WO2016063364A1 - 細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置並びに細胞計測方法 - Google Patents

細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置並びに細胞計測方法 Download PDF

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雅子 河原井
智也 桜井
島瀬　明大
裕之 越
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to a cell measurement mechanism, an automatic cell culture apparatus having the same, and a cell measurement method.
  • Patent Document 2 discloses a method for identifying and quantifying red blood cells, white blood cells, and platelets in whole blood by using a laser light source having a plurality of wavelengths and a plurality of in-flow optical measurements (flow cytometers). Yes.
  • the accuracy is improved as compared with the conventional counting with a hemocytometer.
  • the reliability of the counting results was extremely reduced in the concentration region where the cell concentration of the cell suspension was 1 ⁇ 10 5 cells / mL or less and 5 ⁇ 10 6 cells / mL or more.
  • the cell culture device is applied to regenerative medicine or cell therapy, it is necessary to measure a specimen having a cell concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL or less.
  • the cell counter according to Patent Document 1 cannot be applied with low measurement accuracy in this concentration region.
  • the cell viability is determined by virtue of the contrast of the cell outline.
  • cells with reduced activity hereinafter referred to as low activity viable cells
  • the present invention provides a cell measurement mechanism capable of performing at least cell viability measurement with high accuracy and speed without depending on the skill level of an operator and without staining cultured cells, and a cell culture apparatus having the same And providing a cell counting method.
  • the cell measurement mechanism of the present invention includes a flow path through which a cell suspension flows, a liquid driving unit for feeding the cell suspension in the flow path, and a flow path in the flow path.
  • the cell culture device of the present invention includes an expansion culture mechanism for culturing and proliferating cells, and peeling the proliferated cells, and a flow path for allowing a cell suspension containing the cells detached by the expansion culture mechanism to flow.
  • a liquid drive unit for feeding the cell suspension in the flow path, and the forward scattered light intensity and transmittance obtained by irradiating the cell suspension flowing in the flow path with light from a light source.
  • a cell measuring mechanism having a calculation unit that calculates at least the cell viability in the cell suspension based on the side scattered light intensity.
  • the cell measurement method of the present invention is a cell measurement method for obtaining at least the cell viability in a cell suspension, A step of irradiating irradiation light from a light source from a direction orthogonal to the flow of the cell suspension and a forward scattered light intensity scattered from the cell suspension are measured for the cell suspension flowing through the flow cell.
  • a cell measurement mechanism capable of executing at least measurement of cell viability with high accuracy and speed without depending on the skill level of an operator and without staining cultured cells, and cell culture having the same An apparatus and a cell measurement method can be provided.
  • FIG. 4 is a spectrum diagram showing the relationship between the wavelength of irradiation light from a light source and the intensity of side scattered light in a culture solution in Caco-2 cell suspension and cell viability. It is a figure which shows the relationship between the cell viability in a Caco-2 living cell suspension, and a side scattered light intensity, and is explanatory drawing of a calibration curve (3).
  • the present inventors in the case of cultured cells (passage cells etc.) used in regenerative medicine or cell therapy, depend on differences in cell activity or culture conditions (passage culture environment etc.) for each patient or subject. , Dead cells with a small particle size, dying cells, or live cells with low activity are mixed. Since these are different in size from active living cells, for example, an accurate cell count or only by scattered light obtained by irradiating a living cell suspension flowing through a flow cell with irradiation light from a light source. It was found that it was difficult to determine the cell viability.
  • the present inventors use the forward scattered light intensity and transmittance, or the forward scattered light intensity and transmittance, and the side scattered light intensity, thereby the above-mentioned various cells having different sizes, that is, active living organisms. It has been found that it is possible to identify cells, low-activity live cells and dead cells, and to obtain the number of cells or cell viability with high accuracy and speed.
  • FIG. 1 shows an overall configuration diagram of a cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • the flow path through which the cell suspension flows is shown by a solid line, and the signal line for transmitting and receiving a control signal or a measurement signal is shown by a dotted line.
  • the cell culture device 1 is configured to culture and proliferate cells, and an expanded culture mechanism 15 that peels off the proliferated cells, a cell measurement mechanism 16 that disperses and measures the cells detached by the expanded culture mechanism 15, and a cell measurement mechanism 16.
  • a cell seeding mechanism 17 for feeding the dispersed cell suspension to the expansion culture mechanism 15 and a control unit 18 are configured.
  • control unit 18 cooperates with the cell measurement mechanism 16, and based on the measured forward scattered light intensity, transmittance, and side scattered light intensity, the cell viability in the cell suspension, etc. Has a function to obtain the value by calculation.
  • the control unit 18 constitutes a part of the cell measurement mechanism 16.
  • the control unit 18 also has a function of controlling the expansion culture mechanism 15, the cell measurement mechanism 16, and the cell seeding mechanism 17.
  • the control part 18 demonstrates as an example the structure which has a function which calculates
  • a control calculation unit having the above function may be provided in the cell measurement mechanism 16, or a control calculation unit may be arranged in the measurement unit 6 described later.
  • Cells to be cultured in the expansion culture vessel 2 constituting the expansion culture mechanism 15 are introduced from the cell supply unit 10 using a liquid driving unit, for example, a syringe pump.
  • An appropriate amount of cell culture solution is introduced from the culture solution supply unit 3 by a liquid driving unit, for example, a squeeze pump 7, flows through the three-way valve 8 and the flow path, and is supplied to the expansion culture vessel 2.
  • a liquid driving unit for example, a squeeze pump 7
  • the cell is shaken so that the cells cultured in the expansion culture vessel 2 have a uniform concentration in the introduced cell culture solution, and then left to stand for several days.
  • the cells to be cultured are cultured for several days in the expansion culture vessel 2 under appropriate conditions in a CO 2 incubator.
  • a microscope is installed to enable observation of the growth state of the cultured cells.
  • a washing liquid into the expansion culture container 2 from the cell washing liquid supply unit 11 via a syringe pump
  • a cell culture liquid, dead cells, garbage, or the like having a long residence time is pushed out.
  • the pushed cell culture solution containing dead cells is discharged out of the closed system of the cell culture device 1 as waste fluid 14 via the squeezing pump 7.
  • the cell detachment solution supply unit 12 contains a proteolytic enzyme such as trypsin, collagenase, dispase and the like. These proteolytic enzymes are introduced into the expansion culture vessel 2 and left for a certain period of time.
  • the sample introduction unit 4 collects the cultured cells peeled from the bottom surface of the expansion culture vessel 2 via the ironing pump 7 and the three-way valve 8. At this time, if there is a large amount of cultured cell residue on the bottom surface of the expansion culture vessel 2, it is washed with the cell culture solution introduced from the culture solution supply unit 3 and then collected in the sample introduction unit 4, thereby culturing. It is possible to improve the cell recovery rate.
  • the cultured cells collected in the sample supply unit 4 are introduced as a cell suspension into the circulation channel of the cell measurement mechanism 16 via a liquid drive unit such as a syringe pump (not shown) and the three-way valve 8. .
  • the cell measurement mechanism 16 includes a dispersion unit 5, an iron pump 7 as a liquid drive unit, and a measurement unit 6.
  • the dispersion unit 5, the squeezing pump 7, and the measurement unit 6 are connected by a circulation channel.
  • the aggregation property differs depending on the cell type to be cultured. If a highly aggregated cell type is cultured, the cultured cells contained in the cell suspension introduced into the circulation channel of the cell measurement mechanism 16 (hereinafter simply referred to as “cell aggregation mechanism”).
  • the cell suspension (Referred to as cells) will be lumped and flow through the circulation channel. Therefore, after being dispersed from the lump by the squeezing pump 7 as a liquid driving unit via the three-way valve 8, the cell suspension is introduced into the measuring unit 6.
  • the dispersion part 5 is formed, for example, by providing a narrowing part in which the diameter of the flow path rapidly decreases or a partition plate such as an orifice in the flow path. When the cell suspension flows through these narrowed portions or orifices, the massive cells are dispersed by shearing force (shear stress).
  • the cell measurement mechanism 16 may be configured.
  • the cell seeding mechanism 17 has a cell connected via a three-way valve 8 to a flow path having one end connected to the expansion culture vessel 2 and the other end connected to a circulation flow path in the cell measurement mechanism 16 via the three-way valve 8.
  • a seeding sample adjustment unit 9 is provided.
  • the cell seeding sample adjustment unit 9 is arranged to adjust the cell concentration in the cell suspension flowing through the circulation channel in the cell measurement mechanism 16. That is, the expansion culture container is driven via a flow path in which one end is connected to the expansion culture container 2 by driving the ironing pump 7 that is a liquid driving unit so that the cell concentration in the cell suspension becomes a desired cell concentration.
  • the cell suspension containing the cells detached from the bottom surface of 2 is taken into the cell seeding sample preparation unit 9 through the three-way valve 8.
  • the peristaltic pump 7 is driven to introduce a desired amount of cell culture fluid from the culture fluid supply unit 3 through the three-way valve 8 into the cell seeding sample preparation unit 9 and mix with the already taken-up cell suspension. Dilute. Then, the diluted cell suspension is sent to the circulation channel of the cell measurement mechanism 16, and the forward scattered light intensity, the transmittance, and the side scattered light intensity are measured by the measurement unit 6 described later in detail. .
  • FIG. 2 shows a microscopic image of Caco-2 cells, which is a human colon cancer cell line.
  • the microscopic image shown in FIG. 2 is an image of Caco-2 cells obtained under the following conditions. Caco-2 cells were cultured to 100% confluence or higher, and the cells floating in the culture medium were collected without detaching the adhered cells. Most of the cultured cells in this state have decreased activity, some of the cells are detached, and many dead cells are floating in the cell culture medium.
  • FIG. 2 An image taken with an objective lens 20 times using an inverted microscope after dropping this sample on a slide glass and fixing with a cover glass is a microscope image shown in FIG.
  • viable cells (Vc) 19 that are still active
  • viable cells (Sc) 20 that have low activity
  • dead cells (Dc) 21 that do not have activity and die are observed.
  • the living cells (Vc) 19 shine white and have a large particle size
  • the dead cells (Dc) 21 are generally colored black and are no longer particulate.
  • the low activity live cell (Sc) 20 is in a state intermediate between the live cell (Vc) 19 and the dead cell (Dc) 21, but the particle size is smaller than that of the live cell (Vc) 19. I understand.
  • the live cells (Vc), low-activity live cells (Sc), and dead cells (Dc) shown in FIG. 2 are Caco-2 cells.
  • the particle size of living cells (Vc) is about 10 ⁇ m for NIH / 3T3 cells, about 14 ⁇ m for the above human colon cancer cell line (Caco-2 cells) or human oral mucosal epithelial cells, and about about 20 ⁇ m for human skeletal myoblasts. 20 ⁇ m.
  • human mesenchymal stem cells are about 10-50 ⁇ m and human chondrocytes are about 10 ⁇ m.
  • the measurement unit 6 in the present embodiment includes a flow cell 23 that flows through the cell suspension therein, a light source 22 that is arranged to be orthogonal to the flow direction of the cell suspension that flows through the flow cell 23, and the flow cell 23.
  • a transmittance detector 25 is provided so as to face the sandwiched light source 22, that is, so that the light receiving surface of the detector faces the optical axis of the irradiation light emitted from the light source.
  • the measurement unit 6 is on the side of the transmittance detector 25 and has a forward scattered light detector 24 arranged at a predetermined angle ⁇ (forward scattering detection angle) with respect to the optical axis of the irradiated light, and the light of the irradiated light.
  • a side scattered light detector 26 is arranged on an axis perpendicular to the axis, the axis passes through the approximate center of the flow cell 23, and is arranged at a predetermined distance from the flow cell 23.
  • the light source 22 for example, a laser light source, an LED light source, a tungsten lamp, a xenon lamp, or the like used in a spectrophotometer, a scattering photometer, a fluorophotometer, a flow cytometer, a particle size distribution measuring device, or the like can be used. .
  • the color inside the cell changes to dark in the process of changing from a high active state to a low active state, that is, from a living cell (Vc) to a dead cell (Dc). Therefore, as the content of dead cells (Dc) in the cell suspension increases, the amount of light transmitted through the cell suspension decreases. Therefore, the concentration (CDc) of dead cells (Dc) can be obtained by measuring the transmittance with the transmittance detector 25. In the transmittance measurement, absorption of all organic components in the cell suspension overlaps in the vicinity of ultraviolet light, making it difficult to accurately evaluate only dead cells (Dc). Further, a pH indicator such as phenol red is added to the cell culture solution introduced from the culture solution supply unit 3 shown in FIG.
  • the cell culture solution is colored yellow to red, and the transmittance is greatly reduced by the influence of the color of the cell culture solution at wavelengths in the visible light region. If these factors are taken into consideration and the transmittance is detected by the transmittance detector 25 in the long wavelength region, the concentration (CDc) of dead cells (Dc) in the living cell suspension is stabilized without being affected by interference components. Can be measured.
  • the cell granule density and the internal structure differ between the living cell (Vc) and the dead cell (Dc).
  • Side scattered light is light that is detected at an angle of 90 ° with respect to the optical axis of the light source 22 as described above, and reflects the density and form of the particles. Therefore, the difference in the side scattered light intensity that is scattered by irradiating the intracellular substance with the irradiation light reflects the cell viability.
  • a gentle peak derived from the organic component of the cytoplasm is detected in the ultraviolet region (near 230 nm to 310 nm). Affected by the color of the cell culture. Therefore, it is desirable to measure the side scattered light depending on the intracellular particles on the short wavelength side in the ultraviolet region.
  • FIG. 4 shows a schematic configuration diagram of the control unit 18 shown in FIG.
  • the control unit 18 cooperates with the cell measurement mechanism 16, and based on the measured forward scattered light intensity, transmittance, and side scattered light intensity, The case where it has the function which calculates
  • the control unit 18 includes a calculation processing unit 18a, a calculation program storage unit 18b, an I / O interface 18c, and a calibration curve database (DB), and these are connected to each other via an internal bus 18e.
  • the I / O interface 18c comprises the measurement unit 6 described above, the forward scattered light intensity measured by the forward scattered light detector 24, the transmittance measured by the transmittance detector 25, and the side scattered light. The intensity of the side scattered light measured by the detector 26 can be captured, and the emission command (irradiation timing, etc.) of the irradiation light can be transmitted to the light source 22 constituting the measurement unit 6.
  • the calculation program storage unit 18b stores a live cell concentration calculation program, a dead cell concentration calculation program, and a cell viability calculation program.
  • the calibration curve database 18d stores in advance a calibration curve (1) used for calculation of the living cell concentration (CVc) indicating the relationship between the living cell concentration (CVc) and the forward scattered light intensity.
  • a calibration curve (2) used for calculating the dead cell concentration (CDc) indicating the relationship between the dead cell concentration (CDc) and the transmittance T is also stored in advance.
  • a calibration curve (3) used for calculating the cell viability indicating the relationship between the cell viability and the side scattered light intensity is also stored in advance.
  • a live cell concentration calculation program, a dead cell concentration calculation program, and a cell viability calculation program may be incorporated into one program and stored.
  • the arithmetic processing unit 18a is realized by a processor such as one CPU or a plurality of CPUs connected in parallel. Specific processing by the arithmetic processing unit 18a will be described later in the embodiment.
  • the arithmetic processing unit 18a reads the live cell concentration calculation program from the calculation program storage unit 18b, acquires the forward scattered light intensity acquired from the I / O interface 18c via the internal bus 18e, and executes the live cell concentration calculation program. . Then, with reference to the calibration curve database 18d, the live cell concentration (CVc) in the live cell suspension is obtained using the calibration curve (1).
  • the arithmetic processing unit 18a reads the dead cell concentration calculation program from the calculation program storage unit 18b, acquires the transmittance T acquired from the I / O interface 18c via the internal bus 18e, and executes the dead cell concentration calculation program. To do. Then, referring to the calibration curve database 18d, the dead cell concentration (CDc) in the live cell suspension is obtained using the calibration curve (2). Further, when the low-activity live cells (Sc) contained in the cell suspension are infinitely small and can be ignored, cell viability is determined using the above-mentioned live cell concentration (CVc) and dead cell concentration (CDc). Find the rate.
  • the arithmetic processing unit 18a determines the living cell concentration (CVcc). ) And dead cell concentration (CDc), and then the following processing is performed.
  • the arithmetic processing unit 18a reads the cell survival rate calculation program from the calculation program storage unit 18b, acquires the side scattered light intensity acquired from the I / O interface 18c via the internal bus 18e, and executes the cell survival rate calculation program. To do.
  • the calibration curve database 18d using the calibration curve (3), the cell viability is further determined based on the living cell concentration (CVc) and the dead cell concentration (CDc).
  • control unit 18 uses the forward scattered light intensity, the transmittance T and / or the side scattered light intensity measured by the measuring unit 6 and also stores the calibration curve (1) stored in the calibration curve database 18d in advance.
  • the cell viability in the living cell suspension is obtained, so that at least the cell viability is measured without depending on the skill level of the operator and without staining the cultured cells. It becomes possible to execute with high accuracy and speed.
  • the cell culture device 1 of the present embodiment obtains the living cell concentration (CVc) and the dead cell concentration (CDc), it can also obtain the number of living cells (Vc) and the number of dead cells (Dc). Is possible.
  • the threshold value for low-activity living cells (Sc), by setting a predetermined threshold value in advance to the forward scattered light intensity obtained from the forward scattered light detector 24 and the transmittance T obtained from the transmittance detector 25, It is also possible to determine the low-activity viable cell concentration (CSc) and the number of low-activity viable cells (Sc).
  • an optimal threshold value can be obtained by preparing a standard sample with a known concentration in advance and measuring the forward scattered light intensity and the transmittance T.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the viable cell concentration in the Caco-2 cell suspension and the forward scattered light intensity, and is an explanatory diagram of the calibration curve (1).
  • the calibration curve (1) shown in FIG. 5 is obtained when the forward scattering angle ⁇ shown in FIG. 3 is 20 °.
  • a standard sample in which the viable cell (Vc) has a live cell concentration (CVc) of 100% and a plurality of standard samples having different viable cell concentrations (CVc) are prepared in the Caco-2 cell suspension.
  • the forward scattering detection angle ⁇ is adjusted to 20 °
  • standard samples having different living cell concentrations (CVc) are passed through the flow cell 23, and the forward scattered light intensity is measured by the forward scattering detector 24.
  • the live cell concentration (CVc) is plotted on the horizontal axis, and the forward scattered light intensity measured on the vertical axis is plotted.
  • the plotted measured values of the forward scattered light intensity at each living cell concentration (CVc) are approximated by a straight line to create a calibration curve shown in FIG.
  • FIG. 4 a calibration curve database shown in FIG. 4 as a calibration curve (1) 18d.
  • a plurality of living cell concentrations (CVc) are prepared using the live cells (Vc) of Caco-2 cells as standard samples.
  • the present invention is not limited to this.
  • latex particles having the same particle size as the live cells (Vc) of Caco-2 cells are prepared, and the latex particles are mixed as standard samples in cell culture solutions at different concentrations.
  • the calibration curve (1) may be created by measuring the light intensity.
  • FIG. 6 is a spectrum diagram showing the relationship between the wavelength of light irradiated from the light source and the transmittance T at each dead cell concentration in the Caco-2 cell suspension.
  • Caco-2 cells are introduced into a culture vessel, and the cells floating in the cell culture solution are collected without adhering to the bottom surface of the culture vessel, and allowed to stand for 10 minutes after stirring. Thereafter, the vicinity of the liquid surface is collected, and the collected cells are measured with a cell counter to obtain dead cells (Dc) with 83% having a particle diameter of about 5 ⁇ m.
  • the dead cell concentration (CDc) is 1.5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / mL
  • the live cell concentration (CVc) is 1.8 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • a cell suspension standard sample was prepared, and a transmittance T spectrum at each dead cell concentration (CDc) was measured. As a result, as shown in FIG.
  • the horizontal axis represents the wavelength of the light emitted from the light source
  • the vertical axis represents the transmittance T
  • the dead cell concentration (CDc) is 0 cells / mL, 1.5 ⁇ 10 5 cells / Spectra were obtained at mL, 3.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and 6.0 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the transmittance T is greatly reduced in any dead cell concentration (CDc) sample in a wavelength range of 400 nm or less and a wavelength range of 450 to 600 nm. This is because absorption by the cytoplasm occurs at a wavelength of 400 nm or less, and absorption occurs by coloring the cell culture medium by adding a pH indicator as described above in the wavelength range of 450 to 600 nm.
  • the optimum wavelength range ⁇ of 650 to 750 nm is suitable as a wavelength range in which the absorption of irradiation light by cells that are black outside this wavelength range, that is, dead cells (Dc), can be measured. Table 1 below shows the results of obtaining the transmittance T at a wavelength of 700 nm within the optimum wavelength range ⁇ .
  • the permeability T is 100.6%, and the dead cell concentration (CDc) is 1.5 ⁇ 10 5 cells / mL. Then, the permeability T is 96.5%, and the dead cell concentration (CDc) is 3.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and the permeability T is 93.8% and the dead cell concentration (CDc) is 6.0 ⁇ 10 5 cells. As for / mL, the transmittance T was 89.3%.
  • FIG. 7 shows the relationship between the dead cell concentration (CDc) and the permeability T in the Caco-2 medium.
  • FIG. 8 shows the relationship between the dead cell concentration (CDc) and the transmittance T in the live Caco-2 cell suspension. 7 and 8, as described above, the wavelength of the irradiation light is 700 nm, the transmittance T of a standard sample having a dead cell concentration (CDc) of 0 cells / mL is used as a baseline, and each dead cell concentration (CDc The difference from the transmittance T of the standard sample was obtained, and a calibration curve was created.
  • FIG. 9 is a spectrum diagram showing the relationship between the wavelength of the irradiation light from the light source and the side scattered light intensity in the cell culture solution and the cell viability in the Caco-2 cell suspension.
  • the side scattered light intensity is 17.48, and when the cell viability is 25%, the side scattered light intensity is 19.76.
  • the rate was 40%, the side scattered light intensity was 24.31, and when the cell viability was 70%, the side scattered light intensity was 32.85%.
  • the side scattered light intensity is measured in advance by the side scattered light detector 26, and the measured value is used as a baseline in the storage unit ( (Not shown).
  • FIG. 10 shows the relationship between the cell viability and the side scattered light intensity in the live Caco-2 cell suspension.
  • the side scattered light intensity of the standard sample with each cell viability is set to the baseline using the side scattered light intensity of the standard sample having the irradiation light wavelength of 280 nm and the cell viability of 0% (only cell culture medium).
  • a difference from the intensity is obtained, a calibration curve is created, and stored in the calibration curve database 18d shown in FIG. 4 as a calibration curve (3).
  • the side scattered light intensity is proportional to the cell viability.
  • the cell measurement mechanism 16 and the cell culture device 1 of the present embodiment at least the measurement of the cell viability is highly accurate without depending on the skill level of the operator and without staining the cultured cells. And it becomes possible to execute quickly.
  • the viable cell concentration (CVc), dead cell concentration (CDc), live cell (Vc) number, and dead cell (Dc) number are also possible. Furthermore, for the low activity live cells (Sc), the low activity live cell concentration (CSc) and the number of the low activity live cells (Sc) can also be obtained.
  • the cell culture device 1 of the present embodiment is the same as the configuration shown in FIG. 1 described above, the measurement unit 6 configuring the cell measurement mechanism 16 is the same as the configuration shown in FIG. 3 described above, and the control unit The configuration of 18 is the same as the configuration shown in FIG. 4 described above, and redundant description is omitted.
  • the control unit 18 cooperates with the cell measurement mechanism 16 to calculate the cell viability in the cell suspension based on the measured forward scattered light intensity, transmittance, and side scattered light intensity.
  • the present invention is not limited to this.
  • a control calculation unit having the above function may be provided in the cell measurement mechanism 16, and a control calculation unit is provided in the measurement unit 6 described later. It is good also as a structure to distribute.
  • a human colon cancer cell line (Caco-2 cell) is used as an example of cultured cells, and the angle formed with the optical axis of the light source 22 shown in FIG. 3, that is, the forward scatter detection angle ⁇ is set to 20 ° in advance.
  • the forward scatter detection angle ⁇ depends on the particle diameter of the living cell (Vc) of the cell type.
  • the optimum forward scatter detection angle ⁇ for measurement of other cell tumors other than Caco-2 cells can be adjusted within a range of about 5 ° to 45 °.
  • step S102 the arithmetic processing unit 18a takes in the forward scattered light detection intensity measured by the forward scattered light detector 24 constituting the measuring unit 6 via the I / O interface 18c and the internal bus 18e.
  • the detected intensity of the forward scattered light that is taken in is cultured and expanded in the expansion culture mechanism 15, and the viable cell suspension containing the Caco-2 cells after detachment is passed through the flow cell 23, This is the intensity of the forward scattered light scattered forward by the irradiation light.
  • step S103 the arithmetic processing unit 18a accesses the calibration curve database 18d, and a calibration curve (CVc) indicating the relationship between the viable cell concentration (CVc) in the Caco-2 cell suspension and the forward scattered light intensity shown in FIG. Refer to 1).
  • the arithmetic processing unit 18a calculates the living cell concentration (CVc) by extracting the living cell concentration (CVc) corresponding to the measured forward scattered light intensity by using the calibration curve (1) (step) S104).
  • step S105 the arithmetic processing unit 18a takes in the transmittance T measured by the transmittance detector 25 constituting the measuring unit 6 via the I / O interface 18c and the internal bus 18e. Then, the arithmetic processing unit 18a accesses the calibration curve database 18d again, and the calibration curve (2) showing the relationship between the dead cell concentration (CDc) and the transmittance T in the Caco-2 cell suspension shown in FIG. Is referred to (step S106). The arithmetic processing unit 18a calculates the dead cell concentration (CDc) by extracting the dead cell concentration (CDc) corresponding to the measured transmittance T using the calibration curve (2) (step S107). ).
  • the forward scattered light intensity is a relative signal
  • the transmittance T is a signal that can be handled as an absolute value. This is because, similarly to the creation of the calibration curve (2) described above, only the cell culture solution (equivalent to 0% cell viability) is passed through the flow cell 23 in advance during the measurement, and the transmittance measured at that time is measured. T is stored as a baseline. This is because the difference between the transmittance T obtained when the living cell suspension is passed through the flow cell 23 and the baseline, that is, the decrease in the transmittance T is output.
  • the transmittance T obtained from the transmittance detector 24 is a signal after background correction (removal of background noise) by reference light.
  • step S108 the arithmetic processing unit 18a calculates (CVc / (CVc + CDc)) using the living cell concentration (CVc) obtained in step S104 and the dead cell concentration (CDc) obtained in step S107. Determine the cell viability in the Caco-2 cell suspension.
  • Caco-2 cells which are cultured cells, are resistant to shearing force (shear stress), can easily maintain a high cell viability, and are less affected by decreased activity due to shearing force. This is because it can be assumed that the viable cell concentration (CVc), dead cell concentration (CDc), and low-activity viable cell concentration (CSc) in the Caco-2 cell suspension have the following relationship because they are cells.
  • CVc viable cell concentration
  • CDc dead cell concentration
  • CSc low-activity viable cell concentration
  • the present embodiment it is possible to perform at least the measurement of the cell viability with high accuracy and speed without depending on the skill level of the operator and without staining the cultured cells.
  • FIG. 12 shows a cell viability calculation flowchart of Example 2, which is another example of the present invention.
  • the present embodiment is different from the first embodiment in that the side scattered light intensity measured by the side scattered light detector 26 constituting the measuring unit 6 is used for calculating the cell viability.
  • the description of the same configuration as that of the first embodiment will be omitted.
  • step S101 the arithmetic processing unit 18a receives a cell viability calculation program from the calculation program storage unit 18b in addition to the live cell concentration calculation program and the dead cell concentration calculation program. Read through. Subsequent steps S102 to S107 are executed in the same manner as in the first embodiment.
  • the arithmetic processing unit 18a uses the side scattered light intensity measured by the side scattered light detector 26 constituting the measurement unit 6 as the I / O interface 18c and the internal The data is taken in via the bus 18e (step S109).
  • step S111 the arithmetic processing unit 18a uses the living cell concentration (CVc) obtained in step S104 and the dead cell concentration (CDc) obtained in step S107 to refer to y of the calibration curve (3) referred to. Correct the intercept. Specifically, a cell suspension having a cell viability of about 100% is prepared in advance by using a cell type of an actual sample (here, Caco-2 cells). Then, the relationship between the living cell concentration (CVc) and the side scattered light intensity in the cell suspension is measured by the forward scattered light detector 24 and the side scattered light detector 26 and obtained. A cell suspension with a cell viability of about 100% can be obtained by removing dust and small dead cells in the suspension by centrifugation.
  • CVc living cell concentration
  • CDc dead cell concentration
  • the maximum concentration is obtained from the viable cell concentration (CVc) and the dead cell concentration (CDc) obtained in steps S104 and S107.
  • the side scattered light intensity at the cell viability is determined.
  • the y intercept of the calibration curve (3) is corrected using the obtained side scattered light intensity value.
  • step S112 the arithmetic processing unit 18a calculates the cell survival rate by extracting the cell survival rate corresponding to the measured side scattered light intensity using the corrected calibration curve (3). Is performed (step S112).
  • the calibration curve (3) whose y-intercept has been corrected in step S111 is stored in place of the calibration curve (3) already stored in the calibration curve database 18d. That is, the corrected calibration curve (3) is updated and stored.
  • Caco-2 cells which are cultured cells, are resistant to shearing force (shear stress), can easily maintain a high cell viability, and depend on shearing force. Since the cells are less affected by the decrease in activity, the viable cell concentration (CVc), dead cell concentration (CDc), and low active cell concentration (CSc) in the Caco-2 cell suspension have the following relationship: Assumed.
  • the cell survival rate can be measured with higher accuracy by correcting the calibration curve (3) and calculating the cell survival rate.
  • FIG. 13 shows a cell viability calculation flowchart of Example 3, which is another example of the present invention.
  • Example 1 and Example 2 the case where the concentration of low-activity living cells (CSc) in the living cell suspension is negligibly low, that is, the case where CDc ⁇ (CSc + CDc) can be assumed has been described.
  • the present embodiment is different from the first and second embodiments in that the cell survival rate in the live cell suspension when CDc ⁇ (CSc + CDc) cannot be assumed is calculated.
  • the description of the same configurations as those in the first and second embodiments will be omitted.
  • the particle diameter of low-activity live cells (Sc) in a living cell suspension sample is smaller than that of living cells (Vc) and larger than that of dead cells (Dc). Therefore, even if the particle size of the low activity live cell (Sc) is almost the same as the particle size of the dead cell (Dc), the calibration curve (1) used to calculate the live cell concentration (CVc). Will not be affected. However, if there are many low-activity living cells (Sc) having a size close to the particle size of the living cells (Vc) in the living cell suspension, the slope of the calibration curve (1) is affected. Will be affected.
  • the arithmetic processing unit 18a executes steps S101 to S107 in the same manner as in the first embodiment. Thereafter, the arithmetic processing unit 18a uses the viable cell concentration (Cc) obtained in step S104 and the dead cell concentration (CDc) obtained in step S107 to reduce the viable cell concentration (CSc) and the total number of cells. That is, the number of live cells (Vc) + the number of dead cells (Dc) + the number of live cells (Sc) with low activity is calculated (step S201).
  • step S202 the arithmetic processing unit 18a calculates the following (step S202). ((CVc + CSc + CDc) ⁇ CDc) / (CVc + CSc + CDc) Then, the calculation result is compared with CVc / (CVc + CDc) (similar to step S108 shown in FIG. 11). A large difference in the comparison results reveals that there are many low-activity live cells (Sc) having a size close to the particle size of the live cells (Vc) in the live cell suspension. Further, it can be seen that in step S104, the living cell concentration (CVc) calculated using the calibration curve (1) is not a normal value. Therefore, the process proceeds to a process for correcting the calibration curve (1).
  • step S203 the living cell suspension is allowed to stand for a certain time ( ⁇ t).
  • ⁇ t some of the low activity live cells (Sc) become dead cells (Dc)
  • Dc dead cells
  • the number of low activity live cells (Sc) is calculated after the passage of ⁇ t from the number at time t A before leaving ⁇ t. to reduce to the number at the time t B. Further, the number of dead cells (Dc) increases from the number at time t A before being left at ⁇ t to the number at time t B after ⁇ t has elapsed.
  • latex particles smaller than the particle diameter of live cells (Vc) are prepared in advance, and these latex particles are used as pseudo low-activity live cells (Sc) as standard samples used when the calibration curve (1) is created. Added. Then, the influence on the relationship between the live cell concentration (CVc) and the forward scattered light intensity, which is the calibration curve (1) stored in the calibration curve database 18d, is obtained. Then, a calibration curve when latex particles having different concentrations are added to the standard sample is prepared and newly stored in the calibration curve database 18d, so that a large number of low-activity living cells (Sc) are present in the living cell suspension. When it exists, it is good also as a calibration curve used for calculation of a living cell density
  • the particle size of the latex particles to be used is desirably ⁇ several ⁇ m of the particle size of the living cells (Vc), and it is desirable to use latex particles having at least one particle size.
  • Caco-2 cells were shown as an example of cultured cells, but other cell types such as NIH / 3T3 cells, human oral mucosal epithelial cells, human skeletal muscle myoblasts, humans The same applies to the case of culturing various cells such as mesenchymal stem cells or human chondrocytes.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • Calibration curve database 18e ... Internal bus, 19 ... Live cells , 20 ... low active living cells, 21 ... dead cells, 22 ... light source, 23 ... flow cell, 24 ... forward scattered light detector, 25 ... transmittance detector, 26 ... side scattered light detector

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Abstract

　本発明は、作業者の熟練度に依ることなく、また、培養細胞を染色することなく、細胞生存率等の計測を高精度かつ迅速に実行し得る細胞計測機構及び細胞培養装置、並びに細胞計測方法を提供することにある。細胞計測機構１６は、細胞懸濁液を通流させる流路と、流路内の細胞懸濁液を送液する液体駆動部７と、フローセル２３内を通流する細胞懸濁液に光源２２より照射光を照射し、得られる前方散乱光強度並びに透過率及び／又は側方散乱光強度に基づき、細胞懸濁液中の細胞生存率を求める演算部１８を有する。生細胞濃度と前方散乱光強度との関係、死細胞濃度と前記透過率との関係、及び細胞生存率と前記側方散乱光強度との関係を示す各校正曲線を予め格納する校正曲線ＤＢ１８ｄを備える。

Description

細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置並びに細胞計測方法
　本発明は、細胞計測機構及びそれを有する自動細胞培養装置、並びに細胞計測方法に関する。
　従来、細胞培養は、ほとんどの操作が手作業により行われてきたが、細胞培養操作は煩雑であり時間がかかるため多大な人的コストを必要としている。特に、細胞計数と細胞生存率測定は、煩雑で困難な作業であり、作業者の熟練度が必須である。
　そこで、特許文献１に示すセルカウンターのように、トリパンブルー色素染色した培養細胞の画像データに基づいて、細胞数の計数と細胞生存率等を自動で算出する方法が提案されている。
　また、特許文献２には、複数波長のレーザー光源と複数回のインフロー光学測定（フローサイトメータ）を用いることにより、全血中の赤血球、白血球、血小板を同定し定量する方法が示されている。
特表２０１３－５１７４６０号公報 特表２０１２－５２５５８９号公報
　特許文献１に記載されるセルカウンターを使用して細胞数の計数を試みると、従来の血球計算盤による計数に比べ精度が向上する。しかし、我々の実験結果によると、細胞懸濁液の細胞濃度が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下及び５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の濃度領域では、計数結果の信頼性が極端に低下した。細胞培養装置を再生医療や細胞治療に適用する場合、細胞濃度が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の検体を計測する必要が生じる。しかしながら、特許文献１によるセルカウンターは、この濃度領域内における計測精度が低く適用できなかった。また細胞生存率は、細胞輪郭のコントラストにより細胞の生死を判別しているが、活性の低下した細胞（以下、低活性の生細胞）は細胞輪郭のコントラストが低く、生死判断が困難である。すなわち、継代培養における細胞懸濁液中の細胞生存率を計測することはできない。
　また、特許文献２に示されるフローサイトメータを用いた細胞計測方法では、１個の細胞毎に測定する必要があるため、多大な時間を要する。　
　一方、再生医療あるいは細胞治療を目的とし細胞培養をおこなう場合、安全性が確認できていないため治療に供する細胞を染色することはできない。従って、色素で細胞を染色することを必須とする特許文献１による細胞計測方法では、このような細胞培養に適用することは困難である。また、上述のとおり特許文献２による細胞計測方法では、計測に多大の時間を要するため、細胞培養装置に適用することは困難となる。　
　そこで本発明は、作業者の熟練度に依ることなく、また、培養細胞を染色することなく、少なくとも細胞生存率の計測を高精度かつ迅速に実行し得る細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置、並びに細胞計測方法を提供することにある。
　上記課題を解決するため、本発明の細胞計測機構は、細胞懸濁液を通流させる流路と、前記流路内の細胞懸濁液を送液する液体駆動部と、前記流路内で流動中の細胞懸濁液に光源より照射光を照射し、得られる前方散乱光強度並びに透過率及び／又は側方散乱光強度に基づき、少なくとも前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求める演算部を有することを特徴とする。
　また、本発明の細胞培養装置は、細胞を培養し増殖させ、増殖させた細胞を剥離する拡大培養機構と、前記拡大培養機構により剥離された細胞を含む細胞懸濁液を通流させる流路と、前記流路内の細胞懸濁液を送液する液体駆動部と、前記流路内で流動中の細胞懸濁液に光源より照射光を照射し、得られる前方散乱光強度並びに透過率及び／又は側方散乱光強度に基づき、少なくとも前記細胞懸濁液中の細胞生存率を算出する演算部を有する細胞計測機構と、を備えることを特徴とする。
　また、本発明の細胞計測方法は、細胞懸濁液中の少なくとも細胞生存率を求める細胞計測方法であって、
　フローセル内を通流する細胞懸濁液に対し、前記細胞懸濁液の流れに直交する方向より光源から照射光を照射する工程と、前記細胞懸濁液より散乱する前方散乱光強度を測定する工程と、前記細胞懸濁液を透過する前記照射光の透過率を測定する工程と、前記測定された前方散乱光強度及び予め記憶された生細胞濃度と前記前方散乱光強度との関係を示す第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度を求める工程と、前記測定された前記透過率及び予め記憶された死細胞濃度と前記透過率との関係を示す第２の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の死細胞濃度を求める工程と、前記求めた生細胞濃度及び死細胞濃度に基づき、前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求める工程と、を有することを特徴とする。
　本発明によれば、作業者の熟練度に依ることなく、また、培養細胞を染色することなく、少なくとも細胞生存率の計測を高精度かつ迅速に実行し得る細胞計測機構及びそれを有する細胞培養装置、並びに細胞計測方法を提供することができる。
　例えば、継代培養細胞を含む細胞懸濁液中の細胞生存率を、細胞培養装置内に配するフローセル内で、非染色にて迅速に計測することが可能となる。
　上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の全体構成図である。 Ｃａｃｏ－２細胞の顕微鏡画像であり、生細胞、死細胞及び低活性の生細胞を含む画像を示す図である。 図１に示す測定部の光学系の概略構成図である。 図１に示す制御部の概略構成図である。 Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の生細胞濃度と前方散乱光強度の関係を示す図であり、校正曲線（１）の説明図である。 Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の各死細胞濃度における、光源からの照射光の波長と透過率Ｔとの関係を示すスペクトル図である。 Ｃａｃｏ－２培地中の死細胞濃度と透過率Ｔの関係を示す図であり、校正曲線の説明図である。 Ｃａｃｏ－２生細胞懸濁液中の死細胞濃度と透過率Ｔの関係を示す図であり、校正曲線（２）の説明図である。 Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の培養液及び各細胞生存率における、光源からの照射光の波長と側方散乱光強度との関係を示すスペクトル図である。 Ｃａｃｏ－２生細胞懸濁液中の細胞生存率と側方散乱光強度の関係を示す図であり、校正曲線（３）の説明図である。 本発明の一実施例に係る実施例１の細胞計測機構による細胞生存率算出処理のフローチャートである。 本発明の他の実施例に係る実施例２の細胞計測機構による細胞生存率算出処理理のフローチャートである。 本発明の他の実施例に係る実施例３の細胞計測機構による細胞生存率算出処理のフローチャートである。
　本発明者らは鋭意努力の結果、再生医療あるいは細胞治療で使用する培養細胞（継代培養細胞等）の場合、患者あるいは被験者毎の細胞活性の相違又は培養状態（継代培養環境等）により、粒子径の小さい死細胞や、死にかけの細胞あるいは低活性の生細胞が混入する。これらは、活性を有する生細胞と大きさが異なるため、例えば、フローセル中を通流する生細胞懸濁液へ、光源より照射光を照射することで得られる散乱光のみにより正確な細胞数あるいは細胞生存率を求めることが困難であるとの知見を得た。そこで、本発明者らは、前方散乱光強度と透過率、あるいは、前方散乱光強度及び透過率並びに側方散乱光強度を用いることで、大きさの異なる上記各種細胞、すなわち、活性を有する生細胞、低活性の生細胞及び死細胞を識別し、細胞数あるいは細胞生存率を高精度かつ迅速に得ることが可能であるとの知見を得たものである。
　本明細書においては、細胞懸濁液中の生細胞（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ）をＶｃ、生細胞の濃度をＣＶｃ、細胞懸濁液中の死細胞（ｄｅａｄ　ｃｅｌｌ）をＤｃ、死細胞の濃度をＣＤｃ、細胞懸濁液中の低活性の生細胞（ｓｕｂｖｉｔａｌ　ｃｅｌｌ）をＳｃ、低活性の生細胞の濃度をＣＳｃとそれぞれ、併記あるいは単独で表記する。
　図１に、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の全体構成図を示す。図１において、細胞懸濁液を通流させる流路を実線で示し、制御信号あるいは計測信号を送受信する信号線を点線で示している。細胞培養装置１は、細胞を培養し増殖させ、増殖させた細胞を剥離する拡大培養機構１５、拡大培養機構１５により剥離された細胞を分散させ、測定する細胞計測機構１６、細胞計測機構１６により分散させた細胞懸濁液を拡大培養機構１５へ送液する細胞播種機構１７、及び制御部１８より構成される。なお、後述するように、制御部１８は、細胞計測機構１６と協働し、計測される前方散乱光強度、透過率及び側方散乱光強度に基づき、細胞懸濁液中の細胞生存率等を演算により求める機能を有する。この点において、制御部１８は、細胞計測機構１６の一部を構成する。また、制御部１８は、拡大培養機構１５、細胞計測機構１６及び細胞播種機構１７を制御する機能も有する。以下では、制御部１８が、細胞懸濁液中の細胞生存率、生細胞濃度（ＣＶｃ）、及び死細胞濃度（ＣＤｃ）を求める機能を有する構成を一例として説明するが、これに限られるものではない。例えば、細胞計測機構１６内に上記機能を有する制御演算部を設けても良く、また、後述する測定部６に制御演算部を配する構成としても良い。
　拡大培養機構１５は、図示しないＣＯ２インキュベータ内に格納されている。同様に、細胞計測機構１６及び細胞播種機構１７もＣＯ２インキュベータ内に格納する構成としても良い。細胞培養装置１内の流路内は閉鎖系で無菌状態とされており、細胞培養装置１の動作中において、流路内に導入される空気は、例えば、ＨＥＰＡフィルタ（図示せず）を介しており、細胞の継代操作等を含む細胞培養を、無菌状態を維持した環境下で実施することができる。
　拡大培養機構１５を構成する拡大培養容器２にて培養する細胞は、細胞供給部１０より液体駆動部、例えば、シリンジポンプ等を用いて導入される。培養液供給部３より液体駆動部、例えば、しごきポンプ７により適量の細胞培養液が導入され、三方バルブ８及び流路内を通流し、拡大培養容器２へ供給される。その後、拡大培養容器２にて培養する細胞が、導入された細胞培養液中で均一の濃度となるよう、容器を揺り動かした後、数日間静置される。培養される細胞は、ＣＯ２インキュベータ内で適切な条件の下、拡大培養容器２内で数日間培養される。拡大培養容器２には、培養細胞の増殖状態を観察可能とするため顕微鏡が設置されている。これは、１００％コンフルエント状態、すなわち、拡大培養容器２の底面全域に培養細胞が増殖すると、それ以上の増殖は行えず、培養細胞の活性が低下するあるいは死滅する恐れがあるからである。一般的には、７０％～８０％のコンフルエントに達した時点で、培養細胞を剥離することが望ましい。細胞洗浄溶液供給部１１は、内部に、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓｌｉｎｅ）あるいはＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液等、細胞に適した洗浄液を収容する。例えば、シリンジポンプを介して、細胞洗浄液供給部１１より洗浄液を拡大培養容器２内に導入することにより、滞留期間の長い細胞培養液、死細胞又はごみ等が押し出される。押し出された、死細胞を含む細胞培養液は、しごきポンプ７を介して廃液１４として、細胞培養装置１の閉鎖系外へと排出される。細胞剥離溶液供給部１２は、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を収容する。これらタンパク質分解酵素を、拡大培養容器２へ導入し一定時間放置する。これらタンパク質酵素により、増殖された培養細胞と拡大培養容器２の底面とを接着するインテグリン等のタンパク質が分解され、培養細胞が拡大培養容器２より剥離される。細胞剥離溶液阻害剤供給部１３は、トリプシンインヒビターあるいは細胞培養液等の酵素活性阻害剤を収容する。これら細胞剥離溶液阻害剤を拡大培養容器２へ導入することにより、培養細胞剥離後のタンパク質分解酵素の活性を停止させ、酵素活性による培養細胞へのダメージの低減が図られる。
　試料導入部４は、拡大培養容器２の底面より剥離された培養細胞を、しごきポンプ７、三方バルブ８を介して回収する。このとき、拡大培養容器２の底面に培養細胞の残渣が多い場合には、培養液供給部３より導入される細胞培養液により共洗いし、その後、試料導入部４に回収することで、培養細胞の回収率を向上することが可能となる。
　試料供給部４に回収された培養細胞は、シリンジポンプ（図示せず）等の液体駆動部及び三方バルブ８を介して、細胞計測機構１６の循環流路内に細胞懸濁液として導入される。細胞計測機構１６は、分散部５、液体駆動部としてのしごきポンプ７、及び測定部６より構成される。これら分散部５、しごきポンプ７及び測定部６は、循環流路にて接続されている。培養する細胞種によりその凝集性が異なり、仮に、凝集性の高い細胞種を培養する場合、細胞計測機構１６の循環流路内に導入される細胞懸濁液に含まれる培養細胞（以下、単に細胞と称す）は、塊状となって循環流路を通流することとなる。そこで、液体駆動部としてのしごきポンプ７により、三方バルブ８を介して、分散部５へ導入され、塊状から分散された後、細胞懸濁液は測定部６へ導入される。ここで、分散部５は、例えば、流路径が急激に縮小する狭窄部あるいは、オリフィス等の仕切り板を流路内に設けることで形成される。これら狭窄部あるいはオリフィスを細胞懸濁液が通流する際、せん断力（シェアストレス）により、塊状の細胞は分散される。なお、低凝集性の細胞種を培養する場合においては、必ずしも細胞計測機構１６内に分散部５を配する必要はなく、測定部６、しごきポンプ７及び三方バルブ８を循環流路で接続することで、細胞計測機構１６を構成すれば良い。
　細胞播種機構１７は、一端が拡大培養容器２と、他端が細胞計測機構１６内の循環流路に三方バルブ８を介して接続される流路に、三方バルブ８を介して接続される細胞播種試料調整部９を備える。細胞播種試料調整部９は、細胞計測機構１６内の循環流路内を通流する細胞懸濁液中の細胞濃度を調整するために配されている。すなわち、細胞懸濁液中の細胞濃度が所望の細胞濃度となるよう、液体駆動部であるしごきポンプ７を駆動し、一端が拡大培養容器２に接続される流路を介して、拡大培養容器２の底面より剥離された細胞を含む細胞懸濁液を、三方バルブ８を介して細胞播種試料調整部９内に取り込む。その後、しごきポンプ７の駆動により培養液供給部３より三方バルブ８を介して所望量の細胞培養液を、細胞播種試料調整部９に導入し、既に、取り込まれた細胞懸濁液と混合し希釈する。そして、希釈後の細胞懸濁液を細胞計測機構１６の循環流路へ送液し、詳細は後述する測定部６により、前方散乱光強度、透過率、及び側方散乱光強度が計測される。
　ここで、細胞懸濁液に含まれる、生細胞（Ｖｃ）、低活性の生細胞（Ｓｃ）及び死細胞（Ｄｃ）について説明する。図２に、ヒト大腸がん細胞株であるＣａｃｏ－２細胞の顕微鏡画像を示す。図２に示す顕微鏡画像は以下の条件にて得られたＣａｃｏ－２細胞の画像である。Ｃａｃｏ－２細胞を１００％コンフルエント以上に培養し、接着している細胞を剥離せずに培養液中に浮遊している細胞を回収した。この状態の培養細胞のほとんどは活性が低下し、細胞の一部が剥離し、細胞培養液中に死細胞が多く浮遊している。細胞培養液の一部をとり、セルカウンターを使用して細胞濃度と生存率を測定したところ、細胞濃度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率２０％であった。この試料をスライドガラスに滴下しカバーガラスにより固定後、倒立顕微鏡を使用して対物レンズ２０倍で撮影した画像が図２に示す顕微鏡画像である。図２に示すように、まだ活性を有する生細胞（Ｖｃ）１９、低活性の生細胞（Ｓｃ）２０、活性を有さず死滅した死細胞（Ｄｃ）２１が観察される。生細胞（Ｖｃ）１９は白く光り、大きな粒径であるのに比べ、死細胞（Ｄｃ）２１は全体的に黒く着色し、粒子状でなくなったものが多い。また、細胞膜がはっきりせず細胞内部の構造が変化している様子が観察される。大きく見えても粒子状ではないため光を散乱しにくい。低活性の生細胞（Ｓｃ）２０は、生細胞（Ｖｃ）１９と死細胞（Ｄｃ）２１の中間の状態で、白く光ってはいるものの、その粒径は生細胞（Ｖｃ）１９より小さいことがわかる。
　図２に示す、生細胞（Ｖｃ）、低活性の生細胞（Ｓｃ）及び死細胞（Ｄｃ）は、Ｃａｃｏ－２細胞の場合であるが、ここで細胞種に依る粒子径の相違について説明しておく。生細胞（Ｖｃ）の粒子径は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では約１０μｍ、上述のヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ－２細胞）あるいはヒト口腔粘膜上皮細胞は約１４μｍ、ヒト骨格筋筋芽細胞は約２０μｍである。また、ヒト間葉系幹細胞は約１０～５０μｍ及びヒト軟骨細胞は約１０μｍである。
　次に、図１に示す細胞計測機構１６を構成する測定部６について説明する。図３に、測定部６の光学系の概略構成図を示す。本実施形態における測定部６は、内部に細胞懸濁液を通流するフローセル２３、フローセル２３を通流する細胞懸濁液の流れの方向に対し直交するよう配される光源２２、フローセル２３を挟み光源２２と対向する位置、すなわち、光源から照射される照射光の光軸に検出器の受光面が対向するよう配される透過率検出器２５を備える。また、測定部６は、透過率検出器２５側であって、照射光の光軸に対し所定の角度θ（前方散乱検出角度）をもって配される前方散乱光検出器２４、及び照射光の光軸に垂直な軸上に配され、その軸がフローセル２３の略中心を通り、フローセル２３より所定の距離離間した位置に配される側方散乱光検出器２６を有する。ここで、光源２２として、例えば、分光光度計、散乱光度計、蛍光光度計、フローサイトメータ又は粒度分布測定装置等で用いられる、レーザー光源、ＬＥＤ光源、タングステンランプ、あるいはキセノンランプ等が使用できる。
　ここで、前方散乱光とは、光源２２の光軸に対して前方方向に散乱される光であり、計測される前方散乱光強度は粒子の大きさを反映している。また、光軸とのなす角、すなわち、前方散乱検出角度θは、粒子径に依存する。従って、例えば、上述の細胞種毎の生細胞（Ｖｃ）の粒子径に最適となるよう、予め前方散乱検出角度θを調整し、前方散乱光検出器２４を配する。このように、細胞種の生細胞（Ｖｃ）の粒子径に適した角度で散乱する前方散乱光強度を測定すれば、同じ大きさの粒子径の生細胞（Ｖｃ）であれば散乱光強度は、生細胞（Ｖｃ）の濃度（ＣＶｃ）に比例する。また、前方散乱光の測定には、細胞（生細胞（Ｖｃ））の大きさに応じて光源波長を選択する必要がある。細胞の粒子径に合った波長のとき前方散乱光強度が細胞濃度に依存して変化しやすく、粒子径の大きな細胞ほど長波長の光を照射することが望ましい。光源２２からの照射光は、レーザー光のような平行光が望ましい。
　また、細胞が活性の高い状態から低い状態、すなわち生細胞（Ｖｃ）から死細胞（Ｄｃ）に変化する過程で細胞内部の色が黒っぽく変化する。そのため細胞懸濁液中の死細胞（Ｄｃ）の含有率が増すにつれ、細胞懸濁液を透過する光量が減衰する。よって、透過率検出器２５により透過率を測定することで、死細胞（Ｄｃ）の濃度（ＣＤｃ）を得ることができる。透過率測定において、紫外光付近では、細胞懸濁液中のあらゆる有機成分の吸収が重なるため、死細胞（Ｄｃ）のみを正確に評価することが困難となる。また、図１に示す培養液供給部３より拡大培養容器２へ導入される細胞培養液には、ｐＨ判定のためにフェノールレッドなどのｐＨ指示薬が添加されている。そのため細胞培養液は黄色～赤色に着色されており、可視光領域の波長では細胞培養液の色の影響を受けて透過率が大きく低下する。これらを考慮し長波長領域で透過率検出器２５により透過率を検出すれば、生細胞懸濁液中の死細胞（Ｄｃ）の濃度（ＣＤｃ）を、妨害成分の影響を受けることなく安定して計測することができる。
　更にまた、生細胞（Ｖｃ）と死細胞（Ｄｃ）とでは、細胞内の顆粒密度や内部構造が異なる。側方散乱光は、上述のとおり光源２２の光軸に対して９０°の角度で検出される光であり、粒子の密度・形態を反映している。従って、細胞内の物質に照射光が照射されることにより散乱する側方散乱光強度の相違は、細胞生存率を反映することになる。細胞懸濁液中の側方散乱光スペクトルを測定すると、紫外領域（２３０ｎｍ～３１０ｎｍ付近）に細胞質の有機成分に由来するなだらかなピークが検出され、可視光領域の波長に近づくと、上述のとおり、細胞培養液の色の影響を受ける。従って、細胞内粒子に依存する側方散乱光は紫外領域の短波長側で計測することが望ましい。
　図４に、図１に示す制御部１８の概略構成図を示す。上述のように、本実施形態では一例として、制御部１８が細胞計測機構１６と協働し、計測される前方散乱光強度、透過率及び側方散乱光強度に基づき、細胞懸濁液中の細胞生存率等を演算により求める機能を有する場合を示している。
　制御部１８は、演算処理部１８ａ、演算プログラム格納部１８ｂ、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃ、及び校正曲線データベース（ＤＢ）を備え、これらを内部バス１８ｅにて相互に接続する構成を有する。Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃは、上述の測定部６を構成する、前方散乱光検出器２４にて計測された前方散乱光強度、透過率検出器２５にて計測された透過率、及び側方散乱光検出器２６にて計測された側方散乱光強度を取り込み可能とすると共に、測定部６を構成する光源２２へ照射光の出射指令（照射タイミング等）を送信可能とする。演算プログラム格納部１８ｂには、生細胞濃度演算プログラム、死細胞濃度演算プログラム及び細胞生存率演算プログラムが格納されている。また、校正曲線データベース１８ｄには、生細胞濃度（ＣＶｃ）と前方散乱光強度との関係を示す、生細胞濃度（ＣＶｃ）の演算に用いられる校正曲線（１）が予め格納されている。死細胞濃度（ＣＤｃ）と透過率Ｔとの関係を示す、死細胞濃度（ＣＤｃ）の演算に用いられる校正曲線（２）も、同様に予め格納されている。また、細胞生存率と側方散乱光強度との関係を示す、細胞生存率の演算に用いられる校正曲線（３）も予め格納されている。なお、演算プログラム格納部１８ｂに格納されるプログラムとして、生細胞濃度演算プログラム、死細胞濃度演算プログラム及び細胞生存率演算プログラムを１つのプログラムに組み込み、格納しても良い。
　演算処理部１８ａは、例えば、１つのＣＰＵあるいは、複数並列接続されたＣＰＵ等のプロセッサにて実現される。演算処理部１８ａによる具体的処理については、実施例にて後述する。演算処理部１８ａは、演算プログラム格納部１８ｂより生細胞濃度演算プログラムを読み出し、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃより取り込まれる前方散乱光強度を、内部バス１８ｅを介して取り込み、生細胞濃度演算プログラムを実行する。そして、校正曲線データベース１８ｄを参照し、校正曲線（１）を用いて生細胞懸濁液中の生細胞濃度（ＣＶｃ）を求める。また、演算処理部１８ａは、演算プログラム格納部１８ｂより死細胞濃度演算プログラムを読み出し、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃより取り込まれる透過率Ｔを、内部バス１８ｅを介して取り込み、死細胞濃度演算プログラムを実行する。そして、校正曲線データベース１８ｄを参照し、校正曲線（２）を用いて生細胞懸濁液中の死細胞濃度（ＣＤｃ）を求める。更に、細胞懸濁液中に含まれる低活性の生細胞（Ｓｃ）が限りなく小数であって、無視し得る場合、上記生細胞濃度（ＣＶｃ）及び死細胞濃度（ＣＤｃ）を用いて細胞生存率を求める。
　また、演算処理部１８ａは、上記と異なり生細胞懸濁液中に含まれる低活性の生細胞（Ｓｃ）が無視できない程度の数含まれる場合には、上記と同様に、生細胞濃度（ＣＶｃｃ）及び死細胞濃度（ＣＤｃ）を求めた後、次の処理を実行する。演算処理部１８ａは、演算プログラム格納部１８ｂより細胞生存率演算プログラムを読み出し、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃより取り込まれる側方散乱光強度を、内部バス１８ｅを介して取り込み、細胞生存率演算プログラムを実行する。そして、校正曲線データベース１８ｄを参照し、校正曲線（３）を用い、更に生細胞濃度（ＣＶｃ）及び死細胞濃度（ＣＤｃ）に基づき細胞生存率を求める。
　このように、制御部１８が、測定部６により計測される前方散乱光強度、透過率Ｔ及び／又は側方散乱光強度を用いると共に、予め校正曲線データベース１８ｄに格納される校正曲線（１）～（３）を用いて、生細胞懸濁液中の細胞生存率を求めることにより、作業者の熟練度に依ることなく、また、培養細胞を染色することなく、少なくとも細胞生存率の計測を高精度かつ迅速に実行することが可能となる。
　なお、上述のとおり本実施形態の細胞培装置１は、生細胞濃度（ＣＶｃ）及び死細胞濃度（ＣＤｃ）を求めることから、生細胞（Ｖｃ）数及び死細胞（Ｄｃ）数を求めることも可能である。また、低活性の生細胞（Ｓｃ）については、前方散乱光検出器２４より得られる前方散乱光強度及び透過率検出器２５より得られる透過率Ｔに、所定の閾値を予め設定することで、低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）、更には、低活性の生細胞（Ｓｃ）数を求めることも可能となる。閾値の設定については、予め既知の濃度の標準サンプルを用意し、前方散乱光強度及び透過率Ｔを測定することで、最適な閾値が得られる。
　以下に、予め校正曲線データベース１８ｄに格納される校正曲線（１）～（３）について、ヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ－２細胞）の場合を例に説明する。
＜生細胞濃度（ＣＶｃ）と前方散乱光強度との関係を示す、校正曲線（１）＞
　図５は、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の生細胞濃度と前方散乱光強度の関係を示す図であり、校正曲線（１）の説明図である。図５に示す校正曲線（１）は、図３に示す前方散乱角度θが２０°とした場合のものである。
　先ず、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中に生細胞（Ｖｃ）が生細胞濃度（ＣＶｃ）１００％となる標準試料、更には、生細胞濃度（ＣＶｃ）が異なる複数の標準試料を準備する。そして、前方散乱検出角度θを２０°に調整し、それぞれ生細胞濃度（ＣＶｃ）の異なる標準試料をフローセル２３内に通流し、前方散乱光強度を前方散乱検出器２４により計測する。そして、横軸に生細胞濃度（ＣＶｃ）、縦軸に計測された前方散乱光強度を取り、プロットする。プロットされた、各生細胞濃度（ＣＶｃ）における前方散乱光強度の測定値を、直線にて近似し、図５に示す校正曲線を作成し、校正曲線（１）として図４に示す校正曲線データベース１８ｄに格納する。なお、ここでは、Ｃａｃｏ－２細胞の生細胞（Ｖｃ）を標準試料として、複数の生細胞濃度（ＣＶｃ）分用意したがこれに限られるものではない。例えば、Ｃａｃｏ－２細胞の生細胞（Ｖｃ）と同一粒径のラテックス粒子を用意し、このラテックス粒子を標準試料として、それぞれ、異なる濃度で細胞培養液に混合し、上記と同様に、前方散乱光強度を測定することにより、校正曲線（１）を作成しても良い。
＜死細胞胞濃度（ＣＤｃ）と透過率Ｔとの関係を示す、校正曲線（２）＞
　図６は、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の各死細胞濃度における、光源からの照射光の波長と透過率Ｔとの関係を示すスペクトル図である。
　先ず、Ｃａｃｏ－２細胞を培養容器に導入し、培養容器の底面に接着することなく、細胞培養液中を浮遊する細胞を集め、撹拌後１０分静置する。その後、液面付近を分取し、分取された細胞をセルカウンターにより測定し、８３％が粒子径約５μｍの死細胞（Ｄｃ）を得る。この死細胞（Ｄｃ）を用いて死細胞濃度（ＣＤｃ）が１．５～６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生細胞濃度（ＣＶｃ）が１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、細胞懸濁液標準試料を調製し、各死細胞濃度（ＣＤｃ）における透過率Ｔスペクトルを測定した。その結果、図６に示すように、横軸に光源からの照射光の波長、縦軸に透過率Ｔを取り、死細胞濃度（ＣＤｃ）が、０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、及び６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにおけるスペクトルが得られた。
　図６のスペクトル図に示されるように、波長４００ｎｍ以下の波長域、及び４５０～６００ｎｍの波長域では、いずれの死細胞濃度（ＣＤｃ）試料でも透過率Ｔが大きく減少している。これは、波長４００ｎｍ以下では細胞質による吸収が、また、４５０～６００ｎｍの波長域では、上述のようにｐＨ指示薬の添加による細胞培養液の着色による吸収が生じるためである。この波長域以外で黒くなった細胞、すなわち、死細胞（Ｄｃ）による照射光の吸収を測定可能な波長域として、６５０～７５０ｎｍの最適波長域Δλが好適である。この最適波長域Δλ内の波長７００ｎｍにおける透過率Ｔを求めた結果を、以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、生細胞懸濁液中の死細胞濃度（ＣＤｃ）が０ｃｅｌｌｓ／ｍＬでは透過率Ｔは１００.６％、死細胞濃度（ＣＤｃ）が１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでは透過率Ｔは９６.５％、死細胞濃度（ＣＤｃ）が３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでは透過率Ｔは９３.８％、死細胞濃度（ＣＤｃ）が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでは透過率Ｔは８９.３％が得られた。これより、死細胞濃度（ＣＤｃ）が０ｃｅｌｌｓ／ｍＬの試料(細胞培養液等)をフローセル２３に通流し、透過率検出器２５により透過率Ｔを予め測定し、その測定値をベースラインとして記憶部（図示せず）に格納することで、照射光波長７００ｎｍにおいて、各生細胞懸濁液中の死細胞濃度（ＣＤｃ）における透過率Ｔの計測値とベースラインとの差分を得ることで、生細胞懸濁液中の死細胞（Ｄｃ）による透過率Ｔの減少を出力することが可能となる。
　図７に、Ｃａｃｏ－２培地中の死細胞濃度(ＣＤｃ)と透過率Ｔの関係を示す。また、図８に、Ｃａｃｏ－２生細胞懸濁液中の死細胞濃度(ＣＤｃ)と透過率Ｔの関係を示す。図７及び図８のいずれにおいても、上記のとおり、照射光の波長を７００ｎｍとし、死細胞濃度（ＣＤｃ）が０ｃｅｌｌｓ／ｍＬの標準試料の透過率Ｔをベースラインとし、各死細胞濃度（ＣＤｃ）の標準試料の透過率Ｔとの差分を求め、校正曲線を作成した。培地中の校正曲線及び生細胞懸濁液中の校正曲線の傾きは同一であり、生細胞懸濁液に影響されることなく、黒い死細胞（Ｄｃ）の個数が増加することに伴い透過率Ｔが減衰することが確認された。これにより、図８に示す死細胞濃度（ＣＤｃ）と透過率Ｔとの関係を示す、校正曲線を、校正曲線（２）として図４に示す校正曲線データベース１８ｄに格納する。なお、ここでは、Ｃａｃｏ－２細胞の死細胞（Ｄｃ）を標準試料として、複数の死細胞濃度（ＣＤｃ）分用意したがこれに限られるものではない。例えば、Ｃａｃｏ－２細胞の死細胞（Ｄｃ）と同一粒径の黒色粒子を用意し、この黒色粒子を標準試料として、それぞれ、異なる濃度で細胞培養液に混合し、上記と同様に、透過率Ｔを測定することにより、校正曲線（２）を作成しても良い。ここで、黒色粒子として、例えば、磁性粒子やカーボンブラック等が使用できる。
＜細胞生存率と側方散乱光強度との関係を示す、校正曲線（３）＞
　図９は、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の細胞培養液及び各細胞生存率における、光源からの照射光の波長と側方散乱光強度との関係を示すスペクトル図である。
　先ず、生細胞懸濁液標準試料として、細胞生存率０％、すなわち細胞培養液のみ（ブランク：ｂｌａｎｋ）の標準試料、細胞生存率２５％、細胞生存率４０％、細胞生存率７０％となるよう細胞懸濁液標準試料を調整する。そして、こら各細胞生存率の細動懸濁液標準試料をフローセル２３内に通流し、側方散乱光検出強度を側方散乱光検出器２６により測定する。その結果、図９に示すように、横軸に光源からの照射光の波長、縦軸に側方散乱光強度を取り、細胞生存率が、０％(細胞培養液のみ)、２５％、４０％、７０％におけるスペクトルが得られた。
　図９の側方散乱光スペクトル図に示されるように、紫外領域（２３０ｎｍ～３１０ｎｍ付近）では、細胞生存率毎に、照射光の波長に対する側方散乱光強度に相違が生じる。しかし、紫外領域外では、細胞生存率毎の側方散乱光強度に相違は生じず、これでは各細胞生存率を識別することができない。これは、上述のとおり可視光領域の波長に近づくと、細胞培養液の色の影響を受けるためである。従って、細胞内粒子に依存する側方散乱光は紫外領域の短波長側で計測することが好ましい。波長２８０ｎｍにおける側方散乱光強度の測定結果を、以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、生細胞懸濁液中の細胞生存率が０％では側方散乱光強度は１７.４８、細胞生存率が２５％では側方散乱光強度は１９.７６、細胞生存率が４０％では側方散乱光強度は２４.３１、細胞生存率が７０％では側方散乱光強度は３２.８５％が得られた。これにより、細胞培養液のみ（細胞生存率：０％）をフローセル２３に通流し、側方散乱光検出器２６により側方散乱光強度を予め測定し、その測定値をベースラインとして記憶部（図示せず）に格納する。そして、照射光波長２８０ｎｍにおいて、各生細胞懸濁液中の細胞生存率における側方散乱光強度とベースラインとの差分を得ることで、生細胞懸濁液中の細胞生存率の増加分を出力することが可能となる。なお、必ずしもベースラインに対する差分（増加分）を出力する構成に限らず、側方散乱光検出器２６により測定された側方散乱光強度そのものを出力する構成としても良い。
　図１０に、Ｃａｃｏ－２生細胞懸濁液中の細胞生存率と側方散乱光強度の関係を示す。上記のとおり、照射光の波長を２８０ｎｍとし、細胞生存率が０％（細胞培養液のみ）の標準試料の側方散乱光強度をベースラインとし、各細胞生存率の標準試料の側方散乱光強度との差分を求め、校正曲線を作成し、校正曲線（３）として図４に示す校正曲線データベース１８ｄに格納する。なお、図１０に示すように、側方散乱光強度は細胞生存率に比例することが確認できる。
　以上のとおり、本実施形態の細胞計測機構１６及び細胞培養装置１によれば、作業者の熟練度に依ることなく、また、培養細胞を染色することなく、少なくとも細胞生存率の計測を高精度かつ迅速に実行することが可能となる。
　また、細胞生存率の他、生細胞濃度（ＣＶｃ）、死細胞濃度（ＣＤｃ）、生細胞（Ｖｃ）数及び死細胞（Ｄｃ）数を求めることも可能である。また、更には、低活性の生細胞（Ｓｃ）についても同様に、低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）及び、低活性の生細胞（Ｓｃ）数を求めることも可能となる。
　以下、図面を用いて本発明の実施例について説明する。
　本実施例の細胞培養装置１は、上述の図１に示す構成と同様であり、細胞計測機構１６を構成する測定部６は、上述の図３に示す構成と同様であり、また、制御部１８の構成は、上述の図４に示す構成と同様であり、重複する説明は省略する。なお、以下では、制御部１８が、細胞計測機構１６と協働し、計測される前方散乱光強度、透過率及び側方散乱光強度に基づき、細胞懸濁液中の細胞生存率等を演算により求める機能を有する場合を一例として説明するが、これ限らず、例えば、細胞計測機構１６内に上記機能を有する制御演算部を設けても良く、また、後述する測定部６に制御演算部を配する構成としても良い。
　また、以下では、培養細胞として、ヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ－２細胞）を例に、図３に示す光源２２の光軸とのなす角、すなわち前方散乱検出角度θを２０°に予め調整し測定する場合を例に説明する。なお、上述のとおり、前方散乱検出角度θは、細胞種の生細胞（Ｖｃ）の粒子径に依存する。Ｃａｃｏ－２細胞以外の他の細胞腫の測定に最適な前方散乱検出角度θは、約５°～４５°の範囲内で調整可能である。
　図１１に、本実施例の細胞計測機構１６による細胞生存率算出処理のフローチャートを示す。先ず、図４に示す演算処理部１８ａは、演算プログラム格納部１８ｂより、生細胞濃度演算プログラム及び死細胞濃度演算プログラムを、内部バス１８ｅを介して読み出す（ステップＳ１０１）。
　ステップＳ１０２では、演算処理部１８ａは、測定部６を構成する前方散乱光検出器２４により測定された前方散乱光検出強度を、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃ及び内部バス１８ｅを介して取り込む。ここで、取り込まれる前方散乱光検出強度は、拡大培養機構１５にて培養し増殖され、剥離後のＣａｃｏ－２細胞を含む生細胞懸濁液がフローセル２３内に通流され、光源２２からの照射光により前方へ散乱する前方散乱光の強度である。
　ステップＳ１０３では、演算処理部１８ａは、校正曲線データベース１８ｄにアクセスし、図５に示すＣａｃｏ－２細胞懸濁液中の生細胞濃度（ＣＶｃ）と前方散乱光強度との関係を示す校正曲線（１）を参照する。演算処理部１８ａは、測定された前方散乱光強度に対応する生細胞濃度（ＣＶｃ）を、この校正曲線（１）を用いて抽出することで、生細胞濃度（ＣＶｃ）の算出を行う（ステップＳ１０４）。
　次にステップＳ１０５では、演算処理部１８ａは、測定部６を構成する透過率検出器２５により測定された透過率Ｔを、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃ及び内部バス１８ｅを介して取り込む。そして、再び演算処理部１８ａは、校正曲線データベース１８ｄにアクセスし、図８に示すＣａｃｏ－２細胞懸濁液中の死細胞濃度（ＣＤｃ）と透過率Ｔとの関係を示す校正曲線（２）を参照する（ステップＳ１０６）。演算処理部１８ａは、測定された透過率Ｔに対応する死細胞濃度（ＣＤｃ）を、この校正曲線（２）を用いて抽出することで、死細胞濃度（ＣＤｃ）の算出を行う（ステップＳ１０７）。なお、前方散乱光強度は相対的な信号であるのに対し、透過率Ｔは絶対値として扱うことができる信号である。これは、上述した校正曲線（２）の作成時と同様に、測定時においても、予め細胞培養液のみ（細胞生存率０％と同等）をフローセル２３に通流し、その時に測定される透過率Ｔをベースライとして記憶する。そして、生細胞懸濁液をフローセル２３へ通流した時に得られる透過率Ｔとベースラインとの差分、すなわち透過率Ｔの減少を出力する構成としていることによる。換言すれば、透過率検出器２４より得られる透過率Ｔは、レファレンス光によるバックグラウンド補正（バックグラウンドのノイズ除去）後の信号であることによる。
　ステップＳ１０８では、演算処理部１８ａは、ステップＳ１０４にて得られた生細胞濃度（ＣＶｃ）及びステップＳ１０７で得られた死細胞濃度（ＣＤｃ）を用いて、（ＣＶｃ／（ＣＶｃ＋ＣＤｃ））を算出し、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中の細胞生存率を求める。
　なお、本実施例では、培養細胞であるＣａｃｏ－２細胞は、せん断力（シェアストレス）に強く、細胞生存率を高く維持することが容易であり、且つ、せん断力による活性低下の影響が少ない細胞であるため、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中における生細胞濃度（ＣＶｃ）、死細胞濃度（ＣＤｃ）及び低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）が以下の関係にあると想定できるからである。
　低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）＜＜（ＣＶｃ＋ＣＳｃ＋ＣＤｃ）
　ＣＤｃ≒（ＣＳｃ＋ＣＤｃ）
　以上のとおり、本実施例では、生細胞懸濁液に光源より照射光を照射することにより得得られる、前方散乱光検出強度及び透過率に基づき、生細胞懸濁液に未知の濃度で含まれる生細胞、すなわち細胞生存率を得ることができる。なお、細胞生存率の他、生細胞濃度（ＣＶｃ）、死細胞濃度（ＣＤｃ）、生細胞（Ｖｃ）数及び死細胞（Ｄｃ）数も得ることができる。
　本実施例によれば、作業者の熟練度に依ることなく、また、培養細胞を染色することなく、少なくとも細胞生存率の計測を高精度かつ迅速に実行することが可能となる。
　また、本実施例によれば、ベースライン補正後の透過光を得る構成であることから、簡易な測定部の構成により、ダブルビーム分光光度計と同様の計測精度を得ることができる。
　図１２に、本発明の他の実施例である実施例２の細胞生存率算出フローチャートを示す。本実施例では、細胞生存率の算出に、測定部６を構成する側方散乱光検出器２６により測定される側方散乱光強度を用いる点が実施例１と異なる。以下では、実施例１と同様の構成については説明を省略する。
　図１２に示すように、ステップＳ１０１では、演算処理部１８ａは、演算プログラム格納部１８ｂより、生細胞濃度演算プログラム及び死細胞濃度演算プログラムに加え、更に、細胞生存率演算プログラムを、内部バス１８ｅを介して読み出す。その後のステップＳ１０２～ステップＳ１０７までは実施例１と同様に実行される。
　ステップＳ１０７にて死細胞濃度（ＣＤｃ）算出後、演算処理部１８ａは、測定部６を構成する側方散乱光検出器２６により測定された側方散乱光強度を、Ｉ／Ｏインタフェース１８ｃ及び内部バス１８ｅを介して取り込む（ステップＳ１０９）。
　ステップＳ１１０では、演算処理部１８ａは、校正曲線データベース１８ｄにアクセスし、図１０に示すＣａｃｏ－２細胞懸濁液中の細胞生存率と側方散乱光強度との関係を示す校正曲線（３）を参照する。
　ステップＳ１１１では、演算処理部１８ａは、ステップＳ１０４にて得られた生細胞濃度（ＣＶｃ）及びステップＳ１０７にて得られた死細胞濃度（ＣＤｃ）を用いて、参照した校正曲線（３）のｙ切片を補正する。具体的には、予め実試料の細胞種（ここでは、Ｃａｃｏ－２細胞）を用い、細胞生存率約１００％の細胞懸濁液を用意する。そして、この細胞懸濁液中の生細胞濃度（ＣＶｃ）及び側方散乱光強度との関係を、前方散乱光検出器２４及び側方散乱光検出器２６により測定し求めておく。なお、細胞生存率約１００％の細胞懸濁液は、遠心分離操作により懸濁液中のごみや小さな死細胞を除去することにより得ることができる。しかし再生医療や細胞治療に使用される検体や、株化されていない初代培養細胞等、細胞種によっては、細胞剥離操作や遠心分離操作の過程でダメージを受け細胞活性が低下しやすく、細胞生存率約１００％を維持できないものもある。この場合は細胞剥離や遠心分離操作で得られる細胞懸濁液の平均的な最大細胞生存率を求めておく。例えば、ヒト口腔粘膜上皮細胞では最大細胞生存率は８５～９０％程度である。最大細胞生存率における生細胞濃度（ＣＶｃ）と側方散乱光強度の関係を求め、記憶部に格納する。この最大細胞生存率における生細胞濃度（ＣＶｃ）と側方散乱光強度との関係を用い、ステップＳ１０４及びステップＳ１０７にて得られた生細胞濃度（ＣＶｃ）及び死細胞濃度（ＣＤｃ）から、最大細胞生存率における側方散乱光強度を求める。この求めた側方散乱光強度の値を用いて、校正曲線（３）のｙ切片を補正する。
　次に、ステップＳ１１２では、演算処理部１８ａは、測定された側方散乱光強度に対応する細胞生存率を、補正後の校正曲線（３）を用いて抽出することで、細胞生存率の算出を行う（ステップＳ１１２）。なお、ステップＳ１１１にてｙ切片が補正された校正曲線（３）を、校正曲線データベース１８ｄに既に格納されている校正曲線（３）に替えて格納する。すなわち、補正後の校正曲線（３）に更新し格納する。
　本実施例においても、実施例１と同様に、培養細胞であるＣａｃｏ－２細胞は、せん断力（シェアストレス）に強く、細胞生存率を高く維持することが容易であり、且つ、せん断力による活性低下の影響が少ない細胞であるため、Ｃａｃｏ－２細胞懸濁液中における生細胞濃度（ＣＶｃ）、死細胞濃度（ＣＤｃ）及び低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）が以下の関係にあると想定している。
　低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）＜＜（ＣＶｃ＋ＣＳｃ＋ＣＤｃ）
　ＣＤｃ≒（ＣＳｃ＋ＣＤｃ）
　本実施例によれば、実施例１の効果に加え、校正曲線（３）を補正し細胞生存率を算出することにより、更に細胞生存率を高精度に計測することが可能となる。
　図１３に、本発明の他の実施例である実施例３の細胞生存率算出フローチャートを示す。実施例１及び実施例２では、生細胞懸濁液中の低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）が無視できるほど低い場合、すなわち、ＣＤｃ≒（ＣＳｃ＋ＣＤｃ）と想定できる場合について説明した。本実施例では、ＣＤｃ≒（ＣＳｃ＋ＣＤｃ）と想定できない場合における生細胞懸濁液中の細胞生存率を算出する点が、実施例１及び実施例２と異なる。以下では、実施例１及び実施例２と同様の構成については説明を省略する。
　一般的に生細胞懸濁液試料中の低活性の生細胞（Ｓｃ）の粒子径は、生細胞（Ｖｃ）の粒子径より小さく、死細胞（Ｄｃ）の粒子径より大きい。そのため、仮に、低活性の生細胞（Ｓｃ）の粒子径が死細胞（Ｄｃ）の粒子径とほぼ同一であっても、生細胞濃度（ＣＶｃ）を算出するために用いられる校正曲線（１）に対し影響を及ぼすことは無い。しかし、仮に、生細胞（Ｖｃ）の粒子径に近い大きさの低活性の生細胞（Ｓｃ）が、生細胞懸濁液中に多数存在する場合は、校正曲線（１）の傾きに影響を及ぼすことになる。
　図１３に示すように、演算処理部１８ａは、ステップＳ１０１～ステップＳ１０７まで、上述の実施例１と同様に実行する。その後、演算処理部１８ａは、ステップＳ１０４にて得られた生細胞濃度（ＣＶｃ）及びステップＳ１０７にて得られた死細胞濃度（ＣＤｃ）により、低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）及び全細胞数、すなわち、生細胞（Ｖｃ）数＋死細胞（Ｄｃ）数＋低活性の生細胞（Ｓｃ）数を算出する（ステップＳ２０１）。
　ステップＳ２０２では、演算処理部１８ａは、以下を算出する（ステップＳ２０２）。
（（ＣＶｃ＋ＣＳｃ＋ＣＤｃ）－ＣＤｃ）／（ＣＶｃ＋ＣＳｃ＋ＣＤｃ）
そして、上記算出結果と、ＣＶｃ／（ＣＶｃ＋ＣＤｃ）（図１１に示すステップＳ１０８と同様）とを比較する。比較結果が大きく異なることで、生細胞（Ｖｃ）の粒子径に近い大きさの低活性の生細胞（Ｓｃ）が、生細胞懸濁液中に多数存在することが判明する。また、ステップＳ１０４にて、校正曲線（１）を用いて算出された生細胞濃度（ＣＶｃ）が正常な値でないことがわかる。そこで校正曲線（１）を補正するための処理に移行する。
　先ず、ステップＳ２０３にて、生細胞懸濁液を一定時間（Δｔ）放置する。このΔｔの期間において、低活性の生細胞（Ｓｃ）の一部は死細胞（Ｄｃ）となり、低活性の生細胞（Ｓｃ）数は、Δｔ放置前の時刻ｔＡにおける個数から、Δｔ経過後の時刻ｔＢにおける個数へと減少する。また、死細胞（Ｄｃ）数は、Δｔ放置前の時刻ｔＡにおける個数から、Δｔ経過後の時刻ｔＢにおける個数へと増加する。
　ステップＳ２０４では、演算処理部１８ａは、側方散乱光強度から得られる細胞生存率をｘ軸、透過率Ｔより得られる細胞生存率をｙ軸とし、時刻ｔＡ及び時刻ｔＢにおける各細胞生存率をプロットする。これらプロットされた２点間を結ぶ直線の傾きは、仮に、低活性の生細胞濃度（ＣＳｃ）が“０”の場合、直線の傾きは“１”となる。しかし、実際の直線の傾きは“１”から乖離する。従って、低活性の生細胞（Ｓｃ）により生じるこの乖離、すなわち直線の傾きの差分を偏差として算出する。
　ステップＳ２０５では、演算処理部１８ａは、ステップＳ２０４で求めた偏差を用いて、校正曲線データベース１８ｄに格納される校正曲線（１）を補正し、補正後の校正曲線（１）を用いて、測定された前方散乱光強度に対応する生細胞濃度（ＣＶｃ）を再度抽出することで、生細胞濃度（ＣＶｃ）を算出する。なお、ステップＳ２０５にて補正された校正曲線（１）を、校正曲線データベース１８ｄに既に格納されている校正曲線（１）に替えて格納する。すなわち、補正後の校正曲線（１）に更新し格納する。
　ステップＳ２０６では、ステップＳ２０５にて算出された生細胞濃度（ＣＶｃ）及びステップＳ１０７にて得られた死細胞濃度（ＣＤｃ）に基づき、以下にて細胞生存率を算出する
　（ＣＶｃ＋ＣＳｃ）／（ＣＶｃ＋ＣＳｃ＋ＣＤｃ）
　本実施例によれば、実施例１の効果に加え、生細胞懸濁液中に低活性の生細胞（Ｓｃ）が多数存在する場合においても、細胞生存率を高精度に求めることが可能となる。
　なお、本実施例のステップＳ２０５に替えて、ステップＳ２０４にて得られる偏差に基づき、前方散乱検出角度θを変更し、校正曲線データベース１８ｄに格納される校正曲線（１）の傾きと一致するよう、前方散乱光検出器２４の配置位置を調整する構成としても良い。
　また、予め、生細胞（Ｖｃ）の粒子径より小さなラテックス粒子を用意し、このラテックス粒子を疑似的な低活性の生細胞（Ｓｃ）として、校正曲線（１）の作成時に用いた標準試料に添加する。そして、校正曲線データベース１８ｄに格納される校正曲線（１）である、生細胞濃度（ＣＶｃ）と前方散乱光強度との関係に及ぼす影響を求める。そして、濃度の異なるラテックス粒子を標準試料に添加した時の校正曲線を作成し、新たに校正曲線データベース１８ｄに格納することで、生細胞懸濁液中に低活性の生細胞（Ｓｃ）が多数存在する場合において、生細胞濃度（ＣＶｃ）の算出に用いる校正曲線としても良い。この場合、使用するラテックス粒子の粒子径は、生細胞（Ｖｃ）の粒子径の±数μｍとするのが望ましく、最低でも１種類以上の粒子径のラテックス粒子を用いることが望ましい。
　実施例１から実施例３では、培養細胞の一例として、Ｃａｃｏ－２細胞を示したが、他の細胞種、例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒト口腔粘膜上皮細胞、ヒト骨格筋筋芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、又はヒト軟骨細胞等、各種細胞を培養する場合においても同様に適用できる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の実施例の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１…細胞培養装置，２…拡大培養容器，３…培養液供給部，４…試料導入部，５…分散部，６…測定部，７…しごきポンプ，８…三方バルブ，９…細胞播種試料調製部，１０…細胞供給部，１１…細胞洗浄溶液供給部，１２…細胞剥離溶液供給部，１３…細胞剥離溶液阻害剤供給部，１４…廃液，１５…拡大培養機構，１６…細胞計測機構，１７…細胞播種機構，１８…制御部，１８ａ…演算処理部，１８ｂ…演算プログラム格納部，１８ｃ…Ｉ／Ｏインタフェース，１８ｄ…校正曲線データベース（ＤＢ），１８ｅ…内部バス，１９…生細胞，２０…低活性生細胞，２１…死細胞，２２… 光源，２３…フローセル，２４…前方散乱光検出器，２５…透過率検出器，２６…側方散乱光検出器

Claims (15)

  1. 　細胞懸濁液を通流させる流路と、
    　前記流路内の細胞懸濁液を送液する液体駆動部と、
    　前記流路内で流動中の細胞懸濁液に光源より照射光を照射し、得られる前方散乱光強度並びに透過率及び／又は側方散乱光強度に基づき、少なくとも前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求める演算部を有することを特徴とする細胞計測機構。
  2. 　請求項１に記載の細胞計測機構において、
    　前記演算部は、
    　生細胞濃度と前記前方散乱光強度との関係を示す第１の校正曲線と、死細胞濃度と前記透過率との関係を示す第２の校正曲線と、細胞生存率と前記側方散乱光強度との関係を示す第３の校正曲線と、を予め格納する校正曲線データベースを有することを特徴とする細胞計測機構。
  3. 　請求項２に記載の細胞計測機構において、
    　前記細胞懸濁液を通流するフローセルと、
    　前記フローセルを通流する細胞懸濁液の流れの方向に対し直交するよう配される光源と、
    　前記フローセルを挟み前記光源と対向し、前記光源からの照射光の光軸上に配される透過率検出器と、
    　前記透過率検出器側であって、前記照射光の光軸に対し前記生細胞の粒子径に応じて所定の角度をもって配される前方散乱光検出器と、
    　前記細胞懸濁液の流れの方向及び前記照射光の光軸の双方と直交するよう配される側方散乱光検出器と、を有する測定部を備えることを特徴とする細胞計測機構。
  4. 　請求項３に記載の細胞計測機構において、
    　前記演算部は、
    　前記前方散乱光検出器により測定される前方散乱光強度及び前記第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度を求め、
    　前記透過率検出器により測定される透過率及び前記第２の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の死細胞濃度を求め、
    　前記求めた生細胞濃度及び死細胞濃度に基づき、前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求めることを特徴とする細胞計測機構。
  5. 　請求項３に記載の細胞計測機構において、
    　前記前方散乱光検出器は、前記照射光の光軸に対し約５°～４５°の角度範囲内に配され、
    　前記演算部は、前記前方散乱光検出器により測定される前方散乱光強度及び前記第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度又は生細胞数を求めることを特徴とする細胞計測機構。
  6. 　請求項３に記載の細胞計測機構において、
    　細胞培養液のみを前記フローセルに通流したときに測定される透過率を予めベースラインとして格納し、培養細胞が前記細胞培養液に含まれる前記細胞懸濁液を前記フローセルに通流したときに測定される透過率を、前記ベースラインとの差分として出力することを特徴とする細胞計測機構。
  7. 　請求項３に記載の細胞計測機構において、
    　前記演算部は、
    　前記前方散乱光検出器により測定される前方散乱光強度及び前記第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度を求め、
    　前記透過率検出器により測定される透過率及び前記第２の校正曲線に基づき、前記死細胞濃度を求め、
    　前記求めた生細胞濃度及び死細胞濃度に基づき、前記第３の校正曲線を補正し、
    　補正後の第３の校正曲線及び前記側方散乱光検出器により測定される側方散乱光強度に基づき、前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求めることを特徴とする細胞計測機構。
  8. 　細胞を培養し増殖させ、増殖させた細胞を剥離する拡大培養機構と、
    　前記拡大培養機構により剥離された細胞を含む細胞懸濁液を通流させる流路と、
    　前記流路内の細胞懸濁液を送液する液体駆動部と、
    　前記流路内で流動中の細胞懸濁液に光源より照射光を照射し、得られる前方散乱光強度並びに透過率及び／又は側方散乱光強度に基づき、少なくとも前記細胞懸濁液中の細胞生存率を算出する演算部を有する細胞計測機構と、を備えることを特徴とする細胞培養装置。
  9. 　請求項８に記載の細胞培養装置において、
    　前記演算部は、生細胞濃度と前記前方散乱光強度との関係を示す第１の校正曲線と、死細胞濃度と前記透過率との関係を示す第２の校正曲線と、細胞生存率と前記側方散乱光強度との関係を示す第３の校正曲線と、を予め格納する校正曲線データベースを有することを特徴とする細胞培養装置。
  10. 　請求項９に記載の細胞培養装置において、
    　前記細胞計測機構は、
    　前記細胞懸濁液を通流するフローセルと、
    　前記フローセルを通流する細胞懸濁液の流れの方向に対し直交するよう配される光源と、
    　前記フローセルを挟み前記光源と対向し、前記光源からの照射光の光軸上に配される透過率検出器と、
    　前記透過率検出器側であって、前記照射光の光軸に対し前記生細胞の粒子径に応じて所定の角度をもって配される前方散乱光検出器と、
    　前記細胞懸濁液の流れの方向及び前記照射光の光軸の双方と直交するよう配される側方散乱光検出器と、を有する測定部を備えることを特徴とする細胞培養装置。
  11. 　請求項１０に記載の細胞培養装置において、
    　前記前方散乱光検出器は、前記照射光の光軸に対し約５°～４５°の角度範囲内に配され、
    　前記演算部は、前記前方散乱光検出器により測定される前方散乱光強度及び前記第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度又は生細胞数を求めることを特徴とする細胞培養装置。
  12. 　請求項１０に記載の細胞培養装置において、
    　細胞培養液のみを前記フローセルに通流したときに測定される透過率を予めベースラインとして格納し、培養細胞が前記細胞培養液に含まれる前記細胞懸濁液を前記フローセルに通流したときに測定される透過率を、前記ベースラインとの差分として出力することを特徴とする細胞培養装置。
  13. 　請求項１０に記載の細胞培養装置において、
    　前記演算部は、
    　前記前方散乱光検出器により測定される前方散乱光強度及び前記第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度を求め、
    　前記透過率検出器により測定される透過率及び前記第２の校正曲線に基づき、前記死細胞濃度を求め、
    　前記求めた生細胞濃度及び死細胞濃度に基づき、前記第３の校正曲線を補正し、
    　補正後の第３の校正曲線及び前記側方散乱光検出器により測定される側方散乱光強度に基づき、前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求めることを特徴とする細胞培養装置。
  14. 　細胞懸濁液中の少なくとも細胞生存率を求める細胞計測方法であって、
    　フローセル内を通流する細胞懸濁液に対し、前記細胞懸濁液の流れに直交する方向より光源から照射光を照射する工程と、
    　前記細胞懸濁液より散乱する前方散乱光強度を測定する工程と、
    　前記細胞懸濁液を透過する前記照射光の透過率を測定する工程と、
    　前記測定された前方散乱光強度及び予め記憶された生細胞濃度と前記前方散乱光強度との関係を示す第１の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の生細胞濃度を求める工程と、
    　前記測定された前記透過率及び予め記憶された死細胞濃度と前記透過率との関係を示す第２の校正曲線に基づき、前記細胞懸濁液中の死細胞濃度を求める工程と、
    　前記求めた生細胞濃度及び死細胞濃度に基づき、前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求める工程と、を有することを特徴とする細胞計測方法。
  15. 　請求項１４に記載の細胞計測方法において、
    　前記細胞懸濁液より、前記照射光の光軸及び前記細胞懸濁液の流れの方向に直交する方向へ散乱する側方散乱光強度を測定する工程と、
    　前記求めた生細胞濃度及び死細胞濃度に基づき、予め記憶された細胞生存率と前記側方散乱光強度との関係を示す第３の校正曲線を補正する工程と、
    　前記補正された第３の校正曲線及び前記側方散乱光強度に基づき、前記細胞懸濁液中の細胞生存率を求める工程と、を更に備えることを特徴とする細胞計測方法。
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