WO2015115612A1 - 変異型グルタミン酸－システインリガーゼ、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法 - Google Patents

変異型グルタミン酸－システインリガーゼ、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法 Download PDF

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gsha
val
mutant
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綾子 笹原
英莉 田渕
鈴木　秀之
宇乃 田上
立己 柏木
崇敬 伊藤
博之 野崎
鈴木　俊一
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味の素株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02002—Glutamate-cysteine ligase (6.3.2.2)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -glutamylvalylglycine and a glutamic acid-cysteine ligase mutant suitably used in the method.
  • ⁇ -Glutamylvalylglycine is useful in fields such as foods and pharmaceuticals.
  • Certain peptides such as ⁇ -glutamyl-L-valyl-glycine (hereinafter also referred to as “ ⁇ -Glu-Val-Gly”), have a calcium receptor activating effect.
  • Patent Document 1 a peptide having a calcium receptor activating effect can impart a rich taste to foods and drinks (Patent Document 2), and can improve the taste of low-fat foods, particularly fat-like richness and smoothness (Patent Document) 3) and it is known that the body feeling of sweet substances can be improved and the bitterness peculiar to sweet substances can be improved (Patent Document 4).
  • the peptide as described above has a preventive or therapeutic effect for diarrhea (Patent Document 5), diabetes (Patent Document 6), and a gastrointestinal bicarbonate secretion promoting effect (Patent Document 7). Yes.
  • chemical synthesis and enzymatic methods are known as methods for producing ⁇ -glutamyl tripeptide.
  • a chemical synthesis method a method of selectively obtaining ⁇ -glutamyl tripeptide from a dipeptide using N-protected glutamic anhydride is known (Patent Document 8).
  • a method using glutamic acid-cysteine ligase and glutathione synthetase is known (Patent Documents 9 and 10).
  • a method is also known in which Val-Gly is converted to ⁇ -glutamyl using ⁇ -glutamyltransferase to produce ⁇ -Glu-Val-Gly (Patent Document 11).
  • Glutamate-cysteine ligase is an enzyme (EC 6.3.2.2) that has an activity of catalyzing the reaction of producing ⁇ -Glu-Cys, ADP, and phosphate using Glu, Cys, and ATP as substrates.
  • GSHA usually requires divalent metal ions such as Mg 2+ and Mn 2+ for enzymatic reactions.
  • Vmax / Km the ratio of ⁇ -Glu-Val production activity to ⁇ -Glu-Gly production activity when Mg 2+ is used as a cofactor
  • Mn 2+ is used as a cofactor
  • Km 1.7 mM
  • Km 21 mM. That is, when Vmax / Km is compared as an activity index, the ratio of ⁇ -Glu-Val production activity to ⁇ -Glu-Gly production activity when Mn 2+ is used as a cofactor can be calculated as 0.20.
  • GSHA derived from Proteus mirabilis a gram-negative bacterium, produces ⁇ -glutamyl peptides using Mg 2+ or Mn 2+ as cofactors, Glu, various amino acids, and ATP as substrates. It is known to do (Non Patent Literature 2).
  • ⁇ -Glu-Gly production activity is reported to be 14.5% and ⁇ -Glu-Val production activity is 7.2% when ⁇ -Glu-Cys production activity is taken as 100%. ing. That is, if a comparison is made based on these relative activities, the ratio of the ⁇ -Glu-Val production activity to the ⁇ -Glu-Gly production activity can be calculated as 0.50.
  • Glutamate-cysteine ligase plays a role in generating ⁇ -Glu-Cys which is a precursor of glutathione in vivo.
  • GSHA can use various amino acids other than Cys as a substrate, but its activity using Val, which is one of branched chain amino acids, as a substrate is relatively low compared to Cys. Therefore, when ⁇ -Glu-Val-Gly is produced from Glu, Val, and Gly using GSHA and glutathione synthase, there is a problem that the yield of ⁇ -Glu-Val-Gly is low. Therefore, an object of the present invention is to provide a GSHA mutant suitable for producing ⁇ -Glu-Val and a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly using the same.
  • the mutant glutamate-cysteine ligase wherein the mutation includes a mutation corresponding to one or more mutations selected from the following: L135 (I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T), Q144 (F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I), Y241 (A), N243 (I, W, K, R, H), Y300 (A, H, R, K).
  • L135 I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T
  • Q144 F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I
  • Y241 A
  • N243 I, W, K, R, H
  • Y300 A, H, R, K
  • the mutant glutamate-cysteine ligase wherein the mutation includes a mutation corresponding to any of the following mutations: L135I / Q144R, L135I / Q144D, L135I / Q144A, L135I / Q144L, L135I / N243W, L135I / N243F, L135F / Q144A, L135F / N243W, L135M / Q144R, L135M / Q144A, L135M / Q144L, L135M / N243W, L135M / N243W N243F, L135M / Q144H, L135M / Q144N, L135M / N243Y, L135M / N243R, L135M / N243C, L135V / Q144R, L135V / Q144D, L135V / Q144A, L135V /
  • the mutant glutamate-cysteine ligase wherein the mutation includes a mutation corresponding to any of the following mutations: L135 (I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T), Q144 (F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I), N243 (R, H), Y300 (R, K), L135I / Q144R, L135I / Q144D, L135I / Q144A, L135I / Q144L, L135I / N243W, L135I / N243F, L135F / Q144A, L135M / Q144R, L135M / Q144A, L135M / Q144L, L135M / N243W, L135M / Q144H, L135M / Q144N, L135M / N243C
  • the mutant glutamate-cysteine ligase wherein the wild-type glutamate-cysteine ligase is the protein described in the following (a), (b), or (c): (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (B) a protein comprising an amino acid sequence comprising a substitution, deletion, insertion, or addition of 1 to 10 amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (C) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a process for producing ⁇ -Glu-Val-Gly and / or a salt thereof comprising the following steps (A) and (B): (A) a step of producing ⁇ -Glu-Val by allowing the mutant glutamate-cysteine ligase to act on Glu and Val; and (B) ⁇ -Glu-Val produced by the step (A) of glutathione synthetase and A step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by acting on Gly.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly and / or a salt thereof comprising the following step (C): (C) A step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by allowing the mutant glutamate-cysteine ligase and glutathione synthase to act on Glu, Val, and Gly. [11] The method as described above, wherein the mutant glutamate-cysteine ligase is a purified enzyme. [12] The method, wherein the mutant glutamate-cysteine ligase is an immobilized enzyme.
  • mutant glutamic acid-cysteine ligase is contained in a culture of a microorganism having the enzyme, a cultured microbial cell, or a processed product of the microbial cell.
  • glutathione synthetase is contained in a culture of a microorganism having the enzyme, a cultured microbial cell, or a processed product of the microbial cell.
  • the mutant glutamate-cysteine ligase and glutathione synthetase are contained in a culture of a microorganism having both enzymes, a cultured cell, or a processed product of the cell.
  • the method, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • the method, wherein the step is performed in the presence of ATP.
  • amino acids are L-forms unless otherwise specified.
  • Mutant glutamic acid-cysteine ligase (mutant GSHA) “Glutamate-cysteine ligase” is an enzyme (EC 6.3.) That usually catalyzes the reaction to produce ⁇ -Glu-Cys, ADP and phosphate using Glu, Cys and ATP as substrates. Known as 2.2). In the present invention, this activity is also referred to as “ ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity”. In the present invention, glutamic acid-cysteine ligase is also referred to as “GSHA”.
  • the activity of catalyzing the reaction of producing ⁇ -Glu-Val, ADP and phosphate using Glu, Val and ATP as a substrate is referred to as “ ⁇ -glutamylvaline synthase activity”. It is also referred to as “ ⁇ -Glu-Val production activity”.
  • the activity of catalyzing the reaction for producing ⁇ -Glu-Gly, ADP and phosphate using Glu, Gly and ATP as substrates is referred to as “ ⁇ -glutamylglycine synthase activity”. It is also referred to as “ ⁇ -Glu-Gly production activity”.
  • mutant glutamate-cysteine ligase refers to GSHA having “specific mutation”.
  • the gene encoding mutant GSHA is also referred to as “mutant glutamate-cysteine ligase gene (mutant gshA gene)”. The “specific mutation” will be described later.
  • glutamate-cysteine ligase having no “specific mutation” is also referred to as “wild-type glutamate-cysteine ligase (wild-type GSHA)”.
  • wild-type GSHA wild-type glutamate-cysteine ligase gene
  • wild-type gshA gene wild-type glutamate-cysteine ligase gene
  • the wild type GSHA will be described below.
  • GshA protein GSHA of Escherichia coli
  • the base sequence of the gshA gene of Escherichia coli K-12 MG1655 strain is disclosed in Blattner FR, et al. Science 277: 1453-62 (1997) and is registered in the NCBI database as GenBank accession NC_000913.3 It corresponds to the complementary sequence of sequence 2,814,883 to 2,816,439 in the genome sequence.
  • the base sequence of gshA gene of MG1655 strain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • wild-type GSHA may be a protein encoded by a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example.
  • the wild type GSHA may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, for example.
  • the expression “having an (amino acid or base) sequence” includes the case of “including the (amino acid or base) sequence” and the case of “consisting of the (amino acid or base) sequence”.
  • the wild-type GSHA may be a variant of the wild-type GSHA exemplified above (GSHA of Escherichia coli such as a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) as long as it does not have a “specific mutation”. That is, the wild-type GSHA may have other mutations unless it has a “specific mutation”.
  • Examples of the variant include homologues of the wild type GSHA exemplified above and artificially modified forms.
  • Examples of the GSHA homologue of Escherichia coli include GSHA homologues of other microorganisms that are similar in structure to the GSHA of Escherichia coli.
  • GSHA homologs of other microorganisms examples include GSHA homologs of bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria, etc. .
  • GSHA homologues of other microorganisms can be obtained from a public database by, for example, BLAST search or FASTA search using the amino acid sequence of the wild type GSHA exemplified above as a query sequence.
  • Wild-type GSHA may usually be a protein having ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity.
  • wild-type GSHA is ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity, ⁇ -glutamylvaline synthase activity, ⁇ -glutamylglycine synthesis as long as the corresponding mutant GSHA has ⁇ -glutamylvaline synthase activity. It may have enzymatic activity, or any combination thereof, and none of them.
  • wild type GSHA has a “specific mutation”, substitution or deletion of one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of the wild type GSHA (for example, SEQ ID NO: 2) Or a protein having an amino acid sequence containing an insertion or addition.
  • “One or several” amino acid residues vary depending on the position of the protein in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, More preferably, it means 1 to 5, particularly preferably 1 to 3.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids described above is preferably a conservative mutation that maintains the protein function normally.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganism from which the gene is derived. Also included by mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganism from which the gene is derived. Also included by mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganism from which the gene is derived. Also included by
  • wild-type GSHA has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, relative to the amino acid sequence of wild-type GSHA (eg, SEQ ID NO: 2), unless it has a “specific mutation”. As described above, it may be a protein having homology of 97% or more, particularly preferably 99% or more. In the present specification, “homology” may refer to “identity”.
  • the wild-type GSHA is a probe that can be prepared from the base sequence (eg, SEQ ID NO: 1) of the wild-type gshA gene, for example, the base sequence (eg, sequence) of the wild-type gshA gene, unless it has a “specific mutation”. It may be a protein encoded by a DNA that can hybridize under stringent conditions with a probe having a complementary sequence to all or part of No. 1). Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known wild-type gshA gene sequence as a primer and a DNA fragment containing the base sequence of the wild-type gshA gene as a template.
  • Stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • highly homologous DNAs for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97%, particularly preferably 99% or more DNAs having homology.
  • Conditions that hybridize and DNAs having lower homology do not hybridize with each other, for example, 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC, which are washing conditions for normal Southern hybridization And 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, and conditions for washing once, preferably 2 to 3 times.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • a person skilled in the art can appropriately set various conditions such as salt concentration and temperature to realize stringency equivalent to the stringency of hybridization exemplified above.
  • the wild type gshA gene may be a gene in which an arbitrary codon is replaced with an equivalent codon as long as it encodes wild type GSHA.
  • the wild-type gshA gene may be modified so as to have an optimal codon according to the codon usage frequency of the host to be used. Specifically, for example, when the start codon is other than ATG, the start codon can be changed to ATG.
  • Mutant GSHA has ⁇ -glutamylvaline synthase activity.
  • the mutant GSHA may or may not have an activity to produce ⁇ -glutamyl dipeptide other than ⁇ -glutamyl valine as long as it has ⁇ -glutamyl valine synthase activity. That is, for example, mutant GSHA may or may not have ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity. For example, the mutant GSHA may or may not have ⁇ -glutamylglycine synthase activity. The mutant GSHA preferably has no ⁇ -glutamylglycine synthase activity.
  • Mutant GSHA has a “specific mutation” described later in the amino acid sequence of wild-type GSHA.
  • the mutant GSHA may be a protein having a “specific mutation” in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the mutant GSHA has a “specific mutation” in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and further substitution or deletion of one or several amino acids other than the “specific mutation” It may be a protein having an amino acid sequence including insertion or addition and having ⁇ -glutamyl valine synthase activity.
  • the mutant GSHA may be a protein having the same amino acid sequence as the wild-type GSHA except that it has a “specific mutation”.
  • the mutant GSHA may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that it has a “specific mutation”.
  • a mutant GSHA has an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that it has a “specific mutation”.
  • a protein having ⁇ -glutamyl valine synthase activity is also known as a mutant GSHA.
  • mutant GSHA has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably, relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that it has “specific mutation”. It may be a protein having an amino acid sequence having homology of 97% or more, particularly preferably 99% or more, and having ⁇ -glutamylvaline synthase activity.
  • the mutant GSHA may be a fusion protein with another peptide.
  • the “other peptide” is not particularly limited as long as the mutant GSHA has ⁇ -glutamylvaline synthase activity. “Other peptides” can be appropriately selected depending on various conditions such as the purpose of use. Examples of “other peptides” include peptide tags, signal peptides, and protease recognition sequences. The “other peptide” may be linked to, for example, the N-terminus or C-terminus of the mutant GSHA, or both. As the “other peptide”, one type of peptide may be used, or two or more types of peptides may be used in combination.
  • Specific peptide tags include His tags, FLAG tags, GST tags, Myc tags, MBP (maltose binding protein), CBP (cellulose binding protein), TRX (Thioredoxin), GFP (green fluorescent protein), HRP (horseradish) peroxidase), ALP (Alkaline Phosphatase), and antibody Fc region.
  • His tag is a 6xHis tag.
  • the peptide tag can be used, for example, for detection and purification of the expressed mutant GSHA.
  • the signal peptide is not particularly limited as long as it functions in a host that expresses mutant GSHA.
  • Examples of the signal peptide include a signal peptide recognized by the Sec-type secretory pathway and a signal peptide recognized by the Tat-type secretory pathway.
  • Specific examples of signal peptides recognized by the Tat secretion pathway include the TorA signal sequence of E. coli, the SufI signal sequence of E. coli, the PhoD signal sequence of Bacillus subtilis, the LipA signal sequence of Bacillus subtilis, and Arthrobacter globiformis.
  • An IMD signal sequence is mentioned (WO2013 / 118544).
  • the signal peptide can be used for secretory production of mutant GSHA, for example. When secretory production of mutant GSHA is performed using a signal peptide, the signal peptide is cleaved during secretion, and mutant GSHA without the signal peptide can be secreted outside the cell.
  • protease recognition sequence examples include Factor Xa protease recognition sequence and proTEV protease recognition sequence.
  • the protease recognition sequence can be used, for example, for cleavage of the expressed mutant GSHA. Specifically, for example, when expressing mutant GSHA as a fusion protein with a peptide tag, by introducing a protease recognition sequence into the junction between the mutant GSHA and the peptide tag, the protease is expressed from the expressed mutant GSHA. The peptide tag is cleaved using it, and the mutant GSHA without the peptide tag can be obtained.
  • the mutant GSHA gene is not particularly limited as long as it encodes the above mutant GSHA.
  • the term “gene” is not limited to DNA as long as it encodes a target protein, and may include any polynucleotide. That is, the “mutant GSHA gene” may mean any polynucleotide encoding the mutant GSHA.
  • the mutant GSHA gene may be DNA, RNA, or a combination thereof.
  • the mutant GSHA gene may be single-stranded or double-stranded.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be single-stranded DNA or single-stranded RNA.
  • the mutant GSHA gene may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a hybrid strand composed of a DNA strand and an RNA strand.
  • the mutant GSHA gene may contain both DNA residues and RNA residues in a single polynucleotide chain, the mutant GSHA gene contains RNA. May be appropriately read according to RNA.
  • the mode of the mutant GSHA gene can be appropriately selected according to various conditions such as the mode of use.
  • “Specific mutation” refers to a mutation that, when introduced into wild-type GSHA, imparts properties suitable for the production of ⁇ -glutamylvaline to wild-type GSHA. That is, the mutant GSHA has a “specific mutation” and thus has a property suitable for the production of ⁇ -glutamylvaline compared to the wild-type GSHA.
  • Properties suitable for the production of ⁇ -glutamyl valine include, for example, increased ⁇ -glutamyl valine synthase activity (specific activity), decreased ⁇ -glutamyl glycine synthase activity (specific activity), and ⁇ -glutamyl glycine synthase activity. Examples thereof include an increase in the ratio of ⁇ -glutamylvaline synthase activity (specific activity) to (specific activity), and combinations thereof.
  • ⁇ -glutamylvalylglycine When ⁇ -glutamylvalylglycine is produced in a single reaction system using GSHA, glutathione synthase and Glu, Val, Gly as raw materials, ⁇ -glutamylvaline is used as an intermediate. When glycine is by-produced, the yield of the target ⁇ -glutamyl valylglycine decreases. Therefore, in particular, a mutant GSHA with an improved ratio of ⁇ -glutamylvaline synthase activity to ⁇ -glutamylglycine synthase activity was created and used for the production of ⁇ -glutamylvalylglycine. It is expected that the yield of ⁇ -glutamylvalylglycine produced as a product will be improved. In addition, it is expected that the production of ⁇ -glutamylglycine as a byproduct and the production of other compounds produced via ⁇ -glutamylglycine can be reduced.
  • the ratio of ⁇ -glutamylglycine synthase activity (specific activity) to ⁇ -glutamylglycine synthase activity (specific activity) is, for example, 0.1 or more, 0.2 or more, 0.5 or more, It may be 0.7 or more, 1.0 or more, 5.0 or more, 10 or more, or 20 or more.
  • the ratio of ⁇ -glutamylglycine synthase activity (specific activity) to ⁇ -glutamylglycine synthase activity (specific activity) is, for example, 10 million or less, 1 million or less, 100,000 or less, 1 It may be 10,000 or less, 1000 or less, or 100 or less.
  • the specific activity ratio can be calculated by measuring ⁇ -glutamylglycine synthase activity and ⁇ -glutamylglycine synthase activity under the conditions described in Example 7.
  • Specific activity measurement conditions are as follows. ⁇ - Guru Tamil valine synthetase activity of the mutant GSHA, for example, a reaction solution composition 10 mM Glu, 10 mM Val, 10 mM ATP, 10 mM MgS0 4, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), the reaction The measurement can be carried out using an appropriate amount of mutant GSHA at a temperature of 30 ° C. and a reaction time of 1 to 30 minutes.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val per minute under these conditions is defined as 1 U of ⁇ -glutamyl valine synthase activity.
  • a reaction solution composition 10mM Glu, 10 mM Gly, 10 mM ATP, 10 mM MgS0 4, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0) The measurement can be performed using an appropriate amount of mutant GSHA at a reaction temperature of 30 ° C. and a reaction time of 1 to 30 minutes.
  • the enzyme activity that generates 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Gly per minute under these conditions is defined as 1 U of ⁇ -glutamylglycine synthase activity.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase activity (specific activity) is, for example, 1.1 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 5 times or more, compared to the wild type GSHA. It may be increased by a factor of 20 or more.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase activity (specific activity) can be measured by the method described above.
  • Examples of the “specific mutation” include a mutation corresponding to a mutation in one or more amino acid residues selected from the following. L135, Q144, Y241, N243, Y300.
  • the number indicates the position in the amino acid sequence of wild-type GSHA shown in SEQ ID NO: 2
  • the letter to the left of the number indicates the amino acid residue at that position in the amino acid sequence of wild-type GSHA shown in SEQ ID NO: 2 (ie, before mutation) Amino acid residues; one letter code). That is, for example, “L135” indicates the Leu residue at position 135 in the amino acid sequence of wild-type GSHA shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid residue after substitution may be any amino acid residue other than the original amino acid residue, as long as the mutant GSHA has ⁇ -glutamyl valine synthase activity.
  • the amino acid residues after substitution are K (Lys), R (Arg), H (His), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile), G ( Gly), S (Ser), T (Thr), P (Pro), F (Phe), W (Trp), Y (Tyr), C (Cys), M (Met), D (Asp), E ( Glu), N (Asn), and Q (Gln) include those other than the original amino acid residue.
  • the “specific mutation” include a mutation corresponding to one or more mutations selected from the following. That is, the “specific mutation” may include a mutation corresponding to one or more mutations selected from the following.
  • the “specific mutation” may be, for example, a mutation corresponding to any mutation selected from the following, or may be a mutation corresponding to a combination of two or more mutations selected from the following.
  • the “specific mutation” is, for example, one or more mutations selected from the following and a mutation in one or more amino acid residues selected from other L135, Q144, Y241, N243, and Y300. It may be a mutation corresponding to a combination.
  • L135 (I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T), Q144 (F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I), Y241 (A), N243 (I, W, K, R, H), Y300 (A, H, R, K).
  • the numbers and the meanings of the characters on the left side are the same as described above.
  • the letter in parentheses on the right side of the number indicates the amino acid residue after mutation (indicated by one letter).
  • L135 (I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T)” in the amino acid sequence of the wild type GSHA shown in SEQ ID NO: 2
  • a mutation in which the Leu residue at position 135 is substituted with any one of the amino acid residues Ile, Phe, Met, Val, Gly, Ala, Trp, Lys, His, Arg, Cys, Asn, Ser, and Thr is shown.
  • the amino acid after each mutation may be expressed without parentheses. That is, for example, “L135I” indicates a mutation in which the Leu residue at position 135 in the amino acid sequence of wild-type GSHA shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with an Ile residue.
  • the combination of mutations is not particularly limited. Specific examples of combinations of mutations include the following combinations. L135I / Q144R, L135I / Q144D, L135I / Q144A, L135I / Q144L, L135I / N243W, L135I / N243F, L135F / Q144A, L135F / N243W, L135M / Q144R, L135M / Q144A, L135M / Q144L, L135M / N243W, L135M / N243W N243F, L135M / Q144H, L135M / Q144N, L135M / N243Y, L135M / N243R, L135M / N243C, L135V / Q144R, L135V / Q144D, L135V / Q144A, L135V / Q144L, L135V / Q144V
  • L135 (I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T), Q144 (F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I), N243 (R, H), Y300 (R, K), L135I / Q144R, L135I / Q144D, L135I / Q144A, L135I / Q144L, L135I / N243W, L135I / N243F, L135F / Q144A, L135M / Q144R, L135M / Q144A, L135M / Q144L, L135M / N243W, L135M / Q144H, L135M / Q144N, L1
  • “mutation corresponding to the mutation of the amino acid residue at position n in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” means the amino acid residue at position n in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It means a mutation at the corresponding amino acid residue. That is, for example, “mutation corresponding to L135I” is a mutation in which the amino acid residue corresponding to the Leu residue at position 135 (L135) in the amino acid sequence of wild-type GSHA shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with an Ile residue. Indicates.
  • the “amino acid residue corresponding to L135” herein may be a Leu residue, but may not be a Leu residue.
  • a mutation corresponding to L135I is not limited to a mutation in which the Leu residue is replaced with an Ile residue when the “amino acid residue corresponding to L135” is a Leu residue, If the ⁇ corresponding amino acid residue '' is a Lys, Arg, His, Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro, Phe, Trp, Tyr, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, or Gln residue Also included are mutations in which an amino acid residue is replaced with an Ile residue. The same applies to other mutations.
  • amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position n in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 refers to the amino acid sequence of the target wild type GSHA and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Means the amino acid residue corresponding to the n-th amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. That is, in the above mutation, the position of the amino acid residue does not necessarily indicate an absolute position in the amino acid sequence of wild-type GSHA, but indicates a relative position based on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. .
  • the original n-position amino acid residue is counted from the N-terminal.
  • the n-1th amino acid residue it is regarded as “the amino acid residue corresponding to the n-th amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2”.
  • amino acid residue at position 100 in the amino acid sequence of a GSHA homolog of a certain microorganism corresponds to position 101 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • amino acid residue in the GSHA homolog is “Amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 101 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2”.
  • Alignment can be performed using, for example, known gene analysis software.
  • Specific gene analysis software includes DNA Solutions from Hitachi Solutions, GENETYX from GENETICS, and ClustalW published by DDBJ (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198 (2), 327-37. 1987; Thompson JD et al., Nucleic acid Reseach, 22 (22), 4673-80. 1994).
  • Mutant GSHA can be produced by expressing a mutant gshA gene in a host having the mutant gshA gene.
  • a host having a mutant gshA gene can be obtained by introducing the mutant gshA gene into an appropriate host. “Introducing a mutant gshA gene into a host” includes modifying the gshA gene on the host chromosome so as to have a “specific mutation”.
  • a host having a mutant gshA gene is also referred to as a host having a mutant GSHA.
  • Mutant GSHA can also be produced by expressing a mutant gshA gene in a cell-free protein synthesis system.
  • the mutant gshA gene can be obtained, for example, by modifying the wild type gshA gene so that the encoded GSHA has the above-mentioned “specific mutation”.
  • the wild-type gshA gene to be modified can be obtained, for example, by cloning from an organism having the wild-type gshA gene or by chemical synthesis.
  • a mutant gshA gene can also be obtained without using a wild-type gshA gene.
  • the mutant gshA gene may be obtained directly by chemical synthesis or another mutant gshA gene may be obtained by further modifying the mutant gshA gene.
  • the gene can be modified by a known method.
  • a target mutation can be introduced into a target site of DNA by site-specific mutagenesis.
  • site-directed mutagenesis a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, rlErlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., ethMeth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the host is not particularly limited as long as it can express a functioning mutant GSHA.
  • the host include bacteria, actinomycetes, yeast, fungi, plant cells, insect cells, and animal cells.
  • Preferred hosts include microorganisms such as bacteria and yeast. More preferred hosts include bacteria.
  • bacteria include gram negative bacteria and gram positive bacteria.
  • Gram-negative bacteria include bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria and the like.
  • Gram-positive bacteria include coryneform bacteria such as Bacillus bacteria and Corynebacterium bacteria. Among them, Escherichia coli can be preferably used as the host.
  • the method for introducing the mutant gshA gene into the host is not particularly limited.
  • the mutant gshA gene only needs to be retained so that it can be expressed under the control of a promoter that functions in the host.
  • the mutant gshA gene may be present on a vector that autonomously replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or may be introduced on the chromosome.
  • the host may have only one copy of the mutant gshA gene, or may have two or more copies.
  • the host may have only one type of mutant gshA gene or may have two or more types of mutant gshA genes.
  • the promoter for expressing the mutant gshA gene is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the “promoter that functions in the host” refers to a promoter having promoter activity in the host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a native promoter of the gshA gene or a promoter of another gene.
  • the promoter is preferably a stronger promoter than the native promoter of the gshA gene.
  • strong promoters that function in Enterobacteriaceae bacteria such as Escherichia coli include, for example, T7 promoter, trp promoter, trc promoter, lac promoter, tac promoter, tet promoter, araBAD promoter, rpoH promoter, PR promoter, and PL promoter is mentioned.
  • a strong promoter that functions in coryneform bacteria artificially redesigned P54-6 promoter (Appl. Microbiol.
  • the activity of the promoter can be increased by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO 00/18935).
  • the highly active promoter include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Patent application 2006134574) and pnlp8 promoter (WO2010 / 027045). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotickpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.,. 1, 105-128 (1995)).
  • a terminator for termination of transcription can be arranged downstream of the mutant gshA gene.
  • the terminator is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the terminator may be a host-derived terminator or a heterologous terminator.
  • the terminator may be a specific terminator of the gshA gene or a terminator of another gene. Specific examples of the terminator include T7 terminator, T4 terminator, fd phage terminator, tet terminator, and trpA terminator.
  • the mutant gshA gene can be introduced into a host using, for example, a vector containing the gene.
  • a vector containing a mutant gshA gene is also referred to as an expression vector or a recombinant vector of the mutant gshA gene.
  • An expression vector for a mutant gshA gene can be constructed by, for example, ligating a DNA fragment containing the mutant gshA gene with a vector that functions in the host. By transforming the host with the expression vector of the mutant gshA gene, a transformant into which the vector has been introduced can be obtained, that is, the gene can be introduced into the host.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell can be used.
  • the vector is preferably a multicopy vector. Further, the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene in order to select a transformant. Moreover, the vector may be equipped with a promoter or terminator for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a vector derived from a bacterial plasmid, a vector derived from a yeast plasmid, a vector derived from a bacteriophage, a cosmid, or a phagemid.
  • vectors capable of autonomous replication in bacteria of the Enterobacteriaceae family such as Escherichia coli, specifically, for example, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (all available from Takara Bio Inc.), pACYC184, pMW219 (Nippon Gene), pTrc99A (Pharmacia), pPROK vector (Clontech), pKK233-2 (Clontech), pET vector (Novagen), pQE vector (Qiagen), pACYC, Hiroshi
  • the host range vector RSF1010 can be mentioned.
  • vectors capable of autonomous replication in coryneform bacteria include, for example, pHM1519 (Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., .48, 2901- 2903 (1984)); plasmids having improved drug resistance genes; plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmid pCRY21 described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • a mutant gshA gene containing a unique promoter region may be directly incorporated into the vector, and the mutant GSHA coding region is linked downstream of the promoter as described above and then incorporated into the vector. It may be incorporated, or the coding region of the mutant GSHA may be incorporated downstream of the promoter originally provided on the vector.
  • the vectors, promoters, and terminators that can be used in various microorganisms are described in detail in, for example, “Basic Course of Microbiology 8, Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan, 1987”, and these can be used.
  • mutant gshA gene can be introduced into the host chromosome, for example.
  • Introduction of a gene into a chromosome can be performed, for example, using homologous recombination (Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • homologous recombination examples include the Red-driven integration method (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97).
  • a transduction method using a phage Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced.
  • multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies on the chromosome as a target. Examples of sequences having many copies on a chromosome include repetitive DNA sequences (inverted DNA) and inverted repeats present at both ends of a transposon.
  • homologous recombination may be performed by targeting an appropriate sequence on a chromosome such as a gene unnecessary for production of the target substance.
  • the gene can also be randomly introduced onto the chromosome using transposon or Mini-Mu (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985, US Pat. No. 5,882,888, EP805867B1).
  • a mutant gshA gene containing a unique promoter region may be incorporated into the chromosome as it is, and after coding the mutant GSHA coding region downstream of the above promoter. It may be incorporated into the chromosome, or the mutant GSHA coding region may be incorporated downstream of the promoter originally present on the chromosome.
  • the introduction of a gene onto a chromosome can be attributed to, for example, Southern hybridization using a probe having a base sequence complementary to all or part of the gene, or a primer prepared based on the base sequence of the gene. Can be confirmed by PCR.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a transformation method for example, a method in which a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), as described for Bacillus subtilis, a method of preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA (Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E .., 1997. Gene 1: 153-167).
  • recombinant DNA is prepared by transforming DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, into a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast
  • a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • the host for expressing the mutant gshA gene may or may not have the wild-type gshA gene.
  • the host for expressing the mutant gshA gene preferably does not have the wild type gshA gene.
  • a host that does not have a wild type gshA gene can be obtained by disrupting the wild type gshA gene on the chromosome. A method for destroying the gene will be described later. For example, by replacing a wild-type gshA gene on a chromosome with a mutant gshA gene, a host having no wild-type gshA gene and having a mutant gshA gene can be obtained.
  • the host for expressing the mutant gshA gene may be modified so that the activity of the protein involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide is reduced.
  • An example of a protein involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide is ⁇ -glutamyltransferase (GGT).
  • GGT ⁇ -glutamyltransferase
  • the activity of GGT can be reduced by disrupting the ggt gene encoding GGT.
  • the base sequence of the ggt gene of Escherichia coli and the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • Protein activity decreases means that the activity per cell of the protein is decreased compared to wild-type strains and parental unmodified strains, and the activity is completely lost. including. Specifically, “the activity of the protein is decreased” means that the number of molecules per cell of the protein is decreased and / or the function per molecule of the protein compared to the unmodified strain. Means that it is decreasing. In other words, “activity” in the case of “decrease in protein activity” means not only the catalytic activity of the protein but also the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. May be. Note that “the number of molecules per cell of the protein is decreased” includes a case where the protein does not exist at all.
  • the function per molecule of the protein is reduced includes the case where the function per molecule of the protein is completely lost.
  • the activity of the protein is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain. For example, it is 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0, compared to the non-modified strain. %.
  • the modification that reduces the activity of the protein is achieved, for example, by reducing the expression of a gene encoding the protein.
  • Gene expression decreases means that the expression level of the gene per cell decreases as compared to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain. “Gene expression decreases” specifically means that the amount of gene transcription (mRNA amount) decreases and / or the amount of gene translation (protein amount) decreases. Good. “Gene expression decreases” includes the case where the gene is not expressed at all. In addition, “the expression of the gene is reduced” is also referred to as “the expression of the gene is weakened”. Gene expression may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to an unmodified strain.
  • the decrease in gene expression may be due to, for example, a decrease in transcription efficiency, a decrease in translation efficiency, or a combination thereof.
  • gene expression can be reduced by altering expression regulatory sequences such as the promoter of the gene, Shine-Dalgarno (SD) sequence (also called ribosome binding site (RBS)), spacer region between RBS and start codon. Can be achieved.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more. Further, part or all of the expression regulatory sequence may be deleted.
  • reduction of gene expression can be achieved, for example, by manipulating factors involved in expression control.
  • Factors involved in expression control include small molecules (such as inducers and inhibitors) involved in transcription and translation control, proteins (such as transcription factors), nucleic acids (such as siRNA), and the like.
  • reduction of gene expression can be achieved, for example, by introducing a mutation that reduces gene expression into the coding region of the gene.
  • gene expression can be reduced by replacing codons in the coding region of the gene with synonymous codons that are used less frequently in the host.
  • gene expression itself may be reduced by gene disruption as described below.
  • the modification that decreases the activity of the protein can be achieved, for example, by destroying a gene encoding the protein. “Gene is disrupted” means that the gene is modified so that it does not produce a normally functioning protein. “Does not produce a protein that functions normally” includes the case where no protein is produced from the same gene, or the case where a protein whose function (activity or property) per molecule is reduced or lost is produced from the same gene. It is.
  • Gene disruption can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene on the chromosome. Furthermore, the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted.
  • the region to be deleted may be any region such as an N-terminal region, an internal region, or a C-terminal region as long as a decrease in protein activity can be achieved. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the gene. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match.
  • gene disruption is, for example, introducing an amino acid substitution (missense mutation) into a coding region of a gene on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or adding or deleting 1 to 2 bases. It can also be achieved by introducing a frameshift mutation (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)).
  • gene disruption can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene on the chromosome.
  • the insertion site may be any region of the gene, but the longer the inserted sequence, the more reliably the gene can be inactivated.
  • the other sequence is not particularly limited as long as it reduces or eliminates the activity of the encoded protein, and examples thereof include marker genes such as antibiotic resistance genes and genes useful for the production of target substances.
  • Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, deleting a partial sequence of the gene and preparing a deleted gene modified so as not to produce a normally functioning protein.
  • the host is transformed with the recombinant DNA containing, and the homologous recombination is caused between the deletion type gene and the wild type gene on the chromosome, thereby replacing the wild type gene on the chromosome with the deletion type gene. Can be achieved.
  • the recombinant DNA can be easily manipulated by including a marker gene in accordance with a trait such as auxotrophy of the host.
  • the modification that reduces the activity of the protein may be performed by, for example, a mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, UV irradiation, and N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ) And the like.
  • all of the plurality of subunits may be modified or only a part may be modified as long as the activity of the protein decreases as a result. . That is, for example, all of a plurality of genes encoding these subunits may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • all the activities of the plurality of isozymes may be reduced, or only a part of the activities may be reduced. That is, for example, all of a plurality of genes encoding these isozymes may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • the decrease in the activity of the protein can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the decrease in protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has decreased.
  • the decrease in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has decreased, or confirming that the amount of protein expressed from the gene has decreased.
  • the amount of transcription of the gene has been reduced by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with that of the unmodified strain.
  • methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring spring Laboratory Laboratory, Cold spring Harbor (USA), 2001)).
  • the amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
  • the amount of protein may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
  • the gene has been destroyed by determining part or all of the nucleotide sequence, restriction enzyme map, full length, etc. of the gene according to the means used for the destruction.
  • the mutant GSHA can be expressed by culturing the host introduced with the mutant gshA gene obtained as described above.
  • Host culture conditions and gene expression induction conditions may be appropriately selected according to various conditions such as marker type, promoter type, and host type.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as the host can proliferate and can express mutant GSHA.
  • As the medium for example, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and other organic components as required can be used.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates
  • alcohols such as glycerol and ethanol
  • organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
  • Nitrogen sources include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • Sulfur sources include inorganic sulfur compounds such as sulfates, sulfites, sulfides, hyposulfites, thiosulfates,
  • Inorganic ions include calcium ions, magnesium ions, manganese ions, potassium ions, iron ions, and phosphate ions.
  • organic components include organic trace nutrient sources.
  • organic micronutrients include required substances such as vitamin B1, yeast extract containing them, and the like.
  • the culture temperature may be, for example, 20 ° C to 45 ° C, preferably 24 ° C to 45 ° C.
  • the culture is preferably aeration culture.
  • the oxygen concentration at that time may be adjusted to, for example, 5 to 50%, preferably about 10% of the saturated concentration.
  • the pH during the culture is preferably 5-9.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances such as calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia, etc. can be used for pH adjustment.
  • the culture containing the mutant GSHA can be obtained by culturing preferably for about 10 to 120 hours under the above conditions.
  • the mutant GSHA can accumulate, for example, in the host cell. “Cells” may be appropriately read as “cells” depending on the type of host. Depending on the host to be used and the design of the mutant gshA gene, the mutant GSHA can be accumulated in the periplasm or the mutant GSHA can be secreted and produced outside the cells.
  • the mutant GSHA may be used as it is contained in the microbial cells or the like, or may be appropriately separated and purified from the microbial cells or the like and used as a crude enzyme fraction or a purified enzyme.
  • mutant GSHA when mutant GSHA accumulates in the host cell, the mutant GSHA can be recovered by appropriately crushing, dissolving, or extracting the cell.
  • the cells can be recovered from the culture by centrifugation or the like.
  • Cell disruption, lysis, extraction or the like can be performed by a known method. Examples of such a method include ultrasonic crushing method, dynomill method, bead crushing, French press crushing, and lysozyme treatment. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination.
  • the culture supernatant can be obtained by centrifugation or the like, and the mutant GSHA can be recovered from the culture supernatant.
  • Mutant GSHA can be purified by a known method used for enzyme purification. Examples of such methods include ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and isoelectric point precipitation. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination. Mutant GSHA can be purified to a desired degree. For example, when a component involved in degradation of ⁇ -glutamyl peptide such as GGT coexists with mutant GSHA, it is preferable to remove such component.
  • the purified mutant GSHA can be used as “mutant GSHA” in the method of the present invention.
  • the mutant GSHA may be used in a free state, or may be used in the state of an immobilized enzyme immobilized on a solid phase such as a resin.
  • any fraction containing mutant GSHA may be used as “mutant GSHA” in the method of the present invention.
  • the fraction containing the mutant GSHA is not particularly limited as long as it is contained so that the mutant GSHA can act on Glu and Val.
  • Such a fraction examples include a culture of a host having a mutant gshA gene (a host having a mutant GSHA), a microbial cell recovered from the same culture (cultured microbial cell), a crushed product of the microbial cell, Collected from lysates of the same cells, extracts of the same cells (cell-free extract), treated cells such as immobilized cells obtained by immobilizing the same cells with a carrier such as acrylamide or carrageenan, and the same culture Culture supernatants, partially purified products (crude products), and combinations thereof. Any of these fractions may be used alone or together with a purified mutant GSHA.
  • Glutathione synthase and its production “Glutathione synthase” is usually composed of ⁇ -Glu-Cys, Gly and ATP as substrates and glutathione ( ⁇ -Glu-Cys-Gly) and ADP. It is known as an enzyme (EC 6.3.2.3) that has the activity of catalyzing the reaction that produces phosphoric acid. In the present invention, this activity is also referred to as “glutathione synthase activity”. In the present invention, glutathione synthase is also referred to as “GSHB”.
  • ⁇ -Glu-Val, Gly, and ATP are used as substrates, and the activity of catalyzing the reaction to produce ⁇ -Glu-Val-Gly, ADP, and phosphate is expressed as “ ⁇ -glutamylvalylglycine synthase ( gamma-Glutamylvalylglycine synthethase) activity ”or“ ⁇ -Glu-Val-Gly production activity ”.
  • GSHB having ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity is used. That is, in the present invention, “glutathione synthase (GSHB)” refers to a protein having ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity.
  • GSHB may or may not have an activity to produce ⁇ -glutamyltripeptide other than ⁇ -glutamylvalylglycine as long as it has ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity. . That is, for example, in the present invention, GSHB may or may not have glutathione synthetase activity.
  • GSHB's ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity can be determined by, for example, using a reaction solution composition of 12.5 mM ⁇ -Glu-Val, 12.5 mM Gly, 12.5 mM ATP, 12.5 mM MgS0 4 , 2 mM dithiothreitol, 100 mM Tris-HCl buffer.
  • the solution (pH 8.0), the reaction temperature is 37 ° C., and the reaction time is 1 minute to 50 hours can be measured using an appropriate amount of GSHB.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val-Gly in 1 minute under these conditions is defined as 1 U of ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity.
  • GSHB includes GshB protein encoded by Escherichia coli gshB gene (GSHB of Escherichia coli) and Gsh2 protein encoded by GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae HGS). ). GSHB also includes a mutant glutathione synthetase described in WO2013 / 054447.
  • the base sequence of the gshB gene of Escherichia coli K-12 MG1655 strain corresponds to the sequence at positions 3,089,900 to 3,090,850 in the genome sequence registered in the NCBI database as GenBank accession NC_000913.3.
  • the base sequence of the gshB gene of Escherichia coli K-12 W3110 strain is the same as that of the MG1655 strain.
  • the base sequence of gshB gene of MG1655 strain (gshB gene of W3110 strain) is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene is shown in SEQ ID NO: 4. That is, GSHB may be a protein encoded by a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, for example.
  • GSHB may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, for example.
  • GSHB may have a tag sequence such as a His tag.
  • GSHB may be a variant of the above GSHB as long as it has ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity.
  • the above description of the wild-type GSHA variants can be applied mutatis mutandis.
  • GSHB can be produced by expressing a gshB gene in a host having a gene encoding GSHB (also referred to as “gshB gene”; however, including a gene having a gene name different from gshB such as GSH2 gene).
  • the host having the gshB gene may be one obtained by introducing the gshB gene into an appropriate host, or may originally have the gshB gene.
  • a host having the gshB gene is also referred to as a host having GSHB. Examples of the host originally having the gshB gene include microorganisms such as Escherichia coli having the gshB gene and Saccharomyces cerevisiae having the GSH2 gene.
  • a host originally having a gshB gene may be modified to increase the expression of the gshB gene.
  • Methods for increasing the expression of the gshB gene include increasing the copy number of the gshB gene and improving the transcription efficiency of the gshB gene.
  • An increase in the copy number of the gshB gene can be achieved by introducing the gshB gene into the host.
  • the above-described description regarding the introduction of the mutant gshA gene can be applied mutatis mutandis.
  • the introduced gshB gene may be derived from the same species or from different species.
  • Improvement of the transcription efficiency of the gshB gene can be achieved by replacing the promoter of the gshB gene with a stronger promoter.
  • a stronger promoter a strong promoter as described above can be used.
  • a host for expressing the gshB gene may be modified so that the activity of a protein involved in degradation of ⁇ -glutamyl peptide such as ⁇ -glutamyltransferase (GGT) is reduced.
  • GSHB can also be produced by expressing the gshB gene in a cell-free protein synthesis system.
  • GSHB mutant GSHA using a host into which the mutant gshA gene has been introduced
  • the produced GSHB (purified GSHB or a fraction containing GSHB) can be used as “GSHB” in the method of the present invention.
  • GSHB may be manufactured independently and may be manufactured collectively with the mutant GSHA.
  • GSHB and mutant GSHA can be produced together by expressing them in a host having both gshB gene and mutant gshA gene.
  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -glutamylvalylglycine ( ⁇ -Glu-Val-Gly)
  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -Glu-Val using mutant GSHA and ⁇ -Glu-Val using mutant GSHA.
  • -Provide manufacturing methods for Gly These methods are collectively referred to as “the method of the present invention”.
  • the present invention provides a method for enzymatically producing ⁇ -Glu-Val-Gly using mutant GSHA. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention (enzyme method)”.
  • ⁇ -Glu-Val can be produced by reacting Glu and Val by using mutant GSHA. That is, the present invention provides a method for producing ⁇ -Glu-Val comprising (A) a step of producing ⁇ -Glu-Val by allowing mutant GSHA to act on Glu and Val. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val of the present invention (enzyme method)”. The produced ⁇ -Glu-Val can be appropriately recovered from the reaction solution.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced using the generated ⁇ -Glu-Val as a raw material.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly using ⁇ -Glu-Val as a raw material a method using glutathione synthetase (GSHB) is known (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-85637). Specifically, by using GSHB, ⁇ -Glu-Val and Gly can be reacted to generate ⁇ -Glu-Val-Gly. That is, one embodiment (also referred to as “first embodiment”) of the production method (enzyme method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention is as follows. A step of generating Glu-Val, and (B) a step of generating ⁇ -Glu-Val-Gly by allowing GSHB to act on ⁇ -Glu-Val and Gly generated in step (A). Glu-Val-Gly production method.
  • the step (A) and the step (B) may be performed separately, or may be performed simultaneously in part or all of the periods. That is, for example, the step (A) and the step (B) may be started at the same time, or the step (B) may be started during or after the completion of the step (A).
  • the step (A) and the step (B) can be started simultaneously.
  • Step (B) can be started.
  • ⁇ -Glu-Val generated in step (A) may be recovered, and step (B) may be performed using the recovered ⁇ -Glu-Val.
  • ⁇ -Glu-Val may be used in step (B) after being appropriately subjected to treatments such as purification, dilution, concentration, drying and dissolution.
  • process (A) of the manufacturing method (enzyme method) of (gamma) -Glu-Val of this invention can be implemented by the aspect similar to implementing the process (A) of a 1st aspect independently, for example.
  • Glu, Val, and Gly can be reacted to produce ⁇ -Glu-Val-Gly by using mutant GSHA and GSHB.
  • another embodiment (also referred to as “second embodiment”) of the production method (enzyme method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention includes (C) mutant GSHA and GSHB, Glu, Val, and A method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly, which comprises a step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by acting on Gly.
  • the mutant GSHA, GSHB, Glu, Val, and Gly are allowed to coexist in the reaction system so that the mutant GSHA and GSHB act together on Glu, Val, and Gly, and ⁇ -Glu -Val-Gly can be manufactured.
  • the mutant GSHA and GSHB are also collectively referred to as “enzyme”.
  • Glu, Val, and Gly are also collectively referred to as “amino acids”.
  • ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-Val-Gly are also collectively referred to as “peptides”.
  • Glu, Val, Gly, and ⁇ -Glu-Val are also collectively referred to as “substrate”.
  • the “substrate” may further include ATP unless otherwise specified.
  • the reaction between an enzyme and the corresponding substrate is also called an “enzymatic reaction”.
  • each enzyme used in the method of the present invention is as described above. That is, as each enzyme, for example, a purified enzyme, an arbitrary fraction containing the enzyme, or a combination thereof can be used. As each enzyme, one type of enzyme may be used, or two or more types of enzymes may be used in combination.
  • amino acid a commercially available product may be used, and an amino acid produced and obtained as appropriate may be used.
  • the production method of the amino acid is not particularly limited, and for example, a known method can be used.
  • Amino acids can be produced, for example, by chemical synthesis, enzymatic reaction, or a combination thereof.
  • An amino acid can be produced, for example, by culturing a microorganism capable of producing the amino acid and recovering the amino acid from the culture.
  • a microorganism having an amino acid-producing ability for example, an amino acid-producing bacterium as described later can be used.
  • an amino acid can be manufactured by collect
  • amino acid a purified product purified to a desired level may be used, or a material containing the amino acid may be used.
  • the material containing an amino acid is not particularly limited as long as it contains the amino acid in such a manner that the enzyme can act on the amino acid.
  • Specific examples of the amino acid-containing material include, for example, a culture obtained by culturing a microorganism having the ability to produce the amino acid, a culture supernatant separated from the culture, and a cell isolated from the culture And processed products such as concentrates (concentrated liquids) and concentrated dry products.
  • the amino acid and the peptide may be a free form, a salt thereof, or a mixture thereof. That is, the term “amino acid” may mean a free amino acid, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified.
  • the term “peptide” may mean a free peptide, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified.
  • the salt is not particularly limited as long as it is chemically acceptable.
  • the salt of ⁇ -Glu-Val-Gly is a chemically acceptable edible salt. If there is no particular limitation.
  • “chemically acceptable edible salt” specifically, for acidic groups such as carboxyl groups, ammonium salts, salts with alkali metals such as sodium and potassium, calcium and magnesium, etc. Salts with alkaline earth metals, aluminum salts, zinc salts, salts with organic amines such as triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine, dicyclohexylamine, salts with basic amine acids such as arginine and lysine Can be mentioned.
  • acidic groups such as carboxyl groups, ammonium salts, salts with alkali metals such as sodium and potassium, calcium and magnesium, etc. Salts with alkaline earth metals, aluminum salts, zinc salts, salts with organic amines such as triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine, dicyclohexylamine, salts with basic amine acids such as arginine and lysine
  • a “chemically acceptable edible salt” specifically, for a basic group, for example, with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, etc. Salt, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, tannic acid, butyric acid, hibenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid And salts with organic carboxylic acids such as malic acid and salts with organic sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, etc. Salt, ace
  • the enzyme reaction may be carried out in a batch type or a column type.
  • the enzyme reaction can be carried out by mixing the enzyme and the substrate in the reaction solution in the reaction vessel.
  • the enzyme reaction may be performed by standing or may be performed with stirring.
  • the enzyme reaction can be carried out by passing a reaction solution containing a substrate through a column filled with immobilized cells or immobilized enzyme.
  • the reaction solution water, a buffer solution or the like containing necessary components can be used.
  • the reaction solution may contain, for example, an enzyme, a substrate, ATP, and a divalent metal ion.
  • the combination of components used for the enzyme reaction can be appropriately selected according to the type of process to be performed and the embodiment thereof (whether a plurality of processes are performed simultaneously).
  • Both mutant GSHA and GSHB use ATP for enzymatic reactions. Therefore, ATP is appropriately supplied to the reaction system. That is, the reaction system (reaction solution) may contain ATP. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of ATP.
  • the method for supplying ATP is not particularly limited as long as ATP can be used for the enzymatic reaction. ATP can be added to the reaction solution in any form such as powder or aqueous solution. ATP may be supplied to the reaction system by, for example, a method for generating or regenerating ATP.
  • a method of generating or regenerating ATP As a method of generating or regenerating ATP, a method of supplying ATP from a carbon source using Corynebacterium bacteria (Hori, H et al., Appl.lMicrobiol. Biotechnol. 48 (6): 693-698 ( 1997)), ATP regeneration using yeast cells and glucose (Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69 (4): 784-789 (2005)), phosphoenolpyruvate and Regenerating ATP using pyruvate kinase (C. (Aug'e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett.
  • mutant GSHA usually requires a divalent metal ion for an enzymatic reaction. Therefore, the reaction system (reaction solution) may contain a divalent metal ion. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of a divalent metal ion.
  • Preferred divalent metal ions include Mg 2+ and Mn 2+ .
  • the concentration of the divalent metal ion may be, for example, 1 to 200 mM.
  • Reaction conditions are not particularly limited as long as ⁇ -Glu-Val-Gly is produced.
  • the pH of the reaction solution may be, for example, usually 6.0 to 10.0, preferably 6.5 to 9.0.
  • the reaction temperature may be, for example, usually 15 to 50 ° C., preferably 15 to 45 ° C., more preferably 20 to 40 ° C.
  • the reaction time may be, for example, 5 minutes to 200 hours for each of the step (A) and the step (B) of the first aspect.
  • the reaction time may be, for example, 5 minutes to 200 hours for the step (C) of the second embodiment.
  • the flow rate of the reaction solution may be a rate such that the reaction time is within the range of the reaction time exemplified above.
  • the concentration of each substrate in the reaction solution may be, for example, usually 0.1 to 2000 mM, preferably 1 to 2000 mM, more preferably 10 to 1000 mM.
  • the molar ratio of each substrate in the first aspect is appropriately referred to the molar ratio of each substrate in the second aspect. May be.
  • the amount of enzyme used can be set based on the enzyme activity, for example.
  • the amount of the mutant GSHA used is generally 0.01 to 1000 ⁇ U, preferably 0.1 to 500 ⁇ U, more preferably, in terms of ⁇ -Glu-Val production activity, for example, with respect to the total amount of 1 ⁇ mmol of Glu and Val. It may be 0.1-100 ⁇ U.
  • the amount of GSHB used is, for example, converted to ⁇ -Glu-Val-Gly production activity with respect to the total amount of 1 mmol of ⁇ -Glu-Val and Gly, Usually, it may be 0.01 to 1000 U, preferably 0.1 to 500 U, more preferably 0.1 to 100 U.
  • the amount of GSHB used is, for example, ⁇ -Glu-Val-Gly production activity with respect to a total amount of 1 ⁇ mmol of half of Glu, half of Val and total amount of Gly.
  • the amount may be generally 0.01 to 1000 0.01U, preferably 0.1 to 500 U, more preferably 0.1 to 100 U.
  • the amount of GSHB used in the first embodiment is appropriately referred to the amount of GSHB used in the second embodiment. Good.
  • reaction conditions may be uniform from the start to the end of the enzyme reaction, or may change during the enzyme reaction. “The reaction conditions change in the course of the enzymatic reaction” includes not only that the reaction conditions change temporally but also that the reaction conditions change spatially. “Reaction conditions vary spatially” means that, for example, when a column-type enzyme reaction is performed, reaction conditions such as reaction temperature and enzyme concentration differ depending on the position on the flow path.
  • a reaction solution containing ⁇ -Glu-Val-Gly can be obtained.
  • the formation of ⁇ -Glu-Val-Gly can be confirmed by a known method used for detection or identification of a compound. Examples of such a method include HPLC, LC / MS, GC / MS, and NMR. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be appropriately recovered from the reaction solution. The recovery of ⁇ -Glu-Val-Gly can be performed by a known method used for separation and purification of compounds.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly may contain components other than ⁇ -Glu-Val-Gly, such as components and moisture used for the production of ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly may be purified to a desired degree.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly is, for example, 30% (w / w) or more, 50% (w / w) or more, 70% (w / w) or more, 80% (w / w) or more, 90% ( It may be purified to a purity of w / w) or higher, or 95% (w / w) or higher. Further, ⁇ -Glu-Val can be recovered in the same manner as ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • the present invention provides a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly by fermentation using mutant GSHA. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention (fermentation method)”.
  • ⁇ -Glu-Val can be fermented and produced from Glu and Val by using a microorganism having a mutant GSHA. That is, the present invention provides a method for producing ⁇ -Glu-Val, which comprises (A) a step of producing ⁇ -Glu-Val from Glu and Val by culturing a microorganism having a mutant GSHA in a medium. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val of the present invention (fermentation method)”. The produced ⁇ -Glu-Val can be appropriately recovered from the culture.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced by fermentation from ⁇ -Glu-Val and Gly. That is, one embodiment (also referred to as “third embodiment”) of the production method (fermentation method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention is (A) by culturing a microorganism having mutant GSHA in a medium. A step of producing ⁇ -Glu-Val from Glu and Val, and (B) ⁇ -Glu-Val- from ⁇ -Glu-Val and Gly produced in step (A) by culturing a microorganism having GSHB in a medium. A method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • the step (A) and the step (B) may be performed separately, or may be performed simultaneously during a part or all of the periods. That is, for example, the step (A) and the step (B) may be started at the same time, or the step (B) may be started during or after the completion of the step (A).
  • the step (A) and the step (B) may be performed using a microorganism having a mutant GSHA and a microorganism having a GSHB that is different from the microorganism having the mutant GSHA. A single microorganism having both of these may be used.
  • step (A) and step (B) can be performed simultaneously.
  • the ⁇ -Glu-Val produced in the step (A) may be recovered, and the recovered ⁇ -Glu-Val may be added to the medium to perform the step (B).
  • ⁇ -Glu-Val may be used in step (B) after being appropriately subjected to treatments such as purification, dilution, concentration, drying and dissolution.
  • process (A) of the manufacturing method (fermentation method) of (gamma) -Glu-Val of this invention can be implemented by the aspect similar to implementing the process (A) of a 3rd aspect independently, for example.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced by fermentation from Glu, Val, and Gly by using a microorganism having both mutant GSHA and GSHB. That is, another embodiment (also referred to as “fourth embodiment”) of the production method (fermentation method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention is (C) culturing a microorganism having mutant GSHA and GSHB in a medium. To produce ⁇ -Glu-Val-Gly from Glu, Val, and Gly, thereby producing ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • microorganisms having mutant GSHA, microorganisms having GSHB, and microorganisms having mutant GSHA and GSHB are also collectively referred to as “microorganisms”.
  • each amino acid serving as a substrate is not particularly limited as long as the amino acid can be used in an enzyme reaction.
  • each amino acid may be biosynthesized by a microorganism used in each step, added to a medium, or a combination thereof. That is, for example, all of Glu, Val, and Gly may be biosynthesized by microorganisms, and all of Glu, Val, and Gly may be added to the medium. Further, for example, one or two amino acids of Glu, Val, and Gly may be biosynthesized by a microorganism, and other amino acids may be added to the medium. Any of Glu, Val, and Gly may be biosynthesized by a microorganism and added to the medium.
  • one embodiment of the production method (fermentation method) of ⁇ -Glu-Val of the present invention is, for example, (A1) by culturing a microorganism having a mutant GSHA in a medium containing Glu and Val.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val comprising a step of producing Val, and (A2) culturing a microorganism having a mutant GSHA and capable of producing Glu and Val in a medium. It may be a method for producing ⁇ -Glu-Val including a step of generating ⁇ -Glu-Val.
  • one aspect of the third aspect is, for example, a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly including any one of (A1) and (A2) and (B1) and (B2). May be: (A1) A step of producing ⁇ -Glu-Val by culturing a microorganism having a mutant GSHA in a medium containing Glu and Val; (A2) A step of producing ⁇ -Glu-Val by culturing a microorganism having a mutant GSHA and capable of producing Glu and Val in a medium; (B1) A step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by culturing a microorganism having GSHB in a medium containing ⁇ -Glu-Val and Gly produced in step (A1) or (A2); (B2) By culturing a microorganism having GSHB and having the ability to produce Gly in a medium containing ⁇ -Glu-Val produced in step (A1) or (A2), ⁇ -Glu-Val-Gly Generating.
  • (C1) ⁇ -Glu-Val-Gly is produced by culturing a microorganism having mutant GSHA and GSHB in a medium containing Glu, Val, and Gly. And (C2) culturing microorganisms having mutant GSHA and GSHB and capable of producing Glu, Val, and Gly in a medium. To produce ⁇ -Glu-Val-Gly, thereby producing a ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • the microorganism having the mutant GSHA the microorganism having the mutant gshA gene as described above can be used as it is or after being appropriately modified.
  • the microorganism having GSHB the microorganism having the gshB gene as described above can be used as it is or after being appropriately modified.
  • the microorganism having the mutant GSHA and GSHB the microorganism having both the mutant gshA gene and the gshB gene as described above can be used as they are or after being appropriately modified.
  • the microorganism having an amino acid-producing ability may be one that originally has an amino acid-producing ability, or one that has been modified to have an amino acid-producing ability.
  • a microorganism having an amino acid-producing ability can be obtained by imparting an amino acid-producing ability to a microorganism, or by enhancing the amino acid-producing ability of a microorganism. Either the provision or enhancement of enzyme production ability such as introduction of a mutant gshA gene and / or gshB gene and the provision or enhancement of amino acid production ability may be performed first.
  • a microorganism having mutant GSHA and / or GSHB and having an amino acid-producing ability is obtained by modifying a microorganism having mutant GSHA and / or GSHB so as to have an amino acid-producing ability.
  • a microorganism having an amino acid-producing ability may be obtained by modifying to have a mutant GSHA and / or GSHB.
  • L-amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by a method conventionally used for breeding amino acid-producing bacteria such as coryneform bacteria or Escherichia bacteria (Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, Inc., 1986). (May 30, 1st edition issued, see pages 77-100).
  • L-amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by reducing the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of the target L-amino acid to produce a compound other than the target L-amino acid. It can be carried out.
  • an odhA-deficient strain obtained from Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 was introduced into a recombinant strain in which the mviN gene having a V197M mutation was introduced (JP 2010- 161970), Pantoea agglomerans strain AJ13355 (patent No.
  • gltA citrate synthase
  • Brevibacterium lactofermentum a gltA gene derived from Brevibacterium lactofermentum
  • tyrosine residue at position 397 of glutamine synthetase is replaced with other amino acid residues
  • Examples include bacteria belonging to the genus Escherichia having a substituted mutant glutamine synthetase (US Patent Application Publication No. 2003-0148474).
  • L-valine-producing bacteria include Escherichia coli VL1970 strain (US Pat. No.
  • Escherichia bacteria having a mutation that requires lipoic acid for growth and / or a mutation that lacks H + -ATPase
  • a bacterium belonging to the genus Escherichia in which a DNA fragment containing the ilvGMEDA operon that expresses at least each gene of ilvG, ilvM, ilvE, and ilvD and does not express threonine deaminase activity has been introduced into cells (WO96 / 06926). That is, for example, amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by introducing these modifications into a microorganism.
  • the microorganism may be modified so that the ability to take in the amino acid added to the medium is improved.
  • the microorganism may be modified so as to improve the ability to discharge the produced ⁇ -Glu-Val out of the microbial cell according to the utilization mode, and the ⁇ -Glu-Val added to the medium may be changed. It may be modified to improve the ability to capture.
  • the microorganism may be modified so that the ability to discharge the produced ⁇ -Glu-Val-Gly out of the cell body is improved.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as microorganisms can grow and ⁇ -Glu-Val-Gly is produced.
  • culture conditions reference can be made to the description of the culture conditions in the above-mentioned method for producing mutant GSHA.
  • Both mutant GSHA and GSHB use ATP for enzymatic reactions. Therefore, ATP is appropriately supplied to the reaction system. That is, the reaction system may contain ATP. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of ATP.
  • the method for supplying ATP is not particularly limited as long as ATP can be used for the enzymatic reaction. ATP may be produced, for example, by a microorganism used in each step, or may be supplied to the reaction system by a method for producing or regenerating ATP as described above.
  • a co-culture system such as a method in which a microorganism having an enhanced ATP regeneration system by normal energy metabolism or a microorganism having the ability to regenerate ATP by the action of polyphosphate kinase coexists in a culture solution ( JP-B-7-16431 and JP-B-6-69386) can be preferably used.
  • mutant GSHA usually requires divalent metal ions for enzyme reaction. Therefore, the reaction system may contain a divalent metal ion. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of a divalent metal ion.
  • the amino acid When using a medium containing an amino acid, the amino acid may be contained in the medium from the beginning of the culture or may be added to the medium at any time during the culture.
  • the timing of addition can be appropriately changed according to various conditions such as the culture time. As an example, it is preferably 0 to 50 hours before the end of the culture, more preferably 0.1 to 24 hours, and particularly preferably 0. .5-6 hours ago.
  • the amino acid may be added once or multiple times, or may be added continuously.
  • the concentration of each amino acid in the medium may be, for example, usually 0.1 to 2000 mM, preferably 1 to 2000 mM, more preferably 10 to 1000 mM.
  • the description regarding the molar ratio of each substrate in the reaction liquid in an enzyme method may apply mutatis mutandis.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly By culturing in this way, a culture containing ⁇ -Glu-Val-Gly can be obtained. Generation of ⁇ -Glu-Val-Gly can be confirmed by a known technique used for detection or identification of a compound as described above. ⁇ -Glu-Val-Gly can be appropriately recovered from the culture. As described above, ⁇ -Glu-Val-Gly can be recovered by a known method used for separation and purification of compounds. In the case where L-amino acid accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed with ultrasonic waves, and the microbial cells are removed from the supernatant obtained by centrifugation to obtain ⁇ - Glu-Val-Gly can be recovered.
  • the yeast when the microorganism is yeast and ⁇ -Glu-Val-Gly accumulates in the microbial cells, the yeast can be used, for example, for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Val-Gly. That is, the present invention provides a method for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu, which comprises preparing a yeast extract using the same yeast as a raw material. Preparation of yeast extract from yeast may be carried out in the same manner as normal yeast extract preparation.
  • the yeast extract may be one obtained by treating a yeast cell extracted with hot water, or one obtained by digesting a yeast cell.
  • the obtained yeast extract may be concentrated as needed, and may be dried and made into a powder form.
  • Example 1 Construction of wild-type gshA gene expression plasmid
  • plasmid pSH1391 carrying a gshA gene of Escherichia coli and a gshB gene of Escherichia coli (Suzuki, H., et al J. Bacteriol. 187: 5861-5867 (2005)) was used as a starting material, and an expression plasmid pTO1 of Escherichia coli wild-type gshA gene in which the start codon was replaced with ATG was constructed.
  • pSH1391 Construction of pSH1391
  • the plasmid construction method of pSH1391 is as follows. For the purpose of obtaining the gshA gene of Escherichia coli, primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 were used using Pfu polymerase manufactured by Stratagene, using the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain (ATCC 47076) as a template (Table 1). ) was used to perform PCR. The approximately 2.4 kb fragment containing the gshA gene obtained by digesting the PCR product with PvuI / PstI and the approximately 4.2 kb fragment obtained by digesting pBR322 with PvuI / PstI were ligated.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 20 ⁇ g / mL tetracycline hydrochloride (Tc), and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • Tc tetracycline hydrochloride
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the plasmid having the target structure was named pFK68.
  • primers of SEQ ID NOs: 9 and 10 were used using Pfu polymerase manufactured by Stratagene as a template with the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain (ATCC 47076). PCR was performed using (Table 2). An approximately 1.5 kb fragment containing the gshB gene obtained by digesting the PCR product with HindIII / BamHI and an approximately 2.7 kb fragment obtained by digesting pUC18 with HindIII / BamHI were ligated.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin sodium (Amp), and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the plasmid having the target structure was named pFK63.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 20 ⁇ g / mL Tc, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the plasmid having the target structure was named pSH1388.
  • a fragment containing about 7.8 kb gshA gene, gshB gene, and tetracycline resistance gene obtained by digesting pSH1388 with BanIII was dephosphorylated, and kUCAmycin obtained by treating pUC4K (Pharmacia) with AccI Ligated with a 1.2 kb fragment containing the resistance gene.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 30 ⁇ g / mL kanamycin sulfate (kan), and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and a plasmid having a structure containing the kanamycin resistance gene and the tetracycline resistance gene in the same orientation was named pSH1391.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL Amp, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the plasmid having the target structure was named pSH1559.
  • PCR was performed according to The obtained PCR product was digested with DpnI, Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL Amp, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid is extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence is confirmed using ABI PRISM 310NT Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and the plasmid with the desired structure is named pSH1560 It was.
  • PCR was performed according to the manufacturer's protocol.
  • the obtained PCR product was digested with DpnI, Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL Amp, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence was confirmed, and the plasmid having the target structure was named pSH1561.
  • a fragment containing about 4.9 kb ampicillin resistance gene obtained by digesting pSH1561 with EcoRV / BglII and pSH1559 A fragment of about 1.1 kb obtained by digesting EcoRV / BglII was ligated.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL Amp, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence was confirmed, and the plasmid having the target structure was named pSH1694.
  • a fragment containing about 5.5 kb kanamycin resistance gene obtained by digesting pSH1391 with AatII / BglII and pSH1694 An about 3.6 kb fragment obtained by digesting AatII / BglII was ligated.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 30 ⁇ g / mL Kan, and then cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence was confirmed, and the plasmid having the target structure was named pSH1695.
  • Example 2 Construction of mutant gshA gene expression plasmids
  • expression plasmids of various mutant gshA genes were constructed based on pTO1.
  • mutant gshA gene constructed in Example 1 using Toyobo's KOD-plus polymerase and according to the manufacturer's protocol, using primers (SEQ ID NOs: 15 to 26) corresponding to various mutant gshA genes.
  • PCR was performed using the prepared pTO1 as a template.
  • Table 5 shows the relationship between each mutation and the primer. In the table, the underlined portion corresponds to the amino acid residue into which the mutation is introduced.
  • the obtained PCR product was digested with DpnI, Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 30 ⁇ g / mL Kan, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence was confirmed, and a plasmid having the target structure was obtained as an expression plasmid for the mutant gshA gene.
  • Table 5 shows the relationship between each mutation and the plasmid.
  • the start codon of the gshA gene which Escherichia coli originally has is TTG, since it is substituted with ATG in pTO1, the start codon of the mutant gshA gene in the expression plasmid of each mutant gshA gene is also ATG.
  • Escherichia coli SI97 strain was transformed with each mutant gshA gene expression plasmid, and the strains shown in Table 5 were obtained. It was. Similarly, the Escherichia coli SI97 strain was transformed with the wild-type gshA gene expression plasmid pTO1 to obtain the TO22 strain.
  • Escherichia coli strain SI97 is a strain lacking the ggt gene and gshA gene of Escherichia coli MG1655 strain (Suzuki, H., et al J. Bacteriol. 187: 5861-5867 (2005)).
  • Escherichia coli strain SI97 By using Escherichia coli strain SI97 as a host, the influence of the gene product of the gshA gene originally possessed by Escherichia coli is eliminated when measuring enzyme activity. In addition, by using Escherichia coli strain SI97 as a host, when measuring enzyme activity, an enzyme reaction product containing a peptide having a ⁇ -glutamyl bond is converted into an enzyme by the ggt gene product contained in the cell-free extract. The effects of automatic decomposition are eliminated.
  • Example 3 Evaluation of ⁇ -glutamyldipeptide production activity of mutant GSHA
  • Each strain obtained in Example 2 was inoculated into 10 mL of LB medium containing 30 ⁇ g / mL Kan at 37 ° C, 120 round-trips / min.
  • a preculture was prepared by overnight shaking culture. The turbidity (600 nm) of the obtained preculture was measured, and the preculture was added to 100 mL of LB medium containing 30 ⁇ g / mL Kan placed in a 500 mL Erlenmeyer flask so that the initial turbidity was 0.1. Was inoculated. After culturing overnight at 37 ° C.
  • the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 8,000 rpm, 5 minutes).
  • the cells obtained as a precipitate were suspended in 5 mL of Tris-HCl buffer (pH 8.0) and centrifuged again (4 ° C., 8,000 rpm, 5 minutes) to wash the cells.
  • the cells obtained as a precipitate were suspended again in 3 mL of Tris-HCl buffer (pH 8.0), and subjected to ultrasonic disruption (190 W, 5 minutes) while cooling with ice water.
  • the disrupted solution was centrifuged (4 ° C., 8,000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • the enzyme activity was measured using a cell-free extract. As the enzyme activity, ⁇ -Glu-Val production activity and ⁇ -Glu-Gly production activity were measured.
  • the measurement conditions for ⁇ -Glu-Val production activity are as follows.
  • the composition of the reaction mixture 25mM glutamic acid, 25mM valine, and 5mM ATP, 25mM MgS0 4, 20mM Tris-HCl buffer and (pH 8.0).
  • the reaction volume was 1 mL, and the enzyme reaction was started by adding a cell-free extract.
  • the reaction temperature was 37 ° C., and the reaction time was 0 to 120 minutes.
  • 0.05 mL of 100 w / v% trichloroacetic acid was added to 0.5 mL of the reaction solution. After completion of the reaction, ⁇ -Glu-Val produced by HPLC was quantified.
  • valine in the reaction solution was replaced with glycine, and the produced ⁇ -Glu-Gly was quantified.
  • HPLC conditions are as follows. Shimadzu Shim-pack Amino-Na (particle size 5 microns, inner diameter 6 mm, length 100 mm) was used for the column. Buffer A (66.6 mM citric acid, 1% perchloric acid, 7% ethanol, pH 2.8) and buffer B (200 mM citric acid, 200 mM boric acid, 0.12N NaOH, pH 10) were used as eluents. The column temperature was 60 ° C and the flow rate was 0.6 mL / min.
  • the gradient of the eluent is 0% to 9% buffer B: 0%, 9 to 13 minutes buffer B: 0 to 7%, 13 to 17.2 minutes buffer B: 7 to 8%, 17.2 to 20.8 minutes buffer B : 11%, 20.8-22 minutes buffer B: 50-58%, 22-28.8 minutes buffer B: 100%.
  • Detection was performed using o-phthalaldehyde as a detection reagent at a fluorescence wavelength of 450 nm and an excitation wavelength of 350 nm.
  • the specific activity was calculated by quantifying the amount of ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-Gly produced by the above method.
  • the results are shown in Table 6.
  • ⁇ Reaction (A) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity
  • ⁇ Reaction (B) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity
  • ⁇ (B) / (A) '' The ratio of the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity to the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity is shown respectively.
  • Example 4 Construction of wild-type gshA gene expression plasmid
  • a gshA gene expression plasmid pSF12-EcGshA encoding the glutamic acid-cysteine ligase of Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) was constructed by the following procedure.
  • the base sequence of the gshA gene and the amino acid sequence of GSHA encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. Since the start codon of the same gene was TTG, the start codon was replaced with ATG in the construction of pSF12-EcGshA.
  • GSHA is expressed in a form in which a His tag is added to the C-terminus.
  • the pUC18-derived plasmid pSF12-ggt (WO2013 / 051685A1) containing the ggt gene encoding the ⁇ -glutamyl transpeptidase derived from Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) and the rpoH promoter was digested with NdeI / PstI and QIAquick Gel Extraction Purification with Kit (manufactured by Qiagen) gave a fragment of about 3.1 kb.
  • an about 3.0 kb fragment obtained by digesting pSF12-ggt with NdeI / PstI and an about 1.6 kb fragment obtained by PCR were prepared using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech).
  • the fusion was performed according to the protocol.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction solution, LB agar medium (1.0% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 1.0%) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin sodium (Amp) (W / v) NaCl, 1.5% (w / v) agar) and then cultured at 30 ° C. for 20 hours.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence was confirmed using 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies), and the plasmid having the target structure was named pSF12-EcGshA .
  • Example 5 Construction of a mutant gshA gene expression plasmid
  • the Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used, and various mutant gshA genes were supported according to the manufacturer's protocol.
  • PCR was performed using pSF12-EcGshA described in Example 4 as a template using the primers (SEQ ID NOs: 29 to 76).
  • Table 8 shows the relationship between each mutation and the primer. In the table, sequences in uppercase letters correspond to amino acid residues into which mutations are introduced.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin sodium (Amp), and cultured at 30 ° C. for 20 hours. did.
  • a plasmid is extracted from a colony of the transformant that has grown in accordance with a known method, and the nucleotide sequence is confirmed using 3130 Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies), and the plasmid having the target structure is transformed into the mutant gshA gene. Obtained as an expression plasmid.
  • the plasmid into which each mutation was introduced was named by adding the form of each mutation to pSF12-EcGshA.
  • a plasmid having a mutant gshA gene encoding a mutant GSHA having the Q144F mutation was named pSF12-EcGshA-Q144F.
  • a mutation is further introduced in the same procedure to obtain a mutant gshA gene expression plasmid having a double mutation. Named.
  • a plasmid having a mutant gshA gene encoding a mutant GSHA having a double mutation (L135M / Q144R) of L135M and Q144R is obtained.
  • PSF12-EcGshA-L135M / Q144R is obtained by using pSF12-EcGshA-L135M as a template and further introducing the Q144R mutation.
  • the start codon of the gshA gene originally possessed by Escherichia coli is TTG, but in pSF12-EcGshA, it is replaced by ATG, so the start codon of the mutant gshA gene in the expression plasmid of the mutant gshA gene is also ATG.
  • GSHA is expressed in a form with a His tag added to the C terminus, so GSHA is also expressed in a form with a His tag added to the C terminus even by an expression plasmid of the mutant gshA gene.
  • Example 6 Purification of wild-type and mutant GSHA derived from Escherichia coli MG1655 strain with His tag added to C-terminal Each strain obtained in Example 4 and Example 5 (JM109 strain having each gshA gene expression plasmid) Inoculate 3 mL of LB medium (1.0% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 1.0% (w / v) NaCl) containing 100 ⁇ g / mL Amp. A preculture was prepared by shaking culture for 20 hours at a minute.
  • the cells obtained as a precipitate are suspended in 0.2 mL of buffer solution (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 15% glycerol) and subjected to ultrasonic crushing while cooling. The cells were crushed. The obtained cell disruption solution was centrifuged (4 ° C., 29,100 ⁇ g, 10 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • buffer solution (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 15% glycerol)
  • the resulting cell-free extract was equilibrated with a buffer solution (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM mM imidazole, 15%% glycerol) in advance.
  • the enzyme was eluted with elution buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 250 mM mM imidazole, 15% glycerol) to obtain an active fraction. This active fraction was used as purified GSHA in subsequent experiments.
  • Example 7 Purification of Escherichia coli W3110 strain-derived GSHB with His tag added to the C-terminal Expression plasmid pET- encoding the glutathione synthetase of Escherichia coli W3110 strain (ATCC 27325) EcgshB was constructed by the method described in JP-A-2012-85637. Subsequently, Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by Life Technologies) was transformed with pET-EcgshB to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-EcgshB.
  • GSHB is expressed in a form in which a His tag is added to the C-terminus.
  • This strain was cultured in the same manner as in JP 2012-85637. Bacteria are collected by centrifugation (12,000 ⁇ g, 10 minutes), washed with physiological saline (0.85% (w / v) NaCl), and then buffered (20 mM Tris-HCl (pH 8.0) The cell suspension was prepared using 300 mM NaCl, 10 M imidazole, 15% glycerol). The bacterial cell suspension was subjected to ultrasonic disruption to disrupt the bacterial cells, centrifuged (29,100 ⁇ g, 15 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON-5mL column (Clontech) equilibrated in advance with a buffer solution (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM mMimidazole, 15% glycerol).
  • the enzyme was eluted with elution buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 200 mM imidazole, 15% glycerol) to obtain an active fraction.
  • the obtained active fraction was subjected to buffer exchange (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 15% glycerol) using a PD-10 column (GE Healthcare) according to the manual.
  • the enzyme solution after the buffer exchange was used as purified GSHB in subsequent experiments.
  • Example 8 Production of ⁇ -glutamyldipeptide by each purified GSHA For each purified GSHA obtained in Example 6, ⁇ -Glu-Val synthetic activity and ⁇ -Glu-Gly synthetic activity were measured.
  • the measurement conditions for ⁇ -Glu-Val production activity are as follows.
  • the composition of the reaction mixture 10mM glutamic acid was 10mM valine, 10mM ATP, and 10mM MgS0 4, 100mM Tris-HCl (pH9.0).
  • the reaction volume was 0.2 mL, and the enzyme reaction was started by adding purified enzyme. At this time, purified GSHA was added to the reaction solution so as to be 0.1 g / L.
  • the reaction temperature was 30 ° C., and the reaction time was 30 minutes.
  • 0.2 mL of 200 mM sulfuric acid was added to 0.2 mL of the reaction solution. After completion of the reaction, ⁇ -Glu-Val produced by HPLC was quantified.
  • Quantitative conditions for ⁇ -Glu-Val are as follows.
  • Phenomenex Synergi 4 ⁇ Hydro-RP 80A particle size 4 microns, inner diameter 4.6 mm, length 250 mm
  • the eluent includes eluent A (50 mM sodium dihydrogen phosphate (pH 2.5, pH adjusted with phosphoric acid)) and eluent B (1: 1 (v / v) of eluent A and acetonitrile). Liquid) was mixed at a ratio of 93: 7 (v / v).
  • the flow rate was 1.0 mL / min, the column temperature was 40 ° C., and the UV detection wavelength was 210 nm.
  • valine in the reaction solution was replaced with glycine, and purified GSHA was added to the reaction solution so as to be 0.025 g / L, and an enzyme reaction was performed. After stopping the reaction by the above procedure, the produced ⁇ -Glu-Gly was quantified.
  • Quantitative conditions for ⁇ -Glu-Gly are as follows.
  • Inertsil® ODS-3 particle size: 5 microns, inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm
  • Eluent C 100 mM potassium dihydrogen phosphate, 5 mM sodium octane sulfonate (pH 2.2, pH adjusted with phosphoric acid)
  • the flow rate was 1.5 mL / min
  • the column temperature was 40 ° C.
  • the UV detection wavelength was 210 nm.
  • the specific activity was calculated by quantifying the amount of ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-Gly produced by the above method.
  • the results are shown in Table 9.
  • ⁇ Reaction (A) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity
  • ⁇ Reaction (B) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity
  • ⁇ (B) / (A) '' The ratio of the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity to the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity is shown respectively.
  • GSHA-WT indicates wild type GSHA.
  • Example 9 Production of ⁇ -Glu-Val-Gly from amino acids using each purified GSHA and purified GSHB Using each purified GSHA obtained in Example 6 and purified GSHB obtained in Example 7, The production of ⁇ -Glu-Val-Gly (CAS 38837-70-6, also called Gluvalicine) was examined. The structural formula of ⁇ -Glu-Val-Gly is shown in the following formula (I).
  • the composition of the reaction mixture 10mM glutamic acid, 10mM valine was 10mM glycine, and 20 mM ATP, and 10mM MgS0 4, 100mM Tris-HCl (pH9.0).
  • the amount of the reaction solution was 0.2 mL, and the purified GSHA was added to the reaction solution so that the concentration was 0.1 g / L and the purified GSHB was 0.05 g / L.
  • the enzymatic reaction was started by adding purified GSHA.
  • the reaction temperature was 30 ° C., and the reaction time was 24 hours. When stopping the reaction, 0.2 mL of 200 mM sulfuric acid was added to 0.2 mL of the reaction solution.
  • Example 10 Obtaining purified GSHA derived from Escherichia coli MG1655 strain His-tagged at the C-terminus using a cell-free protein synthesis system Cell-free protein synthesis service (http: // www) Enzym. riken.jp/fees/external_fee_2013.html) was used to obtain purified enzymes of wild-type GSHA and mutant GSHA derived from Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) and used in the subsequent experiments. After protein synthesis, the eluted fraction obtained by affinity purification against Ni was used as a purified enzyme.
  • a buffer 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), 10% glycerol, 300 mM imidazole, 300 mM NaCl, 1 mM DTT
  • TTG the start codon was replaced with ATG during protein synthesis.
  • Wild-type GSHA and mutant GSHA are expressed in a form in which 6 His residues are added to the C-terminus.
  • the expression level improvement option of the cell-free protein synthesis service was used.
  • Example 11 Production of ⁇ -glutamyldipeptide by each purified GSHA synthesized by cell-free protein synthesis system For each purified GSHA obtained in Example 10, ⁇ -Glu-Val synthesis activity and ⁇ -Glu-Gly synthesis activity was measured.
  • the measurement conditions for ⁇ -Glu-Val production activity are as follows.
  • the composition of the reaction mixture 10mM glutamic acid was 10mM valine, 10mM ATP, and 10mM MgS0 4, 100mM Tris-HCl (pH9.0).
  • the reaction volume was 0.2 ml, and the enzyme reaction was started by adding purified enzyme. At this time, purified GSHA was added to the reaction solution so as to be 0.025 g / l.
  • the reaction temperature was 30 ° C., and the reaction time was 60 minutes. When stopping the reaction, 0.2 ml of 200 mM sulfuric acid was added to 0.2 ml of the reaction solution. After the reaction was completed, the produced ⁇ -Glu-Val was quantified by the method described in Example 8.
  • valine in the reaction solution was replaced with glycine, and an enzyme reaction was performed. After stopping the reaction by the above method, the produced ⁇ -Glu-Gly was quantified by the method described in Example 8.
  • ⁇ Reaction (A) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity
  • ⁇ Reaction (B) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity
  • ⁇ (B) / (A) '' The ratio of the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity to the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity is shown respectively. As a result, it was confirmed that both had the same specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity and that of ⁇ -Glu-Gly production activity.
  • ⁇ -Glu-Val production amount and ⁇ -Glu-Gly production amount of wild-type GHSA and mutant GSHA obtained in Example 10 were quantified by the above method, and the specific activity was calculated.
  • the results are shown in Table 12.
  • ⁇ Reaction (A) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity
  • ⁇ Reaction (B) '' is the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity
  • ⁇ (B) / (A) '' The ratio of the specific activity of ⁇ -Glu-Val production activity to the specific activity of ⁇ -Glu-Gly production activity is shown respectively.
  • GSHA-WT indicates wild type GSHA.
  • the mutant GSHA of the present invention catalyzes a ⁇ -Glu-Val production reaction by selectively using Val as a substrate. Therefore, according to the present invention, using the mutant GSHA of the present invention, ⁇ -Glu-Val can be efficiently produced from Glu and Val as raw materials, and ⁇ -Glu-Val and Gly as raw materials. ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced. Furthermore, according to the present invention, ⁇ -Glu-Val-Gly can be efficiently produced using Glu, Val, and Gly as raw materials using the mutant GSHA of the present invention.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of the wild-type gshA gene of Escherichia coli MG1655 strain
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of the wild-type GSHA protein of Escherichia coli MG1655 strain
  • SEQ ID NO: 3 Base sequence of the gshB gene of Escherichia coli W3110 strain
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of GSHB protein of Escherichia coli W3110 strain
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence of ggt gene of Escherichia coli MG1655 strain
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of GGT protein of Escherichia coli MG1655 strain
  • SEQ ID NOs: 7 to 106 Primer

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Abstract

　γ-Glu-Valを生成するのに好適なグルタミン酸－システインリガーゼ（GSHA）の変異体、及びそれを用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。特定の変異を有する変異型GSHAを利用して、Glu及びValを原料としてγ-Glu-Valを製造し、さらにγ-Glu-Val及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する。特定の変異を有する変異型GSHAを利用して、Glu、Val、及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する。

Description

変異型グルタミン酸－システインリガーゼ、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法
　本発明は、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法、及び、同方法に好適に用いられるグルタミン酸－システインリガーゼの変異体に関する。γ－グルタミルバリルグリシンは、食品及び医薬品等の分野で有用である。
　γ－グルタミルバリルグリシン（L-γ-glutamyl-L-valyl-glycine；以下、「γ-Glu-Val-Gly」ともいう。）のようなある種のペプチドは、カルシウム受容体活性化作用を有している（特許文献１）。このようなカルシウム受容体活性化作用を有するペプチドは、飲食品にコク味を付与できること（特許文献２）、低脂肪食品の呈味、特に脂肪様濃厚感及び滑らかさ、を改善できること（特許文献３）、及び、甘味物質のボディー感を改善し、甘味物質特有の苦味を改善できること（特許文献４）が知られている。
　また、前記のようなペプチドは、下痢（特許文献５）、糖尿病（特許文献６）の予防又は治療効果、及び、消化管の重炭酸分泌促進効果（特許文献７）を有することが知られている。
　一般に、γ－グルタミルトリペプチドの製造法としては、化学合成法および酵素法が知られている。化学合成法としては、N-保護グルタミン酸無水物を利用して、ジペプチドから選択的にγ－グルタミルトリペプチドを得る方法が知られている（特許文献８）。酵素法としては、グルタミン酸－システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素を利用する方法が知られている（特許文献９、１０）。また、酵素法としては、γ－グルタミルトランスフェラーゼを利用し、Val-Glyをγ－グルタミル化してγ-Glu-Val-Glyを生成する方法も知られている（特許文献１１）。
　グルタミン酸－システインリガーゼ（GSHA）は、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.2）である。GSHAは、通常、酵素反応にMg2+やMn2+等の２価の金属イオンを要求する。
　エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のGSHAは、Mg2+またはMn2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ－グルタミルペプチドを生成するが、補因子となる金属イオンの種類が基質特異性に影響することが知られている（非特許文献１）。具体的には、Mg2+を補因子とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は、Vmax = 251 mol/mg/hr, Km = 17.6 mMであるのに対して、γ-Glu-Val生成活性は、Vmax = 59 mol/mg/hr, Km = 27.1 mMであると報告されている。すなわち、Vmax/Kmを活性の指標として比較すれば、Mg2+を補因子とした場合のγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.15と算出できる。一方、Mn2+を補因子とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は、Vmax = 39 mol/mg/hr, Km = 1.7 mMであるのに対して、γ-Glu-Val生成活性は、Vmax = 95 mol/mg/hr, Km = 21 mMであると示されている。すなわち、Vmax/Kmを活性の指標として比較すれば、Mn2+を補因子とした場合のγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.20と算出できる。
　また、グラム陰性細菌の１種であるプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）由来のGSHAは、Mg2+またはMn2+を補因子とし、Gluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ-グルタミルペプチドを生成することが知られている（非特許文献２）。プロテウス・ミラビリス由来のGSHAについて、γ-Glu-Cys生成活性を100%とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は14.5%、γ-Glu-Val生成活性は7.2%であると報告されている。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.50と算出できる。
WO2007/055388 WO2007/055393 WO2008/139945 WO2008/139946 WO2008/139947 WO2009/107660 WO2009/119554 特開平08-119916 WO2013/054447 特開2012-85637 WO2013/051685
Brenda S. Kelly et al., J. Biol. Chem., 277, 50-58, 2002 Kumagai, H. et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1301-1309, 1982
　グルタミン酸－システインリガーゼ（GSHA）は、生体内において、グルタチオンの前駆体であるγ-Glu-Cysを生成する役割を担っている。GSHAは、Cys以外にも種々のアミノ酸を基質として利用できるが、Cysと比較して、分岐鎖アミノ酸の1種であるValを基質とする活性が相対的に低い。そのため、GSHAおよびグルタチオン合成酵素を利用し、Glu、Val、Glyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する場合、γ-Glu-Val-Glyの収量が低いという問題がある。そこで、本発明は、γ-Glu-Valを生成するのに好適なGSHAの変異体、及びそれを用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ-Glu-Glyを生成する活性に対するγ-Glu-Valを生成する活性の比率が向上するGSHAの変異を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
　野生型グルタミン酸－システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する、変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
［２］
　前記変異が、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
Y241（A）、
N243（I, W, K, R, H）、
Y300（A, H, R, K）。
［３］
　前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
［４］
　前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
N243（R, H）、
Y300（R, K）、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
［５］
　前記野生型グルタミン酸－システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［６］
　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が０．７以上である、前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼ。
［７］
　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が０．７以上である、変異型グルタミン酸－システインリガーゼ。
［８］
　下記工程（Ａ）を含む、γ-Glu-Valおよび／またはその塩の製造法：
（Ａ）前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程。
［９］
　下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ａ）前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程；および
（Ｂ）グルタチオン合成酵素を工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［１０］
　下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［１１］
　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼが、精製酵素である、前記方法。
［１２］
　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼが、固定化酵素である、前記方法。
［１３］
　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼが、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１４］
　前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１５］
　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１６］
　前記微生物が、γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、前記方法。
［１７］
　前記微生物が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
［１８］
　前記工程がATPの存在下で実施される、前記方法。
［１９］
　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼをコードする遺伝子。
［２０］
　前記遺伝子を搭載するベクター。
［２１］
　前記遺伝子または前記ベクターを有する微生物。
［２２］
　γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、前記微生物。
［２３］
　グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、前記微生物。
［２４］
　エシェリヒア・コリである、前記微生物。
　以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において、アミノ酸は特記しない限りＬ－体である。
＜１＞変異型グルタミン酸－システインリガーゼ（変異型GSHA）
　「グルタミン酸－システインリガーゼ（glutamate-cysteine ligase）」は、通常、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.2）として知られている。本発明において、同活性を、「γ－グルタミルシステイン合成酵素（gamma-glutamylcysteine synthetase）活性」ともいう。本発明において、グルタミン酸－システインリガーゼを、「GSHA」ともいう。
　また、本発明において、GluとValとATPを基質として、γ-Glu-ValとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ－グルタミルバリン合成酵素（gamma-Glutamylvaline synthethase）活性」または「γ-Glu-Val生成活性」ともいう。
　また、本発明において、GluとGlyとATPを基質として、γ-Glu-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ－グルタミルグリシン合成酵素（gamma-Glutamylglycine synthethase）活性」または「γ-Glu-Gly生成活性」ともいう。
　本発明において、「変異型グルタミン酸－システインリガーゼ（変異型GSHA）」とは、「特定の変異」を有するGSHAをいう。また、本発明において、変異型GSHAをコードする遺伝子を、「変異型グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子（変異型gshA遺伝子）」ともいう。「特定の変異」については後述する。
　本発明において、「特定の変異」を有しないグルタミン酸－システインリガーゼを「野生型グルタミン酸－システインリガーゼ（野生型GSHA）」ともいう。また、本発明において、野生型GSHAをコードする遺伝子を、「野生型グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子（野生型gshA遺伝子）」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。
　以下、野生型GSHAについて説明する。
　野生型GSHAとしては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のgshA遺伝子によりコードされるGshAタンパク質（エシェリヒア・コリのGSHA）が挙げられる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のgshA遺伝子の塩基配列は、Blattner FR, et al. Science 277:1453-62 (1997) に開示されており、GenBank accession NC_000913.3としてNCBIデータベースに登録されているゲノム配列中の2,814,883～2,816,439位の配列の相補配列に相当する。MG1655株のgshA遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また、同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。すなわち、野生型GSHAは、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。また、野生型GSHAは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
　野生型GSHAは、「特定の変異」を有さない限り、上記例示した野生型GSHA（配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質等のエシェリヒア・コリのGSHA）のバリアントであってもよい。すなわち、野生型GSHAは、「特定の変異」を有さない限り、その他の変異を有していてもよい。バリアントとしては、例えば、上記例示した野生型GSHAのホモログや人為的な改変体が挙げられる。エシェリヒア・コリのGSHAのホモログとしては、エシェリヒア・コリのGSHAと構造の類似する他の微生物のGSHAホモログが挙げられる。他の微生物のGSHAホモログとしては、他のエシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌のGSHAホモログが挙げられる。他の微生物のGSHAホモログは、例えば、上記例示した野生型GSHAのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得することができる。
　野生型GSHAは、通常、γ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。ただし、本発明において、野生型GSHAは、それに対応する変異型GSHAがγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ－グルタミルシステイン合成酵素活性、γ－グルタミルバリン合成酵素活性、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性、またはそれらの任意の組み合わせを有していてもよく、それらのいずれも有していなくてもよい。
　野生型GSHAは、「特定の変異」を有さない限り、上記野生型GSHAのアミノ酸配列（例えば配列番号２）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～5個、特に好ましくは1～3個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、好ましくは、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、野生型GSHAは、「特定の変異」を有さない限り、上記野生型GSHAのアミノ酸配列（例えば配列番号２）に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　また、野生型GSHAは、「特定の変異」を有さない限り、上記野生型gshA遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１）から調製され得るプローブ、例えば上記野生型gshA遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１）の全体または一部に対する相補配列を有するプローブ、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAによってコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、公知の野生型gshA遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、野生型gshA遺伝子の塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度および温度等の諸条件を適宜設定して、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　また、野生型gshA遺伝子は、野生型GSHAをコードする限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、野生型gshA遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。具体的には、例えば、開始コドンがATG以外である場合に、開始コドンをATGに改変することができる。
　以下、変異型GSHAについて説明する。
　変異型GSHAは、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する。
　変異型GSHAは、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ－グルタミルバリン以外のγ－グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、変異型GSHAは、γ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、変異型GSHAは、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。変異型GSHAは、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性を有さないのが好ましい。
　変異型GSHAは、野生型GSHAのアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有する。
　すなわち、例えば、変異型GSHAは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
　また、言い換えると、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、野生型GSHAと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
　変異型GSHAは、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。「他のペプチド」は、変異型GSHAがγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、特に制限されない。「他のペプチド」は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。「他のペプチド」としては、ペプチドタグ、シグナルペプチド、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。「他のペプチド」は、例えば、変異型GSHAのＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。「他のペプチド」としては、１種のペプチドを用いてもよく、２種またはそれ以上のペプチドを組み合わせて用いてもよい。
　ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現した変異型GSHAの検出や精製に利用できる。
　シグナルペプチドは、変異型GSHAを発現させる宿主で機能するものであれば、特に制限されない。シグナルペプチドとしては、Sec系分泌経路で認識されるシグナルペプチドやTat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドが挙げられる。Tat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとして、具体的には、E. coliのTorAシグナル配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる（WO2013/118544）。シグナルペプチドは、例えば、変異型GSHAの分泌生産に利用できる。シグナルペプチドを利用して変異型GSHAを分泌生産する場合、分泌時にシグナルペプチドが切断され、シグナルペプチドを有さない変異型GSHAが菌体外に分泌され得る。
　プロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現した変異型GSHAの切断に利用できる。具体的には、例えば、変異型GSHAをペプチドタグとの融合タンパク質として発現させる場合、変異型GSHAとペプチドタグの連結部にプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現した変異型GSHAからプロテアーゼを利用してペプチドタグを切断し、ペプチドタグを有さない変異型GSHAを得ることができる。
　変異型GSHA遺伝子は、上記のような変異型GSHAをコードする限り、特に制限されない。なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「変異型GSHA遺伝子」とは、変異型GSHAをコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。変異型GSHA遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。変異型GSHA遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。変異型GSHA遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。変異型GSHA遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい変異型GSHA遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。変異型GSHA遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
　以下、「特定の変異」について説明する。
　「特定の変異」とは、野生型GSHAに導入した際に、γ－グルタミルバリンの生成に適した性質を野生型GSHAに付与する変異をいう。すなわち、変異型GSHAは、「特定の変異」を有することにより、野生型GSHAと比較して、γ－グルタミルバリンの生成に適した性質を有する。γ－グルタミルバリンの生成に適した性質としては、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の上昇、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）の低下、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率の上昇、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
　GSHAおよびグルタチオン合成酵素を利用し、Glu、Val、Glyを原料としてγ－グルタミルバリルグリシンを単一の反応系で製造する場合、中間体としてγ－グルタミルバリンを経るが、この過程でγ－グルタミルグリシンが副生すると、目的物であるγ－グルタミルバリルグリシンの収量が低下する。よって、特に、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が向上した変異型GSHAを創出し、γ－グルタミルバリルグリシンの製造に利用することで、γ－グルタミルバリンを中間体として生成するγ－グルタミルバリルグリシンの収量が向上すると期待される。併せて、副生物であるγ－グルタミルグリシンの生成、およびγ-グルタミルグリシンを経て生成する他の化合物の生成を低減できると期待される。
　変異型GSHAにおいては、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率が、例えば、０．１以上、０．２以上、０．５以上、０．７以上、１．０以上、５．０以上、１０以上、または２０以上であってよい。また、変異型GSHAにおいては、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率が、例えば、１０００万以下、１００万以下、１０万以下、１万以下、１０００以下、または１００以下であってもよい。比活性の比率は、実施例７に記載の条件でγ－グルタミルグリシン合成酵素活性およびγ－グルタミルグリシン合成酵素活性を測定し、算出できる。具体的な活性測定条件は以下の通りである。変異型GSHAのγ－グルタミルバリン合成酵素活性は、例えば、反応液組成を10 mM Glu、10 mM Val、10 mM ATP、10 mM MgS04、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)、反応温度30℃、反応時間1～30分として、適切な量の変異型GSHAを用いて測定することができる。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ－グルタミルバリン合成酵素活性とする。同様に、変異型GSHAのγ－グルタミルグリシン合成酵素活性は、例えば、反応液組成を10mM Glu、10 mM Gly、10 mM ATP、10 mM MgS04、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)、反応温度30℃、反応時間1～30分として、適切な量の変異型GSHAを用いて測定することができる。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ－グルタミルグリシン合成酵素活性とする。
　また、特に、γ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）が上昇した変異型GSHAを利用することにより、GluおよびValを原料とするγ－グルタミルバリンの生産が向上すると期待される。変異型GSHAにおいては、γ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）が、野生型GSHAと比較して、例えば、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、または２０倍以上に上昇していてよい。γ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）は、上述の方法により測定することができる。
　「特定の変異」としては、下記より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異に相当する変異が挙げられる。
　L135、Q144、Y241、N243、Y300。
　上記表記において、数字は配列番号２に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は配列番号２に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基（すなわち、変異前のアミノ酸残基；一文字表記）を、各々示す。すなわち、例えば、「L135」は、配列番号２に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基を示す。
　上記変異において、置換後のアミノ酸残基は、変異型GSHAがγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、元のアミノ酸残基以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい。置換後のアミノ酸残基として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。
　「特定の変異」として、具体的には、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異が挙げられる。すなわち、「特定の変異」は、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異を含んでいてよい。「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれるいずれかの変異に相当する変異であってもよく、下記より選ばれる２又はそれ以上の変異の組み合わせに相当する変異であってもよい。また、「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異と、それ以外のL135、Q144、Y241、N243、Y300より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異との組み合わせに相当する変異であってもよい。
L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
Y241（A）、
N243（I, W, K, R, H）、
Y300（A, H, R, K）。
　上記表記において、数字およびその左側の文字の意味は前記と同様である。数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基（一文字表記）を示す。すなわち、例えば、「L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）」は、配列番号２に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle、Phe、Met、Val、Gly、Ala、Trp、Lys、His、Arg、Cys、Asn、Ser、およびThrのいずれかのアミノ酸残基に置換される変異を示す。なお、各変異後のアミノ酸をカッコなしで表記してもよい。すなわち、例えば、「L135I」は、配列番号２に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle残基に置換される変異を示す。
　変異の組み合わせは特に制限されない。変異の組み合わせとして、具体的には、下記の組み合わせが挙げられる。
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
　上記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。また、上記表記において、「/」で区切られた２又はそれ以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の多重変異を示す。すなわち、例えば、「L135I/Q144R」は、L135IとQ144Rの二重変異を示す。
　また、実施例においてγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の顕著な上昇が認められた変異として、下記の変異が挙げられる。
L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
N243（R, H）、
Y300（R, K）、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
　任意の野生型GSHAのアミノ酸配列において、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基の変異に相当する変異」とは、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異を意味する。すなわち、例えば、「L135Iに相当する変異」とは、配列番号２に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基（L135）に相当するアミノ酸残基がIle残基に置換される変異を示す。なお、ここでいう「L135に相当するアミノ酸残基」は、通常Leu残基であってよいが、Leu残基でなくてもよい。すなわち、例えば、「L135Iに相当する変異」は、「L135に相当するアミノ酸残基」がLeu残基である場合に当該Leu残基がIle残基に置換される変異に限られず、「L135に相当するアミノ酸残基」がLys、Arg、His、Ala、Val、Gly、Ser、Thr、Pro、Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Asn、またはGln残基である場合に当該アミノ酸残基がIle残基に置換される変異も包含する。他の変異についても同様である。
　任意の野生型GSHAのアミノ酸配列において、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、対象の野生型GSHAのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。すなわち、上記変異において、アミノ酸残基の位置は、必ずしも野生型GSHAのアミノ酸配列における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号２に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる野生型GSHAにおいて、n位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した場合、元のn位のアミノ酸残基はN末端から数えてn-1番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。同様に、例えば、ある微生物のGSHAホモログのアミノ酸配列中の100位のアミノ酸残基が、配列番号２に示すアミノ酸配列中の101位に相当するときは、当該アミノ酸残基は、当該GSHAホモログにおける「配列番号２に示すアミノ酸配列における101位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」である。
　アラインメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して実施できる。具体的な遺伝子解析ソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASIS、ゼネティックス製のGENETYX、DDBJが公開しているClustalWなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987；Thompson JD et al., Nucleic acid Reseach, 22(22), 4673-80. 1994）。
＜２＞変異型グルタミン酸－システインリガーゼ（変異型GSHA）の製造
　変異型GSHAは、変異型gshA遺伝子を有する宿主に変異型gshA遺伝子を発現させることにより製造できる。変異型gshA遺伝子を有する宿主は、変異型gshA遺伝子を適当な宿主に導入することにより取得できる。なお、「変異型gshA遺伝子を宿主に導入する」ことには、宿主の染色体上のgshA遺伝子を「特定の変異」を有するように改変することも含まれる。なお、変異型gshA遺伝子を有する宿主を、変異型GSHAを有する宿主ともいう。また、変異型GSHAは、変異型gshA遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
　変異型gshA遺伝子は、例えば、野生型gshA遺伝子を、コードされるGSHAが上記「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変のもとになる野生型gshA遺伝子は、例えば、野生型gshA遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型gshA遺伝子は、野生型gshA遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成等により変異型gshA遺伝子を直接取得してもよく、変異型gshA遺伝子をさらに改変することにより別の変異型gshA遺伝子を取得してもよい。
　遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
　宿主は、機能する変異型GSHAを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。より好ましい宿主としては、細菌が挙げられる。細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌が挙げられる。宿主としては、中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を好適に用いることができる。
　変異型gshA遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、変異型gshA遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、変異型gshA遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、変異型gshA遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類の変異型gshA遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型gshA遺伝子を有していてもよい。
　変異型gshA遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、gshA遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、gshA遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであるのが好ましい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（（EF-Tu））プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　また、変異型gshA遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、gshA遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
　変異型gshA遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。変異型gshA遺伝子を含むベクターを、変異型gshA遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。変異型gshA遺伝子の発現ベクターは、例えば、変異型gshA遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。変異型gshA遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む変異型gshA遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、変異型GSHAのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流に変異型GSHAのコード領域を組み込んでもよい。
　各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　また、変異型gshA遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む変異型gshA遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、変異型GSHAのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流に変異型GSHAのコード領域を組み込んでもよい。
　染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
　形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
　変異型gshA遺伝子を発現するための宿主は、野生型gshA遺伝子を有していてもよく、有していなくともよい。変異型gshA遺伝子を発現するための宿主は、野生型gshA遺伝子を有していないのが好ましい。野生型gshA遺伝子を有さない宿主は、染色体上の野生型gshA遺伝子を破壊することにより取得できる。遺伝子を破壊する方法については後述する。例えば、染色体上の野生型gshA遺伝子を変異型gshA遺伝子で置換することにより、野生型gshA遺伝子を有さず、且つ、変異型gshA遺伝子を有する宿主を取得できる。野生型gshA遺伝子を変異型gshA遺伝子で置換するためには、例えば、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法、及びその応用による遺伝子に対して点変異を導入する方法（Heermann, R et al., Microbial Cell Factories 7:14(2008)）等の方法を利用できる。
　変異型gshA遺伝子を発現するための宿主は、γ－グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。γ－グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質としては、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）が挙げられる。GGTの活性が低下することにより、γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyの分解を抑制することが出来る。GGTの活性は、GGTをコードするggt遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。一例として、エシェリヒア・コリのggt遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５及び６に示す。
　以下、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
　「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
　遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１～２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT－PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
　上記のようにして得られた、変異型gshA遺伝子が導入された宿主を培養することにより、変異型GSHAを発現させることができる。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、変異型GSHAを発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
　炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
　窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
　イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
　無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
　その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
　培養温度は、例えば、20℃～45℃、好ましくは24℃～45℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5～50%に、好ましくは10%程度に調節してよい。培養中のpHは、5～9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。
　上記のような条件下で、好ましくは10時間～120時間程度培養することにより、変異型GSHAを含む培養物が得られる。変異型GSHAは、例えば、宿主の菌体内に蓄積し得る。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。尚、使用する宿主及び変異型gshA遺伝子の設計によっては、ペリプラズムに変異型GSHAを蓄積させることや、菌体外に変異型GSHAを分泌生産させることも可能である。
　変異型GSHAは、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。
　すなわち、例えば、宿主の菌体内に変異型GSHAが蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、変異型GSHAを回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地に変異型GSHAが蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清から変異型GSHAを回収することができる。
　変異型GSHAの精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。変異型GSHAの精製は、所望の程度に行うことができる。例えば、GGT等のγ－グルタミルペプチドの分解に関与する成分が変異型GSHAと共存している場合には、そのような成分を除去するのが好ましい。
　精製された変異型GSHAは、本発明の方法における「変異型GSHA」として利用できる。変異型GSHAは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
　また、精製された変異型GSHAに限られず、変異型GSHAを含有する任意の画分を本発明の方法における「変異型GSHA」として利用してもよい。変異型GSHAを含有する画分は、変異型GSHAがGluおよびValに作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、変異型gshA遺伝子を有する宿主（変異型GSHAを有する宿主）の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製された変異型GSHAと共に利用されてもよい。
＜３＞グルタチオン合成酵素（GSHB）およびその製造
　「グルタチオン合成酵素（glutathione synthase）」は、通常、γ-Glu-CysとGlyとATPを基質として、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）とADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.3）として知られている。本発明において、同活性を、「グルタチオン合成酵素活性」ともいう。本発明において、グルタチオン合成酵素を、「GSHB」ともいう。
　また、本発明において、γ-Glu-ValとGlyとATPを基質として、γ-Glu-Val-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素（gamma-Glutamylvalylglycine synthethase）活性」または「γ-Glu-Val-Gly生成活性」ともいう。
　本発明において、GSHBとしては、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するものを用いる。すなわち、本発明において、「グルタチオン合成酵素（GSHB）」とは、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質をいうものとする。
　本発明において、GSHBは、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、γ－グルタミルバリルグリシン以外のγ－グルタミルトリペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、本発明において、GSHBは、グルタチオン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　GSHBのγ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性は、例えば、反応液組成を12.5 mMγ-Glu-Val、12.5 mM Gly、12.5 mM ATP、12.5 mM MgS04、2 mMジチオスレイトール、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)、反応温度37℃、反応時間1分～50時間として、適切な量のGSHBを用いて測定することができる。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Val-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性とする。
　GSHBとしては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のgshB遺伝子によりコードされるGshBタンパク質（エシェリヒア・コリのGSHB）やサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のGSH2遺伝子によりコードされるGsh2タンパク質（サッカロマイセス・セレビシエのGSHB）が挙げられる。また、GSHBとしては、WO2013/054447に記載の変異型グルタチオン合成酵素も挙げられる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のgshB遺伝子の塩基配列は、GenBank accession NC_000913.3としてNCBIデータベースに登録されているゲノム配列中の3,089,900～3,090,850位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK-12 W3110株のgshB遺伝子の塩基配列は、MG1655株のものと同一である。MG1655株のgshB遺伝子（W3110株のgshB遺伝子）の塩基配列を配列番号３に示す。また、同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。すなわち、GSHBは、例えば、配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。また、GSHBは、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。GSHBは、Ｈｉｓタグ等のタグ配列を有していてもよい。GSHBは、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、上記GSHBのバリアントであってもよい。バリアントについては、上述した野生型GSHAのバリアントに関する記載を準用できる。
　GSHBは、GSHBをコードする遺伝子（「gshB遺伝子」ともいう；ただしGSH2遺伝子等のgshBとは異なる遺伝子名を有するものも含む）を有する宿主にgshB遺伝子を発現させることにより製造できる。gshB遺伝子を有する宿主は、gshB遺伝子を適当な宿主に導入することにより取得したものであってもよく、もともとgshB遺伝子を有するものであってもよい。なお、gshB遺伝子を有する宿主を、GSHBを有する宿主ともいう。もともとgshB遺伝子を有する宿主としては、上記gshB遺伝子を有するエシェリヒア・コリや上記GSH2遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ等の微生物が挙げられる。もともとgshB遺伝子を有する宿主は、gshB遺伝子の発現が増大するよう改変されていてもよい。gshB遺伝子の発現を増大させる手法としては、gshB遺伝子のコピー数を増加させることやgshB遺伝子の転写効率を向上させることが挙げられる。gshB遺伝子のコピー数の増加は、gshB遺伝子を宿主に導入することにより達成できる。gshB遺伝子の導入については、上述した変異型gshA遺伝子の導入に関する記載を準用できる。なお、導入されるgshB遺伝子は、同種由来であってもよく、異種由来であってもよい。gshB遺伝子の転写効率の向上は、gshB遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。より強力なプロモーターとしては上述したような強力なプロモーターを利用できる。gshB遺伝子を発現するための宿主は、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）等のγ－グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。また、GSHBは、gshB遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
　gshB遺伝子を有する宿主を利用したGSHBの製造については、上述した変異型gshA遺伝子が導入された宿主を利用した変異型GSHAの製造に関する記載を準用できる。製造されたGSHB（精製されたGSHBやGSHBを含有する画分）は、本発明の方法における「GSHB」として利用できる。なお、GSHBは、単独で製造してもよく、変異型GSHAとまとめて製造してもよい。例えば、gshB遺伝子と変異型gshA遺伝子の両方を有する宿主にそれらの遺伝子を発現させることにより、GSHBと変異型GSHAをまとめて製造することができる。
＜４＞γ－グルタミルバリルグリシン（γ-Glu-Val-Gly）の製造法
　本発明は、変異型GSHAを利用したγ-Glu-Valの製造法や変異型GSHAを利用したγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。これらの方法を総称して、「本発明の方法」ともいう。
＜４－１＞酵素法
　本発明は、変異型GSHAを利用してγ-Glu-Val-Glyを酵素的に製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）」ともいう。
　本発明においては、変異型GSHAを利用することにより、GluとValとを反応させ、γ-Glu-Valを生成することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）変異型GSHAをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Valの製造法（酵素法）」ともいう。生成したγ-Glu-Valは、適宜、反応液から回収することができる。
　さらに、生成したγ-Glu-Valを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造することができる。γ-Glu-Valを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する方法としては、グルタチオン合成酵素（GSHB）を利用する方法が知られている（特開2012-85637）。具体的には、GSHBを利用することにより、γ-Glu-ValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の一態様（「第１の態様」ともいう）は、（Ａ）変異型GSHAをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）GSHBを工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
　第１の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。反応開示時に変異型GSHA、GSHB、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることで、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始することができる。また、GSHBおよび／またはGlyが反応系に共存していない条件下で工程（Ａ）を開始し、工程（Ａ）の進行中または完了後にGSHBおよび／またはGlyを反応系に共存させることで、工程（Ｂ）を開始することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを用いて工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
　なお、本発明のγ-Glu-Valの製造法（酵素法）の工程（Ａ）は、例えば、第１の態様の工程（Ａ）を単独で実施するのと同様の態様で実施できる。
　また、本発明においては、変異型GSHAおよびGSHBを利用することにより、GluとValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の別の態様（「第２の態様」ともいう）は、（Ｃ）変異型GSHAおよびGSHBを、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。第２の態様においては、変異型GSHA、GSHB、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることにより、変異型GSHAおよびGSHBを、Glu、Val、およびGlyにまとめて作用させ、γ-Glu-Val-Glyを製造することができる。
　本発明の方法において、変異型GSHAおよびGSHBを総称して「酵素」ともいう。Glu、Val、およびGlyを総称して「アミノ酸」ともいう。γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyを総称して「ペプチド」ともいう。Glu、Val、Gly、およびγ-Glu-Valを総称して「基質」ともいう。「基質」には、特記しない限り、さらにATPを含めてよい。酵素とそれに対応する基質との反応を「酵素反応」ともいう。
　本発明の方法に用いられる各酵素の態様は上述した通りである。すなわち、各酵素としては、例えば、精製された酵素、酵素を含有する任意の画分、またはそれらの組み合わせを用いることができる。各酵素としては、１種の酵素を用いてもよく、２種またはそれ以上の酵素を組み合わせて用いてもよい。
　アミノ酸としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。アミノ酸の製造方法は特に制限されず、例えば、公知の方法を利用できる。アミノ酸は、例えば、化学合成、酵素反応、またはその組み合わせにより製造することができる。また、アミノ酸は、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養し、培養物から当該アミノ酸を回収することにより、製造することができる。アミノ酸の生産能を有する微生物としては、例えば、後述するようなアミノ酸生産菌を利用できる。また、アミノ酸は、例えば、当該アミノ酸を含有する農水畜産物から回収することにより、製造することができる。アミノ酸としては、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、当該アミノ酸を含有する素材を用いてもよい。アミノ酸を含有する素材は、酵素が当該アミノ酸に作用できる態様で当該アミノ酸を含有する限り特に制限されない。アミノ酸を含有する素材として、具体的には、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養して得られた培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、それらの濃縮物（濃縮液）や濃縮乾燥物等の処理物が挙げられる。
　本発明の方法において、アミノ酸およびペプチドは、いずれも、特記しない限り、フリー体、もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のアミノ酸、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。また、「ペプチド」という用語は、特記しない限り、フリー体のペプチド、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩は、化学的に許容されるものであれば特に制限されない。また、製造されるγ-Glu-Val-Glyを経口用途（例えば飲食品への添加用途）に用いる場合、γ-Glu-Val-Glyの塩は、化学的に許容される可食性のものであれば特に制限されない。「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
　酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、反応容器内の反応液中で、酵素と基質を混合することにより、酵素反応を実施できる。酵素反応は、静置で実施してもよく、撹拌下で実施してもよい。カラム式の場合は、固定化菌体又は固定化酵素を充填したカラムに基質を含有する反応液を通液することにより、酵素反応を実施できる。反応液としては、必要な成分を含有する、水や緩衝液等を用いることができる。反応液は、例えば、酵素、基質、ATP、２価の金属イオンを含有していてよい。酵素反応に用いられる成分の組み合わせは、実施する工程の種類およびその実施態様（複数の工程を同時に実施するか等）に応じて適宜選択することができる。
　変異型GSHAおよびGSHBは、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系（反応液）は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、粉末あるいは水溶液等の任意の形態で、反応液に添加することができる。また、ATPは、例えば、ATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPを生成または再生する方法としては、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法（Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997)）、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法（Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005)）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（C. Aug'e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29：789-790 (1988)）、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988)）等が知られている。
　また、例えば、変異型GSHAは、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系（反応液）は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。好ましい２価の金属イオンとしては、Ｍｇ2+やＭｎ2+が挙げられる。２価の金属イオンの濃度は、例えば、１～２００ｍＭであってよい。
　反応条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り特に制限されない。
　反応液のpHは、例えば、通常6.0～10.0、好ましくは6.5～9.0であってよい。
　反応温度は、例えば、通常15～50℃、好ましくは15～45℃、より好ましくは20～40℃であってよい。
　反応時間は、第１の態様の工程（Ａ）および工程（Ｂ）のそれぞれについて、例えば、5分～200時間であってよい。反応時間は、第２の態様の工程（Ｃ）について、例えば、5分～200時間であってよい。反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。
　反応液中の各基質の濃度は、例えば、通常0.1～2000ｍM、好ましくは1～2000ｍM、より好ましくは10～1000ｍMであってよい。
　反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ａ）については、例えば、通常、Glu：Val：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1～10に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：ATP＝0.1～10：0.1～10：0.1～10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ｂ）については、例えば、通常、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1～10に変化させてもよい。すなわち、例えば、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝0.1～10：0.1～10：0.1～10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第２の態様の工程（Ｃ）については、例えば、通常、Glu：Val：Gly：ATP＝1：1：1：2であってよく、任意の基質の比率を0.1～10に変化させてもよく、ATPの比率を0.2～20に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：Gly：ATP＝0.1～10：0.1～10：0.1～10：0.2～20であってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様における各基質のモル比については、適宜、第２の態様における各基質のモル比を参考にしてもよい。
　酵素の使用量は、例えば、酵素活性に基づいて設定することができる。変異型GSHAの使用量は、GluおよびValの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val生成活性に換算して、通常0.01～1000 U、好ましくは0.1～500 U、より好ましくは0.1～100 Uであってよい。GSHBの使用量は、第１の態様の工程（Ｂ）については、γ-Glu-ValおよびGlyの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly生成活性に換算して、通常0.01～1000 U、好ましくは0.1～500 U、より好ましくは0.1～100 Uであってよい。GSHBの使用量は、第２の態様の工程（Ｃ）については、Gluの半量、Valの半量、およびGlyの全量の合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly生成活性に換算して、通常0.01～1000 U、好ましくは0.1～500 U、より好ましくは0.1～100 Uであってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様におけるGSHBの使用量については、適宜、第２の態様におけるGSHBの使用量を参考にしてもよい。
　いずれの態様においても、酵素反応の過程において、基質、酵素、および／またはその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応条件は、酵素反応の開始から終了まで均一であってもよく、酵素反応の過程において変化してもよい。「反応条件が酵素反応の過程において変化する」とは、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することを含む。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で酵素反応を実施する場合に、反応温度や酵素濃度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることをいう。
　このようにして酵素反応を実施することにより、γ-Glu-Val-Glyを含有する反応液が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、反応液から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶液からの結晶化、再結晶が挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。回収されるγ-Glu-Val-Glyは、γ-Glu-Val-Gly以外の成分、例えばγ-Glu-Val-Glyの製造に用いられた成分や水分等、を含んでいてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、所望の程度に精製されていてよい。γ-Glu-Val-Glyは、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上の純度に精製されてよい。また、γ-Glu-Valの回収も、γ-Glu-Val-Glyの回収と同様に行うことができる。
＜４－２＞発酵法
　本発明は、変異型GSHAを利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）」ともいう。
　本発明においては、変異型GSHAを有する微生物を利用することにより、GluとValからγ-Glu-Valを発酵生産することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）変異型GSHAを有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）」ともいう。生成したγ-Glu-Valは、適宜、培養物から回収することができる。
　さらに、GSHBを有する微生物を利用することにより、γ-Glu-ValとGlyからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の一態様（「第３の態様」ともいう）は、（Ａ）変異型GSHAを有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）GSHBを有する微生物を培地で培養することにより工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
　第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。また、第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、変異型GSHAを有する微生物と、それとは別個の、GSHBを有する微生物を用いて実施してもよく、変異型GSHAおよびGSHBの両方を有する単一の微生物を用いて実施してもよい。例えば、変異型GSHAおよびGSHBの両方を有する微生物を利用し、Glu、Val、およびGlyが利用可能な状態で培養を実施すれば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを培地に添加して工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
　なお、本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）の工程（Ａ）は、例えば、第３の態様の工程（Ａ）を単独で実施するのと同様の態様で実施できる。
　また、本発明においては、変異型GSHAおよびGSHBの両方を有する微生物を利用することにより、GluとValとGlyとからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の別の態様（「第４の態様」ともいう）は、（Ｃ）変異型GSHAおよびGSHBを有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
　発酵法において、酵素、アミノ酸、ペプチド、基質、酵素反応等の用語は、酵素法と同様の意味で使用する。また、変異型GSHAを有する微生物、GSHBを有する微生物、および変異型GSHAおよびGSHBを有する微生物を総称して「微生物」ともいう。
　基質となる各アミノ酸の供給方法は、酵素反応に当該アミノ酸を利用できる限り特に制限されない。各アミノ酸は、例えば、各工程で用いられる微生物により生合成されてもよく、培地に添加されてもよく、その組み合わせであってもよい。すなわち、例えば、Glu、Val、およびGlyの全てが微生物により生合成されてもよく、Glu、Val、およびGlyの全てが培地に添加されてもよい。また、例えば、Glu、Val、およびGlyの内、１種または２種のアミノ酸が微生物により生合成され、他のアミノ酸が培地に添加されてもよい。Glu、Val、およびGlyのいずれも、微生物により生合成され、且つ、培地に添加されてもよい。
　すなわち、本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）の一態様は、例えば、（Ａ１）変異型GSHAを有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよく、（Ａ２）変異型GSHAを有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよい。
　また、第３の態様の一態様は、例えば、（Ａ１）と（Ａ２）のいずれか、および、（Ｂ１）と（Ｂ２）のいずれかを含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい：
（Ａ１）変異型GSHAを有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ａ２）変異型GSHAを有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ｂ１）GSHBを有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程；
（Ｂ２）GSHBを有し、且つ、Glyの生産能を有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-Valを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
　また、第４の態様の一態様は、例えば、（Ｃ１）変異型GSHAおよびGSHBを有する微生物をGlu、Val、およびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよく、（Ｃ２）変異型GSHAおよびGSHBを有し、且つ、Glu、Val、およびGlyの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。
　変異型GSHAを有する微生物としては、上述したような変異型gshA遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。GSHBを有する微生物としては、上述したようなgshB遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。変異型GSHAおよびGSHBを有する微生物としては、上述したような変異型gshA遺伝子とgshB遺伝子の両方を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。
　アミノ酸の生産能を有する微生物は、本来的にアミノ酸の生産能を有するものであってもよく、アミノ酸の生産能を有するように改変されたものであってもよい。アミノ酸の生産能を有する微生物は、微生物にアミノ酸生産能を付与することにより、または、微生物のアミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。変異型gshA遺伝子および／またはgshB遺伝子の導入等の酵素生産能の付与または増強と、アミノ酸生産能の付与または増強とは、いずれを先に実施してもよい。すなわち、変異型GSHAおよび／またはGSHBを有し、且つ、アミノ酸の生産能を有する微生物は、変異型GSHAおよび／またはGSHBを有する微生物を、アミノ酸生産能を有するように改変することにより取得してもよく、アミノ酸生産能を有する微生物を、変異型GSHAおよび／またはGSHBを有するように改変することにより取得してもよい。Ｌ－アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７～１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ－アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ－アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。また、Ｌ－アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ－アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ－アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。
　Ｌ－グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869株より取得されたodhA欠損株に、V197M変異を有するmviN遺伝子を導入した組換え株（特開2010-161970）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来gltA（クエン酸シンターゼ）遺伝子を導入したパントエア・アグロメランスAJ13355株（特許第4285582号）、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有するエシェリヒア属細菌（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）などが例示できる。Ｌ－バリン生産菌としては、エシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5658766号）、生育のためにリポ酸を要求する変異および／またはH+-ATPaseを欠損する変異を有するエシェリヒア属細菌、および、これらの性質に加えて、少なくともilvG、ilvM、ilvE、およびilvDの各遺伝子を発現し、且つ、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌（WO96/06926）などが例示できる。すなわち、例えば、これらの改変を微生物に導入することにより、アミノ酸生産能を付与または増強できる。
　また、微生物は、培地中に添加されたアミノ酸を取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、その利用態様に応じて、生成したγ-Glu-Valを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよく、培地中に添加されたγ-Glu-Valを取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、生成したγ-Glu-Val-Glyを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよい。
　培養条件は、微生物が増殖でき、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り、特に制限されない。培養条件については、上述した変異型GSHAの製造法における培養条件の記載を参照できる。
　変異型GSHAおよびGSHBは、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、各工程で用いられる微生物により生成されてもよく、上述したようなATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPの供給には、例えば、通常のエネルギー代謝によるATP再生系が強化された微生物やポリリン酸キナーゼの作用でATPを再生する能力を有する微生物を培養液中に共存させる方法等の共培養系（特公平7-16431、特公平6-69386）が好適に利用できる。
　また、例えば、変異型GSHAは、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。
　アミノ酸を含有する培地を用いる場合、アミノ酸は、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。添加のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜変更できるが、一例としては、培養終了時の好ましくは０～５０時間前、より好ましくは０．１～２４時間前、特に好ましくは０．５～６時間前であってよい。アミノ酸は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。培地中の各アミノ酸の濃度は、例えば、通常0.1～2000ｍM、好ましくは1～2000ｍM、より好ましくは10～1000ｍMであってよい。また、培地中の各基質のモル比については、酵素法における反応液中の各基質のモル比に関する記載を準用してもよい。
　このようにして培養を行うことにより、γ-Glu-Val-Glyを含む培養物が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、上述したように、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、培養物から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、上述したように、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。なお、菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってγ-Glu-Val-Glyを回収することができる。
　また、微生物が酵母であり、γ-Glu-Val-Glyが菌体内に蓄積する場合、同酵母は、例えば、γ-Glu-Val-Glyを含有する酵母エキスの製造に利用できる。すなわち、本発明は、同酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供する。酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
〔実施例１〕野生型gshA遺伝子発現プラスミドの構築
　本実施例では、エシェリヒア・コリのgshA遺伝子及びエシェリヒア・コリのgshB遺伝子を搭載するプラスミドpSH1391（Suzuki, H., et al J. Bacteriol. 187: 5861-5867 (2005)）を出発材料に、開始コドンがATGに置換されたエシェリヒア・コリの野生型gshA遺伝子の発現プラスミドpTO1を構築した。
（１）pSH1391の構築
　pSH1391のプラスミド構築法は以下の通りである。エシェリヒア・コリのgshA遺伝子を取得する目的で、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCC 47076）のゲノムDNAを鋳型として、ストラタジーン社製のPfuポリメラーゼを使用して、配列番号7、8のプライマー（表１）を用いてPCRを実施した。PCR産物をPvuI/PstIで消化して得られたgshA遺伝子を含む約2.4kbの断片と、pBR322をPvuI/PstI消化して得られた約4.2kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、20μg/mLのテトラサイクリン塩酸塩（Tc）を含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpFK68と名付けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　同様に、エシェリヒア・コリのgshB遺伝子を取得する目的で、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCC 47076）のゲノムDNAを鋳型として、ストラタジーン社製のPfuポリメラーゼを使用して、配列番号9、10のプライマー（表２）を用いてPCRを実施した。PCR産物をHindIII/BamHIで消化して得られたgshB遺伝子を含む約1.5kbの断片と、pUC18をHindIII/BamHI消化して得られた約2.7kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、100μg/mLのアンピシリンナトリウム（Amp）を含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpFK63と名付けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、pFK68をAatII/ScaI消化して得られたgshA遺伝子を含む約5.9kbの断片と、pFK63をAatII/SmaI消化して得られたgshB遺伝子を含む約1.9kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、20μg/mLのTcを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpSH1388と名付けた。
　次いで、pSH1388をBanIIIで消化して得られた約7.8kbのgshA遺伝子、gshB遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含む断片を脱リン酸化し、pUC4K（ファルマシア社製）をAccI処理して得られたカナマイシン耐性遺伝子を含む1.2kb断片とライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、30μg/mLのカナマイシン硫酸塩（kan）を含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、カナマイシン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子が同一のオリエンテーションで含まれる構造を持つプラスミドをpSH1391と名付けた。
（２）pTO1の構築
　pET3-a（ノバジェン社製）をSphI消化し、末端をブラント処理後、PvuII消化し、得られた約3.1kbのDNA断片をセルフライゲーションしてプラスミドpSH1558を作製した。pSH1558をAatII/BglII消化して得られた約2.4kbのアンピシリン耐性遺伝子を含む断片とpSH1391をAatII/BglII消化して得られたエシェリヒア・コリの野生型gshA遺伝子の部分断片を含む約3.6kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、100μg/mLのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpSH1559と名付けた。
　次に、gshA遺伝子にW100L変異を導入することを目的として、東洋紡社のKOD-plusポリメラーゼを使用し、pSH1559を鋳型として、配列番号11、12のプライマー（表３）を用いて、製造元のプロトコールに従ってPCRを実施した。得られたPCR産物をDpnIで消化した後、該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、100μg/mLのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ABI PRISM 310NTジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSH1560と名付けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次いで、gshA遺伝子の開始コドンをATGに置換すること（L1M変異）を目的として、東洋紡社のKOD-plusポリメラーゼを使用し、pSH1559を鋳型として、配列番号13、14のプライマー（表４）を用いて、製造元のプロトコールに従ってPCRを実施した。得られたPCR産物をDpnIで消化した後、該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、100μg/mLのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSH1561と名付けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　開始コドンがATGに置換され、且つ、W100L変異を有さないgshA遺伝子の部分断片を取得する目的で、pSH1561をEcoRV/BglII消化して得られた約4.9kbのアンピシリン耐性遺伝子を含む断片とpSH1559をEcoRV/BglII消化して得られた約1.1kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、100μg/mLのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSH1694と名付けた。
　開始コドンがATGに置換され、且つ、W100L変異を有さない完全長のgshA遺伝子を取得する目的で、pSH1391をAatII/BglII消化して得られた約5.5kbのカナマイシン耐性遺伝子を含む断片とpSH1694をAatII/BglII消化して得られた約3.6kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、30μg/mLのKanを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSH1695と名付けた。
　次に、pSH1695上に含まれる不要なgshB遺伝子を排除する目的で、pSH1695をAatII/KpnIで消化した後、アガロースゲル電気泳動にて目的のgshA遺伝子を含むDNAを切り出し、末端をブラント化し、セルフライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、30μg/mLのKanを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpTO1と名付けた。
〔実施例２〕変異型gshA遺伝子発現プラスミドの構築
　本実施例では、pTO1を基に、各種変異型gshA遺伝子の発現プラスミドを構築した。
　変異型gshA遺伝子を構築するため、東洋紡社のKOD-plusポリメラーゼを使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型gshA遺伝子に対応するプライマー（配列番号15～26）を用いて、実施例１で構築したpTO1を鋳型として、PCRを実施した。各変異とプライマーの関係を表５に示す。表中、下線部が、変異の導入されるアミノ酸残基に対応する。得られたPCR産物をDpnIで消化した後、該反応液によりエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、30μg/mLのKanを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドを変異型gshA遺伝子の発現プラスミドとして取得した。各変異とプラスミドの関係を表５に示す。なお、エシェリヒア・コリがもともと有するgshA遺伝子の開始コドンはTTGであるが、pTO1ではATGに置換されているため、各変異型gshA遺伝子の発現プラスミドにおける変異型gshA遺伝子の開始コドンもATGである。
　無細胞抽出液を用いた酵素活性を測定することによって変異導入の効果を評価するために、各変異型gshA遺伝子の発現プラスミドによりエシェリヒア・コリSI97株を形質転換し、表５に示す菌株を得た。同様に、野生型gshA遺伝子の発現プラスミドpTO1でエシェリヒア・コリSI97株を形質転換し、TO22株を得た。エシェリヒア・コリSI97株は、エシェリヒア・コリMG1655株のggt遺伝子及びgshA遺伝子の欠損株である（Suzuki, H., et al J. Bacteriol. 187: 5861-5867 (2005)）。エシェリヒア・コリSI97株を宿主として使用することによって、酵素活性の測定の際に、エシェリヒア・コリがもともと有するgshA遺伝子の遺伝子産物の影響が排除される。また、エシェリヒア・コリSI97株を宿主として使用することによって、酵素活性の測定の際に、酵素反応生成物であるγ－グルタミル結合を有するペプチドが無細胞抽出液中に含まれるggt遺伝子産物によって酵素的に分解される影響が排除される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔実施例３〕変異型GSHAのγ－グルタミルジペプチド生成活性の評価
　実施例２で取得した各菌株を30μg/mLのKanを含む10 mLのLB培地に接種し、37℃、120往復/分で一晩振とう培養することで前培養液を調製した。得られた前培養液の濁度（600nm）を測定し、初期濁度が0.1となるように、500 mL容三角フラスコに張り込んだ30μg/mLのKanを含むLB培地100 mLに前培養液を接種した。37℃、100往復/分で終夜振とう培養した後に、遠心分離（4℃、8,000 rpm、5分）によって集菌した。沈殿として得られた菌体を5mLのTris-HCl buffer (pH 8.0) に懸濁し、再度遠心分離（4℃、8,000 rpm、5分）することによって菌体を洗浄した。沈殿として得られた菌体を3mLのTris-HCl buffer (pH 8.0)に再度懸濁し、氷水で冷やしながら超音波破砕（190 W、5分間）を行った。破砕処理液を遠心分離（4℃、8,000 rpm、10分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　無細胞抽出液を用いて酵素活性の測定を行った。酵素活性としては、γ-Glu-Val生成活性とγ-Glu-Gly生成活性を測定した。
　γ-Glu-Val生成活性の測定条件は以下の通りである。反応液組成は25mM グルタミン酸、25mM バリン、5mM ATP、25mM MgS04、20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)とした。反応液量は1mLとし、無細胞抽出液を添加することによって酵素反応を開始した。反応温度は37℃とし、反応時間は0～120分間とした。反応を停止する際には、反応液0.5mLに対して、0.05mLの100w/v% トリクロロ酢酸を添加した。反応終了後に、HPLCにて生成したγ-Glu-Valを定量した。
　γ-Glu-Gly生成活性を測定する場合には、上記反応液中のバリンをグリシンに置き換え、生成したγ-Glu-Glyを定量した。
　HPLCの条件は以下の通りである。カラムには、島津製作所社製Shim-pack Amino-Na（粒子径5ミクロン、内径6mm、長さ100mm）を用いた。溶離液としては、buffer A (66.6mM クエン酸, 1% 過塩素酸, 7% エタノール, pH2.8)及びbuffer B (200mM クエン酸, 200mM ホウ酸, 0.12N NaOH, pH 10)を使用した。カラム温度は60°C、流速は0.6 mL/minとした。溶離液のグラジエントは、0～9分はbuffer B：0%、9～13分はbuffer B：0～7%、13～17.2分はbuffer B：7～8%、17.2～20.8分はbuffer B：11%、20.8～22分はbuffer B：50～58%、22～28.8分はbuffer B：100%とした。検出は、o-フタルアルデヒドを検出試薬として使用して、蛍光波長450nm、励起波長350nmで行った。
　以上の方法により、γ-Glu-Val生成量及びγ-Glu-Gly生成量を定量し、比活性を算出した。結果を表６に示す。表中、「反応(A)」はγ-Glu-Gly生成活性の比活性、「反応(B)」はγ-Glu-Val生成活性の比活性、「(B)/(A)」は、γ-Glu-Gly生成活性の比活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比活性の比率をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
〔実施例４〕野生型gshA遺伝子発現プラスミドの構築
　エシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）のグルタミン酸－システインリガーゼをコードするgshA遺伝子の発現プラスミドpSF12-EcGshAを以下の手順で構築した。gshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGSHAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。なお、同遺伝子の開始コドンはTTGであったため、pSF12-EcGshAの構築に際し、開始コドンをATGに置換した。また、pSF12-EcGshAによれば、GSHAはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
　初めに、エシェリヒア・コリW3110株（ATCC 27325）由来のγ-グルタミルトランスペプチダーゼをコードするggt遺伝子とrpoHプロモーターを含むpUC18由来プラスミドpSF12-ggt（WO2013/051685A1）をNdeI/PstI消化し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）にて精製し、約3.1kbの断片を得た。
　次に、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型として、Phusionポリメラーゼ（New England Biolabs社製）を使用して、製造元のプロトコールに従って98℃で10秒、55℃で15秒、72℃で25秒の条件で30サイクルのPCRを行い、約1.6kbの断片を得た。プライマーとしては、配列番号２７および配列番号２８のプライマーの組み合わせ（表７）を使用した。
　次に、pSF12-ggtをNdeI/PstI消化して得られた約3.0kbの断片とPCRで得られた約1.6kbの断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて、製造元のプロトコールに従って融合させた。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100μg/mLのアンピシリンナトリウム（Amp）を含むLB寒天培地（1.0%（w/v）ペプトン、0.5%（w/v）酵母エキス、1.0%（w/v）NaCl、1.5%（w/v）寒天）に塗布後、30℃で20時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3130ジェネティックアナライザー（Life Technologies社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSF12-EcGshAと命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
〔実施例５〕変異型gshA遺伝子発現プラスミドの構築
　変異型gshA遺伝子を構築するため、Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型gshA遺伝子に対応するプライマー（配列番号２９～７６）を用いて、実施例４に記載したpSF12-EcGshAを鋳型として、PCRを実施した。各変異とプライマーの関係を表８に示す。表中、大文字表記の配列が変異の導入されるアミノ酸残基に対応する。
　得られたPCR産物をDpnIで消化した後、該反応液によりエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100μg/mLのアンピシリンナトリウム（Amp）を含むLB寒天培地に塗布後、30℃で20時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3130ジェネティックアナライザー（Life Technologies社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドを変異型gshA遺伝子の発現プラスミドとして取得した。各変異が導入されたプラスミドは、pSF12-EcGshAに各々の変異の態様を付加して命名した。例えば、Q144F変異を有する変異型GSHAをコードする変異型gshA遺伝子を持つプラスミドは、pSF12-EcGshA-Q144Fと命名した。次いで、このようにして得られた変異型gshA遺伝子の発現プラスミドを鋳型として、同様の手順でさらに変異を導入することにより、二重変異を有する変異型gshA遺伝子の発現プラスミドを取得し、同様に命名した。例えば、pSF12-EcGshA-L135Mを鋳型として、さらにQ144R変異を導入することにより、L135MとQ144Rの二重変異（L135M/Q144R）を有する変異型GSHAをコードする変異型gshA遺伝子を持つプラスミドを取得し、pSF12-EcGshA-L135M/Q144Rと命名した。なお、エシェリヒア・コリがもともと有するgshA遺伝子の開始コドンはTTGであるが、pSF12-EcGshAではATGに置換されているため、変異型gshA遺伝子の発現プラスミドにおける変異型gshA遺伝子の開始コドンもATGである。また、pSF12-EcGshAによれば、GSHAはC末端にHisタグが付加された形態で発現するため、変異型gshA遺伝子の発現プラスミドによってもGSHAはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
〔実施例６〕C末端にHisタグ付加されたエシェリヒア・コリMG1655株由来野生型および変異型GSHAの精製
　実施例４及び実施例５で取得した各菌株（各gshA遺伝子発現プラスミドを有するJM109株）を100μg/mLのAmpを含むLB培地（1.0%（w/v）ペプトン、0.5%（w/v）酵母エキス、1.0%（w/v）NaCl）3mLに接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養することで前培養液を調製した。得られた前培養液150μlを、100μg/mLのAmpを含むTB培地（1.2%（w/v）トリプトン、2.4%（w/v）酵母エキス、0.4%（w/v）グリセロール、0.23%（w/v）KH2PO4、1.25%（w/v）K2HPO4）15mLを張り込んだ70mL容の試験管（φ25mm）に接種した。30℃、120往復/分で20時間振とう培養した後に、遠心分離（4℃、12,000×g、5分）によって集菌した。沈殿として得られた菌体を0.2 mLの緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）に懸濁し、冷却しながら超音波破砕処理に供して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（4℃、29,100×ｇ、10分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）で平衡化したNi Sepharose 6 Fast Flowビーズ（GEヘルスケア社製）にアプライし、溶離緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 250 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）により酵素を溶出し、活性画分を得た。この活性画分を精製GSHAとして、以降の実験に用いた。
〔実施例７〕C末端にHisタグ付加されたエシェリヒア・コリW3110株由来GSHBの精製
　エシェリヒア・コリW3110株（ATCC 27325）のグルタチオン合成酵素をコードするgshB遺伝子（配列番号３）の発現プラスミドpET-EcgshBを特開2012-85637に記載の方法で構築した。続いて、pET-EcgshBを用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3) (Life Technologies社製)を形質転換し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-EcgshBを得た。gshB遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGSHBのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４に示す。なお、pET-EcgshBによれば、GSHBはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
　本菌株を特開2012-85637と同様の方法で培養した。菌体を遠心分離（12,000×g、10分）により集菌した後、生理食塩水（0.85%（w/v）NaCl）で洗菌した後、緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）を用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100×ｇ、15分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）で平衡化したHisTALON 5mLカラム（クロンテック社製）にアプライし、溶離緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 200 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）により酵素を溶出し、活性画分を得た。得られた活性画分を、PD-10カラム（GE ヘルスケア社製）を用いマニュアルに従ってバッファー交換（20 mM Tris-HCl（pH8.0）, 300 mM NaCl, 15%グリセロール）した。バッファー交換後の酵素溶液を精製GSHBとして以降の実験に用いた。
〔実施例８〕各精製GSHAによるγ－グルタミルジペプチドの生成
　実施例６で取得した各精製GSHAについて、γ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性を測定した。
　γ-Glu-Val生成活性の測定条件は以下の通りである。反応液組成は10mM グルタミン酸、10mM バリン、10mM ATP、10mM MgS04、100mM Tris-HCl (pH9.0)とした。反応液量は0.2mLとし、精製酵素を添加することによって酵素反応を開始した。この時、精製GSHAは0.1g/Lとなるように反応液に添加した。反応温度は30℃とし、反応時間は30分間とした。反応を停止する際には、反応液0.2mLに対して、0.2mLの200mM 硫酸を添加した。反応終了後に、HPLCにて生成したγ-Glu-Valを定量した。
　γ-Glu-Valの定量条件は以下の通りである。カラムには、Phenomenex社製Synergi 4μ Hydro-RP 80A（粒子径4ミクロン、内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。溶離液には、溶離液A（50mMリン酸二水素ナトリウム（pH2.5、リン酸によってpH調整））、及び、溶離液B（溶離液Aとアセトニトリルの1:1（v/v）の混合液）を93:7（v/v）の比率で混合した混合液を用いた。流速は1.0mL/min、カラム温度は40℃、UV検出波長は210nmとした。
　γ-Glu-Gly生成活性を測定する場合には、上記反応液中のバリンをグリシンに置き換え、精製GSHAを0.025g/Lとなるように反応液に添加し、酵素反応を実施した。上記の手順で反応を停止した後、生成したγ-Glu-Glyを定量した。
　γ-Glu-Glyの定量条件は以下の通りである。カラムには、ジーエルサイエンス社製Inertsil ODS-3（粒子径5ミクロン、内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。溶離液には、溶離液C（100mMリン酸二水素カリウム、5mMオクタンスルホン酸ナトリウム（pH2.2、リン酸によってpH調整））を用いた。流速は1.5mL/min、カラム温度は40℃、UV検出波長は210nmとした。
　以上の方法により、γ-Glu-Val生成量及びγ-Glu-Gly生成量を定量し、比活性を算出した。結果を表９に示す。表中、「反応(A)」はγ-Glu-Gly生成活性の比活性、「反応(B)」はγ-Glu-Val生成活性の比活性、「(B)/(A)」は、γ-Glu-Gly生成活性の比活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比活性の比率をそれぞれ示す。また、表中、「GSHA-WT」は、野生型GSHAを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
〔実施例９〕各精製GSHAおよび精製GSHBを用いたアミノ酸からのγ-Glu-Val-Glyの生成
　実施例６で取得した各精製GSHAおよび実施例７で取得した精製GSHBを用い、アミノ酸からのγ-Glu-Val-Gly（CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ぶ）の生成を検討した。γ-Glu-Val-Glyの構造式を下記式（Ｉ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　反応液組成は10mM グルタミン酸、10mM バリン、10mM グリシン、20mM ATP、10mM MgS04、100mM Tris-HCl (pH9.0)とした。反応液量は0.2mLとし、精製GSHAは0.1g/L、精製GSHBは0.05g/Lとなるように反応液に添加した。精製GSHAを添加することによって酵素反応を開始した。反応温度は30℃とし、反応時間は24時間とした。反応を停止する際には、反応液0.2mLに対して、0.2mLの200mM 硫酸を添加した。反応停止後、実施例８におけるγ-Glu-Valの定量と同様の方法でγ-Glu-Val-Glyを定量し、生成量を算出した。その結果と、実施例８の表９で示したγ-Glu-Gly合成活性に対するγ-Glu-Val合成活性の比率（B）/（A）を表１０に示す。また、表中、「GSHA-WT」は、野生型GSHAを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
〔実施例１０〕無細胞タンパク質合成系を用いたC末端にHisタグ付加されたエシェリヒア・コリMG1655株由来の精製GSHAの取得
　独立行政法人理化学研究所の無細胞タンパク質合成サービス（https://www.ynmr.riken.jp/fees/external_fee_2013.html）に委託して、エシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）由来の野生型GSHAと変異型GSHAの精製酵素を取得し、以降の実験に用いた。なお、タンパク質合成後、Niに対するaffinity精製により得られた溶出画分を精製酵素とした。溶出には緩衝液（50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0), 10% グリセロール, 300mM イミダゾール, 300mM NaCl, 1mM DTT）が用いられた。また、これらの遺伝子の開始コドンはTTGであったため、タンパク質合成に際し、開始コドンをATGに置換した。また、野生型GSHAおよび変異型GSHAはC末端に6個のHis残基が付加された形態で発現する。また、タンパク質合成に際し、無細胞タンパク質合成サービスの発現量向上オプションを利用した。
〔実施例１１〕無細胞タンパク質合成系により合成された各精製GSHAによるγ－グルタミルジペプチドの生成
　実施例１０で取得した各精製GSHAについて、γ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性を測定した。
　γ-Glu-Val生成活性の測定条件は以下の通りである。反応液組成は10mM グルタミン酸、10mM バリン、10mM ATP、10mM MgS04、100mM Tris-HCl (pH9.0)とした。反応液量は0.2mlとし、精製酵素を添加することによって酵素反応を開始した。この時、精製GSHAは0.025g/lとなるように反応液に添加した。反応温度は30℃とし、反応時間は60分間とした。反応を停止する際には、反応液0.2mlに対して、0.2mlの200mM 硫酸を添加した。反応終了後に、生成したγ-Glu-Valを実施例８に記載の方法で定量した。
　γ-Glu-Gly生成活性を測定する場合には、上記反応液中のバリンをグリシンに置き換え、酵素反応を実施した。上記の方法で反応を停止した後、生成したγ-Glu-Glyを実施例８に記載の方法で定量した。
　以上の方法により、実施例１０で取得した野生型GSHAのγ-Glu-Val生成量及びγ-Glu-Gly生成量を定量し、比活性を算出した。結果を表１１に「野生型GSHA（１）」として示す。併せて、実施例８の表９に記載の野生型GSHAの比活性の結果を表１１に「野生型GSHA（２）」として示す。表中、「反応(A)」はγ-Glu-Gly生成活性の比活性、「反応(B)」はγ-Glu-Val生成活性の比活性、「(B)/(A)」は、γ-Glu-Gly生成活性の比活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比活性の比率をそれぞれ示す。その結果、両者は同等のγ-Glu-Gly生成活性の比活性とγ-Glu-Gly生成活性の比活性を有することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　続いて、以上の方法により、実施例１０で取得した野生型GHSAおよび変異型GSHAのγ-Glu-Val生成量及びγ-Glu-Gly生成量を定量し、比活性を算出した。結果を表１２に示す。表中、「反応(A)」はγ-Glu-Gly生成活性の比活性、「反応(B)」はγ-Glu-Val生成活性の比活性、「(B)/(A)」は、γ-Glu-Gly生成活性の比活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比活性の比率をそれぞれ示す。また、表中、「GSHA-WT」は、野生型GSHAを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本発明の変異型GSHAは、Valを選択的に基質とし、γ-Glu-Val生成反応を触媒する。したがって、本発明によれば、本発明の変異型GSHAを利用して、Glu及びValを原料としてγ-Glu-Valを効率よく製造することができ、さらにγ-Glu-Val及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造することができる。また、本発明によれば、本発明の変異型GSHAを利用して、Glu、Val、及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを効率よく製造することができる。
＜配列表の説明＞
配列番号１：Escherichia coli MG1655株の野生型gshA遺伝子の塩基配列
配列番号２：Escherichia coli MG1655株の野生型GSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Escherichia coli W3110株のgshB遺伝子の塩基配列
配列番号４：Escherichia coli W3110株のGSHBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Escherichia coli MG1655株のggt遺伝子の塩基配列
配列番号６：Escherichia coli MG1655株のGGTタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７～１０６：プライマー

Claims (24)

  1. 　野生型グルタミン酸－システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する、変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
    L135、Q144、Y241、N243、Y300。
  2. 　前記変異が、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異を含む、請求項１に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
    L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
    Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
    Y241（A）、
    N243（I, W, K, R, H）、
    Y300（A, H, R, K）。
  3. 　前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項１又は２に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
    L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
  4. 　前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
    L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
    Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
    N243（R, H）、
    Y300（R, K）、
    L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
  5. 　前記野生型グルタミン酸－システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼ：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
  6. 　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が０．７以上である、請求項１～５のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼ。
  7. 　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が０．７以上である、変異型グルタミン酸－システインリガーゼ。
  8. 　下記工程（Ａ）を含む、γ-Glu-Valおよび／またはその塩の製造法：
    （Ａ）請求項１～７のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程。
  9. 　下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
    （Ａ）請求項１～７のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程；および
    （Ｂ）グルタチオン合成酵素を工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
  10. 　下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
    （Ｃ）請求項１～７のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
  11. 　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼが、精製酵素である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼが、固定化酵素である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼが、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記変異型グルタミン酸－システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項９または１０に記載の方法。
  16. 　前記微生物が、γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記工程がATPの存在下で実施される、請求項８～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の変異型グルタミン酸－システインリガーゼをコードする遺伝子。
  20. 　請求項１９に記載の遺伝子を搭載するベクター。
  21. 　請求項１９に記載の遺伝子または請求項２０に記載のベクターを有する微生物。
  22. 　γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、請求項２１に記載の微生物。
  23. 　グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２１または２２に記載の微生物。
  24. 　エシェリヒア・コリである、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の微生物。
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