WO2021006305A1 - TGF-β1に対するアプタマー及びその使用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an aptamer for transforming growth factor ⁇ 1 and a method for using the aptamer.
- TGF- ⁇ Transforming Growth Factor ⁇
- Non-Patent Documents 1 and 2 Recent studies have revealed that it contributes to growth suppression, cell differentiation, cell adhesion / migration, and induction of apoptosis in many cell types. Therefore, TGF- ⁇ is considered to play an important role in a wide range of fields such as ontogeny, tissue remodeling, wound healing, inflammation and immunity, and moist metastasis of cancer. It is known that TGF- ⁇ has five isoforms having 70 to 80% homology in the amino acid sequence, and the first of these to be discovered is TGF- ⁇ 1.
- Non-Patent Document 3 Several molecules that bind to TGF- ⁇ 1 and inhibit its function have been reported so far.
- Non-Patent Document 5 a peptide that binds to TGF- ⁇ 1 and exhibits a function-inhibiting effect has also been reported.
- LY2157299 As a small molecule, Galunisertive (LY2157299) and the like, which show a function-inhibiting effect by binding to a TGF- ⁇ 1 type receptor to which TGF- ⁇ 1 binds, have been reported.
- Antibodies specific for human TGF- ⁇ 1 include TGF- ⁇ 1 glomerulonephritis (Non-Patent Document 6), nerve scarring (Non-Patent Document 7), skin scar (Non-Patent Document 8), and lung. It has been shown to be effective in animal models for the treatment of fibrosis (Non-Patent Document 9). Furthermore, antibodies against TGF- ⁇ 1, 2 and 3 are models for pulmonary fibrosis, radiation-induced fibrosis (Patent Document 5), myelofibrosis, burns, Dupuytren's contraction, gastric ulcer and rheumatoid arthritis (Non-Patent Document 10). Has been shown to be effective in.
- aptamer means a nucleic acid that specifically binds to a target molecule (protein, sugar chain, hormone, etc.). It binds to the target molecule by the three-dimensional structure taken by the single-stranded RNA (or DNA).
- a screening method called the SELEX method Systematic Evolution of Ligands by Exponential Evolution
- the aptamer obtained by the SELEX method has a chain length of about 80 nucleotides, and then the chain is shortened by using the physiological inhibitory activity of the target molecule as an index.
- chemical modification is added for the purpose of improving stability in the living body to optimize it as a pharmaceutical product.
- Aptamers have high binding properties to target molecules, and their affinity is often higher than that of antibodies having similar functions. Furthermore, it is less susceptible to immune exclusion, and side effects such as antibody-specific cellular cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC) are less likely to occur. From the viewpoint of delivery, since the aptamer has a molecular size of about 1/10 of that of the antibody, tissue migration is likely to occur, and it is easier to deliver the drug to the target site. In addition, some of the small molecules of the same molecular-targeted drug are sparingly soluble, and optimization may be required for their formulation, but aptamers are highly water-soluble, which is also advantageous. is there.
- aptamers since it is produced by chemical synthesis, cost reduction can be achieved by mass production. In addition, long-term storage stability and heat / solvent resistance are also advantageous features of aptamers. On the other hand, aptamers generally have a shorter half-life in blood than antibodies. However, this point may also be an advantage when toxicity is taken into consideration.
- aptamer for TGF- ⁇ there is an aptamer developed by Gilead Sciences.
- Patent Document 4 describes an aptamer that binds to TGF- ⁇ obtained by the above SELEX method.
- the aptamer has a different sequence from the aptamer specifically shown herein.
- this document does not suggest any aptamers specifically shown herein.
- An object of the present invention is to provide an aptamer for TGF- ⁇ 1.
- the present inventors have succeeded in producing an aptamer that specifically binds to TGF- ⁇ 1, and have shown that this aptamer inhibits the activity of TGF- ⁇ 1. ..
- this aptamer is new in that it has a characteristic motif sequence and four consecutive sets of G bases, and has a structure completely different from that of conventionally known TGF aptamers.
- the present invention provides the following inventions and the like: [1] An aptamer that binds to TGF- ⁇ 1 and contains four consecutive sets of G bases and a combination of nucleotide sequences represented by the following formulas (I) and (II).
- Formula (I): The nucleotide sequence represented by UAAX is located on the most N-terminal side of the set of four G bases
- formula (II): the nucleotide sequence represented by ARACUU is the second G set.
- the aptamer according to [1] which is located between the and the third G set.
- aptamer according to any one of [1] to [5], wherein at least one nucleotide contained in the aptamer is modified.
- (b) In (a) above, one or several nucleotides are substituted or deleted. Inserted or added sequences; or
- C A sequence in which at least one nucleotide is modified in the above (a) or (b).
- the activity of TGF- ⁇ 1 can be selectively inhibited. Therefore, according to the present invention, it is possible to treat diseases and the like caused by overexpression of TGF- ⁇ 1.
- FIG. 1 is an outline showing the positional relationship between a G-quartet structure formed by having four consecutive sets of G bases and a specific base sequence (motif sequence), which is predicted as a structure that the aptamer of the present invention can take. It is a figure. Black arrows indicate bonds or one or more bases. White arrows indicate the four sets of guanosine that make up the G quartet (sometimes referred to herein as the "G set"). Although it is described as a parallel type G quartet structure as an example in this schematic diagram, other G quartet structure types (antiparallel type, mixed type), triple chains other than quadruplex, and other solids It does not deny the possibility of taking a structure.
- nucleobases are as follows. Symbol Meaning Description A A Adenine C C Cytosine GG Guanine TT Thymine U Uracil MA or C Amino RA or G Purine WA or U- SC or G- Y C or U Pyrimidine KG or U Keto VA or C or G- HA or C or U- BC or G or U- NA or C or G or U- (The same applies when using lowercase letters.)
- the present invention provides an aptamer having a binding activity to TGF- ⁇ 1.
- the aptamer of the present invention can inhibit the activity of TGF- ⁇ 1.
- An aptamer is a nucleic acid molecule having a binding activity to a predetermined target molecule. Aptamers can inhibit the activity of a given target molecule by binding to the given target molecule.
- the aptamer of the present invention is an aptamer having a binding activity to TGF- ⁇ 1. It can also be an aptamer capable of inhibiting the activity of TGF- ⁇ 1.
- the aptamer of the present invention can also be RNA, DNA, modified nucleic acid or a mixture thereof.
- the aptamers of the present invention can also be in linear or cyclic form.
- TGF- ⁇ 1 (transforming growth factor- ⁇ 1) is a multifunctional cytokine and is a protein produced in almost all cells.
- the TGF- ⁇ 1 protein is a precursor polypeptide (UniProtKB-P01137, 390 amino acid residues: signal peptide (positions 1 to 29), LAP (positions 30 to 278), mature (or active) TGF- ⁇ 1 (279 to). It is produced as 390th place)).
- the precursor polypeptide is cleaved by a furin-like protease to yield N-terminal LAP (latency associated protein, 249 amino acid residues) and C-terminal mature TGF- ⁇ 1 (112 amino acid residues).
- TGF- ⁇ 1 The LAP and the mature TGF- ⁇ 1 moiety are each homodimerized via a disulfide bond. Such homodimerized mature TGF- ⁇ 1 and LAP bind non-covalently to form a complex.
- TGF- ⁇ has three isoforms, ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3. The homology of these isoforms is 70-80%.
- TGF- ⁇ 1 may have many functions such as cell proliferation, regulation of cell differentiation, induction of epithelial-mesenchymal transition, regulation of immune system through regulation of T cell differentiation, regulation of angiogenesis, promotion of extracellular matrix production, etc. Are known. As described above, it has been reported that administration of an inhibitor of TGF- ⁇ 1 can treat diseases such as cancer and fibrosis.
- the aptamer of the present invention has a binding activity to TGF- ⁇ 1 derived from any mammal.
- the aptamer of the present invention may have an inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 derived from any mammal.
- mammals include, for example, primates (eg, humans, monkeys), rodents (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters), and pets, livestock and working animals (eg, dogs, cats, horses). , Cows, goats, sheep, pigs), but are preferably humans.
- the amino acid sequence of TGF- ⁇ 1 is not limited to the wild-type sequence, and may be a wild-type sequence having a mutation of 1 to several residues, a domain portion thereof, or a peptide portion thereof.
- the aptamer of the present invention binds to TGF- ⁇ 1 in a physiological buffer solution.
- the buffer solution is not particularly limited, but one having a pH of about 5.0 to 10.0 is preferably used, and as such a buffer solution, for example, Solution A described later (see Example 1). Can be mentioned.
- the aptamer of the present invention specifically binds to TGF- ⁇ 1 with an intensity that can be detected by any of the following tests.
- Biacore T200 or the like manufactured by GE Healthcare can be used for measuring the bond strength.
- One measurement method is to first immobilize the aptamer on the sensor chip. The amount of immobilization is about 1000 RU (eg, 1500 RU, etc.).
- a TGF- ⁇ 1 solution for analysis is prepared to 1 nM to 200 nM (eg, 4 nM or 10 nM, etc.) and 20 ⁇ L is injected to detect the binding of TGF- ⁇ 1 to an aptamer.
- RNA containing a random nucleotide sequence consisting of 30 to 100 nucleotides was used as a negative control, and TGF- ⁇ 1 bound to the aptamer equally or significantly more strongly than the control RNA. If so, the aptamer can be determined to have the ability to bind to TGF- ⁇ 1.
- TGF- ⁇ 1 is immobilized on the sensor chip.
- the amount of immobilization is about 1000 RU.
- the aptamer solution for analysis is prepared to 10 nM to 200 nM (eg, 20 nM or 100 nM, etc.) and 20 ⁇ L is injected to detect the binding of the aptamer to TGF- ⁇ 1.
- RNA containing a random nucleotide sequence consisting of 30 to 100 nucleotides (eg, 66, 80, or 90 nucleotides, etc.) was used as a negative control, and TGF- ⁇ 1 bound to the aptamer equally or significantly more strongly than the control RNA. If so, the aptamer is determined to have the ability to bind to TGF- ⁇ 1.
- TGF- ⁇ 1 activity means the inhibitory ability against any activity possessed by TGF- ⁇ 1.
- TGF- ⁇ 1 activity includes TGF- ⁇ mediated signaling, extracellular matrix (ECM) deposition, inhibition of epithelial and endothelial cell growth, promotion of smooth muscle growth, induction of collagen expression, TGF- ⁇ , fibronectin, Induction of VEGF and IL-11 expression, suppression of tumor-induced immunity, promotion of angiogenesis, activation of myofibroblasts, promotion of metastasis, inhibition of NK cell activity, and the like are included, but not limited to these.
- the aptamers of the present invention inhibit at least one of these TGF- ⁇ 1 activities.
- an aptamer inhibits the activity of TGF- ⁇ 1 is determined, for example, by a cell assay system that monitors the Smad signaling pathway known to be activated by stimulation of TGF- ⁇ , as described in Examples. Can be evaluated by. Briefly, it can be evaluated by the following means: Fotinas luciferase with SBE (Smad-binding element) in the promoter region is used as a reporter. Along with this SBE-induced fotina luciferase reporter plasmid, a reniral luciferase expression plasmid is mixed with an appropriate ratio (eg, 20: 1) as a standardized control for transfection efficiency and transfected into HEK293 cells.
- SBE SBE
- a reniral luciferase expression plasmid is mixed with an appropriate ratio (eg, 20: 1) as a standardized control for transfection efficiency and transfected into HEK293 cells.
- Transfected HEK293 cells are re-sown in 96-well plates and cultured until confluent.
- a mixed solution of aptamer synthesized using TGF- ⁇ 1 and T7 RNA polymerase or chemically synthesized aptamer is added thereto to an appropriate final concentration (for example, 10 pM to 100 nM, etc.) and added for 1 to 8 hours (eg, 10 pM to 100 nM, etc.). Incubate for 3 hours, etc.). Then, the expression levels of fotina luciferase and reniral luciferase are confirmed by using appropriate means. It is possible to evaluate whether or not the aptamer inhibits the activity of TGF- ⁇ 1 by appropriately adjusting the expression level and then comparing the results.
- binding means that a nucleotide does not exist at the position of X, and a nucleotide adjacent to the 5'side of X (that is, adenosine 5'-phosphate) is a ribonucleotide adjacent to the 3'side of X. Means a state in which the nucleotide is connected with a phosphodiester bond.
- the number of G bases in the above-mentioned "set of G bases” is not particularly limited as long as the number of G bases is 2 or more, but is preferably 5 or less, and more preferably 2 to 4. It is not necessary for all four "sets of G bases” to have the same number of G bases, and an appropriate number of G bases can be selected as long as the aptamer of the present invention has a desired activity. However, it is desirable that the number of G bases in the "second G set” is 4, and the number of G bases in the "fourth G set” is preferably 3.
- each of the above-mentioned “set of G bases”, “nucleotide represented by formula (I)”, and “nucleotide represented by formula (II)” is directly adjacent as long as the aptamer of the present invention has a desired activity. It may or may not be adjacent.
- the interval when they are not adjacent to each other is not particularly limited, but is preferably 1 to several bases, for example, 1 to 9 bases, 1 to 5 bases, and 1 to 3 bases. There is at least one non-G base between the two "sets of G bases”.
- the G-quartet structure predicted as a structure that can be taken by the aptamer of the present invention is a structure well known in the present technology, and is an intermolecular and intramolecular quadruplex structure in DNA or RNA rich in guanosine nucleotide (G).
- G guanosine nucleotide
- the basic structure of the G-quartet structure is a plane in which four guanosine bases are cyclically tetramerized by two adjacent guanosine bases and Hoogsteen base pairs. Finally, two to three areas overlap to form a stable quadruplex structure (G-quadruplex).
- the G-quartet structure that the aptamer of the present invention may have is illustrated in FIG.
- the white arrow in FIG. 1 means two or more consecutive Gs (“G sets”) involved in the G quartet structure, and the black arrow means a bond or one or more bases.
- the aptamer has a G-quadruplex structure by confirming a predetermined waveform using a CD spectrum. More specifically, the aptamer is dissolved in TBS buffer (10 mMTris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7.4) to prepare a sample solution, and the temperature is 20 ° C., the wavelength is 200 nm to 320 nm, and the scanning speed is 100 nm /. It can be confirmed by the appearance of the minimum value near 240 nm and the maximum value near 260 nm in the CD spectrum when the spectrum is measured under the condition of 10 times of integration.
- TBS buffer 10 mMTris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7.4
- Examples of base combinations that produce combinations in which the number of G bases in the above formula is not four are as follows, but are not limited to: (1) K is G, (2) The first R is G, and the first N is G, (3) K, V, the second N, and the third R are all G.
- formula (III) can be the following sequence: Formula (III-1): UAAGGRNGGSGARCACUUGKGVNRGG (when X is a binding (SEQ ID NO: 49)), Formula (III-2): UAAGUGGRNGGSGARACUGKGVNRGG (when X is GU (SEQ ID NO: 50)) (In the formula, N, R, S, K, V and B are as described above, and are limited to combinations in which the set of G bases is four.)
- the aptamer of the present invention is an aptamer that binds to TGF- ⁇ 1 and contains four consecutive sets of G bases and a combination of nucleotide sequences represented by the following formula (III'). Is.
- formula (III') can be the following sequence: Formula (III'-1): UAAGGRBGGSGARACUGKGVGVBRGG (when X is bound (SEQ ID NO: 51)); Formula (III'-2): UAAGUGGRBGGSGARACUGKGVBRGG (when X is GU (SEQ ID NO: 52)) (In the formula, R, S, K, V and B are as described above, and are limited to combinations in which the set of G bases is four.)
- the aptamer of the present invention binds to TGF- ⁇ 1 which has four consecutive sets of G bases and contains a combination of nucleotide sequences represented by the following formula (III ′′). It is an aptamer.
- the aptamer of the invention may also include an aptamer having the following activity of binding to TGF- ⁇ 1 and / or inhibiting the biological activity of TGF- ⁇ 1:
- A An aptamer containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 4 to 6, 9, 11, 13, 17 to 22, 26 to 29 or 31.
- B In (a), an aptamer comprising a sequence in which one or several (eg, 1, 2, 3, 4, or 5) nucleotides have been substituted, deleted, inserted, or added.
- the aptamers listed here may also include aptamers that do not contain the above-mentioned common motifs (ie, SEQ ID NOs: 5, 11, 13, 18, 19, 20, 22, 26, and 27).
- the aptamer of the invention is the following aptamer: (A) An aptamer consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 6, 9, 11, 13, 17 to 22, 26 to 29 or 31. (B) In (a), an aptamer consisting of a sequence in which one or several (eg, 1, 2, 3, 4, or 5) nucleotides are substituted, deleted, inserted, or added. Or (c) an aptamer consisting of a sequence in which at least one nucleotide is modified in (a) or (b).
- the length of the aptamer of the present invention is not particularly limited and may be usually about 25 to about 200 nucleotides, but for example, about 100 nucleotides or less, preferably about 55 nucleotides or less, more preferably about 45 nucleotides or less. And most preferably no more than about 35 nucleotides.
- the total number of nucleotides is small, chemical synthesis and mass production are easier, and there is a great cost advantage.
- chemical modification is easy, stability in vivo is high, and toxicity is low.
- the length of the aptamer of the present invention is usually about 25 nucleotides or more, preferably about 28 nucleotides or more, more preferably about 29 nucleotides or more, and particularly preferably about 30 nucleotides or more. obtain. If the total number of nucleotides is too small, it cannot have the common sequence described below, and the potential tertiary structure becomes unstable, and in some cases, it may not have activity.
- the aptamer of the present invention inhibits the activity of TGF- ⁇ 1 by specifically binding to TGF- ⁇ 1. As long as the aptamer of the present invention can inhibit the activity of TGF- ⁇ 1, it may bind to any part of TGF- ⁇ 1 and inhibit the activity of TGF- ⁇ 1 by any mechanism of action. However, in one embodiment, the aptamer of the present invention can bind to TGF- ⁇ 1 by inhibiting the binding of TGF- ⁇ 1 to the receptor of TGF- ⁇ 1. It can inhibit the activity. It is clear that the aptamer known to inhibit the activity of TGF- ⁇ 1 is an aptamer that binds to TGF- ⁇ 1 without confirming the binding to TGF- ⁇ 1.
- the aptamer of the present invention may be one in which the sugar residue (eg, ribose) of each nucleotide is modified in order to enhance the binding property, stability, drug delivery property and the like to TGF- ⁇ 1.
- the site modified in the sugar residue include those in which the oxygen atom at the 2'position, 3'position and / or 4'position of the sugar residue is replaced with another atom.
- Types of modification include, for example, fluorolysis, O-alkylation (eg, O-methylation, O-ethylation), O-allylation, S-alkylation (eg, S-methylation, S-ethylation). ), S-allylation, amination (eg, -NH 2 ).
- Such modification of sugar residues can be carried out by a method known per se (eg, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991)). Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).
- Such arbitrary atoms or groups include, for example, hydrogen atom, fluorine atom or -O-alkyl group (eg, -O-Me group (sometimes referred to as "OMe group”)), -O-acyl.
- OMe group fluorine atom or -O-alkyl group
- -O-Me group sometimes referred to as "OMe group”
- -O-acyl examples thereof include nucleotides substituted with a group (eg, -O-COMe group) and an amino group (eg, -NH 2 group).
- all purine nucleotides are nucleotides that are identically or differently substituted with hydroxyl groups at the 2'position of ribose, or any atom or group described above, preferably hydrogen. It can be a nucleotide substituted with an atom or group selected from the group consisting of an atom, a methoxy group and a fluorine atom.
- Modifications of the aptamers of the present invention further include polyethylene glycol, amino acids, peptides, inverted dT, nucleic acids, nucleosides, Myristoyl, Lysotropic-ollyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Lynole, and other lipids.
- Vitamin, pigment, fluorescent substance, anticancer agent, toxin, enzyme, radioactive substance, biotin and the like can be added to the terminal. Such modifications can be made, for example, with reference to US Pat. Nos. 5,660,985 and 5,756,703.
- the nucleotide constituting the aptamer is RNA (that is, the sugar group is ribose), and the mode of modification to the sugar group in the nucleotide will be described. It does not mean that DNA is excluded from the nucleotides constituting the above, and is appropriately read as a modification to DNA.
- the nucleotide constituting the aptamer is DNA
- the substitution of the hydroxyl group at the 2'position of ribose with X is read as the substitution of one hydrogen atom at the 2'position of deoxyribose with X.
- the aptamer of the present invention can be synthesized by the method disclosed in the present specification or a method known per se in the art.
- One of the synthetic methods is a method using RNA polymerase.
- the target RNA can be obtained by chemically synthesizing the DNA having the target sequence and the promoter sequence of RNA polymerase and transcribing this as a template by a method already known. It can also be synthesized by using DNA polymerase. DNA having the desired sequence is chemically synthesized, and this is used as a template for amplification by a known method, the polymerase chain reaction (PCR). This is made into a single strand by a already known method such as polyacrylamide gel electrophoresis or an enzyme treatment method.
- PCR polymerase chain reaction
- This is made into a single strand by a already known method such as polyacrylamide gel electrophoresis or an enzyme treatment method.
- the efficiency of the extension reaction can be increased by using a polymerase in which a mutation is introduced
- Aptamers can be synthesized in large quantities by chemical synthesis methods such as the amidite method or the phosphoramidite method.
- the synthesis method is a well-known method, as described in Nucleic Acid (Vol. 2) [1] Nucleic Acid and Analysis of Nucleic Acid (Editor: Yukio Sugara, Hirokawa Public, etc.). Actually, a synthesizer such as OligoPirot100 or OligoProcesss manufactured by GE Healthcare Bioscience is used. Purification is carried out by a method known per se, such as chromatography.
- Aptamers can add functional substances after synthesis by introducing active groups such as amino groups during chemical synthesis such as the phosphoramidite method. For example, by introducing an amino group at the end of an aptamer, a polyethylene glycol chain having a carboxyl group introduced can be condensed.
- Aptamar binds to a target substance by various bonding modes such as ionic bond using negative charge of phosphate group, hydrophobic bond and hydrogen bond using ribose, hydrogen bond using nucleobase and stacking interaction.
- the ionic bond utilizing the negative charge of the phosphate group existing as many as the number of constituent nucleotides is strong and binds to the positive charge of lysine and arginine existing on the surface of the protein. Therefore, nucleobases that are not directly involved in binding to the target substance can be replaced.
- the functional group at the 2'position of ribose may directly interact with the target molecule, but it is often irrelevant and replaced with another modified molecule. It is possible. Thus, aptamers often retain their activity unless the functional groups involved in direct binding to the target molecule are substituted or deleted. It is also important that the overall three-dimensional structure does not change significantly.
- Aptamers are produced by using the SELEX method and its improved methods (for example, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Turek et al., (1990) Science, 249, 505-510). can do.
- the SELEX method aptamers having a stronger binding force to the target substance are concentrated and sorted by increasing the number of rounds or using a competing substance to tighten the sorting conditions. Therefore, by adjusting the number of rounds of SELEX and / or changing the race condition, aptamers having different binding forces, aptamers having different binding forms, and aptamers having the same binding force and binding form but different base sequences. You may be able to get an aptamer.
- the SELEX method includes an amplification process by PCR, and by inserting mutations such as by using manganese ions in the process, it is possible to perform SELEX with a greater variety.
- the aptamer obtained by SELEX is a nucleic acid having a high affinity for the target substance, but that does not mean that the physiological activity of the target substance is inhibited.
- SELEX can be performed to acquire an aptamer with higher activity.
- the specific method is to prepare a template in which a part of the aptamer having a certain sequence is made into a random sequence or a template in which a random sequence of about 10 to 30% is doped, and then perform SELEX again.
- the aptamer obtained by SELEX has a length of about 80 nucleotides, and it is difficult to use this as it is as a medicine. Therefore, it is necessary to repeat trial and error to shorten the length to about 50 nucleotides or less so that chemical synthesis can be easily performed.
- the aptamer obtained by SELEX depends on its primer design, and the ease of subsequent minimization work changes. If the primers are not designed well, even if SELEX can select active aptamers, subsequent development will be impossible.
- aptamers can be chemically synthesized, they are easy to modify. Aptamers can replace or delete which nucleotides by predicting secondary structure using the MFOLD program, or predicting the three-dimensional structure by X-ray analysis or NMR analysis, and where new nucleotides can be replaced. It is possible to predict to some extent whether or not it is possible to insert. The predicted new sequence of aptamers can be easily chemically synthesized, and whether or not the aptamers retain their activity can be confirmed by an existing assay system.
- the important part of the obtained aptamer for binding to the target substance can be identified by repeating the above trial and error, the activity often changes even if a new sequence is added to both ends of the sequence. do not do.
- the length of the new sequence is not particularly limited.
- the aptamer can be highly designed or modified.
- the present invention also provides a complex containing the aptamer of the present invention and a functional substance bound thereto (hereinafter, may be referred to as "complex of the present invention").
- the bond between the aptamer and the functional substance in the complex of the present invention can be covalent or non-covalent.
- the complex of the present invention may be a combination of the aptamer of the present invention and one or more (eg, 2 or 3) functional substances of the same type or different types.
- the functional substance is not particularly limited as long as it can newly add some function to the aptamer of the present invention or change (eg, improve) some property that can be retained by the aptamer of the present invention.
- Functional substances include proteins, peptides, amino acids, lipids, sugars, monosaccharides, polynucleotides, and nucleotides.
- Functional substances also include, for example, affinity substances (eg, biotin, streptavidin, polynucleotides having affinity for the target complementary sequence, antibodies, glutathione Sepharose, histidine), labeling substances (eg, fluorescent substances, etc.).
- affinity substances eg, biotin, streptavidin, polynucleotides having affinity for the target complementary sequence, antibodies, glutathione Sepharose, histidine
- labeling substances eg, fluorescent substances, etc.
- drug delivery media eg, liposomes, microspheres, peptides, polyethylene glycols
- drugs eg, calikeamycin, duocalmycin, etc.
- nitrogen mustard analogs such as cyclophosphamide, melfaran, ifofamide or trophosphamide
- ethyleneimines such as thiotepa, nitrosourea such as carmustin
- alkylating agents such as temozolomide or dacarbazine
- Folic acid-like metabolic antagonists such as methotrexate or larcitrexed
- purine analogs such as thioguanine, cladribine
- ⁇ унк ⁇ ионент may eventually be removed. Further, it may be a peptide that can be recognized and cleaved by an enzyme such as thrombin, matrix metalloproteinase (MMP), or FactorX, or a polynucleotide that can cleave a nuclease or a restriction enzyme.
- an enzyme such as thrombin, matrix metalloproteinase (MMP), or FactorX
- MMP matrix metalloproteinase
- FactorX FactorX
- the aptamers and complexes of the present invention can be used, for example, as pharmaceuticals or diagnostic agents, test agents, and reagents.
- the aptamer and complex of the present invention can selectively inhibit the activity of TGF- ⁇ 1.
- TGF- ⁇ 1 is a multifunctional cytokine involved in cell proliferation and differentiation, embryogenesis, extracellular matrix formation, bone development, wound healing, hematopoiesis, and immune and inflammatory responses. Therefore, overexpression of TGF- ⁇ 1 has been implicated in a number of conditions in humans, such as fibrotic diseases, cancers, immunomediated diseases, wound healing, kidney diseases and the like. Therefore, the aptamers and complexes of the present invention are also useful as medicines for treating or preventing these diseases.
- the aptamer and complex of the present invention may be useful for the treatment or prevention of fibrotic diseases such as glomerulonephritis, nerve scar, skin scar, pulmonary fibrosis, radiation-induced fibrosis, liver fibrosis, and myelofibrosis.
- fibrotic diseases such as glomerulonephritis, nerve scar, skin scar, pulmonary fibrosis, radiation-induced fibrosis, liver fibrosis, and myelofibrosis.
- the aptamers and complexes of the present invention include breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, stomach cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, skin cancer, lung cancer, cervical cancer, bladder cancer, It may be useful in the treatment or prevention of cancers such as glioma, mesothelioma, leukemia, and sarcoma.
- the aptamers and complexes of the present invention may be useful for enhancing the immune response to macrophage-mediated infections and reducing immunosuppression caused by tumors, AIDS and the like.
- the aptamer and complex of the present invention also include systemic sclerosis, postoperative adhesions, keloids, hypertrophic scars, corneal damage, cataracts, Peyronie's disease, liver cirrhosis, post-myocardial infarction scars, post-angiogenic re-stenosis, and submucosal hemorrhage. It may be useful for treating wounds such as posterior scars, bile liver cirrhosis (including sclerosing cholangitis).
- the aptamers and complexes of the present invention include diabetic (type I and type II) nephropathy, radiation-induced nephropathy, obstructive nephropathy, and hereditary kidney disease (eg, multiple cystic kidney, spongy kidney, horseshoe).
- Kidney glomerular nephritis, nephrosclerosis, renal calcification, systemic erythematosus, Schegren syndrome, Buerger's disease, systemic or glomerular hypertension, tubulointerstitial nephritis, tubular acidosis, renal tuberculosis and kidney It may be useful for the treatment or prevention of kidney diseases such as infarction.
- the aptamer and complex of the present invention can specifically bind to TGF- ⁇ 1. Therefore, in another aspect of the invention, the aptamer and complex of the invention may be useful as a probe for TGF- ⁇ 1 detection.
- the probe is useful for in vivo imaging of TGF- ⁇ 1, blood concentration measurement, tissue staining, ELISA and the like.
- the probe can be useful as a diagnostic agent, a test agent, a reagent, or the like for a disease (cancer, fibrosis, etc.) in which TGF- ⁇ 1 is involved.
- the aptamer and complex of the present invention can be used as a ligand for separation and purification of TGF- ⁇ 1.
- the aptamer and complex of the present invention can be used as a drug delivery agent.
- the medicine of the present invention containing the aptamer of the present invention or the complex containing the aptamer of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
- Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients such as sucrose, starch, mannit, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polypropylpyrrolidone.
- Glue gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, starch, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol-starch, sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, magnesium stearate , Lubricants such as aerodyl, talc, sodium lauryl sulfate, fragrances such as citric acid, menthol, glycyrrhizin / ammonium salt, glycine, orange powder, preservatives such as sodium benzoate, sodium hydrogen sulfite, methylparaben, propylparaben, citric acid , Stabilizers such as sodium citrate, acetic acid, suspending agents such as methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, diluents such as water, physiological saline, orange juice, cacao butter, polyethylene.
- the administration route of the drug of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include oral administration and parenteral administration.
- Suitable preparations for oral administration include solutions in which an effective amount of ligand is dissolved in a diluted solution such as water, physiological saline, and orange juice, capsules containing an effective amount of ligand as solids or granules, and sachets.
- a tablet a suspension in which an effective amount of the active ingredient is suspended in an appropriate dispersion medium, an emulsion in which a solution in which an effective amount of the active ingredient is dissolved is dispersed in an appropriate dispersion medium and emulsified, a water-soluble substance.
- the medicament of the present invention can be coated by a method known per se for the purpose of masking taste, enteric acidity or persistence, if necessary.
- the coating agent used for coating include hydroxypropylmethyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyoxyethylene glycol, Tween 80, Pluronic F68, cellulose acetate phthalate, hydroxypropyl methyl cellulose phthalate, and hydroxymethyl cellulose acetate succinate.
- Eudragit manufactured by Roam, Germany, methacrylic acid / acrylic acid copolymer
- dyes eg, Bengala, titanium dioxide, etc.
- the drug may be either a rapid-release preparation or a sustained-release preparation.
- Suitable preparations for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions. This may contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents and the like.
- aqueous and non-aqueous sterile suspensions may be mentioned, which may include suspending agents, solubilizing agents, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
- the preparation can be encapsulated in a container in units of doses or multiple doses, such as ampoules and vials.
- the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be freeze-dried and stored in a state where it can be dissolved or suspended in a suitable sterile solvent immediately before use.
- sustained-release preparations can also be mentioned as suitable preparations.
- the dosage form of the sustained-release preparation include a sustained-release form from a carrier or container embedded in the body, such as an artificial bone, a biodegradable base material, a biodegradable sponge, or a bag.
- sustained-release preparations also include devices such as drug pumps and osmotic pumps that are continuously or intermittently delivered in-vivo or locally from outside the body.
- the biodegradable substrate include liposomes, cationic liposomes, Poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA), atelocollagen, gelatin, hydroxyapatite, and polysaccharide schizophyllan.
- inhalants suitable for transpulmonary administration and ointments suitable for transdermal administration are also possible.
- the active ingredient in a freeze-dried state is miniaturized and administered by inhalation using an appropriate inhalation device.
- a surfactant, an oil, a seasoning, cyclodextrin or a derivative thereof and the like, which are used as necessary can be appropriately added to the inhalant.
- the inhalant can be produced according to a conventional method. That is, it can be produced by powdering or liquidifying the aptamer or composite of the present invention, blending it in an inhalation propellant and / or carrier, and filling it in an appropriate inhalation container.
- a normal mechanical powder inhaler can be used, and in the case of a liquid, an inhaler such as a nebulizer can be used.
- an inhalation propellant conventionally known ones can be widely used, and CFC-11, CFC-12, CFC-21, CFC-22, CFC-113, CFC-114, CFC-123, CFC-142c, CFC- CFC compounds such as 134a, CFCs-227, CFCs-C318, 1,1,1,2-tetrafluoroethane, hydrocarbons such as propane, isobutane, n-butane, ethers such as diethyl ether, nitrogen gas, A compressed gas such as carbon dioxide can be exemplified.
- Surfactants include, for example, oleic acid, lecithin, diethylene glycol dioleate, tetrahydrofurfuryl oleate, ethyl oleate, isopropyl myristate, glyceryl trioleate, glyceryl monolaurate, glyceryl monooleate, glyceryl monostearate, Glyceryl monolithinoate, cetyl alcohol, stearyl alcohol, polyethylene glycol 400, cetylpyridinium chloride, sorbitan trioleate (trade name span 85), sorbitan monooleate (trade name span 80), sorbitan monolaurate (trade name span 20), Polyoxyethylene hardened castor oil (trade name HCO-60), polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (trade name Tween 20), polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (trade name Tween 80), natural resources Derived lecithin (trade name Epicron), o
- oils examples include corn oil, olive oil, cottonseed oil, sunflower oil and the like.
- appropriate pharmaceutically acceptable bases yellow petrolatum, white petrolatum, paraffin, plastic base, silicone, white ointment, beeswax, pig oil, vegetable oil, hydrophilic ointment, hydrophilic petrolatum, purified lanolin, hydrous lanolin , Water-absorbing ointment, hydrophilic plastibase, macrogol ointment, etc.
- bases yellow petrolatum, white petrolatum, paraffin, plastic base, silicone, white ointment, beeswax, pig oil, vegetable oil, hydrophilic ointment, hydrophilic petrolatum, purified lanolin, hydrous lanolin , Water-absorbing ointment, hydrophilic plastibase, macrogol ointment, etc.
- the dose of the medicament of the present invention varies depending on the type / activity of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, the body weight, the age, etc., but is usually per adult per day.
- the amount of active ingredient can be from about 0.0001 to about 100 mg / kg, such as from about 0.0001 to about 10 mg / kg, preferably from about 0.005 to about 1 mg / kg.
- the present invention also provides a solid phase carrier on which the aptamer and complex of the present invention are immobilized.
- the solid phase carrier include substrates, resins, plates (eg, multi-well plates), filters, cartridges, columns, and porous materials.
- the substrate may be one used for a DNA chip, a protein chip, or the like.
- a nickel-PTFE (polytetrafluoroethylene) substrate for example, a glass substrate, an apatite substrate, a silicon substrate, an alumina substrate, or the like, and these substrates Is coated with a polymer or the like.
- the resin examples include agarose particles, silica particles, a copolymer of acrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide, polystyrene-crosslinked divinylbenzene particles, particles obtained by cross-linking dextran with epichlorohydrin, cellulose fibers, and allyl dextran.
- examples thereof include crosslinked polymers of N, N'-methylenebisacrylamide, monodisperse synthetic polymers, monodisperse hydrophilic polymers, sepharose, toyopearl, etc., and also include resins in which various functional groups are bonded to these resins. ..
- the solid phase carrier of the present invention can be useful, for example, for purification of TGF- ⁇ 1 and detection and quantification of TGF- ⁇ 1.
- the aptamer and complex of the present invention can be immobilized on a solid phase carrier by a method known per se.
- an affinity substance eg, as described above
- a predetermined functional group is introduced into the aptamer and complex of the present invention, and then the affinity substance or a predetermined functional group is used to immobilize on a solid phase carrier.
- the method can be mentioned.
- the present invention also provides such a method.
- the predetermined functional group can be a functional group that can be subjected to a coupling reaction, and examples thereof include an amino group, a thiol group, a hydroxyl group, and a carboxyl group.
- the present invention also provides an aptamer into which such a functional group has been introduced.
- the present invention also provides a method for purifying and concentrating TGF- ⁇ 1.
- the present invention is capable of separating TGF- ⁇ 1 from other family proteins.
- the purification and concentration method of the present invention may include adsorbing TGF- ⁇ 1 on the solid phase carrier of the present invention and eluting the adsorbed TGF- ⁇ 1 with an eluate.
- Adsorption of TGF- ⁇ 1 onto the solid phase carrier of the present invention can be carried out by a method known per se. For example, a sample containing TGF- ⁇ 1 (eg, bacterial or cell culture or culture supernatant, blood) is introduced into the solid phase carrier of the invention or its content.
- the eluate may be appropriately selected in consideration of the known characteristics of TGF- ⁇ 1.
- the purification and concentration method of the present invention may further include washing the solid phase carrier with a washing solution after adsorption of TGF- ⁇ 1.
- the cleaning solution may be appropriately selected in consideration of the known characteristics of TGF- ⁇ 1.
- the purification and concentration methods of the present invention may further include heat treating the solid phase carrier. By this step, the solid phase carrier can be regenerated and sterilized.
- the present invention also provides a method for detecting and quantifying TGF- ⁇ 1.
- the present invention can detect and quantify TGF- ⁇ 1 in a distinctive manner from other family proteins.
- the detection and quantification methods of the present invention may include measuring TGF- ⁇ 1 utilizing the aptamers of the present invention (eg, by using the complex and solid phase carriers of the present invention).
- the method for detecting and quantifying TGF- ⁇ 1 can be carried out in the same manner as the immunological method except that the aptamer of the present invention is used instead of the antibody.
- an enzyme-linked immunosorbent assay eg, direct-competitive ELISA, indirect-competitive ELISA, sandwich ELISA
- radioimmunoassay RIA
- fluorescence immunoassay Detection and quantification can be performed by a method similar to the method (FIA), Western blot method, immunohistochemical staining method, cell sorting method and the like. It can also be used as a molecular probe for PET and the like.
- FIA enzyme-linked immunosorbent assay
- FIA Western blot method
- immunohistochemical staining method cell sorting method and the like.
- Such methods may be useful, for example, in measuring the amount of TGF- ⁇ 1 in a biological or biological sample, diagnosing a disease associated with TGF- ⁇ 1.
- RNA aptamers that specifically bind to TGF- ⁇ 1 were prepared using the SELEX method.
- SELEX was performed with reference to the method of Ellington et al. (Ellington and Szostak, Nature 346,818-822,1990) and the method of Tuerk et al. (Tuerk and Gold, Science 249,505-510,1990).
- TGF- ⁇ 1 Recombinant Human TGF- ⁇ 1, manufactured by Peprotech, hereinafter referred to as TGF- ⁇ 1
- TGF- ⁇ 1 Recombinant Human TGF- ⁇ 1, manufactured by Peprotech, hereinafter referred to as TGF- ⁇ 1
- the carrier on which TGF- ⁇ 1 was immobilized was obtained by activating the carrier with 1 mM hydrochloric acid, mixing the two, and reacting at room temperature for about 3 hours. The amount of immobilization was confirmed by examining the TGF- ⁇ 1 solution before immobilization and the supernatant immediately after immobilization by SDS-PAGE.
- TGF- ⁇ 1 As a result of SDS-PAGE, the band of TGF- ⁇ 1 was not detected from the supernatant, and it was confirmed that almost all of the TGF- ⁇ 1 used was coupled. About 40 pmol of TGF- ⁇ 1 was immobilized on about 1 ⁇ L of resin.
- the random sequence RNA (40N) used in the first round was obtained by transcribing chemically synthesized DNA using T7 RNA polymerase (Y639F).
- the RNA obtained by this method is obtained by fluorinating the 2'position of ribose of the pyrimidine nucleotide.
- a DNA template a DNA having a length of 80 nucleotides having primer sequences at both ends of a random sequence of 40 nucleotides shown below was used.
- the DNA template and primer those prepared by chemical synthesis were used.
- DNA template sequence 5'-TGATAGGCTTCAGTAGACGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTACCTTAGATGCGGATCCC-3'(SEQ ID NO: 1)
- Primer Fwd 5'-TAATACGACTCACTATAGGGATCCGCATCTAGAGTAC-3'(SEQ ID NO: 2)
- Primer Rev 5'-TGATAGCTTCAGTAGAGTT-3'(SEQ ID NO: 3)
- N in the DNA template is any combination of nucleotides (A, G, C or T).
- the primer Fwd contains the promoter sequence of T7 RNA polymerase.
- RNA pool was added to a carrier on which TGF- ⁇ 1 was immobilized, and the mixture was held at room temperature for 30 minutes, and then the resin was washed with Solution A in order to remove RNA that did not bind to TGF- ⁇ 1.
- Solution A is a mixed solution of 145 mM sodium chloride, 5.4 mM potassium chloride, 1.8 mM calcium chloride, 0.8 mM magnesium chloride, 20 mM Tris (pH 7.6), and 0.05% Tween 20.
- RNA bound to TGF- ⁇ 1 was recovered from the supernatant after adding solution B as an eluate and heat-treating at 90 ° C. for 5 minutes.
- the solution B is a mixed solution of 7M urea, 5 mM EDTA, and 0.1 M tris (pH 7.6).
- the recovered RNA was amplified by RT-PCR, transcribed with T7 RNA polymerase (Y639F), and used as a pool for the next round. The above was set as one round, and the same work was repeated a plurality of times.
- the PCR product was cloned into a pGEM-T Easy vector (manufactured by Promega), and the Escherichia coli strain DH5 ⁇ (manufactured by TAKARA) was transformed. After extracting the plasmid from the single colony, the nucleotide sequence of the clone was examined with a DNA sequencer (consigned to FASMAC).
- SEQ ID NOs: 4 to 13 were obtained as sequences from which two or more clones were obtained.
- SEQ ID NO: 4 gggaucccucucugaguaacUAAGGGGUGGGGGAGACUUGGGCCGGGGCAGUCAGACGCGGUGAacgucuacugaagcuauca
- SEQ ID NO: 5 gggaucccucucugaguaacAUCGUGGGCGGGGAAAAGCCGCCCCUUCUCUCUCGGGUCCUAGAacgucuacugaagcuauca
- SEQ ID NO: 7 gggaucccucucuagguaacGAAUAGUAAGGGGAAUGACUCUCGGACCAAUGUAUUGCUAUAacgucuacugaagcuauca
- SEQ ID NO: 8 gggaucccucucugagucGAUGUGCUUGUGCUGAAAAUUAGAUUUCCG
- Example 2 Preparation of RNA aptamer that specifically binds to TGF- ⁇ 1 2
- SELEX As the target substance of SELEX, TGF- ⁇ 1 (Recombinant Human TGF- ⁇ 1, manufactured by Peprotech) immobilized on a carrier of NHS-active Sepharose TM 4 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare) was used.
- the sequences of the templates and primers used are shown below. DNA templates and primers were prepared by chemical synthesis.
- N in the DNA template is any combination of nucleotides (A, G, C or T).
- the primer Fwd contains the promoter sequence of T7 RNA polymerase.
- nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17 to 22 are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed in the Examples are represented in the 5'to 3'direction, and each nucleotide has a purine (A and G) of 2'-OH (natural RNA type). It means that pyrimidines (U and C) are 2'-fluoromodifieds. The primer binding sequence is shown in lowercase.
- SEQ ID NO: 17 gggagaacuguggagcuGAUGUCUGGAGUCCCCAUAUAUCACGUACAGUGUGucggacgguc
- SEQ ID NO: 18 gggagaacuguggagcuCCCCCUCGCACUUAAUGGGUUCUGUGGGCUGGGAGAAagugccugaccuguc
- SEQ ID NO: 19 gggagaacuguggagcuCCCCCUCGCAUUCGGGAUUAAUUUGUGACUGCAUGUGkgacgucguaguc
- 20 gggagaacuguggagcuGGUCCGGAAAACUGGAUCUCUCUCUAAAAGGGGUACCaggucgaccugacc
- SEQ ID NO: 22 gggagaacuugagcuUGACGGCGCGUACAUUAUGCU
- Example 3 Preparation of RNA aptamer that specifically binds to TGF- ⁇ 1 3
- SELEX As the target substance of SELEX, TGF- ⁇ 1 (Recombinant Human TGF- ⁇ 1, manufactured by Peprotech) immobilized on a carrier of NHS-active Sepharose TM 4 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare) was used.
- the sequences of the templates and primers used are shown below. DNA templates and primers were prepared by chemical synthesis.
- DNA template sequence 5'-CTGACTCGACGTCGCAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTGACACTAGTGCATTCCC-3'(SEQ ID NO: 23)
- Primer Fwd 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATGCACTAGTGTTCAA-3'(SEQ ID NO: 24)
- Primer Rev 5'-CTGACTCGACGGTGCAAGCTT-3'(SEQ ID NO: 25)
- N in the DNA template is any combination of nucleotides (A, G, C or T).
- the primer Fwd contains the promoter sequence of T7 RNA polymerase.
- nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 26 to 28 are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed in the Examples are represented in the 5'to 3'direction, and each nucleotide has a purine (A and G) of 2'-OH (natural RNA type). It means that pyrimidines (U and C) are 2'-fluoromodifieds. The primer binding sequence is shown in lowercase.
- SEQ ID NO: 26 gggaaugcacuaguguucaaCCCCGACCAAAUAGCAGGCCCGUCUUUAACUAUUGGAAUCGCAUAACGGGGCCCaagcuugccugagugag
- SEQ ID NO: 27 gggaaugcacuaguguaaCAUUUAGCAACACAAAGUCGUCCCCCCACGGCAAGCAGUCCUCAUCCUGACaagcuugccucggugagugag
- SEQ ID NO: 28 gggaaugcacuaguguucacaUAAACACUAAGUGAUCCUCCUGCAAGCUAUGAAGAACUUAACGGCUCGUAAagcuugccugagugag
- Example 4 Measurement of inhibitory activity of aptamer on TGF- ⁇ 1 1 Monitor the Smad signaling pathway known to activate TGF- ⁇ stimulation to determine if the nucleic acids of SEQ ID NOs: 4-13, 17-22, 26-28 inhibit TGF- ⁇ 1 activity. Evaluated by cell assay system. Specifically, a fotina luciferase containing SBE (Smad-binding element) in the promoter region was used as a reporter (pGL4.48 [luc2P / SBE / Hygro] Vector, Promega).
- TGF- ⁇ 1 and nucleic acid aptamers of SEQ ID NOs: 4 to 13, 17 to 22, and 26 to 28 synthesized using T7 RNA polymerase (Y639F) was added thereto so that the final concentrations were 80 pM and 20 nM, respectively.
- Y639F T7 RNA polymerase
- the expression levels of fotina luciferase and reniral luciferase were confirmed using Dual-Luciferase (registered trademark) Reporter Assay System (Promega).
- the measured value of fotina luciferase in each sample is corrected by the measured value of reniral luciferase, and the ratio of fotina luciferase to reniral luciferase in the sample to which TGF- ⁇ 1 is not added is set to 1 and the relative value of each sample.
- the expression level was calculated. Further, the relative expression level of the sample to which only TGF- ⁇ 1 was added was defined as an inhibition rate of 0%, and the relative expression level of the sample to which TGF- ⁇ 1 was not added was defined as an inhibition rate of 100%, and each nucleic acid was added. The inhibitory activity was determined.
- nucleic acid consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5, 11, 13, 17, 18, 20, 21, 22, 27 and 28 specifically bound to TGF- ⁇ 1 (Table). Left column of 1).
- nucleic acid consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 6, 9, 19, 21 and 26 showed strong inhibitory activity in the cell assay system (right column in Table 1).
- nucleic acid consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5, 7 to 8, 10 to 13, 17 to 18, 20, 22, 27 to 28 has an inhibitory activity on TGF- ⁇ 1 in the cell assay system. There wasn't.
- the aptamer having the nucleotide sequence represented by the above common sequence 1 exhibits a remarkably strong inhibitory activity against TGF- ⁇ 1.
- the aptamer having the nucleotide sequence represented by the common sequence 1 was considered to be an aptamer that specifically and remarkably strongly binds to TGF- ⁇ 1. Further, it was considered that the aptamer having the nucleotide sequence represented by the common sequence 1 is highly likely to be an aptamer capable of inhibiting the activity of TGF- ⁇ 1.
- Example 5 Shortening of aptamer The aptamer of SEQ ID NO: 21 was shortened. The sequences of these shortened products are shown in SEQ ID NOs: 29 to 31.
- nucleotide sequences of each are shown below.
- the underline shows the common sequence 1 portion found in Examples 1 to 4. Unless otherwise stated, the individual sequences listed in the Examples are represented in the 5'to 3'direction, and each nucleotide has a purine (A and G) of 2'-OH (natural RNA type). It means that pyrimidines (U and C) are 2'-fluoromodifieds.
- the primer binding sequence is shown in lowercase.
- SEQ ID NO: 29 (A sequence obtained by shortening the aptamer represented by SEQ ID NO: 21 to a length of 51 nucleotides including a common sequence) gggagaacuuggagcuCCUGA AUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGG CUAA
- SEQ ID NO: 30 (A sequence in which the aptamer represented by SEQ ID NO: 21 is shortened to a length of 26 nucleotides including a part of a common sequence) GGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGG CUAA
- SEQ ID NO: 31 (A sequence obtained by shortening the aptamer represented by SEQ ID NO: 21 to a length of 33 nucleotides including a common sequence) ggc AUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGG CUAA
- the nucleic acids of SEQ ID NOs: 29 to 31 were obtained by transcribing using T7 RNA polymerase (Y639F) using a DNA sequence containing the promoter sequence of chemically synthesized T7 RNA polymerase as a template.
- the nucleic acids of SEQ ID NOs: 21, 29, and 31 were obtained by transcription using T7 RNA polymerase (Y639F) using a DNA sequence containing the promoter sequence of chemically synthesized T7 RNA polymerase as a template. Whether these nucleic acids inhibit the activity of TGF- ⁇ 1 was evaluated by the luciferase reporter assay as in Example 4. The measurement results are shown in Table 2. In Table 2, the results of two independent tests are also shown for the value of the luciferase assay inhibition rate.
- the inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 was maintained even when the sequences around the common sequence were excluded (SEQ ID NOS: 29 and 31). On the other hand, when the common sequence was removed, the inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 was significantly reduced (SEQ ID NO: 30). From the above, it was shown that the common sequence 1 is important for exerting the binding activity to TGF- ⁇ 1 and the inhibitory activity to TGF- ⁇ 1.
- Example 6 Preparation of highly active TGF- ⁇ 1 aptamer 1 Among the sequences represented by SEQ ID NO: 31, SELEX was performed using an RNA pool in which a part of the common sequence 1 was made into a random sequence. SELEX was carried out in the same manner as in Example 1. The template and the primer sequence on the 5'end side are shown below. In addition, the nucleic acid of SEQ ID NO: 16 was used as the primer Rev.
- DNA template sequence 5'-gggagaacttggagctcctgaNNNNNNNGGGNGNGGGGNNNNNNNNGTGNGNGGGGNNNNagtggacgtccatcc-3'(SEQ ID NO: 32)
- Primer Fwd 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTGGAGCTCCTGA-3'(SEQ ID NO: 33)
- the sequences after 2R had common sequence 2 (SEQ ID NO: 34). .. Among them, the sequence having the largest number of reads (SEQ ID NO: 35), the sequence having the next largest number (SEQ ID NO: 36), and the sequence having the largest number of reads (SEQ ID NO: 35) are one base different (SEQ ID NO: 37, 38), a sequence in which the portion of the common sequence 2 in SEQ ID NO: 35 is deleted by one base (SEQ ID NO: 39), and a sequence in which a single base is deleted at a position different from SEQ ID NO: 39 (the last GGG on the 3'end side) (SEQ ID NO: 39).
- SEQ ID NOs: 35 to 40 are all sequences detected in this experiment (Example 6). Unless otherwise stated, the individual sequences listed in the Examples are represented in the 5'to 3'direction, and each nucleotide has a purine (A and G) of 2'-OH (natural RNA type). It means that pyrimidines (U and C) are 2'-fluoromodifieds. The primer binding sequence is shown in lowercase.
- SEQ ID NO: 34 (Common sequence 2 obtained from this experiment) AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGG (H represents A, C or U; W represents A or U)
- nucleotide sequences of each are shown below.
- the underline shows the portion corresponding to the common sequence 2 (SEQ ID NO: 34).
- SEQ ID NO: 34 the individual sequences listed in the Examples are represented in the 5'to 3'direction, and each nucleotide has a purine (A and G) of 2'-OH (natural RNA type). It means that pyrimidines (U and C) are 2'-fluoromodifieds.
- the primer binding sequence is shown in lowercase.
- SEQ ID NO: 35 (sequence with the highest number of reads detected by the high-throughput sequencer) gggagaacuuggagcuccuga AUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGG CAAGagugcgacgucaguc
- SEQ ID NO: 36 (sequence with the second highest number of reads detected by the high-throughput sequencer) gggagaacuuggagcuccuga AUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGG CAAAagugcgacgucaguc
- SEQ ID NO: 38 (A sequence that differs by one base from the sequence having the largest number of reads (SEQ ID NO: 35)) gggagaacu
- aptamers containing the nucleotide sequence represented by the common sequence 2 showed inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 (SEQ ID NOs: 35-38, 40).
- aptamers lacking a part of common sequence 2 did not have inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 (SEQ ID NOs: 39 and 41). From these results, it was clarified that the aptamer having the nucleotide sequence represented by the common sequence 2 (SEQ ID NO: 34) binds to TGF- ⁇ 1 and inhibits the activity of TGF- ⁇ 1.
- Example 7 Shortening and base substitution of highly active TGF- ⁇ 1 aptamer
- the sequence represented by SEQ ID NO: 35 was shortened with reference to SEQ ID NO: 31 to obtain SEQ ID NO: 42. Further, from the results of the high-throughput sequence, in order to determine the optimum bases at two locations considered to be highly variable, sequences substituted with other bases based on SEQ ID NO: 42 were prepared (SEQ ID NOs: 43 to 47). Further, referring to the result of the high-throughput sequence, among the sequences with a relatively large number of detected reads, SEQ ID NO: 48 having a pattern different from that of SEQ ID NOs: 43 to 47 was prepared.
- nucleotide sequences of each are shown below. Unless otherwise stated, the individual sequences listed in the Examples are represented in the 5'to 3'direction, and each nucleotide has a purine (A and G) of 2'-OH (natural RNA type). It means that pyrimidines (U and C) are 2'-fluoromodifieds. [] Indicates nucleotides considered to be highly variable.
- SEQ ID NO: 42 (A sequence obtained by shortening the aptamer represented by SEQ ID NO: 35 to a length of 33 nucleotides with reference to SEQ ID NO: 32) GGC AUAAGGG [A] GGGGAGACUUGUGG [A] GGG CAAG SEQ ID NO: 43: (A sequence in which the 11th A of the aptamer represented by SEQ ID NO: 42 is replaced with U) GGC AUAAGGG [U] GGGGAGACUUGUGG [A] GGG CAAG SEQ ID NO: 44: (A sequence in which the 11th A of the aptamer represented by SEQ ID NO: 42 is replaced with C) GGC AUAAGGG [C] GGGGAGACUUGUGG [A] GGG CAAG SEQ ID NO: 45: (A sequence in which the 26th A of the aptamer represented by SEQ ID NO: 42 is replaced with U) GGC AUAAGGG [A] GGGGAGACUUGUGG [U] GGG CAAG SEQ ID NO:
- the aptamer containing the nucleotide sequence represented by the common sequence 2 showed inhibitory activity against TGF- ⁇ 1 even when the chain was shortened (SEQ ID NO: 42).
- Example 8 Optimization of chemical modification of highly active shortened aptamer 1 Based on the sequence represented by SEQ ID NO: 42, the nucleotide ribose was modified to a chemically modified product of 2'-OMe, and the effect of the aptamer on the TGF- ⁇ 1 inhibitory activity was investigated.
- the prepared variants are shown in SEQ ID NOs: 42 (1) to 42 (3).
- Each nucleotide means that the purines (A and G) are 2'-OH (natural RNA type) and the base described as (F) is a 2'-fluoromodified form. Further, the base described as (M) means that it is a 2'-OMe modified product.
- the individual sequences listed in the examples are represented in the 5'to 3'direction.
- each nucleotide means that the purines (A and G) are 2'-OH (natural RNA type) and the base described as (F) is a 2'-fluoromodified form. Further, the base described as (M) means that it is a 2'-OMe modified product.
- the individual sequences listed in the examples are represented in the 5'to 3'direction.
- the aptamer of the present invention may be useful as a prophylactic and / or therapeutic drug, diagnostic agent or labeling agent for various diseases associated with TGF- ⁇ 1 activation such as fibrosis and cancer.
- This application is based on Japanese Patent Application No. 2019-126940 filed in Japan (Filing date: July 8, 2019), the contents of which are incorporated herein by reference in its entirety.
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Abstract
本発明は、TGF-β1に対するアプタマーを提供することを目的とする。連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ下記式(I)および式(II)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含むTGF-β1に結合するアプタマーはTGF-β1の活性化が関与する各種疾患の予防および/または治療用医薬、診断薬または標識剤として有用であり得る。 式(I):UAAX 式(II):ARACUU (式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表す)
Description
本発明は、トランスフォーミング増殖因子β1に対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。
トランスフォーミング増殖因子β(Transforming Growth Factor-β:TGF-β)は、当初、線維芽細胞の形質転換を促進する増殖因子として同定された(非特許文献1、2)。近年の研究において、数多くの細胞種に対し増殖抑制、細胞分化、細胞接着・遊走、アポトーシスの誘導などに寄与することが明らかとなっている。よってTGF-βは個体発生や組織再構築、創傷治癒、炎症や免疫、癌の湿潤転移など幅広い領域において重要な役割を果たしていると考えられている。TGF-βにはアミノ酸配列に70~80%の相同性を有する5つのアイソフォームの存在が知られ、このうち最初に発見されたものがTGF-β1である。TGF-β1を始めとして各アイソフォームは高分子量の不活性型(潜在型)として分泌され、標的細胞の近傍で活性化を受けて作用を発揮する。細胞外マトリックス蛋白質の産生および沈着促進活性は、TGF-β1の生物活性の大きな部分を占めている。線維化をきたす各種疾患(肺線維症、肝線維症、スキルス胃癌等)においては血漿中のTGF-β1値が上昇する。また、腎糸球体病変、骨疾患、虚血性疾患などとの関連も注目されている。
TGF-β1に結合し、その機能を阻害する分子がこれまでに幾つか報告されている。抗TGF-βモノクローナル抗体であるLY238770(TGF-β1を認識)やFresolimumab(GC1008;TGF-β1、2、および3を認識)は標的であるTGF-β1に結合し(非特許文献3)、その機能阻害効果によって、数種の悪性新生物および特発性肺線維症に対する新たな治療薬として期待されている(NCT00356460、NCT00923169、NCT01472731、NCT01112293、NCT01401062;非特許文献4)。また、TGF-β1に結合し、機能阻害効果を示すペプチドも報告されている(非特許文献5)。低分子では、TGF-β1が結合するTGF-β1型受容体に結合することで機能阻害効果を示すGalunisertib(LY2157299)などが報告されている。
また、ヒトTGF-β1に特異的な抗体は、TGF-β1糸球体腎炎(非特許文献6)、神経瘢痕(neural scarring)(非特許文献7)、皮膚瘢痕(非特許文献8)、および肺線維症(非特許文献9)の処置について動物モデルで有効であることが示されてきた。さらに、TGF-β1、2および3に対する抗体は、肺線維症、放射線誘発線維症(特許文献5)、骨髄線維症、火傷、デュピュイトラン拘縮、胃潰瘍および関節リウマチ(非特許文献10)のモデルに有効であることが示されてきた。
ところで、アプタマーは標的分子(タンパク質、糖鎖、ホルモン等)に特異的に結合する核酸を意味する。一本鎖のRNA(又はDNA)がとる三次元立体構造によって、標的分子に結合する。その取得にはSELEX法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)と呼ばれるスクリーニング法が用いられる(特許文献1~3)。SELEX法で得られるアプタマーは80ヌクレオチド程度の鎖長であり、その後標的分子の生理阻害活性を指標に短鎖化を図る。さらに生体内での安定性向上を目的に化学修飾を加え、医薬品としての最適化を図る。アプタマーは標的分子との結合特性が高く、同様な機能をもつ抗体と比較してもその親和性は高い場合が多い。さらに免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害(ADCC)や補体依存性細胞障害(CDC)などの副作用は起こりにくいとされる。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の1/10程度の分子サイズであるため組織移行が起こりやすく、目的の部位まで薬物を送達させることがより容易である。また同じ分子標的医薬の低分子においては、中には難溶性のものもあり、その製剤化には最適化が必要である場合もあるが、アプタマーは水溶性が高いため、その点でも有利である。さらに化学合成により生産されるので、大量生産すればコストダウンを図ることができる。その他、長期保存安定性や熱・溶媒耐性もアプタマーの優位な特徴である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。
TGF-βに対するアプタマーとしては、Gilead Sciences社が開発していたアプタマーが存在する。そして特許文献4には、上記SELEX法により得られたTGF-βに結合するアプタマーが記載されている。しかしながら当該アプタマーは、本明細書中に具体的に示されるアプタマーとは配列が異なる。またこの文献には本明細書中に具体的に示されるアプタマーについては何ら示唆されていない。
Roberts AB et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Sep;78(9):5339-43.
Anzano MA. et al., Cancer Res. 1982 Nov;42(11):4776-8.
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本発明は、TGF-β1に対するアプタマーを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、TGF-β1に特異的に結合するアプタマーを製造することに成功し、このアプタマーがTGF-β1の活性を阻害することを示した。特に本アプタマーの多くは、特徴的なモチーフ配列と連続したG塩基の集合を4つ有し、従来公知のTGFアプタマーとは全く異なる構造を持つアプタマーである点で新しいものであった。
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである:
[1]連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ下記式(I)および式(II)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマー。
式(I):UAAX
式(II):ARACUU
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表す)
[2]式(I):UAAXで表されるヌクレオチド配列が4つのG塩基の集合の最もN末端側に位置し、式(II):ARACUUで表されるヌクレオチド配列が2つ目のG集合と3つ目のG集合の間に位置する、[1]に記載のアプタマー。
[3][1]または[2]に記載のアプタマーであって、下記式(III)
式(III):UAAXGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Nは、任意の塩基を表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す。(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
[4][1]または[2]に記載のアプタマーであって、下記式(III’)
式(III’):UAAXGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す。(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
[5][1]または[2]に記載のアプタマーであって、下記式(III’’)
式(III’’):AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGGG
(式中、Wは、AまたはUを表し;Hは、A、CまたはUを表す)
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
[6]アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されている、[1]~[5]のいずれかに記載のアプタマー。
[7]以下(a)~(c)のいずれかのヌクレオチド配列を含む、TGF-β1に結合するアプタマー。
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される配列
(b)上記(a)において、1ないし数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列;または、
(c)上記(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列。
[8]ヌクレオチドの長さが55ヌクレオチド以下である、[1]~[6]のいずれかに記載のアプタマー。
[9]TGF-β1とTGF-β1の受容体との結合を阻害する、[1]~[8]のいずれかに記載のアプタマー。
[10][1]~[9]のいずれかに記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
[11][1]~[9]のいずれかに記載のアプタマーまたは[10]に記載の複合体を含む医薬。
[12][1]~[9]のいずれかに記載のアプタマーまたは[10]に記載の複合体を用いることを特徴とする、TGF-β1の検出方法。
[1]連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ下記式(I)および式(II)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマー。
式(I):UAAX
式(II):ARACUU
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表す)
[2]式(I):UAAXで表されるヌクレオチド配列が4つのG塩基の集合の最もN末端側に位置し、式(II):ARACUUで表されるヌクレオチド配列が2つ目のG集合と3つ目のG集合の間に位置する、[1]に記載のアプタマー。
[3][1]または[2]に記載のアプタマーであって、下記式(III)
式(III):UAAXGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Nは、任意の塩基を表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す。(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
[4][1]または[2]に記載のアプタマーであって、下記式(III’)
式(III’):UAAXGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す。(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
[5][1]または[2]に記載のアプタマーであって、下記式(III’’)
式(III’’):AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGGG
(式中、Wは、AまたはUを表し;Hは、A、CまたはUを表す)
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
[6]アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されている、[1]~[5]のいずれかに記載のアプタマー。
[7]以下(a)~(c)のいずれかのヌクレオチド配列を含む、TGF-β1に結合するアプタマー。
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される配列
(b)上記(a)において、1ないし数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列;または、
(c)上記(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列。
[8]ヌクレオチドの長さが55ヌクレオチド以下である、[1]~[6]のいずれかに記載のアプタマー。
[9]TGF-β1とTGF-β1の受容体との結合を阻害する、[1]~[8]のいずれかに記載のアプタマー。
[10][1]~[9]のいずれかに記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
[11][1]~[9]のいずれかに記載のアプタマーまたは[10]に記載の複合体を含む医薬。
[12][1]~[9]のいずれかに記載のアプタマーまたは[10]に記載の複合体を用いることを特徴とする、TGF-β1の検出方法。
本発明によれば、TGF-β1の活性を選択的に阻害することができる。従って、本発明によれば、TGF-β1の過剰発現に起因する疾患等を治療することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において、核酸塩基の略号は以下の通りとする。
記号 意味 説明
A A アデニン
C C シトシン
G G グアニン
T T チミン
U U ウラシル
M A又はC アミノ
R A又はG プリン
W A又はU -
S C又はG -
Y C又はU ピリミジン
K G又はU ケト
V A又はC又はG -
H A又はC又はU -
B C又はG又はU -
N A又はC又はG又はU -
(小文字を使用した場合も同様である。)
記号 意味 説明
A A アデニン
C C シトシン
G G グアニン
T T チミン
U U ウラシル
M A又はC アミノ
R A又はG プリン
W A又はU -
S C又はG -
Y C又はU ピリミジン
K G又はU ケト
V A又はC又はG -
H A又はC又はU -
B C又はG又はU -
N A又はC又はG又はU -
(小文字を使用した場合も同様である。)
本発明は、TGF-β1に対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、TGF-β1の活性を阻害し得る。
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、TGF-β1に対して結合活性を有するアプタマーである。またTGF-β1の活性を阻害し得るアプタマーであり得る。また本発明のアプタマーは、RNA、DNA、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
TGF-β1(transforming growth factor-β1)は、多機能性サイトカインであり、ほとんど全ての細胞で産生されるタンパク質である。TGF-β1タンパク質は、前駆体ポリペプチド(UniProtKB-P01137、390アミノ酸残基:シグナルペプチド(1~29位)、LAP(30~278位)、成熟型(或いは活性型)TGF-β1(279~390位))として産生される。該前駆体ポリペプチドは、furin様プロテアーゼにより切断され、N末側のLAP(latency associated protein、249アミノ酸残基)およびC末側の成熟型TGF-β1(112アミノ酸残基)を生じる。LAP及び成熟型TGF-β1部分は、ジスルフィド結合を介して各々ホモ二量体化する。かかるホモ二量体化した成熟型TGF-β1とLAPは、非共有結合的に結合して複合体を形成する。ヒトを含む哺乳動物において、TGF-βにはβ1、β2、β3の3つのアイソフォームが存在する。これらのアイソフォームの相同性は70~80%である。TGF-β1は、細胞増殖、細胞分化の制御、上皮間葉転換の誘導、T細胞の分化制御を介した免疫系調節、血管新生の調節、細胞外基質の産生促進など多く機能を有することが知られている。上述した通り、TGF-β1の阻害剤の投与により、がんや線維症等の疾患を治療し得ることが報告されている。
本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するTGF-β1に対する結合活性を有する。また本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するTGF-β1に対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類(例、ヒト、サル)、げっ歯類(例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター)、並びにペット、家畜及び使役動物(例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)が挙げられるが、好ましくはヒトである。尚、TGF-β1のアミノ酸配列は野生型の配列に限定されず、野生型の配列に対して1~数残基の変異が入ったものや、そのドメイン部分、ペプチド部分であってもよい。
本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液中でTGF-β1へ結合する。緩衝液としては特に限定されるものではないが、pHが約5.0~10.0程度のものが好ましく用いられ、このような緩衝液としては、例えば後述する溶液A(実施例1参照)が挙げられる。本発明のアプタマーは、以下のいずれかの試験により検出可能な程度の強度で、TGF-β1へ特異的に結合するものである。
結合強度の測定にはGEヘルスケア社製のBiacore T200等を用い得る。一つの測定方法としては、まずセンサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は約1000RU(例、1500RU等)とする。アナライト用のTGF-β1溶液は1nM~200nM(例、4nMまたは10nM等)に調製したものを20μLインジェクトし、TGF-β1のアプタマーへの結合を検出する。30~100ヌクレオチド(例、66、80、または90ヌクレオチド等)からなるランダムなヌクレオチド配列を含むRNAをネガティブコントロールとし、該コントロールRNAと比較してTGF-β1が同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはTGF-β1への結合能を有すると判定することができる。
別の測定方法としては、まずセンサーチップにTGF-β1を固定化する。固定化量は約1000RUとする。アナライト用のアプタマー溶液は10nM~200nM(例、20nMまたは100nM等)に調製したものを20μLインジェクトし、アプタマーのTGF-β1への結合を検出する。30~100ヌクレオチド(例、66、80、または90ヌクレオチド等)からなるランダムなヌクレオチド配列を含むRNAをネガティブコントロールとし、該コントロールRNAと比較してTGF-β1が同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはTGF-β1への結合能を有すると判定する。
TGF-β1に対する阻害活性とは、TGF-β1が保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、TGF-β1の活性には、TGF-β媒介シグナル伝達、細胞外マトリックス(ECM)沈着、上皮および内皮細胞増殖の阻害、平滑筋増殖の促進、コラーゲン発現の誘導、TGF-β、フィブロネクチン、VEGFおよびIL-11の発現の誘導、腫瘍誘導免疫の抑制、血管新生の促進、筋線維芽細胞の活性化、転移の促進、ならびにNK細胞活性の阻害等が含まれるが、これらに限定されない。本発明のアプタマーは、これらのTGF-β1の活性の少なくとも1つを阻害する。
TGF-β1の活性をアプタマーが阻害するか否かは、例えば、実施例に記載されるように、TGF-βの刺激によって活性化することが知られているSmadシグナリングパスウェイをモニターする細胞アッセイ系によって評価することができる。簡潔には、次のような手段により評価が可能である:プロモーター領域にSBE(Smad-binding element)を搭載したフォティナスルシフェラーゼをレポーターとして用いる。このSBE誘発フォティナスルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、トランスフェクション効率の標準化コントロールとしてレニラルシフェラーゼ発現プラスミドを適切な比率(例えば20:1)で混合し、HEK293細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションしたHEK293細胞を改めて96ウェルプレートにまき直しコンフルエントになるまで培養する。そこへTGF-β1とT7 RNAポリメラーゼを用いて合成したアプタマーあるいは化学合成したアプタマーの混合液を適切な終濃度(例えば、10pM~100nM等)になるように添加し、1~8時間(例、3時間等)培養する。その後、適切な手段を用いてフォティナスルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの発現量を確認する。発現量を適宜補正した後に比較することで、TGF-β1の活性をアプタマーが阻害するか否かを評価することができる。
一態様において、本発明のアプタマーは、G塩基の集合を4つ有し、かつ、下記式(I)および式(II)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマーである。
式(I):UAAX
式(II):ARACUU
式(II):ARACUU
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表す)。
尚、「結合」とは、Xの位置にはヌクレオチドが存在せず、Xの5’側に隣接するヌクレオチド(即ち、アデノシン5’-リン酸)が、Xの3’側に隣接するリボヌクレオチドとホスホジエステル結合でつながっている状態を意味する。
尚、「結合」とは、Xの位置にはヌクレオチドが存在せず、Xの5’側に隣接するヌクレオチド(即ち、アデノシン5’-リン酸)が、Xの3’側に隣接するリボヌクレオチドとホスホジエステル結合でつながっている状態を意味する。
一態様において、本発明のアプタマーは、前述したようにG塩基の集合を4つ有し、かつ、式(I):UAAX、そして式(II):ARACUUでそれぞれ表されるヌクレオチド配列も有するという特徴を有している。4つの「G塩基の集合」、「式(I)で表されるヌクレオチド」、「式(II)で表されるヌクレオチド」の並びは特に限定されるものではないが、好ましくは、本発明のアプタマーを構成する式(I)UAAXで示されるモチーフは、最もN末端側に位置するG集合(以下、本発明のアプタマーに含まれる4つのG集合を、N末端側から「1つ目のG集合」、「2つ目のG集合」、「3つ目のG集合」、及び「4つ目のG集合」と称することがある)のN末端側に存在し、式(II)ARACUUで示されるモチーフは2つ目のG集合と3つ目のG集合の間に存在する。なお本概略図(図1)では一例としてパラレル型のGカルテット構造として表記しているが、他のGカルテット構造の型(アンチパラレル型、ミックス型)や、また4重鎖以外の3重鎖やその他の立体構造を取り得る可能性を否定するものではない。
上記した「G塩基の集合」におけるG塩基の数は、2以上であればG塩基が連続している限りにおいて特に限定されないが、好ましくは5以下であり、より好ましくは2~4である。4つある全ての「G塩基の集合」が全て同じG塩基数となる必要はなく、本発明のアプタマーが所望の活性を有する限りにおいて適切なG塩基数を選択することができる。ただし「2つ目のG集合」のG塩基数は4であることが望ましく、「4つ目のG集合」のG塩基数は3であることが望ましい。
上記した「G塩基の集合」と「式(I)で表されるヌクレオチド」、「式(II)で表されるヌクレオチド」のそれぞれは、本発明のアプタマーが所望の活性を有する限りにおいて直接隣接していてもよいし、隣接していなくても良い。隣接していない場合の間隔としては、特に限定されないものの、1~数塩基、例えば1~9塩基、1~5塩基、1~3塩基程度が望ましい。2つの「G塩基の集合」の間には少なくとも1塩基のG以外の塩基が存在する。
本発明のアプタマーがとり得る構造体として予測されるGカルテット構造とは、本技術分野において周知の構造であり、グアノシンヌクレオチド(G)に富むDNA又はRNAにおける分子間及び分子内の四重鎖構造である。Gカルテット構造は、4つのグアノシン塩基が互いに隣接する2つのグアノシン塩基とフーグスティン型塩基対によって環状に4量体化した面を基本構造とする。最終的に2~3面積み重なり、安定な四重鎖構造を形成する(G-quadruplex)。
本発明のアプタマーが有し得るGカルテット構造を図1に例証する。図1における白い矢印はGカルテット構造に関与する、連続する2個以上のG(「G集合」)を意味し、黒い矢印は結合又は1又は複数の塩基を意味する。
Gカルテット構造を有するアプタマーであることは、自体公知の測定手段によって確認することができる。例えば、CDスペクトルを用いて、所定の波形を確認することでGカルテット構造を有するアプタマーであると確認できる。より具体的には、アプタマーをTBS緩衝液(10m MTris-HCl、150mM NaCl、5mM KCl、pH7.4)に溶解して試料液を調製し、温度20℃、波長200nm~320nm、走査速度100nm/分、積算回数10回の条件下でスペクトル測定したときのCDスペクトルにおいて、240nm近傍の極小値と260nm近傍での極大値の出現により確認できる。
本発明のアプタマーは、別の一態様において、連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ、下記式(III)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマーである。
式(III):UAAXGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Nは、任意の塩基を表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))。尚、「ただし、G塩基の集合が4つとなる場合に限る」とは、前記式中のG塩基の集合が4つとならない組合せを生じる塩基の組み合わせが除外されることを意味する。前記式中のG塩基の集合が4つとならない組合せを生じる塩基の組み合わせとしては、以下が例示されるがこれらに限定されない:
(1)KがG、
(2)第1番目のRがGであり、且つ、第1番目のNがG、
(3)K、V、第2番目のN、及び第3番目のRが全てG。
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Nは、任意の塩基を表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))。尚、「ただし、G塩基の集合が4つとなる場合に限る」とは、前記式中のG塩基の集合が4つとならない組合せを生じる塩基の組み合わせが除外されることを意味する。前記式中のG塩基の集合が4つとならない組合せを生じる塩基の組み合わせとしては、以下が例示されるがこれらに限定されない:
(1)KがG、
(2)第1番目のRがGであり、且つ、第1番目のNがG、
(3)K、V、第2番目のN、及び第3番目のRが全てG。
一態様において、式(III)は以下の配列であり得る。
式(III-1):UAAGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG(Xが結合である場合(配列番号49))、
式(III-2):UAAGUGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG(XがGUである場合(配列番号50))
(式中、N、R、S、K、VおよびBは上述の通りであり、且つ、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る。)
式(III-1):UAAGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG(Xが結合である場合(配列番号49))、
式(III-2):UAAGUGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG(XがGUである場合(配列番号50))
(式中、N、R、S、K、VおよびBは上述の通りであり、且つ、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る。)
本発明のアプタマーは、別の一態様において、連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ、下記式(III’)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマーである。
式(III’):UAAXGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;B は、C、GまたはUを表す(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))。
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;B は、C、GまたはUを表す(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))。
一態様において、式(III’)は以下の配列であり得る。
式(III’-1):UAAGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG(Xが結合である場合(配列番号51));
式(III’-2):UAAGUGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG(XがGUである場合(配列番号52))
(式中、R、S、K、VおよびBは上述の通りであり、且つ、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る。)
式(III’-1):UAAGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG(Xが結合である場合(配列番号51));
式(III’-2):UAAGUGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG(XがGUである場合(配列番号52))
(式中、R、S、K、VおよびBは上述の通りであり、且つ、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る。)
本発明のアプタマーは、別の一態様において、連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ、下記式(III’’)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマーである。
式(III’’):AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGGG
(式中、Wは、AまたはUを表し;Hは、A、CまたはUを表す)(配列番号34)
(式中、Wは、AまたはUを表し;Hは、A、CまたはUを表す)(配列番号34)
また、本発明の別の一態様において、本発明のアプタマーには、以下のTGF-β1に結合する活性および/またはTGF-β1の生物学的活性を阻害する活性を有するアプタマーも含まれ得る:
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される塩基配列を含むアプタマー、
(b)(a)において、1ないし数個(例、1個、2個、3個、4個、又は5個)のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、または付加された配列を含むアプタマー、または
(c)(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列を含むアプタマー。
尚、ここに列挙したアプタマーには、上述の共通モチーフを含まないアプタマーも含まれ得る(即ち、配列番号:5、11、13、18、19、20、22、26、および27)。
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される塩基配列を含むアプタマー、
(b)(a)において、1ないし数個(例、1個、2個、3個、4個、又は5個)のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、または付加された配列を含むアプタマー、または
(c)(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列を含むアプタマー。
尚、ここに列挙したアプタマーには、上述の共通モチーフを含まないアプタマーも含まれ得る(即ち、配列番号:5、11、13、18、19、20、22、26、および27)。
本発明の別の一態様において、本発明のアプタマーは以下のアプタマーである:
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される塩基配列からなるアプタマー、
(b)(a)において、1ないし数個(例、1個、2個、3個、4個、又は5個)のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加された配列からなるアプタマー、または
(c)(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列からなるアプタマー。
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される塩基配列からなるアプタマー、
(b)(a)において、1ないし数個(例、1個、2個、3個、4個、又は5個)のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、又は付加された配列からなるアプタマー、または
(c)(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列からなるアプタマー。
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約25~約200ヌクレオチドであり得るが、例えば約100ヌクレオチド以下であり、好ましくは約55ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約45ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約35ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。一方で、本発明のアプタマーの長さは、通常、約25ヌクレオチド以上であり、好ましくは、約28ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約29ヌクレオチド以上であり、特に好ましくは約30ヌクレオチド以上であり得る。総ヌクレオチド数が少なすぎると以下で説明する共通配列を持ちえないし、潜在的3次構造が不安定となって場合によっては活性を有しない場合もある。
本発明のアプタマーは、特異的にTGF-β1に結合することで、TGF-β1の活性を阻害する。本発明のアプタマーは、TGF-β1の活性を阻害し得るものである限り、TGF-β1のいずれの部分に結合するものであっても、またいかなる作用機序によってTGF-β1の活性を阻害するものであってもよいが、一態様において、本発明のアプタマーは、TGF-β1に結合することで、TGF-β1とTGF-β1の受容体との結合を阻害することにより、TGF-β1の活性を阻害し得るものである。尚、TGF-β1の活性を阻害することが分かっているアプタマーは、TGF-β1への結合を確認するまでもなく、TGF-β1に結合するアプタマーであることは明らかである。
また、本発明のアプタマーは、TGF-β1に対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基(例、リボース)が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位及び/又は4’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、O-アルキル化(例、O-メチル化、O-エチル化)、O-アリル化、S-アルキル化(例、S-メチル化、S-エチル化)、S-アリル化、アミノ化(例、-NH2)が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる(例えば、Sproat et al.,(1991)Nucle.Acid. Res.19,733-738;Cotton et al.,(1991) Nucl.Acid.Res.19,2629-2635;Hobbs et al.,(1973)Biochemistry 12,5138-5145参照)。
一態様において、本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース(例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース)の2’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド(即ち、未置換であるヌクレオチド)であるか、あるいはリボースの2’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は-O-アルキル基(例、-O-Me基(「OMe基」とも記載する場合がある))、-O-アシル基(例、-O-COMe基)、アミノ基(例、-NH2基)で置換されているヌクレオチドが挙げられる。
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの2’位において、同一又は異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの2’位において、同一又は異なって、ヒドロキシル基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されるヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの2’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーの修飾はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、核酸、ヌクレオシド、Myristoyl、Lithocolic-oleyl、Docosanyl、Lauroyl、Stearoyl、Palmitoyl、Oleoyl、Linoleoyl、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような修飾については、例えば、米国特許第5,660,985号、同第5,756,703号を参照して行うことができる。
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをRNAと仮定して(すなわち糖基をリボースと仮定して)、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからDNAが除外されることを意味するものではなく、適宜DNAへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがDNAである場合、リボースの2’位のヒドロキシル基のXへの置換は、デオキシリボースの2’位の一方の水素原子のXへの置換として読み替えられる。
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示する方法又は当該技術分野における自体公知の方法により合成することができる。合成方法の一つはRNAポリメラーゼを用いる方法である。目的の配列とRNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つDNAを化学合成し、これをテンプレートにして既に公知の方法により転写することで目的のRNAを得ることができる。また、DNAポリメラーゼを用いることでも合成することができる。目的の配列を有したDNAを化学合成し、これをテンプレートにして、既に公知の方法であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する。これを既に公知の方法であるポリアクリルアミド電気泳動法や酵素処理法により一本鎖とする。修飾の入ったアプタマーを合成する場合は、特定の位置に変異を導入したポリメラーゼを用いることで伸長反応の効率を上げることができる。このようにして得られたアプタマーは公知の方法により容易に精製することができる。
アプタマーはアミダイト法もしくはホスホアミダイト法などの化学合成法によって大量合成することができる。合成方法はよく知られている方法であり、Nucleic Acid(Vol.2)[1]Synthesis and Analysis of Nucleic Acid(Editor:Yukio Sugiura,Hirokawa Publishing Company)などに記載のとおりである。実際にはGEヘルスケアーバイオサイエンス社製のOligoPilot100やOligoProcessなどの合成機を使用する。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。
アプタマーはホスホアミダイト法などの化学合成時にアミノ基などの活性基を導入することで、合成後に機能性物質を付加することができる。例えば、アプタマーの末端にアミノ基を導入することで、カルボキシル基を導入したポリエチレングリコール鎖を縮合させることができる。
アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング相互作用など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。リボースの2’位の修飾に関しては、まれにリボースの2’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
アプタマーは、SELEX法及びその改良法(例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510)を利用することで作製することができる。SELEX法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりして、選別条件を厳しくすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、SELEXのラウンド数を調節したり、及び/又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、SELEX法にはPCRによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだSELEXを行うことが可能となる。
SELEXで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であるが、そのことは標的物質の生理活性を阻害することを意味しない。
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するためのSELEXを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや10~30%程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度SELEXを行うものである。
SELEXで得られるアプタマーは80ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる約50ヌクレオチド以下の長さまで短くする必要がある。SELEXで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、SELEXによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはMFOLDプログラムを用いて二次構造を予測したり、X線解析やNMR解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かなどを、ある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかは、既存のアッセイ系により確認することができる。
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
修飾に関しても、配列と同様に当業者であれば自由に設計又は改変可能である。
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体(以下、「本発明の複合体」と称することがある)を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと1以上(例、2又は3個)の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質としては、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化(例、向上)させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質(例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン)、標識用物質(例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体)、酵素(例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ)、薬物送達媒体(例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類)、薬物(例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド)、毒素(例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素)が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、FactorXなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、TGF-β1の活性を選択的に阻害することができる。TGF-β1は、細胞の増殖および分化、胚発生、細胞外基質形成、骨の発達、創傷治癒、造血、ならびに免疫反応および炎症反応に関与している多機能性サイトカインである。従って、TGF-β1の過剰発現は、ヒトにおいて、多数の状態、例えば、線維性疾患、がん、免疫媒介性疾患、創傷治癒、腎臓疾患等に関連があるとされている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、これらの疾患を治療又は予防するための医薬としても有用である。
本発明のアプタマー及び複合体は、糸球体腎炎、神経瘢痕、皮膚瘢痕、肺線維症、放射線誘発線維症、肝線維症、骨髄線維症等の線維性疾患の治療又は予防に有用であり得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸直腸がん、皮膚がん、肺がん、子宮頸部がん、膀胱がん、グリオーマ、中皮腫、白血病、および肉腫等のがんの治療又は予防に有用であり得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、マクロファージ媒介感染に対する免疫応答の増強や、腫瘍やAIDS等によって引き起こされる免疫抑制の減少に有用であり得る。
また本発明のアプタマー及び複合体は、全身性硬化症、術後癒着、ケロイド、肥厚性瘢痕、角膜損傷、白内障、ペイロニー病、肝硬変、心筋梗塞後瘢痕、血管形成術後再狭窄、くも膜下出血後瘢痕、胆汁性肝硬変(硬化性胆管炎を含む)等の創傷を治療するために有用であり得る。
また、本発明のアプタマー及び複合体は、糖尿病性(I型およびII型)腎障害、放射線誘発性腎症、閉塞性腎症、遺伝性腎臓疾患(例えば、多発性嚢胞腎、海綿腎、馬蹄腎)、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、バージャー病、全身性または糸球体性高血圧、尿細管間質性腎炎、尿細管性アシドーシス、腎結核及び腎梗塞等の腎臓疾患の治療又は予防に有用であり得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、TGF-β1に特異的に結合し得る。従って、本発明の別の一態様において、本発明のアプタマー及び複合体は、TGF-β1検出用プローブとして有用であり得る。該プローブは、TGF-β1のインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ELISA等に有用である。また、該プローブは、TGF-β1が関与する疾患(癌や線維症等)の診断薬、検査薬、試薬等として有用であり得る。
また、そのTGF-β1への特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はTGF-β1の分離精製用リガンドとして使用され得る。
また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。
本発明のアプタマー又は本発明のアプタマーを含む複合体が配合される本発明の医薬は、さらに医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム-グリコール-スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
本発明の医薬の投与経路としては特に限定されるものではないが、例えば経口投与、非経口投与が挙げられる。
経口投与に好適な製剤としては、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、水溶性物質の吸収を促進させるC10等が挙げられる。
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン80、プルロニックF68、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット(ローム社製、ドイツ,メタアクリル酸・アクリル酸共重合体)及び色素(例、ベンガラ、二酸化チタンなど)などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。
非経口的な投与(例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与など)に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤の剤形としては、人工骨や生体分解性基材もしくは生体非分解性スポンジ、バッグなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態が挙げられる。あるいは薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等も徐放製剤に含む。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Poly(lactic-co-glycolic)acid(PLGA)、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。
更に注射液剤、懸濁液剤や徐放製剤以外にも、経肺投与に適した吸入剤、経皮投与に適した軟膏剤なども可能である。
吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、本発明のアプタマー又は複合体を粉末状又は液状にして、吸入噴射剤及び/又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー又は複合体が、粉末状の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで吸入噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン-11、フロン-12、フロン-21、フロン-22、フロン-113、フロン-114、フロン-123、フロン-142c、フロン-134a、フロン-227、フロン-C318、1,1,1,2-テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、n-ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール400、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート(商品名スパン85)、ソルビタンモノオレエート(商品名スパン80)、ソルビタンモノラウエート(商品名スパン20)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(商品名HCO-60)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(商品名ツイーン20)、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート(商品名ツイーン80)、天然資源由来のレシチン(商品名エピクロン)、オレイルポリオキシエチレン(2)エーテル(商品名ブリジ92)、ステアリルポリオキシエチレン(2)エーテル(商品名ブリジ72)、ラウリルポリオキシエチレン(4)エーテル(商品名ブリジ30)、オレイルポリオキシエチレン(2)エーテル(商品名ゲナポル0-020)、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体(商品名シンペロニック)等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤(黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等)を用い、有効成分である本発明のアプタマーと混合し製剤化し使用する。
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.0001~約100mg/kg、例えば約0.0001~約10mg/kg、好ましくは約0.005~約1mg/kgであり得る。
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート(例、マルチウェルプレート)、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、DNAチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル-PTFE(ポリテトラフルオロエチレン)基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとN,N’-メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとN,N’-メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、TGF-β1の精製、及びTGF-β1の検出、定量に有用であり得る。
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質(例、上述したもの)や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
本発明はまた、TGF-β1の精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はTGF-β1を他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にTGF-β1を吸着させ、吸着したTGF-β1を溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのTGF-β1の吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、TGF-β1を含有する試料(例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液)を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。TGF-β1の溶出は、TGF-β1の公知の特性を考慮して、適宜溶出液を選択すればよい。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、TGF-β1の吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液は、TGF-β1の公知の特性を考慮して適宜選択すればよい。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
本発明はまた、TGF-β1の検出及び定量方法を提供する。特に本発明はTGF-β1を他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して(例、本発明の複合体及び固相担体の使用により)TGF-β1を測定することを含み得る。TGF-β1の検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、サンドイッチELISA)、放射免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、PET等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるTGF-β1量の測定、TGF-β1が関連する疾患の診断に有用であり得る。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
[実施例1]TGF-β1に特異的に結合するRNAアプタマーの作製1
TGF-β1に特異的に結合するRNAアプタマーはSELEX法を用いて作製した。SELEXはEllingtonらの方法(Ellington and Szostak,Nature 346,818-822,1990)及びTuerkらの方法(Tuerk and Gold,Science 249,505-510,1990)を参考にして行った。標的物質としてNHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare社製)の担体に固相化したTGF-β1(Recombinant HumanTGF-β1、Peprotech社製、以下、TGF-β1と記す)を用いた。TGF-β1が固相化された担体は、担体を1mMの塩酸で活性化後、両者を混ぜ、3時間程度室温で反応させることで得た。固相化量は、固相化前のTGF-β1溶液と固相化直後の上清をSDS-PAGEにより調べることで確認した。SDS-PAGEの結果、上清からはTGF-β1のバンドは検出されず、使用したTGF-β1のほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約40pmolのTGF-β1が約1μLの樹脂に固相化されたことになる。
TGF-β1に特異的に結合するRNAアプタマーはSELEX法を用いて作製した。SELEXはEllingtonらの方法(Ellington and Szostak,Nature 346,818-822,1990)及びTuerkらの方法(Tuerk and Gold,Science 249,505-510,1990)を参考にして行った。標的物質としてNHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare社製)の担体に固相化したTGF-β1(Recombinant HumanTGF-β1、Peprotech社製、以下、TGF-β1と記す)を用いた。TGF-β1が固相化された担体は、担体を1mMの塩酸で活性化後、両者を混ぜ、3時間程度室温で反応させることで得た。固相化量は、固相化前のTGF-β1溶液と固相化直後の上清をSDS-PAGEにより調べることで確認した。SDS-PAGEの結果、上清からはTGF-β1のバンドは検出されず、使用したTGF-β1のほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約40pmolのTGF-β1が約1μLの樹脂に固相化されたことになる。
最初のラウンドで用いたランダム配列のRNA(40N)は、化学合成したDNAをT7 RNAポリメラーゼ(Y639F)を用いて転写することで得た。この方法によって得られたRNAはピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフルオロ化されたものである。DNA鋳型として、以下に示す40ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ80ヌクレオチドのDNAを用いた。DNA鋳型とプライマーは化学合成によって作製されたものを用いた。
DNA鋳型配列:5’-TGATAGCTTCAGTAGACGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTACTCTAGATGCGGATCCC-3’(配列番号1)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCCGCATCTAGAGTAC-3’(配列番号2)
プライマーRev:5’-TGATAGCTTCAGTAGACGTT-3’(配列番号3)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCCGCATCTAGAGTAC-3’(配列番号2)
プライマーRev:5’-TGATAGCTTCAGTAGACGTT-3’(配列番号3)
DNA鋳型(配列番号1)中のNは、ヌクレオチド(A、G、C又はT)の任意の組み合わせである。またプライマーFwdはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。
TGF-β1が固相化された担体にRNAプールを加え、30分室温で保持した後、TGF-β1に結合しないRNAを取り除くために、溶液Aで樹脂を洗浄した。ここで溶液Aは145mM 塩化ナトリウム、5.4mM 塩化カリウム、1.8mM 塩化カルシウム、0.8mM 塩化マグネシウム、20mM トリス(pH7.6)、0.05% Tween20の混合溶液である。TGF-β1に結合したRNAは、溶出液として溶液Bを加えて90℃で5分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Bは7M Urea、5mM EDTA、0.1Mトリス(pH7.6)の混合液である。回収されたRNAはRT-PCRで増幅し、T7 RNAポリメラーゼ(Y639F)で転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を1ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。SELEX終了後、PCR産物をpGEM-T Easyベクター(Promega社製)にクローニングし、大腸菌株DH5α(TAKARA社製)をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、DNAシーケンサー(FASMAC社に委託)でクローンの塩基配列を調べた。
SELEXを5ラウンド行った後に88クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。2つ以上のクローンが得られた配列として配列番号4から13が得られた。
以下に配列番号4~13のヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また、プライマー結合配列は小文字で表記する。
配列番号4:gggauccgcaucuagaguacUAAGGGUGGGGAGACUUGGGCCGGGCAGUCAGACGCGUGAaacgucuacugaagcuauca
配列番号5:gggauccgcaucuagaguacAUCGUGGCGGGAAAGCCGCCCCAUUCUCUCGGGUCCUAGAaacgucuacugaagcuauca
配列番号6:gggauccgcaucuagaguacUUGUAUAAGUGGAGGGCGAGACUUGGGAGGGGCGAAUUGAaacgucuacugaagcuauca
配列番号7:gggauccgcaucuagaguacGAAUAGUAAGGGAAUGACUCUCGGACCAAUGUAUUGCUAUaacgucuacugaagcuauca
配列番号8:gggauccgcaucuagaguacGAUGUGCUUGUGCUGAAAUUAGAUUUCGCCGACUUUCCCUaacgucuacugaagcuauca
配列番号9:gggauccgcaucuagaguacCAUAAGGGUGGGGAGACUUGGGAGAGGGCAAAGAAGACUAaacgucuacugaagcuauca
配列番号10:gggauccgcaucuagaguacGAUGCAUGUUUUUAUAAAGUAUUGUUAUGUAAUGCAUCAAaacgucuacugaagcuauca
配列番号11:gggauccgcaucuagaguacCGCGUGAGCGGCGUCUUGCUAUGACGUAAAGAAUCGUUACaacgucuacugaagcuauca
配列番号12:gggauccgcaucuagaguacCUAGAGGUGACUUGGGACGCGAGUUAUAAGGGAAUAGUCCaacgucuacugaagcuauca
配列番号13:gggauccgcaucuagaguacACUAGUCACAUUGCGUGUACAUUACUCUGCGCAAUCGAUAaacgucuacugaagcuauca
配列番号5:gggauccgcaucuagaguacAUCGUGGCGGGAAAGCCGCCCCAUUCUCUCGGGUCCUAGAaacgucuacugaagcuauca
配列番号6:gggauccgcaucuagaguacUUGUAUAAGUGGAGGGCGAGACUUGGGAGGGGCGAAUUGAaacgucuacugaagcuauca
配列番号7:gggauccgcaucuagaguacGAAUAGUAAGGGAAUGACUCUCGGACCAAUGUAUUGCUAUaacgucuacugaagcuauca
配列番号8:gggauccgcaucuagaguacGAUGUGCUUGUGCUGAAAUUAGAUUUCGCCGACUUUCCCUaacgucuacugaagcuauca
配列番号9:gggauccgcaucuagaguacCAUAAGGGUGGGGAGACUUGGGAGAGGGCAAAGAAGACUAaacgucuacugaagcuauca
配列番号10:gggauccgcaucuagaguacGAUGCAUGUUUUUAUAAAGUAUUGUUAUGUAAUGCAUCAAaacgucuacugaagcuauca
配列番号11:gggauccgcaucuagaguacCGCGUGAGCGGCGUCUUGCUAUGACGUAAAGAAUCGUUACaacgucuacugaagcuauca
配列番号12:gggauccgcaucuagaguacCUAGAGGUGACUUGGGACGCGAGUUAUAAGGGAAUAGUCCaacgucuacugaagcuauca
配列番号13:gggauccgcaucuagaguacACUAGUCACAUUGCGUGUACAUUACUCUGCGCAAUCGAUAaacgucuacugaagcuauca
[実施例2]TGF-β1に特異的に結合するRNAアプタマーの作製2
ランダム配列が35ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例1で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例1と同様のSELEXをおこなった。SELEXの標的物質としてNHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare社製)の担体に固相化したTGF-β1(Recombinant HumanTGF-β1、Peprotech社製)を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
ランダム配列が35ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例1で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例1と同様のSELEXをおこなった。SELEXの標的物質としてNHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare社製)の担体に固相化したTGF-β1(Recombinant HumanTGF-β1、Peprotech社製)を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
DNA鋳型配列:5’-GACTGACGTCGCACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGCTCCAAGTTCTCCC-3’(配列番号14)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTGGAGCT-3’(配列番号15)
プライマーRev:5’-GACTGACGTCGCACT-3’(配列番号16)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTGGAGCT-3’(配列番号15)
プライマーRev:5’-GACTGACGTCGCACT-3’(配列番号16)
DNA鋳型(配列番号14)中のNは、ヌクレオチド(A、G、C又はT)の任意の組み合わせである。またプライマーFwdはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。
SELEXを7ラウンド行った後に48クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。その中から、代表的な配列として配列番号17~22が得られた。
以下に配列番号17~22のヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また、プライマー結合配列は小文字で表記する。
配列番号17:gggagaacuuggagcuGAUGUCUGGAGUCCCCAUAUAUCACGUACAGUGUagugcgacgucaguc
配列番号18:gggagaacuuggagcuCCCCCUCGCACUUAAUGGGUUCUGUGGCUGGAGAAagugcgacgucaguc
配列番号19:gggagaacuuggagcuCCCCCUCGCAUUCGGAUUAAUUUGUGACUGCAUUGagugcgacgucaguc
配列番号20:gggagaacuuggagcuGGUCCGGAAACUGGAUUCUCUCUAAAAGGGGUACCagugcgacgucaguc
配列番号21:gggagaacuuggagcuCCUGAAUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAAagugcgacgucaguc
配列番号22:gggagaacuuggagcuUGACGGCGCUACAUUAUGCUCCAACGGUACUUUAUagugcgacgucaguc
配列番号18:gggagaacuuggagcuCCCCCUCGCACUUAAUGGGUUCUGUGGCUGGAGAAagugcgacgucaguc
配列番号19:gggagaacuuggagcuCCCCCUCGCAUUCGGAUUAAUUUGUGACUGCAUUGagugcgacgucaguc
配列番号20:gggagaacuuggagcuGGUCCGGAAACUGGAUUCUCUCUAAAAGGGGUACCagugcgacgucaguc
配列番号21:gggagaacuuggagcuCCUGAAUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAAagugcgacgucaguc
配列番号22:gggagaacuuggagcuUGACGGCGCUACAUUAUGCUCCAACGGUACUUUAUagugcgacgucaguc
[実施例3]TGF-β1に特異的に結合するRNAアプタマーの作製3
ランダム配列が50ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例1又は2で用いたものとは異なる鋳型を用いて、実施例1と同様のSELEXをおこなった。SELEXの標的物質としてNHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare社製)の担体に固相化したTGF-β1(Recombinant HumanTGF-β1、Peprotech社製)を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
ランダム配列が50ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例1又は2で用いたものとは異なる鋳型を用いて、実施例1と同様のSELEXをおこなった。SELEXの標的物質としてNHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare社製)の担体に固相化したTGF-β1(Recombinant HumanTGF-β1、Peprotech社製)を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。DNA鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
DNA鋳型配列:5’-CTGACTCGACGTGCAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTGAACACTAGTGCATTCCC-3’(配列番号23)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAATGCACTAGTGTTCAA-3’(配列番号24)
プライマーRev:5’-CTGACTCGACGTGCAAGCTT-3’(配列番号25)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAATGCACTAGTGTTCAA-3’(配列番号24)
プライマーRev:5’-CTGACTCGACGTGCAAGCTT-3’(配列番号25)
DNA鋳型(配列番号23)中のNは、ヌクレオチド(A、G、C又はT)の任意の組み合わせである。またプライマーFwdはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。
SELEXを8ラウンド行った後に48クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。その中から、代表的な配列として配列番号26~28が得られた。
以下に配列番号26~28のヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また、プライマー結合配列は小文字で表記する。
配列番号26:gggaaugcacuaguguucaaCCCCGACCAAUAGCAGCCCGUCUUUAACUAUUGGAAUCGCAUACGGGCCCaagcuugcacgucgagucag
配列番号27:gggaaugcacuaguguucaaCAUUUAGCAACACAAGUCGUCCCCCACGGCAAGCAGUCCUCAAUCCUGACaagcuugcacgucgagucag
配列番号28:gggaaugcacuaguguucaaUAAACACUAAGUGAUCCUCCUGCAAGCUAUGAAGAACUUAACGGCUCGUAaagcuugcacgucgagucag
配列番号27:gggaaugcacuaguguucaaCAUUUAGCAACACAAGUCGUCCCCCACGGCAAGCAGUCCUCAAUCCUGACaagcuugcacgucgagucag
配列番号28:gggaaugcacuaguguucaaUAAACACUAAGUGAUCCUCCUGCAAGCUAUGAAGAACUUAACGGCUCGUAaagcuugcacgucgagucag
[実施例4]アプタマーのTGF-β1に対する阻害活性の測定1
配列番号4~13、17~22、26~28の核酸が、TGF-β1の活性を阻害するかどうかを、TGF-βの刺激によって活性化することが知られているSmadシグナリングパスウェイをモニターする細胞アッセイ系によって評価した。具体的には、プロモーター領域にSBE(Smad-binding element)を搭載したフォティナスルシフェラーゼをレポーター(pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro] Vector、Promega社)として用いた。このSBE誘発フォティナスルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、トランスフェクション効率の標準化コントロールとしてレニラルシフェラーゼ発現プラスミド(pGL4.74[hRluc/TK] Vector、Promega社)を20:1の比率になるように混合し、HEK293細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしたHEK293細胞を改めて96ウェルプレートにまき直しコンフルエントになるまで培養した。そこへ、TGF-β1と、T7 RNAポリメラーゼ(Y639F)を用いて合成した配列番号4~13、17~22、26~28の核酸アプタマーの混合液を終濃度が、それぞれ80pM、20nMになるように添加し、3時間培養した。その後Dual-Luciferase(登録商標)Reporter Assay System(Promega社)を用いてフォティナスルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの発現量を確認した。各サンプルのフォティナスルシフェラーゼの測定値は、レニラルシフェラーゼの測定値で補正し、TGF-β1を添加していないサンプルのフォティナスルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの比を1として各サンプルの相対的な発現量を算出した。さらにTGF-β1のみを添加したサンプルの相対的発現量を阻害率0%として、TGF-β1を添加していないサンプルの相対的発現量を阻害率100%と定義し、それぞれの核酸を添加した際の阻害活性を求めた。ネガティブコントロールとして、35N、40Nまたは50Nの核酸プール(配列番号14、1、23)、ポジティブコントロールとして既知のTGF-β抗体(R&D社 MAB1835)を用いた場合も同様に処理し、測定を行った。その結果を表1に示す。
配列番号4~13、17~22、26~28の核酸が、TGF-β1の活性を阻害するかどうかを、TGF-βの刺激によって活性化することが知られているSmadシグナリングパスウェイをモニターする細胞アッセイ系によって評価した。具体的には、プロモーター領域にSBE(Smad-binding element)を搭載したフォティナスルシフェラーゼをレポーター(pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro] Vector、Promega社)として用いた。このSBE誘発フォティナスルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、トランスフェクション効率の標準化コントロールとしてレニラルシフェラーゼ発現プラスミド(pGL4.74[hRluc/TK] Vector、Promega社)を20:1の比率になるように混合し、HEK293細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしたHEK293細胞を改めて96ウェルプレートにまき直しコンフルエントになるまで培養した。そこへ、TGF-β1と、T7 RNAポリメラーゼ(Y639F)を用いて合成した配列番号4~13、17~22、26~28の核酸アプタマーの混合液を終濃度が、それぞれ80pM、20nMになるように添加し、3時間培養した。その後Dual-Luciferase(登録商標)Reporter Assay System(Promega社)を用いてフォティナスルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの発現量を確認した。各サンプルのフォティナスルシフェラーゼの測定値は、レニラルシフェラーゼの測定値で補正し、TGF-β1を添加していないサンプルのフォティナスルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの比を1として各サンプルの相対的な発現量を算出した。さらにTGF-β1のみを添加したサンプルの相対的発現量を阻害率0%として、TGF-β1を添加していないサンプルの相対的発現量を阻害率100%と定義し、それぞれの核酸を添加した際の阻害活性を求めた。ネガティブコントロールとして、35N、40Nまたは50Nの核酸プール(配列番号14、1、23)、ポジティブコントロールとして既知のTGF-β抗体(R&D社 MAB1835)を用いた場合も同様に処理し、測定を行った。その結果を表1に示す。
アプタマーのTGF-β1に対する阻害活性の測定2
配列番号6、9、19、21、26の核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。測定には、GEヘルスケア社製のBiacore T200を用い、以下に示す方法で測定を行った。CM4チップのセンサーチップ表面に、アミンカップリングキットを使用し、約1500RUのプロテインAを固定化した。流速20μL/minで、アナライトとして30nMに調整したFc融合TRIIレセプター(R&D社)を20μLインジェクトした。これによりFc融合TRIIレセプターがプロテインAを介してCM4チップのセンサーチップ表面に固定化される。さらにTGF-β1(4nM)またはTGF-β1(10nM)と核酸(30nM)の混合溶液をインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Aを用いた。TGF-β1のみをインジェクトしたサンプルのRU値とTGF-β1をインジェクトする前のRU値を基準とし、核酸存在下でTGF-β1をインジェクトした際のRU値の上昇抑制効果をTGF-β1のTRIIレセプターへの結合阻害効果として算出した。TGF-β1:核酸(Apt)=10nM:30nMの場合の結果を表1に示す。
配列番号6、9、19、21、26の核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。測定には、GEヘルスケア社製のBiacore T200を用い、以下に示す方法で測定を行った。CM4チップのセンサーチップ表面に、アミンカップリングキットを使用し、約1500RUのプロテインAを固定化した。流速20μL/minで、アナライトとして30nMに調整したFc融合TRIIレセプター(R&D社)を20μLインジェクトした。これによりFc融合TRIIレセプターがプロテインAを介してCM4チップのセンサーチップ表面に固定化される。さらにTGF-β1(4nM)またはTGF-β1(10nM)と核酸(30nM)の混合溶液をインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Aを用いた。TGF-β1のみをインジェクトしたサンプルのRU値とTGF-β1をインジェクトする前のRU値を基準とし、核酸存在下でTGF-β1をインジェクトした際のRU値の上昇抑制効果をTGF-β1のTRIIレセプターへの結合阻害効果として算出した。TGF-β1:核酸(Apt)=10nM:30nMの場合の結果を表1に示す。
表1に示される通り、配列番号5、11、13、17、18、20、21、22、27および28で表される塩基配列からなる核酸は、TGF-β1に特異的に結合した(表1の左のカラム)。
また、配列番号6、9、19、21および26で表される塩基配列からなる核酸は、TGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害した(表1の中央のカラム)。
さらに、配列番号4、6、9、19、21および26で表される塩基配列からなる核酸は、細胞アッセイ系において強い阻害活性を示した(表1の右のカラム)。一方、配列番号5、7~8、10~13、17~18、20、22、27~28で表される塩基配列からなる核酸は、細胞アッセイ系においてはTGF-β1に対する阻害活性を有さなかった。
本結果において注目すべき点としては、配列番号4、6、9、21に共通する配列が含まれていたことが挙げられる。該配列を、本明細書において、共通配列1と称する。
共通配列1:UAAXGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG
(Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;B は、C、GまたはUを表す)
(Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;B は、C、GまたはUを表す)
上記共通配列1で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーは、表1に示されるように、TGF-β1に対する顕著に強い阻害活性を示す。
換言すれば、共通配列1で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーは、TGF-β1に特異的且つ顕著に強く結合するアプタマーであると考えられた。また共通配列1で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーは、TGF-β1の活性を阻害することができるアプタマーである可能性が高いと考えられた。
[実施例5]アプタマーの短鎖化
配列番号21のアプタマーの短鎖化を行った。これらの短鎖化体の配列を配列番号29~31に示す。
配列番号21のアプタマーの短鎖化を行った。これらの短鎖化体の配列を配列番号29~31に示す。
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。下線は実施例1~4で見出した共通配列1部分を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また、プライマー結合配列は小文字で表記する。
配列番号29:(配列番号21で表わされるアプタマーを、共通配列を含む51ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
gggagaacuuggagcuCCUGAAUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAA
配列番号30:(配列番号21で表わされるアプタマーを、共通配列の一部を含む26ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
GGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAA
配列番号31:(配列番号21で表わされるアプタマーを、共通配列を含む33ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
ggcAUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAA
gggagaacuuggagcuCCUGAAUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAA
配列番号30:(配列番号21で表わされるアプタマーを、共通配列の一部を含む26ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
GGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAA
配列番号31:(配列番号21で表わされるアプタマーを、共通配列を含む33ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
ggcAUAAGGGCGGGGAAACUUGUGGUGGGCUAA
配列番号29~31の核酸は化学合成したT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んだDNA配列を鋳型とし、T7 RNAポリメラーゼ(Y639F)を用いて転写することで得た。
これらの核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、実施例4と同様にTGF-β1(4nM)またはTGF-β1(10nM)と核酸(30nM)の混合溶液をインジェクトし、表面プラズモン共鳴法により評価した。TGF-β1:核酸(Apt)=10nM:30nM(1:3)の場合の測定結果を表2に示す。
配列番号21、29、31の核酸は化学合成したT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んだDNA配列を鋳型とし、T7 RNAポリメラーゼ(Y639F)を用いて転写することで得た。これらの核酸がTGF-β1の活性を阻害するかどうかを、実施例4と同様にルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。測定結果を表2に示す。尚、表2中、ルシフェラーゼアッセイ阻害率の値については、2回の独立試験の結果を併記した。
表2に示されるように、共通配列周辺の配列を除いてもTGF-β1に対する阻害活性は維持されていた(配列番号29、31)。一方で、共通配列まで除いた場合TGF-β1に対する阻害活性は著しく低下した(配列番号30)。以上のことから、共通配列1がTGF-β1に対する結合活性や、TGF-β1に対する阻害活性を発揮するために重要であることが示された。
[実施例6]高活性TGF-β1アプタマーの作製1
配列番号31で表わされる配列のうち、共通配列1の一部をランダム配列にしたRNAプールを用いてSELEXをおこなった。SELEXは実施例1と同様におこなった。その鋳型と5’末端側のプライマー配列を以下に示す。また、プライマーRevは配列番号16の核酸を使用した。
配列番号31で表わされる配列のうち、共通配列1の一部をランダム配列にしたRNAプールを用いてSELEXをおこなった。SELEXは実施例1と同様におこなった。その鋳型と5’末端側のプライマー配列を以下に示す。また、プライマーRevは配列番号16の核酸を使用した。
DNA鋳型配列:5’-gggagaacttggagctcctgaNNNNGGGNNGGGNNNNNNGTGGNGGGNNNNagtgcgacgtcagtc-3’(配列番号32)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTGGAGCTCCTGA-3’(配列番号33)
プライマーFwd:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTGGAGCTCCTGA-3’(配列番号33)
0ラウンドから6ラウンド終了後のそれぞれのDNAライブラリープールをハイスループットシークエンサー(IonPGMTMシステム、ThermoFisher Scientific社)で調べたところ、2R以降の配列が共通配列2(配列番号34)を有していた。その中で、最もリード数が多かった配列(配列番号35)と次に多かった配列(配列番号36)、最もリード数が多かった配列(配列番号35)と一塩基異なる配列(配列番号37、38)、配列番号35における共通配列2の部分を一塩基欠損した配列(配列番号39)、配列番号39とは異なる位置(3’末端側の最後のGGG)で一塩基欠損が生じた配列(配列番号41)とその欠損が生じなかった場合の配列(配列番号40)を以下に示す。配列番号35~40は全て本実験(実施例6)で検出された配列である。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また、プライマー結合配列は小文字で表記する。
配列番号34:(本実験から得られた共通配列2)
AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGGG
(Hは、A、CまたはUを表し;Wは、AまたはUを表す)
AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGGG
(Hは、A、CまたはUを表し;Wは、AまたはUを表す)
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。下線は共通配列2(配列番号34)に相当する部分を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また、プライマー結合配列は小文字で表記する。
配列番号35:(ハイスループットシークエンサーでリード数が最も多く検出された配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号36:(ハイスループットシークエンサーでリード数が二番目に多く検出された配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGGCAAAagugcgacgucaguc
配列番号37:(最もリード数が多かった配列(配列番号35)と一塩基異なる配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGUGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号38:(最もリード数が多かった配列(配列番号35)と一塩基異なる配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGUGGGGAGACUUGUGGAGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号39:(配列番号35における共通配列2の部分から一塩基欠損した配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGAGACUUGUGGAGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号40:(配列番号41での欠損が生じなかった場合の配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGGCAGAagugcgacgucaguc
配列番号41:(配列番号35の共通配列2における3’末端側の最後のGGGにおいて一塩基欠損が生じた配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGCAGAagugcgacgucaguc
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号36:(ハイスループットシークエンサーでリード数が二番目に多く検出された配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGGCAAAagugcgacgucaguc
配列番号37:(最もリード数が多かった配列(配列番号35)と一塩基異なる配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGUGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号38:(最もリード数が多かった配列(配列番号35)と一塩基異なる配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGUGGGGAGACUUGUGGAGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号39:(配列番号35における共通配列2の部分から一塩基欠損した配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGAGACUUGUGGAGGGCAAGagugcgacgucaguc
配列番号40:(配列番号41での欠損が生じなかった場合の配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGGCAGAagugcgacgucaguc
配列番号41:(配列番号35の共通配列2における3’末端側の最後のGGGにおいて一塩基欠損が生じた配列)
gggagaacuuggagcuccugaAUAAGGGAGGGGAGACUUGUGGAGGCAGAagugcgacgucaguc
配列番号35~41の核酸は化学合成したT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んだDNA配列を鋳型とし、T7 RNAポリメラーゼ(Y639F)を用いて転写することで得た。これらの核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、実施例4と同様にTGF-β1(10nM)と核酸(10nMまたは30nM)の混合溶液をインジェクトし、表面プラズモン共鳴法により評価した。TGF-β1:核酸(Apt)=10nM:30nM、10nM:10nMの場合の測定結果を表3に示す。
さらにこれらの核酸がTGF-β1の活性を阻害するかどうかを、実施例1と同様に実施例4と同様なルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。測定結果を表3に示す。
表3に示されるように、共通配列2(配列番号34)で表されるヌクレオチド配列を含むアプタマーは、TGF-β1に対する阻害活性を示した(配列番号35~38、40)。一方、共通配列2(配列番号34)の一部が欠損したアプタマーはTGF-β1に対する阻害活性を有さなかった(配列番号39、41)。これらの結果から、共通配列2(配列番号34)で表されるヌクレオチド配列を有するアプタマーは、TGF-β1に結合し、TGF-β1の活性を阻害することが明らかとなった。
[実施例7]高活性TGF-β1アプタマーの短鎖化と塩基置換
配列番号35で表わされる配列に対し、配列番号31を参考にした短鎖化を行い、配列番号42を得た。またハイスループットシークエンスの結果から、可変性が高いと考えられる2カ所の最適な塩基を決定するために配列番号42を基準に他の塩基に置換した配列を作成した(配列番号43~47)。またハイスループットシークエンスの結果を参考に、検出されたリード数が比較的多い配列の中で、配列番号43~47とはパターンが異なる配列番号48を作製した。
配列番号35で表わされる配列に対し、配列番号31を参考にした短鎖化を行い、配列番号42を得た。またハイスループットシークエンスの結果から、可変性が高いと考えられる2カ所の最適な塩基を決定するために配列番号42を基準に他の塩基に置換した配列を作成した(配列番号43~47)。またハイスループットシークエンスの結果を参考に、検出されたリード数が比較的多い配列の中で、配列番号43~47とはパターンが異なる配列番号48を作製した。
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、ピリミジン(U及びC)が2’-フルオロ修飾体であることを意味している。[ ]は可変性が高いと考えられたヌクレオチドを示す。
配列番号42:(配列番号35で表わされるアプタマーを、配列番号32を参考に33ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列)
GGCAUAAGGG[A]GGGGAGACUUGUGG[A]GGGCAAG
配列番号43:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[U]GGGGAGACUUGUGG[A]GGGCAAG
配列番号44:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをCに置換した配列)
GGCAUAAGGG[C]GGGGAGACUUGUGG[A]GGGCAAG
配列番号45:(配列番号42で表わされるアプタマーの26番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[A]GGGGAGACUUGUGG[U]GGGCAAG
配列番号46:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをUに、26番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[U]GGGGAGACUUGUGG[U]GGGCAAG
配列番号47:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをCに、26番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[C]GGGGAGACUUGUGG[U]GGGCAAG
配列番号48:(26番目のAがCである配列をハイスループットシークエンスの結果を参考に設計した配列番号42の類似配列)
GGCAUAAGGG[A]GGGGAGACUUGUGG[C]GGGUAAA
GGCAUAAGGG[A]GGGGAGACUUGUGG[A]GGGCAAG
配列番号43:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[U]GGGGAGACUUGUGG[A]GGGCAAG
配列番号44:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをCに置換した配列)
GGCAUAAGGG[C]GGGGAGACUUGUGG[A]GGGCAAG
配列番号45:(配列番号42で表わされるアプタマーの26番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[A]GGGGAGACUUGUGG[U]GGGCAAG
配列番号46:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをUに、26番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[U]GGGGAGACUUGUGG[U]GGGCAAG
配列番号47:(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目のAをCに、26番目のAをUに置換した配列)
GGCAUAAGGG[C]GGGGAGACUUGUGG[U]GGGCAAG
配列番号48:(26番目のAがCである配列をハイスループットシークエンスの結果を参考に設計した配列番号42の類似配列)
GGCAUAAGGG[A]GGGGAGACUUGUGG[C]GGGUAAA
配列番号42~48の核酸は化学合成し、HPLCで精製したものを用いた。これらの核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、実施例4と同様にTGF-β1(4nM)と核酸(4nM)の混合溶液をインジェクトし、表面プラズモン共鳴法により評価した。TGF-β1:核酸(Apt)=4nM:4nM(1:1)の場合の測定結果を表4に示す。
さらにこれらの核酸がTGF-β1の活性を阻害するかどうかを、実施例4と同様に最終濃度がTGF-β1(80pM)と核酸(312.5pM)となるように培地に添加し、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。測定結果を表4に示す。
表4に示されるように、共通配列2(配列番号34)で表されるヌクレオチド配列を含むアプタマーは、短鎖化してもTGF-β1に対する阻害活性を示した(配列番号42)。
さらにハイスループットシークエンスの結果から、可変性が高いと考えられる2カ所の塩基(一つ目のG集合と二つ目のG集合の間の塩基[A](共通配列2におけるH)と、三つ目のG集合と四つ目のG集合の間の塩基[A](共通配列2におけるW))を改変した場合であっても、TGF-β1に対する阻害活性は維持された(配列番号42~47)。また四つ目のG集合の後ろのCAGGを別の配列に変えても、TGF-β1に対する阻害活性は維持された(配列番号48)。以上のことから、TGF-β1への結合活性と、TGF-β1に対する阻害活性の発揮には、共通配列2(配列番号34)が重要であることが示された。
[実施例8]高活性短鎖化アプタマーの化学修飾の最適化1
配列番号42で表わされる配列をもとに、ヌクレオチドのリボースが2’-OMeである化学修飾体への改変を行い、アプタマーのTGF-β1阻害活性に対する影響を調べた。作製した改変体を配列番号42(1)~42(3)に示す。各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、(F)と記載されている塩基は2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また(M)と記載されている塩基は2’-OMe修飾体であることを意味している。実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表している。
配列番号42で表わされる配列をもとに、ヌクレオチドのリボースが2’-OMeである化学修飾体への改変を行い、アプタマーのTGF-β1阻害活性に対する影響を調べた。作製した改変体を配列番号42(1)~42(3)に示す。各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、(F)と記載されている塩基は2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また(M)と記載されている塩基は2’-OMe修飾体であることを意味している。実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表している。
配列番号42(1):(配列番号42で表わされるアプタマーの1~3番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
G(M)G(M)C(M)AU(F)AAGGGAGGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2):(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(3):(配列番号42で表わされるアプタマーの26番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGAGGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGA(M)GGGC(F)AAG
G(M)G(M)C(M)AU(F)AAGGGAGGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2):(配列番号42で表わされるアプタマーの11番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(3):(配列番号42で表わされるアプタマーの26番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGAGGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGA(M)GGGC(F)AAG
配列番号42(1)~42(3)の核酸は化学合成し、HPLCで精製したものを用いた。これらの核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、実施例4と同様にTGF-β1(4nM)と核酸(4nM)の混合溶液をインジェクトし、表面プラズモン共鳴法により評価した。TGF-β1:核酸(Apt)=4nM:4nM(1:1)の場合の測定結果を表5に示す。
またこれらの核酸がTGF-β1の活性を阻害するかどうかを、実施例4と同様に最終濃度がTGF-β1(80pM)と核酸(312.5pM)となるように培地に添加し、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。測定結果を表5に示す。
表5から示されるように、本発明のアプタマーにおいて、共通配列2(配列番号34)で表されるヌクレオチド配列以外の配列については、OMe修飾が可能であることが分かった(配列番号42(1))。
一方、共通配列2(配列番号34)で表されるヌクレオチド配列においても、実施例7(表4)において検討した、ハイスループットシークエンスの結果から可変性が高いと考えられる2カ所の塩基は、OMe修飾が可能であることが分かった(配列番号42(2)、42(3))。
高活性短鎖化アプタマーの化学修飾の最適化2
配列番号42(2)で表わされる配列をもとに、ヌクレオチドのリボースが2’-OMeである修飾塩基への置換を行い、アプタマーのTGF-β1阻害活性に対する影響を調べた。作製した変異アプタマーの配列を配列番号42(2-1)~42(2-8)に示す。下線は置換されたヌクレオチドを示す。各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、(F)と記載されている塩基は2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また(M)と記載されている塩基は2’-OMe修飾体であることを意味している。実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表している。
配列番号42(2)で表わされる配列をもとに、ヌクレオチドのリボースが2’-OMeである修飾塩基への置換を行い、アプタマーのTGF-β1阻害活性に対する影響を調べた。作製した変異アプタマーの配列を配列番号42(2-1)~42(2-8)に示す。下線は置換されたヌクレオチドを示す。各ヌクレオチドは、プリン(A及びG)が2’-OH(天然RNA型)であり、(F)と記載されている塩基は2’-フルオロ修飾体であることを意味している。また(M)と記載されている塩基は2’-OMe修飾体であることを意味している。実施例中に挙げられる個々の配列は、5’から3’の方向で表している。
配列番号42(2-1):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの26番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGA(M)GGGC(F)AAG
配列番号42(2-2):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの1番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
G(M)GC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-3):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの4番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)A(M)U(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-4):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの16番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGA(M)GAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-5):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの17番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAG(M)AC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-6):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの31番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)A(M)AG
配列番号42(2-7):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの32番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AA(M)G
配列番号42(2-8):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの33番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG(M)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGA(M)GGGC(F)AAG
配列番号42(2-2):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの1番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
G(M)GC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-3):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの4番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)A(M)U(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-4):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの16番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGA(M)GAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-5):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの17番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAG(M)AC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG
配列番号42(2-6):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの31番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)A(M)AG
配列番号42(2-7):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの32番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AA(M)G
配列番号42(2-8):(配列番号42(2)で表わされるアプタマーの33番目の塩基をOMe修飾塩基に置換した配列)
GGC(F)AU(F)AAGGGA(M)GGGGAGAC(F)U(F)U(F)GU(F)GGAGGGC(F)AAG(M)
配列番号42(2-1)~42(2-8)の核酸は化学合成し、HPLCで精製したものを用いた。これらの核酸がTGF-β1のTGF-βレセプターへの結合を阻害するかどうかを、実施例4と同様にTGF-β1(4nM)と核酸(4nM)の混合溶液をインジェクトし、表面プラズモン共鳴法により評価した。TGF-β1:核酸(Apt)=4nM:4nM(1:1)の場合の測定結果を表6に示す。またこれらの核酸がTGF-β1の活性を阻害するかどうかを、実施例4と同様に最終濃度がTGF-β1(80pM)と核酸(312.5pM)となるように培地に添加し、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。測定結果を表6に示す。
表6の結果から、共通配列2(配列番号34)で表されるヌクレオチド配列において、
(1)実施例7(表4)において検討した、ハイスループットシークエンスの結果から可変性が高いと考えられる2カ所の塩基は、いずれもOMe修飾が可能である(配列番号42(2-1))
(2)AUAAおよびAGACUUの各塩基についても、OMe修飾が可能である(配列番号42(2-4)および42(2-5))
ことが分かった。
(1)実施例7(表4)において検討した、ハイスループットシークエンスの結果から可変性が高いと考えられる2カ所の塩基は、いずれもOMe修飾が可能である(配列番号42(2-1))
(2)AUAAおよびAGACUUの各塩基についても、OMe修飾が可能である(配列番号42(2-4)および42(2-5))
ことが分かった。
本発明のアプタマーは、線維症やがんなどのTGF-β1の活性化が関与する各種疾患の予防および/または治療用医薬、診断薬または標識剤として有用であり得る。
本出願は、日本で出願された特願2019-126940(出願日:2019年7月8日)を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
本出願は、日本で出願された特願2019-126940(出願日:2019年7月8日)を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (12)
- 連続したG塩基の集合を4つ有し、かつ下記式(I)および式(II)で表されるヌクレオチド配列の組合せを含む、TGF-β1に結合するアプタマー。
式(I):UAAX
式(II):ARACUU
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表す) - 式(I):UAAXで表されるヌクレオチド配列が4つのG塩基の集合の最もN末端側に位置し、式(II):ARACUUで表されるヌクレオチド配列が2つ目のG集合と3つ目のG集合の間に位置する、請求項1に記載のアプタマー。
- 請求項1または2に記載のアプタマーであって、下記式(III)
式(III):UAAXGGRNGGSGARACUUGKGVNRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Nは、任意の塩基を表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す。(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。 - 請求項1または2に記載のアプタマーであって、下記式(III’)
式(III’):UAAXGGRBGGSGARACUUGKGVBRGG
(式中、Xは、結合またはGUを表し;Rは、AまたはGを表し;Sは、CまたはGを表し;Kは、GまたはUを表し;Vは、A、CまたはGを表し;Bは、C、GまたはUを表す。(ただし、G塩基の集合が4つとなる組合せに限る))
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。 - 請求項1または2に記載のアプタマーであって、下記式(III’’)
式(III’’):AUAAGGGHGGGGAGACUUGUGGWGGG
(式中、Wは、AまたはUを表し;Hは、A、CまたはUを表す)
で表されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。 - アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されている、請求項1~5のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 以下(a)~(c)のいずれかのヌクレオチド配列を含む、TGF-β1に結合するアプタマー。
(a)配列番号4~6、9、11、13、17~22、26~29または31で表される配列
(b)上記(a)において、1ないし数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列;または、
(c)上記(a)または(b)において、少なくとも一つのヌクレオチドが修飾された配列。 - ヌクレオチドの長さが55ヌクレオチド以下である、請求項1~6のいずれか一項に記載のアプタマー。
- TGF-β1とTGF-β1の受容体との結合を阻害する、請求項1~8のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項10に記載の複合体を含む医薬。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項10に記載の複合体を用いることを特徴とする、TGF-β1の検出方法。
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---|---|---|---|---|
WO1999048904A1 (en) * | 1998-03-23 | 1999-09-30 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | HIGH AFFINITY TGFβ NUCLEIC ACID LIGANDS AND INHIBITORS |
WO2005113811A2 (en) * | 2004-04-21 | 2005-12-01 | Board Of Regents The University Of Texas System | Combinatorial selection of phosphorothioate aptamers for tgf-beta |
WO2010143714A1 (ja) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | 株式会社リボミック | キマーゼに対するアプタマー及びその使用 |
-
2020
- 2020-07-08 JP JP2021530723A patent/JPWO2021006305A1/ja active Pending
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999048904A1 (en) * | 1998-03-23 | 1999-09-30 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | HIGH AFFINITY TGFβ NUCLEIC ACID LIGANDS AND INHIBITORS |
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Title |
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KANG, J. ET AL.: "Combinatorial selection of a single stranded DNA thioaptamer targeting TGF-betaI protein", BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 18, no. 6, 2008, pages 1835 - 1839, XP025694977, DOI: 10.1016/j.bmcl.2008.02.023 * |
MATHARU, ZIMPLE, PATEL DIPALI, GAO YANDONG, HAQUE AMRANUL, ZHOU QING, REVZIN ALEXANDER: "Detecting transforming growth factor-beta release from liver cells using an aptasensor integrated with microfluidics", ANAL. CHEM., vol. 86, no. 17, 2014, pages 8865 - 8872, XP055783360, DOI: 10.1021/ac502383e * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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