WO2021101273A2 - 조절 t 세포 배양용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages

Definitions

  • the present invention relates to a composition for culturing T cells and a method for culturing control T cells using the same.
  • T cells play a central role in cell-mediated immunity.
  • T cells can be differentiated from other lymphocytes, including B cells, by receptors present on the surface of T cells, such as T cell receptors (TCRs).
  • T cells are memory T cells (TM) including helper T cells (TH cells), cytotoxic T cells (TC cells, or CTL), central memory T cells (TCM cells) and effector memory T cells (TEM cells).
  • TM memory T cells
  • TH cells helper T cells
  • T cells cytotoxic T cells
  • TCM cells central memory T cells
  • TEM cells effector memory T cells
  • Cells natural killer T cells (NKT cells), gamma delta T cells ( ⁇ T cells), and regulatory T cells (Treg cells).
  • Treg regulatory T cells
  • Treg cells are T cells that act to suppress the immune response of other cells.
  • Treg cells suppress T cell-mediated immunity during the immune response and play a role in suppressing self-reactive T cells that have escaped during the negative selection process of the thymus.
  • Treg cells can be largely divided into natural regulatory T cells (nTreg) and induced regulatory T cells (iTreg).
  • Natural regulatory T cells known as CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells arise in the thymus.
  • Induced regulatory T cells share a number of properties with naturally occurring Treg cells, but the characteristic of conversion from CD4+CD25-FoxP3- T cells to CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells is known as a representative difference.
  • regulatory T cells can secrete IL-10, TGF- ⁇ , and IL-35, which are known as immunosuppressive cytokines (H Nishikawa et al., Int. J. Cancer, 2010, 127: 759- 767). Regulatory T cells that secrete immunosuppressive cytokines secrete IL-10 and induce antigen-specific T cells that cause autoimmune diseases to immune tolerant antigen presenting cells, thereby inducing immunological resistance. Research to prove that is in progress (S. Karumuthil-Melethil et, al., Diabetes, 2015, 64:1341-1357).
  • the present inventors studied a method for effectively culturing regulatory T cells, by confirming that a novel fusion protein dimer containing IL-2 protein and CD80 protein in one molecule can effectively proliferate regulatory T cells.
  • the present invention has been completed.
  • composition or medium for culturing a regulated T cell comprising an IL-2 protein or a variant thereof and a fusion protein dimer including a CD80 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • a fusion protein dimer comprising an IL-2 protein or a variant thereof and a CD80 protein or a fragment thereof.
  • composition comprising, as an active ingredient, regulatory T cells cultured in a medium containing an IL-2 protein or a variant thereof and a fusion protein dimer comprising a CD80 protein or a fragment thereof.
  • the culture composition of the present invention When the culture composition of the present invention is used, not only T cells can be effectively proliferated, but in particular, regulatory T cells can be effectively proliferated. In particular, it was confirmed that the survival rate of regulatory T cells significantly increased compared to the conventional culture method using IL-2. In addition, it was confirmed that the amount of Foxp3+ expression was increased in the obtained regulatory T cells. Therefore, this proliferation method can be utilized in the field of cell therapy using regulatory T cells.
  • Figure 1a shows a schematic diagram of the fusion protein dimer used in the present invention.
  • Fig. 1b is a confirmation of the obtained fusion protein dimer (GI-101) by SDS-PAGE.
  • Figure 1c shows the content of the fusion protein dimer (GI-101) according to the absorbance.
  • 1D is an analysis of the obtained fusion protein dimer (GI-101) by size exclusion chromatography (SEC).
  • Figure 2a shows the obtained hCD80-Fc fusion protein dimer confirmed by SDS-PAGE.
  • 2B is an analysis of the obtained hCD80-Fc fusion protein dimer by size exclusion chromatography (SEC).
  • Figure 3a shows the obtained Fc-IL2v2 fusion protein dimer confirmed by SDS-PAGE.
  • 3B is an analysis of the obtained Fc-IL2v2 fusion protein dimer by size exclusion chromatography (SEC).
  • Figure 3c shows the obtained Fc-IL2wt fusion protein dimer confirmed by SDS-PAGE.
  • 3D is an analysis of the obtained Fc-IL2wt fusion protein dimer by size exclusion chromatography (SEC).
  • Figure 4a shows the obtained hCD80-Fc-IL2wt fusion protein dimer confirmed by SDS-PAGE.
  • 4B is an analysis of the obtained hCD80-Fc-IL2wt fusion protein dimer by size exclusion chromatography (SEC).
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of a method of culturing Treg cells using a fusion protein dimer.
  • FIG. 6 shows the number of regulatory T cells cultured in a composition containing RPMI1640 medium.
  • FIG. 7 shows the survival rate of regulatory T cells cultured in a composition containing RPMI1640 medium.
  • FIG. 10 shows the IL-10 secretion ability of regulatory T cells cultured using a composition containing RPMI1640 medium.
  • 11 shows the IL-10 secretion ability of regulatory T cells cultured using a composition containing TexMACS medium.
  • 12A and 12B show the number of regulatory T cells proliferated when cultured in a composition including RPMI1640 medium in the optimization process.
  • 13A and 13B show the survival rate of regulatory T cells when cultured in a composition including RPMI1640 medium in the optimization process.
  • 14A and 14B show the number of regulatory T cells when cultured in a composition including TexMACS medium in the optimization process.
  • 15A and 15B show the survival rate of regulatory T cells when cultured in a composition including TexMACS medium in the optimization process.
  • 16A to 16C show the results of FACS analysis of the characteristics of cells cultured in a composition including RPMI1640 medium in the optimization process.
  • 17A to 17C show the number of regulatory T cells expressing Foxp3 when cultured in a composition including RPMI1640 medium in the optimization process.
  • 18A to 18C show the results of FACS analysis of the characteristics of cells cultured in a composition including a TexMACS medium in the optimization process.
  • 19A to 19C show the number of regulatory T cells expressing Foxp3 when cultured in a composition including TexMACS medium in the optimization process.
  • 21 shows the IL-10 secretion ability of regulatory T cells cultured in a composition including TexMACS medium in the optimization process.
  • compositions and medium for regulatory T cell proliferation Composition and medium for regulatory T cell proliferation
  • composition for regulated T cell proliferation comprising, as an active ingredient, a fusion protein dimer including an IL-2 protein or a variant thereof and a CD80 protein or a fragment thereof.
  • a medium for regulatory T cell proliferation comprising the fusion protein dimer as an active ingredient.
  • the medium for proliferation of the regulatory T cells may be a medium to which a fusion protein dimer including the IL-2 protein or a variant thereof and a CD80 protein or a fragment thereof is added to a medium for culturing T cells.
  • the T cell culture medium may contain any one selected from the group consisting of amino acids, sugars, inorganic salts, and vitamins.
  • the T cell culture medium may contain all of amino acids, sugars, inorganic salts, and vitamins.
  • the medium may further include Fetal Bovine Serum (FBS), Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic Acid (HEPES), protein, carbohydrate, mercaptoethanol, and growth factors.
  • the medium for culturing the regulated T cells may further contain retinoic acid.
  • the medium for proliferation of the regulatory T cells may include the basic components of Table 3 or Table 4 below.
  • the term "cell culture medium” refers to a medium used for culturing cells, and specifically refers to a medium for culturing regulatory T cells, more specifically CD4 + CD25 + CD127- cells. . Contains components required by cells for cell growth and survival in vitro , or contains components that aid in cell growth and survival. Specifically, the ingredients may be vitamins, essential or non-essential amino acids, and trace elements.
  • the medium may be a medium used for culturing cells, preferably eukaryotic cells, more preferably regulatory T cells, even more preferably CD4 + CD25 + CD127- T cells or CD4 + CD25 + Foxp3 + T cells.
  • the cell culture medium according to the present invention is composed of an amino acid component, a vitamin component, an inorganic salt component, other components and purified water,
  • the amino acid component is glycine, L-alanine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-serine, L-cysteine, L-methionine, L-aspartic acid, L-asparagine, L -Glutamic acid, L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-proline, ⁇ -alanine, ⁇ -aminobutyric acid, ornithine, citrulline, homo It is at least any one amino acid selected from the group consisting of serine, triiodotyrosine, thyroxine, and dioxyphenylalanine, or a combination thereof, and preferably, glycine, L-alanine, L-arginine, L-cysteine, L-glutamine, L -
  • the vitamin component is at least one selected from the group consisting of biotin, D-calcium pantothenate, folic acid, niacinamide, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B12, choline chloride, i-inositol and ascorbic acid. Vitamins or combinations thereof, preferably at least one or more vitamins selected from the group consisting of i-inositol, thiamine hydrochloride, niacinamide and pyridoxine hydrochloride, or combinations thereof,
  • the inorganic salt component is calcium chloride (CaCl 2) (anhydride), copper sulfate pentahydrate (CuSO 4 -5H 2 O), ferric sulfate hepta-hydrate (FeSO 4 -7H 2 O), magnesium chloride (anhydrous), magnesium sulfate ( MgSO 4 ) (anhydrous), potassium chloride (KCl), sodium chloride (NaCl), disodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4 ), sodium hydrogen phosphate monohydrate (NaH 2 PO 4 -H 2 O), zinc sulfate heptahydrate (ZnSO 4 -7H 2 O), ferric nitrate nonahydrate (Fe(NO 3 ) 3 9H 2 O) and sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ).
  • CaCl 2 2 calcium chloride
  • CuSO 4 -5H 2 O copper sulfate pentahydrate
  • FeSO 4 -7H 2 O ferric sulfate hepta-hydrate
  • the other ingredients are D-glucose (dextrose), sodium pyruvate, hypoxanthine Na, thymidine, linoleic acid, lipoic acid, adenosine, cytidine, guanosine, uridine, 2'-deoxyadenosine, 2 It is at least any one other component selected from the group consisting of'-deoxycytidine HCl and 2'-deoxyguanosine, or a combination thereof, preferably sodium pyruvate.
  • Purified water is used to dissolve the amino acids, vitamins, inorganic salts and other components, and may be obtained through one or more distillation, or purified water through a filter.
  • growth factors or cytokines may be further included in the cell culture medium according to the present invention.
  • growth factor IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF, or PDGF may be used alone or in two or more, but is not particularly limited thereto.
  • cytokine IL-1, IL-4, IL-6, IFN- ⁇ , IL-10, or IL-17 may be used alone or in two or more, but is not particularly limited thereto.
  • T cell refers to one of the lymphocytes responsible for antigen-specific adaptive immunity. T cells are classified into naive T cells that have not yet met the antigen, mature T cells that have met the antigen, and memory T cells. At this time, the mature effect T cells include helper T cells, cytotoxic T cells, and natural killer T cells.
  • helper T cell refers to a cell that promotes humoral immunity by regulating the differentiation and activation of other white blood cells. Because it has a CD4 protein on the cell surface, it is also called a CD4+ T cell. Helper T cells can be further classified into Th1, Th2, Th17, and Treg according to their detailed function. Th1 cells secrete interferon-gamma (IFN- ⁇ ) and tumor necrosis factor beta (TNF- ⁇ ) to induce endosomes and lysosomes to fuse inside macrophages to form endolysosomes. do. Meanwhile, Th2 cells secrete several types of interleukin (IL) to allow B cells to differentiate into plasma cells. Th17 cells secrete interleukin-17 (IL-17) to gather neutrophils.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor beta
  • regulatory T cell includes natural regulatory T cells (nTreg) or induced regulatory T cells (iTreg).
  • Regulatory T cells herein include CD4+CD25+ T cells, CD4+CD25+CD127low/- T cells or CD4+CD25+Foxp3+ T cells.
  • the regulatory T cells maintain immunity homeostasis by suppressing the immune response and block autoimmune reactions and the like.
  • cytotoxic T cells refers to cells that kill virus-infected cells or tumor cells by secreting cytotoxic substances such as granzyme or perforin. It is also called a CD8 T cell because it has a CD8 protein on the cell surface. In contrast to helper T cells, it mediates cellular immunity to eliminate virus and cancer cells.
  • Natural killer T cells refers to one of effective T cells distributed in a small proportion compared to helper T cells and cytotoxic T cells. Natural killer T cells have the same T cell receptor (TCR) on the cell surface as T cells, but also have natural killer cell-specific molecules such as NK1.1. Naturally killer T cells secrete gamma interferon and interleukin-4 to regulate the immune response.
  • TCR T cell receptor
  • memory T cells refers to T cells that recognize antigens, which survive for a long time after undergoing differentiation and selection process, and are then rapidly activated when the antigen re-invades later to function as effective T cells. It refers to a cell with potential ability.
  • naive T cells meet antigens, cells in an activated state, or effective T cells, are influenced by interleukin-7 and interleukin-15 to differentiate into long-lived memory T cells.
  • the fusion protein dimer including the IL-2 protein or a variant thereof and a CD80 protein or a fragment thereof may be included in the culture medium from 1 nM to 2,000 nM.
  • the dimer may be included in 1 nM to 1,000 nM, or 1 nM to 500 nM.
  • the dimer may be included in 2 nM to 300 nM, 5 nM to 100 nM, 10 nM to 80 nM, 20 nM to 70 nM, or 40 nM to 50 nM.
  • the fusion protein dimer may be included in 1 nM, 3.2 nM, 10 nM, 50 nM in the medium.
  • Fusion protein dimer comprising IL-2 protein or variant thereof and CD80 protein or fragment thereof
  • IL-2 or "Interleukin-2"
  • mammals such as primates (eg humans) and rodents (eg mice and rats).
  • rodents eg mice and rats
  • the IL-2 may be obtained from animal cells, but includes those obtained from recombinant cells capable of producing IL-2.
  • the IL-2 may be wild-type IL-2 or a variant thereof.
  • IL-2 or a variant thereof is collectively referred to as "IL-2 protein” or "IL-2 polypeptide".
  • IL-2, IL-2 protein, IL-2 polypeptide, and IL-2 variants specifically bind to, for example, IL-2 receptors. This specific binding can be confirmed through methods known to those skilled in the art.
  • the IL-2 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36.
  • the IL-2 may be in a mature form. Specifically, the matured IL-2 may not include a signal sequence, and may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 may be used as a concept including a fragment in which a part of the N-terminus or C-terminus of wild-type IL-2 is deleted (truncated).
  • the IL-2 fragment is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 consecutively from the N-terminus of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36. Pcs, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or It may be a form in which 25 amino acids have been deleted.
  • the fragment of IL-2 is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 consecutively from the C-terminus of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 It may be a form in which dog amino acids have been deleted.
  • the term "IL-2 variant” refers to a form in which a part of an amino acid of a full-length IL-2 or a fragment of IL-2 is substituted. That is, the IL-2 variant may have an amino acid sequence different from that of wild-type IL-2 or a fragment thereof. However, the IL-2 variant may have an activity equal to or similar to wild-type IL-2.
  • IL-2 activity may mean specifically binding to the IL-2 receptor, for example, and this specific binding can be measured through a method known to those skilled in the art.
  • the IL-2 variant may be one in which a part of the amino acid of wild-type IL-2 is substituted.
  • the IL-2 variant by amino acid substitution at least one of the 38th, 42nd, 45th, 61st, and 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted.
  • the IL-2 variant may be one in which at least one of the 38th, 42nd, 45th, 61st, or 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is substituted with another amino acid.
  • IL-2 when IL-2 is a form in which a part of the N-terminal portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 is deleted, an amino acid at a position corresponding to that of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted with another amino acid.
  • the variant of IL-2 is among the 58th, 62nd, 65th, 81st or 92nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.
  • At least one of them may be substituted with another amino acid.
  • These correspond to the 38th, 42nd, 45th, 61st and 72nd amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, respectively.
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids may be substituted. have.
  • from 1 to 5 amino acids may be substituted.
  • the IL-2 variant may be in a form in which two amino acids are substituted. Specifically, the IL-2 variant may be one in which the 38th and 42nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 38th and 45th amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 38th and 61st amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be one in which the 42nd and 45th amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 42nd and 61st amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 42nd and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 45th and 61st amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be one in which the 45th and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 61st and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be in a form in which three amino acids are substituted. Specifically, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 42nd, and 45th amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 42nd, and 61st amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 42nd, and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be one in which the 38th, 45th, and 61st amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 45th, and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 61st, and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 42nd, 45th, and 61st amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be one in which the 42nd, 45th, and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 45th, 61st, and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be in a form in which four amino acids are substituted. Specifically, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 42nd, 45th and 61st amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 42nd, 45th and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 45th, 61st and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be one in which the 38th, 42nd, 61st and 72nd amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may be one in which amino acids 42, 45, 61, and 72 are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may have a form in which five amino acids are substituted. Specifically, in the IL-2 variant, all of the 38th, 42nd, 45th, 61st and 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted with other amino acids.
  • the "other amino acids" introduced by the substitution are alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, and glutamine. , Histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyl alanine, proline, serine, threonine, tryptophan ( tryptophan), tyrosine, and valine.
  • the 38th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 cannot be substituted with arginine
  • the 42nd cannot be substituted with phenylalanine
  • the 45th cannot be substituted with tyrosine.
  • the 61st position cannot be substituted with glutamic acid
  • the 72nd position cannot be substituted with leucine.
  • arginine which is the 38th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted with an amino acid other than arginine.
  • arginine which is the 38th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted with alanine (R38A).
  • phenylalanine which is the 42nd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • amino acids other than phenylalanine Preferably, in the amino acid substitution of the IL-2 variant, phenylalanine, which is the 42nd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, may be substituted with alanine (F42A).
  • tyrosine which is the 45th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted with an amino acid other than tyrosine.
  • tyrosine which is the 45th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may be substituted with alanine (Y45A).
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • E61A arginine
  • leucine which is the 72nd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • an amino acid other than leucine Preferably, in the amino acid substitution of the IL-2 variant, leucine, which is the 72nd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, may be substituted with glycine (L72G).
  • the IL-2 variant may have at least one substitution selected from the group consisting of R38A, F42A, Y45A, E61R, and L72G in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the IL-2 variant may have amino acid substitutions at two, three, four, or five positions at positions selected from the group consisting of R38A, F42A, Y45A, E61R and L72G.
  • the IL-2 variant may have a form in which two amino acids are substituted. Specifically, the IL-2 variant may have been substituted with R38A and F42A. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be substituted with R38A and Y45A. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be substituted with R38A and E61R. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be substituted with R38A and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be substituted with F42A and Y45A. In addition, in one embodiment, the IL-2 mutant may have been substituted with F42A and E61R. In addition, in one embodiment, the IL-2 mutant may have been substituted with F42A and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 mutant may have been substituted with E61R and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 mutant may have been substituted with E61R and L72G.
  • the IL-2 variant may be in a form in which three amino acids are substituted. Specifically, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, F42A and Y45A. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, F42A, and E61R. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, F42A, and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, Y45A, or E61R. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, Y45A, and L72G.
  • the IL-2 mutant may have been substituted with F42A, Y45A, and E61R.
  • the IL-2 variant may have been substituted with F42A, Y45A, and L72G.
  • the IL-2 variant may have been substituted with F42A, E61R, and L72G.
  • the IL-2 variant may have been substituted with Y45A, E61R, and L72G.
  • the IL-2 variant may be in a form in which four amino acids are substituted. Specifically, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, F42A, Y45A and E61R. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be substituted with R38A, F42A, Y45A, and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may have been substituted with R38A, F42A, E61R, and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 variant may be substituted with R38A, Y45A, E61R, and L72G. In addition, in one embodiment, the IL-2 mutant may have been substituted with F42A, Y45A, E61R, and L72G.
  • the IL-2 variant may have been substituted with R38A, F42A, Y45A, E61R and L72G.
  • one specific example of the IL-2 variant may be a substitution of any one combination selected from the following (a) to (d) combinations in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10:
  • IL-2 when IL-2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, it may have an amino acid substitution at a position complementary to SEQ ID NO: 10. In addition, even when IL-2 is a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, an amino acid at a position complementary to SEQ ID NO: 10 may be substituted.
  • the variant of IL-2 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, 22, 23 or 24.
  • the IL-2 variant may be characterized in that it has low toxicity in vivo.
  • the low toxicity in vivo may be a side effect caused by binding of IL-2 to the alpha chain (IL-2R ⁇ ) of the IL-2 receptor.
  • IL-2R ⁇ alpha chain
  • Various IL-2 variants have been developed in order to improve the side effects caused by the IL-2 and IL-2R ⁇ binding, and such IL-2 variants can be used those disclosed in U.S. Patent No. 5,229,109 and Korean Patent No. 10-1667096.
  • the mutant of IL-2 described in the present application has low binding power to the alpha chain (IL-2R ⁇ ) of the IL-2 receptor, and thus has a lower toxicity in vivo than that of wild-type IL-2.
  • CD80 is also called “B7-1", and is a membrane protein present in dendritic cells, activated B cells, and monocytes. CD80 provides co-stimulatory signals essential for T cell activation and survival. CD80 is known as a ligand for two different proteins, CD28 and CTLA-4, present on the surface of T cells. CD80 is composed of 288 amino acids, and may specifically have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • CD80 protein refers to a full-length CD80 or CD80 fragment.
  • CD80 fragment means a truncated form of CD80.
  • the CD80 fragment may be the extracellular domain of CD80.
  • amino acids 1 to 34 from the N-terminus, which is a signal sequence of CD80 may be excluded.
  • one specific example of the CD80 fragment may be a protein composed of amino acids 35 to 288 of SEQ ID NO: 11.
  • a specific example of the CD80 fragment may be a protein composed of amino acids 35 to 242 of SEQ ID NO: 11.
  • a specific example of the CD80 fragment may be a protein consisting of amino acids 35 to 232 of SEQ ID NO: 11.
  • a specific example of the CD80 fragment may be a protein composed of amino acids 35 to 139 of SEQ ID NO: 11.
  • a specific example of the CD80 fragment may be a protein consisting of amino acids 142 to 242 of SEQ ID NO: 11.
  • the CD80 fragment may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the IL-2 protein and the CD80 protein may be bound by a linker or a carrier.
  • the IL-2 or a variant thereof and the CD80(B7-1) or fragment thereof may be bound by a linker or a carrier.
  • the linker and the carrier may be used interchangeably.
  • the linker connects the two proteins.
  • One embodiment of the linker may include 1 to 50 amino acids, albumin or fragments thereof, or the Fc domain of an immunoglobulin.
  • the Fc domain of the immunoglobulin includes the heavy chain constant region 2 (CH2) and the heavy chain constant region 3 (CH3) of the immunoglobulin, and includes the variable region of the heavy and light chain and the light chain constant region 1 (CH1) of the immunoglobulin. It means a protein that doesn't.
  • the immunoglobulin may be IgG, IgA, IgE, IgD or IgM, preferably IgG4.
  • the Fc domain of wild-type immunoglobulin G4 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the Fc domain of the immunoglobulin may be a wild-type Fc domain as well as an Fc domain variant.
  • the term "Fc domain variant" used herein is different from the glycosylation pattern of the wild-type Fc domain, increased sugar chains compared to the wild-type Fc domain, decreased sugar chains compared to the wild-type Fc domain, or a sugar chain has been removed. (deglycosylated) form.
  • an aglycosylated Fc domain is also included.
  • the Fc domain or variant may have a sialic acid, fucosylation, or glycosylation whose content is controlled through culture conditions or genetic manipulation of the host.
  • the Fc domain variant may be an immunoglobulin in a form in which an Fc region of IgG, IgA, IgE, IgD or IgM is mixed.
  • the Fc domain variant may have a form in which some amino acids of the Fc domain are substituted with other amino acids.
  • One specific example of the Fc domain variant may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the fusion protein may have a structure in which CD80 and IL-2 proteins are linked or IL-2 and CD80 are linked to the N-terminus and C-terminus of the Fc domain as a linker (or carrier) (FIG. 1A).
  • the link between the N-terminus or C-terminus of the Fc domain and CD-80 or IL-2 may be optionally made by a linker peptide.
  • the fusion protein may be composed of the following structural formula (I) or (II):
  • the N' is the N-terminus of the fusion protein
  • X is a CD80 protein
  • Y is an IL-2 protein
  • linker (1) and linker (2) are peptide linkers
  • n and m are independently O or 1.
  • the fusion protein may be composed of structural formula (I).
  • the IL-2 protein is as described above.
  • the CD80 protein is as described above.
  • the IL-2 protein may be an IL-2 variant in which one to five amino acids are substituted compared to wild-type IL-2.
  • the CD80 protein may be a fragment in which up to about 34 amino acid residues are successively deleted (truncated) from the N-terminus or C-terminus of wild-type CD80.
  • the CD80 protein may be an extracellular immunoglobulin-like domain having activity to bind to T-cell surface receptors CTLA-4 and CD28.
  • the fusion protein may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 26, 28 or 30.
  • the fusion protein is 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 26, 28 or 30 , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • the identity may be determined through, for example, percent homology, homology comparison software such as BlastN software of the National Center of Biotechnology Information (NCBI).
  • a peptide linker (1) may be included between the CD80 protein and the Fc domain.
  • the peptide linker (1) may consist of 5 to 80 contiguous amino acids, 20 to 60 contiguous amino acids, or 25 to 50 contiguous amino acids, or 30 to 40 amino acids. In one embodiment, the peptide linker (1) may consist of 30 amino acids.
  • the peptide linker 1 may include at least one cysteine. Specifically, it may contain one, two or three cysteines.
  • the peptide linker (1) may be derived from a hinge of an immunoglobulin. In one embodiment, the peptide linker (1) may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the peptide linker (2) may consist of 1 to 50 contiguous amino acids, or 3 to 30 contiguous amino acids, or 5 to 15 amino acids.
  • the peptide linker (2) may be (G4S)n (here, n is an integer of 1 to 10). In this case, n in (G4S)n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the peptide linker (2) may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Another aspect of the present invention provides a dimer in which two fusion proteins including the IL-2 protein and the CD80 protein are bound.
  • the fusion protein comprising IL-2 or a variant thereof and CD80 or a fragment thereof is as described above.
  • the bond between the fusion proteins constituting the dimer may be made by a disulfide bond by a cysteine present in the linker, but is not limited thereto.
  • the fusion proteins constituting the dimer may be the same, but may be different fusion proteins.
  • the dimer may be a homodimer.
  • An embodiment of the fusion protein constituting the dimer may be a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • a regulatory T cell comprising culturing CD4 + CD25 + CD127- T cells in a medium containing IL-2 protein or a variant thereof and a fusion protein dimer comprising a CD80 protein or fragment thereof. It provides a way to cultivate.
  • the CD4 + CD25 + CD127- T cells may be obtained from blood cells.
  • CD4 + CD25 + CD127- T cells may be isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells).
  • the CD4+CD25+CD127- T cells may be obtained by specifically proliferating CD4+CD25+CD127- T cells in blood cells.
  • the CD4+CD25+CD127- T cells can be obtained from CD4+ cells after CD4-T cells are removed from PBMCs.
  • CD4+ T cells may be isolated using anti-CD4 antibodies, and in one embodiment, they were isolated using beads to which anti-CD4 antibodies were bound.
  • CD25+ T cells can be isolated using an anti-CD25+ antibody.
  • regulatory T cells can be isolated by isolating T cells that are CD4+, CD25+ and CD127-.
  • the medium may be a conventionally used medium. Preferably, it may be a medium optimized for CD4 + CD25 + CD127- T cells. In one embodiment, as disclosed in Tables 3 and 4, it may be a medium in which FBS, HEPES, L-Glutamine, and 2-Mercaptoethanol are added to RPMI1640 medium or TexMACS medium. In addition, the medium may further contain retinoic acid. In addition, the medium may further contain penicillin and/or streptomycin.
  • control CD4+ T cells may be cultured in the medium for 1 to 30 days and 2 to 20 days. In addition, it can be cultured for 3 to 10 days, and can be cultured for 4 to 6 days.
  • the CD4 + CD25 + CD127- T cells culturing CD4 + T cells may be obtained through the step of culturing CD25+ T cells.
  • the CD4+ T cells and CD25+ T cells may be obtained from blood cells, respectively.
  • each of the CD4+ T cells and CD25+ T cells may be isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells) or may be obtained by specifically proliferating CD4+ T cells or CD25+ T cells from blood cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CD4+ T cells or CD25+ T cells can be obtained after removing CD4- T cells or CD25- T cells from PBMCs.
  • CD4+ T cells may be isolated using anti-CD4 antibodies, and in one embodiment, they were isolated using beads to which anti-CD4 antibodies were bound.
  • CD25+ T cells can be isolated using an anti-CD25+ antibody.
  • regulatory T cells can be isolated by isolating T cells, which are CD4+, CD25+ and CD127-, from CD4+ T cells or CD25+ T cells.
  • composition for treating a regulated T cell mediated disease comprising the regulatory T cell obtained by the above-described method as an active ingredient.
  • the regulatory T cells obtained by the above culture method may have an increased expression level of Foxp3+.
  • Foxp3 is a protein also called scurfin.
  • the protein is a protein involved in the regulatory mechanism pathway of regulatory T cells, and is known as a marker of regulatory T cells.
  • the regulatory T cells obtained above may be CD4+CD25+CD127-Foxp3+ T cells.
  • regulatory T cell mediated disease refers to a disease induced by abnormality or deficiency of regulatory T cells, and may be specifically characterized as an inflammatory disease or an autoimmune disease.
  • the inflammatory disease is lupus, Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, fibromyositis, scleroderma, ankylosing spondylitis, Behcet's disease, Aphtha stomatitis, Gillian Barre syndrome, alopecia areata, dermatitis, Crohn's disease, colitis, nodular It may be characterized in that at least one selected from the group consisting of polyarteritis, recurrent polychondritis, and autoimmune thrombocytopenia.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, insulin-dependent childhood diabetes by pancreatic cell antibodies, alopecia areata, psoriasis, pemphigus, asthma, aphtha stomatitis, chronic thyroiditis, some acquired aplastic aplasticity.
  • Anemia primary cirrhosis, ulcerative colitis, Becce's disease, Crohn's disease, silicosis, asbestosis, IgA kidney disease, glomerulonephritis after streptococcal infection, Sjogren's syndrome, Gillian-Barre syndrome, dermatitis, multiple myositis, multiple sclerosis, Autoimmune hemolytic anemia, autoimmune encephalomyelitis, myasthenia gravis, Graves' hyperthyroidism, polyarteritis nodosa, ankylosing spondylitis, fibromyalitis, temporal arteritis, Wilson's disease, Fanconi syndrome, multiple myeloma, and systemic lupus erythematosus. It can be characterized by the above.
  • composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive for example, sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants, surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives.
  • organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymer or copolymer, polyethylene glycol polymer or copolymer and chemical derivatives thereof, and mixtures thereof can be used. However, it is not limited thereto.
  • dextran 40 for example, dextran 40, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, sodium metasulfate, and the like may be used.
  • the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbic acid palmitate, L-ascorb Chelating agents such as acid stearate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triamyl gallic acid, propyl gallic acid or sodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate, and the like can be used.
  • EDTA ethylenediamine tetraacetate
  • the suspending agent may be, for example, methylcellulose, polysorbate 80, hydroxyethylcellulose, gum arabic, tragantmal, sodium carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, and the like.
  • the tonicity agent for example, D-mannitol, sorbitol, and the like may be used.
  • the preservative for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol, and the like can be used.
  • a method for treating a regulatory T cell mediated disease comprising administering the regulatory T cells to an individual having a regulatory T cell mediated disease.
  • regulatory T cells and regulatory T cell mediated diseases are as described above.
  • a fusion protein comprising a human CD80 fragment, an Fc domain and an IL-2 variant, a signal peptide (SEQ ID NO: 1), a CD80 fragment (SEQ ID NO: 2), an Ig hinge (SEQ ID NO: 3) to which a linker is bound, Fc A fusion protein comprising a domain (SEQ ID NO: 4), a linker (SEQ ID NO: 5) and two amino acid-substituted IL-2 variants (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) in this order from the N-terminus
  • a polynucleotide containing the encoding nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) was synthesized through the Invitrogen GeneArt Gene Synthesis service of ThermoFisher Scientific, and loaded into the pcDNA3_4 vector.
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHO TM ) to express the fusion protein of SEQ ID NO: 9. After the vector was introduced, the culture medium was collected and cultured for 7 days in an environment at 37° C., 125 RPM, and 8% CO 2 to purify the fusion protein.
  • the purified fusion protein dimer was named "GI-101".
  • the fusion protein was bound under the conditions of 25 mM Tris, 25 mM NaCl, and pH 7.4. Then, it was eluted with 100 mM NaCl and 100 mM acetic acid at pH 3. After putting 20% of 1 M Tris-HCl of pH 9 into the collection tube, the fusion protein was collected. The collected fusion protein was changed by dialysis with PBS buffer for 16 hours.
  • a high concentration fusion protein was obtained by measuring absorbance at a wavelength of 280 nm over time using size exclusion chromatography using a TSKgel G3000SWXL column (TOSOH Bioscience).
  • the separated and purified fusion protein was subjected to SDS-PAGE under reducing (R) or non-reducing (NR) conditions, and stained with coomassie blue to confirm its purity (Fig. 1b).
  • Fig. 1c When detected using NanoDrop, it was confirmed that the fusion protein was contained at a concentration of 2.78 mg/ml.
  • the results analyzed using size exclusion chromatography are as shown in FIG. 1D.
  • a signal peptide SEQ ID NO: 1
  • Ig hinge SEQ ID NO: 38
  • Fc domain SEQ ID NO: 4
  • linker SEQ ID NO: 5
  • ThermoFisher a polynucleotide containing the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 45) encoding the fusion protein containing the amino acid-substituted IL-2 variant (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) from the N-terminus in this order
  • the polynucleotide was synthesized through Scientific's Invitrogen GeneArt Gene Synthesis service and loaded into the pcDNA3_4 vector.
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHOTM) to express the fusion protein of SEQ ID NO: 44. After the vector was introduced, the culture medium was collected and cultured for 7 days in an environment at 37° C., 125 RPM, and 8% CO 2 to purify the fusion protein dimer.
  • the purified fusion protein dimer was named "Fc-IL2v2".
  • the purification and collection of the fusion protein were performed in the same manner as in Preparation Example 1.
  • the separated and purified fusion protein was subjected to SDS-PAGE under reducing (R) or non-reducing (NR) conditions, and stained with Comasi Blue to confirm its purity (FIG. 3A ). As a result, it was confirmed that the fusion protein forms a dimer.
  • the results analyzed using size exclusion chromatography are as shown in FIG. 3B.
  • a fusion protein comprising an Fc domain and wild-type IL-2, signal peptide (SEQ ID NO: 1), Ig hinge (SEQ ID NO: 38), Fc domain (SEQ ID NO: 4), linker (SEQ ID NO: 5) and wild-type IL PcDNA3_4 by synthesizing a polynucleotide containing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 43) encoding a fusion protein containing -2 (SEQ ID NO: 43) in this order from the N-terminus through the Invitrogen GeneArt Gene Synthesis service of ThermoFisher Scientific Loaded into the vector.
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHOTM) to express the fusion protein of SEQ ID NO: 42. After the vector was introduced, the culture medium was collected and cultured for 7 days in an environment at 37° C., 125 RPM, and 8% CO 2 to purify the fusion protein dimer.
  • the purified fusion protein dimer was named "Fc-IL2wt”.
  • the purification and collection of the fusion protein were performed in the same manner as in Preparation Example 1.
  • the separated and purified fusion protein was subjected to SDS-PAGE under reducing (R) or non-reducing (NR) conditions, and stained with Comasi Blue to confirm its purity (FIG. 3C). As a result, it was confirmed that the fusion protein forms a dimer.
  • the results analyzed using size exclusion chromatography are as shown in FIG. 3D.
  • a signal peptide SEQ ID NO: 1
  • a CD80 fragment SEQ ID NO: 2
  • an Ig hinge to which a linker is bound SEQ ID NO: 3
  • Poly comprising an Fc domain (SEQ ID NO: 4), a linker (SEQ ID NO: 5) and IL-2 wild type (SEQ ID NO: 10) from the N-terminus to the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 41) encoding a fusion protein containing in this order
  • Nucleotides were synthesized by ThermoFisher Scientific's Invitrogen GeneArt Gene Synthesis service and loaded into pcDNA3_4 vector.
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHO TM ) to express the fusion protein of SEQ ID NO: 46. After the vector was introduced, the culture medium was collected and cultured for 7 days in an environment at 37° C., 125 RPM, and 8% CO 2 to purify the fusion protein dimer.
  • the purified fusion protein dimer was named "hCD80-Fc-IL2wt".
  • the fusion protein was bound under the conditions of 25 mM Tris, 25 mM NaCl, and pH 7.4. Then, it was eluted with 100 mM NaCl and 100 mM acetic acid at pH 3. After putting 20% of 1M Tris-HCl of pH 9 into the collection tube, the fusion protein was collected. The collected fusion protein was changed by dialysis with PBS buffer for 16 hours.
  • a high concentration fusion protein was obtained by measuring absorbance at a wavelength of 280 nm over time using size exclusion chromatography using a TSKgel G3000SWXL column (TOSOH Bioscience).
  • the separated and purified fusion protein was subjected to SDS-PAGE under reducing (R) or non-reducing (NR) conditions, and stained with coomassie blue to confirm its purity (FIG. 4A).
  • R reducing
  • NR non-reducing
  • FIG. 4B results analyzed using size exclusion chromatography are as shown in FIG. 4B.
  • a signal peptide SEQ ID NO: 1
  • a CD80 fragment SEQ ID NO: 2
  • a linker-bound Ig hinge SEQ ID NO: 3
  • an Fc domain SEQ ID NO: 4
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHO TM ) to express the fusion protein of SEQ ID NO: 40. After the vector was introduced, the culture medium was collected and cultured for 7 days in an environment at 37° C., 125 RPM, and 8% CO 2 to purify the fusion protein dimer.
  • the purified fusion protein dimer was named "hCD80-Fc".
  • the fusion protein was bound under the conditions of 25 mM Tris, 25 mM NaCl, and pH 7.4. Then, it was eluted with 100 mM NaCl and 100 mM acetic acid at pH 3. After putting 20% of 1 M Tris-HCl of pH 9 into the collection tube, the fusion protein was collected. The collected fusion protein was changed by dialysis with PBS buffer for 16 hours.
  • a high concentration fusion protein was obtained by measuring absorbance at a wavelength of 280 nm over time using size exclusion chromatography using a TSKgel G3000SWXL column (TOSOH Bioscience).
  • the separated and purified fusion protein was subjected to SDS-PAGE under reducing (R) or non-reducing (NR) conditions, and stained with coomassie blue to confirm its purity (FIG. 2A).
  • R reducing
  • NR non-reducing
  • FIG. 2B the analysis results using size exclusion chromatography are as shown in FIG. 2B.
  • Preparation Example 1 Composition for cultivation for culturing control T cells
  • a medium for culturing CD4+ cells was prepared in the following composition. At this time, after preparing the medium of the basic component, the additive components GI-101, GI-101WT, hCD80-Fc, Fc-IL-2v2 or Fc-IL-2wt were added before use.
  • CD4 + CD25 + CD127 - cell culture medium was prepared.
  • Example 1 Confirmation of the degree of regulatory T cell proliferation of fusion protein dimers including IL-2 protein and CD80 protein
  • Example 1.1 Preparation of beads for stimulation of regulatory T cell proliferation
  • beads for stimulating regulatory T cell proliferation using MACS GMP ExpAct Treg Kit (Cat#:170-076-119) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) bead) was prepared. Specifically, transfer the reagent in the MACS GMP ExpAct Treg Kit containing beads for proliferation stimulation of regulatory T cells to a new tube, wait for 1 minute in a magnet, and remove the supernatant to bead (bead) was separated. At this time, the reagent in the MACS GMP ExpAct Treg Kit was 1 ⁇ L per 2 ⁇ 10 5 cells. After separation of the beads, 0.5 mL to 1 mL of the CD4+ cell culture composition of Table 1 or Table 2 (including only the basic components) not containing any additional components was added to release the beads.
  • the number of cells of the purchased PBMC (Cat#: SER-PBMC-200-F) (Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA) was measured. Then, it centrifuged for 10 minutes at 300xg. Then, after removing the supernatant buffer, 80 ⁇ L of MACs buffer per 1 ⁇ 10 7 cell number was added to release the cell pellet. Thereafter, 20 ⁇ L of CD4 MicroBeads (Cat#: 130-045-101) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) per 1 ⁇ 10 7 cell number was dispensed, tapped, and sufficiently mixed. Then, it was reacted at 4°C to 8°C for 15 minutes.
  • MACs buffer For washing, 10 mL of MACs buffer was added and centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes. Then, after removing the supernatant, 500 ⁇ L of MACs buffer per 1 ⁇ 10 8 cell number was added to release the cell pellet. Thereafter, after preparing the LS column, 3 mL of MACs buffer was flowed. The cell suspension prepared above was passed through an LS column (Cat#: 130-042-401) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). 3 mL of MACs buffer was flowed 3 times so that the cells attached to the LS column could be sufficiently washed.
  • the LS column was separated from a magnet stand, and then 3 mL of MACs buffer was added and pressure was applied with a piston to recover CD4+ cells. Then, it centrifuged for 5 minutes at 300xg. Then, the number of cells was measured after removing the supernatant.
  • control T cell culture solution containing beads prepared in Example 1.1 was inoculated onto the CD4+ T cells isolated above.
  • the CD4+ cells prepared in Example 1.2 were seeded at 1 ⁇ 10 7 cells/mL, and GI-101 (50 nM), GI-101_WT (50 nM), and CD80-Fc dimers as additives.
  • Cells of Table 1 or Table 2 each containing a body (50 nM) + Fc-IL-2v2 dimer (50 nM) or CD80-Fc dimer (50 nM) + Fc-IL-2wt dimer (50 nM) CD4+ cells were cultured under the conditions of the culture composition.
  • the cells in the 6-well plate showed more than 80% confluency, they were subcultured into 25T flasks.
  • the cells in the 25T flask showed more than 80% confluency
  • cells were obtained when the cells in the 75T flask showed more than 80% confluency.
  • the CD4+ cells recovered in Example 1.3 were centrifuged for 5 minutes at 1,300 rpm, 4°C.
  • Example 1.4 The CD4 + CD25 + CD127- cells isolated in Example 1.4 were seeded in a 48-well plate at 3 ⁇ 10 5 cells/mL, and at the same time, 2 ⁇ 10 to stimulate the proliferation of regulatory T cells as in Example 1.1. Beads were isolated from 1 ⁇ L MACS GMP ExpAct Treg Kit (Cat#:170-076-119) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) per 5 cell count. After dissolving the isolated beads in the cell culture composition (0.5 mL to 1 mL) of Table 3 or Table 4 (including only the basic components) containing no additional components, CD4 + CD25 + CD127- obtained in Example 1.4 The cells were added to the seeded well plate.
  • GI-101 50 nM
  • GI-101_WT 50 nM
  • CD80-Fc 50 nM + Fc- CD4 + CD25 + CD127- cells were cultured under the conditions of the cell culture composition of Table 3 or Table 4 each containing IL-2wt (50 nM).
  • control T cell proliferation in the control T cell culture medium composition including the RPMI1640 medium are shown in Tables 5 and 6, and the cell viability is shown in Tables 6 and 7.
  • control T cell proliferation results in the culture composition containing the TexMACS medium are shown in Tables 7 and 8, and the cell viability in Tables 8 and 9.
  • Example 1.6 Confirmation of the ability to secrete immunosuppressive cytokines: interleukin-10
  • Example 1.5 In order to evaluate the IL-10 secretion ability of the regulatory T cells obtained in Example 1.5, the cell number was adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells/mL, and then the culture supernatant was obtained, followed by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) analysis. Performed.
  • the interleukin-10 secretion ability of cells cultured from the composition containing RPMI1640 medium is as shown in FIG. 10
  • the interleukin-10 secretion ability of the cells cultured from the composition containing TexMACS medium is as shown in FIG. 11. 10 and 11, it was confirmed that interleukin-10 was highly expressed from regulatory T cells in which GI-101 was added to the culture composition.
  • the number of cells of the purchased PBMC (Cat#: SER-PBMC-200-F) (Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA) was measured. Then, it centrifuged for 10 minutes at 300xg. Thereafter, after removing the supernatant buffer, 80 ⁇ L of MACs buffer per 1 ⁇ 10 7 cell number was added to release the cell pellet. Thereafter, 20 ⁇ L of CD4 MicroBeads (Cat#: 130-045-101) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) per 1 ⁇ 10 7 cell number was dispensed, tapped, and sufficiently mixed. Then, it was reacted at 4°C to 8°C for 15 minutes.
  • MACs buffer For washing, 10 mL of MACs buffer was added and centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes. Then, after removing the supernatant, 500 ⁇ L of MACs buffer per 1 ⁇ 10 8 cell number was added to release the cell pellet. Thereafter, after preparing the LS Column, 3 mL of MACs buffer was flowed. The cell suspension prepared above was passed through an LS column (Cat#: 130-042-401) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). 3 mL of MACs buffer was flowed 3 times so that the cells attached to the LS column could be sufficiently washed.
  • the LS column was separated from a magnet stand, and then 3 mL of MACs buffer was added and pressure was applied with a piston to recover CD4+ cells. Then, it centrifuged for 5 minutes at 300xg. After centrifugation, the supernatant was removed and the number of cells was measured.
  • Example 1.1 In order to stimulate the proliferation of regulatory T cells in the isolated CD4+ cells, 0.5 mL to 1 mL of the CD4+ cell culture composition of Table 1 or Table 2 (including only the basic component) containing no additional components was added to the above Example 1.1. As described above, the prepared beads were released, and the CD4+ cells isolated from the PBMC were inoculated.
  • the CD4+ cells prepared in Example 2.1 were seeded at 1 ⁇ 10 7 cells/mL, and GI-101 (3.2 nM/50 nM) and GI-101_WT (3.2 nM/50 nM) as additives. ), CD80-Fc dimer (3.2 nM/50 nM) + Fc-IL-2v2 dimer (3.2 nM/50 nM) or CD80-Fc dimer (3.2 nM/50 nM) + Fc-IL-2wt dimer CD4+ was cultured under the conditions of the cell culture composition of Table 1 or Table 2 each containing (3.2 nM/50 nM).
  • the CD4+ cells recovered in Example 2.2 were centrifuged for 5 minutes at 1,300 rpm, 4°C. In addition, the supernatant was removed, 1 mL of an Fc block (biolegend, cat#422302) diluted 1:200 in FACS buffer was added, and left on ice for 10 minutes. After that, 50 ul CD4-Pacific Blue (BioLegend, cat#317429), 50 ul CD25-PE/Cy7 (BioLegend, cat#356108), and 50 ul CD127-PE (BD, cat#557938) were added to the second sample. It was left on ice for 20 minutes.
  • Example 2.3 All CD4 + CD25 + CD127- cells isolated in Example 2.3 were seeded in a 24-well plate, and at the same time, 1 ⁇ L MACS GMP per 2 ⁇ 10 5 cells number to stimulate the proliferation of regulatory T cells as in Example 2.1.
  • Cell culture in Table 3 or Table 4 (basic ingredients only) without additional ingredients by separating beads from ExpAct Treg Kit (Cat#:170-076-119) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) Beads were released into the composition (0.5 mL to 1 mL). Then, the CD4+CD25+CD127- cells were added to the seeded well plate.
  • GI-101 (3.2 nM/50 nM), GI-101_WT (3.2 nM/50 nM), CD80-Fc dimer (3.2 nM/50 nM) + Fc-IL-2v2 dimer (3.2 nM / 50 nM) or CD80-Fc dimer (3.2 nM / 50 nM) + Fc-IL-2wt dimer (3.2 nM / 50 nM) containing CD4 + under the conditions of the cell culture composition of Table 3 or Table 4, respectively CD25+CD127- cells were cultured. When the cells in the 24-well plate showed more than 80% confluency, they were subcultured into a 12-well plate.
  • the cells in the 12-well plate showed more than 80% confluency, they were subcultured into a 6-well plate.
  • the cells in the 6-well plate showed more than 80% confluence, they were subcultured into 25T flasks.
  • the cells in the 25T flask showed more than 80% confluency, they were subcultured into the 75T flask.
  • the cell proliferation results in the culture composition containing RPMI1640 medium are shown in Table 9, Figs. 12a and 12b, and the cell viability is shown in Table 10, Figs. 13a and 13b.
  • the cell proliferation results in the culture composition containing the TexMACS medium are shown in Table 11, FIGS. 14A and 14B, and the cell viability in Table 12, FIGS. 15A and 15B.
  • the CD4+CD25+CD127- cells recovered in Example 2.4 were centrifuged for 5 minutes at 1,300 rpm, 4°C. In addition, the supernatant was removed, and 100 ul of the Fc block (biolegend, cat#422302) diluted 1:200 in FACS buffer was added and left on ice for 10 minutes, and an additional 2.5 ul CD4-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, cat #45-0048-42), 2.5 ul CD25-APC/Cy7 (BD, cat#557753), 2.5 ul CD127-Brilliant Violet 785 (Biolegend, cat#351330) and left on ice for 20 minutes.
  • FACS analysis results for the cell characteristics cultured from the RPMI1640 medium-containing composition are as shown in Figs. 16A to 16C, and the number of T cells expressing CD4 + CD25 + Foxp3 + confirmed in the culture conditions is shown in Table 13, Figs. Same as 17c.
  • the FACS analysis results for the cell characteristics cultured from the composition containing TexMACS medium are as shown in Figs. 18A to 18C, and the number of T cells expressing CD4 + CD25 + Foxp3 + confirmed in the culture conditions is Table 14 and Figs. 19A to 19C Is the same as
  • Example 2.4 In order to evaluate the IL-10 secretion ability of the regulatory T cells obtained in Example 2.4, the cells were cultured at 1 ⁇ 10 6 cells/mL, and then the culture supernatant was obtained and analyzed by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Was performed.
  • the interleukin-10 secretion ability of cells cultured from the composition containing RPMI1640 medium is shown in FIG. 20
  • the interleukin-10 secretion ability of cells cultured from the composition containing TexMACS medium is shown in FIG. 20 and 21, it was confirmed that interleukin-10 was highly expressed from regulatory T cells in which GI-101 was added to the culture composition.

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포를 효과적으로 증식시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재하에, CD4+, CD25+ 및 CD127- T 세포를 효과적으로 증식시킬 수 있다. 특히, 소정의 세포 배양 배지와 조합할 경우, 효과적으로 CD4+, CD25+ 및 CD127-와 같은 조절 T 세포를 특이적으로 증식시킬 수 있다. 또한, 상기 방법을 이용할 경우 종래 이용했던 IL-2를 이용한 배양법에 비해 조절 T 세포의 생존율이 현격히 증가함을 확인하였고, Foxp3+ 조절 T 세포의 수득량이 현저히 증가함을 확인하였다. 따라서, 이러한 증식 방법은 조절 T 세포를 이용한 세포 치료제 분야에 활용될 수 있다.

Description

조절 T 세포 배양용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 T 세포 배양을 위한 배양용 조성물 및 이를 이용한 조절 T 세포 배양 방법에 관한 것이다.
T 세포는 세포-매개 면역에서 중심적인 역할을 한다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 T 세포 표면에 존재하는 수용체에 의해, B 세포를 비롯한 다른 림프구와 구분될 수 있다. 또한, T 세포는 도움 T 세포(TH 세포), 세포독성 T 세포(TC 세포, 또는 CTL), 중앙 메모리 T 세포(TCM 세포) 및 이펙터 메모리 T 세포(TEM 세포)가 포함되는 메모리 T 세포(TM 세포), 내츄럴 킬러(Natural killer) T 세포(NKT 세포), 감마 델타 T 세포(γδT 세포), 및 조절 T 세포(Treg 세포)와 같이 다양한 종류의 T 세포를 포함한다.
이중, 조절 T 세포(Treg)는 다른 세포의 면역 응답을 억제하는 작용을 하는 T 세포이다. 예를 들어, Treg 세포는 면역 반응 동안 T 세포-매개 면역을 억제하며, 흉선의 음성 선별 과정에서 탈출한 자가-반응성 T 세포를 억제하는 역할을 한다. Treg 세포는 크게 자연 조절 T 세포(natural regulatory T cells, nTreg) 및 유도 조절 T 세포(induced regulatory T cells, iTreg)로 구분될 수 있다. CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T 세포로 알려진 자연 조절 T 세포는 흉선에서 생겨난다. 유도 조절 T 세포는 천연 발생 Treg 세포와 다수의 속성을 공유하지만, CD4+CD25-FoxP3- T 세포들로부터 CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T 세포로 전환되는 특징이 대표적인 차이점으로 알려져 있다.
이처럼 각종 자가면역체계의 이상에 의해 발생되는 질병과 관련하여, 조절 T 세포의 중요성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 1970년대 초 Gershon에 의해 억제 T 세포라는 개념을 도입하여 처음으로 제시된 이래(R K Gershon and K Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37), 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다. 특히, 1995년 Sakaguchi에 의해 CD25가 자연 발생 CD4+ 조절 T 세포의 중요한 표현형 마커로서 작용할 수 있음이 제시된 이래(S Sakaguchi et, al., J Immunol, 1995, 155: 1151-1164), 자가 항원(self-antigen)에 대한 말초 관용(peripheral tolerance)의 유도에 있어 조절 T 세포가 갖는 역할과 중요성에 대한 연구가 중점적으로 수행되었다.
조절 T 세포는 면역억제성 사이토카인으로 알려진 IL-10, TGF-β, IL-35 등을 분비할 수 있다고 알려져 있다(H Nishikawa et, al., Int. J. Cancer, 2010, 127: 759-767). 면역억제성 사이토카인을 분비하는 조절 T 세포는 IL-10 등을 분비하여 자가 면역 질환의 원인이 되는 항원 특이적 T 세포를 면역 관용성 항원 제시 세포로 유도함으로써, 면역학적으로 내성을 유도할 수 있음을 증명하는 연구가 진행되고 있다(S. Karumuthil-Melethil et, al., Diabetes, 2015, 64:1341-1357).
이와 같이 조절 T 세포의 자가면역 질환을 치료하는 용도는 많이 알려져 있지만, 이를 효과적으로 사용하기 위하여 증폭시킬 수 있는 구체적인 방법은 아직까지 부족한 상황이다.
따라서, 본 발명자들은 조절 T 세포를 효과적으로 배양하는 방법에 대해 연구한 결과, IL-2 단백질과 CD80 단백질을 한 분자 내에 포함하는 신규한 융합단백질 이량체가 조절 T 세포를 효과적으로 증식시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 조절 T 세포 배양용 조성물 또는 배지를 제공한다.
또한, IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 이용한 조절 T 세포 배양 방법을 제공한다.
또한, IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체가 포함된 배지에서 배양된 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 배양 조성물을 이용할 경우, T 세포를 효과적으로 증식시킬 뿐 아니라, 특히, 조절 T 세포를 효과적을 증식시킬 수 있다. 특히, 종래에 활용했던 IL-2를 이용한 배양법에 비해 조절 T 세포의 생존율이 현격히 증가함을 확인하였다. 뿐만 아니라, 수득된 조절 T 세포에서 Foxp3+ 발현량이 증가함을 확인하였다. 따라서, 이러한 증식 방법은 조절 T 세포를 이용한 세포 치료제 분야에 활용될 수 있다.
도 1a은 본 발명에서 사용된 융합단백질 이량체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 수득한 융합단백질 이량체(GI-101)를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 1c는 흡광도에 따른 융합단백질 이량체(GI-101)의 함량을 나타낸 것이다.
도 1d는 수득한 융합단백질 이량체(GI-101)를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 2a는 수득한 hCD80-Fc 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 2b는 수득한 hCD80-Fc 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 3a는 수득한 Fc-IL2v2 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 3b는 수득한 Fc-IL2v2 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 3c는 수득한 Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 3d는 수득한 Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 4a는 수득한 hCD80-Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 4b는 수득한 hCD80-Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 5는 융합단백질 이량체를 이용하여 Treg 세포를 배양하는 방법에 관한 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 RPMI1640 배지 포함 조성물에서 배양된 조절 T 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 7은 RPMI1640 배지 포함 조성물에서 배양된 조절 T 세포의 생존률을 나타낸 것이다.
도 8은 TexMACS 배지 포함 조성물에서 배양된 조절 T 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 9는 TexMACS 배지 포함 조성물에서 배양된 조절 T 세포의 생존률을 나타낸 것이다.
도 10은 RPMI1640 배지 포함 조성물을 이용하여 배양한 조절 T 세포의 IL-10 분비능을 나타낸 것이다.
도 11은 TexMACS 배지 포함 조성물을 이용하여 배양한 조절 T 세포의 IL-10 분비능을 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 최적화 공정에서 RPMI1640 배지를 포함한 조성물에서 배양시 증식된 조절 T 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 13a 및 도 13b는 최적화 공정에서 RPMI1640 배지를 포함한 조성물에서 배양시 조절 T 세포의 생존률을 나타낸 것이다.
도 14a 및 도 14b는 최적화 공정에서 TexMACS 배지를 포함한 조성물에서 배양시 조절 T 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 15a 및 도 15b는 최적화 공정에서 TexMACS 배지를 포함한 조성물에서 배양시 조절 T 세포의 생존률을 나타낸 것이다.
도 16a 내지 도 16c는 최적화 공정에서 RPMI1640 배지를 포함한 조성물에서 배양된 세포의 특성을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17a 내지 도 17c는 최적화 공정에서 RPMI1640 배지를 포함한 조성물에서 배양시 Foxp3가 발현된 조절 T 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 18a 내지 도 18c는 최적화 공정에서 TexMACS 배지를 포함한 조성물에서 배양된 세포의 특성을 FACS로 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19a 내지 도 19c는 최적화 공정에서 TexMACS 배지를 포함한 조성물에서 배양시 Foxp3가 발현된 조절 T 세포의 수를 나타낸 것이다.
도 20은 최적화 공정에서 RPMI1640 배지를 포함한 조성물에서 배양된 조절 T 세포의 IL-10 분비능을 나타낸 것이다.
도 21은 최적화 공정에서 TexMACS 배지를 포함한 조성물에서 배양된 조절 T 세포의 IL-10 분비능을 나타낸 것이다.
조절 T 세포 증식용 조성물 및 배지
본 발명의 일 측면으로, IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 조절 T 세포 증식용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 조절 T 세포 증식용 배지를 제공한다.
상기 조절 T 세포 증식용 배지는 T 세포 배양용 배지에 상기 IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체가 첨가된 배지일 수 있다. 이때, 상기 T 세포 배양용 배지는 아미노산(amino acids), 당류(sugars), 무기염(inorganic salts) 및 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 T 세포 배양용 배지는 아미노산, 당류, 무기염 및 비타민을 모두 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 추가적으로, FBS(Fetal Bovine Serum), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 단백질, 탄수화물, 머캅토에탄올, 성장인자를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 조절 T 세포 배양용 배지는 레티노익산(retinoic acid)을 더 포함할 수 있다. 일 구체예로는 상기 조절 T 세포 증식용 배지는 하기 표 3 또는 표 4의 기본 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포 배양용 배지"는 세포를 배양하기 위해 사용된 배지를 의미하며, 구체적으로 조절 T 세포, 보다 구체적으로 CD4+CD25+CD127- 세포를 배양하기 위한 배지를 의미한다. 시험관 내에서(in vitro) 세포 성장 및 생존을 위해 세포가 필요로 하는 성분을 함유하거나, 세포 성장 및 생존을 돕는 성분을 함유한다. 구체적으로, 상기 성분은 비타민, 필수 또는 비필수 아미노산, 및 미량 원소일 수 있다. 상기 배지는 세포, 바람직하게는 진핵세포, 더 바람직하게는 조절 T 세포, 보다 더 바람직하게는 CD4+CD25+CD127- T 세포 또는 CD4+CD25+Foxp3+ T 세포의 배양에 사용되는 배지일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 세포배양배지는 아미노산 성분, 비타민 성분, 무기염 성분, 기타 성분 및 정제수로 구성되며,
a) 상기 아미노산 성분은 글리신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-세린, L-시스테인, L-메티오닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-글루탐산, L-글루타민, L-리신, L-아르기닌, L-히스티딘, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, L-프롤린, β-알라닌, 膨-아미노부티르산, 오르니틴, 시트룰린, 호모세린, 트리요드티로신, 티록신 및 디옥시페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 글리신, L-알라닌, L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, L-히스티딘, L-라이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌 및 L-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 또는 이의 조합이며,
b) 상기 비타민 성분은 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, 염화콜린, i-이노시톨 및 아스코르브산으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 비타민 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아마이드 및 피리독신 하이드로클로라이드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 비타민 또는 이의 조합이며,
c) 상기 무기염 성분은 염화칼슘(CaCl2)(무수), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), 질산제이철 노나하이드레이트(Fe(NO3)3·9H2O) 및 탄산수소나트륨(NaHCO3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 무기염 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2)(무수) 및 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 무기염 또는 이의 조합이며,
d) 상기 기타 성분은 D-글루코즈 (덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 티미딘, 리놀레산, 리포산, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시시티딘 HCl 및 2'-데옥시구아노신으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 기타 성분 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 소듐 피루베이트일 수 있다.
e) 정제수는 상기 아미노산, 비타민, 무기염 및 기타 성분을 용해시키기 위해 사용되며, 1차 이상의 증류를 거쳐 수득되거나, 필터를 통해 정제된 물일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 세포배양배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10 또는 IL-17 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어, "T 세포"는 항원 특이적인 적응 면역을 주관하는 림프구의 하나를 의미한다. T 세포는 아직 항원을 만나지 못한 미접촉 T 세포(naive T cell)와, 항원을 만나 성숙한 T 세포, 및 기억 T 세포로 분류된다. 이때, 상기 성숙한 효과 T 세포는 도움 T 세포, 세포독성 T 세포 및 자연살상 T 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "도움 T 세포(helper T cell, 또는 Th cell)"는 다른 백혈구들의 분화 및 활성화를 조절함으로써 체액성 면역을 촉진하는 세포를 말한다. 세포 표면에 CD4 단백질을 가지고 있기 때문에, CD4+ T 세포라고도 한다. 도움 T 세포는 세부 기능에 따라 다시 Th1, Th2, Th17, Treg으로 분류될 수 있다. Th1 세포는 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)과 종양괴사인자 베타(tumor necrosis factor beta, TNF-β)를 분비함으로써 대식세포의 내부에서 엔도솜과 리소좀이 융합하여 엔도리소좀을 형성하도록 유도한다. 한편 Th2 세포는 여러 종류의 인터루킨(interleukin, IL)을 분비하여 B 세포가 형질 세포로 분화하도록 한다. Th17 세포는 인터루킨-17(IL-17)을 분비하여 호중성백혈구를 모이게 한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)"는 자연 조절 T 세포(natural regulatory T cells, nTreg) 또는 유도 조절 T 세포(induced regulatory T cells, iTreg)를 포함한다. 본 명세서에서 조절 T 세포는 CD4+CD25+ T 세포, CD4+CD25+CD127low/- T 세포 또는 CD4+CD25+Foxp3+ T 세포를 포함한다. 상기 조절 T 세포는 면역 반응을 억제함으로써 면역의 항상성을 유지하며 자가면역반응 등을 차단한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "세포독성 T 세포"는 그랜자임(granzyme)이나 퍼포린(perforin)과 같은 세포독성물질을 분비하여 바이러스에 감염된 세포나 종양 세포 등을 죽이는 세포이다. 세포 표면에 CD8 단백질을 가지고 있기 때문에 CD8 T 세포라고도 한다. 도움 T 세포와는 반대로 세포성 면역을 매개하여 바이러스 및 암세포를 제거한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "자연살상 T 세포"는 도움 T 세포 및 세포독성 T 세포에 비해 적은 비율로 분포하는 효과 T 세포의 하나를 의미한다. 자연살상 T 세포는 세포 표면에 T 세포와 같은 T 세포 항원수용체(T cell receptor, TCR)를 가지고 있으나, NK1.1과 같은 자연살해세포 특이적인 분자도 가지고 있다. 자연살상 T 세포는 감마인터페론, 인터루킨-4 등을 분비하여 면역 반응을 조절하는 역할을 한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "기억 T 세포"는 항원을 인지한 T 세포가 분화 및 선별 과정을 거친 뒤 장기간 생존하고 있다가 나중에 항원이 재차 침입하였을 때 빠르게 활성화되어 효과 T 세포의 기능을 할 수 있는 잠재적 능력을 가진 세포를 의미한다. naive T 세포가 항원을 만나 활성화된 상태의 세포, 또는 효과 T 세포가 인터루킨-7과 인터루킨-15의 영향을 받아 장기 생존 가능한 기억 T 세포로 분화하게 된다.
이때, 상기 IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체는 배양 배지 내에 1 nM 내지 2,000 nM 포함될 수 있다. 또한, 상기 이량체는 1 nM 내지 1,000 nM, 또는 1 nM 내지 500 nM로 포함될 수 있다. 또한, 상기 이량체는 2 nM 내지 300 nM, 5 nM 내지 100 nM, 10 nM 내지 80 nM, 20 nM 내지 70 nM, 또는 40 nM 내지 50 nM로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질 이량체는 배지 내에 1 nM, 3.2 nM, 10 nM, 50 nM로 포함될 수 있다.
IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 의미한다. 상기 IL-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-2는 야생형 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서는 IL-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-2 단백질" 혹은 "IL-2 폴리펩티드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-2, IL-2 단백질, IL-2 폴리펩티드, 및 IL-2 변이체는 예를 들어 IL-2 수용체(receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 IL-2의 일 구체예는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이때, 상기 IL-2는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-2는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 IL-2는 야생형 IL-2의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함하는 개념으로 이용될 수 있다.
또한, 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2 변이체"는 전장(full-length) IL-2 또는 상술한 IL-2의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-2 변이체는 야생형 IL-2 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-2 활성"은 예를 들어 IL-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 IL-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 또는 72번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 뿐만 아니라, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 N 말단의 일 부분이 결실된 형태일 경우, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, IL-2가 서열번호 35의 아미노산을 서열을 가질 경우에, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 35의 아미노산 서열에서 58번째, 62번째, 65번째, 81번째 또는 92번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이들은 각각 서열번호 10의 아미노산 서열의 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 잔기에 각각 해당한다. 일 구체예에 따르면, IL-2 활성이 유지되는 한, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 혹은 10개의 아미노산이 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 1개에서 5개까지의 아미노산이 치환될 수 있다.
일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번재, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 다섯 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 모두 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환에 의해 도입되는 "다른 아미노산"은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 단, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 상기 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째는 아르기닌으로 치환될 수 없으며, 42번째는 페닐알라닌으로 치환될 수 없고, 45번째는 티로신으로 치환될 수 없으며, 61번째는 글루탐산으로 치환될 수 없고, 72번째는 루신으로 치환될 수 없다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 아르기닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 알라닌으로 치환(R38A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 페닐알라닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 알라닌으로 치환(F42A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 티로신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 알라닌으로 치환(Y45A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 글루탐산을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 아르기닌으로 치환(E61A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 글리신으로 치환(L72G)될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데, 세 군데, 네 군데 또는 다섯 군데의 위치에서 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 F42A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 일 구체예는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 하기 (a) 내지 (d) 조합 중 선택되는 어느 하나의 조합의 치환이 일어난 것일 수 있다:
(a) R38A/F42A
(b) R38A/F42A/Y45A
(c) R38A/F42A/E61R
(d) R38A/F42A/L72G
이때, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 경우, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또한, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 단편인 경우에도, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 6, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 생체 내에서 낮은 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합하여 유발되는 부작용일 수 있다. 상기 IL-2와 IL-2Rα 결합에 의한 부작용을 개선시키기 위해서 다양한 IL-2 변이체가 개발되었으며, 이러한 IL-2 변이체는 미국특허 제5,229,109호 및 대한민국특허 제10-1667096호에 개시된 것들을 사용할 수 있다. 특히, 본 출원에서 기술되는 IL-2의 변이체는 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합력이 낮아 생체내 독성이 야생형 IL-2에 비해 낮다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80"은 "B7-1"로도 불리며, 수지상세포, 활성화된 B세포 및 단핵구에 존재하는 막단백질이다. CD80은 T 세포의 활성화와 생존에 필수적인 공자극 신호를 제공한다. CD80은 T 세포 표면에 존재하는 서로 다른 두 단백질인 CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드로 알려져 있다. CD80은 288개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 구체적으로 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 "CD80 단백질"은 전장 CD80 또는 CD80 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80 단편"이란, CD80의 절단형을 의미한다. 또한, 상기 CD80 단편은 CD80의 세포외도메인일 수 있다. CD80 단편의 일 구체예로는 CD80의 신호서열인 N-말단으로부터 1번째 내지 34번째의 아미노산이 제외된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 288번째의 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 232번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 139번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 142번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 상기 일 실시예로 CD80 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질은 링커 혹은 캐리어(carrier)에 의해 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 상기 CD80(B7-1) 또는 이의 단편은 링커 혹은 캐리어에 의해 결합된 것일 수 있다. 본 명세서에서 링커와 캐리어는 호환적으로 사용되기도 한다.
상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다. 이때, 야생형 면역글로불린 G4의 Fc 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인 뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 함량이 조절된 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
융합단백질은 Fc 도메인을 링커(혹은 캐리어)로 하여 이의 N-말단과 C-말단에 각각 CD80과 IL-2 단백질이 연결되거나 혹은 IL-2와 CD80이 연결된 구조를 가질 수 있다(도 1a). Fc 도메인의 N-말단 혹은 C-말단과 CD-80 혹은 IL-2의 연결은 임의적으로 링커 펩타이드에 의해 이루어질 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C' (II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 CD80 단백질이고,
상기 Y는 IL-2 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
바람직하게는, 상기 융합단백질은 구조식 (I)로 이루어진 것일 수 있다. 상기 IL-2 단백질은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 CD80 단백질은 상술한 바와 같다. 일 구체예에 따르면, IL-2 단백질은 야생형 IL-2와 비교하여 하나에서 다섯개까지의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체일 수 있다. CD80 단백질은 야생형 CD80의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 연속적으로 약 34개까지의 아미노산 잔기가 결실된(truncated) 단편일 수 있다. 혹은 CD80 단백질은 T-세포 표면 수용체(T cell surface receptors) CTLA-4와 CD28에 결합하는 활성을 갖는 세포외 면역글로불린-유사 도메인일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software와 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
상기 CD80 단백질과 Fc 도메인의 사이에는 펩타이드 링커(1)가 포함될 수 있다. 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다. 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다. 상기 이량체를 구성하는 융합단백질의 일 실시예는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
조절 T 세포 배양 방법
본 발명의 또 다른 측면으로는 IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체가 포함된 배지에서 CD4+CD25+CD127- T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 CD4+CD25+CD127- T 세포는 혈액세포에서 수득된 것일 수 있다. 이때, CD4+CD25+CD127- T 세포는 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)에서 분리된 것일 수 있다. 또는 상기 CD4+CD25+CD127- T 세포는 혈액세포에서 CD4+CD25+CD127- T 세포를 특이적으로 증식시켜 수득한 것일 수 있다. 또는, 상기 CD4+CD25+CD127- T 세포는 PBMC에서 CD4- T 세포를 제거한 후, CD4+ 세포로부터 수득할 수 있다. 또한, CD4+ T 세포의 분리는 항 CD4 항체를 이용해 분리될 수 있으며, 일 실시예에서는 항 CD4 항체가 결합된 비드를 이용하여 분리하였다. 또한, CD25+ T 세포의 분리는 항 CD25+ 항체를 이용해 분리될 수 있다. 특히, CD4+, CD25+ 및 CD127-인 T 세포를 분리함으로써 조절 T 세포를 분리할 수 있다.
상기 배지는 종래에 사용되고 있는 배지일 수 있다. 바람직하게는 CD4+CD25+CD127- T 세포에 최적화된 배지일 수 있다. 일 구체예에서는 표 3 및 표 4에 개시된 바와 같이, RPMI1640 배지 또는 TexMACS 배지에 FBS, HEPES, L-Glutamine 및 2-Mercaptoethanol을 첨가한 배지일 수 있다. 또한, 상기 배지는 레티노익산(Retinoic acid)을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지는 페니실린(Penicillin) 및/또는 스트렙토마이신(Streptomycin)을 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 조절 CD4+ T 세포를 상기 배지에, 1일 내지 30일, 2일 내지 20일 배양할 수 있다. 또한, 3일 내지 10일 배양할 수 있으며, 4일 내지 6일 배양할 수 있다.
한편, 상기 CD4+CD25+CD127- T 세포는 CD4+ T 세포를 배양하는 단계; 또는 CD25+ T 세포를 배양하는 단계를 통해 수득된 것일 수 있다.
이때, 상기 CD4+ T 세포 및 CD25+ T 세포는 각각 혈액세포에서 수득된 것일 수 있다. 이때, CD4+ T 세포 및 CD25+ T 세포 각각은 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)에서 분리된 것이거나 혈액세포에서 CD4+ T 세포 또는 CD25+ T 세포를 특이적으로 증식시켜 수득한 것일 수 있다. 또는, PBMC에서 CD4- T 세포 또는 CD25- T 세포를 제거한 후 CD4+ T 세포 또는 CD25+ T 세포를 수득할 수 있다. 또한, CD4+ T 세포의 분리는 항 CD4 항체를 이용해 분리될 수 있으며, 일 실시예에서는 항 CD4 항체가 결합된 비드를 이용하여 분리하였다. 또한, CD25+ T 세포의 분리는 항 CD25+ 항체를 이용해 분리될 수 있다. 특히, CD4+ T 세포 또는 CD25+ T 세포로부터 CD4+, CD25+ 및 CD127-인 T 세포를 분리함으로써 조절 T 세포를 분리할 수 있다.
수득된 조절 T 세포 및 이의 용도
본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 배양 방법에 의해 수득된 조절 T 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 상술한 방법에 의해 수득된 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환 치료용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 배양 방법에 의해 수득된 조절 T 세포는 Foxp3+의 발현량이 증가된 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "Foxp3"는 스컬핀(scurfin)이라고도 불리우는 단백질이다. 상기 단백질은 조절 T 세포의 조절 기작 경로에 관여하는 단백질로서, 조절 T 세포의 마커로 알려져 있다. 바람직하게, 상기에서 수득된 조절 T 세포는 CD4+CD25+CD127-Foxp3+ T 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “조절 T 세포 매개성 질환”은 조절 T 세포의 이상 또는 결핍에 의하여 유도되는 질환을 의미하며, 구체적으로는 염증성 질환 또는 자가면역성 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 염증성 질환은 루푸스, 쇼그렌증후군, 류마티스 관절염, 섬유근염, 경피증, 강직성 척추염, 베체트병, 아프타 구내염, 길리안바레 증후군, 원형탈모증, 피부근염, 크론병, 대장염, 결절성 다발 동맥염, 재발성 다발 연골염 및 자가면역 혈소판 감소증으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한 본 발명의 일 구체예로, 상기 자가면역성 질환은 류머티스성 관절염, 전신성 경피증, 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 건선, 천포창, 천식, 아프타 구내염, 만성 갑상선염, 일부 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 실리코시스, 아스베스토시스, IgA 신장질환, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염, 쇼그렌증후군, 길리안-바레증후군, 피부근염, 다발성 근염, 다발성 경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증, 그레이브씨 갑상선 항진증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 측두동맥염, 윌슨병, 판코니증후군, 다발성 골수종 및 전신성 홍반성 루푸스로 이루어진 군에서 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가물 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제, 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 또한, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그 화학적 유도체, 그리고 이들의 혼합조성물을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 안정제로는 예를 들어, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 상기 산화방지제로는 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산 토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 사용할 수 있다. 상기 현탁제는 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 등을 사용할 수 있다. 상기 등장화제로는 예를 들어, D-만니톨, 소르비톨 등을 사용할 수 있다. 상기 보존제로는 예를 들어, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산 에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 사용할 수 있다.
수득된 조절 T 세포를 이용한 치료 방법
본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 조절 T 세포를 조절 T 세포 매개성 질환을 가지고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환 치료 방법을 제공한다. 이때, 조절 T 세포 및 조절 T 세포 매개성 질환은 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 조절 T 세포 매개성 질환의 치료를 위한 상기 조절 T 세포의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. hCD80-Fc-IL-2 변이체(2M)의 제조: GI-101
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 8)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 9의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "GI-101"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1 M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비-환원(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 1b). NanoDrop을 사용하여 검출시 2.78 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다(도 1c). 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 1d에 나타난 바와 같다.
제조예 2. Fc-IL-2 변이체(2M) 이량체의 제조: Fc-IL-2v2
Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), Ig 힌지(서열번호 38), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 45)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 44의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "Fc-IL2v2"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 3a). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 3b에 나타낸 바와 같다.
제조예 3. Fc-IL-2 이량체의 제조: Fc-IL-2wt
Fc 도메인 및 야생형 IL-2를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), Ig 힌지(서열번호 38), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 야생형 IL-2(서열번호 10)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 43)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 42의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "Fc-IL2wt"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 3c). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 3d에 나타낸 바와 같다.
제조예 4. hCD80-Fc-IL-2 야생형 이량체의 제조: hCD80-Fc-IL-2wt
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 IL-2 야생형 단백질을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-2 야생형(서열번호 10)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 41)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 46의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "hCD80-Fc-IL2wt"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 4a). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 4b에 나타낸 바와 같다.
제조예 5. hCD80-Fc 이량체의 제조: hCD80-Fc
인간 CD80 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3) 및 Fc 도메인(서열번호 4)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 39)를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 40의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "hCD80-Fc"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1 M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 2a). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 2b에 나타낸 바와 같다.
준비예 1. 조절 T 세포 배양을 위한 배양용 조성물
준비예 1.1. CD4+ 세포 배양 조성물
하기와 같은 조성으로 CD4+ 세포 배양용 배지를 제조하였다. 이때, 기본성분의 배지를 제조한 후, 첨가성분인 GI-101, GI-101WT, hCD80-Fc, Fc-IL-2v2 또는 Fc-IL-2wt을 사용전 첨가하였다.
성분(Component) 용량 최종 농도
성분명 제조사 Cat.#
기본 성분 RPMI1640 medium Welgene LM 011-01 to 500 mL 　
FBS Hyclone SH30084.03 50 mL 10%
HEPES Welgene BB 001-01 5 mL 10 mM
Penicillin & Streptomycin Welgene LS 202-02 5 mL Penicillin: 100 U/ml
Streptomycin: 100 μg/ml
Sodium pyruvate Welgene LS 013-01 5 mL 1 mM
MEM Non-Essential Amino Acids Solution GIBCO 11140050 5 mL 1 mM
L-Glutamine GIBCO 25030149 5 mL 2 mM
2-Mercaptoethanol GIBCO 21985-023 0.5 mL 55 μM
첨가 성분 GI-101 GI-Innovation - 사용 전
즉시 첨가		 3.2 nM, 50 nM
GI-101_WT GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
hCD80-Fc GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2v2 GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2wt GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
성분(Component) 용량 최종 농도
성분명 제조사 Cat.#
기본 성분 TexMACS medium Miltenyi Biotec 170-076-307 to 1000 mL 　
Human AB serum Sigma H4522 50 mL 5%
Penicillin& Streptomycin Welgene LS 202-02 10 mL 100 U/ml (Penicillin) 및
100 μg/ml (Streptomycin)
첨가 성분 GI-101 GI-Innovation - 사용 전
즉시 첨가		 3.2 nM, 50 nM
GI-101_WT GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
hCD80-Fc GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2v2 GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2wt GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
준비예 1.2. CD4+CD25+CD127- 세포 배양 조성물
하기와 같은 CD4+CD25+CD127- 세포 배양용 배지를 제조하였다.
성분(Component) 용량 최종 농도
성분명 제조사 Cat.#
기본 성분 RPMI1640 medium Welgene LM 011-01 to 500 mL 　
FBS Hyclone SH30084.03 50 ml 10%
HEPES Welgene BB 001-01 5 mL 10 mM
Penicillin & Streptomycin Welgene LS 202-02 5 mL Penicillin: 100 U/ml
Streptomycin: 100 μg/ml
Sodium pyruvate Welgene LS 013-01 5 mL 1 mM
MEM Non-Essential Amino Acids Solution GIBCO 11140050 5 mL 1 mM
L-Glutamine GIBCO 25030149 5 mL 2 mM
2-Mercaptoethanol GIBCO 21985-023 0.5 mL 55 μM
첨가 성분 GI-101 GI-Innovation - 사용 전
즉시 첨가		 3.2 nM, 50 nM
GI-101_WT GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
hCD80-Fc GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2v2 GI-Innovation - 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2wt GI-Cell - 3.2 nM, 50 nM
성분(Component) 용량 최종 농도
성분명 제조사 Cat.#
기본 성분 TexMACS medium Miltenyi Biotec 170-076-307 to 1000 mL 　
Human AB serum Sigma H4522 50 mL 5%
Penicillin& Streptomycin Welgene LS 202-02 10 mL 100 U/ml (Penicillin) 및
100 ㎍/ml (Streptomycin)
첨가 성분 GI-101 GI-Innovation 　- 사용 전
즉시 첨가		 3.2 nM, 50 nM
GI-101_WT GI-Cell 　- 3.2 nM, 50 nM
hCD80-Fc GI-Cell 　- 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2v2 GI-Cell 　- 3.2 nM, 50 nM
Fc-IL-2wt GI-Cell 　- 3.2 nM, 50 nM
실시예 1. IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체의 조절 T 세포 증식 정도 확인
실시예 1.1. 조절 T 세포 증식 자극용 비드 제조
분리된 CD4+ 세포에서 조절 T 세포의 증식을 자극하기 위하여, MACS GMP ExpAct Treg Kit(Cat#:170-076-119)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 조절 T 세포 증식 자극용 비드(bead)를 준비하였다. 구체적으로, 조절 T 세포의 증식 자극용 비드가 포함된 MACS GMP ExpAct Treg Kit 내 시약을 새로운 튜브(tube)에 옮겨 주고, 상기 튜브를 마그넷(magnet)에서 1분 동안 대기 후 상층액을 제거하여 비드(bead)를 분리하였다. 이때, MACS GMP ExpAct Treg Kit 내 시약은 2×105개의 세포수 당 1 μL를 사용하였다. 비드 분리 후, 첨가 성분을 포함하지 않는 표 1 또는 표 2(기본 성분만 포함)의 CD4+ 세포 배양 조성물을 0.5 mL 내지 1 mL 추가하여 비드를 풀어주었다.
실시예 1.2. CD4+ T 세포의 분리
구입한 PBMC(Cat#: SER-PBMC-200-F)(Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA)의 세포수를 측정하였다. 그 후, 300×g로 10분간 원심분리하였다. 그 후, 상층 버퍼액 제거 후 1×107 세포수 당 80 μL의 MACs 버퍼를 추가하여 세포 펠렛을 풀어주었다. 그 후, 1×107 세포수 당 20 μL의 CD4 MicroBeads(Cat#: 130-045-101)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 분주하고 탭핑하여 충분히 섞어주었다. 그 후, 4℃ 내지 8℃에서 15분간 반응시켰다.
세척을 위해 10 mL의 MACs 버퍼를 추가 후 300×g로 10 분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액 제거 후 1×108 세포수 당 500 μL의 MACs buffer를 추가하여 세포 펠렛(Cell pellet)을 풀어주었다. 그 후, LS Column을 준비 후 3 mL의 MACs 버퍼(buffer)를 흘려주었다. 상기에서 준비된 세포 현탁액을 LS column(Cat#: 130-042-401)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에 통과시켜주었다. LS Column에 붙어있는 세포(Cell)가 충분히 세척될 수 있도록 3 mL의 MACs 버퍼를 3회 흘려주었다. 그 후, LS column을 마그넷 스탠드(Magnet stand)에서 분리 후 3 mL의 MACs 버퍼를 넣고 피스톤으로 압력을 주어 CD4+ 세포를 회수하였다. 그 후, 300×g 로 5분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액 제거 후 세포수를 측정하였다.
또한, 실시예 1.1에서 준비한 비드가 포함된 조절 T 세포 배양액을 상기에서 분리한 CD4+ T 세포에 접종하였다.
실시예 1.3. CD4+ T 세포 배양
6-웰 플레이트에 실시예 1.2에서 준비된 CD4+ 세포를 1×107 cells/mL로 파종(seeding) 하고, 첨가물질로 GI-101(50 nM), GI-101_WT(50 nM), CD80-Fc 이량체(50 nM)+Fc-IL-2v2 이량체(50 nM) 또는 CD80-Fc 이량체(50 nM)+Fc-IL-2wt 이량체(50 nM)를 각각 포함하는 표 1 또는 표 2의 세포 배양 조성물 조건 하에 CD4+ 세포를 배양하였다. 6-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시(confluency)를 나타낼 때 25T 플라스크로 계대 배양하였다. 25T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 75T 플라스크로 계대 배양하였다. 75T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 최종적으로 세포를 수득하였다.
실시예 1.4. CD4+CD25+CD127- 세포 분리
실시예 1.3에서 회수한 CD4+ 세포를 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 또한, 상층액을 제거하고 1:200으로 FACS 버퍼에 희석한 Fc block(biolegend, cat#422302) 1 mL을 넣고 얼음에 10분간 방치한 후, 50 ul CD4-Pacific Blue(BioLegend, cat#317429), 50 ul CD25-PE/Cy7(BioLegend, cat#356108), 50 ul CD127-PE(BD, cat#557938)을 넣고 얼음에 20분간 방치하였다. 그 후, 4 mL FACS 버퍼를 추가로 넣고 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액 제거 후 FACS 버퍼를 3 mL 넣고, 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 이후, 상층액 제거하고 FACS 버퍼 3 mL에 세포를 풀어주었다. 마지막으로, BD FACS Aria를 이용하여 CD4+CD25+CD127- 세포를 분리하였다.
실시예 1.5. CD4+CD25+CD127- 세포 배양
상기 실시예 1.4에서 분리된 CD4+CD25+CD127- 세포를 3×105 cells/mL로 48-웰 플레이트에 파종하고, 이와 동시에 실시예 1.1과 같이 조절 T 세포의 증식을 자극하기 위해 2×105개의 세포수 당 1 μL MACS GMP ExpAct Treg Kit(Cat#:170-076-119)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로부터 비드(beads)를 분리하였다. 상기 분리한 비드를 첨가 성분을 포함하지 않는 표 3 또는 표 4(기본 성분만 포함)의 세포 배양 조성물(0.5 mL 내지 1 mL)에 풀어준 다음, 실시예 1.4에서 수득한 CD4+CD25+CD127- 세포를 파종한 웰 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 첨가물질로 GI-101(50 nM), GI-101_WT(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL-2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL-2wt(50 nM)을 각각 포함하는 표 3 또는 표 4의 세포 배양 조성물 조건 하에 CD4+CD25+CD127- 세포를 배양하였다.
배양 시, 48-웰 플레이트 상에서 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 24-웰 플레이트로 계대 배양하였다. 24-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 12-웰 플레이트로 계대 배양하였다. 12-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 6-웰 플레이트로 계대 배양하였다. 6-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 25T 플라스크로 계대 배양하였다. 25T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 75T 플라스크로 계대 배양하였다. 175T 플라스크로 계대 배양 후 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼때 최종 수득하였다.
그 결과, RPMI1640 배지를 포함한 조절 T 세포 배양 배지 조성물에서 조절 T 세포 증식 결과는 표 5 및 도 6, 세포 생존률은 표 6 및 도 7과 같다. 또한 TexMACS 배지 포함 배양 조성물에서 조절 T 세포 증식 결과는 표 7 및 도 8, 세포 생존률은 표 8 및 도 9에 나타내었다.
총 세포수(×106)
배양 조성물 첨가물질 CD4+CD25+CD127- 세포수
0일
(파종)		 3일 5일 7일 9일 12일
50nM GI-101 0.3 0.26 1.3 1.6 3 11.7
GI-101 WT 0.3 0.23 1.3 1.5 2.1 8.4
hCD80-Fc+Fc-IL-2_v2 0.3 0.25 1 1.4 3.2 10.3
hCD80-Fc+Fc-IL-2_wt 0.3 0.3 1.2 1.5 1.9 9.36
배양 조성물 첨가물질 CD4+CD25+CD127- FACS 세포 생존률
3일 5일 7일 9일 12일
50nM GI-101 71 91 93 94 91
GI-101 WT 70 94 94 96 92
hCD80-Fc+Fc-IL-2_v2 58 90 90 95 92
hCD80-Fc+Fc-IL-2_wt 64 94 93 96 90
총 세포수(×106)
배양 조성물 첨가물질 CD4+CD25+CD127- 세포수
0일
(파종)		 3일 5일 7일 9일 12일
50nM GI-101 0.3 0.8 2.9 3 8.4 10.6
GI-101 WT 0.3 0.5 1.1 0.8 1.8 2
hCD80-Fc+Fc-IL-2_v2 0.3 0.7 2.7 2.4 8 9.6
hCD80-Fc+Fc-IL-2_wt 0.3 0.7 2.9 2.4 5.4 7.3
배양 조성물 첨가물질 CD4+CD25+CD127- FACS 세포 생존률
3일 5일 7일 9일 12일
50nM GI-101 92 88 95 93 88
GI-101 WT 91 73 88 89 90
hCD80-Fc+Fc-IL-2_v2 88 88 94 94 89
hCD80-Fc+Fc-IL-2_wt 89 90 94 93 88
실시예 1.6. 면역 억제성 사이토카인 분비능 확인: 인터루킨-10
상기 실시예 1.5에서 수득된 조절 T 세포의 IL-10 분비능을 평가하기 위하여 세포수를 1×106 cells/mL으로 맞춰 배양한 후 배양 상층액을 수득하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)　분석을 수행하였다.
먼저, Human IL-10 ELISA Kit(Invitrogen, Cat# KAC1321)의 인큐베이션 버퍼를 100 ul씩 마이크로플레이트(micro plate)에 분주한 후, 칼리브레이션(calibration), 컨트롤(control) 또는 조절 T 세포 배양 상층액 샘플(sample)을 각각 100 ul씩 넣어 분주하였다. 그 후, 마이크로플레이트를 접착 필름(Adhesive film)으로 덮고 쉐이커(shaker)에서 2시간 동안 실온(18℃ 내지 25℃)에서 700 rpm으로 쉐이킹하며 반응시켰다. 그 후, 웰(well) 당 약 150 μL 세척 버퍼로 마이크로웰 스트립(microwell strip)을 3회 세척하였다.
세척 후에, 표본 희석제(Specimen Diluent)를 100 ul씩 넣어주었다. 그 후, anti-IL-10-HRP를 50 ul 넣어준 후, 2시간 동안 실온에서 700 rpm으로 쉐이킹하며 반응시킨 뒤, 웰 당 약 150 μL 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 세척 후, TMB를 100 ul씩 넣어 주고, 15분 동안 실온에서 반응시킨 다음, 100 ul 스탑 솔루션(stop solution)을 넣어 반응을 종료하였다. 그 후, 450 nm를 사용하여 각 마이크로웰의 형광 값을 측정하였다.
그 결과, RPMI1640 배지 포함 조성물로부터 배양된 세포의 인터루킨-10 분비능은 도 10과 같으며, TexMACS 배지 포함 조성물로부터 배양된 세포의 인터루킨-10 분비능은 도 11과 같다. 도 10 및 도 11를 통해 GI-101을 배양 조성물에 첨가한 조절 T 세포들로부터 인터루킨-10이 높게 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 최적화 배양 공정에서 GI-101에 의한 조절 T 세포 증식 확인
실시예 2.1. CD4+ T 세포 분리
구입한 PBMC(Cat#: SER-PBMC-200-F)(Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA)의 세포수를 측정하였다. 그 후, 300×g로 10분간 원심분리하였다. 그후, 상층 버퍼액 제거 후 1×107 세포수 당 80 μL의 MACs 버퍼를 추가하여 세포 펠렛을 풀어주었다. 그 후, 1×107 세포수 당 20 μL의 CD4 MicroBeads(Cat#: 130-045-101)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 분주하고 탭핑하여 충분히 섞어주었다. 그 후, 4℃ 내지 8℃에서 15분간 반응시켰다.
세척을 위해 10 mL의 MACs 버퍼를 추가 후 300×g로 10분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액 제거 후 1×108 세포수 당 500 μL의 MACs buffer를 추가하여 세포 펠렛을 풀어주었다. 그 후, LS Column을 준비 후 3 mL의 MACs 버퍼를 흘려주었다. 상기에서 준비된 세포 현탁액을 LS column(Cat#: 130-042-401)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에 통과시켜주었다. LS Column에 붙어있는 세포가 충분히 세척될 수 있도록 3 mL의 MACs 버퍼를 3회 흘려주었다. 그 후, LS column을 마그넷 스탠드(Magnet stand)에서 분리 후 3 mL의 MACs 버퍼를 넣고 피스톤으로 압력을 주어 CD4+ 세포를 회수하였다. 그 후, 300×g로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 세포수를 측정하였다.
상기 분리된 CD4+ 세포에서 조절 T 세포의 증식을 자극하기 위하여, 첨가 성분을 포함하지 않는 표 1 또는 표 2(기본 성분만 포함)의 CD4+ 세포 배양 조성물을 0.5 mL 내지 1 mL 추가하여 상기 실시예 1.1과 같이 분리하여 준비된 비드를 풀어주고, 이를 상기 PBMC로부터 분리된 CD4+ 세포에 접종하였다.
실시예 2.2. CD4+ T 세포 배양
6-웰 플레이트에 실시예 2.1에서 준비된 CD4+ 세포를 1×107 cells/mL로 파종(seeding)하고, 첨가물질로 GI-101(3.2 nM/50 nM), GI-101_WT(3.2 nM/50 nM), CD80-Fc 이량체(3.2 nM/50 nM)+Fc-IL-2v2 이량체(3.2 nM/50 nM) 또는 CD80-Fc 이량체(3.2 nM/50 nM)+Fc-IL-2wt 이량체(3.2 nM/50 nM)를 각각 포함하는 표 1 또는 표 2의 세포 배양 조성물 조건 하에 CD4+를 배양하였다. 6-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 25T 플라스크로 계대 배양하였다. 25T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 75T 플라스크로 계대 배양하였다. 75T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 최종적으로 세포를 수득하였다.
실시예 2.3. CD4+CD25+CD127- T 세포 분리
실시예 2.2에서 회수한 CD4+ 세포를 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 또한, 상층액을 제거하고 1:200으로 FACS 버퍼에 희석한 Fc block(biolegend, cat#422302) 1 mL을 넣고 얼음에 10분간 방치하였다. 그 후, 50 ul CD4-Pacific Blue(BioLegend, cat#317429), 50 ul CD25-PE/Cy7(BioLegend, cat#356108), 50 ul CD127-PE(BD, cat#557938)을 2번 샘플에 넣고 얼음에 20분간 방치하였다.
그 후, 4 mL FACS 버퍼를 추가로 넣고 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 제거하고 3 mL의 FACS 버퍼를 넣은 다음 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 제거하고 FACS 버퍼 3 mL에 세포를 풀어주었다. 마지막으로, BD FACS Aria로 CD4+CD25+CD127- 세포를 분리하였다.
실시예 2.4. CD4+CD25+CD127- T 세포 배양
24-웰 플레이트에 실시예 2.3에서 분리된 모든 CD4+CD25+CD127- 세포를 파종하고, 이와 동시에 실시예 2.1과 같이 조절 T 세포의 증식을 자극하기 위해 2×105 세포수 당 1 μL MACS GMP ExpAct Treg Kit(Cat#:170-076-119)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로부터 비드(beads)를 분리하여 첨가 성분을 포함하지 않는 표 3 또는 표 4(기본 성분만 포함)의 세포 배양 조성물(0.5 mL 내지 1 mL)에 비드를 풀어주었다. 그 다음 상기 CD4+CD25+CD127- 세포를 파종한 웰 플레이트에 첨가하였다.
그 후, 첨가물질로 GI-101(3.2 nM/50 nM), GI-101_WT(3.2 nM/50 nM), CD80-Fc 이량체(3.2 nM/50 nM)+Fc-IL-2v2 이량체(3.2 nM/50 nM) 또는 CD80-Fc 이량체(3.2nM /50 nM)+Fc-IL-2wt 이량체(3.2 nM/50 nM)를 각각 포함하는 표 3 또는 표 4의 세포 배양 조성물 조건 하에 CD4+CD25+CD127- 세포를 배양하였다. 24-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 12-웰 플레이트로 계대 배양하였다. 12-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼때 6-웰 플레이트로 계대 배양하였다. 6-웰 플레이트의 세포가 80% 이상의 컨플루언스를 나타낼 때, 25T 플라스크로 계대 배양하였다. 25T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 75T 플라스크로 계대 배양하였다.
표 3 또는 표 4의 첨가물질이 3.2 nM 처리된 그룹에 대해서는 75T 플라스크의 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 최종 수득하였다. 상기 표 3 또는 표 4의 첨가물질이 50 nM 처리된 그룹에 대해선 175T 플라스크로 계대 배양 후 세포가 80% 이상의 컨플루언시를 나타낼 때 최종 수득하였다.
그 결과, RPMI1640 배지 포함 배양 조성물에서 세포 증식 결과는 표 9, 도 12a 및 도 12b, 세포 생존률은 표 10, 도 13a 및 도 13b와 같다. 또한 TexMACS 배지 포함 배양 조성물에서 세포 증식 결과는 표 11, 도 14a 및 도 14b, 세포 생존률은 표 12, 도 15a 및 도 15b와 같다.
총 세포수(×106)
배양 조성물 첨가물질 CD4+ 세포 CD4+CD25+CD127- FACS 분리 후 세포수
0일 3일 6일 0일 3일 5일 7일 9일 12일
3.2nM GI-101 10 12.1 18.8 0.5 4.9 32 58 98 420
GI-101 WT 10 13.1 12 0.6 2.77 30 45 70 300
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 10 12.1 14.1 0.4 1.69 16 74 80 255
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 10 11.1 13.5 0.3 1.07 6.4 63 88 196
50nM GI-101 10 21 51.9 1.8 2.7 29 47 71 380
GI-101 WT 10 23 45.8 0.8 2.6 22 64 65 206
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 10 16.5 37.3 0.89 0.9 7.7 24 41 108
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 10 18.9 49.3 1.1 2.4 10 38 52 200
세포 생존률(%)
배양 조성물 첨가물질 CD4+ 세포 CD4+CD25+CD127- FACS 분리 후 세포 생존률
0일 3일 6일 0일 3일 5일 7일 9일 12일
3.2nM GI-101 92 96.5 96 92 93 90 93 92 93
GI-101 WT 92 96 95 89 92 89 93 92 92
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 92 95 95 90 92 91 93 90 93
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 92 95 94 90 91 90 92 91 92
50nM GI-101 92 96.5 96 92 94 93 92 94 94
GI-101 WT 92 96 95 90 92 94 92 93 93
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 92 95 95 90 92 93 94 91 94
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 92 95 94 91 92 92 93 92 94
총 세포수(×106)
배양 조성물 첨가물질 CD4+ 세포 CD4+CD25+CD127- FACS 분리 후 세포수
0일 3일 6일 0일 3일 5일 7일 9일 12일
3.2nM GI-101 10 35 64 5.8 5.2 30 30 92 220
GI-101 WT 10 27 57 5 2.14 46 16 74 200
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 10 24 50 5.48 3.45 16 16 50 170
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 10 25 55 3.5 2.7 15 15 42 72
50nM GI-101 10 30 68 6.2 5.7 30.6 30 240 500
GI-101 WT 10 28 60 5.4 5 21 20 276 370
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 10 23.5 48 5 4.2 13.3 13.3 113 150
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 10 24 54 3.73 3.8 19 19.6 248 220
세포 생존률(%)
배양 조성물 첨가물질 CD4+ 세포 CD4+CD25+CD127- FACS 분리 후 세포 생존률
0일 3일 6일 0일 3일 5일 7일 9일 12일
3.2nM GI-101 94 93 96 92 93 97 94 92 96
GI-101 WT 94 93 95 90 92 93 93 92 94
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 94 95 95 90 92 95 93 96 95
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 94 94 94 91 91 90 92 91 95
50nM GI-101 94 96.5 96 92 94 96 96 94 98
GI-101 WT 94 96 95 90 92 94 92 96 93
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 94 95 95 91 88 93 94 91 96
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 94 95 94 93 92 92 93 92 94
실시예 2.5. 세포 특성 확인
실시예 2.4에서 회수한 CD4+CD25+CD127- 세포를 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 또한, 상층액을 제거하고 1:200으로 FACS 버퍼에 희석한 Fc block(biolegend, cat#422302) 100 ul을 넣고 얼음에 10분간 방치하고, 추가적으로 2.5 ul CD4-PerCP-Cy5.5(eBioscience, cat#45-0048-42), 2.5 ul CD25-APC/Cy7(BD, cat#557753), 2.5 ul CD127-Brilliant Violet 785(Biolegend, cat#351330)를 넣고 얼음에 20분간 방치하였다.
이후, 1 mL FACS 버퍼를 추가로 넣고 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. Fixation/Permeabilization concentrate와 Fixation/Permeabilization Diluent를 1:3으로 혼합한 용액을 준비하고, 상기 원심분리 하여 얻은 세포에서 상층액 제거 후 100 ul를 넣고 얼음에 30분간 방치하였다. 이후, 1 mL FACS 버퍼를 추가로 넣고 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리를 두 번 반복하였다. 그 후, 상층액 제거하고 100 ul FACS 버퍼와 2.5 ul Foxp3-Pacific Blue(Biolegend, cat#320116)를 넣고 얼음에 20분간 방치하였다. 그 후, 1 mL FACS 버퍼를 추가로 넣고 1,300 rpm, 4℃, 5분간 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 제거하고 FACS 버퍼 200 ul에 세포를 풀어주었다. 마지막으로, Cytek Aurora 장비로 세포 특성을 분석하였다.
그 결과, RPMI1640 배지 포함 조성물로부터 배양된 세포 특성에 대한 FACS 분석 결과는 도 16a 내지 도 16c와 같으며, 상기 배양 조건에서 확인된 CD4+CD25+Foxp3+ 발현 T 세포수는 표 13, 도 17a 내지 도 17c와 같다. 또한, TexMACS 배지 포함 조성물로부터 배양된 세포 특성에 대한 FACS 분석 결과는 도 18a 내지 도 18c와 같으며, 상기 배양 조건에서 확인된 CD4+CD25+Foxp3+ 발현 T 세포수는 표 14 및 도 19a 내지 도 19c와 같다.
총 세포수(×106)
배양 조성물 첨가물질 CD4+ 세포 CD4+CD25+CD127- FACS 분리 후 세포 수
0일 6일 6일 12일
3.2nM GI-101 0.25 2.1 33.3 61.3
GI-101 WT 0.25 0.97 18.9 30
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 0.25 0.99 2.96 67
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 0.25 1.08 7.56 18
50nM GI-101 0.25 7.27 27.7 98.8
GI-101 WT 0.25 2.75 28.1 30.3
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_v2		 0.25 2.35 1.2 11.2
hCD80-Fc+
Fc-IL-2_wt		 0.25 1.97 3.3 20
총 세포수(×106)
배양 조성물 첨가물질 CD4+ 세포 CD4+CD25+CD127- FACS 분리 후 세포 수
0일 6일 6일 12일
3.2nM GI-101 0.3 38.4 18 118.8
GI-101 WT 0.3 35.3 26.7 83.4
hCD80-Fc+Fc-IL-2_v2 0.3 8.2 5.4 56.1
hCD80-Fc+Fc-IL-2_wt 0.3 8.7 5.25 30.2
50nM GI-101 0.3 43.1 20.8 353.5
GI-101 WT 0.3 38.2 13.6 189.8
hCD80-Fc+Fc-IL-2_v2 0.3 7.7 5.3 18
hCD80-Fc+Fc-IL-2_wt 0.3 10.5 7.2 28.6
실시예 2.6. 면역 억제성 사이토카인 분비능 확인: 인터루킨-10
상기 실시예 2.4에서 수득된 조절 T 세포의 IL-10 분비능을 평가하기 위하여, 세포수를 1×106 cells/mL로 맞춰 배양한 후 배양 상층액을 수득하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)　분석을 수행하였다.
먼저, Human IL-10 ELISA Kit(Invitrogen, Cat# KAC1321)의 인큐베이션 버퍼를 100 ul씩 마이크로플레이트(micro plate)에 분주한 후, 칼리브레이션(calibration), 컨트롤(control) 또는 조절 T 세포 배양 상층액 샘플(sample)을 각각 100 ul씩 넣어 분주하였다. 그 후, 마이크로플레이트를 접착 필름(Adhesive film)으로 덮고 쉐이커(shaker)에서 2시간 동안 실온(18℃ 내지 25℃)에서 700 rpm으로 쉐이킹하며 반응시켰다. 그 후, 웰 당 약 150 μL 세척 버퍼로 마이크로웰 스트립(microwell strip)을 3회 세척하였다.
세척 후에, 표본 희석제(Specimen Diluent)를 100 ul씩 넣어주었다. 그 후, anti-IL-10-HRP를 50 ul 넣어준 후, 2시간 동안 실온에서 700 rpm으로 쉐이킹하며 반응시킨 뒤, 웰 당 약 150 μL 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 세척 후, TMB를 100 ul씩 넣어 주고, 15분 동안 실온에서 반응시킨 다음, 100 ul 스탑 솔루션(stop solution)을 넣어 반응을 종료하였다. 그 후, 450 nm를 사용하여 각 마이크로웰의 형광 값을 측정하였다.
그 결과, RPMI1640 배지 포함 조성물로부터 배양된 세포의 인터루킨-10 분비능은 도 20과 같으며, TexMACS 배지 포함 조성물로부터 배양된 세포의 인터루킨-10 분비능은 도 21과 같다. 도 20 및 도 21을 통해 GI-101을 배양 조성물에 첨가한 조절 T 세포들로부터 인터루킨-10이 높게 발현하는 것을 확인하였다.

Claims (17)

  1. IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 조절 T 세포 증식용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편은 링커에 의해 결합된 것인, 조절 T 세포 증식용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것인, 조절 T 세포 증식용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CD80은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것인, 조절 T 세포 증식용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것인, 조절 T 세포 증식용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 CD4+CD25+CD127- 세포인 것인, 조절 T 세포 증식용 조성물.
  7. IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 포함하는 조절 T 세포 증식용 배지.
  8. 제7항에 있어서,
    CD4+ T 세포 배양용 배지를 더 포함하는 것인, 조절 T 세포 증식용 배지.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 CD4+ T 세포 배양용 배지는 아미노산(amino acids), 당류(sugars), 무기염(inorganic salts) 및 비타민을 포함하는, 조절 T 세포 증식용 배지.
  10. IL-2 단백질 또는 이의 변이체 및 CD80 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체가 포함된 배지에서 CD4+CD25+CD127- T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 조절 T 세포 배양 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 CD4+CD25+CD127- T 세포는 혈액세포에서 수득된 것인, 조절 T 세포 수득 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    1일 내지 20일 배양하는 것인, 조절 T 세포 수득 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 CD4+CD25+CD127- T 세포는 CD4+ T 세포를 배양하는 단계; 또는 CD25+ T 세포를 배양하는 단계를 통해 수득된 것인, 조절 T 세포 수득 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 하나의 방법에 의해서 수득된 조절 T 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 Foxp3+ 발현량이 증가된 것인, 조절 T 세포.
  16. 제14항의 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환 치료용 조성물.
  17. 제14항의 조절 T 세포를 조절 T 세포 매개성 질환을 가지고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환 치료 방법.
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