の不死化細胞株としては、白血病患者から培養により低確率で樹立した細胞株は存在するが、当該細胞株は白血病変異遺伝子が恒常的に発現した細胞であり、正常分化が不可能であり、成熟細胞を用いて行う薬剤スクリーニングは不可能である。また、ガン化のリスクがあり、細胞療法のソースとしては使用できない。

　かかる事情に鑑み、本発明は、好中球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞等の細胞の安定した産生系の確立のために、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる新規な方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、造血前駆細胞から特定の骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させることで、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本願発明は以下の発明を包含する。
［１］　造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含み、
　骨髄球系前駆細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法。
［２］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［４］に記載の方法。
［６］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］　［１］～［６］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法。
［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を分化する工程を含む、ＣＭＰ系分化細胞を製造する方法。
［９］　ＣＭＰ系分化細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球である、［８］に記載の方法。
［１０］　［１］～［７］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ若しくは骨髄球系前駆細胞、又は［８］若しくは［９］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む、医薬組成物。
［１１］　［１］～［７］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ、骨髄球系前駆細胞、［８］若しくは［９］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞、又は［１０］に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
［１２］　［１］～［７］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
［１３］　［８］又は［９］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞。
［１４］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤であって、
　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、
　骨髄球系前駆細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である、増殖促進剤。
［１５］　第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞であって、骨髄球系前駆細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
［１６］　［１５］に記載のＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団全体における該ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の割合が１０％以上である、細胞集団。
［１７］　［１６］に記載の細胞集団を含む、細胞調製物。
［１８］　以下の工程を含む、マクロファージを製造する方法：
１）造血前駆細胞からマクロファージ前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程、
２）工程１で得られた細胞を培養し、増殖させる工程、
３）工程２で得られた細胞におけるＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現を抑制し、マクロファージ分化条件下で更に培養することにより、マクロファージへの分化及び成熟を促進する工程。
［１９］　工程１が、造血前駆細胞からマクロファージ前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させることを更に含む、請求項１４記載の方法。
［２０］　工程３が、工程２で得られた細胞におけるＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制することを更に含む、［１９］記載の方法。
［２１］　工程１が、造血前駆細胞からマクロファージ前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することを更に含む、［１８］～［２０］のいずれかに記載の方法。

［１Ｂ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程を含み、
　骨髄球系前駆細胞が、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞又は樹状細胞前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法。
［２Ｂ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、［１Ｂ］に記載の方法。
［３Ｂ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［４Ｂ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１Ｂ］～［３Ｂ］のいずれかに記載の方法。
［５Ｂ］　［１Ｂ］～［４Ｂ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法。
［６Ｂ］　［１Ｂ］～［５Ｂ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を分化する工程を含む、ＣＭＰ系分化細胞を製造する方法。
［７Ｂ］　ＣＭＰ系分化細胞が、マクロファージ又は樹状細胞である、［６Ｂ］に記載の方法。
［８Ｂ］　［１Ｂ］～［５Ｂ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞、又は［６Ｂ］若しくは［７Ｂ］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む、医薬組成物。
［９Ｂ］　［１Ｂ］～［５Ｂ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ、骨髄球系前駆細胞、又は［６Ｂ］若しくは［７Ｂ］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞、又は［８Ｂ］に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
［１０Ｂ］　［１Ｂ］～［５Ｂ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
［１１Ｂ］　［６Ｂ］又は［７Ｂ］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞。
［１２Ｂ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤であって、
　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、
　骨髄球系前駆細胞が、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞又は樹状細胞前駆細胞である、増殖促進剤。
［１３Ｂ］　外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞であって、骨髄球系前駆細胞が、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞又は樹状細胞前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
［１４Ｂ］　［１３Ｂ］に記載のＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団全体における該ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の割合が１０％以上である、細胞集団。
［１５Ｂ］　［１４Ｂ］に記載の細胞集団を含む、細胞調製物。

［１Ｃ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含み、
　骨髄球系前駆細胞が、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞又は赤血球前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法。
［２Ｃ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、［１Ｃ］に記載の方法。
［３Ｃ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載の方法。
［４Ｃ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、［１Ｃ］～［３Ｃ］のいずれかに記載の方法。
［５Ｃ］　［１Ｃ］～［４Ｃ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法。
［６Ｃ］　［１Ｃ］～［５Ｃ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を分化する工程を含む、ＣＭＰ系分化細胞を製造する方法。
［７Ｃ］　ＣＭＰ系分化細胞が、マクロファージ、樹状細胞又は赤血球である、［６Ｃ］に記載の方法。
［８Ｃ］　［１Ｃ］～［５Ｃ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞、又は［６Ｃ］若しくは［７Ｃ］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む、医薬組成物。
［９Ｃ］　［１Ｃ］～［５Ｃ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ、骨髄球系前駆細胞、又は［６Ｃ］若しくは［７Ｃ］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞、又は［８Ｃ］に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
［１０Ｃ］　［１Ｃ］～［５Ｃ］のいずれかに記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
［１１Ｃ］　［６Ｃ］又は［７Ｃ］に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞。
［１２Ｃ］　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤であって、
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含み、
　骨髄球系前駆細胞が、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞又は赤血球前駆細胞である、増殖促進剤。
［１３Ｃ］　第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸、及び／又は第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞であって、骨髄球系前駆細胞が、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞又は赤血球前駆細胞である、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
［１４Ｃ］　［１３Ｃ］に記載のＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団全体における該ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の割合が１０％以上である、細胞集団。
［１５Ｃ］　［１４Ｃ］に記載の細胞集団を含む、細胞調製物。

　本発明によれば、造血前駆細胞から特定の骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させることで、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させることが可能になる。

　また、本発明は、ドキシサイクリン誘導性にヒトｉＰＳ細胞由来造血前駆細胞を長期間安定増殖させることが可能であり、任意のタイミングで培地からドキシサイクリンを除去するだけで、増殖を抑制すると同時に、正常機能を有する好中球、マクロファージ、赤芽球、赤血球等を大量に準備可能である。
　本発明は様々なｉＰＳ細胞から高効率に骨髄球系の不死化細胞株に誘導可能であることから異物特異的抗原を標的としたレセプター導入したｉＰＳ細胞、標的細胞への細胞毒性を強める遺伝子改変したｉＰＳ細胞、免疫拒絶反応を抑えたＨＬＡ　ｎｕｌｌ　ｉＰＳ細胞、遺伝性疾患ｉＰＳ細胞を用いることで、より生理的であり、薬剤スクリーニング、細胞療法、双方で優位性が期待できる。

図１は、実施例１－１で用いた不死化ＣＭＰ株を樹立する方法を示す。図２は、培養１４日後にｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１の２遺伝子を導入したＣＭＰ株を、そのまま培養した株（ＭＢ）、培養２１日後にＭＢ株に更にドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を導入した株（ＭＢＸ）、培養２１日後にＭＢ株に更に持続的に発現するｓｈ　ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを感染させた株（ＭＢ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）、及び培養２１日後にＭＢＸ株に更に持続的に発現するｓｈ　ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを感染させた株（ＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）について、１４日目と３１日目と４３日目における細胞の増殖数の結果を示す。図３は、健常者由来ｉＰＳ細胞から誘導したＣＭＰ株（上列：Ｃｌｏｎｅ７－３、下列：Ｃｌｏｎｅ７－４）について、培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制して７日目に、骨髄球系の主要な３系統への終末分化を確認した結果を示す。図４は、ＭＢＸ株及びＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ株について、培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制して７日目に、マクロファージへの分化を確認した結果を示す。図５は、実施例２－１で用いたＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｓｙｓｔｅｍを示す。図６は、実施例２－１で樹立したマクロファージ株の増殖曲線を示す。図７は、実施例２－１で得た１３８３Ｄ１０由来のマクロファージ株をＣＤ１３，ＣＤ１４，ＣＤ３３，ＣＤ４３，ＨＬＡ－ＤＲで染色しＦＡＣＳで解析した結果を示す。図８上部は、実施例２－１で得た各マクロファージ株をマクロファージのマーカーであるＣＸ３ＣＲ１でｓｏｒｔｉｎｇ後、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）とする操作を示す。図８下部は、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）のマクロファージ細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図９は、実施例２－１で得た各マクロファージ株について、遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）のマクロファージ細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図１０は、実施例２－１で得た各マクロファージ株について、Ｍ１型、Ｍ２型のいずれの型であるかを検証した結果を示す。図１１は、実施例２－１で得た各マクロファージ株の培養液からドキシサイクリンを除去し、Ｄｏｘ　ｏｆｆ時にマトリゲル上で培養した細胞株をＣＤ１１ｂで染色した結果を示す。図１２は、実施例２－１で得た各マクロファージ株の貪食能を調べた結果を示す。図１３は、実施例２－１で得た各マクロファージ株のβ－ａｍｉｌｏｉｄの貪食能を調べた結果を示す。図１４は、実施例２－１で樹立した赤血球株について、細胞数をグリコフォリンＡ（Ｇｌｙ－Ａ）陽性細胞でカウントした結果を示す。図１５は、実施例３－１で用いたＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｓｙｓｔｅｍを示す。図１６は、実施例３－１で樹立したマクロファージ株の増殖曲線を示す。図１７は、実施例３－１で樹立した樹状細胞株の増殖曲線を示す。図１８上部は、実施例３－１で得た各マクロファージ株をマクロファージのマーカーであるＣＸ３ＣＲ１でｓｏｒｔｉｎｇ後、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）とする操作を示す。図１８下部は、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）のマクロファージ細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図１９は、実施例３－１で得た各マクロファージ株について、遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）のマクロファージ細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図２０は、実施例３－１で得た各マクロファージ株のβ－ａｍｉｌｏｉｄの貪食能を調べた結果を示す。図２１上部は、実施例３－１で得た各樹状細胞株を樹状細胞のマーカーであるＣＤ２０９でｓｏｒｔｉｎｇ後、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）とする操作を示す。図２１下部は、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）の樹状細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図２２は、実施例３－１で得た各樹状細胞株について、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）の樹状細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図２３は、実施例３－１で得た各樹状細胞株について、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）の樹状細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した結果を示す。図２４は、実施例３－１で樹立した赤血球株について、細胞数をＧｌｙ－Ａ陽性細胞でカウントした結果を示す。

（１）方法論１
　本実施形態に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法は、造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含み、これにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性が向上し、無限に増殖する不死化細胞株を得ることが期待できる。

　「造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程」には、造血前駆細胞は含まれない。造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程の細胞としては、ＣＭＰ及び下記に詳述する骨髄球系前駆細胞を挙げることができる。
　本明細書で使用する場合、「骨髄系共通前駆細胞」（common myeloid progenitor：ＣＭＰ）とは、マクロファージや樹状細胞等の単球系細胞、好中球や好塩基球等の顆粒球系細胞、血小板を産出する巨核球細胞、及び赤芽球細胞や赤血球等の赤血球系細胞に分化する能力を有し、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞等のリンパ球へ分化する能力を有していない前駆細胞である。
　ＣＭＰは、フローサイトメトリー解析において、例えば、ＣＤ３３^＋の細胞表面マーカー発現により特徴付けることができる。ＣＭＰは、造血前駆細胞や造血内皮細胞を、ＣＭＰ分化誘導に適した条件下で培養することにより得ることができる。例えば、造血前駆細胞又は造血内皮細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＳＣＦ及びＴＰＯを含む適切な培地中で、ＣＭＰへの分化に十分な期間培養することにより得ることができる。培養の環境としては、例えば、５％ＣＯ_２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ＣＭＰが誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、上述のＣＭＰに特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、上述のＣＭＰに特徴的な分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。ＣＭＰが誘導されるまでの培養期間は、出発細胞（造血前駆細胞、造血内皮細胞等）の種類によって異なるが分化誘導を開始してから、１～２０日後くらいにはその存在を確認することができる。

　「造血前駆細胞」とは、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^＋細胞として特徴付けられる造血系の細胞であり、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞由来の細胞であってもよく、特に、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から調製されるネット様構造物（「ＥＳ－ｓａｃ」又は「ｉＰＳ－ｓａｃ」とも称する）から得られる細胞（特に、ネット様構造物から分離した直後の細胞）が好ましい。ここで、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団等で形成され、内部に造血前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造については、例えば、WO2008/041370；WO2009/122747；Lordier et al.,Blood,112:3164-3174 2009；TAKAYAMA et al., BLOOD 2008,111:5298-5306を参照できる。

　「造血内皮細胞」とは、ＶＥ－カドヘリンを発現し、１個の細胞から血液細胞と血管内皮細胞の両方のコロニーを形成する能力（二分化能）を持つ細胞をいう。造血内皮細胞は、ＶＥ－カドヘリン陽性、ＣＤ４１陽性、ＣＸＣＲ４陽性の細胞であり得る。「造血内皮細胞」は、例えば、ＥＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞由来の細胞であってもよく、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からネット様構造物を誘導する過程で、誘導される。

　ネット様構造物をヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性幹細胞から調製するために適した細胞の培養条件は、用いる多能性幹細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子及びサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦを０～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％ＣＯ_２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、多能性幹細胞の種類や誘導条件によって異なるが、一般的には、多能性幹細胞をフィーダー細胞上に播いてから、７日後くらいまでに造血内皮細胞を含む細胞塊が形成され、１４～１６日後くらいまでに、造血前駆細胞を含むネット様構造物が形成される。
　形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。細胞塊に含まれる造血内皮細胞やネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナー等）に通すことにより、分離することができる。

　「骨髄球系前駆細胞」とは、ＣＭＰから分化した、ＣＭＰに由来する細胞であり、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞を広く意味する。ＣＭＰは、巨核球・赤芽球前駆細胞（megakaryocyte-erythrocyte progenitor：MEP）や顆粒球・マクロファージ前駆細胞（granulocyte-macrophage progenitor：GMP）に分化し得る。
　その後多段階の分化を経て、ＧＭＰからは、マクロファージ、樹状細胞、及び顆粒球が、ＭＥＰからは、巨核球、赤芽球、又は赤血球が生成される。すなわち、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞（骨髄球系前駆細胞）は、最終分化したマクロファージ、樹状細胞、顆粒球、巨核球、赤芽球、又は赤血球自体ではないものの、ＣＭＰからマクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球への分化過程における任意の細胞であればよい。骨髄球系前駆細胞としては、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞等を例示することができるが、これらに限定されない。なお、本発明においては、骨髄球系前駆細胞からは、ＭＥＰから巨核球への分化過程における巨核球の前駆細胞（多核化前のもの、ＷＯ２０１１／０３４０７３で「巨核前駆細胞」と記載しているものを含む）が除かれる。

　ＭＥＰは、造血前駆細胞、造血内皮細胞又はＣＭＰを、ＭＥＰ分化誘導に適した条件下で培養することにより得ることができる。例えば、造血前駆細胞、造血内皮細胞又はＣＭＰを、ＩＬ－３、ＳＣＦ及びＴＰＯを含む適切な培地中で、ＭＥＰへの分化に十分な期間培養することにより得ることができる。マクロファージ前駆細胞は、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰを、マクロファージ前駆細胞分化誘導に適した条件下で培養することにより得ることができる。例えば、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰを、ＩＬ－１ｂ、ＳＣＦ及びＭ－ＣＳＦを含む適切な培地中で、マクロファージ前駆細胞への分化に十分な期間培養することにより得ることができる。樹状細胞前駆細胞は、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰを、樹状細胞前駆細胞分化誘導に適した条件下で培養することにより得ることができる。例えば、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰを、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦを含む適切な培地中で、樹状細胞前駆細胞への分化に十分な期間培養することにより得ることができる。好中球前駆細胞は、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰを、好中球前駆細胞分化誘導に適した条件下で培養することにより得ることができる。例えば、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰを、ＳＣＦ及びＧＭ－ＣＳＦを含む適切な培地中で、好中球前駆細胞への分化に十分な期間培養することにより得ることができる。赤血球前駆細胞は、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰ又はＭＥＰを、赤血球前駆細胞分化誘導に適した条件下で培養することにより得ることができる。例えば、造血前駆細胞、造血内皮細胞、ＣＭＰ又はＭＥＰを、ＳＣＦ及びＥＰＯを含む適切な培地中で、赤血球前駆細胞への分化に十分な期間培養することにより得ることができる。培養の環境としては、例えば、５％ＣＯ_２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。各骨髄球系前駆細胞が誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、下述の各骨髄球系前駆細胞に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、各骨髄球系前駆細胞に特徴的な分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。ＣＭＰが誘導されるまでの培養期間は、出発細胞（造血前駆細胞、造血内皮細胞等）の種類によって異なるが、分化誘導を開始してから、７～１４日後くらいにはその存在を確認することができる。

　ＣＭＰ、ＭＥＰは、フローサイトメトリー解析において、以下の細胞表面マーカー発現パターンにより特徴付けられ得る。
ＣＭＰ：Ｌｉｎ^－／ＣＤ３３^＋
ＭＥＰ：ＣＤ４１^＋　又はＣＤ４１^＋Ｇｌｙ－Ａ^＋

　その他の骨髄球系前駆細胞は、フローサイトメトリー解析において、例えば、以下の細胞表面マーカーの少なくとも１つ、好ましくは２以上を発現することにより特徴付けられ得る。
マクロファージ前駆細胞：ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ８６
樹状細胞前駆細胞：ＣＤ２０９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３０３、ＣＤ８０、ＣＤ８６
赤血球前駆細胞：Ｇｌｙ－Ａ、ＣＤ７１
好中球前駆細胞：ＣＤ１５、ＣＤ１６

　本発明者らは、多能性幹細胞から誘導した多核化前の巨核球（ＷＯ２０１１／０３４０７３中で「巨核前駆細胞」と記載しているものを含む）中でＭＹＣ等の癌遺伝子とＢＭＩ１等の遺伝子を強制発現させ、該巨核球の増殖能を高めることについて報告をしているが（ＷＯ２０１１／０３４０７３、JEM, 207:2817-2830 2010）、本発明は、この方法論が、巨核球のみならず、造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞に適用可能であり、その増殖能を高め得ることを見出したことに基づく。

　本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現」とは、対象の遺伝子をコードするＤＮＡがｍＲＮＡへ転写されること、及び／又はｍＲＮＡがタンパク質へ翻訳されることを意味する。ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。なお、強制発現後に、細胞を継代培養してもよく、最後の継代から強制発現を解除する日までの期間も特に限定されないが、例えば、１日間、２日間又は３日間以上としてもよい。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖を維持する場合には、培養期間中、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現を維持することが好ましい。

　ＭＹＣファミリー遺伝子は、生体内において細胞の癌化を誘導する遺伝子である。ＭＹＣファミリー遺伝子としては、例えば、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ遺伝子が挙げられる。これらの中でもｃ－ＭＹＣが好ましい。

　ＢＭＩ遣伝子は、ＣＤＫＮ２ａ（ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ）遺伝子を負に制御し、細胞老化を回避するために機能する遺伝子である（小倉ら，　再生医療，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．４，ｐｐ２６－３２；Ｊｓｅｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｓｅｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．７，ｐｐ６６７－６７７，２００６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ２１１－２１６，２００３）。

　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法においては、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を抽出（単離又は精製）する工程をさらに含んでいてもよい。特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）の抽出は、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる前に行っても後に行ってもよい。一態様において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる前にこの抽出工程を行い、抽出した特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる。別の態様において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させた、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を含む細胞集団を調製し、その後該細胞集団から、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を抽出する。この抽出した特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を引き続き強制発現させてもよい。目的とする細胞を抽出し、抽出された細胞に対して、本発明の方法を適用することにより、或いは本発明の方法を適用した細胞集団から、目的とする細胞を抽出して、該細胞を継続して培養することにより、目的の細胞種を効率よく増殖させることができる。抽出する細胞は、抽出した細胞種の増殖性を効率的に向上させる観点から、ＣＭＰの細胞株のみとすることや、骨髄球系前駆細胞の単一種の細胞株のみとすることが好ましいが、これらの２種以上の細胞が混合した細胞集団としてもよい。
　抽出する細胞としては、例えば、ＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞等を挙げることができる。目的とする細胞の抽出は、該細胞に特異的に発現している（又は発現していない）細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、フローサイトメトリー、パニング、磁気ビーズ等の当業者に周知の方法により行うことができる。ＣＭＰ、ＭＥＰの単離は、上述の細胞表面マーカー発現パターンを満足する細胞を単離することにより行うことができる。マクロファージ前駆細胞を抽出する場合、例えば、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３及びＣＤ８６からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカー（好ましくは、ＣＸ３ＣＲ１）が陽性の細胞を単離する。樹状細胞前駆細胞を抽出する場合、例えば、ＣＤ２０９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３０３、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカー（好ましくは、ＣＤ２０９）が陽性の細胞を単離する。赤血球前駆細胞を抽出する場合、例えば、Ｇｌｙ－Ａ及びＣＤ７１からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカー（好ましくは、Ｇｌｙ－Ａ）が陽性の細胞を単離する。好中球前駆細胞を抽出する場合、例えば、ＣＤ１５及びＣＤ１６からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーが陽性の細胞を単離する。
　抽出操作後の細胞集団に含まれる目的とする細胞の割合が、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）となるように、目的とする細胞の単離を行うことができる。目的とする細胞のシングルセルを単離してもよい。

　本発明に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含んでいてもよい。ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子に加えて、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を発現させることにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖の更なる促進が期待できる。ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の上記強制発現の期間は当業者が適宜決定することができる。

　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する遣伝子である。

　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及び／又はＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子を強制発現させ、続いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させて、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得てもよい。また、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同時に強制発現させて、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得ることもできる。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖を維持する場合には、培養期間中、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子に加えてＢＣＬ－ＸＬの強制発現を維持することが好ましい。

　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の細胞増殖を促進するが、ＣＭＰ系分化細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、好中球、赤血球）の終末分化を阻害し得るために、終末分化工程に入る前にこれら遺伝子の発現を抑制してもよい。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内のこれら遺伝子発現を抑制することにより、機能的でより成熟したＣＭＰ系分化細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、好中球、赤血球）が誘導されやすくなる。

　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の遺伝子を細胞内で強制発現させる場合、当業者において周知のいかなる方法により実施してもよいが、例えば、遺伝子を、レンチウイルスやレトロウイルス等のウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクター等の非ウイルスベクターによる遺伝子導入システムを利用して、細胞内に導入し、発現させてもよい。トランスポゾンを用いて非ウイルス的に、目的遺伝子を細胞のゲノムに組み込み，安定発現細胞株を樹立した後に、不要となった導入遺伝子をトランスポゾネースにより除去する方法（例、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステム）を用いることもまた好ましい。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞に、所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現ベクター（例、ウイルスベクター）をトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞からＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を誘導し、その段階で当該遺伝子を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞において、当該遺伝子を強制発現させながら、該多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血内皮細胞から、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞への分化を誘導してもよい。遺伝子導入ベクターにより遺伝子発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を作用可能に連結し、これを遺伝子導入ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的遺伝子を発現させてもよい。該プロモーターは外来性プロモーターであり得る。本明細書中、遺伝子の「内在性」プロモーターとは、ゲノム中における該遺伝子と自然な状態で連結されているプロモーターを意味し、遺伝子の「外来性」プロモーターとは、遺伝操作（すなわち分子生物学的技法）によって、人為的に該遺伝子の近位に、該遺伝子の転写が、作用可能に連結されているプロモーターによって指示されるように配置されているものを意味する。ここで、「作用可能」に連結するとは、該プロモーターによって目的遺伝子がシスに支配され、目的遺伝子の所望の発現が実現されるようにプロモーターと目的遺伝子を連結することを意味する。外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得る。恒常的プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキチンプロモーター等を挙げることができる。調節性プロモーターとは、誘導可能又は抑制解除可能なプロモーターを意味し、リプレッサー又はインデューサーのいずれか一方と結合することのできる、プロモーターと共に働くＤＮＡ配列を有するプロモーターを指す。プロモーターが誘導されるか或いは抑制解除されると「オンの状態」になり、プロモーターが誘導されないか或いは抑制解除されていない状態では、プロモーターは「オフの状態」となる。調節性プロモーターの例としては、テトラサイクリン反応性プロモーター、ステロイド反応性プロモーター、メタロチオネインプロモーター等の薬剤反応性プロモーターを挙げることができる。テトラサイクリン反応性プロモーターとは、テトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ））の存在又は非存在によって可逆的に制御される、既知の調節性プロモーターである。テトラサイクリン反応性プロモーターは、内部にテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）が配置されたプロモーターであり、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）タンパク質又はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）のＴＲＥへの結合により、活性化される（即ち、目的タンパク質の発現を誘導する）プロモーターである。ｒｔＴＡタンパク質はＤｏｘ存在下でＴＲＥに結合し、一方ｔＴＡタンパク質はＤｏｘ非存在下でＴＲＥに結合して、ＴＲＥ配列の下流のプロモーターと機能的に連結された目的遺伝子の発現を誘導する。テトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された該遺伝子と、ｒｔＴＡ又はｔＴＡタンパク質とが導入された細胞を、Ｄｏｘ存在下で培養することにより、Ｄｏｘ依存的に該遺伝子の発現を誘導又は抑制することができる。外来性プロモーターは、好ましくは調節性プロモーターである。調節性プロモーターを用いることにより、例えば、薬剤添加等の制御により目的遺伝子を誘導的に発現させることもできる。このような薬剤による遺伝子発現システムは、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の所望の発現制御を実現するために、当業者において、適当なシステムを容易に選択することができる。このような発現を行うために、市販のキット等を使用してもよい。また、発現制御の目的遺伝子であるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、それぞれ別々のベクターに挿入してもよいし、同一のベクターに挿入してもよい。

　細胞内におけるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の発現の抑制は、例えば、前述の調節性プロモーターを用いた薬剤誘導的な発現システムによる発現の誘導を、薬剤等の除去により解除することで達成してもよい。或いは、導入したＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等をＣｒｅ／ｌｏｘシステム等を使用して除去し、これらの遺伝子の発現を抑制的に制御してもよい。ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の発現を抑制的に調節するために、市販のキット等を適宜使用することもできる。

　上記各遺伝子の強制発現及びその解除のためにＴｅｔ－ｏｎ（登録商標）又はＴｅｔ－ｏｆｆ（登録商標）システムのような市販の薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いてもよい。この場合、強制発現させる工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制してもよい。

　遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、国際公開第２０１１／０３４０７３号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８０２３号、国際公開第２０１２／１５７５８６号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１４／０１２７８１５号、国際公開第２０１４／１２３２４２号及び米国特許出願公開第２０１６／０００２５９９号、又はＮａｋａｍｕｒａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　１４，　５３５－５４８，　２０１４に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。

　本発明に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含んでいてもよい。ここで、発現とは、転写及び翻訳を含む概念で用いられ、発現を阻害するという場合、転写レベルで阻害することも翻訳レベルで阻害することも含みうる。本発明の方法において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖の更なる向上が期待できる。

　ＣＤＫＮ１Ａ（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１Ａ）遺伝子は細胞周期の阻害因子ｐ２１をコードしており、癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の下流遺伝子としても知られている。活性化したｐ５３タンパク質は転写因子として働き、ｐ５３下流遺伝子群の発現を増加させる。そのため、本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する」とは、対象の遺伝子の発現やその発現産物（例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の場合にはｐ２１）の機能を直接抑制することによって達成してもよいし、対象の遺伝子の上流にある遺伝子の発現やそれらの発現産物の機能を制御することで達成することもできる。ただし、本明細書においては、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する場合、その対象となるＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の上流遺伝子の中に、ｐ５３遺伝子、更にはｐ５３遺伝子の上流にある別の癌抑制遺伝子であるＩＮＫ４Ａ遺伝子及びＡＲＦ遺伝子は含まれない。

　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のみならず、ｐ５３遺伝子の発現、或いはそれらの発現産物の機能を抑制することが好ましい。

　上記各遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、既知の方法により行うことができ、例えば、各遺伝子の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸（「発現抑制核酸」という。）、又はこれらの発現抑制核酸を発現し得る発現ベクター等の、種々の分子を細胞に導入することにより行うことができる。或いは、それ以外の技術、例えばゲノム編集技術等を利用し、遺伝子をノックダウンしてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを利用して遺伝子をノックダウンする場合、その遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと、ｄＣａｓのような不活化Ｃａｓとリプレッサードメインの融合タンパク質等が用いられる。

　ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる２本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの長さは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常１９～３０塩基程度、好ましくは２１塩基～２５塩基程度である。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列は、発現が抑制される遺伝子の配列情報により当業者が適宜設計することができる。ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡを使用することもできる。

　アンチセンス核酸とは、標的ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、かつハイブリダイズした状態で標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸を意味する。アンチセンス核酸は、一般的には１０塩基長～１００塩基長、好ましくは１５塩基長～３０塩基長の一本鎖核酸である。アンチセンス核酸の種類は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいし、或いはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。アンチセンス核酸のヌクレオチド配列は、発現が抑制される遺伝子の配列情報により当業者が適宜設計することができる。

　上記の技術に加え、各遺伝子の発現を抑制することが知られている化合物を使用することもできる。例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制する化合物として、ＵＣ２２８８、ブチロラクトンＩ、ＬＬＷ１０、ソラフェニブ、ステリグマトシスチン等のｐ２１阻害剤が知られている。また、ｐ５３阻害剤としては、ピフィスリンα、ナトリン－３、ＲｅＡＣｐ５３、ＲＧ７３８８等が知られている。

　或いは、遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制のために、公知の技術を用いて対象の遺伝子をノックアウトしてもよい。遺伝子のノックアウトとは、遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように破壊又は変異されていることを意味する。遺伝子は、ゲノム上の一つの対立遺伝子が機能しないように破壊又は変異されていてもよい。また、複数の対立遺伝子が破壊又は変異されていてもよい。ノックアウトは、既知の方法により行うことができ、例えば、標的遺伝子との間で遺伝的組換えが起こるように作られたＤＮＡコンストラクトを細胞に導入することによりノックアウトする方法や、ＴＡＬＥＮやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム等のゲノム編集技術を利用して、塩基の挿入、欠失、置換導入によりノックアウトする方法が挙げられる。

　その他、各遺伝子の転写及び転写産物を抑制する化合物、又は産生されたタンパクの標的タンパクとの結合阻害剤（ｐ５３結合阻害：ピフィスリンα、ナトリン－３、ＲｅＡＣｐ５３、ＲＧ７３８８等；ｐ２１結合阻害：ＵＣ２２８８、ブチロラクトンＩ、ＬＬＷ１０、ソラフェニブ、ステリグマトシスチン等）等を使用してもよい。

　遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、上述の方法により行うことができる。

　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現の抑制は、好ましくは、各遺伝子に対する発現抑制核酸を発現する発現ベクターを細胞に導入することにより行う。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子等の遺伝子に対する発現抑制核酸を細胞内で強制発現させる場合、当業者において周知のいかなる方法により実施してもよいが、例えば、該発現抑制核酸をコードする核酸を、レンチウイルスやレトロウイルス等のウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクター等の非ウイルスベクターによる遺伝子導入システムを利用して、細胞内に導入し、発現させてもよい。トランスポゾンを用いて非ウイルス的に、発現抑制核酸をコードする核酸を細胞のゲノムに組み込み、発現抑制核酸の安定発現細胞株を樹立した後に、不要となった導入核酸をトランスポゾネースにより除去する方法（例、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステム）を用いることもまた好ましい。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞に、所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現ベクター（例、ウイルスベクター）をトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞からＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を誘導し、その段階で当該ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンス核酸を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞において、当該発現抑制核酸を強制発現させながら、該多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血内皮細胞から、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞への分化を誘導してもよい。発現ベクターを用いて細胞内で発現抑制核酸の発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該発現抑制核酸をコードする核酸（例、ＤＮＡ）を作用可能に連結し、これを発現ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的とする発現抑制核酸を発現させてもよい。該プロモーターは外来性プロモーターであり得る。外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは恒常的プロモーターである。恒常的プロモーターの例としては、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ等の比較的小さいＲＮＡを発現する場合、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ　ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ　ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ　ＲＮＡプロモーター等のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いることが好ましい。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸と、ｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、それぞれ別々の発現ベクターに挿入してもよいし、同一の発現ベクターに挿入してもよい。

　本局面において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制は、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、又はＢＣＬ－ＸＬ遺伝子のいずれかの強制発現と同時であってもよい。好ましくはＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時か、或いはその後である。例えば細胞増殖の低下が確認された後に実施することができる。一例として、ある時点の細胞増殖率を直近の細胞増殖率と比較し（例えば、一週間ごとに細胞の増殖を確認したとして、ある週の細胞増殖率をその一週間前の増殖率と比較して）、増殖率が１／２以下になった状態が確認された後に実施することができる。細胞増殖の低下は、限定することを意図するものではないが、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現直後から約３０日後、約４０日後、約５０日後、約６０日後、約７０日後、約８０日後、又は約９０日後まで見られる。一態様において、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させ、これと並行して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。一態様において、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させ、これと並行して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。

　本明細書で使用する場合のＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子等の各遺伝子は、それらの公知の核酸配列、例えばｃＤＮＡ配列でコードされるものを意味する。各遺伝子には、公知の核酸配列の相同性に基づいて同定されるホモログも含まれ得る。「ホモログ」とは、遺伝子のｃＤＮＡ配列が、その遺伝子の核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。

　ＭＹＣファミリー遺伝子のうち、ｃ－ＭＹＣ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号１で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。或いは、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号１で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。

　ＢＭＩ１遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号２で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号２で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。或いは、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号２で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。

　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号３で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号３で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。或いは、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号３で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。

　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号４で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号４で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。或いは、配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号４で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。

　ｐ５３遺伝子とは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号５で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号５で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号５で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号５で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。或いは、配列番号５で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号５で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。

　ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーションの条件のことであり、一般的に核酸の塩基長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、塩基が長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、塩基が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。

　具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃～４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄すること等が上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄すること等が挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。

　本実施形態に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法は、上述した本実施形態に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程（培養工程）を含む。

　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の培養条件は、細胞の種類やその状態に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、培養温度は約３５℃～約４２℃、約３６℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃とすることができ、二酸化炭素濃度は例えば５％ＣＯ_２、酸素濃度は例えば２０％０_２とすることができる。静置培養であっても、振とう培養であってもよい。振とう培養の場合の振とう速度も特に限定されず、例えば、１０ｒｐｍ～２００ｒｐｍ、３０ｒｐｍ～１５０ｒｐｍ等とすることができる。

　培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地であってもよい。この場合、ＩＭＤＭ培地はさらにＳＣＦを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。さらに、ホルボールエステル（例えば、ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート；ＰＭＡ）を加えてもよい。

　細胞の培養工程は、フィーダー細胞の存在下又は不在下で実施することができる。本明細書において、「フィーダー細胞」とは、増殖又は分化させようとしている標的細胞の培養に必要な環境を整えるために、標的細胞と共培養される細胞をいう。フィーダー細胞は、標的細胞と識別できる細胞である限り、同種由来の細胞であっても異種由来の細胞であってもよい。フィーダー細胞は、抗生物質やガンマ線により増殖しないよう処理した細胞であっても、処理されていない細胞であってもよい。

　培地は、血清又は血漿を含有していてもよく、或いは無血清でもよい。血清を用いる場合は、ヒト血清が好ましい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカイン等の１つ以上の物質も含有してもよい。サイトカインとしては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、ＩＴＳ（インスリンートランスフェリンーセレナイト）サプリメント、ＡＤＡＭ（Ａ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤等が挙げられる。

　培養するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の種類に応じ、細胞増殖に適したサイトカインの生み合わせを、培地に添加することが好ましい。例えば、ＣＭＰを培養する場合、ＣＭＰの増殖を促進するのに十分な量のＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＳＣＦ及びＴＰＯから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。ＭＥＰを培養する場合、ＩＬ－３、ＳＣＦ及びＴＰＯから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。ＧＭＰを培養する場合、ＳＣＦ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。マクロファージ前駆細胞を培養する場合、ＩＬ－１ｂ、ＳＣＦ及びＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。樹状細胞前駆細胞を培養する場合、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。好中球前駆細胞を培養する場合、ＳＣＦ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。赤血球前駆細胞を培養する場合、ＳＣＦ及びＥＰＯから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。

　本発明は、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（以下、本発明の細胞）を提供する。ＭＹＣファミリー遺伝子は、好ましくはｃ－ＭＹＣである。骨髄球系前駆細胞としては、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞等を例示することができる。第１の外来性プロモーター及び第２の外来性プロモーターは、独立して、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、調節性プロモーターである。調節性プロモーターは、好ましくは薬剤反応性プロモーターであり、より好ましくは、テトラサイクリン反応性プロモーターである。第１の外来性プロモーターと第２の外来性プロモーターの種類は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一の種類のプロモーターである。同一の種類のプロモーターを用いることにより、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子を同期的に発現させることができ、また同期的に発現を抑制することができる。第１の外来性プロモーターと第２の外来性プロモーターは、好ましくは、同一の調節性プロモーター（例、薬剤反応性プロモーター）であり、より好ましくは共にテトラサイクリン反応性プロモーターである。第１の外来性プロモーターと第２の外来性プロモーターとは、それぞれ独立して、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子と作用可能に連結されていてもよいし、１つの外来性プロモーターに、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とが作用可能に連結されていてもよい。この場合、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とは、ＩＲＥＳ等の介在配列を介して連結されることにより、１つの外来性プロモーターの制御下で、バイシストロニックな発現が可能となる。第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン依存的な発現制御を可能とするため、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有することが好ましい。第３の外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　本発明の細胞は、該細胞をＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞が増殖し得る条件下で培養した場合に、インビトロでＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖を促進し得る量のＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子を発現する。インビトロでＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖を促進し得る量のＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子とは、当該量のＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を発現するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖速度が、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を発現していないことを除いては上記細胞と同様に作成したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞と比較して、有意に上昇するようなＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の量を意味する。

　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞は、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を更に有していてもよい。該細胞を第４の外来性プロモーターが作動する条件下で培養すると、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が発現し、本発明の細胞の増殖が更に促進されることが期待できる。第４の外来性プロモーターは、独立して、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、調節性プロモーターである。調節性プロモーターは、好ましくは薬剤反応性プロモーターであり、より好ましくは、テトラサイクリン反応性プロモーターである。第４の外来性プロモーターの種類は、第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、同一の種類のプロモーターである。同一の種類のプロモーターを用いることにより、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同期的に発現させることができ、また同期的に発現を抑制することができる。第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、好ましくは、同一の調節性プロモーター（例、薬剤反応性プロモーター）であり、より好ましくは全てテトラサイクリン反応性プロモーターである。第４の外来性プロモーターは、第１及び第２の外来性プロモーターと独立して、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子と作用可能に連結されていてもよいし、第１の外来性プロモーターにＭＹＣファミリー遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子とが作用可能に連結されていてもよいし、第２の外来性プロモーターにＢＭＩ１遺伝子と・BR>AＣＬ－ＸＬ遺伝子とが作用可能に連結されていてもよいし、１つの外来性プロモーターに、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が作用可能に連結されていてもよい。複数の遺伝子をＲＥＳ等の介在配列を介して連結することにより、１つの外来性プロモーターの制御下で、バイシストロニックな発現が可能となる。第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞は、第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸（例、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸）をコードする核酸、及び／又は第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸を更に有していてもよい。該細胞を第５の外来性プロモーター、及び／又は第６の外来性プロモーターが作動する条件下で培養すると、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸、及び／又はｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸が発現し、本発明の細胞の増殖が更に促進されることが期待できる。第５の外来性プロモーター及び第６の外来性プロモーターは、独立して、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。恒常的プロモーターは、好ましくは、Ｈ１プロモーター等のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターである。第５の外来性プロモーターの種類は、第６の外来性プロモーターと同一であっても異なっていてもよい。第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよいが、好ましくは、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　一態様において、本発明の細胞は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、及び
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞）である。第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　一態様において、本発明の細胞は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸
を有するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞）である。第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　一態様において、本発明の細胞は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸
を有するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞）である。第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　本発明の細胞は、上述した本発明のＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法、又はＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法により得ることができる。

　また、本発明は、上記本発明の細胞を含む細胞集団（本発明の細胞集団という。）を提供する。該細胞集団は、上記本発明の細胞を豊富に含み、該細胞集団全体に含まれる本発明の細胞の割合は、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このような本発明の細胞を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法を適用した細胞集団から、目的とする特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＭＥＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞、好中球前駆細胞））を、抽出することにより得ることができる。好ましい態様において、本発明の細胞集団は、特定の分化段階にある本発明の細胞を豊富に含む。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞はＣＭＰである）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞はＭＥＰである）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞はＧＭＰである）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞はマクロファージ前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は樹状細胞前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は赤血球前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は好中球前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このように特定の分化段階にある本発明の細胞を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法の方法を適用した細胞集団から、目的とする分化段階の細胞を、該分化段階の細胞に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター等で単離・抽出することにより得ることができる。

　本発明の細胞、及び本発明の細胞集団は、上述した本発明のＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法、又はＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法により得ることができる。

　また、本発明は、上記本発明の細胞集団を含む細胞調製物（本発明の細胞調製物という。）を提供する。本発明の細胞調製物は、上記本発明の細胞集団を、適切な生理的水溶液（例、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、液体培地）で懸濁することにより調整することができる。該生理的水溶液には、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム等）等を配合してもよい。該細胞調製物中には、細胞濃度が、例えば１．０×１０^１～１．０×１０^１２細胞／ｍＬとなるように、上記本発明の細胞集団を懸濁する。

　細胞調製物中に含まれるＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の種類に応じ、該細胞の増殖に適したサイトカインの生み合わせを、該細胞調製物に添加してもよい。例えば、ＣＭＰを含む細胞調製物の場合、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＳＣＦ及びＴＰＯから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを該細胞調製物に添加することができる。ＭＥＰを含む細胞調製物の場合、ＩＬ－３、ＳＣＦ及びＴＰＯから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを該細胞調製物に添加することができる。ＧＭＰを含む細胞調製物の場合、ＳＣＦ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを該細胞調製物に添加することができる。マクロファージ前駆細胞を含む該胞調製物の場合、ＩＬ－１ｂ、ＳＣＦ及びＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを該細胞調製物に添加することができる。樹状細胞前駆細胞を含む細胞調製物の場合、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを培地に添加することができる。好中球前駆細胞を含む細胞調製物の場合、ＳＣＦ及びＧＭ－ＣＳＦから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを該細胞調製物に添加することができる。赤血球前駆細胞を含む細胞調製物の場合、ＳＣＦ及びＥＰＯから選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのサイトカインを該細胞調製物に添加することができる。

　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞は、凍結保存後解凍しても、細胞増殖能及び分化能を維持する凍結解凍耐性を有し得る。そのため、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を凍結保存して、必要に応じて溶解して、分化誘導培養に付すことにより、ＣＭＰ系分化細胞を製造することが可能である。従って、上記本発明の細胞を用いることにより、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞からＣＭＰ系分化細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、赤血球、好中球等を製造する一連の作業を始めの工程から行う必要がなくなる。つまり、本発明の細胞を原料として、多量に調製し、必要に応じて凍結保存をしておくことにより、製造プロセスの合理化・効率化が図られ、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、好中球等の様々なＣＭＰ系分化細胞を迅速に供給可能な仕組みを構築することができる。したがって、一態様において、本発明の細胞調製物は、凍結した上記本発明の細胞集団を含む凍結細胞調製物である。本発明の細胞を用いて、凍結細胞調製物を作製する場合には、上記本発明の細胞集団と、凍結保存液とから構成することができ、その他必要に応じて添加剤等も組成中に含めることができる。凍結保存液としては、ＤＭＳＯ入りの凍結液等を利用できる。具体的にはセルバンカー（日本全薬工業株式会社）やバンバンカー（日本ジェネティクス株式会社）、ＴＣプロテクター（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、アルブミン加ｃｐ－１（極東製薬工業株式会社）等である。

　本実施形態に係るＣＭＰ系分化細胞を製造する方法は、上述したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法又はＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（すなわち、本発明の細胞）を分化させる工程を含む。ＣＭＰ系分化細胞は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞から分化した、マクロファージや樹状細胞等の単球系細胞、好中球や好塩基球等の顆粒球系細胞、赤芽球細胞や赤血球等であり、骨髄球系前駆細胞とは区別される。

　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を分化する方法としては、マクロファージや樹状細胞等の単球系細胞、好中球や好塩基球等の顆粒球系細胞、赤芽球細胞や赤血球への公知の分化誘導方法を、上記で培養する方法も含め適宜選択することができる。例えば、各遺伝子を強制発現させる工程において用いた薬剤、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制した後、引き続き細胞を培養すればよい。

　ＣＭＰ系分化細胞は、単球系細胞、顆粒球系細胞、又は赤芽球細胞を含んでもよく、単球系細胞又は顆粒球系細胞を含んでもよい。このように、ＣＭＰを特定の細胞に分化させるよう制御する方法は、好適な公知の培地やそれに準ずる培地を適宜使用することができる。例えば、本実施形態に係るＣＭＰ系分化細胞を製造する方法においては、培地に含まれるサイトカイン条件を制御することにより、分化する細胞の種類を制御することができる。具体的には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及びインターロイキン３（ＩＬ３）のサイトカインを用いて培養することにより、単球系細胞、顆粒球系細胞、又は赤芽球細胞を含むＣＭＰ系分化細胞を得ることができる。また、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及びインターロイキン３（ＩＬ３）のサイトカインを用いることにより、単球系細胞又は顆粒球系細胞を含むＣＭＰ系分化細胞を得ることができる。具体的には、各種細胞に分化するためのサイトカイン条件として、実施例に示すものが挙げられる。

　例えば、薬剤（例、テトラサイクリン、ドキシサイクリン）反応性プロモーター制御下で、当該薬剤の添加により、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）を強制発現させ、任意的にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制したマクロファージ前駆細胞を、マクロファージ分化条件下（例、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ｂ存在下）で培養すると、マクロファージ前駆細胞は、その分化段階を維持したまま良好に増殖するが、該薬剤の除去により該細胞におけるＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の強制発現を抑制した後、引き続きマクロファージ分化条件下（例、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ｂ存在下）で培養することにより、細胞増殖が抑制され、マクロファージへの分化、成熟が促進される。薬剤（テトラサイクリン、ドキシサイクリン）反応性プロモーター制御下で、当該薬剤の添加により、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）を強制発現させ、任意的にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制した樹状細胞前駆細胞を、樹状細胞分化条件下（例、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ存在下）で培養すると、樹状細胞前駆細胞は、その分化段階を維持したまま良好に増殖するが、該薬剤の除去により該細胞におけるＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の強制発現を抑制した後、引き続き樹状細胞分化条件下（例、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ存在下）で培養することにより、細胞増殖が抑制され、樹状細胞への分化、成熟が促進される。薬剤（テトラサイクリン、ドキシサイクリン）反応性プロモーター制御下で、当該薬剤の添加により、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）を強制発現させ、任意的にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制した赤血球前駆細胞を、赤血球分化条件下（例、ＳＣＦ、ＥＰＯ存在下）で培養すると、赤血球前駆細胞は、その分化段階を維持したまま良好に増殖するが、該薬剤の除去により該細胞におけるＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の強制発現を抑制した後、引き続き赤血球分化条件下（例、ＳＣＦ、ＥＰＯ存在下）で培養することにより、細胞増殖が抑制され、赤芽球や赤血球への分化、成熟が促進される。

　本実施形態に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤は、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、任意に、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、或いはＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む。また、骨髄球系前駆細胞は、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である。

　本実施形態に係る医薬組成物は、上述したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法又はＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞、或いは上述したＣＭＰ系分化細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む。

　上述したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法又はＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞、或いは上述したＣＭＰ系分化細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ系分化細胞は、自然免疫系を司る細胞であり、腫瘍・変性細胞、病原性生物の除去に役立たせることができる。したがって、本実施形態に係る医薬組成物は、腫瘍・変性細胞、感染性病原生物の除去等のために用いられ得る。具体的には、正常体内における異物特異的抗原を標的としたレセプター導入や、標的細胞への細胞毒性を強める遺伝子改変を行うことで、疾患毎に特化した輸血用免疫細胞製剤として使用される。また、免疫製剤、抗がん剤、抗アレルギー製剤、抗動脈硬化用の医薬組成物として使用される。上述したＣＭＰ、骨髄球系前駆細胞又はＣＭＰ系分化細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合する等して注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）等の注射用の水性液を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム等）等と配合しても良い。本発明の医薬組成物を水性懸濁液剤として製剤化する場合、例えば、上記水性液に約１．０×１０^２～約１．０×１０^１２細胞／ｍＬとなるように、上述したＣＭＰ、骨髄球系前駆細胞又はＣＭＰ系分化細胞を懸濁すればよい。

　本実施形態に係る疾患の治療又は予防方法は、上述したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法又はＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞、或いは上述したＣＭＰ系分化細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ系分化細胞、或いは本実施形態に係る医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。疾患としては、特に限定されないが、腫瘍・変性細胞、感染性病原生物に関する疾患や、炎症・アレルギー性疾患（自己免疫疾患、動脈硬化等の慢性炎症性疾患）等が挙げられる。投与方法は特に限定されないが、好ましくは注射であり、静脈内投与、腹腔内投与等が挙げられる。本発明の剤の投与量は、投与対象、治療標的部位、症状、投与方法等により差異はあるが、通常、患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば、静脈内投与の場合、１回につきヒトミエロイド系血液細胞の量として約１．０×１０^６～約１．０×１０^１１細胞を、１週間に約２～３回、約２～３週間以上投与することができる。

　本実施形態に係るキットは、上述したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤を含み、腫瘍・変性細胞、感染性病原生物に関する疾患や、炎症・アレルギー性疾患（自己免疫疾患、動脈硬化等の慢性炎症性疾患）の診断に用いられる。

　キットは、その用途に応じて試薬や、担体や添加物を含んでいてもよく、更には緩衝液、容器、使用説明書等を含んでいてもよい。具体的なキットの形態としては、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤を含み、炎症・アレルギー性疾患（自己免疫疾患、動脈硬化等の慢性炎症性疾患）の主要な原因細胞である好中球、マクロファージ、樹状細胞等の特定の細胞種に用いられる疾患診断チップが挙げられる。

（２）方法論２
　更なる局面において、本発明は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法（以下、「本発明の方法２」という。）を提供する。骨髄球系前駆細胞は、好ましくは、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞又は樹状細胞前駆細胞である。ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させることにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性が向上し、無限に増殖する不死化細胞株を得ることが期待できる。

　本発明の方法２においては、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を抽出（単離又は精製）する工程をさらに含んでいてもよい。特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）の抽出は、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる前に行っても後に行ってもよい。一態様において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる前にこの抽出工程を行い、抽出した特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる。別の態様において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させた、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を含む細胞集団を調製し、その後該細胞集団から、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を抽出する。この抽出した特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を引き続き強制発現させてもよい。目的とする細胞を抽出し、抽出された細胞に対して、本発明の方法を適用することにより、或いは本発明の方法を適用した細胞集団から、目的とする細胞を抽出して、該細胞を継続して培養することにより、目的の細胞種を効率よく増殖させることができる。抽出する細胞は、抽出した細胞種の増殖性を効率的に向上させる観点から、ＣＭＰの細胞株のみとすることや、骨髄球系前駆細胞の単一種の細胞株のみとすることが好ましいが、これらの２種以上の細胞が混合した細胞集団としてもよい。抽出する細胞は、好ましくは、ＣＭＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞又は樹状細胞前駆細胞である。目的とする細胞の抽出は、方法論１に記載した方法に従って行うことができる。抽出操作後の細胞集団に含まれる目的とする細胞の割合が、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）となるように、目的とする細胞の単離を行うことができる。目的とする細胞のシングルセルを単離してもよい。

　本発明の方法２は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程をさらに含んでいてもよい。ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子に加えて、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子を発現させることにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖の更なる促進が期待できる。ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現の期間は当業者が適宜決定することができる。

　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子を強制発現させ、続いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させて、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得てもよい。また、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同時に強制発現させて、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得ることもできる。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖を維持する場合には、培養期間中、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を維持することが好ましい。

　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の遺伝子は、方法論１に記載した方法に準じて細胞内で強制発現させることができる。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞に、所望の遺伝子（例、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、任意的に更にＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子）の発現ベクターをトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、任意的に更にＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子）の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞からＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を誘導し、その段階で当該遺伝子を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、任意的に更にＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子）の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞において、当該遺伝子を強制発現させながら、該多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血内皮細胞から、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞への分化を誘導してもよい。発現制御の目的遺伝子であるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、それぞれ別々のベクターに挿入してもよいし、同一のベクターに挿入してもよい。

　細胞内におけるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の発現の抑制は、方法論１に記載した方法に準じて行うことができる。

　本発明の方法２は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含んでいてもよい。本発明の方法２において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖の更なる向上が期待できる。

　上記各遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、方法論１に記載した方法に準じて行うことができる。

　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現の抑制は、方法論１と同様に、好ましくは、各遺伝子に対する発現抑制核酸を発現する発現ベクターを細胞に導入することにより行う。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞に、所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現ベクター（例、ウイルスベクター）をトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞からＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を誘導し、その段階で当該ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンス核酸を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞において、当該発現抑制核酸を強制発現させながら、該多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血内皮細胞から、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞への分化を誘導してもよい。発現ベクターを用いて細胞内で発現抑制核酸の発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該発現抑制核酸をコードする核酸（例、ＤＮＡ）を作用可能に連結し、これを発現ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的とする発現抑制核酸を発現させてもよい。該プロモーターは外来性プロモーターであり得る。外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは恒常的プロモーターである。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸と、ｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、それぞれ別々の発現ベクターに挿入してもよいし、同一の発現ベクターに挿入してもよい。

　本局面において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制は、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、又はＢＣＬ－ＸＬ遺伝子のいずれかの強制発現と同時であってもよい。好ましくは、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時か、或いはその後である。例えば細胞増殖の低下が確認された後に実施することができる。一例として、ある時点の細胞増殖率を直近の細胞増殖率と比較し（例えば、一週間ごとに細胞の増殖を確認したとして、ある週の細胞増殖率をその一週間前の増殖率と比較して）、増殖率が１／２以下になった状態が確認された後に実施することができる。一態様において、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させ、これと並行して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。

　本発明は、上記本発明の方法２で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程（培養工程）を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法（以下、本発明の製造方法２という）をも提供する。

　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の培養条件は、方法論１に記載の通りである。方法論１に記載の通り、培養するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の種類に応じ、細胞増殖に適したサイトカインの生み合わせを、培地に添加することができる。

　本発明は、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（以下、本発明の細胞２）を提供する。骨髄球系前駆細胞は、好ましくは、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞又は樹状細胞前駆細胞である。第４の外来性プロモーターの用語の説明は、方法論１について記載した部分に準ずる。第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　第４の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン依存的な発現制御を可能とするため、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有することが好ましい。第３の外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞２は、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子を更に有していてもよい。ＭＹＣファミリー遺伝子は、好ましくはｃ－ＭＹＣである。第１の外来性プロモーター及び第２の外来性プロモーターの用語の説明は、方法論１について記載した部分に準ずる。第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターの種類は、第４の外来性プロモーターと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、同一の種類のプロモーターである。同一の種類のプロモーターを用いることにより、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同期的に発現させることができ、また同期的に発現を抑制することができる。第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、好ましくは、同一の調節性プロモーター（例、薬剤反応性プロモーター）であり、より好ましくは全てテトラサイクリン反応性プロモーターである。第４の外来性プロモーターは、第１及び第２の外来性プロモーターと独立して、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子と作用可能に連結されていてもよいし、第４の外来性プロモーターにＭＹＣファミリー遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子とが作用可能に連結されていてもよいし、第４の外来性プロモーターにＢＭＩ１遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子とが作用可能に連結されていてもよいし、１つの外来性プロモーターに、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が作用可能に連結されていてもよい。

　第１、第２及び第４の外来性プロモーターの少なくとも１つについてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン依存的な発現制御を可能とするため、本発明の細胞２は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有することが好ましい。第３の外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞２は、第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸（例、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸）をコードする核酸、及び／又は第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸を更に有していてもよい。第５の外来性プロモーター及び第６の外来性プロモーターの用語の説明は、方法論１について記載した部分に準ずる。第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよいが、好ましくは、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　一態様において、本発明の細胞２は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ）、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、及び
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞）である。第１、２及び４の外来性プロモーターから選択される少なくとも１つ（好ましくは全て）としてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　一態様において、本発明の細胞２は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸
を有するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞）である。第１、２及び４の外来性プロモーターから選択される少なくとも１つ（好ましくは全て）としてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　本発明の細胞２は、上述した本発明の方法２、又は本発明の製造方法２により得ることができる。

　また、本発明は、上記本発明の細胞２を含む細胞集団（本発明の細胞集団２という。）を提供する。該細胞集団２は、上記本発明の細胞２を豊富に含み、該細胞集団２全体に含まれる本発明の細胞２の割合は、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このような本発明の細胞２を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法２を適用した細胞集団から、目的とする特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞））を、抽出することにより得ることができる。好ましい態様において、本発明の細胞集団２は、特定の分化段階にある本発明の細胞２を豊富に含む。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞２（該細胞はＧＭＰである）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞２（該細胞はマクロファージ前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞２（該細胞は樹状細胞前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このように特定の分化段階にある本発明の細胞２を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法２を適用した細胞集団から、目的とする分化段階の細胞を、該分化段階の細胞に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター等で単離・抽出することにより得ることができる。

　また、本発明は、上記本発明の細胞集団２を含む細胞調製物（本発明の細胞調製物２という。）を提供する。本発明の細胞調製物２は、方法論１と同様に、上記本発明の細胞集団２を、適切な生理的水溶液で懸濁することにより調製することができる。一態様において、本発明の細胞調製物２は、凍結した上記本発明の細胞集団２を含む凍結細胞調製物である。

　方法論１と同様に、本発明の方法２又は本発明の製造方法２で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（すなわち、本発明の細胞２）を分化させることにより、ＣＭＰ系分化細胞を得ることができる。

　本実施形態に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤（本発明の増殖促進剤２という）は、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含む。本発明の増殖促進剤２は、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を更に有効成分として含んでいてもよい。本発明の増殖促進剤２は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を更に有効成分として含んでいてもよい。

　また、本発明の方法２又は本発明の製造方法２で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（本発明の細胞２）、或いは上述したＣＭＰ系分化細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む医薬組成物を調製し、各種疾患の治療又は予防に用いることもできる。医薬組成物の調整及び、疾患の治療又は予防は、方法論１に準じて実施することができる。

　各用語の定義は、方法論１について記載した部分に準ずる。

（２）方法論３
　更なる局面において、本発明は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法（以下、「本発明の方法２」という。）を提供する。骨髄球系前駆細胞は、好ましくは、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、又は赤血球前駆細胞である。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖性が向上し、無限に増殖する不死化細胞株を得ることが期待できる。

　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現の抑制は、方法論１と同様に、好ましくは、各遺伝子に対する発現抑制核酸（例、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸）を発現する発現ベクターを細胞に導入することにより行う。ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞に、所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現ベクター（例、ウイルスベクター）をトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞からＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を誘導し、その段階で当該発現抑制核酸を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）、造血前駆細胞又は造血内皮細胞において、当該発現抑制核酸を強制発現させながら、該多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血内皮細胞から、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞への分化を誘導してもよい。発現ベクターを用いて細胞内で発現抑制核酸の発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該発現抑制核酸をコードする核酸（例、ＤＮＡ）を作用可能に連結し、これを発現ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的とする発現抑制核酸を発現させてもよい。該プロモーターは外来性プロモーターであり得る。外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは恒常的プロモーターである。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸と、ｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、それぞれ別々の発現ベクターに挿入してもよいし、同一の発現ベクターに挿入してもよい。

　本発明の方法３においては、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を抽出（単離又は精製）する工程をさらに含んでいてもよい。当該特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）の抽出は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する前に行っても後に行ってもよい。一態様において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する前にこの抽出工程を行い、抽出した特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。別の態様において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制した、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を含む細胞集団を調製し、その後該細胞集団から、所望の特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）を抽出する。この抽出した特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞）において、引き続きＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制してもよい。目的とする細胞を抽出し、抽出された細胞に対して、本発明の方法３を適用することにより、或いは本発明の方法３を適用した細胞集団から、目的とする細胞を抽出して、該細胞を継続して培養することにより、目的の細胞種を効率よく増殖させることができる。抽出する細胞は、抽出した細胞種の増殖性を効率的に向上させる観点から、ＣＭＰのみとすることや、骨髄球系前駆細胞の単一種の細胞のみとすることが好ましいが、これらの２種以上の細胞種が混合した細胞集団としてもよい。抽出する細胞は、好ましくは、ＣＭＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、又は赤血球前駆細胞である。目的とする細胞の抽出は、方法論１に記載した方法に従って行うことができる。抽出操作後の細胞集団に含まれる目的とする細胞の割合が、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）となるように、目的とする細胞の単離を行うことができる。目的とする細胞のシングルセルを単離してもよい。

　本発明の方法３は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程をさらに含んでいてもよい。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制に加えて、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子を発現させることにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖の更なる促進が期待できる。ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子の上記強制発現の期間は当業者が適宜決定することができる。

　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制と同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子を強制発現させ、続いてＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制して、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得てもよい。また、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現と、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制を同時に行い、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得ることもできる。

　本発明の方法３は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制させる工程をさらに含んでいてもよい。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制に加えて、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を発現させることにより、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖の更なる促進が期待できる。ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の上記強制発現の期間は当業者が適宜決定することができる。

　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制と同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させ、続いてＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制して、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得てもよい。また、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制を同時に行い、増殖能を向上させたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を得ることもできる。

　一態様において、本発明の方法３は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ遺伝子）、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制させる工程をさらに含んでいてもよい。本態様において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制は、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、又はＢＣＬ－ＸＬ遺伝子のいずれかの強制発現と同時であってもよい。好ましくはＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時か、或いはその後にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。一態様において、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の細胞増殖の低下が確認された後に、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。一態様において、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（好ましくはｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現したＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の細胞増殖の低下が確認された後に、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現とＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制を実施する。一例として、ある時点の細胞増殖率を直近の細胞増殖率と比較し（例えば、一週間ごとに細胞の増殖を確認したとして、ある週の細胞増殖率をその一週間前の増殖率と比較して）、増殖率が１／２以下になった状態が確認された後に実施することができる。一態様において、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させ、これと並行して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。

　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の遺伝子は、方法論１や方法論２に記載した方法に準じて細胞内で強制発現させることができる。細胞内におけるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の発現の抑制は、方法論１や方法論２に記載した方法に準じて行うことができる。

　本発明は、上記本発明の方法３で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程（培養工程）を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法（以下、本発明の製造方法２という）をも提供する。

　本発明は、第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸（例、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸）をコードする核酸、及び／又は第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（以下、本発明の細胞３）を提供する。骨髄球系前駆細胞は、好ましくは、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞又は赤血球前駆細胞である。第５の外来性プロモーター及び第６の外来性プロモーターの用語の説明は、方法論１について記載した部分に準ずる。第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよいが、好ましくは、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞３は、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子を更に有していてもよい。第１の外来性プロモーター及び第２の外来性プロモーターの用語の説明は、方法論１について記載した部分に準ずる。第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞３は、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を更に有していてもよい。第４の外来性プロモーターの用語の説明は、方法論１について記載した部分に準ずる。第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　第１、第２及び第４の外来性プロモーターの種類は、第４の外来性プロモーターと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、同一の種類のプロモーターである。同一の種類のプロモーターを用いることにより、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同期的に発現させることができ、また同期的に発現を抑制することができる。第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、好ましくは、同一の調節性プロモーター（例、薬剤反応性プロモーター）であり、より好ましくは全てテトラサイクリン反応性プロモーターである。

　第１、第２及び第４の外来性プロモーターの少なくとも１つについてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン依存的な発現制御を可能とするため、本発明の細胞３は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有することが好ましい。第３の外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞のゲノムに組み込まれている。

　一態様において、本発明の細胞３は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ）、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸を有する、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＣＭＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞）である。第１及び２の外来性プロモーターから選択される少なくとも１つ（好ましくは全て）としてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　一態様において、本発明の細胞３は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸
を有するＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＣＭＰ、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞）である。第１、２及び４の外来性プロモーターから選択される少なくとも１つ（好ましくは全て）としてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。

　本発明の細胞３は、上述した本発明の方法３、又は本発明の製造方法３により得ることができる。

　また、本発明は、上記本発明の細胞３を含む細胞集団（本発明の細胞集団３という。）を提供する。該細胞集団３は、上記本発明の細胞３を豊富に含み、該細胞集団３全体に含まれる本発明の細胞３の割合は、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このような本発明の細胞３を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法３を適用した細胞集団から、目的とする特定の分化段階の細胞（ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（例、ＧＭＰ、マクロファージ前駆細胞、樹状細胞前駆細胞、赤血球前駆細胞））を、抽出することにより得ることができる。好ましい態様において、本発明の細胞集団３は、特定の分化段階にある本発明の細胞３を豊富に含む。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞３（該細胞はＧＭＰである）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞３（該細胞はマクロファージ前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞３（該細胞は樹状細胞前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞３（該細胞は赤血球前駆細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このように特定の分化段階にある本発明の細胞３を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法３を適用した細胞集団から、目的とする分化段階の細胞を、該分化段階の細胞に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター等で単離・抽出することにより得ることができる。

　また、本発明は、上記本発明の細胞集団３を含む細胞調製物（本発明の細胞調製物２という。）を提供する。本発明の細胞調製物３は、方法論１と同様に、上記本発明の細胞集団３を、適切な生理的水溶液で懸濁することにより調製することができる。一態様において、本発明の細胞調製物３は、凍結した上記本発明の細胞集団３を含む凍結細胞調製物である。

　方法論１と同様に、本発明の方法３又は本発明の製造方法３で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（すなわち、本発明の細胞３）を分化させることにより、ＣＭＰ系分化細胞を得ることができる。

　本実施形態に係るＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤（本発明の増殖促進剤３という）は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む。本発明の増殖促進剤３は、好ましくは、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を特異的に抑制し得る発現抑制核酸（例、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸）又はこれらの発現抑制核酸を発現し得る発現ベクター、並びに／或いはｐ５３遺伝子の発現を特異的に抑制し得る発現抑制核酸、又はこれらの発現抑制核酸を発現し得る発現ベクターを有効成分として含む。本発明の増殖促進剤３は、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を更に有効成分として含んでいてもよい。本発明の増殖促進剤３は、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる分子を更に有効成分として含んでいてもよい。

　また、本発明の方法３又は本発明の製造方法３で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞（本発明の細胞３）、或いは上述したＣＭＰ系分化細胞を製造する方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む医薬組成物を調製し、各種疾患の治療又は予防に用いることもできる。医薬組成物の調製及び、疾患の治療又は予防は、方法論１に準じて実施することができる。

　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。

実施例１－１：ＣＭＰ株の増殖促進
　ヒトｉＰＳ細胞から、図１に示す方法に従って培養を１４日間行い、血液前駆細胞への分化培養を実施し、セルソーターでＣＤ３４^＋ＣＤ４３^＋細胞をソートすることにより単離した血液前駆細胞を得た。得られた血液前駆細胞に、以下の処理を行うことで増殖能を有するＣＭＰ株を樹立した。まず、培養１４日目の単離した血液前駆細胞（１．０×１０^４～１．０×１０^５個）に、ドキシサイクリン制御によりｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１を強制発現させるレンチウイルスベクターを導入し（ＭＢ）、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で、ドキシサイクリン存在下で培養することにより、増殖能を有するＣＭＰ（ＭＢ）を樹立した。増殖した細胞がＣＭＰであることは、メチルセルロースコロニーアッセイにて、シングルセルから好中球、マクロファージ、赤芽球及び巨核球が誘導できたことから、樹立した細胞がＣＭＰであることを確認した（Takayama et al., Blood, 111(11):5298-5306, 2008）。

　培養２１日目に、ＣＭＰ（ＭＢ）にドキシサイクリン制御によりＢＣＬ－ＸＬを強制発現させるレンチウイルスベクター、及びｐ２１に対するｓｈＲＮＡ及びｐ５３に対するｓｈＲＮＡを持続的に発現するレンチウイルスベクターを感染させて、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＴＰＯを含む培地中で、ドキシサイクリン存在下でさらに培養した。この培養操作により、ＭＢ導入に加えてドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を更に導入したＣＭＰ（ＭＢＸ）、ＭＢ導入に加えて持続的に発現するｓｈ　ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを更に感染させたＣＭＰ（ＭＢ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）、及びＭＢ導入に加えてドキシサイクリン誘導レンチウイルスベクターを用いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を導入し、持続的に発現するｓｈ　ｐ２１／ｐ５３レンチウイルスベクターを感染させたＣＭＰ（ＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３＿ＫＤ）を樹立した。樹立した細胞は、マクロファージ、ＭＥＰ及び巨核球前駆細胞のマーカーを発現していないことから、ＣＭＰ単一のポピュレーションと考えられた。

　各ＣＭＰについて、１４日目と３１日目と４３日目の細胞数をカウントした結果を図２に示す。ｃ－ＭＹＣ及びＢＭＩ１の強制発現により、ＣＭＰは良好に増殖した。ＢＣＬ－ＸＬの強制発現により、細胞増殖が促進された。またｐ２１及びｐ５３のノックダウンによっても細胞増殖が促進された。同様の方法により、異なる７株のｉＰＳ細胞から、増殖性を有するＣＭＰの樹立に成功した。

実施例１－２：赤芽球・マクロファージ・好中球への分化誘導
　実施例１－１で得た各細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、ｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制後、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＩＬ３のサイトカインの存在下で細胞を培養し、７日目にＣＭＰ株から分化した赤芽球・マクロファージ・好中球をＦＡＣＳで解析した。抗体はＣＤ４３抗体、ＣＤ３３抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＧＰＡ（Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ　Ａ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０６６１２）、ＡＰＣ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ４１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号：３０３７１０）を使用した。結果を図３に示す。巨核球への分化も確認できた。ドキシサイクリン除去（ｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの発現抑制）により、骨髄系の主要な３系統への終末分化が確認された。この結果から、実施例１－１で得られた細胞がＣＭＰであること、及びｃ－ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの発現抑制により、骨髄系細胞への終末分化が促進されることが示唆された。

実施例１－３：マクロファージ・好中球への分化誘導
　実施例１－１で得た各細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、ＭＹＣ／ＢＭＩ１／ＢＣＬ－ＸＬの３因子の発現を抑制後、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ３のサイトカインの存在下で細胞を培養し、７日目にＣＭＰ株から分化した赤芽球・マクロファージ・好中球をＦＡＣＳで解析した。抗体はＣＤ１６抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、及びＣＤ１１ｃ抗体を使用した。結果を図４に示す。ＭＢＸ及びＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３ＫＤのいずれのＣＭＰからもマクロファージが誘導された。ＭＢＸよりもＭＢＸ－ｐ２１／ｐ５３ＫＤの方が、マクロファージに分化した細胞のパーセンテージが高いことから、ｐ２１／ｐ５３ＫＤによりマクロファージへの分化が促進される可能性が示唆された。

実施例２－１：ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｓｙｓｔｅｍ
　ＰｉｇｇｙＢａｃベクター内のテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）の下流にＢＭＩ１　ＩＲＥＳＳ　ｃ－ＭＹＣを導入し、Ｈ１　ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にｓｈ　ｐ５３，　ｓｈ　ｐ２１を導入したベクターを作製した（ｐｂ　ＢＭＩ１　ＩＲＥＳＳ　ｃ－ＭＹＣ－ｒｔＴＡ　ｓｈ　ｐ５３　ｓｈ　ｐ２１）（図５（Ａ）参照）。ＰｉｇｇｙＢａｃベクター内のＴＲＥの下流にＢＣＬ－ＸＬを導入した。このベクター内にＵｂｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流にｒｔＴＡ　２Ａ　ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子が発現する（ｐｂ　ＢｃｌＸＬ）。用いたＰｉｇｇｙＢａｃベクターは、京都大学ｉＰＳ細胞研究所のＫｎｕｔ　Ｗｏｌｔｊｅｎ准教授から分与されたものである。

　上記のベクターを１３８３Ｄ１０（ｉＰＳ細胞）、ＫｈＥＳ３、ＫｔｈＥＳ１４の各細胞株にリポフェクションで導入後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎで導入細胞をセレクションした。その後、各細胞を１４日間で血液前駆細胞に分化・単離後、図５（Ｂ）に示す条件下で培養し、マクロファージ株、赤血球株の各細胞株を得た。
　より具体的には、マクロファージ株を調製する場合、血液前駆細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で７日間培養した後に、セルソーターでＣＸ３ＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性細胞を単離した。単離されたＣＸ３ＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性細胞を、引き続きＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養することによりマクロファージ株を得た。
　赤血球株を調製する場合、血液前駆細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ），Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で７日間培養した後に、セルソーターでＣＤ７１陽性ＣＤ２３５ａｂ陽性細胞を単離した。単離されたＣＤ７１陽性ＣＤ２３５ａｂ陽性細胞を、引き続きＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ），Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養することにより、赤血球株を得た。
　各マクロファージ細胞株の増殖曲線を図６に示す。細胞数はＣＸ３ＣＲ１陽性細胞をカウントした。

実施例２－２：マクロファージ株
　実施例２－１で得た１３８３Ｄ１０由来のマクロファージ株をＣＤ１３，ＣＤ１４，ＣＤ３３，ＣＤ４３，ＨＬＡ－ＤＲで染色しＦＡＣＳで解析した。抗体はＣＤ１３抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ３３抗体、ＣＤ４３抗体、ＨＬＡ－ＤＲ抗体を使用した。結果を図７に示す。マクロファージのマーカーであるＣＤ１３，ＣＤ１４陽性細胞であることが確認された。

実施例２－３：マクロファージ細胞表面マーカー
　実施例２－１で得た各マクロファージ株をマクロファージのマーカーであるＣＸ３ＣＲ１でｓｏｒｔｉｎｇした後、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）で、マクロファージ細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した。Ｄｏｘ　ｏｎはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養し、Ｄｏｘ　ｏｆｆはＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）存在下で３日間培養した（図１６上部参照）。遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）の結果を図８下部に、遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）の結果を図９に示す。Ｄｏｘ　ｏｆｆ時にはＤｏｘ　ｏｎと比べＣＤ１４，ＣＤ１６３，ＣＤ８０が高発現した。しかし、ＣＤ１１ｂの発現は低かった。

実施例２－４：Ｍ１型、Ｍ２型
　実施例２－１で得た各マクロファージ株がＭ１型、Ｍ２型どちらの型なのかをＦＡＣＳで解析した。Ｄｏｘ　ｏｆｆ細胞をＭ１型のマーカーであるＣＤ３２、Ｍ２型のマーカーであるＣｄ１６３で染色したところ、どちらも陽性なためＦＡＣＳでは識別できなかった（図１０参照）。

実施例２－５：ＣＤ１１ｂ陽性細胞
　実施例２－１で得た各マクロファージ株の培養液からドキシサイクリンを除去し、Ｄｏｘ　ｏｆｆ時にＭ－ＣＳＦの存在下マトリゲル上で培養した細胞株をＣＤ１１ｂで染色したところ、ＣＤ１１ｂ陽性細胞が得られた。結果を図１１に示す。培養環境の変化（マトリゲル上での培養）でマクロファージマーカーであるＣＤ１１ｂが発現することがわかった。

実施例２－６：貪食能
　実施例２－１で得た各マクロファージ株の貪食能を調べた。各細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、Ｄｏｘ　ｏｎ，　Ｄｏｘ　ｏｆｆ後１日目、２日目、３日目の細胞株に蛍光標識した酵母細胞壁ペプチドを添加後ＦＡＣＳで解析した。結果を図１２に示す。Ｄｏｘ　ＯＮでは貪食能が低かっ
た。一方、ｏｆｆ時では１日目から貪食能が確認された。

実施例２－７：β－ａｍｉｌｏｉｄの貪食能
　実施例２－１で得た各マクロファージ株のβ－ａｍｉｌｏｉｄの貪食能を調べた。各細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、Ｄｏｘ　ｏｎ，　Ｄｏｘ　ｏｆｆ後５日目の細胞株に蛍光標識したオリゴマーβ－ａｍｉｌｏｉｄを添加後ＦＡＣＳで解析した。結果を図１３に示す。Ｄｏｘ　ＯＮでは貪食能が低かった。一方、Ｄｏｘ　ｏｆｆ時では貪食能が確認された。

実施例２－８：赤血球株
　実施例２－１において、ｋｈＥＳ３（ＥＳ細胞）、１３８３Ｄ１０（ｉＰＳ細胞）由来血液前駆細胞をＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ），Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）の条件下で培養することで、取得した不死化の赤血球株について、細胞数をＧｌｙ－Ａ陽性細胞でカウントした（図１４参照）。

実施例３－１：ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｓｙｓｔｅｍ
　実施例２－１と同様に、ＥＳ細胞５株、ｉＰＳ細胞５株を用いて血球分化７日目に、図１５に示す各条件で培養することでマクロファージ株、樹状細胞株、赤血球株の各細胞株を得た。
　より具体的には、マクロファージ株を調製する場合、造血内皮細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で７日間培養した後に、セルソーターでＣＸ３ＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性細胞を単離した。単離されたＣＸ３ＣＲ１陽性ＣＤ１４陽性細胞を、引き続きＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養することによりマクロファージ株を得た。
　樹状細胞株を調製する場合、造血内皮細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で７日間培養した後に、セルソーターでＣＤ２０９陽性細胞を単離した。単離されたＣＤ２０９陽性細胞を、引き続きＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養することにより樹状細胞株を得た。
　赤血球株を調製する場合、造血内皮細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ），Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で７日間培養した後に、セルソーターでＣＤ７１陽性ＣＤ２３５ａｂ陽性細胞を単離した。単離されたＣＤ７１陽性ＣＤ２３５ａｂ陽性細胞を、引き続きＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ），Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養することにより、赤血球株を得た。
　ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），Ｍ－ＣＳＦ（２０μｇ／ｍｌ），ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ），Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）の条件下で培養することで、取得した増殖能を有する各マクロファージ細胞株の増殖曲線を図１６に示す。細胞数はＣＸ３ＣＲ１陽性細胞をカウントした。
　ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），Ｍ－ＣＳＦ（２０μｇ／ｍｌ），ＧＭ－ＣＳＦ（２０μｇ／ｍｌ），Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）の条件下で培養することで、取得した増殖能を有する各樹状細胞株の増殖曲線を図１７に示す。細胞数はＣＤ２０９陽性細胞をカウントした。

実施例３－２：マクロファージ細胞表面マーカー
　実施例３－１で得た各マクロファージ株をマクロファージのマーカーであるＣＸ３ＣＲ１でｓｏｒｔｉｎｇした後、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）で、マクロファージ細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した。Ｄｏｘ　ｏｎはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養し、Ｄｏｘ　ｏｆｆはＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）存在下で３日間培養した（図１８上部参照）。遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）の結果を図１８下部に、遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）の結果を図１９に示す。Ｄｏｘ　ｏｆｆ時にはＤｏｘ　ｏｎと比べＣＤ１４，ＣＤ１６３，ＣＤ８０が高発現した。しかし、ＣＤ１１ｂの発現は低かった。

実施例３－３：β－ａｍｉｌｏｉｄの貪食能
　実施例３－１で得た各マクロファージ株のβ－ａｍｉｌｏｉｄの貪食能を調べた。各細胞の培養液からドキシサイクリンを除去し、Ｄｏｘ　ｏｎ，　Ｄｏｘ　ｏｆｆ後３日目の細胞株に蛍光標識したオリゴマーβ－ａｍｉｌｏｉｄを添加後ＦＡＣＳで解析した。結果を図２０に示す。Ｄｏｘ　ＯＮでは貪食能が低かった。一方、Ｄｏｘ　ｏｆｆ時では貪食能が確認された。

実施例３－４：樹状細胞表面マーカー
　実施例３－１で得た各樹状細胞株を樹状細胞のマーカーであるＣＤ２０９でｓｏｒｔｉｎｇした後、遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）と遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）で、樹状細胞表面マーカーをＦＡＣＳで解析した。Ｄｏｘ　ｏｎはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘｃｙｃｌｉｎｅ（１μｇ／ｍｌ）存在下で培養し、Ｄｏｘ　ｏｆｆはＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）存在下で５日間培養した（図２０上部参照）。遺伝子発現時（Ｄｏｘ　ｏｎ）の結果と、遺伝子発現抑制時（Ｄｏｘ　ｏｆｆ）の結果とをそれぞれ図２１～２３に示す。Ｄｏｘ　ｏｆｆ時にはＤｏｘ　ｏｎと比べＣＤ１１ｃ，ＣＤ２０９，ＣＤ８０が高発現した。また、一部の細胞でＤｏｘ　ｏｆｆ時に細菌の脂質分子をＴ細胞に抗原提示する受容体であるＣＤ１ａ，ＣＤ１ｃが発現した。

実施例３－５：赤血球株
　実施例３－１において、ｋｈＥＳ３（ＥＳ細胞）、ｋｔｈＥＳ１４（ＥＳ細胞）由来血液前駆細胞をＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ），Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）の条件下で培養することで、取得した増殖能を有する赤血球株について、細胞数をＧｌｙ－Ａ陽性細胞でカウントした（図２４参照）。

Claims

　造血前駆細胞から骨髄球系前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含み、
　骨髄球系前駆細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）又は骨髄球系前駆細胞の増殖性を向上させる方法。
　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を抽出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１～６のいずれか一項に記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を培養する工程を含む、ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を製造する方法。
　請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞を分化する工程を含む、ＣＭＰ系分化細胞を製造する方法。
　ＣＭＰ系分化細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球である、請求項８に記載の方法。
　請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で得られたＣＭＰ若しくは骨髄球系前駆細胞、又は請求項８若しくは９に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞を含む、医薬組成物。
　請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で得られたＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞。
　請求項８又は９に記載の方法で得られたＣＭＰ系分化細胞。
　ＣＭＰ又は骨髄球系前駆細胞の増殖促進剤であって、
　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、
　骨髄球系前駆細胞が、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、赤芽球、又は赤血球の前駆細胞である、増殖促進剤。
　以下の工程を含む、マクロファージを製造する方法：
１）造血前駆細胞からマクロファージ前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程、
２）工程１で得られた細胞を培養し、増殖させる工程、
３）工程２で得られた細胞におけるＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現を抑制し、マクロファージ分化条件下で更に培養することにより、マクロファージへの分化及び成熟を促進する工程。
　工程１が、造血前駆細胞からマクロファージ前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させることを更に含む、請求項１４記載の方法。
　工程３が、工程２で得られた細胞におけるＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制することを更に含む、請求項１５記載の方法。
　工程１が、造血前駆細胞からマクロファージ前駆細胞への分化過程における任意の細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することを更に含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。