WO2014126175A1

WO2014126175A1 - 糖尿病の予防又は治療用組成物

Info

Publication number: WO2014126175A1
Application number: PCT/JP2014/053382
Authority: WO
Inventors: 新恒川; 上田　実; 朗仁山本; 貴子泉本
Original assignee: 国立大学法人名古屋大学
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2014-08-21
Also published as: JPWO2014126175A1

Abstract

【課題】糖尿病の予防又は治療用組成物を提供する。【解決手段】歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を、糖尿病の予防又は治療用組成物として用いる。

Description

糖尿病の予防又は治療用組成物

　本明細書は、糖尿病の予防又は治療用組成物に関する。
　本出願は、２０１３年２月１３日に出願された日本国特許出願特願２０１３－２５１２０に対する優先権を主張するものであり、この内容は、引用により、本明細書に組み込まれる。

　糖尿病は、多くの国において増え続けている重大な疾患である。糖尿病は、各種の重篤な合併症も発症するため、有効な予防・治療方法が期待されている。糖尿病には１型糖尿病と２型糖尿病とがあり、１型糖尿病は、自己免疫による膵β細胞の死滅を伴い、２型糖尿病は、一定の膵β細胞の死滅と共にインスリン分泌低下と感受性の低下を伴う。糖尿病は、遺伝的素因や環境的素因がその発症の原因とは考えられているが、必ずしも明らかではない。

　これら糖尿病の治療は、基本的には、１型にはインスリンの投与であり、２型には血糖降下剤の投与、その後にはインスリンの投与である。

　近年、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病モデルマウスに骨髄幹細胞移植することで、耐糖能障害が改善されたという報告がある（非特許文献１）。また、膵島移植はカナダ、エドモントンにあるアルバータ大学によって確立され、複数の脳死ドナー（組織提供者）から分離した膵島組織を比較的短期間に、ひとりの１型糖尿病患者に移植するという膵島移植を７人の１型糖尿病患者に対して行い、一時的ではあるがその７人全員がインスリン離脱（正常血糖値を維持するのにインスリン注射が不要である状態)となったとの報告がある（非特許文献２）。

　損傷部の治療を目的として、歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清を含む組成物が有効であることが記載されている（特許文献１）。

国際公開第ＷＯ２０１１／１１８７９５号

Urban VS et al; Stem Cell. 2008 Jan;26(1):244-53 Shapiro AM et al; N Engl J M. 2000 Jul 27;343(4):230-8

　しかしながら、長期のインスリン離脱を目標とした場合、現在の技術では、複数回の移植が必要であること、膵島はたらきは徐々に悪化するため、５年インスリン離脱成績は悪い。また、幹細胞移植や膵島移植の場合、たとえ自己由来であっても、癌化する可能性は否定できない。また、免疫拒絶反応も異種の場合は避けて通ることはできないため、免疫抑制剤の使用は回避できない。

　歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清を含む組成物は組織損傷に有効であり、歯周病や脊髄損傷等に有効であるが、糖尿病に有効であることは一般に想定できない。

　本明細書は、糖尿病の予防又は治療用組成物を提供する。

　本発明者らは、糖尿病の治療について検討していたところ、意外にも歯髄幹細胞の培養上清が有効であるという知見を得た。本明細書は、本知見に基づき以下の手段を提供する。

（１）歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含む、糖尿病の予防又は治療用組成物。
（２）血清を含まない、（１）に記載の組成物。
（３）前記歯髄幹細胞を含まない、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）（１）～（３）のいずれかに記載の予防又は治療用組成物の製造方法であって、
　歯髄細胞から接着性細胞を選抜し、
　前記接着性細胞を培養し、
　培養上清を回収する、製造方法。
（５）糖尿病の予防又は治療方法であって、
　（１）～（３）のいずれかに記載の組成物を、糖尿病リスクのある個体あるいは糖尿病を罹患する個体に、糖尿病の予防又は治療に有効な量で投与することを含む、方法。
（６）前記組成物を、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与及び鼻腔内投与からなる群より選択された投与方法により投与する、（５）に記載の方法。

ＳＴＺ投与量の違いによる血糖値の変化を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時におけるＩＰＧＴＴ（ｄａｙ２７）結果（血糖値）を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時におけるＩＰＧＴＴ（ｄａｙ２７）結果（インスリン）を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓中のインスリン含有量の測定結果を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓組織のＨＥ染色結果（倍率×４）を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓組織のＨＥ染色結果（倍率×４０）を示す図である。ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓組織の免疫染色結果（倍率×４０）を示す図である。ＳＴＺ大量投与マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。ＳＴＺ大量投与マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。ＳＴＺ大量投与マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ３１）の結果（血糖値）を示す図である。高脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。高脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。高脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ６９）の結果（血糖値）を示す図である。脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ６９）の結果（インスリン）を示す図である。脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＴＴ（ｄａｙ５８）の結果（血糖値及び低下率）を示す図である。マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６を用いたＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＤＡＰ染色結果に基づくネクロシス(％）を示す図である。マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６を用いたインスリン分泌実験結果(content，release/content）を示す図である。マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６を用いたＳＨＥＤ－ＣＭのＡｐｏｐｔｏｓｉｓ対する効果を示す図である。ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ３６）結果（血糖値）を示す図である。ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ３６）の結果（インスリン）を示す図である。ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時のＩＴＴ（ｄａｙ５１）の結果（血糖値及び低下率）を示す図である。ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ－ＣＭ投与時の膵インシュリン含有量（ｄａｙ６１）を示す図である。

　本明細書は、糖尿病の予防又は治療用組成物に関する。本組成物は、歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含むことができる。本培養上清は、種々のサイトカインが含まれている。特許文献１では、本培養上清が、こうしたサイトカインを含有していることから、損傷部における細胞を増殖させ、その結果、損傷部を有する組織を修復することができるとしている。本発明者らは、こうした本培養上清の未だ知られていない作用として糖尿病を罹患する個体に対して本培養上清を投与することでこれらを治療できるという知見を得るにいたった。本培養上清に種々のサイトカインが含まれているといっても、糖尿病に有効であることは、当業者である本発明者らも予想しえなかった。

　本組成物によれば、従来の糖尿病治療の問題点を解消しつつ、糖尿病を効果的に予防又は治療できる。

　以下では、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された糖尿病の予防又は治療用組成物を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。

　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。

　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。

　本明細書において、「糖尿病」とは、分類を問わず、血糖値が病的に高い状態を疾患を意味している。より具体的には血糖値及びヘモグロビンA1cが一定以上の数値を超えている場合をいう。さらに、本明細書において、「糖尿病」には、糖尿病に合併する糖尿病性の急性又は慢性障害（合併症）を含むものとする。急性障害としては、糖尿病性昏睡（ケトン性昏睡、非ケトン性高浸透圧性昏睡、乳酸アシドーシス、低血糖性昏睡）、急性感染症が挙げられる。慢性障害としては、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の微小血管障害、脳血管障害、糖尿病性壊疽などの大血管障害、高脂血症・慢性感染症、胆石症、白内障などが挙げられる。

（糖尿病の予防又は治療用組成物）
　本組成物は、歯髄に由来する体性幹細胞、すなわち、歯髄幹細胞を培養して得られる培養上清を含むことができる。

（歯髄幹細胞）
　歯髄幹細胞は、歯髄から得られる歯髄に由来した幹細胞であれば特に限定されない。永久歯歯髄幹細胞であってもよいし、乳歯歯髄幹細胞であってもよいが、好ましくは、細胞増殖能の観点から、脱落した乳歯に由来する歯髄幹細胞を用いる。本組成物を適用する個体との関係においては、拒絶反応を抑制又は回避するため、同一生物種（ヒトであればヒト由来）の歯髄幹細胞であることが好ましく、より好ましくは自家歯髄幹細胞を用いる。

　歯髄幹細胞は、歯髄細胞の中の接着性細胞として選別可能である。脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞の中の接着性細胞又はその継代細胞を培養して得られる培養上清を、「歯髄幹細胞の培養上清」として用いることができる。例えば、以下に示す、特開２０１１－２１９４３２号公報に記載の方法等により適宜取得できる。

　なお、歯髄幹細胞の不死化細胞も提供されうる。通常、歯髄幹細胞の不死化にあたり、１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上の遺伝子が導入されている。このため不死化細胞においては、もとの細胞である歯髄幹細胞と均等な性質をもはや有していない。元の細胞とその不死化細胞とは、その産生物や分泌物や量が異なるのは当業者においてよく知られたことである。したがって、もとの細胞である歯髄幹細胞と歯髄幹細胞由来の不死化細胞とでは、その産生物が異なるとともに、分泌物状況や分泌物の組成も相違している。したがって、歯髄幹細胞の培養上清と歯髄幹細胞由来の不死化細胞の培養上清とは、その組成、すなわち、成分の種類やその割合においても大きく相違している。したがって、炎症性疾患に対する培養上清の作用や治療効果も、歯髄幹細胞と当該細胞に由来する不死化細胞とでは異なっている。

（１）歯髄の採取
　自然に脱落した乳歯（又は抜歯した乳歯、或いは永久歯）をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
（２）酵素処理
　採取した歯髄組織を基本培地（１０％ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地）に懸濁し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ及びディスパーゼで３７℃、１時間処理する。５分間の遠心操作（５０００回転／分）により酵素処理後の歯髄細胞を回収する。セルストレーナーによる細胞選別はＳＨＥＤやＤＰＳＣの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるので原則、使用しない。
（３）細胞培養（接着性細胞の選択）
　細胞を４ｃｃ基本培地で再懸濁し、直径６ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて３日間培養した後、コロニーを形成した接着性細胞を０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理する。ディッシュから剥離した歯髄細胞を直径１０ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１～８回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０^７個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば－１９８℃）。
（別法）
　細胞を４ｃｃ基本培地で再懸濁し、直径６ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。培養液（例えば、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ'ｓＭｅｄｉｕｍ））を添加した後、５％ＣＯ_２、３７℃に調整したインキュベータにて２週間程度培養する。培養液を除去した後、ＰＢＳ等で細胞を１回又は数回洗浄する。この操作（培養液の除去及び細胞の洗浄）に代えて、コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を回収することにしてもよい。この場合には例えば、０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収する。
（４）細胞の回収
次に、細胞を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収することができる。このようにして回収した歯髄幹細胞を用いて本発明の組成物を調製する。

（歯髄幹細胞の培養上清）
　歯髄幹細胞の培養上清は、歯髄幹細胞を培養して得られる培養液の上清である。すなわち、実質的に細胞成分（歯髄幹細胞又は歯髄細胞）を含んでいない。本組成物は、典型的には、歯髄幹細胞及び歯髄細胞を含まず、歯髄幹細胞の培養上清のみで構成された組成物である。培養した歯髄幹細胞は、培養後に細胞成分を分離除去することによって、除去される。培養液からの細胞成分の分離は、当業者に周知の方法で可能である。さらに、培養液に対して各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。

　歯髄幹細胞の培養には、基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。基本培地としてはＤＭＥＭの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば商品名：ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２（ＧＩＢＣＯ社）として市販される）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。

　本組成物は、血清を含まないことが好ましい。血清を含まないことでその安全性が高められる。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄幹細胞を培養することによって、血清を含まない培養上清を調製することができる。１回又は複数回の継代培養を行うことにし、最後又は最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。

（培養上清の取得）
　歯髄幹細胞の培養には、通常幹細胞に用いられる条件をそのまま適用あるいは適宜変更して適用できる。歯髄幹細胞培養上清の製造は、当業者であれば適宜行うことができる。例えば、以下のような操作で培養上清を取得してもよい。

　まず、既に説明したように、歯髄から選抜した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、上記した培地で培養する。例えば、細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃に調整したインキュベータにて培養する。必要に応じて継代培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１～８回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０^７個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば－１９８℃）。

　次いで、選抜・培養した歯髄幹細胞の培養上清を回収する。例えば、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま或いは一以上の処理を経た後に本発明の組成物の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、４℃、－８０℃）を例示することができる。

　本培養上清に対して適宜濃縮処理を施すこともできる。すなわち、本培養上清は濃縮物として含まれていてもよい。濃縮方法としては公知の手法から当業者であれば適宜選択して用いることができる。例えば、スピンカラム濃縮法、エタノール沈殿濃縮法により、培養上清の濃縮物を得ることができる。本培養上清は、凍結乾燥処理が施されていてもよい。すなわち、本培養上清は、凍結乾燥物であってもよい。

（本組成物の成分や形態）
　本組成物は、歯髄幹細胞の培養上清であり、歯髄幹細胞が培養中において分泌したタンパク質などの高分子化合物のほか、低分子有機化合物を含みうる。さらに、本組成物は、培養上清であるため、培地由来の成分も含みうる。

　本組成物は、液体状（液状、ゲル状など）及び固体状（粉状、細粒、顆粒状など）の形態を採りうる。また、本組成物は、疾患の種類、疾患を有する個体の特徴、投与方法及び投与量に応じて、公知の各種製剤形態を採りうる。例えば、錠剤、粉剤、粒剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、用時溶解する固形の注射剤、坐剤などの固形性剤、液状の注射剤（静注／筋注）、注入剤、点滴用剤などの液状性剤、点眼剤、スプレー剤、ローション剤、クリーム剤、貼付剤などの局所外用剤等が挙げられる。また、体内留置型の医療器具等に担持される形態を採ることもできる。そのほか、本組成物は、公知の薬学上許容される塩を含むことができる。当業者であれば、適切な製剤化が可能である。

　本組成物は、疾患の種類や製剤形態に応じて、製剤上許容される他の成分を含むことができる。製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF））等を含有させることにしてもよい。

　本組成物は、糖尿病の予防又は治療用として用いることができる。糖尿病としては、１型、２型糖尿病のほか、既に記載したとおり、これらに伴う急性及び慢性の糖尿病性障害を含むことができる。

　本組成物の投与経路は特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。たとえば、非経口投与は、全身投与であってもよいし局所投与であってもよい。より具体的には、注入、塗布又は噴霧が挙げられる。また、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。

　本組成物の用法用量は特に限定されない。被験対象の年齢、体重、病態等を勘案して設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回～数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。

　本組成物が適用される対象個体としては、ヒトを含む哺乳動物（ペット、家畜、実験動物等）が挙げられる。例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、モルモット、ラット及びマウス等が挙げられる。

（糖尿病の予防又は治療方法）
　本明細書に開示される予防又は治療方法は、本組成物を、糖尿病リスクのある個体又は糖尿病に罹患する個体に、糖尿病の予防又は治療に有効な量で投与することを含むことができる。本治療方法によれば、従来の不都合を一挙に解決して糖尿病を予防又は治療できる。本組成物、投与方法等については、既に説明した態様を本方法に適用することができる。

（糖尿病の予防又は治療に有効な因子又はその組合せのスクリーニング方法）
　本明細書の開示によれば、歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１又は２以上の成分を糖尿病に対する評価系に供給して、炎症性疾患への作用を評価する工程、を備える、方法が提供される。

　本スクリーニング方法によれば、歯髄幹細胞の培養上清に含まれる成分のうち、どの成分が糖尿病に対して有効であるかをスクリーニングでき、特定された歯髄幹細胞の培養上清成分を有効成分として含有する、すなわち、主として特定された培養上清成分のみを有効成分として含有する予防又は治療用組成物を取得できる。また、こうした組成物は、歯髄幹細胞の培養上清に由来しないで、市販され及び／又は精製等された特定成分を組み合わせることで有効な予防又は治療用組成物を得ることができる。

　なお、本スクリーニング方法で用いる糖尿病に関する評価系は、糖尿病について公知である。例えば、ストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルマウス・ラッ、NODマウス(NOD.Cg-Prkdcscid　Il2rgtm1Sug/Jic)、dbdbマウス(C57BLKS/JＩaｒ- +Lepr db /+Lepr db)、obobマウス(C57BL/6JHamSlc ob/ ob)、Goto-Kakizakiラット(GKラット)、Zucker fattyラット(ZDF-Leprfa/ CrlCrlj)=ZDFラット(Zucker Diabetic fatty)、Wistar fatty ラット(Wistar- Leprfa/ Leprfa)、高脂肪食負荷モデル動物等の糖尿病モデル動物を利用できるほか、MIN6細胞、INS-1細胞、βTC細胞、HIT細胞等の膵β細胞株を用いた評価系を適宜選択して利用できる。こうした各種の評価系については、当業者であれば適宜選択できるほか、本明細書の実施例等を参照することによっても適宜選択することができる。

　歯髄幹細胞の培養上清には、以下に示す成分(各成分は、タンパク質、遺伝子あるいは物質名、通称名等でそれぞれ記載されている)が含まれている。こうした成分から選択される１又は２以上、あるいは３以上を適宜組み合わせて糖尿病に有効な因子のスクリーニングに適用することができる。

　以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。

　以下の実施例で用いた実験方法等について以下に記載する。

（ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清（ＳＨＥＤ－ＣＭ）の調製）
　１０ｃｍｄｉｓｈを用いてＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡＡＬＯＲＩＣＨＣｏ　ＵＳＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡＡＬＯＲＩＣＨＣｏＵＳＡ）＋１％ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＪａｐａｎＬｔｄ）でヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を培養し、８０～９０％コンフルエントになるまで培養を行う。ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培養液（ＤＭＥＭ）に変更し、４８時間培養を行った。上清を回収し、１５００ｒｐｍで４～５分、３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、その上清を、ＳＨＥＤ－ＣＭとして以下の実施例に使用した。

（腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）とインスリン負荷試験（ＩＴＴ））
　１６時間絶食マウスにＩＰＧＴＴは２ｇ／ｋｇのグルコース、ＩＴＴはヒューマリンＲを２Ｕ／ｋｇで腹腔内投与した。投与前，投与後１５分，３０分，６０分，１２０分に眼窩採血を行い、血糖値測定および血中インスリン量を測定した。
　血糖値測定は、全血をアントセンス（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定を行った。また、血中インスリン量測定は、ＥＤＴＡで分離した血清をＥＬＩＳＡ法（モリナガインスリン測定キット：商品名（森永製菓））で測定した。

（単離膵臓インスリン含有量）
単離した膵臓を、ＫＲＢ１０ｍｌ中でホモゲナイザーを用いて撹拌させ、２５％ａｓｉｄｅｔｈａｎｏｌを投与し、一晩反応させた。遠心分離した上清をＨＴＲＦ法（ＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓＴｉｍｅＲｅｓｏｌｖｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ．ＣｉｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓ）を用いてインスリン含有量を測定した。

（病理組織学的検討）
　単離膵島を４％ＰＦＡに４時間浸水させ、組織を固定した。病理組織学的検討は、免疫染色とＨＥ染色で比較検討を行った。

（免疫染色）
　ＰＦＡ固定後、１０％スクロースに８時間、２０％スクロースに一晩浸水させ、ＯＣＴコンパウンドに包埋した。１０μｍの厚さに切片を作成し、インスリン及びグルカゴンの発現を蛍光免疫染色法を用いて比較検討を行った。

　切片をＰＢＳで３回洗浄した後に、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ－ＸｉｎＰＢＳで２分間処理し、１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－ＸｉｎＰＢＳで３０分ブロッキングを行った。その後、ブロッキング溶液で１／５００に希釈した１次抗体を４℃で一晩反応させた（インスリン：ａｂｃａｍ；ａｂ７８４２，ｇｌｕｃａｇｏｎ：ａｂｃａｍ；ａｂ８０５５）。１次抗体反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識した２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をブロッキング溶液で１／１０００希釈し、室温で２時間反応させた。２次抗体反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、マウントした後に、蛍光顕微鏡で観察を行った。

　５枚の非連続切片を無作為に選出し、１切片あたり５視野以上観察した（１匹あたり、２５視野以上）。ｉｍａｇｅＪを使用し、蛍光発現した面積評価の解析を行った。

（ＨＥ染色）
　ＰＦＡで固定した組織をＰＢＳ置換し（２時間、８時間及び２時間の順でＰＢＳを交換）、パラフィン包埋器（サクラファインテックスジャパン）を用いてパラフィン包埋し、４μｍの厚さに切片を作成した。切片を脱パラフィン処置（キシレン３分×３回、１００％エタノール３分×３回、９５％エタノール１分、９０％エタノール１分、７０％エタノール１分、９５％エタノール１分、ミリＱ水（ＭＱ）の順で洗浄）し、×５ヘマトキシリン液（マイヤー：ＭＱで希釈）で５分間反応させ、ＭＱで１０分間洗浄した。その後、×５１％エオシンＹ液（ＷＡＫＯ：７０％エタノールで希釈）で２分間反応させ、ＭＱで１回洗浄し、脱水処置（７０％エタノール１分、８０％エタノール１分、９０％エタノール１分、１００％エタノール３分×３回、キシレン３分×３回の順で）し、マウントした後に蛍光顕微鏡で観察を行った。

（核染色）
　ＳＴＺ負荷後、スライドガラスをＰＢＳで３回洗浄し、スライドガラス上の細胞を４％ＰＦＡで３０分固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳで１／２０００に希釈したＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ；Ｊａｐａｎ）を５分間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、マウントした後に、蛍光顕微鏡で観察を行った。ｉｍａｇｅＪを使用し、１視野中のｎｅｃｒｏｓｉｓ細胞数／全体の細胞数をカウントし、比較検討をおこなった。（１スライドガラスより６視野ｎ：３）

（ウェスタンブロッティング）
　ＳＴＺ負荷後、ＰＢＳで３回洗浄し、５０×プロテアーゼインヒビター＋Ｃｄｃ４２ライシスバッファー４００μｌ／ｗｅｌｌを投与し、１５分間反応させた。ｗｅｌｌの内容物を全て回収し、４℃で１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離した上清３０μｌ＋１×ＳＤＳ３０μｌを混和させ、１００℃３分間反応させたものを、サンプルとして使用した。（全てのサンプルのタンパク量：約２０００μｌ／ｍｌであることをＢＣＡａｓｓａｙ；ＳＩＧＭＡＡＬＯＲＩＣＨを用いて確認している。）

　サンプル１０μｌをＳＤＳポリアミドゲルで電気泳動した後（２０ｍＡ／１．５時間）、メンブレンに転写（２５０ｍＡ／１時間）した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇｏｎｅ（ナカライテスク）で３０分間メンブレンのブロッキングを行い、ブロッキング後、ｃａｎｇｅｔｓｉｇｎａｌ（東洋紡）で１／３０００に希釈した１次抗体（ｃａｓｐａｓｅ３：ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ：ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を４℃で一晩反応させ、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。その後ｃａｎｇｅｔｓｉｇｎａｌ（東洋紡）で１／１００００に希釈した２次抗体（ｒａｂｉｔ：ＳＩＧＭＡＡＤＬＩＣＨ）を室温で２時間反応させ、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ－ｐｒｉｍｅを用いて、蛍光発色させ、現像をおこなった。

（ＳＴＺ投与による膵臓β細胞の破壊による糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ－ＣＭの投与）
　Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（以下ＳＴＺ、ＳＩＧＭＡＡＬＯＲＩＣＨＣｏ．ＵＳＡ）を生理食塩液に溶解して５ｍｇ／ｍｌの溶液を調整し、この溶液を９～１０週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに対し、１日１回５０ｍｇ／ｋｇを５日間腹腔内投与を行い、糖尿病モデルマウスを作成した。

　ＳＴＺ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ１より１４日間ＳＨＥＤ－ＣＭを２ｍｌ／ｄａｙ尾静脈内投与を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ群として、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）を２ｍｌ／ｄａｙで尾静脈内投与し、またＥｘｅｎｄｉｎ－４（以下、Ｅｘ－４）群として、Ｅｘ－４を１４日間４８ｎｍｏｌ／ｄａｙで腹腔内投与を行った。２４時間毎に体重・随時血糖測定を行い、ｄａｙ１５，２７に腹腔内グルコース負荷試験（以下ＩＰＧＴＴ）で血糖値および血中インスリン濃度を測定した。ｄａｙ３４に膵臓を単離し、病理組織学的検討および膵臓のインスリン含有量を測定した。結果を図１～図９に示す。

　図１に示すように、本実施例で作製したマウスは、徐々に血糖値が高くなり、２週間後程度に最高血糖値（４００ｍｇ／ｍｌ）となった。図２に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ上清を添加した群において顕著に血糖値低下効果が観察された。これに対して骨髄幹細胞培養上清投与群及びＥｘ－４投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と同等の血糖値を示したにすぎなかった。なお、図３に示すように、各群の体重は、観察期間を通じてほぼ同等であった。

　図４及び図５に示すように、ＩＰＧＴＴの結果は、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群において血糖値が最も低下し、血中のインスリン濃度も高くインスリン分泌が促進されていた。また、図６に示すように、ｄａｙ３４の膵臓中のインスリン含有量は、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群において最も高かった。

　図７及び図８に示すように、ｄａｙ３４に採取した膵臓のＨＥ染色の結果からは、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群において最も良好なβ細胞の存在が多数確認された。図９に示すように、３４日後の免疫染色結果からは、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群においては、インスリンを生成分泌するβ細胞が充実しその周囲をα細胞が取り囲んだ組織を観察できた。これに対して骨髄幹細胞培養上清投与群やＥｘ－４投与群では、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群のような良好な組織形態を観察できなかった。

（ＳＴＺ投与による膵臓β細胞の破壊による糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ－ＣＭの投与）
　ＳＴＺの生理食塩溶液１５ｍｇ／ｍｌを９～１０週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに対し、１５０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔内投与し、糖尿病モデルマウスを作製した。ＳＴＺ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に血糖値４００ｍｇ／ｄＬ以上であることを確認した後に、ｄａｙ３～ｄａｙ１６までＳＨＥＤ－ＣＭ，ＤＭＥＭを各群２ｍｌ／ｄａｙで尾静脈内投与し、Ｅｘ－４を４８ｎｍｏｌ／ｄａｙで腹腔内投与を行った。２４時間毎に体重・随時血糖値の測定を行い、ｄａｙ１７，３１にＩＰＧＴＴで血糖値および血中インスリン濃度を測定した。ｄａｙ３７に膵臓を単離し、膵臓のインスリン含有量を測定した。結果を図１及び図１０～１２に示す。

　図１に示すように、本実施例で作製したマウスは、急激に血糖値が高くなり、最高血糖値（約５００～６００ｍｇ／ｍｌ）となった。図１０に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群では、早期に血糖値が低下傾向となり、その効果が維持された。図１１に示すように、体重については、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群とＥｘ－４投与群は同様の体重減少傾向を呈した。図１２に示すように、ｄａｙ１７のＩＰＧＴＴの結果からは、ＳＨＥＤーＣＭ投与群で最も血糖値抑制効果が高いことがわかった。

（高脂肪食による糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ－ＣＭの投与）
　４週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊに３６日間、高脂肪食（ＨｉｇｈＦａｔＤｉｅｔ３２：ＨＦＤ）を摂食させ、体重３９．５ｇ血糖値２００ｍｇ／ｄＬまで上昇させた。その後、ＨＦＤの摂食を継続したまま、ＳＨＥＤ－ＣＭ，ＤＭＥＭを２ｍｌ／ｄａｙ腹腔内投与した。体重・随時血糖測定は、高脂肪食開始後から７日毎に行った。ＳＨＥＤ－ＣＭ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ５８にインスリン負荷試験（ＩＴＴ）でインスリン抵抗性の評価を行い、ｄａｙ６９にＩＰＧＴＴで血糖値および血中インスリン濃度を測定した。結果を、図１３～１７に示す。

　図１３に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して有意に低い血糖値を維持した。図１４に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群とＣｏｎｔｒｏｌ群との体重増加は同程度であった。図１５及び図１６に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群のＩＰＧＴＴの結果は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群より良好であった。図１７に示すように、ＩＴＴの結果によれば、インスリン抵抗性は、ＳＨＥＤ－ＣＭ群とＣｏｎｔｒｏｌ群とはほぼ同程度であった。

（マウス膵β細胞を用いたＳＨＥＤ－ＣＭの評価）
　マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６（１×１０^６／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した後、培養液をそれぞれＳＨＥＤ－ＣＭ，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ＋Ｅｘ－４（１０ｎＭ）に交換した。なお、ＭＩＮ６の培地には、ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡＡＤＬＩＣＨＣｏＵＳＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡＡＬＯＲＩＣＨＣｏＵＳＡ）＋１％ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎＵＳＡ）を用いた。培養液の交換と同時にＳＴＺ（０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）の各濃度となるように添加し、６時間培養を行った。ＰＦＡで細胞を固定した後、スライドガラス上のＭＩＮ６をＤＡＰＩ染色し、蛍光顕微鏡で観察を行った。ｉｍａｇｅＪを用いて、ｎｅｃｒｏｓｉｓ細胞数／全体の細胞数（１００～２００）をカウントし、各群でのｎｅｃｒｏｓｉｓ（細胞死）の割合の評価を行った。結果を図１８に示す。

　図１８に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群では、最もｎｅｃｒｏｓｉｓが有意に抑制されていることがわかった。

（マウス膵β細胞を用いたＳＨＥＤ－ＣＭのインスリン分泌促進に対する評価）
　ＭＩＮ６（１×１０^６／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した後、培養液をそれぞれＳＨＥＤ－ＣＭ，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ＋Ｅｘ－４（１０ｎＭ）に交換した。培養液の交換と同時にＳＴＺ（０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）の各濃度となるように添加し、６時間培養を行った。その後、２．５ｍＭグルコースのＫＲＢｂｕｆｆｅｒで３０分間スタベーションを行った後、低グルコースＫＲＢｂｕｆｆｅｒ（２．５ｍＭ）および高グルコースＫＲＢｂｕｆｆｅｒ（１６．７ｍＭ）で３０分間刺激を行った。低グルコースと高グルコースそれぞれ刺激後の上清を回収し、上清を回収した後、ａｓｉｄｅｔｈａｎｏｌ法にて最終的にインスリン含有量を回収した。ＨＴＲＦ法を用いて、上清中のインスリン量（ｒｅｌｅａｓｅ）および上清回収後のインスリン含有量（ｃｏｎｔｅｎｔ）を測定し、ｒｅｌｅａｓｅ／ｃｏｎｔｅｎｔ（％）にてインスリン分泌能の比較検討を行った。結果を図１９に示す。

　図１９に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群では、インスリンの分泌が促進されていることがわかった。

（マウス膵β細胞を用いたＳＨＥＤ－ＣＭのＡｐｏｐｔｏｓｉｓ促進に対する評価）
　ＭＩＮ６（１×１０^６／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した後、培養液をそれぞれＳＨＥＤ－ＣＭ，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ＋Ｅｘ－４（１０ｎＭ）に交換した。培養液の交換と同時にＳＴＺ（０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）を添加し、６時間培養を行った。その後ＭＩＮ６のタンパク質を回収し、ウェスタンブロット法にて、カスパーゼ３、クリーブドカスパーゼ３の発現量の比較検討を行った。結果を図２０に示す。

　図２０に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群及び骨髄幹細胞培養上清投与群よりも低いクリーブドカスパーゼ３の発現量を呈した。

　以上の結果から、ＳＨＥＤ－ＣＭは、β細胞のｎｅｃｒｏｓｉｓ及びＡｐｏｐｔｏｓｉｓを抑制し、β細胞のインスリン分泌能を促進しているものと考えられた。

（２型糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ－ＣＭの投与）
　レプチン受容体欠損マウス（自然発症型）（dbdbマウス）の１３週齢（雌）に６１日間、１２時間毎に実施例１で調製したＳＨＥＤ－ＣＭ１ｍｌを静注及び腹腔内投与した。また、コントロールとして、ＤＭＥＭを同様にして静注投与した。体重・随時血糖測定は、投与開始後から５日毎に行った。ＳＨＥＤ－ＣＭ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３６にグルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）で血糖値および血中インスリン濃度を測定した。また、ｄａｙ５１にインスリン負荷試験（ＩＴＴ）でインスリン抵抗性の評価を行った。結果を、図２１～２６に示す。

　図２１に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して概して低い血糖値を維持した。図２２に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群とＣｏｎｔｒｏｌ群との体重増加は同程度であった。図２３及び図２４に示すように、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群のＩＰＧＴＴの結果は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群より良好であった。図２５に示すように、ＩＴＴの結果によれば、インスリン抵抗性は、ＳＨＥＤ－ＣＭ群とＣｏｎｔｒｏｌ群とはほぼ同程度であった。また、図２６に示すように、ｄａｙ６１の膵臓インシュリン含有量はＳＨＥＤ－ＣＭ投与群において高く、ＳＨＥＤ－ＣＭのインスリン分泌促進効果を支持するものであった。

　以上の結果から、本組成物は、糖尿病の治療に有用であることがわかった。

Claims

　歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含む、糖尿病の予防又は治療用組成物。
　血清を含まない、請求項１に記載の組成物。
　前記歯髄幹細胞を含まない、請求項１又は２に記載の組成物。
　請求項１～３のいずれかに記載の予防又は治療用組成物の製造方法であって、
　歯髄細胞から接着性細胞を選抜し、
　前記接着性細胞を培養し、
　培養上清を回収する、製造方法。
　糖尿病の予防又は治療方法であって、
　請求項１～３のいずれかに記載の組成物を、糖尿病リスクのある個体あるいは糖尿病を罹患する個体に、糖尿病の予防又は治療に有効な量で投与することを含む、方法。
　前記組成物を、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与及び鼻腔内投与からなる群より選択された投与方法により投与する、請求項５に記載の方法。
　糖尿病の予防又は治療に有効な因子又はその組合せのスクリーニング方法
　歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１又は２以上の成分を糖尿病に関する評価系に供給して、糖尿病への作用を評価する工程、を備える、方法。